La Naturaleza de Las Enzimas

Bioquímica

Ing. M. Sc. Alberto Santos Montero

TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA I. LA NATURALEZA DE LAS ENZIMAS ENZIMAS Las enzimas son catalizadores que aumentan la velocidad de las reacciones de otra manera lenta o imperceptible, sin sufrir ningún cambio neto en su estructura. Estas enzimas son proteínas y mediar en todas las reacciones de síntesis y de degradación, llevada a cabo por los organismos vivos. Son catalizadores muy eficientes, a menudo muy superiores a los catalizadores químicos convencionales, por lo cual se están empleando cada vez más en la sociedad de alta tecnología de hoy, como una parte muy significativa de la expansión de la biotecnología. Las enzimas tienen una serie de ventajas sobre los catalizadores químicos convencionales. La primera de ellas es su especificidad y selectividad selectividad no sólo para las reacciones en particular, sino también en la discriminación entre las partes de moléculas similares (regioespecificidad) o isómeros ópticos (estereoespecificidad). Ellos sólo catalizar las reacciones de rangos muy estrechos de los reactivos (sustratos), que puede consistir en pequeño número de clases de compuestos estrechamente relacionados (por ejemplo, la tripsina cataliza la hidrólisis de algunos péptidos y ésteres además de la mayoría de las proteínas), una sola clase de compuestos (por ejemplo, la hexoquinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP a varias hexosas), o un compuesto único (por ejemplo, glucosa oxidasa oxida la glucosa sólo entre los azúcares naturales). Las enzimas son moléculas complejas de proteínas presentes en las células vivas, donde actúan como catalizadores en el logro de cambios químicos en las sustancias. Estos son catalizadores catalizadores biológicos utilizados por las células vivas para lograr una serie de conversiones químicas reconocida como la "química de la vida". Cada célula contiene un gran número de enzimas, cada una con una capacidad limitada para la conversión de una molécula de producto químico o una porción de la molécula a una versión modificada o escindido de esa molécula. Más de 3.000 enzimas catalizar una amplia gama de reacciones se sabe que existen. La desintegración de los productos alimenticios alimenticios a los aminoácidos, azúcares, lípidos se realiza normalmente a menos de 3 a 6 horas, dependiendo de la cantidad y tipo de alimentos. En ausencia de enzimas, la hidrólisis por las enzimas digestivas se tardaría más de 30 años. Con el desarrollo de la ciencia de la bioquímica, bioquímica, una mejor comprensión de la amplia gama de enzimas presentes pre sentes en las células vivas y de d e su modo de acción ha salido a la luz. 1

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Sin enzimas no puede haber vida. a pesar de las enzimas sólo se forman en las células vivas, muchos se pueden separar de las células y puede seguir funcionando in vitro. vitro. Esta capacidad única de enzimas para realizar realizar sus transformaciones químicas específicas de aislamiento ha dado lugar a un uso cada vez mayor de las enzimas en procesos industriales, denominados colectivamente tecnología de enzimas.

1.1 Categorías o tipos de enzimas Todas las enzimas contienen un esqueleto de la proteína. proteína. En algunas enzimas este es el único componente componente de la estructura. Sin embargo hay otros restos de proteínas no suelen estar presentes, que pueden o no participar en la actividad catalítica de la enzima. Covalentemente grupos de hidratos de carbono son frecuentes los rasgos estructurales que a menudo no tienen relación directa con la actividad catalítica, aunque también puede afectar la estabilidad de una enzima y la solubilidad. Otros factores que se encuentran a menudo son iones metálicos (cofactores) y moléculas de bajo peso molecular orgánica (coenzimas). (coenzimas). Estos pueden ser libremente o bien obligado por las fuerzas no covalentes o covalentes. Las enzimas se clasifican de acuerdo con el informe de un Comité de Nomenclatura designado por la Unión Internacional de Bioquímica (1984). La comisión de la enzima (CE) número de enzimas dividen en seis grupos principales según el tipo de reacción catalizada:

Oxidorreductasas Están implicados en las reacciones redox en la que los átomos de hidrógeno, oxígeno o electrones son transferidos entre las moléculas. En esta clase se incluye la amplia deshidrogenasas (transferencia de hidruro), oxidasas (transferencia de electrones al oxígeno molecular), oxigenasas (transferencia de oxígeno a partir del oxígeno molecular) y peroxidasas (transferencia de electrones al peróxido). Por ejemplo: la glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4, nombre sistemático, β D-glucosa: oxígeno 1-oxidorreductasa). Transferasas Catalizan la transferencia de un átomo o grupo de átomos (por ejemplo, acilo, alquilo y glicosil-), entre dos moléculas, pero excluidas las transferencias, como se clasifican int que que otros grupos (por ejemplo, oxidorreductasas y hidrolasas). Por ejemplo: aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1, nombre sistemático, L-aspartato aminotransferasa: 2-oxoglutarato, también llamada transaminasa glutámicooxalacética o simplemente GOT) Hidrolasas Implican reacciones hidrolíticas y su reversión. Esta es actualmente la clase más comunes de las enzimas en el campo de la tecnología de enzimas e incluye las 2

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esterasas, glucosidasas, lipasas y proteasas. Por ejemplo: quimosina (CE 3.4.23.4, sin nombre sistemático declaró, también llamada renina).

