Nama
: Rossalina Kurniawan
NPM
: 1406552982
Jurusan
: Teknik Kimia - DTK!" PR#T"N -
$%s&rak Dalam men'analisis (ro&ein) a*a %er%a'ai ma+am +ara ,an' *a(a& *ilakukan &er'an&un' *ari enis analisis ,an' *ilakukan *an &uuan *ari analisis &erse%u&. !e+ara umum &er*a(a& *ua ma+am analisis un&uk men*e&eksi (ro&ein ,ai&u analisis se+ara kuali&a&i/ *an analisis se+ara kuan&i&a&i/. !er&a analisis ,an' *a(a& u'a *i%a'i %er*asarkan /un'si *ari analisis &erse%u& &erse%u& se(er&i analisis analisis s&ruk&ur s&ruk&ur *an enis (ro&ein. (ro&ein. Pa*a lem%ar lem%ar &u'as &u'as man*iri man*iri ini akan *i%aasas %er%a'ai ma+am enis +ara un&uk men*e&eksi kan*un'an (ro&ein *alam sua&u sam(el %eser&a (rinsi( kera *ari me&o*e &erse%u&. Ka&a Ka&a Kun+i Kun+i:: kris&a kris&alo' lo'a/i a/i sinarsinar-) ) s(ek&r s(ek&rosk osko(i o(i nmr) nmr) se(&ro se(&rosko sko(i (i +*) elek& elek&ro/ ro/ore oresis sis)) &es an&or an&or(ro (ro&ei &ein) n) &es o(ki o(kinsns-+ol +ole) e) &es millon millon)) &es %iure %iure&) &) &es ni&ro( ni&ro(rus rusi*) i*) &es saka' saka'u+ u+i) i) (ereaksi (ereaksi nini*ri nini*rin) n) me&o*e me&o*e !ulli3an !ulli3an)) me&o*e me&o*e ke*al ke*al)) me&o*e me&o*e %iure&.se %iure&.seuen uen+in' +in' (ro&ein) (ro&ein) me&o*e lowrl,) &i&rasi /ormo
A. Metode Kuantitatif 1. Analisis Struktur Protein 1.1. Metode Kristalogra Sinar-X Sinar-X Struktur protein tiga dimensi penting untuk diketahui sebab dapat merepresentasikan aktivitas, fungsi, stabilitas, maupun paramater sika-kimia lainna. Metode penentuan struktur tiga dimensi protein ang luas digunakan saat ini adalah kristalogra sinar-X !X-ra "rstallograph#. Kristalogra sinar-X menggunakan pan"aran sinar-X ang ditembakA. Metode Kuantitatif Kuantitatif 1. Analisis Struktur Protein 1.1. Metode Kristalogra Sinar-X Sinar-X Struktur protein tiga dimensi penting untuk diketahui sebab dapat merepresentasikan aktivitas, fungsi, stabilitas, maupun paramater sika-kimia lainna. Metode penentuan struktur tiga
dimensi protein ang luas digunakan saat ini adalah kristalogra sinar-X !X-ra "rstallograph#. Kristalogra sinar-X menggunakan pan"aran sinar-X ang ditembakkan mengenai suatu protein ang telah dimurnikan atau memiliki kemurnian tinggi sehingga berbentuk kristal. Pan"aran gelombang sinar-X ang mengenai struktur kristal protein kemudian akan terhambur. $amburan sinar-X ang mun"ul kemudian diba"a dan struktur kristal protein dapat diketahui. kan mengenai suatu protein ang telah dimurnikan atau memiliki kemurnian tinggi sehingga berbentuk kristal. Pan"aran gelombang sinar-X ang mengenai struktur kristal protein kemudian akan terhambur. $amburan sinar-X ang mun"ul kemudian diba"a dan struktur kristal protein dapat diketahui. 1.%. Metode Spektroskopi &M' Pada Protein, tidak semua protein dapat dikristalisasi. Sebaga "ontoh, membrane protein ang memiliki banak asam amino hidrofobik akan sulit untuk mengkristalisasi. (eknik lain untuk melakukan analisis protein dalam larutan tanpa kristalisasi adalah nu"lear magneti" resonan"e !&M'#. &M' beker)a berdasarkan prinsip )ika nu"lei dari beberapa elemen atom. Seperti hdrogen, akan beresonansi saat sebuah molekul, seperti protein, ditempatkan pada medan magnet kuat. &M' mengukur perubahan kimia pada nu"lei atom pada protein, ang tbergantung pada atom di sekitarna dan )arak dengan atom di sekitarna . &M' akan
