Manual de Bio - Agronomia

INGENIERIA INGENIERIA AGRONOMA AGRONOMA

UNIVERSIDA UNIVERSIDA D NACIONAL DEL SANTA

PRACTICA N0 1

I.- INTRODUCCION La colorimetría es una de las técnicas más usadas en Bioquímica cuando se requiere determinar la concentración de un compuesto o grupo de compuestos que forman parte de una solución coloreada, ya sea naturalmente o hecha así mediante reacciones químicas específicas. Si un rayo de luz monocromática, de intensidad inicial Io pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida, de manera que la intensidad de luz transmitida It es menor que Io. La relación entre It e Io depende de la longitud del medio absorbente, I; y de la concentración de la solución, c. Solución absorbente concentración o

Luz Monocromática

Rayo Incidente

Rayo Emergente

Intensidad Io

Intensidad It

Espesor de la Solución Fig. 1: Absorción de la luz por una solución Estos factores se hallan relacionados en la ley de LAMBER y BEER que se expresa en la siguiente fórmula: Log (Io /I /It) = E.C.l. DONDE: Io = Intensida Intensidadd de luz incidente It = Intensida Intensidadd de luz transmitida E = Coeficiente Coeficiente de extinción (contante que depende depende de la longitud longitud de onda y del soluto) soluto) l = Distancia que recorre la luz a través de la solución C = Concentración de la solución.     

En esta fórmula log (Io /I /It) se conoce como DENSIDAD ÓPTICA (D.O.) o ABSORBANCIA, la cual es directamente proporcional a la concentración de la solución e inversamente proporcional a la intensidad de la luz transmitida. La cantidad de la luz absorbida por una solución s olución puede ser medida por los FOTOCOLO FOTOCOLORIM RIMETROS ETROS , aparatos que funcionan a base de filtros, y los ESPECTROFOTÓMETROS que utilizan prismas o redes de difracción que dispersan la luz, formando un espectro del cual se elige la longitud de onda o la banda. Un espectrofotómetro tiene dos aplicaciones importantes, una de ellas es para medir la absorbancia o transmitancia en una determinación cuantitativa basada en la ley de BEER. Otras es para medir los espectros de absorción se sustancias coloridas. Como cada sustancia colorida tiene su propio BIOQUIMICA BIOQ UIMICA

1

J. Rui Ruiz, O. Vil Villa nueva, W. Cappa Cap pa



espectro, los espectros son importantes para la identificación cualitativa de sustancias y para elegir una longitud de onda adecuada en una determinación espectrofotométrica cuantitativa. Para calcular la concentración concentración de una solución se puede puede recurrir a dos procedimientos: procedimientos:  

Factor de calibración Curva de de calibración o curva curva estándar

1.- FACTOR DE CALIBRACION (FC).- Es la cantidad en peso de una sustancia que corresponde a una unidad de lectura en e n el fotocolorímetro o espectrofotómetro. espectrofotómetro. Se halla dividiendo dividiendo la la concentración concentración de muestras estándar (solución de composición química igual a la muestra problema, y de concentración conocida) conocida) entre su D.O. D.O. Para mayor exactitud exactitud se obtienen obtienen varios FC y se trabaja con el promedio. Esta división debe ser un valor aproximadamente igual para cada estándar, puesto que expresa la proporcionalidad entre D.O. y concentración.

2.- CURVA ESTÁNDAR.- Este método consiste en preparar soluciones estándar de diferente concentración y construir un gráfico en un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas del estándar en la ordenada y la concentración (en g%, mg% o moles/l, etc) en la abscisa. La concentración de la muestra problema se obtendrá ploteando su lectura en el gráfico y en el punto de intersección se trazará una perpendicular al eje de las abscisas donde se leerá su concentración. II.- OBJETIVOS 2.1. Obtener Obtener el espectro de absorción de una sustancia 2.2. Preparar una curva de calibración para una sustancia coloreada 2.3. Determinar la concentración de una muestra problema mediante factor de calibración y curva de calibración. III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 EQUIPOS 3.1.1 Espectrofotómetro 3.1.2 Balanza 3.1.3 Agitador magnético 3.2 MATERIALES Y REACTIVOS 3.2.1 Azul de metileno 0,1% 3.2.2 Sulfato de cobre 10% 3.2.3 Dicromato de potasio 0,1% 3.2.4 Agua destilada 3.2.5 Pipetas de 5 – 10 ml 3.2.6 Matraces 3.2.7 Probetas IV.- PROCEDIMI PROCEDIMIENTO ENTO EXPERIMENTAL EXPERIMENTAL 4.1 OBTENCION DEL ESPECT ES PECTRO RO DE ABSORCIÓN ABS ORCIÓN 4.1.1. Encender el espectrofotómetro espectrofotómetro (siga las instrucciones instrucciones del prof.) 4.1.2. Preparar 20 20 ml de las soluciones de: CuSO 4, Azul de metileno, K 2CrO2 4.1.3. Colocar agua destilada (solvente) en una cubeta del espectrofotómetro espectrofotómetro para que sirva de blanco 4.1.4. Medir el blanco a la longitud longitud de onda seleccionada como inicial: 400 nm 4.1.5. Reemplazar el blanco con una cubeta cubeta que contenga contenga las muestras muestras a medir 4.1.6. Realizar lecturas a intervalos de 25 nm

BIOQUIMICA BIOQ UIMICA

2




espectro, los espectros son importantes para la identificación cualitativa de sustancias y para elegir una longitud de onda adecuada en una determinación espectrofotométrica cuantitativa. Para calcular la concentración concentración de una solución se puede puede recurrir a dos procedimientos: procedimientos:  

Factor de calibración Curva de de calibración o curva curva estándar

1.- FACTOR DE CALIBRACION (FC).- Es la cantidad en peso de una sustancia que corresponde a una unidad de lectura en e n el fotocolorímetro o espectrofotómetro. espectrofotómetro. Se halla dividiendo dividiendo la la concentración concentración de muestras estándar (solución de composición química igual a la muestra problema, y de concentración conocida) conocida) entre su D.O. D.O. Para mayor exactitud exactitud se obtienen obtienen varios FC y se trabaja con el promedio. Esta división debe ser un valor aproximadamente igual para cada estándar, puesto que expresa la proporcionalidad entre D.O. y concentración.

2.- CURVA ESTÁNDAR.- Este método consiste en preparar soluciones estándar de diferente concentración y construir un gráfico en un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas del estándar en la ordenada y la concentración (en g%, mg% o moles/l, etc) en la abscisa. La concentración de la muestra problema se obtendrá ploteando su lectura en el gráfico y en el punto de intersección se trazará una perpendicular al eje de las abscisas donde se leerá su concentración. II.- OBJETIVOS 2.1. Obtener Obtener el espectro de absorción de una sustancia 2.2. Preparar una curva de calibración para una sustancia coloreada 2.3. Determinar la concentración de una muestra problema mediante factor de calibración y curva de calibración. III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 EQUIPOS 3.1.1 Espectrofotómetro 3.1.2 Balanza 3.1.3 Agitador magnético 3.2 MATERIALES Y REACTIVOS 3.2.1 Azul de metileno 0,1% 3.2.2 Sulfato de cobre 10% 3.2.3 Dicromato de potasio 0,1% 3.2.4 Agua destilada 3.2.5 Pipetas de 5 – 10 ml 3.2.6 Matraces 3.2.7 Probetas IV.- PROCEDIMI PROCEDIMIENTO ENTO EXPERIMENTAL EXPERIMENTAL 4.1 OBTENCION DEL ESPECT ES PECTRO RO DE ABSORCIÓN ABS ORCIÓN 4.1.1. Encender el espectrofotómetro espectrofotómetro (siga las instrucciones instrucciones del prof.) 4.1.2. Preparar 20 20 ml de las soluciones de: CuSO 4, Azul de metileno, K 2CrO2 4.1.3. Colocar agua destilada (solvente) en una cubeta del espectrofotómetro espectrofotómetro para que sirva de blanco 4.1.4. Medir el blanco a la longitud longitud de onda seleccionada como inicial: 400 nm 4.1.5. Reemplazar el blanco con una cubeta cubeta que contenga contenga las muestras muestras a medir 4.1.6. Realizar lecturas a intervalos de 25 nm


2




4.1.7. Construir los espectros de absorción para cada solución representando represent ando el valor de absorbancia en el eje vertical y la longitud de onda en el eje horizontal. 4.2

CALC ULO DE LA CONCENTRACIÓN CALCULO CONCENTRA CIÓN DE UNA SOLUCIÓN 4.2.1. Preparar soluciones de acuerdo al siguiente esquema: TUBOS (ml) CuSO4 Agua destilada

I --5

II 1 4

III 2 3

IV 3 2

V 4 1

VI 5 ---

4.2.2. Leer las D.O. de las soluciones preparadas a la longitud longitud de onda adecuada adecuada (resultado de 4.1) 4.2.3. Construir en papel milimetrado una curva de calibración con las D.O. y sus concentraciones respectivas. 4.2.4. Hallar el F.C. para cada solución y sacar un promedio 4.2.5. Determinar la concentración de la muestra problema (proporcionado (proporcionado por el docente) docente) por los dos métodos estudiados. V.- DATOS EXPERIMEN EXPERIMENTALES TALES 5.1. Tabla de datos obtenidos obtenidos (D ( D.O. a las diferentes longitudes longitudes de onda) onda) VI.- CALCULOS CALCULOS RESULTADOS RESULTADOS Y DISCUSIO DISCUSION N 6.1. Utilizar Utilizar la fórmula C1 V 1 = C2 V 2 para determinar las concentraciones de las soluciones, preparadas y construir la curva de calibración 6.2. Efectuar Efectuar los cálculos necesario de la muestra problema en mg% 6.3. Con los datos obtenidos obtenidos construir construir el espectro de absorción de cada una una de las sustancias sustancias estudiadas. VII. VII. CONCLU CONCLUSION SIONES ES 7.1. Anotar sus conclusiones de la práctica de acuerdo a los objetivos y resultados. VIII VIII. CUEST CUESTIO IONARI NARIO O 8.1. ¿Cuál crees que es método más exacto para obtener la concentración de una una muestra problema, el gráfico o el analítico? ¿Por qué? 8.2. ¿Qué factores alteran la ley de de LAMBER LAMBER y BEER? BEER? 8.3. ¿El color que exhibe exhibe una sustancia está determinada por la luz que transmite transmite o que que absorbe? 8.4. A fin de probar la validez de la ley de BEER BEER en la determinación determinación de la vitamina vitamina A, se prepararon soluciones de concentración conocida y se trataron por un procedimiento normalizado con tricloruro de antimonio en cloroformo para producir una coloración azul. El porcentaje de transmisión de la luz incidente filtrada para cada concentración, expresada en µg ml-1, fue el siguiente: Concentración µg ml-1 Transmisi Tra nsmisión, ón, %

