Tổng quan một số ứng dụng của quang phổ Raman trong kiểm nghiệm dược phẩm.pdf

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI LINH

TỔNG QUAN MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA QUANG PHỔ RAMAN TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI LINH

TỔNG QUAN MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA QUANG PHỔ RAMAN TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Đặng Thị Ngọc Lan Bùi Việt Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến: ThS. Đặng Thị Ngọc Lan DS. Bùi Việt Phương là thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và chia sẻ cho tôi những kinh nghiệm vô cùng quý báu để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉnh sửa quý báu và kịp thời của DS. Bùi Văn Trung, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, để hoàn chỉnh nghiên cứu này một cách tốt nhất. Tôi xin cảm ơn bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã tạo điều kiện cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng suốt 5 năm học dưới mái trường này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp N1K64 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên

Nguyễn Thị Mai Linh

MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ và đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ RAMAN................................... 3 1.1. Giới thiệu quang phổ Raman ................................................................... 3 1.1.1. Lịch sử phát triển .............................................................................. 3 1.1.2. Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn .... 4 1.2. Nguyên lý cơ bản của phổ Raman ........................................................... 5 1.2.1. Thuyết cổ điển của hiệu ứng Raman.................................................. 8 1.2.2. Thuyết lượng tử của hiệu ứng Raman ............................................. 12 1.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman ................................ 13 1.3.1. Nguyên tắc hoạt động ..................................................................... 13 1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo cơ bản .............................................................. 14 1.4. Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman ............................ 24 1.4.1. Ưu điểm .......................................................................................... 24 1.4.2. Nhược điểm và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình đo phổ ......... 27 CHƯƠNG II. ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC ..................................... 29 2.1. Phân tích định tính ............................................................................... 29 2.2. Phân tích định lượng ............................................................................. 30 2.3. Ứng dụng chung của phương pháp phân tích phổ Raman trong ngành dược………………………………………………………………………… .. 35

2.4. Ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc. ............................................................................................ 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................. 46 1. Kết luận.................................................................................................... 46 2. Đề xuất..................................................................................................... 46

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT API

Active Pharmaceutical Ingredients

Dược chất có hoạt tính

CCD

Charge-coupled device

Thiết bị tích điện kép

FT

Fourier Transform

Biến đổi Fourier

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

NMR

Nuclear magnetic resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

NIR

Near Infrared

Hồng ngoại gần

IR

Infrared

Hồng ngoại

S/N

Signal-to-noise

Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu

TLTK UV-VIS

Tài liệu tham khảo Ultraviolet–visible

Tử ngoại-khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số loại nguồn laser sử dụng trong công nghệ dược phẩm…………………………………………………………………………16 Bảng 2.1. Tổng quan về một số quy trình định lượng dược phẩm bằng phổ Raman đã được công bố từ năm 2002-2006…………………………………31

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1. Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu………………………………………………………………………..…..6 Hình 1.2 .Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng lượng………………………………………………………………………..…7 Hình 1.3. Tán xạ Stokes và đối Stokes của CCl4………………………….....10 Hình 1.4. Sự thay đổi của các ellip phân cực trong quá trình dao động của phân tử CO2………………………………………………………………….11 Hình 1.5. Sự thay đổi momen lưỡng cực α bởi các kiểu dao động

1,

2,

3

trong phân tử CO2……………………………………………………………11 Hình 1.6. Cơ chế thay đổi mức năng lượng của tán xạ Stokes và tán xạ đối Stokes………………………………………………………………………..12 Hình 1.7. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman…………………………….14 Hình 1.8. Đầu đo kéo dài giúp đo mẫu bên trong các bao bì đựng lớn, trong môi trường độc hại…………………………………………………………..17 Hình 1.9. Đầu đo nhanh giúp đo trực tiếp các mẫu đơn giản………………..17 Hình 1.10. Bộ phận đựng mẫu hỗ trợ đo các mẫu dạng lỏng, mẫu viên…….18 Hình 1.11. Sơ đồ một detector CCD………………………………………...20 Hình 1.12. Cấu hình 90o(a) và cấu hình 180o(b)…………………………….21 Hình 1.13.Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng Renishaw…………………………………………………………………….22 Hình 1.14. Máy quang phổ Raman cầm tay hãng NanoRam®………………23

Hình 1.15. Máy quang phổ Raman cầm tay TruScan RM của hãng Thermo Scientific…………………………………………………………………….23 Hình 1.16. Kết quả định tính của một mẫu từ máy Raman cầm tay………...24 Hình 2.1. Công thức hóa học và phổ Raman của một số tá dược thường dùng, và một số API………………………………………………………………..30 Hình 2.2. Tỷ lệ cường độ tín hiệu của hợp chất……………………………..34 Hình 2.3. Phổ Raman shift Ibuprofen chuẩn………………………………...40 Hình 2.4. Phổ Raman Shift Ibuprofen mẫu thử……………………………...41 Hình 2.5. Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Ibuprofen trên thị trường………………………………………….…………………………42 Hình 2.6. Phổ Raman shift Sildenafil chuẩn………………………………...43 Hình 2.7. Phổ Raman Shift Sildenafil mẫu thử……………………………...44 Hình 2.8. Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Sildenafil trên thị trường…………………………………………………………………….45

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Bên cạnh các phương pháp phân tích quang phổ thông thường được sử dụng như phổ UV - VIS, phổ IR, khối phổ... có một phương pháp phân tích quang phổ còn khá mới mẻ trong ngành Dược, đó là quang phổ Raman. Quang phổ Raman được ra đời từ những năm 30 của thế kỷ trước, nhưng do hạn chế về khoa học kỹ thuật mà nó phát triển khá chậm. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhất là kỹ thuật laser, quang phổ Raman đang ngày càng phát triển và cho thấy nhiều ưu thế. Trên thế giới, phương pháp phân tích phổ Raman được áp dụng một cách hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau như hải quan, pháp y, khảo cổ học… trong đó có trong ngành Dược. Với ưu điểm nổi bật là phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng đã mang lại nhiều tiềm năng lớn để khai thác kỹ thuật phổ này trong công tác phân tích, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và công tác phòng chống thuốc giả với độ an toàn và hiệu quả cao. Vậy nên, những nghiên cứu trong khóa luận này được thực hiện với mong muốn đưa lại một cái nhìn tổng quan về phổ Raman và khả năng ứng dụng trong ngành Dược và đặc biệt trong kiểm nghiệm Dược phẩm, nhằm tạo một nền tảng cơ bản cho việc ứng dụng của quang phổ Raman trong điều kiện thực tế tại Việt Nam. Mục tiêu của khóa luận: 1. Tìm hiểu nguyên lý tổng quan về quang phổ Raman, nguyên tắc hoạt động, nguyên tắc cấu tạo và các bộ phận chính của máy quang phổ Raman. 2. Phân tích ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman so với các phương pháp phân tích quang phổ khác.

2

3. Phân tích khả năng ứng dụng thực tế của quang phổ Raman trong ngành Dược và khả năng áp dụng phương pháp quang phổ này trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc.

3

Chương I. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ RAMAN 1.1.

Giới thiệu quang phổ Raman

1.1.1. Lịch sử phát triển Năm 1928, chỉ với các thiết bị đo đạc thô sơ, sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn kích thích, kính hiển vi làm bộ phận hội tụ ánh sáng tán xạ, “detector” bằng mắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra một hiệu ứng tán xạ ánh sáng yếu, hiệu ứng này sau đó được đặt theo tên ông, hiệu ứng Raman. Với điều kiện thiếu thốn như thế, sự phát hiện ra một hiện tượng yếu như tán xạ Raman là một thành quả rất đáng khâm phục và nó đã giúp ông đạt được giải Nobel vật lý năm 1930. [11] Theo thời gian, đã có những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị đo đạc tán xạ Raman. Những nghiên cứu đầu tiên được tập trung phát triển là nguồn ánh sáng kích thích. Các loại đèn từ các nguyên tố khác nhau được nghiên cứu (như heli, chì, kẽm) nhưng không đạt yêu cầu bởi vì cường độ ánh sáng tán xạ thu được vẫn rất yếu. Nhiều năm sau đó, người ta nghiên cứu áp dụng và phát triển nguồn kích thích bằng đèn thủy ngân, nhưng nó vẫn không mang lại hiệu quả như mong muốn. Cho tới tận năm 1962, đã có bước ngoặt lớn trong công nghệ Raman, đó là người ta đã đưa laser vào làm nguồn kích thích cho tán xạ Raman. Các loại nguồn Laser sử dụng phổ biến thời đó chủ yếu là laser thuộc vùng UV-VIS như Laser Ar+ (351,1-514,5nm); Kr (337,4674,4nm) và cho đến gần đây các nguồn laser IR và NIR được đưa vào sử dụng làm hạn chế rất nhiều hiện tượng huỳnh quang (một hiện tượng tác động mạnh đến việc thu phổ Raman). [28] Nhưng vẫn có nhiều hạn chế khiến cho quang phổ Raman phát triển tương đối chậm. Đầu tiên là khó khăn trong việc điều khiển hệ thống quang học. Thứ hai là huỳnh quang trong chất mẫu ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát

4

hiện Raman. Thứ ba, tán xạ Raman là tán xạ yếu, tản mát, muốn ghi được chính xác phổ của nó thì cần phải chiếu xạ laser kích thích trong một thời gian dài, điều này dẫn đến sự phân hủy và biến tính của mẫu. Vậy nên, mặc dù bản chất là một phương pháp phân tích không phá hủy mẫu, nhưng một vài trường hợp, phổ Raman lại được nhận định là một phương pháp phá hủy mẫu chất. [28] Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ Raman. Nhờ sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng rãi hơn. Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát tại thực địa các mẫu cần phân tích. 1.1.2. Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn Với sự phát triển mạnh mẽ như vậy, ngày nay quang phổ Raman không chỉ còn là phương pháp phân tích cơ bản sử dụng trong phòng thí nghiệm mà còn được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học khác nhau. Trong khoa học vật liệu, quang phổ Raman giúp xác định cấu trúc vật liệu, xác định thành phần cấu tạo trong hỗn hợp rắn. Trong pháp y, người ta sử dụng quang phổ Raman như một công cụ hiệu quả để tìm ra các chất độc hại, gây tử vong hoặc dùng phương pháp phổ Raman để bổ sung khẳng định kết luận pháp y. Trong khảo cổ học, người ta dùng phổ Raman để tìm ra các kim loại, đá quý, xác định nguồn gốc các cổ vật... Trong hải quan, phổ Raman dùng để kiểm tra nhanh phát hiện các chất cấm như ma túy, chất gây nghiện, hướng thần, chất

5

kích thích…Và đặc biệt trong ngành Dược có rất nhiều ứng dụng quan trọng sẽ được đề cập đến ở phần sau. 1.2.

Nguyên lý cơ bản của phổ Raman [1], [11], [28]

Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ ánh sáng, thì quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ. Tán xạ này xảy ra do va chạm giữa các photon và các phân tử. Ánh sáng tới với tần số

0

trên

một phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h 0. Ví dụ nguồn laser có bước sóng 500 nm và công suất 1W chứa khoảng 2,5x1018 photon trong một giây. Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử. Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là tán xạ Rayleigh. Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số với ánh sáng tới. Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử và trao đổi năng lượng sau va chạm. Nếu phân tử nhận năng lượng h từ photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h( của photon tán xạ khi đó là

0–

0

– ), và tần số

. Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng

h từ phân tử, các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h( và tần số của photon tán xạ là

0

0

+ )

+ . Tán xạ mà có sự trao đổi năng lượng

của photon với một phân tử như trên được gọi là tán xạ Raman. Và các tán xạ có tần số

0

–

và có tần số

“tán xạ đối Stokes”.

0

+

được gọi tương ứng là “tán xạ Stokes” và

6

Hình 1.1. Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu Khi chiếu bức xạ điện từ h vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu hoặc phát xạ  Tán xạ Rayleigh xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với nguyên tử.  Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết trong phân tử. Cũng như các phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman, ta khảo sát sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử. Quá trình trao đổi năng lượng có thể xảy ra giữa các mức năng lượng của điện tử, các mức năng lượng của dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang phổ Raman chúng ta chỉ khảo

7

sát năng lượng dao động phân tử, cụ thể hơn đó là dao động dọc theo trục của các liên kết. Hình 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes. Tán xạ Stokes xảy ra khi một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng kích thích. Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số. Vì vậy, trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes.

Hình 1.2. Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng lượng Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman đặc trưng cho sự thay đổi tần số trong hiệu ứng Raman được gọi là “Raman shift”. Đối với một chất, cường độ của các bức xạ tương ứng trên Raman shift là khác nhau, chúng tạo nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm chức thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau. Vì vậy, phân tích phổ Raman, chúng ta có thể xác định được chính xác một chất và nghiên cứu cấu trúc của chất ấy.

8

1.2.1. Thuyết cổ điển của hiệu ứng Raman [1], [11] Khi một phân tử nào đó được đặt trong điện trường E của bức xạ điện từ có tần số

0,

dưới tác dụng của điện trường có sự phân bố lại electron trong

phân tử và làm xuất hiện momen lưỡng cực P. Khi điện trường E đủ nhỏ, độ lớn của momen lưỡng cực P và của E tỷ lệ thuận với nhau và được biểu diễn bởi công thức sau P = αE

(1.1)

Trong đó, α là hệ số phân cực. Trạng thái phân cực có thể tạo thành dễ dàng như là khi một đám mây electron nào đó biến dạng. Trong hệ tọa độ không gian Oxyz, phương trình (1.1) được viết lại như sau

(1.2) Để đơn giản, chúng ta giả sử P và E là các giá trị trong cùng một trục tọa độ. Thay E = E0 cos 2πv0t vào phương trình (1.1) ta được: P = α E0 cos 2πv0t

(1.3)

Hệ số phân cực α không phải là một hằng số mà nó có thể thay đổi trong suốt quá trình dao động của phân tử. Chúng ta có thể chia hệ số phân cực này thành hai thành phần, thành phần α0 không đổi khi phân tử không dao động và một thành phần Q (Q = Q0 cos 2πv0t). Khi đó ta có: α = α0 + (

)0 Q = α0 + (

Thay (1.4) vào (1.3) ta được

)0 Q0 cos 2πvt

(1.4)

9

Phương trình trên chỉ ra momen lưỡng cực P gồm có ba tần số dao động là 0,

0

–

và

0+

. Số hạng đầu tiên chỉ ra tán xạ cùng tần số

0

với ánh sáng

tới, đó là tán xạ Rayleigh. Số hạng thứ hai biểu thị sự thay đổi tần số so với ánh sáng tới và như được biết đó là tán xạ Stokes và đối Stokes (tán xạ Raman). Phương trình (1.5) chỉ ra điều kiện tiên quyết để có tán xạ Raman là yếu tố(∂α/∂Q)0Q0E0 không thể là 0. Tức là Q0 hay E0 đều không thể là 0, điều kiện quan trọng là (∂α/∂Q)0 ≠ 0. Theo phương trình trên, hoạt động Raman chỉ là những dao động mà có sự thay đổi độ phân cực kết hợp với dao động trong phân tử. Hai số hạng trong phương trình (1.5) cho ta thấy sự liên quan giữa các tán xạ Raman (tán xạ Stokes và đối Stokes) và tỷ lệ giữa tán xạ Raman với tán xạ Rayleigh. Bởi vì cường độ của tán xạ đối Stokes phụ thuộc vào số lượng của những phân tử ở trạng thái kích thích ban đầu, mặt khác các phân tử này ở trạng thái kích thích thường có nhiệt độ cao mà phân bố Boltzmann lại giảm khi nhiệt độ của chất tăng. Chính vì vậy, tán xạ đối Stokes là ít hơn, khó thu thập hơn và có cường độ nhỏ hơn tán xạ Stokes. Phương trình (1.5) không chỉ ra tỷ lệ giữa ba loại tán xạ này, nhưng thực nghiệm cho thấy cả hai loại tán xạ Raman này đều yếu hơn tán xạ Rayleigh (thường là nhỏ hơn 0,1%).

10

Hình 1.3. Tán xạ Stokes và đối Stokes của CCl4 Để minh họa cho các hoạt động Raman, chúng ta cùng tìm hiểu về các trạng thái dao động của phân tử CO2. Hình 1.4 miêu tả ba trạng thái dao động của phân tử CO2 và hình 1.5 chỉ ra sự thay đổi độ phân cực α theo các trạng thái dao động

1,

2,

3.

Trong quá trình dao động IR, độ phân cực của phân

tử là không đổi, còn theo phương trình (1.5) để có hoạt động Raman thì tỷ số (∂α/∂Q)0 ≠ 0 (độ phân cực thay đổi) nên trạng thái dao động Raman, còn trạng thái dao động

2

và

3

là dao động IR. [28]

1

là dao động

11

Hình 1.4.Sự thay đổi của các ellip phân cực trong quá trình dao động của phân tử CO2

Hình 1.5. Sự thay đổi momen lưỡng cực α bởi các kiểu dao động

1,

2,

3

trong phân tử CO2 Ví dụ trên minh họa mối quan hệ loại trừ lẫn nhau giữa các dao động IR và Raman trong các phân tử, tuy nhiên, vẫn có sự chồng chéo giữa phổ IR và phổ Raman. Vì vậy việc lựa chọn dải phổ đặc trưng cho các loại dao động này là rất quan trọng. Tóm lại dao động đối xứng kéo dài hoặc thu hẹp của các đám mây điện tử là dao động Raman mà không phải IR. Còn các dao động uốn, rung động

12

không đối xứng (kể cả thay đổi momen lưỡng cực mà không kèm theo sự thay đổi lớn trong các điện tử) thì hoạt động IR rất mạnh nhưng Raman lại yếu. Cả hai loại phổ này được đặc trưng bởi các đỉnh sắc nét, rõ ràng trên phổ đồ. 1.2.2. Thuyết lượng tử của hiệu ứng Raman [28] Mặc dù thuyết cổ điển giúp chúng ta dễ hình dung về hiệu ứng Raman nhưng có vài yếu tố mà một mình thuyết cổ điển không thể giải thích được; chỉ thông qua thuyết lượng tử chúng ta mới có thể giải thích hoàn toàn hiện tượng này. Ví dụ, thuyết cổ điển không giải thích được sự khác nhau giữa năng lượng photon trong tán xạ Stokes và photon trong tán xạ đối Stokes. Để làm rõ hiệu ứng Raman bằng thuyết lượng tử, chúng ta hãy theo dõi sự thay đổi các mức năng lượng của phân tử như trên hình 1.6.