Liasas Implican reacciones de eliminación en el que se elimina un grupo de átomos del substrato. Esto incluye la aldolasas, decarboxilasas, deshidratasas y pectinasas algunos, pero no incluye hidrolasas. Por ejemplo: histidina amonio-liasa (EC 4.3.1.3, nombre sistemático, amoníaco L-histidina-liasa, también llamado histidasa). Isomerases Catalizan isomerisations moleculares e incluir la epimerases, racemasas y transferasas intramoleculares. Por ejemplo: xilosa isomerasa (EC 5.3.1.5, nombre sistemático, ketol D-xilosa-isomerasa, comúnmente llamada glucosa isomerasa). Ligasas, También conocido como sintetasas, forman un grupo relativamente pequeño de las enzimas que son la creación de un enlace covalente que une dos moléculas unidas, junto con la hidrólisis de un nucleósido trifosfato. Por ejemplo: glutatión sintasa (EC 6.3.2.3, nombre sistemático, gL-glutamil-L-cisteína: ligasa glicina (ADP-formación), también llamado glutatión sintetasa). Las enzimas llevar a cabo una rápida conversión de su sustrato a temperaturas moderadas y el pH cercanos a la neutralidad, por lo general con una alta especificidad, tanto en la selección de sustrato de una mezcla compleja, y en la conversión química efectivamente afectada. Productos alimenticios son a menudo los sustratos, como por la enzima conocida producida en el estómago o el intestino de los animales. La actividad de una enzima se debe a su carácter catalizador. Una enzima lleva a cabo su actividad sin ser consumida en la reacción, mientras que la reacción se produce a un ritmo mucho mayor cuando la enzima está presente. Las enzimas son altamente específicas y sólo funcionan en ciertos tipos de compuestos, los sustratos. Algunas enzimas requieren factores adicionales, denominados cofactores que pueden ser iones metálicos, los nucleótidos, etc La tecnología enzimática se describe mejor como la tecnología asociada a la aplicación de enzimas como las herramientas de la industria, la agricultura y la medicina. Aunque los primeros informes sobre la explotación de las enzimas se han documentado a finales de 1800, verdadera aplicación industrial de enzimas sólo empezó en serio en la década de 1960. La mayoría de las enzimas utilizadas en la industria y aplicaciones biotecnológicas se derivan de los hongos en particular (Aspergillus) y bacterias (Bacillus). organismos de seguridad debe ser utilizado para aplicaciones de consumo relacionados. La tecnología enzimática abarca la producción, el aislamiento, purificación, su uso 3

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en forma soluble y por último, la inmovilización y el uso de enzimas en una amplia gama de sistemas de biorreactor.

1.2Nuevas aplicaciones y usos futuros La explotación de las enzimas como electrocatalizadores (biosensores específicos); Las enzimas como herramientas analíticas para medir los compuestos específicos, para la regeneración de los metabolitos específicos; Utilización de la enzima en la síntesis de materias orgánicas y la producción de perfumes y cosméticos; Enzima int utilización que la formación de sabores de alimentos y compuestos aromáticos; El uso de enzimas como herramientas para la detoxificación de los residuos de plaguicidas; Las enzimas como monitores de los niveles de químicos tóxicos en los alimentos y el agua.

Aplicaciones Biomédicas de la tecnología enzimática La síntesis de nuevos compuestos anti-microbianos Terapia de sustitución enzimática Las enzimas en el tratamiento del cáncer Enzima del injerto y aplicaciones dermatológicas Las enzimas como activadores de las biomoléculas precursoras Enzima tecnología en la prevención de la caries dental

Fuentes de la enzima Biológicamente activa enzimas puede ser extraído de cualquier organismo vivo. Una amplia gama de fuentes se utilizan para la producción comercial de la enzima Actinoplanes de Zymomonas, de la espinaca al veneno de serpiente. De los cien o más enzimas que se utilizan industrialmente, más de la mitad es de hongos y levaduras y más de un tercio son de bacterias con el resto dividido entre el animal (8%) y vegetales (4%) de fuentes (Cuadro 14.1). Un gran número de enzimas encuentran uso en los análisis químicos y el diagnóstico clínico. Fuentes no microbiana proporcionar una mayor proporción de estos, en la actualidad. Los microbios son preferibles a las plantas y los animales como fuente de enzimas porque Ellos son generalmente más baratos de producir. Su contenido de enzimas son más predecibles y controlables. suministro confiable de materia prima de la composición constante son más fáciles de organizar y de plantas y tejidos animales contienen más materiales 4

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potencialmente dañinos que los microbios, incluidos los compuestos fenólicos (de plantas), los inhibidores de la enzima endógena y proteasas. Se están haciendo esfuerzos para superar algunas de estas dificultades mediante el uso de animales y cultivo de células vegetales. Las enzimas están presentes en todos los seres vivos y, si se toma el suficiente cuidado para protegerlos, que puede ser aislada y purificada a partir de cualquier organismo. La mayor parte de las enzimas utilizadas en la industria son de origen microbiano, pero hay excepciones, como las proteasas vegetales caries (incluyendo la papaína, bromelina y ficina) y el animal proteasas como la renina y la pepsina. En general, el aumento de los tejidos vegetales no son satisfactorios los materiales de los que tratar de aislar las enzimas. El peligro principal de las enzimas de células animales es la hidrólisis por las proteasas que resulta en la alteración de las células. Las plantas no tienen medios de la excreción de los residuos y se acumulan estas vacuolas. Sobre las alteraciones de las células, el contenido vacuola se liberan y entran en contacto con las enzimas con efectos indeseables. Sus efectos pueden ser reducidos por la inclusión de proteínas adicionales, tales como las albúminas, en medio de extracción, manteniendo la frescura del tejido durante la extracción, y mediante el aislamiento de la enzima requerida lo más rápidamente posible. Mientras que aislar las enzimas de las células microbianas, el aislamiento se debe hacer rápidamente y en las bajas temperaturas.

Importancia Industrial de las enzimas y sus fuentes

Enzyme1 Animales enzimas Catalasa Quimotripsina Lipase5

CE número2

Fuente

Intra / extra cellular3

Escala de production4

Para uso industrial,

1.11.1.6 3.4.21.1

Hígado

I E

-

Alimentos Cuero

E

-

Alimentos

E

+

Queso

E

-

Cuero

Páncreas 3.1.1.3 Páncreas

Rennet6

3.4.23.4 Abomaso

Tripsina

3.4.21.4 Páncreas

5

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Enzyme1 Enzimas de Planta Actinidina a-amilasa

β-amilasa


CE número2

Fuente

Intra / Escala de Para uso extra production4 industrial, cellular3

3.4.22.14 3.2.1.1

Kiwi Cebada malteada

E E

Cebada malteada

E

Piña látex

E

Cebada malteada

E

La figura de látex Soja

E

-

Elaboración de la cerveza Alimentos

I

-

Alimentos

E

++

Carne

3.2.1.2

La bromelina

3.4.22.4

β-

3.2.1.6

Glucanase7 Ficina

3.4.22.3

Lipoxigenasa 1.13.11.12 Papaína 3.4.22.2

Enzyme1 Enzimas bacterianas a-amilasa β-amilasa

Alimentos Elaboración de la cerveza

+++ Elaboración de la cerveza Elaboración de la cerveza ++

CE número2

Fuente


3.2.1.1 3.2.1.2 3.5.1.1

Bacilo Bacilo

E E I

+++ + -

Almidón Almidón Salud

I

++

Jarabe de

Asparaginasa La glucosa

Papaya latex

+++

5.3.1.5

Escherichia coli Bacilo

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isomerase8 La penicilina amidasa Protease9