1,0 66,8

2,0 44,7

3,0 29,2

4,0 19,9

5,0 13,3

IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 9.1. Albert, R. y F. Daniela. 1989 Fisicoquímica. 2da. Reimpresión. Continental S.A. de C.V. México, 1970 9.2. Ayres, G. 1970. Análisis Químico Cuantitativo. Cuantitativo. 2da. Edición. Edición. Harla. México 9.3. Horna, E. La célula. Módulo I de Bioquímica. Chimbote. Universidad nacional del Santa. 1988.


3


INGENIERIA AGRONOMA

UNIVERSIDA D NACIONAL DEL SANTA

PRACTICA N0 2

I.- INTRODUCCION Las enzimas son proteínas altamente especializadas que funcionan como catalizadores biológicos de las reacciones celulares. Existen seis clases principales de enzimas de acuerdo al tipo de reacción catalizada; una de estas es la clase de las oxidorreductasas. Como ya se sabe, los organismos obtienen su energía a través de reacciones de oxidación reducción catalizadas por las oxidorreductasas y su capacidad de realizar una determinada reacción depende del potencial redox (Eh). Existen microorganismos que pueden desarrollarse en ambientes pobres o ricos en oxígeno, la presencia de mayores o menores concentraciones de oxígeno en un alimento indicarán si éste es un medio oxidante o no, o lo que es lo mismo si posee valores altos o bajos de E h respectivamente; de acuerdo con esto, los microorganismos se clasifican en: 1.

Aerobios estrictos: Crecen en presencia de oxígeno Eh : + 350 a 500mv

2.

Anaerobios estrictos: Crecen en ausencia de oxígeno Eh : - 150mv

3.

Aerobios facultativos: Crecen en presencia o ausencia de oxígeno Eh : - 350 a + 500 mv

La determinación de los potenciales de óxido reducción en alimentos se realiza con electrodos apropiados y también se usan algunas sustancias que se van a colorear o decolorar a diferentes valores de Eh En la práctica se usará el azul de metileno, un indicador de óxido reducción, con la finalidad de estimar en forma aproximada la carga microbiana de leche. El ensayo se denomina PRUEBA DE LA REDUCTASA, una prueba rápida que se usa para inspeccionar leche tratada o no por el calor y destinada a los consumidores. El fundamento radica en que por la actividad microbiana sus nutrientes van a ser oxidados y otras sustancias, entre ellas el indicador, van a ser reducidas por acción enzimática. II.- OBJETIVOS 2.1. Verificar la actividad de una enzima de óxido reducción 2.2. Estimar el número de microorganismos presentes en un alimento mediante la prueba de la reductasa. III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 EQUIPOS 3.1.1 Balanza analítica 3.1.2 Baño maría 3.2 MATERIALES Y REACTIVOS 3.2.1 50 ml de leche fresca (por sub grupo de práctica) 3.2.2 05 ml Solución diluida de azul de metileno 3.2.3 Termómetro 3.2.4 100 ml Agua destilada 3.2.5 Pipetas de 1 – 10 ml 3.2.6 03 Tubos de ensayo 15 X 150 IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1 Mezclar cuidadosamente la muestra por inversión y agitación y colocar 10 ml en un tubo de ensayo, cuidando que los lados internos no se mojen de leche.

BIOQUIMICA

4

J. Ruiz, O. Villanueva, W. Cappa

INGENIERIA AGRONOMA


4.2 Añade 1 ml de la solución de azul de metileno evitando que la pipeta haga contacto con la muestra, ni con las paredes del tubo. 4.3 Tapar asépticamente el tubo con tapón de goma, inviértelo 2 veces de tal manera que toda la columna de aire se eleve por encima de la leche. 4.4 Después de 5 minutos colocar el tubo de ensayo en el baño de agua a 37.5 ± 0,5 0C, cuida que el agua se mantenga por encima del nivel de la leche en el tubo y que el interior del baño sea oscura. 4.5 Preparar 2 tubos control, uno que contenga 1 ml de agua corriente y 10 ml de leche similar a la que se está probando, y otro que contenga 1 ml del indicador y 10 ml de leche. Ambos tubos control tienen que introducirse en agua hirviente por lo menos durante 3 minutos. 4.6 Se considera que la leche está en buen estado cuando no se decolora después de haberla incubado 30 minutos los tres tubos a 37 °C. Una leche decolorada es aquella que ha perdido el color en toda la columna o hasta 5 mm de la superficie. Registra tus resultados. V.- RESULTADOS Y DISCUSION 5.1. Representar mediante esquemas los resultados obtenidos VI.- CONCLUSIONES 6.1. Anotar las conclusiones de la práctica de acuerdo a los objetivos propuestos VII. CUESTIONARIO 7.1. ¿Qué es el potencial redox? 7.2. ¿Qué correlación existe entre el número de microorganismos en una muestra alimenticia y el tiempo de reducción del azul de metileno? 7.3. ¿Una muestra de carne tendrá los mismos valores de Eh en toda su masa? 7.4. ¿Señale dos muestras alimenticias en las que se puede aplicar la prueba de la reductasa? 7.5. ¿Que razones hacen difícil la determinación de Eh en alimentos? VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 8.1. Horna, E.1988. Transformaciones energéticas. Módulo 2 de Bioquímica. Universidad Nacional del Santa. Chimbote – Perú 8.2. Morris, J. G. 1976. Fisicoquímica para Biólogos. Reverté S.A. España.

BIOQUIMICA

5


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 3

I.- INTRODUCCION Las enzimas son la clase más numerosa y especializada de las proteínas que funcionan como catalizadores biológicos para las reacciones celulares. Las enzimas tienen enorme poder catalítico, gran especificidad y actividad regulada, intervienen en la transformación de la energía en diversas formas de trabajo. Las reacciones mas simples como son la “autólisis” de los tejidos animales, de considerable interés para la industria alimenticia, en lo que se refiere al ablandamiento de la carne durante el sazonado, son catalizadas por las catepsinas, las cuales se liberan y activan luego de ocurrida la muerte. El efecto acelerador es uno de los más altos que se conocen, multiplica la velocidad de la reacción hasta en un millón de veces. Las enzimas son proteínas que contienen los mismos aminoácidos que se encuentran en otras proteínas. Al igual que otras proteínas también tiene una estructura tridimensional, que representa la conformación de contenido de energía mínimo, y pueden consistir de una sola o de varias cadenas polipeptídicas. El objetivo del presente experimento es evidenciar que las enzimas son proteínas que gozan de las propiedades de éstas y que son sensibles a todos los agentes físico-químicos que actúan sobre los mismos, haciendo variar su comportamiento y actividad. II.- OBJETIVOS 2.1. Obtener un extracto crudo de la enzima catalasa 2.2. Demostrar cualitativamente el efecto de ácidos, bases y sales sobre la actividad de la catalasa . III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 EQUIPOS 3.1.1 Congeladora 3.1.2 Centrífuga 3.1.3 Estufa 3.2 MATERIALES Y REACTIVO PROPORCIONADO POR EL ALUMNO 3.2.1 Tomates verdes (inmaduras) 3.2.2 Papas verdes (inmaduras) 3.2.3 Manzanas verdes (inmaduras) 3.2.4 Un cuchillo de cocina 3.2.5 Un rayador 3.2.6 Dos paquetes de gasa o papel de filtro PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO 3.2.7 Hidróxido de sodio 2N 3.2.8 Ácido clorhídrico 0.5N 3.2.9 Acido tricloroacético 20% 3.2.10 Sulfato de cobre 20% 3.2.11 Buffer fosfato 0.05 M, y 0.1 M pH 6,5 3.2.12 Peróxido de hidrógeno 3% 3.2.13 Cloruro de sodio 0.15 M 3.2.14 Tubos de ensayo 3.2.15 Embudos 3.2.16 Matraces 3.2.17 Pipetas de 5 y 10 ml 3.2.18 Mortero IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

BIOQUIMICA

6


INGENIERIA AGRONOMA

4.1

4.2


OBTENCION DEL EXTRACTO CRUDO 4.1.1. Pelar los tomates verdes y eliminar la cáscara, el pericarpio almacenarlo a -70 0C 4.1.2. Limar el pericarpio congelado, adicionar 3 ml de Buffer fosfato 0.1 M pH 6,5 4.1.3. Filtrar el extracto crudo a través de 2 capas de gasa o papel de filtro y centrifugar a 10 000 rpm por 15 minutos y guardar las alícuotas a -18 0C DEMOSTRACIÓN DE LA NATURALEZA PROTEICA 4.2.1 Armar el siguiente sistema: TUBOS (ml)

