MAKALAH BIOTEKNOLOGI FARMASI INSULIN DNA REKOMBINAN
DI SUSUN OLEH :
-
Zulfah Fi!i Suli"#a$i$%"ih D'l(# Da)a#a$i Nia Al*a Da"u+i Sa!a S'$ia ,a!al"a
13 13330112 1&330001 1&330002 1&33000& 1&33000.
/ROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU /ENGETAHUAN ALAM INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL AKARTA 201 KATA /ENGANTAR
Puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga dapat tersusunnya tersusunnya tugas makalah makalah ini.
Pengembangan, Pengembangan, pembelajaran dan materi yang ada pada makalah ini, dapat senantiasa dilaku dilakukan kan oleh oleh mahas mahasisw iswaa dalam dalam bimbin bimbinga gann dosen. dosen. Up Upaya aya ini dihara diharapka pkann dapat dapat lebih lebih mengoptimalkan dalam penguasaan mahasiswa terhadap kompetensi yang dipersyaratkan. alam penyusunan makalah ini, masih banyak kekurangannya, untuk itu penulis mengharapkan tegur,sapa atau perbaikan yang akan datang.
!akarta, No"ember #$%&
DAFTAR ISI KATA KATA /ENGANTAR /ENG ANTAR .............................................. ..................................................................... .............................................. .......................................... ...................## BAB I............................................ ................................................................... .............................................. .............................................. ............................................... ........................'' /ENDAHULUAN............................................. .................................................................... .............................................. .................................................' ..........................'
11
Laa! B'la+a$%..........................................................................................................'
12
Tuua$.........................................................................................................................(
BAB II.......................................................................................................................................& /EMBAHASAN.......................................................................................................................& 21 /!i$"i4 Da"a! R'+a#a"a G'$'i+a .................................................................................& 22 /!"'" R'+a#a"a G'$'i+a ...........................................................................................%% 23 /')5uaa$ I$"uli$ *a$ /'!a$a$ Mi+!!%a$i")' ...................................................%% 2& M')5ua I$"uli$ Ma$u"ia *'$%a$ T'+$i+ DNA R'+)5i$a$ ................................%# 2. /'!5'*aa$ "u"u$a$ a"a) a)i$ 4a*a i$"uli$ )a$u"ia6 5a5i *a$ "a4i ...................%) 2 /!"'" /!*u+"i .............................................................................................................%) 27 /')5'!ia$ I$"uli$ /a*a /'$*'!ia Dia5''" M'lliu"..............................................%( 28 /!*u+ 5a u$u+ '!a4i Dia5''" M'lliu" ..............................................................%* 29 K$*i"i +'"'haa$ #a$% *a4a 5'!i$'!a+"i *'$%a$ i$"uli$ %la!%i$' ......................%+ 30 Ka!a+'!i"i+ fa!)a++i$'i+: 4'$*'+6 i$'!)'*i' *a$ l$%-ai$% "'*iaa$ i$"uli$...................................................................................................................................% BAB III....................................................................................................................................#% /ENUTU/...............................................................................................................................#% 31 KESIM/ULAN.............................................................................................................#% DAFTAR /USTAKA..............................................................................................................#)
BAB I /ENDAHULUAN 11
Laa! B'la+a
%$ ioteknologi diartikan sebagai penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam pemanaatan makhluk hidup / bakteri, ungi, "irus, dan lain-lain0 maupun produk dari makhluk hidup /en1im, alkohol0 dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. ewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer , biologi molekular , mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. engan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai 2abang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa. ioteknologi se2ara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi. Aplikasi teknologi tersebut dapat memodiikasi ungsi biologis suatu organisme dengan menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut. Pada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat. 3emajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai ma2am teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, NA rekombinan, pengembangbiakan sel induk , kloning, dan lain-lain. Teknologi ini memungkinkan kita untuk memperoleh penyembuhan penyakit-penyakit genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan, seperti kanker ataupun A4S. 3emajuan di bidang bioteknologi tak lepas dari berbagai kontro"ersi yang melingkupi perkembangan teknologinya. Sebagai 2ontoh, teknologi kloning dan rekayasa genetika terhadap tanaman pangan mendapat ke2aman dari berma2am-ma2am golongan. 5ekayasa genetika dalam arti paling luas adalah penerapan genetika untuk kepentingan manusia. engan pengertian ini kegiatan pemuliaaan hewan atau tanaman melalui seleksi dalam populasi dapat dimasukkan. emikian pula penerapan mutasi buatan tanpa target dapat pula dimasukkan. 6asyarakat ilmiah sekarang lebih bersepakat dengan batasan yang lebih sempit, yaitu penerapan teknik-teknik genetika molekular untuk mengubah susunan genetik dalam kromosom atau mengubah sistem ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanaatan tertentu. Perubahan siat iologis melalui rekayasa genetika tersebut menyebabkan 7lahirnya organisme baru7 produk bioteknologi dengan siat - siat yang menguntungkan bagi manusia. Sebagai bagian dari kajian bioteknologi, pada penulisan makalah ini akan dibahas se2ara lebih mendalam mengenai rekayasa genetika meliputi teknik dan penerapan rekayasa genetika serta dampak dari rekayasa genetika itu sendiri.