mnghasilkan data berupa kemungkinan struktur ang ter)adi, bukan sebuah struktur. *ntuk protein ke"il, &M' dapat se"ara akurat memprediksi strukturna se"ara tiga dimensi. 1.+. Metode Spektroskopi Spektroskopi ir"ular i"hroism !# mengukur perbedaan antara penerapan "ahaa ang terpolarisasi tangan kiri versus "ahaa terpolarisasi takan kanan ang mun"ul akibat struktur ang asimentri. (idak adana struktur regular akan menun)ukan intensitas ang bernilai no, sementari struktur ang berurutan dalam spe"trum dapat menun)ukan nilai intensitas ang berupa positif atau negative. Spektrum dari protein pada daerah spektrum near-*/0 !%-2+2 nm# akan sensitive pada beberapa aspek struktur tersier. Pada pan)ang gelombang sebesar ini, "hromophores-na adalah asam amino aromati" dan ikatan disulde, dan sinal ang dihasilkan akan sensitive pada struktur tersier protein se"ara keseluruhan. S3nal pada daerha spe"trum dari %2-%42 nm akan "o"ok dengan residu phnlalanine, sinal pada daerah %42-%52 nm akan menun)ukan tirosin, %62-+22 akan "o"ok dengan atribut trptophan.7 %. Pe8arnaan %.1. Metode 9iuret :arutan protein dibuat alkalis dengan &a;$ kemudian ditambahkan larutan uS;< en"er. *)i ini untuk menun)ukkan adana sena8asena8a ang mengandung gugus amida asam ang berada bersama gugus amida ang lain. *)i ini memberikan reaksi positif aitu ditandai dengan timbulna 8arna merah violet atau biru violet. %.%. Metode :o8r
Metode :o8r merupakan pengembangan dari metode 9iuret. alam metode ini terlibat % reaksi. A8alna, kompleks u!33#-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, ang dalam suasana alkalis u!33# akan tereduksi men)adi u!3#. 3on u= kemudian akan mereduksi reagen >olin-io"alteu, kompleks phosphomolibdat phosphotungstat !phosphomolbdotungstate#, menghasilkan heteropol molbdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik !rantai samping asam amino# terkatalis u, ang memberikan 8arna biru intensif ang dapat dideteksi se"ara kolorimetri. 9era8al dari pemanfaatan alat spektrofotometer aitu untuk mengukur )umlah penerapan ?at suatu sena8a. Penerapan "ahaa pada sena8a larutan tersebut, dalam spektrofotometri dapat digunakan sebagai dasar atau pedoman dalam penentuan konsentrasi larutan atau sena8a se"ara
kuantitatif. alam pratikum ini
penggunaan KMn;
< bertu)uan untuk memudahkan dalam pengenalan dan latihan a8al spektrofotometri. Kekuatan 8arna biru terutama bergantung pada kandungan residu trptophan dan trosinena. Keuntungan metode :o8r adalah lebih sensitif !122 kali# daripada metode 9iuret !Sudarma)i, 155@#. +. Analisis 9erat Molekul Protein +.1. Metode lektroforesis lektroforesis adalah teknik pemisahan komponenBmolekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasina dalam sebuah medan listrik !Cestermeier, %22<#. Ke"epatan molekul ang
bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. engan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul !seperti protein dan asam nukleat#. Posisi molekul ang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pe8arnaan atau autoradiogra, atau pun dilakukan kuantikasi dengan densitometer. Seperti halna dengan elektroforesis &A, elektroforesis protein memungkinkan kita untuk memisahkan protein berdasarkan ukuranna dan memperlihatkan hasilna. Akan tetapi protein )auh lebih beragam dalam ukuran dan strukturna, karena itu teknikna )auh lebih rumit 9eberapa faktor ang mempengaruhi pemisahan komponen pada elektroforesis protein ensitas muatan molekul D berbeda diantara p$ media dan pl molekul.