fructosa 3.5.1.11 3.4.21.14 3.2.1.41

Bacilo

I

-

Bacilo

E

+++

Farmacéutica Hornear

Klebsiella

E

-

Almidón

Pullulanase10

Enzyme1

Enzimas de hongos a-amilasa Aminoacylase

Glucoamylase 1 1 Catalasa Celulasa

CE número 2

Fuente

Intra / extra cellular 3

Escala de production 4

Para uso industrial,

3.2.1.1 3.5.1.14

Aspergillus Aspergillus

E E

++ -

Hornear

3.2.1.3

Aspergillus

E

+++

Farmacéutic a Almidón

1.11.1.6 3.2.1.4

Aspergillus

I I

-

Alimentos Residuos

E I

-

Alimentos Alimentos

Dextranasa La glucosa oxidasa Lactase12 Lipase5 Rennet13

3.2.1.11 1.1.3.4

Pectinse14 La pectina liasa Protease13

3.2.1.23 3.1.1.3 3.4.23.6

Trichoderm a Penicillium Aspergillus

E E E

++

Lácteos Alimentos Queso

3.2.1.15 4.2.2.10

Aspergillus Rhizopus Mucor miehei Aspergillus Aspergillus

E E

++ -

Bebidas Bebidas

3.4.23.6

Aspergillus

E

+

Hornear

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Raffinase15

Enzyme1


3.2.1.22

CE número2

Mortierella

I

Fuente

-

Alimentos


Enzimas de la levadura 3.2.1.26 Invertase16 Lactase12 Lipase5 Raffinase15

3.2.1.23 3.1.1.3 3.2.1.22

Saccharomyces Kluyveromyces Candida

I/E

-

Confitería

I/E E I

-

Lácteos Alimentos Alimentos

Saccharomyces

Aplicaciones de las enzimas de la Biotecnología Durante miles de años de procesos tales como la elaboración de la cerveza, la panificación y la producción de queso han implicado el uso no reconocida de las enzimas. En Occidente la comprensión de las enzimas industriales giraba en torno a la levadura y malta, donde hornear tradicionales y las industrias de elaboración de la cerveza fueron en rápida expansión. Gran parte del desarrollo inicial de la bioquímica se centró en la fermentación la levadura y los procesos de transformación del almidón en azúcar. Varias enzimas, especialmente los utilizados en la industria del almidón, la fabricación de jarabe de alta fructosa, desencolado textil y de la formulación de detergente, se comercializan como productos de consumo en el mercado mundial. Relativamente pocas enzimas, especialmente las de los detergentes, ablandadores de carne y de los agentes jardín de compostaje, se venden directamente al público. La mayoría son utilizados por la industria para producir productos mejorados o nuevos, para evitar largos y complicados caminos de síntesis química o para su utilización en la separación y purificación de mezclas de isómeros. Muchos de los más útiles, pero menos comprendidos, los usos de las enzimas libres en la industria alimentaria. En la actualidad existe una proliferación incursión de los usos y los usos potenciales de más alta pureza procesamiento enzima pecado preparación industrial, medicina clínica y la práctica de laboratorio. La gama de enzimas puras 8

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ya está disponible comercialmente está aumentando rápidamente. La mayoría de las enzimas que se utilizan a escala industrial son enzimas extracelulares, es decir, las enzimas que normalmente son excretadas por los microorganismos que actúan sobre su sustrato en un entorno externo, y son análogas a las enzimas digestivas de los seres humanos y animales. Por lo tanto, cuando los microorganismos producen enzimas para dividir grandes moléculas externas en una forma asimilable, las enzimas son usualmente excreta en los medios de fermentación. De esta forma el caldo de fermentación forma el cultivo de ciertos microorganismos, por ejemplo, bacterias, levaduras u hongos filamentosos, se convierte en una fuente importante de proteasas, amilasas y celulasas (en menor medida), lipasas, etc Algunas enzimas intracelulares están siendo producidos industrialmente, e incluyen la glucosa oxidasa para la conservación de los alimentos, asparaginasa para la terapia del cáncer y la penicilina acilasa para la conversión de los antibióticos. Como la mayoría de las enzimas celulares son por naturaleza intracelular, más avances se pueden esperar en esta área. Las enzimas en forma soluble se han utilizado en la industria alimentaria para years.This muchos es especialmente cierto en las industrias de panadería y elaboración de la cerveza, siendo este último el mejor ejemplo de la biotecnología tradicional.

Enzima Bacteriana isomerasa de glucosa Bacteriana a-amilasa fúngica amiloglucosidasa Hongos a-amilasa Cuajos microbianos Bacteriana de la proteasa

Usos ----> Glucosa Azúcar invertido (es decir, la formación de fructosa) Almidón -----> glucosa la degradación parcial de almidón en la suplementación de la harina de amilasadeficientes para hacer pan -----> K-caseína paracaseína (en la leche cuajada para la fabricación de queso) La eliminación de las manchas a base de proteínas dinero (en los detergentes biológicos)

La papaína (de melón papaya)

zy

Varias aplicaciones de la proteasa como ablandamiento de la carne y dehazing de cerveza

Celulosa

Celulosa -----> glucosa

Hongos pectinasa

la degradación de pectina (en el procesamiento de frutas y vegetales)

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Aminoacylase (inmovilizado)


Resolución del DL-amino ácidos para producir Laminoácidos para la suplementación de alimentos

isomerasa de glucosa (inmovilizado)

La producción de azúcar invertido y jarabes de alta fructosa de la glucosa

La penicilina acilasa (inmovilizado)

La hidrólisis de la penicilina-G para producir ácido 6-aminopenicilánico para la producción de penicilinas nuevo

.