I II III IV Enzima 1.0 1.0 1.0 1.0 NaOH 2N ---- 2.4 ---- ---HCl 0.5N ---- ---- 2.4 --- ATCA 20% ---- ---- ---- 2.4 CuSO4 20% ---- ---- ---- ---Buffer Fosfato 0.05 M pH 6,5 ---- ---- ---- ---Dejar en reposo los 6 tubos durante 20 minutos a 4.2.2

4.2.4

VI 1.0 ------------2.4

V 2.0 1.0 1.0

VI 2.0 1.0 1.0

Preparar el siguiente sistema TUBOS (ml) Buffer fosfato 0.05 M pH 6,5 NaCl 0.15 M H2O2 3%

4.2.3

V 1.0 ---------2.4 ---30 0C

I 2.0 1.0 1.0

II 2.0 1.0 1.0

III 2.0 1.0 1.0

IV 2.0 1.0 1.0

Preincubar por 2 minutos a 25 0C, luego agregar a cada uno de los tubos 2,0 ml de la enzima tratada en el paso 4.2.1. Dejar en incubación durante 5 minutos a 25 0C y determinar la actividad enzimática cualitativamente de la siguiente manera:  

Presencia de actividad enzimática (+) Ausencia de actividad enzimática (-)

= =

Formación de gas Ausencia de gas

V.- RESULTADOS Y DISCUSION Tomates Papas Manzanas

TUBOS

I

II

III

IV

V

VI

VI. CONCLUSIONES 6.1. Anotar sus conclusiones de la práctica. VII. CUESTIONARIO 7.1. ¿Qué es un extracto crudo? 7.2. ¿A qué clase de enzima corresponde la catalasa? Su nombre y su código EC. 7.3. ¿Qué otros factores pueden considerarse para demostrar que las enzimas son proteínas? 7.4. Indique 4 enzimas que pueden extraerse de vegetales 7.5. Importancia de las enzimas VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 8.1. Braverman, J.B. 1980. Introducción a la Bioquímica de los alimentos. El manual moderno. México. 8.2. Metzler, E.D. 1981. Bioquímica, Omega. Barcelona.

BIOQUIMICA

7


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 4

I.- INTRODUCCION Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica cuya función es acelerar las reacciones químicas llevándolas más rápidamente a su posición de equilibrio. Pertenecen al grupo de las proteínas globulares cuyos pesos moleculares oscilan entre 104 y 106 daltons; pueden consistir de una sola o de varias cadenas polipeptídicas, y contener también partes no proteicas. En una reacción bioquímica catalizada por enzimas, a medida que progresa la reacción se incrementa la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes sustratos, en tanto que pertenece fija la concentración de la enzima. De esto podemos deducir que si se desea medir la actividad de una enzima puede hacerse controlando el sustrato no transformado (sustrato residual) o controlando los productos liberados. También puede medirse la modificación de los factores, en el caso de enzimas que requieren estas sustancias. La actividad catalítica se expresa en términos de unidades de actividad, y para ello la Comisión de Enzimas para la Unión Internacional de Bioquímica sugirió que “Una unidad (u) de cualquier enzima

se define como la cantidad que catalizará la transformación de un micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de pH y temperatura”.

En la práctica se estudiará la actividad de una amilasa de origen vegetal, midiendo el sustrato residual. Asimismo, se medirá su actividad específica, que viene a constituir un criterio de pureza, y se define como “el número de unidades de enzima por mg de pro teína. II.- OBJETIVOS 2.1. Determinar la actividad enzimática de una amilasa, extraída de trigo germinado, dosando almidón residual. 2.2. Determinar la actividad específica de la amilasa vegetal III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 EQUIPOS 3.1.1 Estufa 3.1.2 Espectrofotómetro 3.2 MATERIALES Y REACTIVO PROPORCIONADO POR EL ALUMNO 3.2.1 Semillas germinadas de trigo 3.2.2 Semillas germinadas de cebada PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO 3.2.3 Solución de almidón 0.1% 3.2.4 Ácido clorhídrico 0.5N 3.2.5 Lugol 3.2.6 Reactivo de Biuret 3.2.7 Tubos de ensayo 3.2.8 Embudos 3.2.9 Mortero 3.2.10 Pipetas de 1, 5 y 10 ml IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1 EXTRACCION DE LA AMILASA 4.1.1. Poner a germinar 3 días, 50 semillas 4.1.2. Triturar las semillas cuando las raicillas tenga 0.5 cm de largo, adicionando 10 ml de buffer + cloruro de calcio. 4.1.3. Filtrar en gasa 4.2 DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA 4.2.1 Armar el siguiente sistema:

BIOQUIMICA

8


INGENIERIA AGRONOMA


Almidón inicial TUBOS (ml) I Sustrato 1.0 0 Dejar en incubación a 30 C durante 5 minutos Extracto crudo de enzima --0 Mezclar e incubar a 30 C durante15 minutos exactos Acido clorhídrico 0.5 N 1.0 Dejar en reposo por 5 minutos a temperatura ambiente Agua destilada 9.9 Lugol 0.5 4.2.2 4.2.3

Almidón residual II 1.0

III 1.0

IV 1.0

0.1

0.2

0.3

1.0

1.0

1.0

9.8 0.5

9.7 0.5

9.6 0.5

Mezclar, medir las absorbancias después de 5 minutos a 620 nm Anotar las absorbancias de los 4 tubos de prueba.

4.3 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA 4.3.1 Determinar el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el reactivo de Biuret de acuerdo al siguiente esquema: TUBOS (ml) Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 4.3.2 4.3.3

I --1.0 4.0

II 0.2 0.8 4.0

III 0.1 0.9 4.0

IV 0.05 0.95 4.0

Mezclar e incubar a 37 0Cdurante 30 minutos Realizar las lecturas de absorbancia a 540 nm calibrando a cero con el tubo N0 1

V.- DATOS EXPERIMENTALES 5.1. Determinación de la actividad enzimática N0 TUBO I II III IV

ABSORBANCIA (….. nm)

5.2. Determinación de la actividad específica N0 TUBO I II III IV

ABSORBANCIA (….. nm)

VI. CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION 6.1. Determinar la concentración del almidón (mg/ml), multiplicando absorbancia por factor de calibración. Obtener el promedio de los tubos II, III, y IV. 6.2. Calcular las unidades de enzima (U) de la siguiente forma:

6.3. Determinar mg de proteína/ml = Absorbancia X Factor BIOQUIMICA

9


INGENIERIA AGRONOMA


6.4. Obtener el promedio de los tubos II, III, IV, y determinar la Actividad Específica (AE) de la siguiente manera:

6.5. Realizar un flujograma de la obtención de la amilasa. VII. CONCLUSIONES 7.1. Anotar sus conclusiones de la práctica VIII. CUESTIONARIO 8.1. En la síntesis de arginina a partir de ácido glutámico se observaron las siguientes reacciones: 1 2 3 4 Glu — N ac. Glu — Orn — Cit — Arg Siendo 1, 2, 3, 4 enzimas

8.2. 8.3. 8.4. 8.5.

Indica cuáles son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas mediante un cuadro ¿Por qué se sometieron las raicillas del cereal a un proceso físico y químico en el proceso de extracción? Si se te da una solución que supuestamente contiene una enzima, ¿Cómo determinarías en la solución la presencia de una enzima que cataliza la hidrólisis del almidón? Represente mediante un flujograma el proceso de extracción de una amilasa de una fuente diferente a la utilizada en práctica ¿Cómo se puede incrementar la actividad específica de una enzima?

IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 9.1. Horna, E. 1988. Enzimas. Módulo 03 de Bioquímica. Universidad Nacional del Santa. Chimbote – Perú. 9.2. Villavicencio, M. 1993. Bioquímica. Tomo I. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Lima – Perú.

BIOQUIMICA

10


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 6

I.- INTRODUCCION Los carbohidratos desempeñan en los organismos vivos diversas funciones. Los animales los emplean de preferencia como combustible para producir energía, cuando los reciben en exceso los almacenan en forma de polisacáridos (glucógeno) o los convierten en grasa para ser utilizadas en el momento oportuno. Las plantas pueden sintetizar o almacenar grandes cantidades de carbohidratos, especialmente mientras ocurre la fotosíntesis, los que servirán como fuente energética para ellos mismos o para los animales. Por otro lado, diversos glúcidos o derivados de ellos contribuyen a la formación a la formación de estructuras de sostén, pues son constituyentes de sustancias como la celulosa en los vegetales, los mucopolisacáridos en los animales y diversos glúcidos complejos en la pared bacteriana. Además, numerosas moléculas esenciales para cualquier célula, como los ácidos nucleicos y numerosas coenzimas poseen residuos hidrocarbonados. Químicamente, los carbohidratos son derivados aldehídicos o cetónicos de alcoholes superiores polivalentes o compuestos que por hidrólisis dan estos derivados. Se clasifican en cuatro gran des grupos: Monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Tiene diferentes propiedades físicas y químicas, y en base a ellas existen métodos que nos permiten diferenciarlos, lo que constituye el objetivo de esta práctica. II.- OBJETIVOS 2.1. Reconocer los diferentes tipos de carbohidratos 2.2. Identificar la presencia de azúcares reductores provenientes de la hidrólisis ácida de muestras de carbohidratos. III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 EQUIPOS 3.1.1 Balanza 3.1.2 Baño maría 3.2 MATERIALES Y REACTIVO PROPORCIONADO POR EL ALUMNO 3.2.1 Una papa 3.2.2 5 gr de almidón por grupo de trabajo PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO 3.2.3 Solución de glucosa 1 % 3.2.4 Solución de sacarosa 1 % 3.2.5 Solución de maltosa 1 % 3.2.6 Solución de almidón 1 % 3.2.7 Solución de fructosa % 3.2.8 Solución alcohólica de Alfa naftol 5 % 3.2.9 Acido sulfúrico Q.P. 3.2.10 Reactivo de Selivanoff 3.2.11 Reactivo de Bradford 3.2.12 Acido clorhídrico 1,5 % 3.2.13 Solución de Hidróxido de potasio 1 % 3.2.14 Solución de Fehling “A” 3.2.15 Solución de Fehling “B” 3.2.16 Tubos de ensayo 3.2.17 Pipetas de 1, 5 y 10 ml IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