•
Pengaruh buEer
•
p$ D akan mempengaruhi densitas muatan protein dan akibatna mempengaruhi •
tingkat dan arah pergerakanna Kekuatan ionik D mempengaruhi tingkat pemisahan
•
Komposisi D bisa berinteraksi dengan protein menebabkan perubahan dalam •
densitas muatan sebagai "ontoh ion borak dan glikoprotein 9entuk dan ukuran molekul
•
Media pendukung
•
'estriksi pada mobilitas
•
Pengaruh difusi
•
lektroendosmosis
•
Mikro-heterogenitas molekuler spesies
•
<. (itrasi Asam Amino
<.1. Metode K)ehdahl Analisis protein dalam bahan pangan dapat dilakukan dengan dua metode aitu metode kuantitatif dan kualitatif. Kadar protein ang ditentukan berdasarkan "ara K)eldahl disebut sebagai kadar protein kasar !"rude protein# karena terikut sena8aan & bukan protein. Prinsip ker)a dari metode K)eldahl adalah protein dan komponen organi" dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. $asil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan dalam larutan asam
alkali dan
melalui destilasi. estilat ditampung
borat. Selan)utna ion- ion borat ang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan $l. Metode K)eldahl merupakan metode ang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan sena8a ang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator ang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia ang terbentuk disuling uap se"ara kuantitatif ke dalam larutan penerap dan ditetapkan se"ara titrasi. Metode ini telah banak mengalami modikasi. Metode ini "o"ok digunakan se"ara semimikro, sebab hana memerlukan )umlah sampel dan pereaksi ang sedikit dan 8aktu analisa ang pendek. ara K)eldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan se"ara tidak langsung, karena ang dianalisis kadar nitrogenna.
dengan "ara
ini adalah
engan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi @,%, diperoleh nilai protein
dalam bahan makanan itu. *ntuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikutF ,5, ,41, dan ,6+. Angka @,% berasal dari angka konversi serum albumin ang biasana mengandung 1@G nitrogen. <.%. Metode (itrasi >ormol Pada metode ini, larutan protein dinetralkan dengan basa !&a;$# lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. engan terbentukna dimethilol ini berarti gugus aminona sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa &a;$ sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. 3ndikator ang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat ter)adi perubahan 8arna men)adi merah muda ang tidak hilang dalam +2 detik 9. Metode Kualitatif . Analisis Asam Amino !pembentukan 8arna protein# .1. (es Xantoprotein Pereaksi Hantoprotein adalah larutan asam nitrat pekat. Iika larutan $&; + pekat dimasukkan ke dalam larutan protein se"ara hati-hati, akan terbentuk endapan putih, dan berubah men)adi kuning )ika dipanaskan. Je)ala ini akibat nitrasi pada inti ben?ena ang terdapat dalam protein.
Pereaksi Hantoprotein positif terhadap protein ang mengandung asam amino dengan gugus samping fenil, seperti asam amino tirosin, fenilalanin, dan triptofan. .%. (es $opkins-ole Pereaksi $opkins-"ole dibuat dari asam oksalat dan serbuk magnesium dalam air. Pereaksi ini positif terhadap protein ang mengandung asam amino dengan gugus samping indol, seperti pada asam amino triptofan.