Hình 1.6. Cơ chế thay đổi mức năng lượng của tán xạ Stokes và tán xạ đối Stokes Khi ánh sáng tới tương tác với phân tử, từ các mức năng lượng ban đầu (m hoặc n), phân tử bị kích thích lên mức năng lượng cao hơn là r (trạng thái kích thích này chỉ là trạng thái kích thích các dao động trong phân tử hoặc thay đổi hình dạng các đám mây electron mà không làm thay đổi vị trí của chúng như phổ UV-VIS). Tiếp theo, phân tử sẽ bức xạ ra các photon để chuyển năng lượng về trạng thái n hoặc m tương ứng (nếu ban đầu nó ở trạng thái m thì sẽ chuyển sang trạng thái n và ngược lại).

13

Theo công thức lượng tử hóa học thì tổng cường độ ánh sáng Imn của tán xạ Raman tương ứng với sự chuyển mức năng lượng từ trạng thái m sang trạng thái n mà người ta biểu diễn ở phương trình sau: Imn =

(

i

±

mn)

4

Ii

αpσ

2

(1.6)

Trong công thức trên Ii là cường độ của ánh sáng tới (có tần số dao động i);

αpσ là hệ số phân cực của thành phần σ. Công thức trên diễn tả diễn tả

cường độ tán xạ Raman tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng tới I i, tỷ lệ lũy thừa bậc bốn của hiệu tần số

i

±

mn

và bình phương của hệ số phân cực αpσ.

Hệ số (αpσ)mn được tính theo công thức ( 1.7)

Trong công thức trên, r bao gồm tất cả các giá trị lượng tử riêng của phân tử; vrm là tần số chuyển tiếp từ m đến n; , ,… là các thành phần của momen lưỡng cực điện; µplà một momen lưỡng cực điển p, Γ là năng lượng giảm từ trạng thái r. Phương trình này là một công thức quan trọng để giải thích tán xạ Raman và nó được biết như là “phương trình của tán sắc Kramers-Heisenberg-Dirac”. 1.3.

Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman

1.3.1. Nguyên tắc hoạt động [6] Mẫu phân tích sau khi được kích thích bởi bức xạ laser sẽ phát ra ánh sáng tán xạ. Tán xạ Raman được thu lại cùng với các bức xạ khác qua hệ kính hiển vi và đưa tất cả các bức xạ này cùng vào hệ quang. Hệ quang sẽ phân tách và loại bỏ các bức xạ tạp, chọn lọc và đưa tín hiệu Raman vào dectector.

14

Detector ghi lại các tín hiệu Raman, sau đó thông qua bộ phận xử số liệu, các tín hiệu quang được biến đổi thành tín hiệu điện tử và cho ta phổ Raman của mẫu phân tích. 1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo cơ bản Máy quang phổ Raman được phát triển bởi nhiều công ty, nhiều hãng sản xuất khác nhau. Nhưng về cơ bản nó bao gồm năm bộ phận sau: Nguồn laser, bộ phận đựng mẫu, quang phổ kế, detector, hệ quang. Hình 1.9 mô tả các bộ phận cơ bản của máy quang phổ Raman.

Hình 1.7: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman 1.3.2.1. Nguồn laser [11], [28] Khi sử dụng nguồn laser kích thích, vấn đề quan trọng nhất được đặt ra đó là nó có gây ra hiện tượng huỳnh quang đối với mẫu phân tích hay không. Trong trường hợp khả năng xảy ra huỳnh quang cao thì laser NIR sẽ là sự lựa chọn thích hợp. Có nhiều loại laser với bước sóng đủ cao để giảm bớt hiện tượng huỳnh quang nhưng nguồn laser hay được dùng nhất là nguồn laser xung quang vùng 780 nm. Đây là loại laser được tạo ra dựa trên sự phát

15

quang từ các nút bán dẫn. Loại nguồn laser này thường được thiết kế nhỏ gọn, giá thành rẻ và có khả năng kích thích được cho nhiều loại mẫu khác nhau. Vì vậy mà loại laser này ngày càng được phổ biến trong các máy quang phổ Raman, nhất là trong các máy quang phổ Raman cầm tay. Một loại laser khác được sử dụng đó là laser Nd: YAG (Neodymium-YAG), nguồn laser này cho bước sóng 1064 nm và thường được sử dụng trong các máy FT-Raman. [11], [28] Đối với những mẫu phát huỳnh quang yếu thì người ta sử dụng các nguồn laser với bước sóng khoảng 470-650 nm. Các nguồn laser này thường dựa trên ion Ar+. Có một số loại khác được dùng đó là laser He-Ne hoặc Kr+. Tất cả các loại này đều có thể cung cấp một nguồn laser với công suất lớn, dễ xảy ra hiện tượng phá hủy mẫu khi đo. [11] Các tính năng chính của hai nhóm laser trên đó là: Nguồn laser với bước sóng kích thích trong vùng nhìn thấy thường cho tín hiệu tốt hơn (hệ số signal-to-noise: S/N cao hơn), do đó tín hiệu dễ phát hiện hơn bởi vì dòng photon Raman mạnh, nhờ thế mà detector đi cùng với nó thường đơn giản và có giá thành rẻ. Tuy nhiên, sử dụng nguồn laser này có một số nhược điểm là có thể xảy ra hiện tượng huỳnh quang làm che phủ tín hiệu Raman và vì năng lượng lớn nên mẫu phân tích dễ bị phá hủy. Đối với nguồn laser kích thích trong vùng NIR thì cho tín hiệu Raman thấp hơn trên Detector vì vậy mà detector cần phải tinh vi và được tối ưu hóa. Các thiết bị sử dụng với nguồn laser này ít nhạy hơn các thiết bị sử dụng với laser trong vùng nhìn thấy. Nhưng bù lại, tín hiệu đường nền có xu hướng thấp hơn, vì vậy việc ghi tín hiệu Raman dễ dàng hơn. [28] Với những phân tích trên, laser NIR thường được dùng cho các mẫu sinh học. Bởi vì các thành phần của mẫu thường phát huỳnh quang và nó làm giảm nguy cơ phá hủy mẫu. Ngược lại, do có độ nhạy cao hơn với trang thiết bị đơn

16

giản hơn, laser với nguồn kích thích trong vùng nhìn thấy được sử dụng để phân tích các nguyên vật liệu không có bản chất sinh học, nhất là công nghệ dược phẩm và trong các điều kiện sản xuất đặc biệt, thực phẩm chức năng. Ngoài hiệu quả sử dụng, các vấn đề an toàn cho người sử dụng đang được quan tâm và nó định hướng cho sự phát triển của các loại nguồn laser hiện đại. Bảng 1.1. Một số loại nguồn laser sử dụng trong công nghệ dược phẩm [29] Nguồn

Loại

laser (nm)

Công suất

Dải Raman

nguồn

(cm-1)

Chú thích

NIR laser 1064

Dạng

rắn Lên tới 3 W

1075-1563

(Nd:YAG) 830

785

Diode

Diode

Thường được sử dụng với thiết bị FT-Raman

Lên tới 300 827-980

Ít phổ biến hơn các nguồn

mW

laser khác

Tới 500 mW

791-1027

Được sử dụng rộng rãi nhất

VIS Laser 632.8

He-Ne

Tới 500 mW

637-781

Nguy cơ huỳnh quang thấp

532

Doubled

Tới 1 W

535-632.8

Nguy cơ huỳnh quang cao

Ar+

Tới 1 W

517-608

Nguy cơ huỳnh quang cao

488-632.8 Ar+

Tới 1 W

490-572

Nguy cơ huỳnh quang cao

(Nd:YAG) 514.5

17

1.3.2.2. Thiết bị đựng mẫu [29] Phương pháp phân tích quang phổ Raman được xem như là một phương pháp phân tích nhanh, không cần chuẩn bị mẫu. Nên có thể thu phổ Raman trực tiếp trên bề mặt mẫu qua đầu đo nhanh, đo mẫu bên trong các bao bì lớn thông qua các đầu dò quang học; đo mẫu lỏng bằng curvet; đo mẫu rắn, mẫu viên bằng thiết bị giữ mẫu… Việc lựa chọn các thiết bị lấy mẫu thường được quyết định bởi bản chất của mẫu phân tích. Tuy nhiên, khi lấy mẫu cần phải cân nhắc khối lượng mẫu, tốc độ đo, độ an toàn của nguồn laser, độ tái lặp của phép đo để tối ưu hóa các thiết bị lấy mẫu nhằm thu được tín hiệu Raman tốt nhất.[29] Có một số thiết bị hỗ trợ đo mẫu đi kèm với máy quang phổ Raman như sau:

Hình 1.8. Đầu đo kéo dài giúp đo mẫu bên trong các bao bì đựng lớn, trong môi trường độc hại.