Utilización de enzimas en la industrias del cuero y la lana La industria del cuero consume una proporción significativa de la producción de enzimas en el mundo. proteasas alcalinas se utilizan para quitar el pelo de las pieles. Este proceso es mucho más seguro y más agradable que los métodos tradicionales de participación de sulfuro de sodio. Una cantidad relativamente grande de la enzima se requieren (0.1-1.0% (w / w)) y el proceso debe ser cuidadosamente controlada para evitar la reducción de la calidad del cuero. Después de depilado, esconde que se van a utilizar para la producción de ropa de cuero suave y mercancías entrecortado, un proceso, a menudo con las enzimas pancreáticas, que aumenta su flexibilidad y mejora la suavidad de su apariencia. Proteasas se han utilizado en el pasado, a 'shrinkproof de lana. Las fibras de lana están cubiertos en escamas superpuestas que apuntan hacia la punta de la fibra. Un métodos exitosos implica la hidrólisis parcial de los consejos escala con la papaína de la proteasa. Este método también dio la lana un brillo sedoso y se añade a su valor. keratinases microbiana se han convertido en biotecnológicamente importante, ya que apuntan a la hidrólisis de gran rigidez, fuertemente reticulado polipéptido estructural "queratina" recalcitrantes a la comúnmente conocida tripsina enzimas proteolíticas pepsina y papaína. Estas enzimas son producidas en gran medida la presencia de sustratos de queratina en forma de pelo, plumas, lana, uñas, cuernos, etc durante su degradación. El complejo mecanismo de keratinolysis implica la cooperación de los sistemas de sulphitolytic y proteolíticas. Keratinases son enzimas estables con un rango de temperaturas y pH y la actividad son en gran parte serina o metaloproteasas. homología de secuencia de keratinases indicar su relación con la subtilisina de la familia de las proteasas de serina (Gupta y Ramnani, 2006). Su aplicación también podría extenderse a las industrias de detergentes y artículos de cuero donde sirven como enzimas especiales. Además, también encuentran aplicación en la limpieza de la lana y seda, en la industria del cuero, mejor depilado potencial de estas enzimas ha llevado al desarrollo de la tecnología más verde depilación de pelo de ahorro y productos de cuidado personal. 10

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Aplicaciones médicas de las enzimas Desarrollo de aplicaciones médicas de las enzimas han sido en el arriendo tan amplias como las de usos industriales, lo que refleja la magnitud de las recompensas posibles: por ejemplo, las enzimas pancreáticas se han utilizado desde el siglo XIX para el tratamiento de trastornos digestivos. La variedad de enzimas y su aplicación terapéutica potencial es considerable.

Lista de las enzimas Terapéuticas Enzima Asparaginasa

Número CE 3.5.1.1

Collagense Glutaminasa

3.4.24.3 3.51.2 3.2.1.35

Hyaluronidase1 La lisozima Rhodanase2 Ribonucleasa b-lactamasas Streptokinase3 Tripsina Uricase4 Urokinase5

Reacción

Utilice

L de L-asparagina + H2O --->-aspartato + NH3 Hidrólisis del colágeno L-Glutamina + H2O ----> L-glutamato + NH3 Hialuronato de hidrólisis

Leucemia

3.2.1.17

la pared celular bacteriana hidrólisis 2.8.1.1 S2O32-NC + -------> SO32-+ SCN3.4.26.4 Hidrólisis del RNA 3.5.2.6 Penicilina ------> Penicilloate 3.4.22.10 Plasminógeno ------> plasmina 3.4.21.4 La proteína de hidrólisis 1.7.3.3 Urato + O2 ------> Alantoína 3.4.21.31 Plasminógeno ------> plasmina

Úlceras en la piel Leucemia Ataque al corazón Antibióticos Envenenamiento por cianuro Antivirales Alergia a la penicilina Los coágulos de sangre La inflamación Gota Los coágulos de sangre

Ingeniería de enzimas Un desarrollo más emocionante en los últimos años es la aplicación de técnicas de ingeniería genética de la enzima tecnología. Hay una serie de propiedades que pueden ser mejoradas o modificadas por ingeniería genética, incluyendo el rendimiento y la cinética de la enzima, la facilidad de procesamiento de aguas abajo y diversos aspectos de seguridad. Las enzimas de microorganismos peligrosos o no autorizados y de la planta de crecimiento lento o limitado o tejido 11

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animal puede ser clonado en los microorganismos de seguridad de alta producción. La cantidad de enzima producida por un microorganismo puede ser aumentado por el aumento del número de copias de genes que codifican para la misma. Este principio se ha utilizado para aumentar la actividad de la penicilina G-amidasa en Escherichia coli. El ADN celular de una cepa que produce es selectiva escindida por la endonucleasa de restricción Hind III. Este hidroliza el ADN en sitios relativamente raro que contenía los 5 '- AAGCTT-3' secuencia de bases para dar idéntico "escalonada" termina. El ADN total se escinde en unos 10.000 fragmentos, sólo uno de los cuales contiene la información genética necesaria. Estos fragmentos son clonados por separado en un vector cósmido y por lo tanto volvió a E. coli. Aquellas colonias que contienen el gen activa se identifican por su inhibición de un organismo de 6 aminopenicilánico sensibles a la acidez. Estas colonias se encuentran aisladas y la penicilina - G - amidasa gen transferido a pBR 322 plásmidos y recloned de nuevo en E. coli. Las células de ingeniería, con la ayuda de la amplificación del plásmido en alrededor de 50 copias por célula, producir la penicilina - G - amidasa constitutivamente y en cantidades considerablemente mayores que hace la cepa totalmente inducida por los padres. Tal aumento de los rendimientos son económicamente relevante no sólo por el aumento de la productividad volumétrica sino también por la reducción de los costes de transformación aguas abajo, la enzima cruda que resulta que es mucho más puro que. Otra muy prometedores son la ingeniería genética es la ingeniería de proteínas. Las nuevas estructuras de la enzima puede ser diseñado y producido con el fin de mejorar sobre las enzimas existentes o crear nuevas actividades. ingeniería de proteínas Mucho se ha dirigido a Subtilisina (de Bacillus amyloliquefaciens), la enzima principal en la preparación enzimática detergente, Alcalase. Esto ha tenido como objetivo la mejora de su actividad en los detergentes, estabilizando a temperaturas aún más alto, el pH y la fuerza oxidante. Fuente: http://www.studentsguide.in/animal-biotechnology/enzymetechnology/important-industrial-enzymes-and-sources.html

II. TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA La tecnología enzimática tiene como objetivo la superación de todos aquellos inconvenientes que parecen retrasar la aplicación de las enzimas en estos procesos a escala industrial, las enzimas son proteínas cuya función biológica es catalizar las reacciones que suceden en las células. Esta área tiene aplicaciones desde tiempos remotos como la fermentación, actualmente en diferentes industrias a diferentes niveles, ya que implica la utilización de sistemas enzimáticos diversos que optimizan el procesamiento en la obtención de detergente, aditivos alimenticios, productos químicos y farmacéuticos. La 12

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tecnología enzimática se presenta como alternativa biotecnológica basada en que las industrias desarrollen productos de calidad homogénea, aprovechen óptimamente sus materias primas, aceleres sus procesos de producción, minimicen desperdicios y disminuyan el deterioro del medio ambiente.

