Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta taha tahapa pann-ta taha hapa pan n klon klonin ing g gen, gen, yang yang seca secara ra garis garis besa besarr meli melipu puti ti isol isolas asii DNA DNA kromos kromosom om dan DNA vekto vektor, r, pemoto pemotong ngan an DNA menggu menggunak nakan an enzim enzim restrik restriksi, si, pembentukan molekul DNA rekombinan, dan transformasi sel inang oleh molekul DNA rekombinan. Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasisa diharapkan mampu menjelaskan!
1.
pengertian teknologi DNA rekombinan,
2.
dua segi manfaat teknologi DNA rekombinan, rekombinan,
3.
tahapan-tahapan kloning gen,
4.
pengertian dan cara kerja enzim restriksi, dan
5.
garis besar cara seleksi transforman dan seleksi rekombinan.
"engetahuan aal yang diperlukan oleh mahasisa agar dapat mempelajari pokok bahasan ini dengan lebih baik adalah struktur dan sifat-sifat asam nukleat seperti yang telah dibahas pada #ab $$.
Pengertian Teknologi DNA Rekombinan
Secara Secara klasik klasik analis analisis is molek molekule ulerr protei protein n dan materi materi lainny lainnya a dari dari kebany kebanyaka akan n organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untu untuk k
memu memurn rnik ikan anny nya a
dala dalam m
juml jumlah ah besa besarr. Namu Namun, n, seja sejak k
tahu tahun n
%&'( %&'(-a -an n
berkembang berkembang suatu teknologi teknologi yang dapat dapat diterapkan diterapkan sebagai sebagai pendekat pendekatan an dalam mengat mengatasi asi masala masalah h terse tersebut but melalu melaluii isolas isolasii dan dan manip manipula ulasi si terhad terhadap ap gen yang yang bertanggung jaab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk.
)eknologi knologi yang yang dikenal dikenal sebagai sebagai teknologi DNA rekombinan, rekombinan, atau dengan istilah yang yang lebi lebih h popu popule lerr rekayasa rekayasa genetika genetika,, ini meliba melibatka tkan n upaya upaya perba perbanya nyakan kan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan seba ebagai gai klonin kloning g gen. gen. #anya #anyak k defini definisi si telah telah diberi diberikan kan untuk untuk mendes mendeskri kripsi psikan kan penger pengertia tian n teknol teknologi ogi DNA rekombin rekombinan an.. Salah Salah satu satu di antara antaranya nya,, yang yang mungki mungkin n paling paling repres represent entati atif, f, menye menyebut butkan kan baha baha teknol teknologi ogi DNA rekomb rekombina inan n adalah adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam dalam suatu suatu vektor vektor sehing sehingga ga memun memungki gkinka nkanny nnya a untuk untuk terint terintegr egrasi asi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.
)eknolog knologii DNA rekomb rekombina inan n mempu mempunya nyaii dua segi segi manfaa manfaat. t. "ertam "ertama, a, dengan dengan mengis mengisola olasi si dan mempe mempelaj lajari ari masing masing-ma -masin sing g gen gen akan akan dipero diperoleh leh penge pengetah tahuan uan tentan tentang g fungs fungsii dan mekan mekanism isme e kontro kontrolny lnya. a. *edua *edua,, teknol teknologi ogi ini memung memungkin kinkan kan diperolehnya produk gen tertentu dalam aktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
"ada dasarnya dasarnya upaya upaya untuk untuk mendapatk mendapatkan an suatu produk yang yang diinginka diinginkan n melalui melalui teknologi teknologi DNA rekombinan rekombinan melibatkan melibatkan beberapa tahapan tahapan tertentu tertentu +ambar +ambar &.%. )ahapan-tahapan ahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomikkromosom yang akan diklon, pemoto pemotonga ngan n moleku molekull DNA menjad menjadii sejuml sejumlah ah fragme fragmen n dengan dengan berbag berbagai ai ukura ukuran, n, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molek molekul ul DNA rekomb rekombina inan, n, transf transform ormas asii sel sel inang inang menggu menggunak nakan an moleku molekull DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Isolasi DNA
$solasi DNA diaali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, bekuleleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. /angkah berikutnya adalah lisis sel. #ahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton 0-%(( atau dengan sodium dodesil sulfat +SDS. "ada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukanremukan sel harus dibuang. #iasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. "rotein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan 1NA sehingga perlu ditambahkan 1NAse untuk membersihkan DNA dari 1NA. 2olekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan 3s3l +lihat #ab $$.