Hình 1.9. Đầu đo nhanh giúp đo trực tiếp các mẫu đơn giản

18

Hình 1.10. Bộ phận đựng mẫu hỗ trợ đo các mẫu dạng lỏng, mẫu viên 1.3.2.3. Quang phổ kế [11], [28] Cũng như các loại quang phổ kế khác, quang phổ kế trong máy Raman có chức năng chính là phân tách ánh sáng dựa theo bước sóng (hoặc số sóng) được thể hiện trên phổ đồ Raman. Có hai loại quang phổ kế đó là: quang phổ kế phân tán và quang phổ kế không phân tán. Quang phổ kế phân tán dựa trên sự nhiễu xạ của các bức xạ tán xạ thông qua hệ cách tử. Các quang phổ kế này được sử dụng cùng với các nguồn laser kích thích từ vùng VIS đến 785 nm. Đặc điểm chính của loại quang phổ kế này là rất nhạy (tỷ lệ S/N cao), vì thế thiết bị không cần sử dụng nguồn laser có năng lượng cao và các bộ phận của nó không cần phải di chuyển trong quá trình đo. Tuy nhiên, thiết bị này có hạn chế là độ phân giải ở các vùng khác nhau trên phổ đồ không đồng đều. Các loại quang phổ kế này khá phổ biến và được sử dụng rộng rãi, chúng được sản xuất theo một vài cách đơn giản và mang lại hiệu quả cao. Vấn đề lớn của các quang phổ kế này làm ảnh hưởng đến hiệu quả của máy quang phổ đó là ánh sáng lạc. Phần lớn bắt nguồn từ ánh sáng laser của nguồn kích thích truyền đến hệ thống quang học. Khi cường độ nguồn mạnh hơn nhiều so với tán xạ Raman thì chúng ta không thể phát hiện được tín hiệu Raman. Để loại bỏ tín hiệu này, người ta phải sử dụng

19

nhiều hệ thống lọc khác nhau để không cho ánh sáng kích thích truyền đến detector. [11] Hiệu năng của quang phổ kế phân tán được quyết định bởi độ phân giải của máy và các đại lượng: độ rộng dải phổ, tần số f, khả năng truyền tải và hiệu quả loại bỏ ánh sáng lạc (nó đặc biệt quan trọng trong việc phân tích ở vùng có số sóng thấp < 200 cm-1). [28] Quang phổ kế không phân tán hầu hết được kết hợp với thiết bị biến điệu FT (Fourier transform) của tín hiệu và nó cần phân tách số sóng bằng phương pháp vật lý. Các quang phổ kế này thường được sử dụng trong các thiết bị FTRaman với bước sóng kích thích ở 1064 nm. Lợi thế lớn nhất của thiết bị này là các số sóng có độ chính xác cao trên phạm vi rộng. Vì vậy, các thiết bị thường được sử dụng để định tính các chất hoặc để phát hiện các thay đổi nhỏ trên Raman shift. Tuy nhiên, thiết bị này có độ nhạy tương đối thấp so với quang phổ kế phân tán. [28] 1.3.2.4. Detector Trong quá trình phát triển của công nghệ Raman, đã có một số loại detector được đưa vào sử dụng như máy đếm photon, photodiode array, nhưng detector CCD được sử dụng rộng rãi nhất trong các thiết bị Raman hiện đại. Vì vậy, chúng ta sẽ tập trung tìm hiểu về detector CCD. CCD có bản chất là một chất bán dẫn silicon, được sắp xếp như một dải các yếu tố cảm quang. Nó tạo ra các quang điện tử, mỗi quang điện tử như một tải nhỏ để lưu giữ tín hiệu quang truyền đến. Các tải quang được lưu trữ trên các pixel ảnh riêng biệt, theo đó, các tải này từ mỗi hàng được di chuyển lên hàng cao hơn. Các tải trên các pixel ở hàng trên cùng được chuyển từ trái sang phải và được đọc bởi bộ chuyển đổi từ tín hiệu quang sang tín hiệu số. Quá trình chuyển đổi như vậy là quá trình thu các tín hiệu tự do và hầu hết tất cả các tín hiệu này được tập trung lại tạo nên tín hiệu được đọc bởi CCD ở

20

đầu ra. Để đọc được toàn bộ các tín hiệu trên toàn vùng, hàng trên cùng được đọc trước bằng cách di chuyển từng vị trí từ trái sang phải, sau khi đọc xong hàng đó, hàng dưới lại được chuyển lên và quá trình trên được lặp lại. [11]

Hình 1.11. Sơ đồ một detector CCD Các CCD hiện nay thường được có định dạng nhiều hơn 1024 x 1024 pixel, với tổng diện tích lên tới 25 mm2. Ưu điểm chính của CCD so với các detector đa kênh khác là độ nhiễu thấp, hiệu suất lượng tử cao và độ nhạy trong phạm vi bước sóng rộng (120-1000 nm). Detector CCD thường sử dụng cùng với nguồn kích thích là laser NIR trong các thiết bị FT-Raman. [5] 1.3.2.5. Hệ quang Tùy thuộc vào cách kích thích ánh sáng và cách thu tín hiệu từ mẫu mà hệ quang có các cấu hình 1800, 900 hoặc có thể sử dụng sợi quang để kích thích và thu tín hiệu Raman. [11], [28] Trong cấu hình 1800, các chùm tia laser và chùm ánh sáng tán xạ nằm trên cùng một trục. Có nhiều cách kết hợp gương và thấu kính để tạo thành hệ

21

thống này. Cấu hình này đang được sử dụng rộng rãi bởi vì không cần thiết phải điều chỉnh thêm chùm laser và bộ phận thu tín hiệu quang. Cấu hình 900 tạo ra một góc giữa chùm kích thích và chùm tán xạ thu được. Cấu hình này không có nhiều ý nghĩa thực tế. [28]

Hình 1.12. Cấu hình 90o(a) và cấu hình 180o(b) Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ cáp quang từ những năm 1990 trở lại đây, đã mang lại nhiều lựa chọn trong việc cung cấp và thu thập ánh sáng. Tín hiệu Raman hoặc tín hiệu laser trong khoảng từ 500-1000 nm rất phù hợp và hoàn toàn có thể ứng dụng các sợi quang cho phản xạ toàn phần giữa lõi và lớp vỏ của nó. Điều này làm giảm thiểu sự hấp thu trong quá trình truyền ánh sáng ngay cả trong sợi quang rất dài. Trên thực tế, người ta thường sử dụng sợi quang đa chế độ, loại sợi này tuy khá cồng kềnh với đường kính từ 50-600 µm nhưng lại rất thuận tiện để kết hợp tia laser với thiết bị thu thập tán xạ. Khi sử dụng thiết bị này, chúng ta đồng thời phải thực hiện hai việc:

22

thu tán xạ Raman và loại bỏ ánh sáng lạc. Do đó cần phải sử dụng thêm các thiết bị bổ sung để thu thập các tán xạ cần thiết và loại bỏ những yếu tố ảnh hưởng đến phép đo. Các đầu dò quang học này có lợi thế lớn là có thể đo được tín hiệu Raman từ khoảng cách khá xa hoặc thu tín hiệu Raman từ trong lòng các bao bì đựng mẫu lớn, trong lòng chất lỏng, trong môi trường độc hại. [28] Hiện nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học công nghệ, các máy quang phổ Raman được phát triển với hiệu lực phân tích cao và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học khác nhau. Các máy quang phổ Raman để bàn cho phép phân tích có độ chính xác cao, dải phổ rộng, độ phân giải tốt; máy quang phổ Raman cầm tay thì có kết cấu nhỏ gọn, phù hợp với việc đo mẫu tại hiện trường. Một số máy quang phổ Raman đang được thương mại hóa đó là:

Hình 1.13. Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng Renishaw.

23

Hình 1.14. Máy quang phổ Raman cầm tay hãng NanoRam®

Hình 1.15. Máy quang phổ Raman cầm tay TruScan RM của hãng Thermo Scientific

24

Hình 1.16. Kết quả định tính của một mẫu từ máy Raman cầm tay 1.4.

Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman

1.4.1. Ưu điểm [1], [11], [14], [28]  Các phương pháp phân tích thông thường thường hay đi đôi với việc chuẩn bị mẫu như nghiền, hòa tan, lắc siêu âm, lọc, chiết, tách… đôi khi rất mất công mà lại còn làm ảnh hưởng đến bản chất của chất phân tích. Ví dụ như việc nghiền mẫu dẫn đến thay đổi một số trạng thái rắn như trạng thái ngậm nước, dạng đa hình, và các liên kết hydro. Phương pháp phân tích quang phổ Raman hầu như không yêu cầu việc chuẩn bị mẫu, vì vậy mà tiết kiệm về thời gian, không cần sử dụng thêm các dụng cụ bổ trợ khác, tiết kiệm công sức và tiết kiệm chi phí.  Có thể đo phổ Raman trực tiếp xuyên qua các bao bì đựng, các chai lọ thủy tinh, các vỏ bao film… mà không cần phải xâm lấn vào các cấu tạo bên trong mẫu, không làm hỏng cấu tạo của thành phẩm, ảnh hưởng đến mẫu đo và vì vậy, không làm gián đoạn hoặc gây hao phí trong quá

25

trình suẩn xuất. Điều này rất thuận tiện trong việc theo dõi và kiểm soát chất lượng sản phẩm trong các khâu của quá trình sản xuất dược phẩm.  Phương pháp quang phổ Raman có thể phân tích được chỉ với một lượng mẫu nhỏ. Điều này rất quan trọng trong việc đánh giá sự đồng nhất của mẫu đo, phân tích để phát hiện các chất chỉ với một lượng mẫu nhỏ. Ngoài ra, nó còn có ý nghĩa trong quá trình theo dõi các phản ứng hóa học, bởi vì ở giai đoạn đầu của phản ứng thì sản phẩm tạo ra là rất ít và khó để nhận biết được.  Phép phân tích vừa đơn giản, không phải chuẩn bị mẫu và vừa cho kết quả nhanh. Điều này giúp tiết kiệm thời gian phân tích, do đó chúng ta sẽ sớm có kết luận trong các phép phân tích định tính xác định mẫu đo; còn trong sản xuất dược phẩm thì việc cho kết quả sớm giúp chúng có những điều chỉnh kịp thời nhằm được những sản phẩm như ý muốn.  Việc đo quang phổ Raman khá dễ dàng, vì vậy việc đào tạo để sử dụng được một thiết bị quang phổ Raman sẽ rất đơn giản, áp dụng được cho nhiều loại đối tượng phổ thông khác nhau mà không nhất thiết phải có kiến thức chuyên sâu. Việc sử dụng dễ dàng như vậy giúp máy quang phổ Raman ngày càng được phổ cập hơn, phương pháp phân tích phổ Raman được ứng dụng trong nhiều ngành nghề khác nhau hơn, nhất là trong công tác Hải quan và Pháp y, những ngành cần phải cho kết quả sàng lọc nhanh, độ tin cậy cao.  Sự ra đời của thiết bị FT-Raman với độ lặp lại cao tạo điều kiện cho sự phát triển các đầu thu có khẩu độ lớn, cho phép tia laser tập trung được vào một lượng mẫu lớn hơn, tín hiệu Raman thu được nhiều hơn, và chúng ta phân tích được một lượng mẫu lớn hơn khi cần thiết.  Nước hấp thu tán xạ Raman kém, vì vậy rất thuận tiện cho việc đo phổ của các chất ở dạng dung dịch trong nước.

26

 Đầu dò sợi quang sử dụng công nghệ của cáp quang giúp kích thích và thu tín hiệu Raman ở một khoảng cách xa, ở trong những điều kiện độc hại, đo mẫu trong lòng của bao bì đựng lớn, điều kiện môi trường có nhiệt độ cao… Khi nói đến phổ dao động phân tử, quang phổ Raman và IR luôn có quan hệ mật thiết với nhau, có tính chất bổ sung cho nhau trong trong các phép phân tích xác định cấu trúc phân tử. So với phương pháp quang phổ IR thì phương pháp phân tích phổ Raman có một số lợi thế hơn như sau:  Đối với các hợp chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí, cho vào ống thủy tinh nút kín rồi thu phổ Raman, trong phổ IR thì ống thủy tinh hấp thụ bức xạ IR.  Đo phổ trong dung dịch nước trong Raman dễ hơn IR, vì nước có tán xạ Raman rất yếu, trong khi nước cho phổ hồng ngoại mạnh.  Các máy quang phổ Raman bộ phận kích thích thường trang bị cùng thấu kính hiển vi, giúp phân tích tập trung hơn nên chỉ cần một mẫu diện tích nhỏ là có thể thu nhận được phổ, quang phổ hồng ngoại không có tính chất này.  Nhờ bước sóng laser kích thích ngắn hơn là bước sóng trong vùng hồng ngoại nên tia laser có khả năng đâm xuyên cao hơn, thu được tín hiệu từ sâu bên trong mẫu hơn, bên cạnh đó, cũng do nước và thủy tinh không hấp thụ phổ Raman mà phương pháp quang phổ Raman có thể dùng để định lượng chất rắn trong viên, chất lỏng trong dung dịch nước. Phổ IR không có được điều này và nó chủ yếu là dùng để định tính.

27

1.4.2. Nhược điểm và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình đo phổ [1], [14], [28], [29] Tuy đã được phát triển từ rất lâu, có rất nhiều ưu điểm, nhưng chi phí cho các thiết bị quang phổ Raman còn rất cao, nên nó rất khó để được sử dụng rộng rãi như một phép phân tích thông thường. Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến phép đo phổ Raman đó là hiện tượng huỳnh quang, sự nóng lên của mẫu đo, sự hấp thụ phổ Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu và ảnh hưởng của độ phân cực. Nếu nền mẫu đo cho huỳnh quang, tín hiệu của phép đo sẽ có những thành phần huỳnh quang trong đó. Tín hiệu huỳnh quang xuất hiện khi bước sóng laser kích thích trùng lặp với một dải hấp thụ của mẫu đo. Huỳnh quang thường phủ lên tín hiệu Raman, nó như là một nền dốc khá phẳng, có thể gây ra một đường nền ảo với độ nhiễu thấp và làm giảm tỉ lệ S/N của các tín hiệu Raman. Dải bước sóng và cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần hóa học của vật liệu phát huỳnh quang. Bởi vì tín hiệu huỳnh quang thường mạnh hơn tín hiệu Raman nên chúng thường bao phủ và làm suy giảm đáng kể tín hiệu Raman. Muốn triệt tiêu hoặc hạn chế huỳnh quang chúng ta thường sử dụng các detector vùng NIR. Tuy nhiên, việc giảm tín hiệu huỳnh quang bằng cách sử dụng nguồn laser kích thích có bước sóng dài một phần nào đó cũng làm giảm cường độ của tín hiệu Raman. Chính vì vậy để tỷ lệ S/N của tín hiệu lớn nhất, chúng ta phải tính toán để cân bằng giữa các yếu tố: loại bỏ huỳnh quang, cường độ phát hiện và sự đáp ứng của detector. Huỳnh quang chất rắn đôi khi được giảm thiểu bằng cách chiếu bức xạ laser vào mẫu đo một khoảng thời gian trước khi đo. Quá trình này được gọi là photobleaching, nó là quá trình làm giảm các loại hấp thụ cao. Photobleaching kém hiệu quả hơn trong chất lỏng, nơi có các mẫu di động.

28

Quá trình chiếu laser kích thích, có thể làm nóng mẫu và gây ra một loạt các ảnh hưởng như làm thay đổi trạng thái vật lý của mẫu (nóng chảy), chuyển đổi dạng thù hình, đốt cháy hoặc làm phân hủy mẫu. Nguy cơ làm nóng mẫu tăng khi công suất nguồn laser lớn hoặc kích thước của nguồn laser càng nhỏ (độ tụ cao) trong trường hợp sử dụng thấu kính hội tụ. Vấn đề này thường xảy ra với các chất màu, chất hấp thụ ánh sáng tốt hoặc các hạt nhỏ có khả năng truyền nhiệt kém. Những ảnh hưởng của việc làm nóng mẫu lên quá trình thu phổ Raman có thể nhận ra khi quan sát trực tiếp mẫu đo hoặc qua quan sát phổ đồ. Một số cách đơn giản làm giảm sự nóng lên của mẫu đó là giảm thông lượng tia laser, di chuyển mẫu hoặc chùm laser trong quá trình đo, tăng tính truyền nhiệt của mẫu bằng cách cho tiếp xúc với các vật dẫn nhiệt tốt. Sự hấp thụ các tín hiệu Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu đo cũng có thể xảy ra. Tuy việc sử dụng laser NIR để kích thích cùng với hệ thống FT-Raman làm giảm hiện tượng huỳnh quang, nhưng chính việc sử dụng laser NIR lại ảnh hưởng lớn đến sự thu tín hiệu Raman. Các ảnh hưởng này nhiều hay ít phụ thuộc vào hệ quang của máy quang phổ Raman và phụ thuộc vào bản chất của mẫu đo. Tuy nhiên, sự ảnh hưởng này không quá nặng nề như trong việc đo phổ hấp thụ NIR bởi vì với bước sóng dài thì độ xâm nhập vào bên trong mẫu đo của chùm laser là ít, tín hiệu Raman thu được chủ yếu là từ lớp mỏng ngoài cùng và vì lớp này mỏng nên độ hấp thụ tín hiệu Raman là không đáng kể. Cuối cùng, chúng ta cần phải nhớ rằng bức xạ laser là phân cực, vì vậy phổ Raman của mẫu tinh thể cũng như các mẫu có cấu trúc định hướng có thể khác nhau phụ thuộc vào cách mà chúng được tạo thành.

29

Chương II. ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC 2.1.