2.1 LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES Las enzimas son catalizadores de origen biológico que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria química. Son catalizadores muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperatura, presión, pH, etc. Son catalizadores muy específicos: pueden modificar un único substrato en una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos isómeros de una mezcla racémica de un compuesto quiral, Son catalizadores muy selectivos: pueden modificar un único enlace o un único grupo funcional en una moléculas que tenga varias posiciones modificables. A pesar de esas excelentes propiedades catalíticas, las enzimas han ido evolucionando a través de los siglos para cumplir mejor las necesidades fisiológicas de los seres vivos y no para ser utilizadas en sistemas químicos industriales. Así, las enzimas son catalizadores solubles, generalmente muy inestables y que sufren inhibiciones por substratos y productos. Además, las enzimas muchas veces no poseen todas las propiedades ideales (actividad, selectividad, etc) cuando queremos que catalicen procesos distintos de los naturales (por síntesis en lugar de hidrólisis), sobre substratos no naturales, en condiciones experimentales no convencionales (en disolventes orgánicos notóxicos).

2.2 TECNOLOGIA ENZIMATICA MODERNA A mediados de los años 50, la tecnología de las enzimas vivió su época de gran esplendor, creciendo a un ritmo desenfrenado. El progreso de la bioquímica ha derivado en una mejor comprensión de la gran variedad de enzimas presentes en las células vivas, así como un mejor conocimiento acerca de su modo de acción. Por ejemplo, su eficacia se puede aumentar extrayéndolas de los microorganismos y manteniéndolas aisladas. Las enzimas purificadas a través de este sistema no pierden sus propiedades; al contrario, estas preparaciones "sin células" devienen incluso más eficaces. "A comienzos de 1970 la tecnología enzimático comenzaba a entrar en periodo de desarrollo industrial, dirigido a la producción de aminoácidos y azúcares a partir de glucosa isomerizada. En aquel momento, los mercados Europeos y Americanos se encontraban dominados por la comercialización de las enzimas proteolíticas utilizadas en la industria de los detergentes, pero e xistian grandes expectativas sobre el mercado de enzimas aplicadas a la industria alimentaría, al cual se le auguraba un crecimiento importante (Dunnill, 1980; Lewis y Kristiansen, 1985). En 1981 el mercado mundial del azúcar se valor ó en 200 millones de dólares y en 1985 la oficina de Valores Tecnológicos de USA lo cifraban en 250 millones. La 13

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interpretaciónmas clara es el mercado para las enzimas utilizadas en la industria ha crecido espectacularmente a lo largo de los años 1970, y que este crecimiento ha sido paralelo al desarrollo de un gran número de aplicaciones a la industria alimentaría. Se puede esperar en el futuro que el mercado experimente un aumento cuando las enzimas comiencen a utilizarse en procesos de producción de la industria química."(1) En época más reciente se ha visto que puede utilizarse diversos tejidos vegetales y homogenados tisulares, obtenidos de distintas fuentes, como alternativas a las células microbianas y a las enzimas purificadas. Por consiguiente, la conclusión evidente es que existen una serie de preparaciones biocatalíticas para resolver una situación concreta, entre las cuales debe realizarse una elección. Por tanto, es conveniente considerar los criterios que debe manejarse en la elección del biocatalizador.

2.3 INDUSTRIAS TRADICONALES Y ENZIMAS ASOCIADAS

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Las aplicaciones industriales tradicionales se refieren a la producción de una transformación útil por alguna enzima, bien sea natural o añadida intencionalmente. Entre las que podemos citar: Fermentación.-"La fermentación alcohólica es un ejemplo conocido de los procedimientos en que se efectúan alteraciones enzimáticas, tanto cuando se agrega alguna enzima como cuando se añade algún microbio vivo (levadura). Primero se calienta el grano amiláceo para gelatinizar el almidón, y luego se añade malta ( que contienen enzimas diastásicas) para convertir el almidón en azúcar fermentable (maltosa). Si el producto que se desea obtener es alcohol, se agrega entonces levadura. El empleo de amilasa en forma de malta es indudablemente la mayor aplicación industrial que tiene las enzimas, pero no es del todo conocida la acción de estas amilasas. La elaboración de vinagre con alcoholes es un procesoenzímico producido por un microbio vivo (Acetobacter aceti). Como el alcohol es oxidado y convertido en ácido acético con oxígeno de la atmósfera. Aislada de las bacterias, la enzima cataliza igualmente la oxidación, pero es mucho más económico valerse de la célula viva intacta."(2)

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Curtición.-" Primero se quitan a las pieles el pelo y el exceso de carne y luego se ponen en remojo para que se hinchen y se vuelvan más o menos porosas y permeables a las sustancias curtientes. El primer remojo se ha efectuado siempre mediante la acción enzimática. Cuando se observó que la hinchazón era producida parcial o totalmente por enzimas protealítina impura. La cantidad de material enzimático que se usa en la industria de curtiduría representa probablemente la mayor aplicación industrial de las enzimas después de la industria de fermentación."(3)

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Fabricación de queso.- "La operación más importante en la fabricación de queso es la coagulación de la caseína de la leche, que luego se trata para convertirla en 14

