LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V AKTIVITAS ENZIM PROTEASE PADA BUAH NANAS
ZELISA NUDIA FITRI E1M015071 PENDIDIKAN KIMIA
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN UNIVERSITAS MATARAM 2017
1
PERCOBAAN V AKTIVITAS ENZIM PROTEASE PADA BUAH NANAS
A. ABSTRAK
Tujuan praktikum ini adalah untuk mengetahui aktivitas enzim protease dari buah nanas secara kualitatif. Pada praktikum ini dilakukan dua kali tahap yaitu isolasi enzim protease dari buah nanas kemudian dilanjutkan dengan uji aktivitas enzim protease tersebut secara kualitatif. Di antara berbagai jenis buah, nanas merupakan sumber protease dengan konsentrasi tinggi dalam buah yang masak. Enzim protease adalah enzim proteolitik yang hanya ada di buah dan batang nanas, yaitu enzim yang bisa menguraikan molekul kecil dari sebuah protein. Larutan kasein yang ditambahkan ekstrak enzim (enzim protease) setelah ditambahkan biuret berwarna ungu pekat, sedangkan larutan kasein (larutan standar) tanpa penambahan ekstrak enzim setelah ditambahkan biuret berwarna ungu lebih muda. Larutan kasein ini berfungsi sebagai substrat enzim. Hidrolisis kasein untuk memperlihatkan aktivitas hidrolitik protease. Kata kunci : buah nanas, enzim protease, substrat enzim,hidrolitik protease
B. PENDAHULUAN
Enzim merupakan golongan proteinyang paling banyak terdapat dalam sel dan mempunyai fungi penting sebagai biokatalisator pada reaksi-reaksi biokimia. Salah satu enzim yang berperan di dalam industri adalah enzim protease karena enzim ini banyak digunakan baik untuk pangan maupun non pangan (Stanbury and Whitaker,1984). Kelebihan enzim sebagai katalis dibandingkan dengan bahan kimia lainnya adalah (1) enzim memiliki spesifitas yang tinggi, (2) enzim hanya mengkatalis substrat tertentu, (3) tidak terbentuk produk sampingan (by-product) yang tidak diinginkan, (4) produktifitas yang tinggi sehingga dapat mengurangi biaya, (5) produk akhir pada umumnya tidak terkontaminasi sehingga mengurangi biaya purifikasi dan mengurangi efek kerusakan terhadap lingkungan (Sutandi, 2003).
2
Protease merupakan kelompok enzim-enzim yang sangat kompleks yang menduduki posisi sentral dalam aplikasinya pada bidang fisiologis dan produk produk komersil. Protease ekstraseluler sebagian besar berperan dalam hidrolisis substrat polipeptida besar. Enzim proteolitik intraseluler memainkan peran penting dalam metabolisme dan proses regulasi pada sel hewan, tumbuhan dan mikroorganisme, seperti menggantikan protein, memelihara keseimbangan antara degradasi dan sintesis protein. Protease intraseluler berperan dalam fungsi fisiologis lainnya, seperti penecernaan, maturasi hormon, perakitan virus, respon imun, imflamantasi, fertilisasi, koagulasi darah, fibrinolisis, kontrol tekanan darah, sporulasi, germinasi dan pathogenesis. Protease juga diimplikasikan dalam peran regulasi ekspresi gen, perbaikan DNA, dan sintesis DNA (Rao et al., 1998). Protease dihasilkan dari tiga sumber utama, yaitu tanaman, hewan dan mikroba. Enzim papain, bromelin dan fisin merupakan protease yang dihasilkan dari tanaman. Sedangkan tripsin, kemotripsin, pepsin, dan rennin merupakan protease yang berasal dari hewan. Kelemahan tanaman sebagai sumber protease adalah kesulitan untuk melakukan ekstraksi enzim efisien karena membutuhkan peralatan berat untuk menghancurkan jaringan tanaman yang besar dan keras (Lehninger, 2005). Selain itu, pertumbuhan tanaman terlalu lama untuk produksi enzim skala besar. Produksi protease dari hewan pun sangat terbatas, membutuhkan jumlah hewan dan biaya yang besar karena proses ekstraksi enzim dari jaringan hewan sulit dilakukan. Enzim dari hewan paling banyak digunakan dalam industri pangan adalah kimosin, yaitu pada industri keju. Sedangkan enzim tanaman yang paling banyak digunakan dalam industri pangan adalah papain dan bromelin. Pada tahun 1950-1960, pemanfaatan enzim dari hewan dan tanaman mulai digantikan oleh enzim mikrobial (Nagodawithana dan Reed, 1993). Banyak varietas nanas ((Pineapple, Ananas comosus L) yang termasuk dalam family bromeliaseae mengandung enzim proteolitik yang disebut bromelin. Enzim ini menguraikan protein dengan jalan memutuskan ikatan peptida dan menghasilkan protein yang lebih sederhana . Enzim bromelin terdapat dalam semua jaringan tanaman nanas. Sekitar setengah dari protein dalam nanas mengandung protease bromelin. Di antara berbagai jenis buah,
3
nanas merupakan sumber protease dengan konsentrasi tinggi dalam buah yang masak (Donald, 1997).
C. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM
1. Alat a. Neraca analitik b. Mortal dan pastel c. Gelas kimia d. Penjepit e. Corong f. Hot plate g. Pipet tetes h. Gelas ukur i. Termometer j. Tabung reaksi k. Rak tabung reaksi l. Erlenmeyer m. Sentrifugator n. Stopwatch 2. Bahan a. Buah nanas segar b. Aquades c. Buffer fosfat dingin d. Kasein e. Reagen buret f. Kain kasa g. Es batu h. Tisu i. Air keran
4
D. PROSEDUR KERJA
1. ISOLASI ENZIM PROTEASE DARI NANAS a.
Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
b.
Menimbang 250 gram buah nanas segar menggunakan neraca analitik.
c.
Menghaluskan nanas yang telah ditimbang menggunakan mortar dan pastel kemudian dipindahkan kedalam gelas kimia.
d.
Menambahkan 50 ml buffer fosfat dingin (ph 7) kedalam gelas kimia yang berisi nanas yang telah dihaluskan.
e.
Menyaring campuran nanas dan buffer fosfat dingin tersebut menggunakan kain kasa sehingga didapatkan filtrat (dalam keadaaan dingin).
f.
Menyaring filtrat yang dihasilkan dari proses sebelumnya dengan kertas saring (dalam keadaan dingin) sehingga menghasilkan enzim protease yang telah diisolasi.
2. UJI AKTIVITAS ENZIM PROTEASE SECARA KUALITATIF a. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. b. Memasukkan 1 ml kasein 0,65% kedalam tabung reaksi kemudian diinkubasi pada suhu 40-50 0C sampai tidak menggumpal. c. Memasukkan 1 ml ekstrak enzim dan fosfat (ph 7) 4 ml buffe kemudian diinkubasi pada suhu 40-50 0C selama 20 menit. d. Mendinginkan tabung reaksi yang telah diinkubasi sebelumnya kedalam air es. e. Memindahkan larutan yang sudah didinginkan kedalam tabung reaksi yang lebih kecil. f.
Mensentrifugasi larutan tersebut dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit sehingga didapatkan endapan dan supernatan.
g. Memisahkan supernatan dengan endapan pada tabung reaksi yang berbeda. h. Menambahkan 2 ml biuret kedalam tabung reaksi yang berisi supernatan. Kemudian dikocok sehingga menghasilkan larutan yang berwarna disebut larutan sampel.
5
i.
Memasukkan 1 ml kasein 0,65 % dan 5 ml buffer fosfat (ph 7) kedalam tabung reaksi yang baru yang akan digunakan sebagai larutan kontrol.
j.
Menambahkan 2 ml biuret kedalam tabung reaksi yang berisi larutan kontrol kemudian dikocok sehingga menghasilkan larutan yang berwarna.
k. Membandingkan warna larutan yang dihasilkan pada larutan kontrol dan larutan sampel.
E. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Hasil Pengamatan (Terlampir). 2. Pembahasan
Tujuan praktikum biokimia I percobaan V yang berjudul ‘Aktivitas Enzim Protease pada Buah Nanas’ ini adalah untuk mengetahui aktivitas enzim protease pada buah nanas secara kualitatif. Semua enzim adalah protein, dan aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Enzim seperti protein lain, mempunyai berat molekul berkisar kira-kira 12.000 sampai 1 juta. Oleh karena itu, enzim berukuran amat besar dibandingkan dengan substrat atau gugus fungsional targetnya. Protease merupakan enzim penting dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena penggunaannya sangat luas. Enzim ini memainkan peranan yang penting pada industri makanan, misalnya dalam proses konversi susu menjadi keju, sebagai bahan pada deterjen maupun pada pemrosesan kulit (Saefuddin,2006). Oleh karena itu , tidak mengherankan apabila protease yang digunakan mencapai 60% dari total enzim yang diperjualbelikan di seluruh dunia (Ward,1985). Nilai perdagangan enzim dunia mencapai 3-4 miliar dolar per tahun ,4-5 juta dolar di antaranya dari pasar Indonesia yang keseluruhannya diimpor dari negara-negara produsen enzim (Rajasa,2003).