12
Tuua$
1 Untuk mengetahui pengertian rekayasa genetika. 2 Untuk mengetahui teknik-teknik yang digunakan dalam rekayasa genetika. 3 Untuk mengetahui bagaimana penerapan dari rekayasa genetika dalam kehidupan
manusia
BAB II /EMBAHASAN 21 /!i$"i4 Da"a! R'+a#a"a G'$'i+a
5ekayasa genetika adalah proses mengidentiikasi dan mengisolasi NA dari suatu sel hidup atau mati dan memasukkannya dalam sel hidup lainnya. 5ekayasa genetika merupakan suatu 2ara memanipulasikan gen untuk menghasilkan makhluk hidup baru dengan siat yang diinginkan. 5ekayasa genetika disebut juga pen2angkokan gen atau rekombinasi NA. alam rekayasa genetika digunakan NA untuk menggabungkan siat makhluk hidup. 8al itu karena NA dari setiap makhluk hidup mempunyai struktur yang sama, sehingga dapat direkombinasikan. Selanjutnya NA tersebut akan mengatur siat-siat makhluk hidup se2ara turun-temurun. 5ekayasa 9enetika pada mikroba bertujuan untuk meningkatkan eekti"itas kerja mikroba tersebut /misalnya mikroba untuk ermentasi, pengikat nitrogen udara, meningkatkan kesuburan tanah, memper2epat proses kompos dan pembuatan makanan ternak, mikroba prebiotik untuk makanan olahan0, dan untuk menghasilkan bahan obatobatan dan kosmetika, serta Pembuatan insulin manusia dari bakteri / Sel pan2reas yang mempu mensekresi 4nsulin digunting , potongan NA itu disisipkan ke dalam Plasmid bakteri 0 NA rekombinan yang terbentuk menyatu dengan Plasmid diinjeksikan lagi ke "ektor, jika hidup segera di kembangbiaakan. Prinsip dasar teknologi rekayasa genetika adalah memanipulasi atau melakukan perubahan susunan asam nukleat dari NA /gen0 atau menyelipkan gen baru ke dalam struktur NA organisme penerima. 9en yang diselipkan dan organisme penerima dapat berasal dari organisme apa saja. Pada proses rekayasa genetika organisme yang sering digunakan adalah bakteri Escherichia coli. akteri Escherichia coli dipilih karena paling mudah dipelajari pada tara molekuler. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi NA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi NA genomik:kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul NA menjadi sejumlah ragmen dengan berbagai ukuran, isolasi NA "ektor, penyisipan ragmen NA ke dalam "ektor untuk menghasilkan molekul NA rekombinan, transormasi sel inang menggunakan molekul NA rekombinan, reisolasi molekul NA rekombinan dari sel inang, dan analisis NA rekombinan. a. Isolasi DNA 4solasi NA diawali dengan peme2ahan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan 2ara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan 2ara en1imatis seperti pemberian liso1im. ;angkah berikutnya adalah lisis sel. ahan-bahan sel
yang relati lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium buer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton <-%$$ atau dengan sodium dodesil sulat /SS0. Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. iasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentriugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan enol atau pelarut organik seperti kloroorm untuk kemudian disentriugasi dan dihan2urkan se2ara en1imatis dengan proteinase. NA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih ter2ampur dengan 5NA sehingga perlu ditambahkan 5NAse untuk membersihkan NA dari 5NA. 6olekul NA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentriugasi kerapatan menggunakan =s=l. Teknik isolasi NA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk NA genomik maupun NA "ektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua ma2am molekul NA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular /===0, sedangkan NA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya
dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan NA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan NA kromosom. >leh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan NA plasmid dengan NA kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, 1at pewarna NA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul NA. NA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh NA kromosom per satuan panjangnya. engan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan NA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan NA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentriugasi kerapatan. b. Pemotongan DNA Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul NA, baik genomik maupun plasmid. Untuk memotong NA dibutuhkan suatu en1im restriksi. ?n1im restriksi yang sering digunakan ialah en1im restriksi tipe 44. ?n1im restriksi tipe 44 antara lain mempunyai siat-siat umum yang penting sebagai berikut@
•
mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam
•
molekul NA memotong kedua untai molekul NA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat
•
pengenalannya menghasilkan ragmen-ragmen NA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.
2. Ligasi Molekul – molekul DNA Pemotongan NA genomik dan NA "ektor menggunakan en1im restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, ragmen-ragmen NA genomik nantinya harus dapat disambungkan /diligasi0 dengan NA "ektor yang sudah berbentuk linier. Ada tiga 2ara yang dapat digunakan untuk meligasi ragmen-ragmen NA se2ara in vitro.
Pertama, ligasi menggunakan en1im NA ligase dari bakteri. 3edua, ligasi
menggunakan NA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diineksi dengan bakterioag T ' atau la1im disebut sebagai en1im T ' ligase. !ika 2ara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket /sti2ky0, 2ara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul /blunt0. Sementara itu, 2ara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian en1im deoksinukleotidil transerase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik ). engan untai tunggal sema2am ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan NA ligase. Suhu optimum bagi akti"itas NA ligase sebenarnya )*B=. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang se2ara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. >leh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara ' dan %(B= dengan waktu inkubasi /reaksi0 yang diperpanjang /sering kali hingga semalam0. Pada reaksi ligasi antara ragmen-ragmen NA genomik dan NA "ektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan en1im restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. 8al ini jelas akan menurunkan eisiensi ligasi. Untuk meningkatkan eisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa 2ara, antara lain penggunaan NA dengan konsentrasi tinggi /lebih dari %$$Cg:ml0, perlakuan dengan en1im alkalin osatase untuk menghilangkan gugus osat dari ujung ( pada molekul NA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan en1im deoksinukleotidil transerase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik ) seperti telah disebutkan di atas.