Gambar 9.1. Skema tahapan kloning gen
)eknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. 4ntuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. "ertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular +333, sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. "erbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap
denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. 5leh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
"endekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pearna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada j umlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan
menggunakan
etidium
bromid akan menjadikan kerapatan
DNA
kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.
Enzim Restriksi
)ahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. "erkembangan teknik pemotongan DNA beraal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda +l. 6irus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli , yakni strain * dan 3. 7ika l yang telah menginfeksi strain 3 diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain 3, maka akan diperoleh l progeni +keturunan yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan baha efficiency of plating +85" dari strain 3 ke strain 3 adalah %. Namun, jika l yang diisolasi dari strain 3 digunakan untuk menginfeksi strain *, maka nilai 85"-nya hanya %( -9. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak %%(.((( kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain * mempunyai nilai 85" sebesar %, baik ketika direinfeksikan pada strain * m aupun
pada strain 3. :al ini terjadi karena adanya sistem restriksimodifikasi +rm pada strain *.
"ada aktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain 3 diinfeksikan ke strain *, molekul DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain *. Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain * juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi tersebut.
DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diariskan dan harus dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain * ke strain 3 dan dikembalikan lagi ke strain * akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi.
2etilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA. #erlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi.
8nzim restriksi dari strain * telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I. #anyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya.
"ada tahun %&'( ).7. *elly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. $a
mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain 1d, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari 9'; enzim restriksi tipe $$ dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika.
8nzim restriksi tipe $$ antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut!
%.
mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di
dalam molekul DNA
<.
memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat
tempat pengenalannya
=.
menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan
basa.
Sebagian besar enzim restriksi tipe $$ akan mengenali dan memotong urutan pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi. ambar %%.= memperlihatkan beberapa enzim restriksi beserta tempat pengenalannya.
"emberian nama kepada enzim restriksi mengikuti aturan sebagai berikut. :uruf pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi enzim, sedangkan huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua nama petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. :uruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari nama strain bakteri, dan angka romai digunakan untuk membedakan enzim yang berbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama.
)empat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa. "emotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung ;> yang runcing karena masingmasing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai !ng lengket (sticky end) atau !ng kohesi" .
:al itu berbeda dengan enzim restriksi seperti :ae $$$, yang mempunyai tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. *edua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung ;> yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. ?ragmen-fragmen DNA dengan !ng tmpl (blunt end) akan sulit
untuk disambungkan. #iasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk
menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik =>.
#igasi $olekl % molekl DNA
"emotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan +diligasi dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. "ertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. *edua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag
)9 atau lazim disebut sebagai enzim ) 9 ligase. 7ika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik =>. Dengan untai tunggal semacam ini
akan diperoleh ujung lengket
buatan,
yang
selanjutnya
dapat diligasi
menggunakan DNA ligase.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya ='@3. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. 5leh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 9 dan %;@3 dengan aktu inkubasi +reaksi yang diperpanjang +sering kali hingga semalam.
"ada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristia religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. :al ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. 4ntuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi +lebih dari %((gml, perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung ;> pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik => seperti telah disebutkan di atas.
)ransformasi Sel $nang
)ahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan
teknik elektroforesis +lihat #ab
0.
7ika hasil
elektroforesis
menunjukkan baha fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. )ahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan trans"ormasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
)eknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun %&'( oleh 2. 2andel dan A. :iga, yang melakukan transformasi bakteri E. coli . Sebelumnya, transformasi pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. *emampuan transformasi B. subtilis pada aktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof +tidak dapat tumbuh pada medium minimal menjadi prototrof +dapat tumbuh pada medium minimal dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. #aru beberapa aktu kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi E.coli .
:al terpenting yang ditemukan oleh 2andel dan :iga adalah perlakuan kalsium klorid +3a3l< yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari bakteriofag l. "ada tahun %&'< S.N. 3ohen dan kaan-kaannya menemukan baha sel-sel yang diperlakukan dengan 3a3l < dapat juga mengambil DNA plasmid.
?rekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan 3a3l< pada suhu ( hingga ;@3. "erlakuan kejut panas antara =' dan 9;@3 selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran DNA dengan larutan 3a3l< tersebut dapat meningkatkan frekuensi transformasi tetapi tidak terlalu esensial. 2olekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil.
2ekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidaktidaknya transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. 2olekul 3a3l< akan menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion 3a
Seleksi Trans"orman &an Seleksi Rekombinan
5leh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membaa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membaa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membaa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
3ara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid +lihat #ab 0$. "ada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu +% sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau
berarti transformasi gagal, +< sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan += sel inang dimasuki vektor rekombinan dengantanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. 4ntuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. 7ika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan baha kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. 7ika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan baha kemungkinan ketigalah yang terjadi.
Seleksi sel rekombinan yang membaa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction 'P(R). "enjelasan lebih rinci tentang teknik "31 dapat dilihat pada #ab 0$$. "elacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibri&isasi koloni +lihat #ab 0. *oloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. "osisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur aal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membaa fragmen yang diinginkan.
#ab ini akan membahas pengertian dan macam-macam vektor kloning, baik yang digunakan pada sel inang prokariot maupun eukariot. Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasisa diharapkan mampu menjelaskan!
1.
pengertian vektor kloning,
2.
ciri-ciri plasmid,
3.
ciri-ciri kosmid,
4.
ciri-ciri bakteriofag, dan
5.
ciri-ciri vektor kloning pada khamir dan eukariot tingkat tinggi.
4ntuk dapat mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini dengan lebih baik mahasisa disarankan telah memahami pokok bahasan tentang dasar-dasar teknologi DNA rekombinan dan konstruksi perpustakaan gen, yang masing-masing telah diberikan pada #ab $0 dan 0.
Pengertian &an $a*am+ma*am ,ektor -loning "ada #ab $0 antara lain telah dibicarakan baha transformasi sel inang dilakukan menggunakan perantara vektor. 7adi, vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai ahana atau kendaraan yang akan membaa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut. 6ektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya 8. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu, vektor CA3s dan C8ps dapat digunakan pada khamir. "lasmid )i, baculovirus, S69(,
dan retrovirus merupakan vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot tingkat tinggi.
Plasmi& Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. "lasmid tersebar l uas di antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar % kb hingga lebih dari <;( kb +% kb %((( pb. Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syaratsyarat berikut ini!
1.
mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya,
2.
mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,
3.
mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan
4.
mempunyai titik aal replikasi +ori sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.
Salah satu contoh plasmid buatan yang banyak digunakan dalam kloning gen adalah p#1=<<. "lasmid ini dikonstruksi oleh ?. #olivar dan kaan-kaanya pada tahun %&''. 4rutan basa lengkapnya telah ditentukan sehingga baik tempat marker maupun pengenalan restriksinya juga telah diketahui. Sa yangnya, tempat
pengenalan 8co1 $, salah satu enzim restriksi yang sangat umum digunakan, terletak di luar marker. 5leh karena salah satu marker akan menjadi t empat penyisipan fragmen DNA asing, maka 8co1 $ tidak dapat digunakan untuk memotong p#1=<< di tempat penyisipan tersebut. Namun, saat ini telah dikonstruksi derivat-derivat p#1=<< yang mempunyai tempat pengenalan 8co1 $ di dalam marker, misalnya plasmid p#1=<9 dan p#1=<; yang masing-masing mempunyai tempat pengenalan 8co1 $ di dalam gen struktural kolisin dan di dalam gen resisten kloramfenikol.
Gambar 11.1. Plasmi& pR/00 amp1 marker resisten ampisilin tet1 marker resisten tetrasiklin
2isalnya saja kita menyisipkan suatu fragmen DNA pada daerah marker resisten ampisilin dengan memotong daerah ini menggunakan enzim restriksi tertentu selain 8co1 $ +mengapa harus selain 8co1 $E. "lasmid p#1=<< yang tersisipi oleh fragmen DNA akan kehilangan sifat resistensinya terhadap ampisilin, tetapi masih mempunyai sifat resistensi terhadap tetrasiklin. 5leh karena itu, ketika plasmid p#1=<< rekombinan ini dimasukkan ke dalam sel inangnya, yakni 8. coli, bakteri transforman ini tidak mampu tumbuh pada medium yang m engandung ampisilin, tetapi tumbuh pada medium tetrasiklin. Secara alami 8. coli tidak mampu tumbuh baik pada medium ampisilin maupun tetrasiklin sehingga sel transforman dapat dengan mudah dibedakan dengan sel nontransforman yang tidak mengandung p#1=<< sama sekali. Sementara itu, 8. coli transforman yang membaa plasmid p#1=<< utuh +religasi mampu tumbuh pada kedua medium antibiotik tersebut. 7adi, untuk memperoleh sel 8. coli transforman yang membaa DNA rekombinan dicari