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queso. Se puede coagular la caseína mediante la adición de ácido o de enzimas quesos se fabrica coagulada la caseína con rennina, esta probablemente tiene una acción proteolítica muy débil que continua en el queso. La rennina produce un coágulo elástico del que se exprime fácilmente el suero. No es la única porteínasa que se usa en la elaboración del queso, pues también se emplea mezclasde rennina con pepsina. Asimismo se ha usado la papaína, y en este caso al parecer se asegura la proteólisis durante el añejamiento del queso. En los países balcánicos se emplea jugo de higos ( que contiene gran proporción de enzimas proteolíticas ficina). Para preparar el coágulo. La diferentes enzimas coagulantes hacen variar notablemente la naturaleza del queso."(4) Elaboración de pan.- Aún se discute el papel que desempeñan en la fabricación del pan las enzimas que se hallan en la harina. La harina cruda contiene cantidad relativamente pequeña de muchas enzimas, incluso una proteína del tipo de la papaína, que según creen algunos reblandece la masa. Al igual que todas las enzimas del tipo de la papaína, la proteinasa de la harina es inactivada por la oxidación. La harina de trigo contiene también pequeñas -amilasa. La adición de la-amilasa -amilasa y gran proporción de cantidad de -amilasa a la harina, generalmente en forma de harina de trigo malteado,  ocasiona aumento de volumen de la hogaza. La amilasa agregada hidroliza parte del almidón y lo convierte en maltosa, con lo cual suministra mas azúcar para que fermente la levadura y origina la generación de mayor cantidad de dióxido de carbono. amilasa que ya existe en la harina coopera probablemente en el proceso La amilasa.mediante la desintegración de las dextrinas formadas por la "Proteinasas.- Son sustratos de las poteinasa todas las proteínas excepto las queratinaass. La hidrólisis es ordinariamente muy lenta. Las proteinasas desintegran también péptidos sencillos, pero de ordinario con mucha lentitud. Los productos superiores de degradación de las proteínas son descompuestos rápidamente. Los aminoácidos pueden ser liberados por acción proteolítica. Renina.- Se halla en el cuarto estómago de las terneras. Su acción proteolítica, si la tiene, es muy débil. Es un poderoso agente coagulador de la leche ( pH óptimo aproximadamente 5.4) Papaína.- Se halla en el látex del fruto verde de la papaya. Es típica de muchas enzimas vegetales como la ficina de la leche de higuerón, la asclepaína del vencetósigo y la bromelina del ananás. Una de sus características es su contenido de gruposSH, de que parece depender la actividad de la enzima. Por oxidación ligera se vuelve inactiva, pero es reactivada por agentes reductores, como la cisteína, HCN y otros, incluso los grupos SH en las proteínas que están siendo digeridas por las enzimas parcialmente activas. La papaína es relativamente resistentee con el calor, y empleada a temperaturas de 50 a 60°C, es muy rápida la proteólisis. La enzima coagula fácilmente la leche. Los microorganismos vivos son atacados rara vez por las proteinasas, pero la papaína ataca ciertos parásitos intestinales (áscaris) vivos. Descompone la hipurilamida con desprendimiento de amoniaco. 15

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Carbohidrasas.- Descomponen residuos de azúcares de carbohidratos superiores. -Amilasa.- Se hallan en las glándulas salivales,  el páncreas, hongos, bacterias y la malta, que las contienen en abundancia. Descomponen los almidones y el glucógeno en dextrinas y disocian lentamente las dextrinas en maltosa y cantidad mínima de glucosa. Destruyen la estructuraen cadenas ramificada del almidón (amilo pectina) y el glucógeno. Con el tempo -amilasa de malta pueden efectuar la destrucción casi total del almidón. La requiere calcio y puede ser una -amilasa animal necesita cloruro.proteína cálcica. La -amilasa.- Se halla en las  plantas superiores, los granos la producen en abundancia. La enzima de los granos descomponen totalmente la amilasa y la convierte directamente en maltosa, también descompone la amilo pectina ( la porción de cadena ramificada del almidón) y el glucógeno, pero su acción se detiene donde se ramifica la cadena de hidratos de carbono. Cuando se rompe las cadenas ramificadas de hidratos de -amilasa ataca los -amilasa), la carbono entre las ramas ( en presencia de fragmentos de cadena recta así formados. De esta manera, las dos enzimas juntas hidrolizan más rápidamente el almidón que cualquiera de ellas por separado."(5)

2.4 APLICACIONES INDUSTRIALES En relación con las enzimas, la tecnología moderna contribuye al ahorro. Por ejemplo, permite la utilización del excedente de suero derivado de la fabricación del queso. La lactosa transforma el azúcar del suero en una mezcla de glucosa y galactosa con un sabor más dulce. Así, se refina el producto y se concentra en una especie de jarabe cuyo sabor recuerda el de la miel, con lo que las aplicaciones en el sector de la confitería industrial se hacen innumerables. Se usan también muchos otros tratamientos de las enzimas en la producción de edulcorantes modernos. Por ejemplo, EE.UU. se puede constatar que el jarabe del almidón de maíztiene un alto contenido en fructosa, razón por la cual ha llegado a eclipsado a la sacarosa. Las enzimas presentan muchísimas aplicaciones. Con los procedimientos modernos de fabricación de alimentos, benefician tanto a los sectores industriales como a los consumidores. Sus características específicas permiten a los industriales ejercer un control de calidad más estricto. Con un menor consumo de energía y unas condiciones de tratamiento más ligeras, su eficacia favorece el entorno. Pueden utilizarse para tratar los desechos biológicos resultantes de la fabricación de alimentos, puesto que las propias enzimas son biodegradables. Mediante una rápida absorción natural, las enzimas son el típico ejemplo de "tecnología verde". 2.4.1 Alimentos La utilización empírica de preparaciones enzimáticas en la elaboración de alimentos es muy antigua. El cuajo, por ejemplo, se utiliza en la elaboración de 16

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quesos desde la prehistoria, mientras que las civilizaciones precolombinas ya utilizaban el zumo de la papaya. Sin embargo, hasta 1897 no quedó totalmente demostrado que los efectos asociados a ciertos materiales biológicos, como el cuajo o las levaduras pudieran individualizarse en una estructura química definida, llamada enzima, aislable en principio del organismo vivo global. Desde hace unas décadas se dispone de enzimas relativamente puros y con una gran variedad de actividades susceptibles de utilizarse en la elaboración de alimentos. Los progresos que están realizando actualmente la ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar un desarrollo cada vez mayor del uso de los enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales con la actividad deseada aprecios razonables. Los enzimas son piezas esenciales en el funcionamiento de todos los organismos vivos, actuando como catalizadores de las reacciones de síntesis y degradación que tienen lugar en ellos. La utilización de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas, además de las de índole económica o tecnológica. La gran especificidad de acción que tienen los enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Asimismo se puede trabajar en condiciones moderadas, especialmente de temperatura, lo que evita alteraciones de los componentes más lábiles del alimento. Desde el punto de vista de la salud, puede considerarse que las acciones enzimáticas son, en último extremo, naturales. Además los enzimas pueden inactivarse fácilmente cuando se considere que ya han realizado su misión, quedando entonces asimilados al resto de las proteínas presentes en el alimento. Para garantizar la seguridadde su uso deben tenerse en cuenta no obstante algunas consideraciones: en aquellos enzimas que sean producidos por microorganismos, estos no deben ser patógenos ni sintetizar a la vez toxinas, antibióticos, etc. Los microorganismos ideales son aquellos que tienen ya una larga tradición de uso en los alimentos (levaduras de la industria cervecera, fermentos lácticos, etc.). Además, tanto los materiales de partida como el procesado y conservación del producto final deben ser acordes con las prácticas habituales de la industria alimentaría por lo que respecta a pureza, ausencia de contaminantes, higiene, etc.