d. Transformasi el Inang Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan NA genomik dan NA "ektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul NA tersebut. menggunakan teknik elektrooresis. !ika hasil elektrooresis menunjukkan bahwa ragmenragmen NA genomik telah terligasi dengan baik pada NA "ektor sehingga terbentuk molekul NA rekombinan, 2ampuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan 2epat. engan sendirinya, di dalam 2ampuran reaksi tersebut selain terdapat molekul NA rekombinan, juga ada sejumlah ragmen NA genomik dan NA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan 2ampuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan siat tertentu setelah dimasuki molekul NA rekombinan. 6ekanisme transormasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidaknya transormasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. 6olekul =a=l # akan menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk seroplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bo2or. NA yang ditambahkan ke dalam 2ampuran ini akan membentuk kompleks resisten Nase dengan ion-ion =a #D yang terikat pada permukaan sel. 3ompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan. e. eleksi Transforman dan eleksi !ekom"inan >leh karena NA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya NA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transorman yang membawa NA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transorman yang membawa NA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang NA rekombinannya membawa ragmen sisipan atau gen yang diinginkan. =ara seleksi sel transorman akan pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transormasi dilakukan, yaitu @ /%0 sel inang tidak dimasuki NA apa pun atau berarti transormasi gagal, /#0 sel inang dimasuki "ektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan /)0 sel inang dimasuki "ektor rekombinan dengan:tanpa ragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan siat yang terjadi pada sel inang. !ika sel inang memperlihatkan dua siat marker "ektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan siat yang terjadi pada sel inang. !ika sel inang hanya memperlihatkan salah satu
siat di antara kedua marker "ektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang membawa ragmen yang diinginkan dilakukan dengan men2ari ragmen tersebut menggunakan ragmen pela2ak #$ro"e%, yang pembuatannya dilakukan se2ara in vitro menggunakan teknik $olymerase chain reaction /P=50. Pela2akan ragmen
yang
diinginkan
antara
lain
dapat
dilakukan
melalui
2ara
yang
dinamakan hi"ridisasi koloni. 3oloni-koloni sel rekombinan ditranser ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa NAnya saja. Selanjutnya, dilakukan iksasi NA dan perendaman di dalam larutan pela2ak. Posisi-posisi NA yang terhibridisasi oleh ragmen pela2ak di2o2okkan dengan posisi koloni pada kultur awal #master $late%. engan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa ragmen yang diinginkan. Terapi insulin dapat digunakan untuk @ a. Semua penyandang 6 tipe 4 memerlukan insulin eksogen karena produksi insulin oleh sel beta tidak ada atau hampir tidak ada. b. Penyandang 6 tipe 44 tertentu mungkin membutuhkan insulin bila terapi jenis lain tidak dapat mengendalikan kadar glukosa darah. 2. 3eadaan stress berat, seperti pada ineksi berat, tindakan pembedahan, inark miokard akut atau stroke. d. 6 gestasional dan penyandang 6 yang hamil membutuhkan insulin bila diet saja tidak dapat mengendalikan kadar glukosa darah. e. 3etoasidosis diabetik. . 8iperglikemik hiperosmolar non ketotik. g. Penyandang 6 yang mendapat nutrisi parenteral atau yang memerlukan suplemen tinggi kalori, untuk memenuhi kebutuhan energi yang meningkat, se2ara bertahap akan memerlukan insulin eksogen untuk mempertahankan kadar glukosa darah mendekati normal selama periode resistensi insulin atau ketika terjadi peningkatan kebutuhan insulin.