Keun&un'an &eknik %lo& a*ala
a. $kses ,an' le%i %esar ke(a*a molekul ,an' &ela &erika& ke (ermukaan lem%aran *i%an*in'kan ke(a*a molekul ,an' masi %era*a *i *alam 'el a&au ma&riks. %. e%i se*iki& rea'en ,an' *i%u&ukan.
+. 7ak&u un&uk melakukan s&ainin' *na *es&ainin') inku%asi) men+u+i) *ll *a(a& le%i sin'ka&. *. Pola ,an' &er%en&uk *a(a& *ikerin'kan *an *isim(an %er%ulan-%ulan se%elum *ianalisis.
e. Da(a& *i%ua& %an,ak re(lika (ola &erse%u& un&uk memun'kinkan %an,ak me&o*e analisis ,an' *i(akai
Ma&riks an' Di unakan Dalam Me&o*e lo& Ma&riks ,an' %iasa *i(akai *a(a& %eru(a ni&roselulosa ;N<=. Namun N< u'a memiliki kekuran'an) ,ai&u %e%era(a kom(onen ,an' memiliki a/ini&as lema *a(a& ilan' selama (emrosesan. Ma&riks lain ,an' *a(a& *i'unakan un&uk menu&u(i kekuran'ann,a ,ai&u ker&as *ia>o%en>,lo,me&,l ;DM=. $*a (ula ker&as lain) ,ai&u ia>o(en,l&ioe&er ;DPT=.
Ma+am Ma+am Me&o*e lo&&in'
1. !ou&ern lo& !ou&ern %lo& (er&ama kali *ikemukakan ole !ou&ern ;19?5=. Teknik ini men&rans/er DN$ ke ker&as N< *en'an men''unakan (rose*ur aliran (elaru&.
2. Nor&ern lo&
Nor&ern lo& meru(akan &eknikn,a sama *en'an !ou&ern lo&) namun men''unakan ker&as DM *an %iasan,a men*e&eksi RN$.
A. as&ern lo& as&ern lo& meru(akan &eknik ,an' *i&emukan ole Reinar* *an Malamu* ;1982=) a*ala (roses &rans/er %i*ire+&ional *en'an men''unakan aliran (elaru& (ro&ein *ari 'el ke N< %er*asarkan &i&ik isoelek&rik.
4. 7es&ern lo& Teknik ini (er&ama kali *i%ua& ole 7. Neal urne&&e *an *inamai wes&ern %lo& se%a'ai olokolokan &era*a( &ekini sou&ern %lo& ,an' (er&ama kali *i&emukan.
7es&ern %lo& meru(akan &eknik un&uk men*e&eksi (ro&ein s(esi/ik (a*a sam(el arin'an ,an' omo'ena& a&au(un *ari sua&u eks&raksi %er*asarkan kemam(uan (ro&ein &erse%u& %erika&an *en'an an&i%o*i. Teknik ini men''unakan 'el elek&ro/oresis un&uk memisakan (ro&ein %er*asarkan (anan' (oli(e(&i*a a&au %er*asarkan s&ruk&ur AD-n,a. Pro&ein &erse%u& kemu*ian *i&rans/er ke se%ua mem%ran) %iasan,a ni&roselulosa a&au PBD@) *imana mereka kemu*ian akan *ila+ak *en'an men''unakan an&i%o*i ,an' s(esi/ik ke(a*a (ro&ein &ar'e&.
7es&ern %lo& *a(a& men*e&eksi sua&u (ro&ein *alam kom%inasin,a *en'an san'a& %an,ak (ro&ein lain) *a(a& mem%erikan in/ormasi men'enai ukuran *an eks(resi (ro&ein &erse%u&.