Phân tích định tính [29] Cũng như quang phổ IR, phổ Raman là phổ dao động phân tử, nó mang

thông tin về các nhóm chức của mẫu, vì vậy dựa vào phổ thu được mà người ta xác định được chính xác nhóm chức của chất và từ đó xác định cấu trúc của mẫu. Có các phương pháp định tính hay dùng đó là:  Đo phổ Raman, kết hợp với phổ IR để tìm các nhóm chức đặc trưng, xác định cấu trúc của chất.  Đo phổ Raman, so sánh với phổ chuẩn trên thư viện phổ và kết luận sự có mặt hay không có mặt của chất phân tích.

30

Hình 2.1. Công thức hóa học và phổ Raman của một số tá dược thường dùng và một số API 2.2.

Phân tích định lượng [28]

Cơ sở để phân tích định lượng Raman là cường độ tín hiệu Raman từ mẫu phân tích sẽ tăng tương ứng với sự tăng lên của lượng chất cần thăm dò trong mẫu, trong khi các yếu tố khác không thay đổi (cường độ tăng khi nồng độ chất phân tích tăng lên). Về nguyên tắc, điều này được xác định thông qua tín hiệu tán xạ Raman (trong thí nghiệm) cho bất kỳ thành phần nào của hợp chất và xác định nồng độ thành phần ấy trong mẫu thông qua việc đo tín hiệu Raman của đỉnh đặc trưng cho thành phần ấy [11]. Thật vậy, người ta có thể xác định được nồng độ của mẫu cần đo bằng việc so sánh phổ của chất phân

31

tích với đường cong tương quan đã được xác định từ trước. Đường cong này được xây dựng bởi việc đo phổ của mẫu chuẩn với các thành phần đã được biết đến. Ví dụ như để định lượng các dạng thù hình của Indomethacin, sử dụng tỷ lệ cường độ đỉnh ở 1698 cm-1(tinh thể) đến 1680 cm-1 (vô định hình) với đường cong tương quan đã được xây dựng từ trước [14]. Bảng 2.1. Tổng quan về một số quy trình định lượng dược phẩm bằng phổ Raman đã được công bố từ năm 2002-2006

Hợp chất

Dạng bào chế

Quang phổ Phân tích

TLTK

kế

dữ liệu

Viên nén

FT

M

[26]

Acyclovir

Vỉ

FT

U

[25]

Ambroxol

Viên nén

FT

M

[27]

Ambroxol

Viên nén

M

[9]

Calcitonin

Dạng bột

U

[30]

Acetylsalicylic acid, acetaminophen

Captopril,

Kỹ thuật phân tán Kỹ thuật phân tán

Viên nén

FT

M

[14]

Carbamazepine

Vỉ

FT

M và U

[23]

Chlorophenicol

Chất rắn (xác định dạng

palmitate

thù hình)

FT

U

[8]

Dipyrone

Viên nén

FT

U

[10]

prednisolone

32

Diltiazem

Viên nén

FT

U

[31]

Indomethacin

Viên nén

FT

M

[15]

Mannitol

Bột

FT

M

[4]

Mannitol

Bột

FT

U

[22]

Bột

FT

M

[21]

Paracetamol

Bột

FT

U

[3]

Ranitidine

Viên nén

FT

M

[17]

Bột

FT

M

[7]

hydrochloride

Nitrofurantonin, theophylline, caffeine, carbamazenine

5-p-Fluorobenzoyl2benzimidazolecarb amic acid, methyl ester Trong đó : U và M tương ứng là các dữ liệu phân tích đơn biến và đa biến Mặc dù về nguyên tắc thì phương pháp định lượng bằng quang phổ Raman không hề phức tạp hơn các phương pháp thông thường khác, nhưng có rất nhiều thách thức về kỹ thuật đo cần được giải quyết. Ví dụ như cường độ tín hiệu thu được có thể thay đổi khi chỉ cần một sự thay đổi nhỏ của một trong nhiều thông số của trang thiết bị đang sử dụng (công suất laser, khoảng cách từ vị trí đặt mẫu tới nguồn laser, …), vì vậy các tín hiệu tuyệt đối từ cùng một mẫu đo trên cùng một thiết bị sẽ thay đổi ít nhất một vài phần trăm

33

nếu có một bộ phận nào đó được lấy ra và thay thế, thậm chí nếu đo mẫu trong cùng một ngày thì tín hiệu đo của buổi sáng và buổi chiều đã có sự khác nhau mặc dù các yếu tố khác không thay đổi. Vì vậy mà khi có vấn đề về sự lặp lại của phép đo thì người ta rất hiếm khi sử dụng nó trong định lượng. [28] Nhưng vấn đề này được giải quyết dễ dàng bằng cách đo các dải tín hiệu cần thiết cùng với các dải tín hiệu khác trong mẫu, và so sánh tỷ lệ của chúng với nhau vì khi thực hiện như vậy thì các dải sẽ cùng tăng hoặc cùng giảm tín hiệu nhưng tỷ lệ của chúng thì không thay đổi và không làm ảnh hưởng đến kết quả đo. Điều này rất thuận lợi trong phân tích các thành phần trong công thức dược phẩm, thông thường một công thức thành phẩm sẽ gồm nhiều thành phần khác nhau. Ví dụ, khi phân tích quang phổ Raman của viên nén, các tín hiệu Raman của tá dược đều làm ảnh hưởng đến tín hiệu của dược chất trên phổ đồ, vì vậy mà khi định lượng dược chất trong viên, người ta thường chọn dải phổ đặc trưng cho dược chất, sau đó chọn dải phổ đặc trưng cho nền tá dược và cuối cùng so sánh tỷ lệ cường độ của các dải phổ này với nhau để đánh giá hàm lượng thuốc trong viên. Hình 2.1 cho thấy sự thay đổi về tỷ lệ cường độ giữa các dải phổ của manitol và acid salicylic khi thay đổi nồng độ của acid salicylic từ 0% đến 15%. [28]

34

Hình 2.2. Tỷ lệ cường độ tín hiệu của hợp chất Trong một vài cách tiếp cận khác, người ta đưa ra phương pháp khác là phương pháp thêm chất phân tích khác (chất chuẩn nội), có cường độ tín hiệu Raman lớn hơn, sắc nét hơn và có dải tín hiệu không ảnh hưởng đến dải phổ của chất phân tích đang xét để thuận tiện cho việc khảo sát. Tuy nhiên điều này là không cần thiết, và nhiều khi nó còn làm ảnh hưởng đến hiệu quả phân tích. Có hai phương thức tiếp cận để thu được dữ liệu phổ định lượng, đó là phương thức phân tích dữ liệu đơn biến và phân tích dữ liệu đa biến. Trong phương thức thu dữ liệu đơn biến truyền thống, người ta thường đo cả chiều cao và diện tích píc của vùng dữ liệu đặc trưng được quan tâm để so sánh với chiều cao và diện tích píc của chất chuẩn, sau đó tính toán tỉ lệ tương đối của các thành phần để dự đoán và xây dựng cấu trúc của mẫu thử.

35

Hiện tại, phương pháp này vẫn đang được sử dụng bởi những ưu điểm không thể phủ nhận của nó đó là phép phân tích đơn giản và cho độ chính xác khá cao. Tuy nhiên, ngày nay phương pháp phân tích dữ liệu đa biến được sử dụng rộng rãi hơn. Phương pháp phân tích dữ liệu đa biến giúp ta xác định được những biến đổi trên toàn bộ phổ đồ (hoặc một dải nào đó trong phổ đồ). Kiểu phân tích phổ tổng hợp từ nhiều điểm trên toàn bộ phổ đồ mang lại sự khác biệt cho phương pháp này vì nó làm giảm độ nhạy của tín hiệu nhiễu trên tất cả các điểm. Trong kỹ thuật này, cách thức thu dữ liệu từ quang phổ Raman cũng tương tự với cách thu dữ liệu từ quang phổ NIR. Bên cạnh đó quang phổ NIR đang được phát triển mạnh mẽ, đây là động lực lớn để thúc đẩy kỹ thuật này phát triển để phần mềm xử lý ngày càng tiện dụng hơn cũng như mang lại hiệu quả sử dụng cao hơn. Phương pháp đòi hỏi rất nhiều phép tính toán phức tạp, nhưng sự phát triển của công nghệ thông tin cùng với các tính năng ưu việt của máy tính ngày nay giúp cho việc tính toán trở nên dễ dàng và cho kết quả trong thời gian ngắn đã giải quyết được tất cả các vấn đề trên, chính vì vậy mà nó đã xóa bỏ mọi rào cản trong việc phát triển công nghệ phân tích dữ liệu đa biến. 2.3.