BIOQUIMICA

11


INGENIERIA AGRONOMA


4.1 ACCION DE LOS ACIDOS OXIDANTES 4.1.1. REACCIÓN DE MOLISH.Es una reacción general de los carbohidratos que sirve para detectar su presencia en una sustancia problema. Una reacción negativa es una buena evidencia de la ausencia de azúcares, mientras que una prueba positiva es simplemente indicadora de la posibilidad de su existencia y requiere una mayor investigación. TUBOS (ml) Sol. Glucosa 1% Sol. Sacarosa 1% Sol. Maltosa 1% Sol. Almidón 1% Sol. Alfa naftol 5% (gotas) Mezclar bien agitando el tubo, agregar Acido sulfúrico

I II 2.0 ------2.0 ------------02 02 lentamente por las 2.0

2.0

III ------2.0 ---02 paredes

IV ---------2.0 02

2.0

2.0

Observar en la interfase la aparición de un anillo rojo violeta oscuro, lo cual indica una reacción positiva. Esta reacción es debida a la condensación de los furfurales formados por la acción del ácido con el alfanaftol. 4.1.2. REACCION DE SELIVANOFF.Esta es una reacción específica para azúcares con grupo funcional cetónico. TUBOS (ml) Sol. Fructosa 1% Sol. Glucosa 1% Sol. Sacarosa 1% Rx. Selivanoff

I 1.0 ------5.0

II ---1.0 ---5.0

III ------1.0 5.0

Mezclar bien y someter a baño maría hirviente. Observar lo que sucede en los tubos, a intervalos de 3 minutos, durante 15 minutos. La reacción es positiva cuando se observa una coloración rojo – cereza. 4.1.3. REACCION DE BARFOED.Esta prueba se utilizar para diferenciar monosacáridos de disacáridos TUBOS (ml) Sol. Glucosa 1% Sol. Fructosa 1% Sol. Sacarosa 1% Sol. Maltosa 1% Rx Barfoed

I 1.0 ---------5.0

II ---1.0 ------5.0

III ------1.0 5.0

IV ---------1.0 5.0

Mezclar bien y someter a baño maría hirviente por espacio de 5 minutos, controlar el tiempo en que aparecen las reacciones positivas (precipitado rojo naranja) en los diferentes tubos. Interpretar los resultados. 4.1.4. ACCION DE LOS ALCALIS SOBRE LOS CARBOHIDRATOS Las aldosas y cetosas, como los carbohidratos compuestos que contienen un grupo azúcar libre, presentan el fenómeno de la tautomerización cuando son sometidos a la acción de los álcalis dando origen a las formas enólicas que se comportan como ácidos débiles y tiene la capacidad de unirse al álcali dando lugar a sales enólicas que tienen propiedades reductoras.

BIOQUIMICA

12


INGENIERIA AGRONOMA


De estas propiedades se valen los métodos para la identificación y cuantificación de muchos azúcares (Reacción de Benedict, Fehling, etc.). En la práctica se hará una hidrólisis ácida de un polisacárido y luego se procederá a identificar el azúcar reductor correspondiente. PROCEDIMIENTO: Triturar en un mortero una papa sin cáscara Agregar 5 – 10 ml de agua destilada, mezclar y decantar el sobrenadante en un vaso de precipitación. En un tubo de ensayo medir 2 ml del sobrenadante anterior, y en otro tubo de ensayo medir 2 ml de solución de almidón previamente preparado Añadir 2 ml de HCl 1,5 % a cada uno de los tubos Calentar los tubos de ensayo en baño maría hasta que hierva durante 15 minutos; enfriar, adicionar 5 gotas de KOH 1%  



 



Añadir a los tubos anteriores 1 ml de las soluciones de Fehling “A” y “B”, luego

someterlos a ebullición entre 3 y 5 minutos. Observar los que sucede

V.- RESULTADOS Y DISCUSION 5.1. Los resultados de cada prueba indicarlos en un cuadro como el que sigue: TUBOS

I

II

III

IV

VI. CONCLUSIONES 6.1. Indicar las conclusiones de la práctica. VII. CUESTIONARIO 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5

¿Cuál de las pruebas permite diferenciar aldosas de cetosas? Fundamente su respuesta. ¿El almidón ingerido por el ser humano sufre el mismo tipo de hidrólisis ácida realizada en la práctica? ¿Cómo se hidroliza? Cuales son las unidades monoméricas de: - Lactosa - Sacarosa - Maltosa - Celulosa Representa la unión de moléculas en la formación del almidón, glucógeno, y celulosa De los siguientes azúcares, ¿Cuál no es reductor? ¿por qué? - Glucosa - Lactosa

- Sacarosa - Fructosa

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 8.1. Bohinski, R. 1978. Bioquímica 2da edición. Fondo Educativo Latinoamericano S.A. 8.2. Morrison, R. y Boyd. 1985. Química orgánica. 2da edición. Fondo Educativo Latinoamericano S.A. México. 8.3. Villavicencio, M. 1993. Bioquímica. A&B S.A. Editores, Lima – Perú.

BIOQUIMICA

13


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 7

I.- INTRODUCCION Las células jóvenes de las plantas superiores presentan compuestos diferentes a la celulosa en las paredes celulares, éstas son las sustancias pécticas (ácidos pécticos y protopectina) constituidos por una cadena de ácidos galacturónicos, unidos por enlaces alfa 1 – 4, muchas veces esterificados con metanol. También se han encontrado en su estructura otros azúcares como: arabinosa, ramnosa, manosa, metilxilosa y metilfucosa. Estos heteropolisacáridos son coloides hidrófilos por lo que tienen la propiedad de absorber agua y transportarla de una célula a otra. Son responsables de la consistencia firme de la textura de las frutas y hortalizas; el ablandamiento de estos alimentos se debe en parte a las modificaciones químicas de las pectinas por la acción de las enzimas pectolíticas. En la industria de los alimentos se utiliza como espesante por su poder gelificante. II.- OBJETIVOS 2.1. Obtener pectinas a partir de la manzana 2.2. Identificar las propiedades químicas de las pectinas. III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 MATERIALES Y REACTIVO PROPORCIONADO POR EL ALUMNO 3.1.1 Manzanas 3.1.2 Gasa PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO 3.1.3 Estufa 3.1.4 Cocina 3.1.5 Acido clorhídrico 0,1 % 3.1.6 Etanol 3.1.7 Acetona 3.1.8 Hidróxido de sodio 3 N 3.1.9 Hidróxido de bario 3 N IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1

OBTENCION DE LA PECTINA.Triturar unas manzanas en un mortero, colocar en una gasa de doble capa y prensar para eliminar el jugo. El bagazo obtenido colocarlo en una placa petri, luego llevar a secar en estufa a 100 0C por espacio de 20 - 30 minutos Remover la muestra y colocarlo en un vaso de precipitación Añadir 20 ml de agua destilada, remover para rehidratación; luego adicionar 50 ml de HCl diluido (pH: 1 – 3) y mantener a una temperatura de 70 0C por espacio de 2 horas Escurrir y prensar en gasa para eliminar el bagazo, enfriar el líquido obtenido y dejar sedimentar. En una cocina hervir el líquido para concentrar su volumen hasta ¼ de su volumen. 

 





4.2

IDENTIFICACION.Seguir las indicaciones del siguiente cuadro, cada tubo debe ser observado inmediatamente para un mejor reconocimiento. TUBOS (ml)

BIOQUIMICA

I

II

III

14

IV

CARACTERISTICAS


INGENIERIA AGRONOMA

Muestra NaOH 3N (gotas) Ba(OH)2 3N Acetona Etanol


1.0 02 ----------

1.0 ---0.5 -------

1.0 ------5 ----

1.0 ---------5

----pp amarillo gelatinoso pp blanco gel incoloro gel incoloro

V.- RESULTADOS Y DISCUSION 5.1. Los resultados de cada prueba indicarlos en un cuadro como el que sigue:

CARACTERISTICAS

TUBOS

I

II

III

IV

VI. CONCLUSIONES 6.1. Indicar las conclusiones de la práctica de acuerdo a los objetivos VII. CUESTIONARIO 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5

¿Cuáles son las condiciones que se requiere para la formación de geles en la preparación de mermeladas de frutas y jaleas? ¿Qué sustancias utiliza la industria de alimentos como gelificante, además de la pectina comercial? ¿Cuál es la función de los solventes orgánicos en los tubos 3 y 4? ¿Qué sustancia se utiliza como clarificante en la elaboración de pectina comercial? ¿Qué otros materiales pueden emplearse para la obtención de pectinas? Indique el procedimiento a partir de uno de ellos.

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 8.1. Braverman, J.B. 1980. Introducción a la Bioquímica de los alimentos. El manual moderno. México.