6
Praktikum pada percobaan kali ini isolasi enzim protease dari buah nanas . Nanas yang digunakan adalah nanas yang masak dan segar. Daging buah nanas yang masak tersebut dihaluskan sebanyak 250 gram menggunakan mortar dan pestle. Praktikum kali ini menggunakan buffer posfat dingin (pH7) dalam mengisolasi
enzim
protease.
Kemudian
dilakukan
penyaringan
untuk
memisahkan ampas dengan filtrat sambil di inkubasi dengan es batu untuk menjaga suhunya. Filtrat tersebut disaring kembali dan enzim protease telah di isolasi. Sebuah enzim diisolasi untuk mengetahui karakteristik yang berada dalam sebuah enzim tersebut. Salah satu fungsi pengisolasian enzim adalah untuk memisahkan sebuah enzim. Enzim protease adalah enzim proteolitik yang hanya ada di buah dan batang nanas, yaitu enzim yang bisa menguraikan molekul kecil dari sebuah protein. Maka dari itu enzim protease yang telah di isolasi digunakan kembali untuk uji kualitatif aktivitas enzim protease pada langkah berikutnya. Uji aktivitas enzim protease secara kualitatif menggunakan 1 ml kasein 0,65 % yang telah dihasilkan pada praktikum sebelumnya. Kasein yang digunakan adalah sebagai substrat enzim. Hidrolisis kasein digunakan untuk memperlihatkan aktivitas hidrolitik protease. Protease mengkatalisis degradasi kasein yaitu dengan memutuskan ikatan peptida CO-NH dengan masuknya air ke dalam molekul. Reaksi tersebut melepaskan asam amino. Kasein tersebut di inkubasi pada suhu 40-500C sampai tidak menggumpal. Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh pH medium. pH saat aktivitas enzim maksimum adalah pH optimum untuk itulah diperlukan penambahan buffer posfat. pH optimum merupakan pH saat gugus pemberi dan penerima proton yang berperan penting pada sis i katalitik enzim atau pada sisi pengikat substrat berada dalam tingkat ionisasi yang diinginkan, sehingga substrat lebih mudah berinteraksi dengan sisi katalitik enzim. Temperatur sangat erat berhubungan dengan energi aktivitas dan kestabilan enzim. Peningkatan temperatur dapat menyebabkan peningkatan kecepatan reaksi dan secara bersamaan meningkatkan kecepatan inaktivasi enzim (Stauffer, 1989). Setelah penambahan buffer posfat dan ekstrak enzim protease yang telah diisolasi
7
kemudian di inkubasi selama 20 menit pada suhu 40-50 0C. Larutan kasein yang sebelumnya berwarna agak keruh kemudian berubah menjadi berwarna bening setelah di inkubasi dan didinginkan dalam air es. Kemudian dipindahkan pada tabung reaksi yang lebih kecil untuk proses sentrifugasi bertujuan untuk mengendapkan enzim kasar dari sisa jaringan nanas. Sentrifugasi dilakukan selama 10 menit pada 4000 rpm. Supernatan dan endapan yang dihasilkan berwarna kuning bening dan kuning. Supernatan tersebut dipindahkan kedalam tabung reaksi yang lain lalu ditambahkan dengan biuret yang berwarna ungu. Campuran supernatan dan larutan biuret tersebut menghasilkan warna ungu pekat. Langkah berikutnya membandingkan dengan larutan standar ( 1 ml kasein 0,65% + 5 ml buffer posfat pH7) yang ditambahkan larutan biuret. Larutan standar yang ditambahkan biuret tersebut berwarna ungu, sedangkan larutan supernatan (yang ditambhkan ekstrak enzim) berwarna ungu lebih pekat. Hasil pengamatan ini menunjukkan aktivitas enzim protease. . Kecepatan reaksi bergatung pada konsentrasi enzim yang berperan sebagai katalisator dalam reaksi itu. Hubungan kecepatan reaksi enzimatik dengan substrat dapat dilihat pada gambar dibawah ini:
Gambar 1. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi enzimatis
Jika konsentrasi enzim yang digunakan tetap, sedangkan substrat dinaikkan dapat dilihat bahwa pada penambahan pertama kecepatan reaksi naik dengan cepat. Tetapi jika penambahan substrat dilanjutkan, maka tambahan kecepatan mulai
8