koloni yang hidup di tetrasiklin tetapi mati di ampisilin. Secara teknis pekerjaan ini dilakukan menggunakan transfer koloni atau replica plating +lihat #ab 0. "lasmid yang digunakan pada bakteri gram negatif seperti halnya p#1=<< tidak dapat digunakan pada bakteri gram positif. Namun, saat ini telah tersedia plasmid untuk kloning pada bakteri gram positif, misalnya p)%<' dan p3%&9, yang dikonstruksi oleh S.D. 8rlich pada tahun %&'' dari bakteri Staphylococcus aureus. Demikian juga, telah ditemukan plasmid untuk kloning pada eukariot, khususnya pada khamir, misalnya yeast integrating plasmids +C$ps, yeast episomal plasmids +C8ps, yeast replicating plasmids +C1ps, dan yeast centromere plasmid +C3ps. akterio"ag #akteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vektor kloning. Dua di antaranya akan dijelaskan berikut ini. akterio"ag l #akteriofag atau fag l merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri 8. coli. #erkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya sebagai vektor kloning semenjak masa-masa aal perkembangan rekayasa genetika. DNA l yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai ganda dengan panjang 9F,; kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang %< pb yang komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA l untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya kedua untai tunggal sepanjang %< pb tersebut dinamakan kos. Seluruh urutan basa DNA l telah diketahui. Secara alami terdapat lebih dari satu
tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. 5leh karena itu, DNA l tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA l yang memenuhi syarat sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA l, yaitu vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing, vektor substitusi, yang untuk membaa fragmen DNA asing harus membuang sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut. Di antara kedua macam vektor l tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan karena kemampuannya untuk membaa fragmen DNA asing hingga <= kb. Salah satu contohnya adalah vektor G8S, yang mempunyai mutasi pada tiga gen esensial, yaitu gen G, 8, dan S. 6ektor ini hanya dapat digunakan pada sel inang yang dapat menekan mutasi tersebut. 3ara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. 7ika suatu enzim restrisksi memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA l di antara kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmen DNA asing. 7ika pembuangan segmen DNA l tidak diikuti oleh substitusi fragmen DNA asing, maka akan terjadi religasi vektor DNA l yang kehilangan sebagian segmen pada daerah nonesensial. 6ektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi automatis yang dapat membedakan antara sel inang dengan vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi.
ambar %%.<. DNA bakteriofag l konformasi linier +di luar sel inang konformasi sirkuler +di dalam sel inang
#akteriofag l mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik. "ada fase litik, transfeksi sel inang +istilah transformasi untuk DNA fag dimulai dengan masuknya DNA l yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalami replikasi secara independen atau tidak bergantung kepada kromosom sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA l sirkuler, masingmasing DNA ini akan melakukan transkripsi dan translasi membentuk protein kapsid +kepala. Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas +packaged dalam kapsid sehingga dihasilkan partikel l baru yang akan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase lisogenik DNA l akan terintegrasi ke dalam kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang. ?ase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang. Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak +plaHue berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. 5leh karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak tersebut. akterio"ag $1/ Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi 8. coli. #erbeda dengan l yang mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini mempunyai struktur berupa filamen. 3ontoh yang paling penting adalah 2%=, yang mempunyai genom berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang I.9(F basa. $nfeksinya pada sel inang berlangsung melalui pili, suatu penonjolan pada permukaan sitoplasma. *etika berada di dalam sel inang genom 2%= berubah menjadi untai ganda sirkuler
yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar %(( salinan. Salinansalinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke permukaan sel inang. Dengan cara seperti ini DNA 2%= akan terselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa menyebabkan lisis. 5leh karena fag 2%= terselubungi dengan cara pembentukan kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang dapat disisipkan kepadanya. $nilah salah satu keuntungan penggunaan 2%= sebagai vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan l. *euntungan lainnya adalah baha 2%= dapat digunakan untuk sekuensing +penentuan urutan basa DNA dan mutagenesis tapak terarah +site directed mutagenesis karena untai tunggal DNA 2%= dapat dijadikan cetakan +templat di dalam kedua proses tersebut. 2eskipun demikian, 2%= hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada DNAnya yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan restriksinya pun sangat sedikit. Namun, sejumlah derivat 2%= telah dikonstruksi untuk mengatasi masalah tersebut. -osmi& *osmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari DNA l dengan plasmid. *emampuannya untuk membaa fragmen DNA sepanjang =< hingga 9' kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag l dan plasmid. asmi& Selain kosmid, ada kelompok vektor sintetis yang merupakan gabungan antara plasmid dan fag l. 6ektor yang dinamakan fasmid ini membaa segmen DNA l yang berisi tempat att. )empat att digunakan oleh DNA l untuk berintegrasi dengan kromosom sel inang pada fase lisogenik. ,ektor 2A(s
Seperti halnya kosmid, CA3s +yeast artifisial chromosomes atau kromosom buatan dari khamir dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA plasmid dan segmen tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang digunakan terdiri atas sekuens telomir, sentromir, dan titik aal replikasi. CA3s dapat membaa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari % 2b. 5leh karena itu, CA3s dapat digunakan untuk mengklon gen utuh manusia, misalnya gen penyandi cystic fibrosis yang panjangnya <;( kb. Dengan kemampuannya itu CA3s sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada "royek enom 2anusia. ,ektor 2Eps 6ektor-vektor untuk keperluan kloning dan ekspresi gen pada Saccharomyces cerevisiae dirancang atas dasar plasmid alami berukuran < Jm, yang selanjutnya dikenal dengan nama plasmid < mikron. "lasmid ini memiliki sekuens DNA sepanjang I kb, yang mencakup titik aal replikasi dan dua gen yang terlibat dalam replikasi. 6ektor-vektor yang dirancang atas dasar plasmid < mikron disebut C8ps +yeast episomal plasmids. Segmen plasmid < mikronnya membaa titik aal replikasi, sedangkan segmen kromosom khamirnya membaa suatu gen yang berfungsi sebagai penanda seleksi, misalnya gen /84< yang terlibat dalam biosintesis leusin. 2eskipun biasanya bereplikasi seperti plasmid pada umumnya, C8ps dapat terintegrasi ke dalam kromosom khamir inangnya. Plasmi& Ti Agroba*terim tme"a*iens Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, ada suatu bakteri, yaitu Agrobacterium tumefaciens, yang membaa plasmid berukuran <(( kb dan disebut plasmid )i +tumor inducing
atau penyebab tumor. #akteri A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil, khususnya padi. *etika infeksi berlangsung bagian tertentu plasmid )i, yang disebut )-DNA, akan terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman, mengakibatkan terjadinya pertumbuhan sel-sel tanaman yang tidak terkendali. Akibatnya, akan terbentuk tumor atau cron gall. "lasmid )i rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah )-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. en target ini selanjutnya akan dieskpresikan menggunakan sistem DNA tanaman. Dalam prakteknya, ukuran plasmid )i yang begitu besar sangat sulit untuk dimanipulasi. Namun, ternyata apabila bagian )-DNA dipisahkan dari bagian-bagian lain plasmid )i, integrasi dengan DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan )-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada di dalam satu sel bakteri A. tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya dilakukan pada )-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid 8.coli. Selanjutnya, plasmid )-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel A. tumefaciens yang membaa plasmid )i tanpa bagian )-DNA. "erbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang terdapat pada )-DNA. a*lo3irs #aculovirus merupakan virus yang menginfeksi serangga. Salah satu protein penting yang disandi oleh genom virus ini adalah polihedrin, yang akan terakumulasi dalam jumlah sangat besar di dalam nuklei sel-sel serangga yang diinfeksi karena gen tersebut mempunyai promoter yang sangat aktif. "romoter ini dapat digunakan untuk memacu overekspresi gen-gen asing yang diklon ke dalam genom bacilovirus sehingga akan diperoleh produk protein yang sangat banyak jumlahnya di dalam
kultur sel-sel serangga yang terinfeksi. ,ektor -loning pa&a $amalia 6ektor untuk melakukan kloning pada sel-sel mamalia juga dikonstruksi atas dasar genom virus. Salah satu di antaranya yang telah cukup lama dikenal adalah S69(, yang menginfeksi berbagai spesies mamalia. enom S69( panjangnya hanya ;,< kb. enom ini mengalami kesulitan dalam pengepakan +packaging sehingga pemanfaatan S69( untuk mentransfer fragmenKfragmen berukuran besar menjadi terbatas. 1etrovirus mempunyai genom berupa 1NA untai tunggal yang ditranskripsi balik menjadi DNA untai ganda setelah terjadi infeksi. DNA ini kemudian terintegrasi dengan stabil ke dalam genom sel mamalia inang sehingga retrovirus telah digunakan sebagai vektor dalam terapi gen. 1etrovirus mempunyai beberapa promoter yang kuat.