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Los enzimas utilizados dependen de la industria y del tipo de acción que se desee obtener, siendo éste un campo en franca expansión. A continuación se mencionan solamente algunos ejemplos. Industrias lácteas "Como se ha indicado, el cuajo del estómago de los rumiantes es un producto clásico en la elaboración de quesos, y su empleo está ya citado en la Iliada y en la Odisea. Sin embargo, el cuajo se obtuvo como preparación enzimática relativamente pura solo en 1879. Está formado por la mezcla de dos enzimas digestivos (quimosina y pepsina) y se obtiene del cuajar de las terneras jóvenes. 17

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Estos enzimas rompen la caseína de la leche y producen su coagulación. Desde los años sesenta se utilizan también otros enzimas con una acción semejante obtenidos a partir de microorganismos o de vegetales.

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Actualmente empieza a ser importante también la lactasa, un enzima que rompe la lactosa, que es el azúcar de la leche. Muchas personas no pueden digerir este azúcar, por lo que la leche les causa trastornos intestinales. Ya se comercializa leche a la que se le ha añadido el enzima para eliminar la lactosa. "(6) Panadería En panadería se utiliza la lipoxidasa, simultáneamente como blanqueante de la harina y para mejorar su comportamiento en el amasado. La forma en la que se añade es usualmente como harina de soja o de otras leguminosas, que la contienen en abundancia. Para facilitar la acción de la levadura, se añade amilasa, normalmente en forma de harina de malta, aunque en algunos países se utilizan enzimas procedentes de mohos ya que la adición de malta altera algo el color del pan. La utilización de agentes químicos para el blanqueado de la harina está prohibida en España. A veces se utilizan también proteasas para romper la estructura del gluten y mejorar la plasticidad de la masa. Este tratamiento es importante en la fabricación de bizcochos. Cervecería A principios de este siglo (1911) se patentó la utilización de la papaína para fragmentar las proteínas presentes en la cerveza y evitar que ésta se enturbie durante el almacenamiento o la refrigeración, y este método todavía se sigue utilizando. Este enzima se obtiene de la papaya. Un enzima semejante, la bromelaína, se obtiene de la piña tropical. Un proceso fundamental de la fabricación de la cerveza, la rotura del almidón para formar azúcares sencillos que luego serán fermentados por las levaduras, lo realizan las amilasas presentes en la malta, que pueden añadirse procedentes de fuentes externas, aunque lo usual es lo contrario, que la actividad propia de la malta permita transformar aun más almidón del que contiene. Cuando esto es así, las industrias cerveceras añaden almidón de patata o de arroz para aprovechar al máximo la actividad enzimática. - Fabricación de zumos A veces la pulpa de las frutas hace que los zumos sean turbios y demasiado viscosos, produciéndose también ocasionalmente problemasen la extracción y en su eventual concentración. Esto es debido a la presencia de pectinas (Véase página...), que pueden destruirse por la acción de enzimas presentes en el propio zumo o bien por enzimas añadidas obtenidas de fuentes externas. Esta destrucción requiere la actuación de varios enzimas distintos, uno de los cuales produce metanol, que es tóxico, aunque la cantidad producida no llegue a ser preocupante para la salud. Fabricación de glucosa y fructosa a partir del maíz Una industria en franca expansión es la obtención de jarabes de glucosa o fructosa a partir de almidón de maíz. Estos jarabes se utilizan en la elaboración de 18

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bebidas refrescantes, conservas de frutas, repostería, etc. en lugar del azúcar de caña o de remolacha. La forma antigua de obtener estos jarabes, por hidrólisis del almidón con un ácido, ha sido prácticamente desplazada en los últimos 15 años por la hidrólisis enizmática, que permite obtener un jarabe de glucosa de mucha mayor calidad y a un costo muy competitivo. De hecho, la CE ha limitado severamente la producción de estos jarabes para evitar el hundimiento de la industria azucarera clásica. Los enzimas utilizados son las alfa-amilasas y las amiloglucosidasas. La glucosa formada puede transformarse luego en fructosa, otro azúcar más dulce, utilizando el enzima glucosa-someraza, usualmente inmovilizado en un soporte sólido. Refinado de azúcar "La extracción de la sacarosa, a partir de la melaza de la remolacha azucarera puede complicarse por la presencia de rafinosa, un trisacárido que previene la cristalización. Para incrementar la recuperación del azúcar y mejorar el proceso, la rafinosa puede degradarse enzimáticamente. El resultado de esta degradación es doble; por un lado favorece la cristalización y, además, produce sacarosa como uno de los productos de la -galactosida es producida por el hongo Morteirellahidrólisis. La enzima vinaceae raffinosutilizer y puede ser empleada convenientemente para inmovilizar los residuos micelares que producen este organismo. La reacción hidrolítica se efectúa a pH superior a 5 para evitar la inversión de la sacarosa catalizada por el medio ácido. Algunas veces, se requiere un tratamiento similar en el proceso de obtención a partir de la caña de azúcar, donde el almidón es hidrolizado antes de la cristalización mediante el uso de amilasa."(7) Otras aplicaciones Los enzimas se utilizan en la industria alimentaría de muchas otras formas, en aplicaciones menos importantes que las citadas anteriormente. Por ejemplo, en la fabricación de productos derivados de huevos, las trazas de glucosa presentes, que podrían oscurecerlos, se eliminan con la acción combinada de dos enzimas, la glucosa-oxidasa y la catalasa. Por otra parte, la papaína y bromelaína, enzimas que rompen las proteínas, se pueden utilizar, fundamentalmente durante el cocinado doméstico, para ablandar la carne. Algunas enzimas, como la lactoperoxidasa, podrían utilizarse en la conservación de productos lácteos. 2.4.2 Detergentes Entre otros aditivos importantes que se encuentran en los detergentes están las enzimas, los cuales por lo general son sustancias de naturaleza proteínica, que se encargan de catalizar las reacciones en los seres vivos. La tecnología de enzimas en los detergentes se desarrolló a partir de la década de los años 60, como una herramienta más de éstos para atacar ciertos sustratos (generalmente protéicos) específicos. Las más comunes son las llamadas proteasas, las cuales degradan restos de proteínas; y las lipasas que pueden atacar restos de sustratos lípidosque son los que comúnmente se adhieren a la ropa y a ellas se les adhieren el resto de la suciedad como polvo, restos de otros compuestos orgánicos etcétera. Los detergentes que contienen enzimas se les llama detergentes biológicos. 19