Ứng dụng chung của phương pháp phân tích phổ Raman trong ngành dược [19], [28], [31] Từ khi phương pháp Raman xuất hiện, trên lý thuyết người ta đã mong

muốn phát triển ứng dụng cho cả định tính và định lượng. Nhưng giai đoạn trước khi có sự xuất hiện của nguồn sáng kích thích laser, thời gian để thu được quang phổ phải tính theo giờ, nên hoàn toàn không thực tế khi sử dụng tán xạ Raman, thay vào đó người ta đã sử dụng các kỹ thuật phân tích thông thường. Với sự phát triển của công nghệ laser và sự ra đời hệ thống quang phổ kế/detector đã giúp thu được tín hiệu của Raman ở dải phổ rộng với độ

36

nhạy và độ chính xác cao. Sau đó công cụ biến đổi Fourier hay quang phố kế đã sử dụng detector đa kênh (chủ yếu dùng CCD) không những giảm đáng kể thời gian ghi lại quang phổ mà còn giúp cho người sử dụng có thể thao tác dữ liệu trên hệ thống kỹ thuật số và làm đơn giản hóa các quá trình loại trừ tín hiệu nhiễu và trừ nền. Ngoài ra kỹ thuật FT còn có thể sử dụng với bước sóng kích thích dài hơn các thiết bị quang phổ kế trước đó nhằm mục đích làm giảm tín hiệu huỳnh quang một cách đáng kể. [28] Ngoài những ứng dụng rất quan trọng trong định tính, quang phổ Raman cũng được sử dụng trong các kỹ thuật phân tích định lượng dược phẩm và kỹ thuật này đã có những bước thay đổi đáng kể từ một thập kỷ trước. Ngày nay, các thiết bị Raman đã được cải thiện về rất nhiều về tính năng cũng như hình thức để hóa phù hợp để sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau, nhất là trong dược phẩm. Một tính năng hữu ích quan trọng của quang phổ Raman là khả năng đo trực tiếp trên chất rắn. Các thông số ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu Raman thu được từ chất rắn là kích thước hạt và mật độ dược chất trong viên. [31] Quang phổ Raman đang trở nên phổ biến trong các lĩnh vực khác nhau của ngành Dược. Cũng như quang phổ IR, nó cũng cung cấp các thông tin về dải dao động cơ bản (vùng vân tay), cung cấp các phép phân tích định tính với độ chính xác cao. Nó cũng là phương pháp bổ sung cho những phương pháp phân tích hiện có như NMR, MS và các phép phân tích nguyên tố khác. Việc xác định nhanh các hợp chất trong hỗn hợp thuốc, các hoạt chất và tá dược; việc xác định các chất gây ô nhiễm, việc xác định các đặc tính về cấu trúc của nguyên liệu và các thông tin về các thành phần trong các quá trình pha trộn tạo nên công thức thuốc… có thể được làm sáng tỏ thông qua kỹ thuật phổ Raman. Sau đây là một số ứng dụng của quang phổ Raman trong ngành Dược.

37

Một số dược phẩm đã được nghiên cứu bởi phương pháp quang phổ Raman như Acebutolol, Alprenolol, Acetaminophen, Amilorid, Amoxycillin, Amphetamin và / hoặc các hợp chất liên quan, Amphotericin A / B, Arterenol, Aspirin, Bucindolol, Canxi cacbonat và glycin, Cimetidin, Ciprofloxacin, Cocain,

Diclofenac,

Nicotinamid,

Fluconazol,

Spironolacton,

Fluocortolon,

Strychnin,

Ibuprofen,

Sulfamerazin,

Isosorbid, Sulfadiazin,

Triamteren, Trifluoperazin. [19] Để kiểm soát hoạt động sản xuất dược phẩm đòi hỏi phải biết các tính chất vật lý cũng như tính chất hóa học, công thức bào chế của tất cả các phân đoạn trong quá trình sản xuất. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu dược phẩm đã thừa nhận các tiện ích không phá hủy mẫu của phương pháp quang phổ Raman và xem nó như một công cụ tiềm năng để ứng dụng trong các quy trình phân tích hiện đại, nhằm mục tiêu xác định thành phần thuốc và giám sát quá trình chuyển đổi đa hình. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu còn cho thấy quang phổ Raman có thể được sử dụng trong phép định lượng, kiểm tra chất lượng trong dây chuyền sản xuất mà không ảnh hưởng đến quá trình sản xuất cũng như xác định các thành phần dược phẩm trong viên nang xuyên qua màng gelatin mà không cần phải bóc viên. Niemczyk cho thấy quang phổ Raman sử dụng nguồn kích thích laser NIR rất tiềm năng là một phương pháp xác định nhanh các mẫu dược phẩm. Tán xạ Raman xuyên qua lớp vỉ và thu dữ liệu phổ trực tiếp về công thức thuốc từ bên trong viên nang và từ viên nang bên trong vỉ thuốc. Một điều đáng lưu ý là phương pháp Raman đang được sử dụng là phương pháp phân tích để bổ sung hoặc thay thế, chứ không phải để chống lại các phương pháp quang phổ hiện nay. Và kỹ thuật Raman cũng đang được xem như một phương pháp rất có khả năng thay thế các kỹ thuật phân tích cơ bản.

38

2.4.

Ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc. Với những lợi thế của mình, phương pháp phân tích quang phổ Raman đã

và đang giữ một vai trò to lớn trong công tác kiểm soát, phân tích và phát hiện thuốc giả. Cụ thể như sau:  Nhắc đến phương pháp phân tích quang phổ Raman thì người ta thường nghĩ ngay đến phương pháp phân tích cho kết quả nhanh, không cần chuẩn bị mẫu. Ngày nay, có hàng nghìn loại dược phẩm đang được thương mại hóa trên thị trường với số lượng lớn. Việc trà trộn thuốc giả vào đó là không thể tránh khỏi và nhất là với điều kiện máy móc, thiết bị và nhân lực còn hạn chế như hiện nay thì không thể nào kiểm soát hoàn toàn được các loại mặt hàng này. Vì vậy, phương pháp phân tích nhanh sẽ giúp sàng lọc, đánh giá sơ bộ số lượng lớn chất lượng của các thuốc đang lưu hành trên thị trường, làm giảm gánh nặng cho đội ngũ cán bộ quản lý chất lượng dược phẩm.  Phổ Raman có thể được đo trực tiếp thông qua màng vỉ, màng genlatin, qua chai lọ thủy tinh… mà không cần phải phá hủy mẫu, điều này vừa giúp tiết kiệm chi phí mua mẫu phân tích, vừa kiểm soát được nhiều loại sản phẩm mà ít làm ảnh hưởng đến việc buôn bán ở các cơ sở phân phối, bán lẻ.  Việc đo phổ Raman là khá dễ dàng nên có thể trang bị máy cho nhiều cơ quan quản lý cấp cơ sở, không cần phải cán bộ có trình độ cao để sử dụng.  Thông thường, trong quá trình phân tích, kiểm tra và khẳng định chất lượng của một loại thuốc, chúng vẫn đang được lưu hành và bán ra trên thị trường hàng ngày, nếu đó là thuốc giả thì rất khó hạn chế được khả năng nó đến tay người tiêu dùng. Vì vậy sự ra đời của máy quang phổ Raman

39

cầm tay có ý nghĩa cực kỳ quan trọng, nó giúp phân tích mẫu ngay tại hiện trường, đưa ra kết quả nhanh chóng để có biện pháp cảnh báo, tạm ngưng hoặc thu hồi ngay các thuốc có nguy cơ làm giả, ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân.  Các đầu dò quang học có thể đo được phổ Raman ở nhiều vị trí khác nhau trong bao bì đựng lớn giúp cho kiểm soát được sự đồng đều của nguyên liệu, của thuốc bột, dung dịch thuốc, nhũ tương, hỗn dịch…  Khi đo phổ Raman của thành phẩm thuốc, chúng ta thường so sánh phổ Raman của thuốc đó với thuốc đối chiếu do nhà sản xuất cung cấp. Vì khi đo thành phẩm thì ngoài tín hiệu Raman của dược chất ra, chúng ta còn thu được tín hiệu nền của hệ tá dược, do đó sẽ khẳng định được thuốc đó có đúng là thuốc do chính nhà sản xuất đã đăng ký hay không. Điều này vừa giúp người dân mua được thuốc có chất lượng tốt, đúng hãng uy tín, vừa bảo vệ quyền lợi chính đáng của nhà sản xuất.  Phổ Raman của một số chất tiêu biểu: Phổ

Ibuprofen

và

phổ

Sildenafil

40

Hình 2.3. Phổ Raman shift Ibuprofen chuẩn

41

Hình 2.4. Phổ Raman Shift Ibuprofen mẫu thử

42

Hình 2.5. Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Ibuprofen trên thị trường. Kết quả cho hệ số chồng phổ lên tới 96,89%.

43

Hình 2.6. Phổ Raman shift Sildenafil chuẩn

44

Hình 2.7. Phổ Raman Shift Sildenafil mẫu thử

45

Hình 2.8. Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Sildenafil trên thị trường. Kết quả cho hệ số chồng phổ lên tới 96,73%.