7es&ern %lo& a*ala (roses (emin*aan (ro&ein *ari 'el asil elek&ro/oresis ke mem%ran. Mem%ran ini *a(a& *i(erlakukan le%i /leksi%el *ari(a*a 'el sein''a (ro&ein ,an' &er%lo& (a*a mem%ran *a(a& *i*e&eksi *en'an +ara 3isual mau(un /luoresensi. De&eksi eks(resi (ro&ein (a*a or'anisme *ilakukan *en'an (rinsi( imunolo'i men''unakan an&i%o*i (rimer *an an&i%o*i sekun*er. !e&ela (em%erian an&i%o*i sekun*er) *e&eksi *ilakukan se+ara 3isual *en'an (em%erian kromo'en a&au se+ara /luoresensi. Pa*a *e&eksi se+ara /luoresensi) reaksi an&ara an&i%o*i (rimer *en'an an&i%o*i sekun*er akan mem%erikan asil /luoresens ,an' selanu&n,a akan mem%akar /ilm C-ra,) *e&eksi ini *ilakukan *i kamar 'ela(.
an'ka-lan'ka *alam 7es&ern lo& :
1= Men,ia(kan sam(el ,an' akan *i&eli&i) a(aka i&u lim/osi& T a&au /i%ro%las a&au(un sel *ara &e(i. !am(el arus *ia'a &e&a( *in'in.
2= Men,ia(kan %u//er a'ar ( *a(a& %era*a (a*a an'kauan ,an' s&a%il.
A= Men,ia(kan an&i%o*i ,an' akan *i'unakan se%a'ai (ela+ak
Monoklonal an&i%o*i mau(un (oliklonal an&i%o*i *a(a& *i'unakan
a. $n&i%o*i monoklonal a*ala ,an' le%i %aik *i'unakan) karena : !in,al ,an' le%i %aik !(esi/isi&as ,an' le%i &in''i asil ,an' le%i erni (a*a (roses (em%ua&an /ilm wes&ern %lo&
%. $n&i%o*i Poliklonal - Men'enali le%i %an,ak e(i&o(
4= Melisis !el Ki&a (erlu melisis sel un&uk men'eluarkan (ro&ein ,an' *iin'inkan *ari sel. En&uk melisis sel *a(a& *i'unakan *e&er'en !D! *an R"P$. ila ,an' *iin'inkan a*ala se%ua (ro&ein ,an' &er/os/orilasi) maka (erlu *i&am%akan ini%i&or /os/a&ase a'ar 'u'us /os/a& (a*a (ro&ein &erse%u& &i*ak *i%uan'.
5= el lek&ro/oresis el ,an' %iasa *i(akai misaln,a !D!-P$ ;so*ium *o*e+,l sul/a&e- (ol,a+r,lami*e 'el ele+&ro(oresis= un&uk memisakan (ro&ein %er*asarkan ukurann,a *en'an a*an,a arus lis&rik. $krilami* 10F u'a *i&am%akan. Kera !D!-P$ ini a*ala *en'an men*ena&urasi (oli(e(&i*a se&ela &erle%i *aulu (oli(e(&i*a &erse%u& *i%uan' s&ruk&ur sekun*er *an &ersiern,a. !am(el &erle%i *aulu *imasukkan ke *alam sumur 'el. !a&u alur %iasan,a un&uk sa&umarker. Pro&ein sam(el akan memiliki mua&an ,an' sama *en'an !D! ,an' ne'a&i/ sein''a %er'erak menuu elek&ro*a (osi&i/ melalui arin'-arin' akrilami*. Pro&ein
,an' le%i ke+il akan %er'erak le%i +e(a& melewa&i arin'-arin' akrilami*. Per%e*aan ke+e(a&an (er'erakan ini akan &erlia& (a*a (i&a-(i&a ,an' &er'am%ar (a*a &ia( alur.
6= Trans/er el $'ar (ro&ein &erse%u& *a(a& *iakses ole an&i%o*i) maka (ro&ein &erse%u& arus *i(in*akan *ari 'el ke se%ua ker&as mem%ran) %iasan,a ni&roselulosa a&au PBD@. Mem%ran ini *ile&akkan *i a&as 'el) *an &um(ukan ker&as (en,era( *ile&akkan *i a&asn,a. aru&an %u//er kemu*ian akan meram%a& ke a&as melalui reaksi ka(iler *en'an mem%awa (ro&ein(ro&einn,a.