menurun sampai pada titik batas. Bagaimanapun tingginya konsentrasi substrat setelah titik ini tercapai, kecepatan reaksi akan mendekati garis maksimum. Pada batas kecepatan maksimum (Vmaks), enzim menjadi jenuh oleh substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat. Dalam reaksi enzimatik, bila konsentrasi substrat tetatp maka kenaikan laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Sedangkan bila konsentrasi enzim yang tetap, maka kenaikan laju reaski berbanding lurus dengan konsentrasi substrat (Miller, 2005). Pengaruh kejenuhan ini diperlihatkan oleh hampir semua enzim. Pada tahun 1913, Leoner Michaelis dan Muan Menten mengemukakan bahwa reaksi enzimatis melibatkan pembentukan kompleks enzim-substrat yang kemudian terurai menjadi produk dan melepaskan enzim kembali. Secara sederhana, hipotesis Michaelis-Menten dapat dituliskan sebagai berikut:
Enzim (E) pertama-tama bergabung dengan substrat (S) dalam reaksi dapat bali k, membentuk kompleks enzim-substrat (ES). Reaksi ini berlangsung relatif cepat. Kompleks ES lalu terurai dalam reaksi kedua yang relatif lebih lambat, menghasilkan produk reaksi (P) dan enzim bebas. Karena reaksi kedua merupakan tahap yang membatasi kecepatan, maka kecepetan keseluruhan reaksi enzimatik harus seimbang dengan konsentrasi komplek enzim-substrat. Pada setiap saat dalam reaksi enzimatik, enzim terdapat dalam dua bentuk, yaitu bentuk bebas atau terikat dan bentuk yang sudah terikat ES. Kecepatan reaksi katalitik menjadi maksimum jika semua enzim terdapat sebagai kompleks ES dan konsentrasi enzim bebas menjadi sangat kecil (Lehninger, 2005).
F.
KESIMPULAN
Berdasarkan tujuan, hasil pengamatan dan pembahasan maka dapat disimpulkan bahwa:
9
a. Di antara berbagai jenis buah, nanas merupakan sumber protease dengan konsentrasi tinggi dalam buah yang masak. b. Enzim protease adalah enzim proteolitik yang hanya ada di buah dan batang nanas, yaitu enzim yang bisa menguraikan molekul kecil dari sebuah protein. c. Pemisahan endapan dan filtrat(supernatan) saat proses sentrifugasi harus dilakukan secara perlahan-perlahan dan hati-hati agar endapan dan filtrat tidak bercampur kembali. d. Proses sentrifugasi bertujuan untuk mengendapkan enzim yang kasar dari sisa jaringan nanas. e. Proses pendinginan sebelum sentrifugasi bertujuan untuk menjaga suhu setelah ditambahkan buffer posfat karena aktivitas enzim sangat berpengaruh terhadap suhu. f. Penambahan buffer posfat bertujuan untuk menjaga pH optimal. g. Warna larutan kasein yang ditambahkan ekstrak enzim (enzim protease) yang telah di isolasi setelah ditambahkan larutan biuret adalah ungu pekat, sedangkan warna larutan standar (larutan kasein+buffer posfat) tanpa penambahan ekstrak enzim setelah ditambahkan dengan biuret adalah ungu. h. Kasein yang digunakan adalah sebagai substrat enzim. Hidrolisis kasein digunakan untuk memperlihatkan aktivitas hidrolitik protease. Protease mengkatalisis degradasi kasein yaitu dengan memutuskan ikatan peptida CO-NH dengan masuknya air ke dalam molekul. Reaksi tersebut melepaskan asam amino.
10
DAFTAR PUSTAKA
Donald A.(1997) Antibiotics and Antimicrobial Action. New York: Edward Arnold. Elvi susanti VH.(2003). Isolasi dan Karakterisasi Protease dari Bacillus subtilis 1012M15. B I O D I V E R S I T A S .4(1): 12-17. Miller.K.(2005). Extracellular Enzymes. London: Van Nostrand Reinhold Co. Ltd. Nagodawithana and Reed.(1993). Biology of Bacilli. Stoneham:Butterworth Heinemann.Press. Inc. Rajasa.M. (2003).Alih Bahasa: Sadikin Mochtar. Intisari Biokimia. Jakarta: Binarupa Aksara. Rao et.al.(1998). Protein Purification-Principles and Practice. New York: Springer Verlag. Stanbury and Whitaker.(1984). The Enzymes. 3rd ed. New York: Academic Elsevier Science Publisher B.V. Stauffer. L. (1989). Biochemistry. 4th ed. New York: W. H. Freeman and Co. Sutandi .(2003). Teknik Isolasi Enzim Bromelain. Jakarta:Erlangga.
11
LAMPIRAN GAMBAR HASIL PENGAMATAN
Supernatan
Larutanstandar
Endapan
Perbandingan larutan standar dengan larutan sampel
12
13
14
15
16