BIOQUIMICA

15


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 8

I.- INTRODUCCIÓN: El análisis de algunas de las características físicas y químicas de las grasas y aceites es necesario, ya que de él se derivan sus propiedades. Este análisis permite establecer adulteraciones en los productos normales e identificar productos nuevos. En análisis de rutina las determinaciones de los índices de yodo, saponificación, acidez, peróxido y la materia no saponificable, junto con las pruebas cualitativas para adulteraciones son suficientes para confirmar la identidad y comestibilidad de la mayoría de las grasas y aceites. Tanto el índice de yodo como el de refracción indican el contenido de ácidos grasos no saturados; en estos, el punto de fusión es más bajo que en los ácidos grasos saturados; el índice de peroxido es indicador del grado de rancidez oxidativa de las grasas. El índice de yodo como algunos de los otros índices presenta grandes fluctuaciones en las diferentes épocas del año. Por ejemplo, la grasa de la leche tiene un 35% de ácido oleico (índice de yodo 35, aproximadamente); sin embargo, este índice es más elevado en verano y más bajo en invierno, según ha sido determinado en países que poseen estaciones marcadas II.- OBJETIVO 2.1 Determinar la extensión de rancidez oxidativa de dos muestras de aceite comestible III. EQUIPOS, MAT ERIALES Y REACTIVOS 3.1. EQUIPOS 3.1.1 Balanza analítica. 3.1.2 Bureta. 3.1.3 Frasco lavador 3.1.4 Matraces erlenmeyer esmerilados 29/32, con tapón (2). 3.1.5 Probeta de 100 ml. 3.1.6 Probeta de 50 ml 3.1.7 Pipetas de 10 ml 3.1.8 Propipetas 3.2 REACTIVOS 3.2.1 Cloroformo p.a. 3.2.2 Acido acético Glacial 38% 3.2.3 Solución saturada de yoduro de potasio 20% 3.2.4 Tiosulfato de sodio 0,01 N 3.2.5 Almidón al 1% IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Pesar una cantidad adecuada de grasa o aceite en un matraz erlenmeyer limpio y seco (5 g/ml) 2. Añadir 10 ml de cloroformo (p.a) y disolver rápidamente la grasa por agitación 3. Añadir 15 ml de ácido acético 38% 4. Añadir 1 ml de disolución saturada de yoduro de potasio. BIOQUIMICA

16


INGENIERIA AGRONOMA


5. 6. 7. 8. 9.

Tapar el matraz y agitar suavemente por rotación durante 1 minuto Dejar reposar 5 minutos en un lugar oscuro. Añadir 75 ml de agua destilada, sacudir con energía por 5 min. Añadir tiosulfato hasta aclarar la muestra Valorar el yodo liberado con disolución de tiosulfato de sodio 0,01N, utilizando disolución de almidón (1 ml) como indicador (gotas). 10. Paralelamente, efectuar un ensayo en blanco. V.- RESULTADOS Cálculos El índice de peróxidos (IP) se expresa en miliequivalentes de oxígeno activo por kilogramo de muestra:

En donde: V = volumen de disolución de tiosulfato de sodio, en ml consumido en el ensayo de la muestra. V' = volumen de disolución de tiosulfato de sodio, en ml consumido en el blanco. N = normalidad de la disolución de tiosulfato de sodio. m = peso, en gramos, de la muestra. VI.- DISCUSIÓN 6.1. Explicar los resultados en base a la literatura recomendada. VII.- CONCLUSIONES 7.1. Anotar sus conclusiones de acuerdo a sus resultados y objetivos. VIII.- CUESTIONARIO 7.1. Esquematice un flujograma de la práctica 7.2. Escribir la reacción entre los peróxidos y el yoduro de potasio. 7.3. Escribir la reacción de valoración (sub apartado 4 de la metodología). IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 7.1. Horton, H. 1995. Bioquímica. Prentice – Hall. Hispanoamericana. S.A. México 7.2. Murray, R. y Col. 1996. Bioquímica de Harper. 13era. Edición. Manual Moderno. México D.F.

BIOQUIMICA

17


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 9

I.- INTRODUCCION El ácido desoxirribonucleico (ADN), es una macromolécula presente en todos los seres vivos, incluyendo muchos virus (adenovirus), es la portadora la herencia. Gracias a los trabajos de Watson y Crack en 1953, propusieron un modelo estructural del ADN compuesto por dos cadenas antiparalelas en forma de hélice. La unidad básica del ADN lo constituye un nucleótido (el ADN es un polímero de polinucleótidos), que está compuesto por un monosacárido de 5 carbonos, una desoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada que puede ser purina: adenina o guanina o base pirimídica: citosina, timina o uracilo. La estructura del ADN suele semejarse a una escalera de mano, en la que las barras están constituidas por unas series alternantes de moléculas de desoxirribosa, ácido fosfórico y los peldaños por pares de bases nitrogenadas complementarias que están unidas entre sí por puentes de hidrógeno y las moléculas de desoxirribosa por puentes de oxígeno. El ADN regula la actividad celular, debido a la síntesis de proteínas que, en su gran mayoría, son enzimas. La información necesaria para la síntesis de proteínas se encuentra en el ADN en forma de clave que están representadas por la secuencia de las bases nitrogenadas. II.- OBJETIVOS 2.1. Extraer el ADN a partir de una muestra biológica 2.2. Reconocer microscópicamente el ADN, haciendo uso de un colorante. III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 3.2

EQUIPOS 3.1.1 Microscopio 3.1.2 Balanza MATERIALES Y REACTIVOS PROPORCIONADO POR EL ALUMNO 3.2.1 10 g de hígado de pollo (por sub grupo de práctica) 3.2.2 10 g de detergente 3.2.3 01 bolsa de gasa PROPORCIONADO POR EL ALUMNO 3.2.4 Solución salina fisiológica 3.2.5 Solución de cloruro de sodio 2 M 3.2.6 Alcohol de 96 % 3.2.7 Colorante de acridina o safranina 3.2.8 Mortero 3.2.9 Vasos de precipitación 3.2.10 Varillas de agitación 3.2.11 Pipetas de 10 ml 3.2.12 Embudo de vidrio 3.2.13 Láminas portaobjetos

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1

EXTRACCIÓN DEL ADN 4.1.1 En un mortero triturar 10 g de hígado de pollo con 15 ml de SSF 4.1.2 Filtrar la mezcla en 3 capas de gasa para eliminar restos de tejido

BIOQUIMICA

18


INGENIERIA AGRONOMA


4.1.3 Agregar una solución de NaCl 2 M (sol. Hipertónica) en igual volumen del filtrado. Luego añade 1 g de detergente y agitar con una varilla de vidrio durante 10 minutos aproximadamente. 4.1.4 Verter la solución anterior en un vaso de precipitación, agregar lentamente alcohol por las paredes del vaso hasta que se formen dos capas o fases. En la interfase se precipita el ADN. 4.1.5. Con la ayuda de una varilla de agitación ir moviendo en la misma dirección y observar cómo se va adviniendo una fibra blanquecina transparente a simple vista (ADN) en la varilla 4.1.6. Realiza una preparación en fresco, sacando una fibra de ADN y depositándolo en una lámina portaobjeto y agregar el colorante 4.1.7 Dejar actuar el colorante por dos minutos, observar en el microscopio a menor y mayor aumento y determinar su estructura fibrilar V. RESULTADOS Y DISCUSION 5.1. Representar mediante un flujograma el procedimiento de extracción del ADN 5.2. Esquematizar las observaciones microscópicas VI. CONCLUSIONES 6.1. Anotar sus conclusiones de la práctica. VII. CUESTIONARIO 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5

¿Qué muestras biológicas podrían utilizarse para extraer ADN? ¿Cuál es el modelo estructural del ADN? ¿Cuáles son las funciones del ADN? ¿Qué otros colorantes podrán ser usados para visualizar el ADN? ¿Cuál es la importancia de la práctica?

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 8.1. Cortez, L.R. 1991. Manual de prácticas de biología general. Universidad Nacional de la Libertad. Departamento de Ciencias Biológicas. Trujillo, Perú. 8.2. Gree, E. y Bobrowsky, K. 1970. Laboratorio de Biología de Investigaciones. Publicaciones Cultural S.A. D.F. de México. 8.3. Villee, C. 1981. Biología. 7ma. Edición. Nueva Editorial Interamericana S.A. México.

BIOQUIMICA

19


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 10

I.- INTRODUCCION Durante la replicación del DNA y otros procesos, deben separarse las dos hebras de la doble hélice, una de la otra, al menos en una región localizada. Las dos hebras de la hélice de DNA se separan cuando se rompen los enlaces de hidrogeno que unen los pares de bases. En el laboratorio, se puede deshacer la doble hélice calentando una disolución de DNA o bien añadiendo un ácido o un álcali para ionizar las bases. La disociación de la doble hélice normalmente se llama fusión porque tiene lugar de forma relativamente brusca a una temperatura determinada. La fusión de los ácidos nucléicos se puede evaluar fácilmente midiendo el comportamiento en su absorbancia de luz, que tiene un pico a una longitud de onda de 260 nm (ver fig.).

En ese sentido, las bases apiladas de los ácidos nucleicos absorben menos luz ultravioleta que las bases que no lo están, efecto que se conoce como hipocromismo. II.- OBJETIVOS 2.3.

conocer el efecto de la temperatura en la desnaturalización del DNA, así como también, determinar los espectros de absorción del DNA natural y desnaturalizado.

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 3.3 EQUIPOS 3.3.1 Espectrofotómetro 3.3.2 Baño María 3.4 MATERIALES Y REACTIVOS PROPORCIONADO POR EL ALUMNO 04 vasos de precipitación o vasitos de plástico. 06 tubos de ensayo 01 cuchilla 01 cebolla pequeña 01 hígado de pollo 1 L de agua destilada Detergente NaCl (Sal)        

BIOQUIMICA

20


INGENIERIA AGRONOMA

    


02 Embudos Gasa, papel filtro o un pañuelo blanco Zumo de piña Alcohol de 96º muy frío Solución desestabilizadora: 900 de H20: 100 detergente + 2 cdtas. de NaCl.