h. 9angguan ungsi ginjal atau hati yang berat. i. 3ontra indikasi atau alergi terhadap obat hipoglikemi oral. 22 /!"'" R'+a#a"a G'$'i+a
Pada proses penyisipan gen diperlukan tiga aktor utama yaitu %. Eektor, yaitu pembawa gen asing yang akan disisipkan, biasanya berupa plasmid, yaitu lingkaran ke2il AN yang terdapat pada bakteri. Plasmid diambil dari bakteri dan disisipi dengan gen asing. #. akteri, berperan dalam memperbanyak plasmid. Plasmid di dalam tubuh bakteri akan mengalami replikasi atau memperbanyak diri, makin banyak plasmid yang direplikasi makin banyak pula gen asing yang di2opy sehingga terjadi 2loning gen. ). ?n1im, berperan untuk memotong dan menyambung plasmid. ?n1im ini disebut en1im endonuklease retriksi, en1im endonuklease retriksi yaitu en1im endonuklease yang dapat memotong AN pada posisi dengan urutan basa nitrogen tertentu. 23 /')5uaa$ I$"uli$ *a$ /'!a$a$ Mi+!!%a$i")'
4nsulin pertama kali di ekstraksi dari jaringan pankreas anjing pada tahun %#% oleh para ahli isiologi asal kanada Sir Federi2k 9lant anting dan =harles 8ebert est serta ahli isiologi asal 4nggris !ohn !ames 5i2hard 6a2leod. Seorang ahli boikimia !ames etram =ollip kemudian memproduksi dengan tingkat kemurnian yang 2ukup baik untuk digunakan sebagai obat pada manusia. Pada tahun %&( insulin manusia telah berhasil disintesis se2ara kimia. 4nsulin merupakan protein manusia pertama yang disintesis se2ara kimia. Se2ara tradisional, insulin untuk pengobatan pada manusia diisolasi dari pankreas sapi atau babi. Walaupun insulin hewan se2ara umum 2ukup memuaskan tetapi untuk penggunaan pada manusia dapat menimbulkan dua masalah. Pertama, adanya perbedaan ke2il dalam asam amino penyusunnya yang dapat menimbulkan eek samping berupa alergi pada beberapa penderita. 3edua, prosedur pemurnian sulit dan 2emaran berbahaya asal hewan tidak selalu dapat dihilangkan se2ara sempurna. Pada tahun %+% telah terjadi perbaikan se2ara berarti 2ara produksi insulin melalui rekayasa genetika. 4nsulin yang diperoleh dengan 2ara ini mempunyai struktur mirip dengan insulin manusia. 6elalui teknologi NA rekombinan, insulin diproduksi menggunakan sel mikroba yang tidak patogen. 3arena kedua hal tersebut di atas, insulin hasil rekayasa genetika ini mempunyai eek samping yang relati sangat
rendah dibandingkan dengan insulin yang diperoleh dari ekstrak pankreas hewan, tidak menimbulkan eek alergi serta tidak mengandung kontaminan berbahaya. 4nsulin adalah suatu hormon polipetida yang diproduksi dalam sel-sel G kelenjar ;angerhaens pankreas. 4nsulin berperan penting dalam regulasi kadar gula darah /kadar gula darah dijaga ),(-+,$ mmol:liter0. 8ormon insulin yang diproduksi oleh tubuh kita dikenal juga sebagai sebutan i$"uli$ '$*%'$. Namun, ketika kalenjar pankreas mengalami gangguan sekresi guna memproduksi hormon insulin, disaat inilah tubuh membutuhkan hormon insulin dari luar tubuh, dapat berupa obat buatan manusia atau dikenal juga sebagai sebutan i$"uli$ '+"%'$. 3ekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit seperti diabetes mellitus tergantung insulin /diabetes tipe %0. 4nsulin terdiri dari (% asam amino. 6olekul insulin disusun oleh # rantai polipeptida A dan yang dihubungkan dengan ikatan disulida. 5antai A terdiri dari #% asam amino dan rantai terdiri dari )$ asam amino. Produk hormon insulin manusia dapat dihasilkan dari teknik rekayasa genetika dengan teknologi Plasmid. 4nsulin adalah hormon yang berungsi menurunkan kadar gula dalam darah. 8ormon ini sangat diperlukan oleh penderita diabetes mellitus karena kelenjar pankreas penderita tidak mampu menghsilkan hormone tersebut. 8ormon insulin berungsi untuk mengubah glukosa dalam darah menjadi glikogen. Produksi insulin dapat dilakukan dengan 2ara mentransplantasikan gen-gen pengendali hormon tersebut ke plasmid bakteri. 3eberhasilan memindahkan gen insulin manusia ke dalam bakteri sudah dapat diperoleh, yaitu melalui bakteri-bakteri yang tumbuh dengan metode ermentasi. Teknik Plasmid bertujuan untuk membuat hormone dan antibodi. 6isal untuk membuat hormon insulin dengan teknik plasmid. 9en :NA digunting dengan ?n1im ?ndonuklease 5estriksi 9en :NA disambung dengan ?n1im ;igase. 2& M')5ua I$"uli$ Ma$u"ia *'$%a$ T'+$i+ DNA R'+)5i$a$
Sejak anting dan est menemukan hormon insulin pada tahun %#%, pasien diabetes mellitus yang mengalami peningkatan kadar gula darah disebabkan gangguan produksi insulin, telah diterapi dengan menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas hewan. 6eskipun insulin sapi dan babi mirip dengan insulin manusia, namun komposisinya sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah sistem kekebalan tubuh pasien menghasilkan antibodi terhadap insulin babi dan sapi yang berusaha menetralkan dan mengakibatkan respon inlamasi pada tempat injeksi. Selain itu eek samping dari insulin sapi dan babi ini adalah kekhawatiran adanya komplikasi jangka panjang dari injeksi 1at asing yang rutin.