46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận  Nghiên cứu tổng quan trên đã cho chúng ta những kiến thức cơ bản về hiện tượng Raman (nguyên lý hoạt động, nguyên tắc cấu tạo và đặc điểm của kỹ thuật Raman) cũng như về phương pháp phân tích quang phổ Raman.  Kỹ thuật phổ Raman đã cho thấy những ứng dụng của nó trong phân tích nói chung và trong phân tích dược phẩm nói riêng với ưu điểm nổi bật so với các phương pháp phổ biến hiện nay là phân tích nhanh, không phá hủy mẫu.  Việc áp dụng những tiến bộ khoa học công nghệ vào kỹ thuật phân tích phổ Raman đã làm tăng độ đúng, độ chính xác và hạn chế tối đa các nhược điểm của phép đo.  Trong lĩnh vực Dược, kỹ thuật quang phổ Raman ngày càng đóng vai trò quan trọng, nhất là trong công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc và phòng chống thuốc giả. 2. Đề xuất Khóa luận đã đưa ra một cái nhìn tổng quan nhất về phương pháp quang phổ Raman và khả năng ứng dụng của nó. Quang phổ Raman và các máy quang phổ Raman đã được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới. Một số quốc gia như Mỹ, Anh,… đã đưa phương pháp phân tích phổ Raman vào dược điển và từ đó phương pháp này đã trở thành một trong những cơ sở pháp lý để kết luận về chất lượng thuốc. Riêng ở Việt Nam, phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu ít ỏi ở một số ngành khoa học cơ bản. Nhận thấy tầm quan trọng

47

và tiềm năng của nó, chúng tôi xin được đề xuất tiếp tục một số hướng phát triển cho kỹ thuật này, nhất là trong ngành Dược như sau:  Nghiên cứu, học hỏi kinh nghiệm của các nước đi trước để dần đưa phương pháp phân tích phổ Raman vào áp dụng thực tế ở Việt Nam.  Trang bị thiết bị phân tích, cụ thể là máy quang phổ Raman để bàn và máy quang phổ Raman cầm tay để nghiên cứu và thực hành kỹ thuật phân tích phổ này. Nghiên cứu sử dụng thành thạo ở một số nơi có trình độ cao, sau đó đào tạo và nhân rộng đến các cơ sở trong cả nước.  Đối với ngành Dược, xây dựng thư viện phổ chuẩn Raman của các dược chất, các thành phẩm thuốc trên thị trường, đưa thư viện phổ này trở thành một cơ sở dữ liệu chung để triển khai phương pháp phân tích phổ Raman trong kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc.  Tiếp tục khai thác thêm những tiềm năng của phương pháp phân tích phổ này trong các lĩnh vực khác nhau, mở rộng ứng dụng từ ngành Dược sang các ngành khác, nhất là trong công tác Hải quan.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Quang Hinh, Phát hiện một số thuốc cấm (Heroin-MorphinCodein Chất gây nghiên) bằng phương pháp quang phổ FT-Raman, (1999), Luận văn thạc sỹ, Đại học khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh 2. Anil K. Deisingh, (2005), “Pharmaceutical counterfeiting”, Analyst, 130, pp.271-279. 3. Al-Zoubi N, Koundourellis JE, Malamataris S, (2002), “FT-IR and Raman spectroscopic methods for identification and quantitation of orthorhombic and monoclinic paracetamol in powder mixes”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 29(3), pp.459–467. 4. Auer

ME.,

GriesserUJ.,Sawatzki

J.

(2003),

“Qualitative

and

quantitative study of polymorphic forms in drug formulations by near infrared FT-Raman spectroscopy”, Journal of Molecular Structure, 661–662(16), pp.307–317. 5. R. B. Bilhorn, P. M. Epperson, I. V. Sweedler, and M. B. Denton (1987), "Spectrochemical Measurements with Multichannel Integrating Detectors", Applied Spectroscopy , 41(7), pp. 1125-1136. 6. Derek A. Long (2002), The Raman Effect: A Unified Treatment of the Theory of Raman Scattering by Molecules, John Wiley & Sons Ltd, England. 7. De Spiegeleer B., Seghers D., Wieme R., Schaubroeck J., Verpoort F., Slegers G., Van Vooren L. (2005),“Determination of the relative

amounts of three crystal forms of a benzimidazole drug in complex finished formulations by FT-Raman spectroscopy”J. Pharm. Biomed. Anal., 39 (1-2), pp. 275–280. 8. Gamberini MC., Baraldi C., Tinti A., Rustichelli C., Ferioli V., Gamberini G. (2006), “Solid state characterization of chloramphenicol palmitate. Raman spectroscopy applied to pharmaceutical polymorphs”, Journal of Molecular Structure, 785(1–3), pp. 216–224. 9. Hwang MS., Cho S., Chung H., Woo YA.(2005), “Nondestructive determination spectroscopy”,

of

theambroxol Journal

content

in

tablets

by

Raman

of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis,38(2), Pp. 210–215. 10. Izolani AO., DeMoraes MT., Tellez CA. (2003), “Fourier transform Raman spectroscopy of drugs:Quantitative analysis of 1-phenyl-2,3dimethyl-5-Pyrazolone-4-methylaminomethane

sodium

sulfonate

(dipyrone)”, Journal of Raman Spectroscopy, 34(10), pp. 837–843. 11. John R. Ferraro, Kazuo Nakamoto, Chris W. Brown (2003), Introductory Raman Spectroscopy, Elsevier, America. 12. Lin W-Q, Jiang J-H, Yang H-F, Ozaki Y, Shen G-L, Yu R-Q (2006), “Characterisation of Chloroamphenicol Palmitate drug polymorphs by Ramanmapping with multi variate image segmentation using a spatial directed agglomeration clustering method”, Analytical Chemistry, 78 (17), pp. 6003–6011. 13. McCreery RL, (2000), Raman Spectroscopy for Chemical Analysis, John Wiley & Sons Ltd, New York.

14. Mazurek S., Szostak R. (2006), “Quantitative determination of captopril and prednisolone in tablets by FT-Raman spectroscopy”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40(5), pp. 1225– 1230. 15. Okumura T., Otsuka M. (2005), “Evaluation of the microcrystallinity of a drug substance, indomethacin, in a pharmaceutical model tablet by chemometric FT-Raman spectroscopy”, Pharmaceutical Research, 22(8), pp.1350–1357. 16. Pemberton J. E., Sobocinski R. L., Bryant M. A., and Carter D. A., (1990), “Raman Spectroscopy Using Charge Coupled Device Detection”, Spectroscopy, 5(2), pp.26. 17. Pratiwi D., Fawcett JP., Gordon KC., Rades T. (2002),“Quantitative analysis of polymorphic mixtures of ranitidne hydrochloride by Raman spectroscopy and principal component analysis”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 54(3),pp. 337–341. 18. Pelletier MJ (2003), Quantitative analysis using Raman spectrometry. Applied

Spectroscopy,57,

pp.20A-39A,

Society

for

appied

Spectroscop, England and America. 19. Pushkar P. Kalantri, Rakesh R. Somani, Dinesh T. Makhija (2010), “Raman

spectroscopy:

A

potential

technique

in

analysis

of

pharmaceuticals”, Der Chemica Sinica, pp.5-8. 20. Pestaner JP., Mullick FG., Centeno JA. (1996), “Characterization of acetaminophen: molecular microanalysis with Raman microprobe spectroscopy”, Journal of Forensic Sciences, 41(6).

21. Rantanen J, Wikstrom H, Rhea FE, Taylor LS, (2005), “Improved understanding

of

factors

contributing

to

quantification

of

anhydrate/hydrate powder mixtures”, Applied Spectroscopy, 59(7), pp. 942–951. 22. Roberts SNC., Williams AC., GrimseyIM., Booth SW. (2002), “Quantitative

analysis

of

mannitol

polymorphs.

FT-Raman

spectroscopy”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28(6), pp. 1135–1147. 23. Strachan CJ., Pratiwi D., Gordon KC., Rades T. (2004), “Quantitative analysis of polymorphic mixtures of carbamazepine by Raman spectroscopy and principal components analysis”,Journal of Raman Spectroscopy, 35(5), pp. 347–352. 24. Steven E. J. Bell, D. Thorburn Burns, Andrew C. Dennisa and James S. Speersb, (2000), “Rapid analysis of ecstasy and related phenethylamines in seized tablets by Raman spectroscopy”, Analyst, 125(3), pp. 541–544. 25. Skoulika SG., Georgiou CA. (2003), “Rapid, noninvasive quantitative determination of acyclovir in pharmaceutical solid dosage forms through their poly(vinyl chloride) blister package by solid-state fourier transform Raman spectroscopy”, Applied Spectroscopy, 57(4). 26. Szostak R, Mazurek S, (2002), “Quantitative determination of acetylsalicylic acid and acetaminophen in tablets by FT-Raman spectroscopy”, Analyst, 127, 144–148. 27. Szostak R., Mazurek S. (2004), “FT-Raman quantitative determination of ambroxol in tablets”, Journal of Molecular Structure, 704(1–3), pp 229-233.

28. Slobodan Šašic (2008), Pharmaceutical applications of Raman Spectroscopy, John Wiley & Son, Canada. 29. U.S Pharmacopeial Convention 34,(2012), America. 30. Vehring R. (2005), “Red-excitation dispersive Raman spectroscopy is a

suitable

technique

for

solid-state

analysis

of

respirable

pharmaceutical powders”, Applied Spectroscopy, 59(3), pp. 267-391. 31. Vankeirsbilck T., Vercauteren A., Baeyens W., Van derWeken G., Verpoort F., Vergote G., Remon JP. (2002), “Applications of Raman spectroscopy in pharmaceutical analysis”, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 21(12), pp 869–877.