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Extracción del DNA Machacar 05 g de hígado de pollo o cebolla, en un mortero por espacio de 3 min, seguidamente mezclarlo con 10 ml de solución desestabilizadora, moviéndolo durante 2 min. Se filtra el líquido obtenido con un papel filtro o gasa. Después, se llena un cuarto de un tubo de ensayo con la disolución filtrada y se añade otro tanto de pepsina (zumo de piña) y se mezcla vigorosamente. Se añade un volumen de alcohol muy frío equivalente al del filtrado, cuidadosamente, haciéndolo resbalar por las paredes del vaso para que forme una capa sobre el filtrado. Se deja reposar durante 2 ó 3 minutos hasta que se forme una zona turbia entre las dos capas. Finalmente, se introduce una varilla de vidrio y se extrae una maraña de fibras blancas de DNA. Es importante que cuando se añada el alcohol frío se debe hacer de forma tal que resbale por las paredes del tubo para que se forme una capa sobre el filtrado y luego retirar el “DNA natural” con una varilla de vidrio. Desnaturalización del DNA En primer lugar, hay que resuspender en 10 ml de agua destilada el DNA natural extraído en el paso anterior. Después, hay que tomar 05 ml de la solución de DNA natural y calentarlos a una temperatura de 80°C por espacio de 3 min. De esta manera se obtendrá el “DNA desnaturalizado”.

Determinación del espectro de absorción del DNA Con las muestras obtenidas, el DNA natural y el DNA desnaturalizado, se realizarán lecturas espectrofotométricas en un rango de longitud de onda de 200-300 nm, y con una frecuencia de cada 10 nm. V. RESULTADOS Y DISCUSION 5.3.

Se realizará la construcción de los espectros de absorción del DNA natural y desnaturalizado. Es interesante encontrar los picos de máxima absorción y encontrar la explicación de acuerdo con las propiedades físico químicas del DNA. Después, se discutirán los resultados ayuda de la literatura especializada.

VI. CONCLUSIONES 6.1. Anotar sus conclusiones de la práctica. VII. CUESTIONARIO 7. 1. Definir que es hipercromismo. Mencionar ejemplos. 7. 2. ¿Cuál es la diferencia entre temperatura de fusión y temperatura de desnaturalización? 7. 3. ¿Por qué se hacen lecturas espectrofotométricas del DNA en el espectro de 200-300nm? 7.4. ¿Qué otras propiedades físicas tiene el DNA? 7.5. Definir que son los cromóforos ¿Cuáles son los elementos del DNA que tienen esta función? VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. 2. 3.

Clark J. Bioquímica Experimental. Tr. por Justino Burgos Gonzáles. Zaragoza: Acribia; 1996 Garrido A. Fundamentos de Bioquímica estructural. Madrid: Alfaomega; 2005 Laguna J y Piña E. Bioquímica de Laguna. 6ª ed. México: El Manual Moderno; 2007

BIOQUIMICA

21


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 13

I.- INTRODUCCION La mayoría de los vegetales obtienen la casi totalidad de sus nutrientes minerales vía raíces pero, en ocasiones, las sales se incorporan a través de las hojas (epifitos). El 25%, de Ia materia seca de los vegetales está compuesto por carbono, oxigeno, nitrógeno 1, nitrógeno. El 5{/o restante lo forman diversos elementos minerales de los que unos son imprescindibles para el desarrollo vegetal y otros son accesorios. La falta de un elemento esencial provoca serios problemas fisiológicos en las plantas traduciéndose luego en trastornos de tipo estructural y morfológico, provocando posteriormente la muerte prematura de la planta. El principal problema de la nutrición mineral es determinar cuáles de los elementos son esenciales. Al hacer un análisis de tejido en una planta no prueba su esencialidad. Una forma de resolver el problema de la esencialidad es haciendo crecer plantas ante la completa ausencia de un elemento dado. Si la planta crece normalmente, evidentemente el elemento no es esencial, pero si normalmente decae su crecimiento. El elemento es esencial. Entonces, un elemento es esencial si la planta no puede completar su ciclo vegetativo y/o reproductivo ante Ia deficiencia de dicho elemento. Una forma de estudiar los efectos de las deficiencias de los elementos esenciales en las plantas es haciendo crecer plan1as en soluciones nutritivas con niveles deficientes, óptimos y/o tóxicos de cualquiera de los ejercicios esenciales, para diferenciar los múltiples síntomas que éstos provocan en los distintos órganos de las plantas, principalmente en el follaje, para el desarrollo de esta práctica" primero prepararemos el material vegetal, lo cual es hacer germinar las semillas del vegetal que vamos a utilizar, luego se preparan las soluciones nutritivas con fertilizantes comerciales y posteriormente se colocaban las plantas en ellas y mantenidas mediante la técnica de la hidroponía la evaluación. La evaluación del elemento deficiente se hará midiendo e1 crecimiento y anotando los síntomas que aparezcan. OBJETIVOS: Diferenciar los síntomas de las deficiencias de un nutriente en las plantas. Adiestrarse en las desinfestaciones del material vegetal y preparación de soluciones nutritivas. A. PREPARACTÓN DEL MATERIAL VEGETAL Puede usarse diversas especies vegetales para demostrarles deficiencias de los nutrientes minerales. Sin embargo, usualmente se emplean plantas de tomate, girasol, tabaco o frijol, 1,a que ellas manifiestan muy bien los diversos síntomas. Objetivo: Adiestrarse en el proceso cie germinación y en 1a manipulación de plántulas Material de Practica: Material Biológico: Lote de semillas de alfalfa (Medicago sativa) o frejol (Phaseolus Material de Laboratorio: Sustrato: grava arena de río, papel de filtro, etc. 06 Germinadores 01 litro de lejía comercial Clorox 01 litro de agua destilada 01 navaja Gillette 02 beaker (100 ml)

vulgaris)

ll. PROCEDIMIENTO BIOQUIMICA

22


INGENIERIA AGRONOMA


l. Semilla: la semilla debe ser de buena calidad, y no haber sido tratados con sustancias químicas, como fungicida. Lavar la semilla con agua de grifo, para eliminar las impurezas. Remojar las sernillas en una solución de lejía l% por cinco (5'), el tiempo depende la especie vegetal con que se trabaje. Se elimina la solución de lejía y e continuación se enjuaga varias veces, las semillas, con agua destilada. Dejar las semillas en agua destilada, para luego ser llevadas al sustrato e iniciar el proceso de germinación. 2. Sustrato: Es el medio de soporte en donde germinaran las semillas. Este sustrato debe rellenar poca humedad., el diámetro de las partículas deben estar en un rango de 2 a l0 ml, que no sea material calcáreo y que no presente sustancias orgánicas. Si se utiliza grava o arena se recomienda desinfestarle con lejía 1% por 24 horas luego se elimina la lejía y se lava varias veces hasta que no trascienda a lejía. También se puede usar como desinfectante formol, o el proceso de solarización, etc. 3. Germinación: Colocar las semillas en el sustrato a utilizan, previamente humedecido y depositarlo en maceteros o semilleros. Las semillas germinan fácilmente a la temperatura de la habitación y/o invernadero. Para mantener las semillas germinación, regar solamente con agua destilada. 4. Plántulas: A los 10 o l5 días de la germinación, según la especie se selecciona las que mejor aspecto presenta (altura promedio, hojas enteras y verdes, tallo recto etc.), si se observan cotiledones, estos deben ser eliminados. Cuando aparezcan el segundo nivel de hojas se debe iniciar la experiencia. IV. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es Ia diferencia entre un desinfestante y desinfectante? 2. ¿Por qué se remojan las semillas en lejía 1 %? El Clorox contiene 5,259á de hipoclorito de sodio como sustancia activa. ¿Cuántos ml debo formar de Clorox para preparar 50 ml de lejía al 1%? PREPARACIÓN DE LAS SOLUCION ES Objetivos: Calcular los pesos de los fertilizantes que intervienen en la solución de Hogland & Amon (1938). Determinar los volúmenes a utilizar a partir de una solución stock Adiestrar al estudiante en la técnica del cultivo hidropónico. Material de Práctica Material Biológico: Plántulas de frejol (Phasolus vulgaris). Material de Laboratorio: 01 kg de mezcla sulfonítrica 31?/n N 01 kg de KNo3 (l59l" N. 4496 K?o) 01 kg de Supersimple (20y; P20t, 20%CaA) 01 kg de SoMg (20%MgO, B0% S04) 01 litro Fe -EDTA (10?/o Fe) Solución stock de micronutrientes 01 kg SO4K2 (50% K2O) 250g de benlate (funguicida) 10Pipetas (1,5 y 10 ml) 05 probetas (100 v 250 ml) 05 litros de agua de grifo 01 balanza analítica 10 frascos oscuros (capacidad 500 ml) 10 tapones (technopor) 250 g de detergente 500 g de algodón III. Procedimiento: Preparación de las soluciones stock: Solución stock de mezcla sulfonitrica:

BIOQUIMICA

23


INGENIERIA AGRONOMA


0,32 g M.S contiene 0,1 g N En32 g M.S/ habrán 10g de N o 10 N/ml solución stock. Solución stock de KNO3: 0,68 g de KNO3 contiene 0,25 g K y 0,10 g de N En 68 g de KNO3/1 habrán 25 g de K v l0 g de N ó 25 Solución stock Solución Stock de Súper Simple 0,34 g S.S contiene 0,03 g P y 0,049 g Ca En 34g de S.S/ habrán 3.0 g dc P y 4,9 g de Ca ó 3,0 mg P y 4,9 mg de Ca/ml de solución stock. Solución stock de SOMg 0,1 g de SOaMg contiene 0.012 g Mg y 0,027 g S. En 10 g de SOMg/habrán 1,2 g de Mg o 1,2 de Mg/ml de sol. Stock. Solucion stock de SOK 0.6 g SOKr/l habrán 25 g de K ó 25 mg K/ml sol stock. Milimetros de soluciones stock para preparar un litro de solución nutritiva usando aguade grifo (UNT) Soluciones Stock