Faktor-aktor ini menyebabkan peneliti mempertimbangkan untuk membuat 8umulin dengan memasukkan gen insulin ke dalam "ektor yang 2o2ok, yaitu sel bakteri ?. 2oli, untuk memproduksi insulin yang se2ara kimia identik dan dapat se2ara alami diproduksi. 8al ini telah di2apai dengan menggunakan teknologi NA rekombinan. Se2ara kimia, insulin adalah protein ke2il sederhana yang terdiri dari (% asam amino, )$ di antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan #% lainnya yang membentuk rantai kedua. 3edua rantai dihubungkan oleh ikatan disulida. 3ode genetik untuk insulin ditemukan dalam NA di bagian atas lengan pendek dari kromosom kesebelas yang berisi %() basa nitrogen /&) dalam rantai A dan $ dalam rantai 0. NA yang membentuk kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari rantai nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, osat dan nitrogen. Ada empat basa nitrogen yang berbeda yaitu adenin, timin, sitosin dan guanin. Sintesis protein tertentu seperti insulin ditentukan oleh urutan dasar tersebut yang diulang. 2. /'!5'*aa$ "u"u$a$ a"a) a)i$ 4a*a i$"uli$ )a$u"ia6 5a5i *a$ "a4i
Spesies 6anusia abi Sapi
A+ Thr Thr Ala
A%$ 4le 4le Eal
#+ Pro Pro Pro
# ;ys ;ys ;ys
)$ Thr Ala Ala
4nsulin manusia dan insulin babi hanya beda % asam amino yaitu pada )$, sedangkan insulin manusia dan insulin sapi beda ) asam amino yaitu pada A+, A%$, dan )$ sehingga pemakaian insulin babi kurang imunogenik dibandingkan insulin sapi. Tapi masalahnya, % babi yang diekstraksi insulinnya hanya 2ukup untuk % orang selama ) hari padahal saat ini ada H &$ juta orang di dunia yang menderita diabetes tergantung insulin dan diduga meningkat (-& I per tahunnya. 6aka dari itu sekarang banyak dikembangkan teknologi rekombinan untuk mendapatkan insulin. 2 /!"'" /!*u+"i
?s2heri2hia 2oli /?. 2oli0, penghuni saluran pen2ernaan manusia, adalah Jpabrik yang digunakan dalam rekayasa genetika insulin. 3etika bakteri bereproduksi, gen insulin direplikasi bersama dengan plasmid. ?. 2oli seketika memproduksi en1im yang dengan 2epat mendegradasi protein asing seperti insulin. 8al tersebut dapat di2egah dengan 2ara
menggunakan ?. 2oli strain mutan yang sedikit mengandung en1im ini. Pada ?. 2oli, galaktosidase adalah en1im yang mengontrol transkripsi gen. Untuk membuat bakteri memproduksi insulin, gen insulin perlu terikat pada en1im ini. ?n1im restriksi se2ara alami diproduksi oleh bakteri. ?n1im restriksi bertindak seperti pisau bedah biologi, hanya mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misal salah satunya rangkaian kode untuk insulin. 8al tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan pasangan basa nitrogen tertentu dan menghapus bagian NA yang berisi kode genetik dari kromosom sebuah organisme sehingga dapat memproduksi insulin. Sedangkan NA ligase adalah suatu en1im yang berungsi sebagai perekat genetik dan pengelas ujung nukleotida. ;angkah pertama pembuatan humulin adalah mensintesis rantai NA yang membawa sekuens nukleotida spesiik yang sesuai karakteristik rantai polipeptida A dan dari insulin. Urutan NA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua rantai telah dipetakan. ?nam puluh tiga nukleotida yang diperlukan untuk mensintesis rantai A dan sembilan puluh untuk rantai , ditambah kodon pada akhir setiap rantai yang menandakan pengakhiran sintesis protein. Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian ditempatkan di setiap awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam amino sel bakteri itu. J9en sintetik rantai A dan kemudian se2ara terpisah dimasukkan ke dalam gen untuk en1im bakteri, -galaktosidase, yang dibawa dalam plasmid "ektor tersebut. Pada tahap ini, sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel ?. 2oli. Praktis penggunaan teknologi NA rekombinan dalam sintesis insulin manusia membutuhkan jutaan salinan plasmid bakteri yang telah digabungkan dengan gen insulin dalam rangka untuk menghasilkan insulin. 9en insulin diekspresikan bersama dengan sel mereplikasi galaktosidase- di dalam sel yang sedang menjalani mitosis. Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari -galaktosidase, bergabung ke salah satu rantai insulin A atau . 5antai insulin A dan rantai kemudian diekstraksi dari ragmen galaktosidase dan dimurnikan. 3edua rantai di2ampur dan dihubungkan kembali dalam reaksi yang membentuk jembatan silang disulida, menghasilkan 8umulin murni /insulin manusia sintetis0.