!elain i&u) *i(erlukan (ula se%ua (rose*ur un&uk men+e'a &era*in,a in&eraksi an&ara molekul-molekul ,an' &i*ak *iin'inkan a'ar asil ,an' *i(erlukan le%i erni ;&o re*u+e GnoiseH=.
?= De&eksi De&eksi *ilakukan *en'an an&i%o*i ,an' &ela *imo*i/ikasi %ersama *en'an se%ua en>im ,an' *ise%u& re(or&er en>,me. Proses *e&eksi %iasan,a %erlan'sun' *alam *ua &aa() ,ai&u :
a. $n&i%o*i Primer $n&i%o*i ,an' *i'unakan *i sini a*ala an&i%o*i ,an' (er&ama kali *iasilkan sis&em imun ke&ika &er(aan (ro&ein &ar'e&. $n&i%o*i &erlaru& kemu*ian *iinku%asi %ersama ker&as mem%ran (alin' se*iki& selama A0 meni&.
%. $n&i%o*i !ekun*er !e&ela *iinku%asi %ersama an&i%o*i (rimer) ker&as me%ran *i%ilas &erle%i *aulu %arula *iinku%asi *en'an an&i%o*i sekun*er. $n&o%o*i sekun*er a*ala an&o%o*i ,an' s(esi/ik un&uk sua&u s(esies (a*a an&i%o*i (rimer. Misaln,a) an&i-&ikus an,a akan %erika&an (a*a an&i%o*i (rimer ,an' %erasal *ari &ikus. $n&i%o*i sekun*er %iasan,a %erika&an *en'an en>im
re(or&er se(er&i alkaline /os/a&ase a&au orsera*is (eroi*ase. $n&i%o*i sekun*er ini kemu*ian akan men'ua&kan sin,al ,an' *iasilkan ole an&i%o*i (rimer.
!ekaran') (roses *e&eksi *a(a& *ilakukan *en'an sa&u lan'ka saa) ,ai&u *en'an men''unakan an&i%o*i ,an' *a(a& men'enali (ro&ein ,an' *iin'inkan sekali'us memiliki la%el ,an' mu*a *i*e&eksi
8= $nalisis a. ,me sein''a *a(a& mewarnai mem%ran ni&orselulosa
%. <emilumines+en& Me&o*e ini *i'unakan %ila su%s&ra& meru(akan molekul ,an' %ila %ereaksi *en'an an&i%o*i sekun*er a&u *en'an re(or&er en>,me akan &eriluminasi. asiln,a kemu*ian *iukur *en'an *ensi&ome&ri un&uk men'e&aui umla (ro&ein ,an' &erwarnai. Teknik &er%arun,a ,an' (akin' +an''i *ise%u& nan+e* <eilumines+en& ;<=. Teknik inila ,an' (alin' %an,ak *i'unakan sekaran'.
+. Ra*ioa+&i3e *e&e+&ion Me&o*e ini men''unakan C-ra, ,an' %ila men'enai la%el akan men+i(&akan re'ion 'ela(. Namun me&o*e ini san'a& maa *an %eresiko &in''i &era*a( kesea&an.
*. @luores+en& *e&e+&ion Pela+ak ,an' mme(un,ai la%el ,an' *a(a& men'alami /luorosensi lalu kemu*ian *i*e&eksi ole /o&osensor se(er&i kamera <
Me&o*e ini u'a meru(akan sala sa&u me&o*e ,an' (alin' serin' *i'unakan karena san'a& sensi&i/.
Da/&ar Pus&aka $n*rews $T. le+&ro(oresis Teor,) Te+niues) io+emi+al an*
Mole+ular !&a&ion. I7es&ern lo&. $3aila%le a& : &&(:www.mole+ulars&a&ion.+om(ro&einwes&ern-%lo& ;*iakses (a*a 25 Mare& 2008=.