M sulfonítrica KNO Super Simple SOK SOMg Fe EDTA Micronutrientes

Testigo

N

10 10 10 0 10 1 1

0 0 10 10 10 1 1

P

10 10 0 0 10 1 1

K

20 0 10 0 10 1 1

Fe

10 10 10 0 10 0 1

Lavar los frascos de suero, pintados de color negro, detergente y enjuagar varias veces con agua de grifo. Al preparar la solución nutritiva, primero vierta la mitad del volumen final de agua de grifo en los frascos; luego adicione las solucione stock según el cuadro descrito líneas arriba. La cantidad de mililitros de cada solución stock señalada es la requerida para un litro de solución nutritiva. Cada solución stock deberá añadirse lentamente, mezclando completamente antes de agregar la próxima solución stock. Para evitar la contaminación de las soluciones stock, cada una de ellas deberá tener su pipeta respectiva, la cual no puede ser utilizada para varias soluciones stock a la vez. Después que se han agregado todas las soluciones stock completar con agua de grifo hará el volumen final requerido. Transferencia de las Plántulas a la Macetas: Las macetas a utilizar deben estar forradas, en su interior por un plástico de color negro y en la base deben ser perforadas por un tubo de drenaje. Agregar a las macetas el sustrato desinfestado y regar con agua de grifo. Las plántulas, previamente desinfestadas. Deben ser acomodadas en las macetas, teniendo cuidado de no romper las raíces. Todo el sistema debe ser colocado bajo sombra por 15 días. Durante los primeros 5 días, las plántulas dañadas o infectadas deberán ser reemplazadas. Las plantas que posteriormente sufran un accidente no deberán ser reemplazadas, pero si dadas a conocer en el informe. CUESTIONARIO l. Escriba la definición de ppm y mili equivalente. 2. De los siguientes enunciados ¿Cual define correctamente a ppm? 1ug/g 1mg/l 1ul/l En una formulación de nutrientes nos pide 200ppm Ca (200 mg/l) ¿Cuántos m de Ca (NO) son necesarios agregar a la solución, asumiendo 100% de pureza? ¿Qué cantidad de N (ppm) hemos añadido al satisfacer las necesidades de Ca? Del problema anterior, si la formulación del nutriente nos pide 150ppm N ¿Se debe agregar o disminuir el N? expréselo en ppm. Si necesita N utilice KNO ¿Por qué es necesario conocer la calidad del agua,

BIOQUIMICA

24


INGENIERIA AGRONOMA


especialmente en lo que refiere a la conductividad eléctrica (mMhos/cm), pH, relación de adsorción de sodio (SAR), presencia de cloruros, boro, carbonatos y bicarbonatos. ANALISIS DEL CRECIMIENTO Objetivos: Reconocer como el crecimiento de la planta es afectado por la falta de un nutriente. Determinar mediante mediciones, gráficas y fórmulas, corno es el crecimiento de una planta. Material de Práctica: Material Biológico: Plantas mantenidas en hidroponía y en tratamiento por deficiencia de nutrientes. Material de Laboratorio: 01 Regla (50 cm) 05 Papel milimetrado 0l Estufa 01 Balanza analítica 0I Termómetro III. Procedimiento: Iniciada la experiencia, cada semana debe anotar Ia apariencia que presenta la planta (síntomas) en una hoja que se le alcanza con esta experiencia- Además se medirá la longitud del vástago, de los entrenudos, número de hojas que van presentando, y el área foliar. 2. La primera, cuarta y octava semana en que se realiza la experiencia- se deben tomar los siguientes datos: Longitud del vástago Longitud de las raíces Longitud de los entrenudos Área foliar Peso fresco del vástago Peso fresco de las raíces Peso seco del vástago Peso seco de las raíces 3. Con los datos obtenidos realizar: Graficas: curvas, histogramas, polígonos Análisis cuantitativos; aplicar fórmulas ICR, IAN, RAF, IC. Cuestionario l. De los elementos minerales en que circunstancia se dice que un elemento es móvil y no móvil. Para hacer un diagnóstico nutricional, ¿Qué métodos conoce para evaluar el requerimiento nutricional? 3 ¿Que se entiende por clorosis-tipos en que se presenta; necrosis; moteado; Marchitamiento, achaparrado? Hacer un resumen de la importancia del N, P, K, Ca, Mg, Fe. S y Micronutrientes, en relación a: Sueño: origen, formas y contenido Planta: asimilación, fisiología, carencia y diagnostico foliar. 5. Esquematice: clorosis intervenal e intravenal. Necrosis marginal y nervaduras antocianicas.

BIOQUIMICA

25


INGENIERIA AGRONOMA


PRACTICA N0 15

I.- INTRODUCCION Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se dividen por gemación. En común con otras células eucariontes, las levaduras tienen un núcleo en donde reside la información genética de la célula, mitocondrias en donde se lleva a cabo la síntesis de ATP y un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de proteínas cuya localización final es la membrana plasmática o el exterior. A nivel de la membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Esta proteína es semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la ATPasa de Na+/K+ de las células animales y, al igual que la bomba de sodio/potasio, se inhibe con concentraciones micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o uniportadores. Para darse una idea de la importancia de esta enzima en la economía celular y en la energización de la membrana celular, basta decir que la ATPasa de H+ consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la célula.

Además de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que se encarga de la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana plasmática, el flujo de protones a través de la ATP sintasa induce la síntesis de ATP. Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la oligomicina. Así, se puede proponer uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en la levadura: por un lado, el ATP se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, y a nivel de la membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para bombear protones al exterior de la célula. El factor común en ambos casos es un flujo de protones a través de la membrana. Objetivos 1. Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras. 2. Que el alumno describa las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH.

BIOQUIMICA

26


INGENIERIA AGRONOMA


3. Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida de protones. Hipótesis Si las levaduras consumen glucosa, se observará una disminución progresiva de su concentración en el medio de cultivo con el tiempo y cambios en el pH extracelular. Material

• Tres vasos de precipitado de 100 ml. • Pipetas de 5 y 10 ml. • Potenciómetro. • Piceta para enjuagar el electrodo del potenciómetro. • Levadura ( Saccharomyces cerevisiae ) 200 mg/ml. • Solución de glucosa (10%) para una concentración final de 1%. • Solución de dinitrofenol 40 mmol/l en etanol. • Solución de azida de sodio 400 mmol/l. • Agua destilada.

Método Experimento 1 (control) 1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada. 2. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal. 3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH. 4. Determinar el pH de la solución cada 5 minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos 2 veces más. EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL) 1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada. 2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40 mmol/l, concentración final de 200 μmol/l.

3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal. 4. Esperar 5 minutos. 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control. EXPERIMENTO 3 (AZIDA) 1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada. 2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5 ml de la solución de azida de sodio 400 mmol/l, concentración final de 5 mmol/l. Agitar con cuidado. 3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal. 4. Esperar 5 minutos. 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control. 6. Registrar sus datos en la siguiente tabla. TIEMPO (Minutos) 0 5 10 15 20 30 40

pH DINITROFENOL AZIDA DE SODIO

GLUCOSA

Análisis de resultados 1. Hacer una gráfica de cada uno de los experimentos; utilizar los valores de las lecturas de pH contra tiempo.

BIOQUIMICA

27


INGENIERIA AGRONOMA


2. Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio. 3. Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tomar en cuenta que las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmática cuya función es similar a la bomba de Na+/K+ en las células de los mamíferos (ver fig. 7.1). Referencias 1. Peña A. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch Biochem Biophys. 1975; 167:397409. 2. Pardo JP. La ATPasa de H+ de la membrana plasmática de los hongos. Mensaje Bioquímico. 1990; 13: 119-172 Responda a las siguientes preguntas: 1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura? 2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos? 3. ¿En qué consisten la glucólisis y la fosforilación oxidativa? 4. ¿Cuáles son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las levaduras? 5. ¿Cuáles son los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios I, II y III? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP. 6. ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual los protonóforos desacoplan la fosforilación oxidativa? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP.

BIOQUIMICA

28


INGENIERIA AGRONOMA


REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 4. Alemany, M y S. Font. Prácticas de Bioquímica. Madrid: Alhambra S.A.; 1983 5. Beckett J, Walker S W, Rae R y Chemical Biochemistry . New York: John Ashby P. Wiley & sons; 2005 6. Berg J M, Tymoczko J L y Bioquímica. Barcelona: Reverté; Barcelona; Stryer L. 2008 7. Campbell M K y Farrell S. Bioquímica , México:Thompson; 2004 8. Cox M y Nelson D. Lehinger Principles of Biochemistry . 4 th ed. San Francisco: W. H. Freeman; 2005 9. Chang R. Físico Química con Aplicaciones a Sistemas Biológicos . México: C.E.C.S.A;1986 10. Clark J. Bioquímica Experimental . Tr. por Justino Burgos Gonzáles. Zaragoza: Acribia; 1996 11. Garrido A. Fundamentos de Bioquímica estructural . Madrid: Alfaomega; 2005 12. Laguna J y Piña E. Bioquímica de Laguna . 6ª ed. México: El Manual Moderno; 2007 13. Morris J.G. Físicoquímica para biólogos . Barcelona: Reverté; 2001 14. Mc Kee T y Mc Kee J R. Biochemistry: An Introduction . 3 rd. ed. New York: Mc GrawHill; 2002 15. Segel I.H. Cálculos de bioquímica. Cómo resolver problemas matemáticos de bioquímica general. Zaragoza: Acribia; 1982 16. Vásquez R. Termodinámica Biológica . México: AGT Editor S.A.; 2002 17. Voet D, Voet J y Pratt C. Fundamentos de Bioquímica: La vida a nivel molecular . Médica Panamericana (2007)

BIOQUIMICA

29


INGENIERIA AGRONOMA


ANEXOS

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Las reacciones que se estudian en Bioquímica están en disolución, por lo que es necesario recordar las formas de expresar e interconvertir las concentraciones de soluciones. 1.- CONCENTRACIONES BASADAS EN EL VOLUMEN: Molaridad (M).- Es el número de moles de soluto por litro de solución, se da entre

corchetes, por ejemplo [H +] es la molaridad del ion Hidronio. M= N° de moles/ litro de solución La molaridad se calcula de la siguiente manera: N° de moles= P / PM, donde P= Peso del soluto PM= Peso molecular del soluto

En el organismo los solutos se encuentran en soluciones diluidas, tales como: 1mM = 10-3 M = 1 nmol/l = 1 µmol/ml 1µM = 10-6 M = 1 µmol/l = 1 nml/ml 1nM = 10-9 M = 1 nmol/l = 1 pmol/ml Una disolución 1M contiene un Número de Avogadro de moléculas; Número de Avogadro= 6.023x 10 23

moléculas, átomos o iones por Molécula-g, átomo-g o íon-g

En general un número de Avogadro de partículas se denomina mol, independientemente de si es iónica, monoatómica o molecular, es decir si es ion-g, átomo-g o molécula-g. Actividad (α) .-

Es la molaridad aparente o efectiva de un soluto; la actividad o molaridad de un soluto se relaciona de la siguiente manera: α=

γ M,

donde;

α= Actividad γ= Coeficiente de actividad, es decir la fracción activa de la concentración

real, y suele ser menor que la unidad.