27 /')5'!ia$ I$"uli$ /a*a /'$*'!ia Dia5''" M'lliu"
4nsulin adalah suatu hormon yang se2ara alami dihasilkan oleh pulau pulau langerhans pankreas. 4nsulin memungkinkan sel K sel tubuh mengabsorbsi glukosa dari darah untuk digunakan sebagai sumber energy, diubah menjadi molekul lain yang diperlukan, atau untuk disimpan. 4nsulin juga merupakan sinyal 2ontrol utama kon"ersi glukosa menjadi glikogen untuk penyimpanan internal di hati dan sel otot. ila jumlah insulin yang tersedia tidak men2ukupi, sel tidak merespon adanya insulin /tidak sensiti atau resisten0, atau bila insulin itu sendiri tidak diproduksi oleh sel K sel beta akibat rusaknya selKsel beta pada pan2reas, maka glukosa tidak dapat dimanaatkan oleh sel tubuh ataupun disimpan dalam bentuk 2adangan makanan dalam hati maupun sel otot. Akibat yang terjadi adalah peningkatan kadar glukosa dalam darah, penurunan sintesis protein, dan gangguan proses K proses metabolisme dalam tubuh. 8ormon ini bekerja mengatur kadar glukosa dalam darah dengan 2ara mempermudah masuknya glukosa ke dalam semua jaringan tubuh. !ika jumlah insulin yang diproduksi tidak memadai, kadar glukosa dalam darah akan meningkat dan sebagai akibatnya glukosa akan di ekskresi dalam urine. eisiensi insulin dalam manusia menyebabkan penyakit genetik diabetes mellitus jenis 4 atau disebut 46 /4nsulin ependent iabetes 6ellitus0. ila tidak diobati penyakit ini akan membahayakan kehamilan, bahkan dapat menyebabkan kematian. Pemberian injeksi insulin se2ara teratur dalam meningkatkan kadar insulin dalam darah penderita dapat meminimumkan komplikasi. Pengobatan ini hanya mungkin dilaksanakan bila insulin tersedia dalam jumlah besar dengan kemurnian dan mutu yang baik. Pemberian insulin kepada penderita diabetes hanya bisa dilakukan dengan 2ara suntikan, jika diberikan melalui oral insulin akan rusak didalam lambung. Setelah disuntikan, insulin akan diserap kedalam aliran darah dan dibawa ke seluruh tubuh. isini insulin akan bekerja menormalkan kadar gula darah /blood glu2ose0 dan merubah glu2ose menjadi energi. Perlu diperhatikan daerah mana saja yang dapat dijadikan tempat menyuntikkan insulin. ila kadar glukosa darah tinggi, sebaiknya disuntikkan di daerah perut dimana penyerapan akan lebih 2epat. Namun bila kondisi kadar glukosa pada darah rendah, hindarilah penyuntikkan pada daerah perut. Se2ara urutan, area proses penyerapan paling 2epat adalah dari perut, lengan atas dan paha. 4nsulin akan lebih 2epat diserap apabila daerah suntikkan digerak-gerakkan. Penyuntikkan insulin pada satu daerah yang sama dapat mengurangi "ariasi penyerapan. Penyuntikkan insulin selalu di daerah yang sama dapat merangsang terjadinya perlemakan dan menyebabkan gangguan penyerapan insulin. aerah suntikkan sebaiknya berjarak % in2hi
/D #,( 2m0 dari daerah sebelumnya. ;akukanlah rotasi di dalam satu daerah selama satu minggu, lalu baru pindah ke daerah yang lain. 3erja insulin dalam tubuh dipengaruhi oleh beberapa aktor di antaranya @ a. Dosis Semakin tinggi dosisnya maka semakin 2epat aksinya. b. Tem$at in&eksi Pada umumnya insulin diberikan dengan injeksi menembus kulit. Pada pemberian intra"ena aksinya 2epat, pad transdermal atau se2ara subkutan maka pada otot terjadi degradasi insulin #$-#(I. 6akanya harus diperhitungkan untuk mendapatkan dosis yang tepat. 3ebanyakan insulin diinjeksikan pada perut /intrperional0. !arum untuk injeksi insulin ke2il sekali dan pendek /$,( - % 2m0. apat juga menggunakan implant pada dada yang dapat mensuplai insulin sedikit demi sedkit. 2. 'ehadiran anti"odi insulin 8al ini terutama pada penggunaan hewan sebagai insulin. !ika digunakan insulin dari luar dikhawatirkan terjadi reaksi antigen antibodi maupun perusakan lain, ke2uali pada penderita autoimun. d. Aktivitas fisik Semakin banyak akti"itas isik yang kita lakukan maka kita perlu energi /dari glukosa0 yang semakin besar sehingga tidak perlu aksi insulin yang ekstra untuk mengubah glukosa menjadi glikogen /insulin yang diperlukan semakin sedikit0. 4nsulin sampai saat ini dikelompokkan menjadi beberapa jenis, antara lain @ %. 3erja 2epat /rapid a2ting0 =ontoh @ A2trapid, 8umulin 5, 5eguler 4nsulin /=rystal Lin2 4nsulin0 bentuknya larutan jernih, eek pun2ak #-' jam setelah penyuntikkan, durasi kerja sampai & jam. 6erupakan satu-satunya insulin yang dapat dipergunakan se2ara intra "ena. ias di2ampur dengan insulin kerja menengah atau insulin kerja panjang. #. 3erja menengah /intermediate a2ting0 =ontoh @ 4nsulatard, 6onotard, 8umulin N, NP8, 4nsulin ;ente dengan menambahkan protamine /NP8: Neutral Protamin 8agedom0 atau 1in2 /pada insulin lente0, maka bentuknya menjadi suspense yang akan memperlambat absorpsi sehingga eek menjadi lebih panjang. entuk NP8 tidak imunogenik karena protamine bukanlah protein.
). 3erja panjang /;ong a2ing0 =ontoh @ 4nsulin 9largine, 4nsulin Ultralente, PL4 insulin bentuk ini diperlukan untuk tujuan mempertahankan insulin basal yang konstan. Semua jenis insulin yang beredar saat ini sudah sangat murni, sebab apabila tidak murni akan memi2u imunogenitas, resistensi, lipoatroi atau lipohipertroi. 28 /!*u+ 5a u$u+ '!a4i Dia5''" M'lliu"
Salah satu insulin yang dapat menjadi pilihan untuk terapi 6 yaitu ;ANTUSM /nama dagang0 dengan nama generik insulin glargine, indikasi dari ;ANTUSM yaitu untuk 6 tipe % dan tipe #. ;ANTUSM dikontraindikasikan bagi pasien yang hipersensiti terhadap insulin glargine, eek samping yang mungkin terjadi yaitu nyeri pada sisi injeksi dan hipoglikemia. ;ANTUSM /PT Sanoi-A"entis0 bisa menjadi pilihan karena insulin glargine telah diuji dan dinyatakan eekti dan aman untuk diberikan kepada kasus-kasus 6 tipe % dan tipe # oleh FA dan oleh the ?uropean Agen2y or the ?"aluation o 6edi2al Produ2ts. ;ANTUSM juga memiliki keuntungan karena memberikan kenyamanan untuk pasien dengan satu kali suntikan per hari dan pasien dapat dengan mudah dan aman mentitrasi ;ANTUSM. entuk sediaan ;ANTUSM yaitu /%0 =artridges@ ) ml untuk digunakan >ptiPen Pro /)$$ 4U insulin glargine0, bo 2artridges ( ) ml, /#0 Eials@ %$ ml "ials /%$$$ 4U insulin glargine0, /)0 Pre-illed pens@ ) ml >ptiset pre-illed, disposable pen /pen sekali pakai0 dengan nama >ptiSetM, optiset (O) ml, in2remental dose # 4U, ma dose:inj '$ 4U. osis ;ANTUSM yaitu pasien tipe # yang telah diobati dengan obat hiperglikemia oral, memulai dengan insulin glargine dengan dosis %$ 4U sekali sehari. osis selanjutnya diatur menurut kebutuhan pasien,dengan dosis total harian berkisar dari #-%$$ 4U.Pasien yang mau menukar insulin kerja sedang atau panjang sekali sehari menjadi insulin glargine sekali sehari, tak perlu melakukan perubahan dosis awal. Tapi jika pemberian sebelumnya dua kali sehari, maka dosis awal insulin glargine dikurangi sekitar #$I untuk menghindari kemungkinan hipoglikemia. Untuk selanjutnya dosis diatur sesuai kebutuhan pasien. 4nsulin glargine adalah long-a2ting basal insulin analouge yang pertama kali dipergunakan dalam pengobatan 6 baik tipe-% maupun tipe-#, disuntikkan subkutan malam hari menjelang tidur. 4nsulin glargine tidak diberikan se2ara intra "ena karena dapat menyebabkan hipoglikemia. Preparat ini dibuat dari modiikasi struktur biokimiawi nati"e human insulin yang menghasilkan khasiat klinik yang baru yaitu delayed onset o a2tion and a 2onstant,
peakless ee2t, yang men2apai hampir #' jam eekti. 6emiliki potensi yang setara dengan insulin NP8 dalam menurunkan 8bA%2 dan kadar glukosa darah, namun lebih aman oleh karena peakless ee2t tersebut dapat mengurangi kejadian hipoglikemi malam hari. Preparat ini dinyatakan eekti dan aman untuk diberikan kepada kasus-kasus diabetes melitus tipe-% maupun tipe-#, dan mampu memenuhi kebutuhan insulin basal. Target pengendalian glukosa darah pada penggunaan monoterapi insulin glargine pada kasuskasus 69 menga2u pada Ameri2an =ollage o >bstetri2ians and 9yne2ologist or Women with 96, yaitu glukosa puasa Q ( mg:dl, # jam pp Q %#$ mg:dl. 8asil penelitian pada dasarnya menjelaskan bahwa insulin glargine berhasil mengendalikan glukosa darah pada kasus-kasus 69 sesuai target seperti tersebut di atas, tanpa terjadi hipoglikemi, dengan beberapa 2atatan sebagai berikut@ /a0 glukosa # jam pp sebelum perlakuan tidak lebih dari %($ mg:dl, /b0 dosis awal ber"ariasi %$-($ unit, disuntikkan pagi hari sebelum makan pagi, ditingkatkan )-( unit bertahap untuk men2apai target pengendalian glukosa darah, /20 dosis waktu partus ber"ariasi %+-*+ unit, /d0 waktu dilahirkan tidak ada bayi dengan berat badan lebih dari normal, dan tidak ada yang mengalami hipoglikemi, /e0 dosis perhari dalam trimester pertama adalah $,'-$,( unit:kg, trimester kedua $,(-$,& unit:kg, dan trimester ketiga $,*-$,+ unit: kg 29 K$*i"i +'"'haa$ #a$% *a4a 5'!i$'!a+"i *'$%a$ i$"uli$ %la!%i$'
3ondisi kesehatan lain yang Anda miliki bisa memengaruhi penggunaan obat ini. Selalu beri tahu dokter jika Anda memiliki masalah kesehatan lain, terutama@ • • •
• •
gun2angan emosi ineksi atau penyakit lainnya stress /misalnya, isik atau emosional0 K dapat meningkatkan gula darah dan dapat meningkatkan jumlah insulin aspart yang Anda butuhkan penyakit ginjal penyakit hati Keek samping dari obat ini dapat meningkat, karena proses pembersihan sisa obat dari tubuh lebih lambat