Por ejemplo, el HCl en disolución molar está totalmente ionizado, pero la disolución se comporta como si solo tuviera [H +]= 0,86M, por tanto γ= 0,86 Normalidad ( N ).- Es el número de equivalentes de soluto por litro de solución, para

conocer el número de equivalentes hay que conocer primero el peso de soluto disuelto (W) y su peso equivalente (PE) y relacionarlos de la siguiente manera: Número de equivalentes= W/PE, donde BIOQUIMICA

30


INGENIERIA AGRONOMA


PE = PM/n, donde n= Número de H+ u OH- sustituibles por molécula (para ácidos o bases) o n= Número de electrones ganados o perdidos por moléculas (para agentes oxidantes o reductores) La molaridad y normalidad se relacionan por:

N=nM

Por lo que una disolución 0,01 M de H 3P04 es 0,03N Porcentaje peso/volumen (%p/v) .- Es el peso en g de soluto por 100 ml de solución.

Se utiliza mayormente en los casos en que las concentraciones exactas de soluto no son demasiado importantes. Porcentaje en miligramos (mg%) .- Peso en mg de soluto por 100 ml de solución

Se utiliza mayormente en laboratorio clínico, por ejemplo un valor clínico de glucosa en sangre de 225 significa que hay 225 mg de glucosa en 100 ml de suero sanguíneo Osmolaridad .- Es la molaridad de partículas en una solución. Una solución 1M de un

soluto no disociable es 1 osmolar. Una solución 1 M de un soluto disociable es n osmolar, donde n es el número de iones producidos por la molécula, p.e. Una solución 0,05M de NaCl es 0,1 osmolar, pues se generaron dos iones: Na + y Cl-. PROBLEMAS DE RECAPITULACIÓN: 1.- ¿Cuántos gramos de NaOH se requieren para preparar 500 ml (0.5 L) de solución 0,04 M? y expresar la concentración de esta solución en N, g/l, %p/v, mg% y osmolaridad Solución: Litros / M = número de moles de NaOH requeridos 0,5 / 0,04 = 0,02 moles de NaOH se necesitan Número de moles = P/PM 0,02 = P/40 P = 0,02x40 P = 0,8 g Se pesan 0,8 g se disuelven en agua y se completa a 500 ml El NaOH contiene un OH- por molécula, entonces M=N y la solución es 0,04 N La solución contiene 0,8 g/500 ml o 1,6 g/L o también % (p/v) = g por 100 ml, y como tenemos 1,6g/ 1000 ml = 0,16 g/ 100 ml = 0,16% o mg% = mg por 100 ml = 0,16 G/100 = 160 mg/ 100 ml = 160 mg % Como Na OH nos da 2 partículas ( Na + y OH- ) La osmolaridad = 2 x M = 0,08 Osmolar

BIOQUIMICA

31


INGENIERIA AGRONOMA


2.- Cuántos mililitros de H2SO4 5M se necesitan para preparar 1500 ml de una solución de H 2 SO4 0,002 M Este problema es de importancia práctica, pues a veces se necesita una solución determinada y solo tiene otra preparada para otro fin, que le puede ser útil y se desarrolla teniendo en cuenta que el número de moles a usar debe ser el mismo en ambas soluciones, por lo tanto como Número de moles = M x volumen en litros Litros x M (solución diluida) = Litros x M (solución concentrada) Reemplazando valores: 1,5 L x 0,002M = L x 5M Luego de despejar l y realizar las operaciones tenemos L = 0,6 ml O lo que es lo mismo que se deben tomar 0,6 ml de la solución 5M y diluir hasta 1,5 l 2.- CONCENTRACIONES BASADAS EN EL PESO Porcentaje peso/peso (% p/p).- Es el peso en g de soluto por 100 g de solución

Esta forma es útil con los ácidos cuya concentración viene dada en % p/p. En este caso es necesario conocer primeo su densidad (ρ) o peso específico (pe), que es: ρ=

peso por unidad de volumen

pe= ρ respecto al agua, como la ρ del agua es 1 g/ml; e l pe es numéricamente igual a la densidad Molalidad (m) .- Es el número de moles de soluto por 1000 g de disolvente

Se utiliza en cálculos físico-químicos, tales como los puntos de ebullición o disminución de puntos de congelación, para soluciones acuosas diluidas, m y M son prácticamente iguales; para interconvertir m y M se necesita conocer el % p/p. Fracción molar (X).- Es la fracción del número total de moles presentes que representa

el compuesto en cuestión y es útil mayormente en algunos cálculos bioquímicos. Por ejemplo en una solución que contiene n 1 del compuesto 1, n2 del compuesto 2 y n3 del compuesto 3, la fracción molar del compuesto 2, X viene dada por: X2 = n2 /n1 + n2 + n3 PROBLEMAS DE RECAPITULACIÓN: Preparar 2 litros de HCl 0,4M partiendo de una solución de HCl concentrado (HCl 28% p/p, PE= 1,15). Calcular su molalidad y fracción molar Solución: Para la primera parte Método 1: Primero calcular el número de moles

BIOQUIMICA

32


INGENIERIA AGRONOMA


Número de moles

= litros x M = 2 x 0,4 = 0,8 moles de HCL son los que se necesitan Luego se calcula el peso Peso

= número de moles x PM = 0,80 x 36,5 = 29,2 g de HCl puro Como la solución comercial del HCl no viene pura sino al 28% en peso se necesitan 29,2 / 0,28 = 104,3 g de solución comercial. Al venir el ácido en forma líquida, en lugar de pesarlo, podemos medir su volumen, el cual es calculado a partir de la fórmula de la ρ Volumen = P/ρ

= 104,3/1,15 = 90,7 ml de solución comercial son requeridos

Método 2: Todo el raciocinio anterior se puede resumir en la siguiente fórmula: Peso = V x ρ x % (tanto por uno), donde Peso = peso de sustancia requerida en g V = Volumen de solución original en ml = densidad Ρ % = fracción del peso total que es sustancia pura Por lo tanto: V= P / ρ x % = 29,2 / 1,15 x 0,28 = 90,7 ml Método 3: Se calcula primero la molaridad de la solución comercial y para ello tenemos que conocer el peso de HCl puro en 1 L de solución comercial: P

=Vxρx%

= 1000 x 1,15 x 0,28 = 322 g El número de moles en la solución comercial será Número de moles = P/PM = 322/36,5 = 8,82 moles Por lo tanto la solución comercial de HCL es 8,82M Como necesitamos 0,08 moles V=Número de moles/ M = 0,8/8,82 = 0,0907 litros Por lo que se toman 90,7 ml de solución comercial y se diluyen hasta 2 litros Para la molalidad: Como la solución de HCL es al 28%, entonces contiene 28 ml de HCl por 100 g de solución o 28 g de HCL por (100-28)= 72 g de H2O. En 1 l se tiene: 28/72 x 1000 =388,9 g HCl/ 1000 g de H 2O Y como Número de moles = P/PM =388,9/36,5 = 10,65 moles HCl/1000g H2O. Entonces la solución es 10,65m Para la fracción molar: Tenemos en 100 g de solución

BIOQUIMICA

33


INGENIERIA AGRONOMA


Número de moles HCl = P/PM = 28g HCl/36,5 g/mol = 0,767 moles HCl y Número de moles H 2O =P/PM = 72 g H 2O/ 18 g/mol = 4,0 moles H 2O XH Cl = nHCl/nHCl + nH2 O = 0,767/4,767 = 0,161 Entonces XH Cl = 0,161

SOLUCIONES AMORTIGUADORAS, TAMPÓN O BUFFER pH

Calcular el pH, el pOH y el número de iones tanto hidrogeniones como oxidrilo por litro en cada una de las soluciones: a. HCl 0,01M

HCl  0,01 M



H  



0,01 M



concentrac ión de iones H



 

pH  log H



pH  log 0,01



pH  2



se sabe que :

 OH  10  10 OH  10 OH  10

sabemos : H

pOH  12

-2



-



pOH  pH  14



-

b.

H 2 S O4





-14

a 25 C 

14





-12

0,0025M

H  ácido  

H  





0,0025  2,5 10



3

mol

pOH  14 - 2.6



l

pH  -log 2,5 10 -3



pOH  11,4

pH  2,6 

OH  -



10 -14 2,5  10 -3



10

11



2,5

Curva de titulación Componentes de solución buffer

BIOQUIMICA

34


Manual de Bio - Agronomia

Recommend Documents