Terdapat ' buah insulin eksogen yang diproduksi dan dikategorikan berdasarkan pun2ak dan jangka waktu eeknya. erikut keterangan jenis insulin eksogen @ a0 Insulin Eksogen ker&a ce$at. entuknya berupa larutan jernih, mempunyai onset 2epat dan durasi pendek. Rang termasuk di sini adalah insulin regular /=rystal Lin2 4nsulin : =L4 0. Saat ini dikenal # ma2am
insulin =L4, yaitu dalam bentuk asam dan netral. Preparat yang ada antara lain @ A2trapid, Eelosulin, Semilente. 4nsulin jenis ini diberikan )$ menit sebelum makan, men2apai pun2ak setelah %K ) ma2am dan eeknya dapat bertahan samapai + jam. b0 Insulin Eksogen ker&a sedang. entuknya terlihat keruh karena berbentuk hablur-hablur ke2il, dibuat dengan menambahkan bahan yang dapat memperlama kerja obat dengan 2ara memperlambat penyerapan insulin kedalam darah. Rang dipakai saat ini adalah Netral Protamine 8egedorn /NP80, 6onotard, 4nsulatard. !enis ini awal kerjanya adalah %.( K #.( jam. Pun2aknya ter2apai dalam ' K %( jam dan eeknya dapat bertahan sampai dengan #' jam. 20 Insulin Eksogen cam$ur antara ker&a ce$at ( ker&a sedang #Insulin $remi)% Raitu insulin yang mengandung insulin kerja 2epat dan insulin kerja sedang. 4nsulin ini mempunyai onset 2epat dan durasi sedang /#' jam0. Preparatnya@ 6itard )$ : '$. d0 Insulin Eksogen ker&a $an&ang #le"ih dari *+ &am%. 6erupakan 2ampuran dari insulin dan protamine, diabsorsi dengan lambat dari tempat penyuntikan sehingga eek yang dirasakan 2ukup lam, yaitu sekitar #' K )& jam. Preparat@ Protamine Lin2 4nsulin / PL4 0, Ultratard. 30 Ka!a+'!i"i+ fa!)a++i$'i+: 4'$*'+6 i$'!)'*i' *a$ l$%-ai$% "'*iaa$ i$"uli$
3ategori Aksi pendek Aksi menengah Aksi lama
>nset /jam0 $,(-% # '
Akti"itas pun2ak /jam0 #-( '-%# %$-#$
urasi /jam0 &-+ Sampai #' Sampai )&
Pemberian insulin@ - short a2ting
@ diberi $,(-% jam sebelum makan
- intermediet a2ting
@ diberi # jam sebelum makan
- long a2ting
@ diberi ' jam sebelum makan
Pemberian preparat insulin perlu diatur seperti di atas supaya saat kadar glukosa dalam tubuh tinggi /men2apai pun2ak0 maka kadar insulin juga sudah tinggi, jadi harus
seimbang. jika kadar insulin tinggi kadar glukosa darah rendah maka akan terjadi sho2k. !ika kadar insulin rendah tetapi kada glukosa darah tinggi maka terjadi kelebihan gula /diabetes0.
BAB III /ENUTU/ 31 KESIM/ULAN
eisiensi insulin dalam manusia menyebabkan penyakit genetik diabetes mellitus
jenis 4 atau disebut 46 /4nsulin ependent iabetes 6ellitus0. 4nsulin adalah suatu hormon yang se2ara alami dihasilkan oleh pulau pulau
langerhans pan2reas. 4nsulin untuk pengobatan pada manusia diisolasi dari pankreas sapi atau babi tetapi masih menimbulkan eek samping.
Produksi insulin bisa dilakukan dengan 2ara rekayasa genetika menggunakan bakteri
?. 2oli. 4nsulin diberikan dengan injeksi karena jika diberikan melalui oral insulin akan rusak
didalam lambung. Proses pembuatan insulin dengan Teknik NA 5ekombinan @ %. langkah pertama adalah mengisolasi plasmid dari ?. 2oli. Plasmid adalah salah satu bahan genetik bakteri yang berupa untaian NA berbentuk lingkaran ke2il. Selain plasmid, bakteri juga memiliki kromosom. 3eunikan plasmid ini adalah@ ia bisa keluar-masuk Jtubuh bakteri, dan bahkan sering dipertukarkan antar bakteri. #. Pada langkah kedua ini plasmid yang telah diisolir dipotong pada segmen tertentu menggunakan en1im restriksi endonuklease. Sementara itu NA yang di isolasi dari sel pankreas dipotong pada suatu segmen untuk mengambil segmen pengkode insulin. Pemotongan dilakukan dengan en1im yang sama. ). NA kode insulin tersebut disambungkan pada plasmid menggunakan bantuan en1im NA ligase. 8asilnya adalah kombinasi NA kode insulin dengan plasmid bakteri yang disebut NA rekombinan. '. NA rekombinan yang terbentuk disisipkan kembali ke sel bakteri. (. ila bakteri ?. 2oli berbiak, maka akan dihasilkan koloni bakteri yang
memiliki NA rekombinan 3erja insulin dalam tubuh dipengaruhi oleh beberapa aktor di antaranya @ - osis - Tempat injeksi - 3ehadiran antibodi insulin - Akti"itas isik Pemberian insulin@ - short a2ting - intermediet a2ting - long a2ting Salah satu insulin yang dapat menjadi pilihan untuk terapi 6 yaitu ;ANTUSM /nama dagang0 dengan nama generik insulin glargine, indikasi dari ;ANTUSM yaitu untuk 6 tipe % dan tipe #.
DAFTAR /USTAKA
https@::aguskrisnoblog.wordpress.2om:#$%%:$%:%%:rekayasa-genetika-dalam-proses pembuatan-insulin-sebagai-salah-satu-terapi-penyakit-diabetes-mellitus: https@::ri1agustia.iles.wordpress.2om:#$%#:$':pembuatan-insulin.pd www.youtube.2om