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Efectos de enzimas activas Como se mencionó anteriormente, algunos detergentes contienen enzimas, las cuales atacan sustratos orgánicos específicos. El problema se presenta al usar exceso de estos detergentes, con lo cual se desechan enzimas activas al drenaje, las cuales al llegar a los cuerpos de agua provocarán daños en los seres vivos presentes en éstos, por acción directa sobre ellos o sobre los nutrientes que componen su dieta alimenticia. Otros efectos. Entre otros efectos secundarios producidos por los detergentes es que afectan procesos de tratamiento de las aguas residuales, por ejemplo: cambios en la demandabioquímica de oxígeno y en los sólidos suspendidos, efectos corrosivos en algunas partes mecánicas de las plantas, interferencias en el proceso de cloración y en la determinación de oxígeno disuelto y algunos aditivos en los detergentes pueden intervenir en la formación de flóculos (agrupaciones de partículas suspendidas).

2.4.3 Energía Otra actividad que llama a las aplicaciones biotecnológicas es la producción de energía, siendo la ventaja de las fuentes orgánicas con respecto a los combustibles fósiles el que las primeras sean renovables. Cada año crecen unas 200 mil millones de toneladas de biomasa (madera, cereales, etc), de las cuales los humanos usamos sólo un 3%. Por lo tanto, este rubro ofrece un enorme potencial que puede ser aprovechado. Un ejemplo clásico de biocombustible es el alcohol obtenido por fermentación de material rico en azúcares y almidón, o de residuos orgánicos varios, incluyendo los forestales. El principal obstáculo para la viabilidad de esta propuesta es el costo, puesto que el petróleo sigue siendo más barato. Sin embargo, los avances tecnológicos están permitiendo acortar la brecha. Hay también diversos sectores de la industria en los que la adaptación o sustitución de procesos químicos o físico-químicos por otros de base biológica puede contribuir al desarrollo sustentable. Beneficios concretos a escala industrial ya se observan con la introducción de enzimas en la producción de celulosa, de textiles y del cuero, entre otros. "

2.4.4 Tratamiento de desechos "Pero es el tratamiento de desechos donde la biotecnología puede tener un mayor impacto a nivel mundial. Los Estados Unidosgastan US$ 40 mil millones al año para combatir la polución que generan los 600 millones de toneladas de desechos industriales. Bacterias, microalgas, levaduras, hongos y plantas han mostrado una notable eficiencia para metabolizar residuos orgánicos, xenobióticos y metales pesados (biorremediación y fitorremediación), reduciendo hasta 20 veces el costo 20

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involucrado en la incineración de dichos residuos. Por otra parte, se han hecho grandes avances en el tratamiento de derrames de petróleo con microorganismos. En fin, hay muchas otras áreas suceptibles de ser abordadas exitosamente mediante el empleo de diversas biotecnologías. Sin embargo, a pesar de los promisorios resultados obtenidos hasta el momento, persisten aún varias limitaciones técnicasy económicas que requieren ser resueltas. Por ello, la biotecnología no debe ser vista como una panacea y en cada caso habrá que ponderar sus ventajas con respecto a las tecnologías tradicionales. Al considerar las aplicaciones enzimáticas en el tratamiento de los residuos, se debe hacer hincapié entre las situaciones donde el residuo de un proceso es el material crudo y los siguientes, por ejemplo, conversión de almidones, y procesos que ayudan a reducir los costos asociados del tratamiento. Existen un amplio número de industrias de procesamiento de alimentos que producen residuos que necesariamente deben ser posteriormente tratados.La aplicaciones de grupos de enzimas depende de la necesidaddd de hidrolizar polímeros complejos para incrementar su posterior degradación microbiolígica. Entre los diversos ejemplos se puede incluir el empleo de las lipasas asociadas con cultivos bacterianos para eliminar los depósitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberías que transportan el efluente. Otra enzima degradante de polímeros utilizados de forma similar son las celulosas, proteinasas y amilasas. Una aplicación particular que puede describirse como tratamiento de residuos, es el emplio de proteinasas en las preparaciones comerciales de detergentes, denominadas como polvo de lavado biológico. Además de estas hidrólisis de materiales poliméricos, existen también aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos altamente tóxicos que podrían inhibir procesos de tratamiento basado en el empleo microbiógico. Un ejemplo específico es el uso de la peroxidasa de la cola de caballo para iniciar la degradación de fenoles y aminas aromáticas que se presentan en muchas industrias con aguas residuales. "(8) En términos más amplio es posible anticipar que los procesos basados en el empleo de organismos construidos genéticamente para degradar los compuestos indicados anteriormente, podría representa un proceso mucho más económico.

2.4.5 Productos médicos y farmacéuticos Aunque las posibilidades de utilización de las enzimas en la medicinay campos relacionados sea potencialmente inmersa, en la actualidad el número concreto de aplicaciones es relativamente pequeño. No obstante, los resultados obtenidos con este pequeño número de ideas afortunadamente son realmente excitantes y demuestran claramente la capacidad potencial existente en las técnicas empleadas. Puesto que las aplicaciones médicas y farmacéuticas de las enzimas abarcan un amplio espectro de materias, es conveniente dividirlas en tres áreas importantes de interés: terapia enzimática, uso analítico y productos de compuestos farmaceúticos. Cada una de estas áreas, auque cubre un gran número de aplicaciones, presenta una serie de principios predominantes que son esencialmente para que la utilización de las enzimas se realice con éxito. 21

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A diferencia de otros usos industriales para las enzimas, las aplicaciones médicas y farmacéuticas de las mismas requieren generalmente pequeñas cantidades de enzimas muy purificadas. En parte, esto refleja el hecho de que para una enzima sea efectiva sólo debe modificarse heléelos compuestos de interés contenido en un fluido o tejidos fisiológicos complejo. Esto contrasta con muchos procesos industriales en los que el medio de cultivo está relativamente bien definido y por, consiguiente, puede utilizarse un extracto enzimático sin purificar. Además, si el destino de una enzima o de un producto obtenido por métodos enzimáticos es su administración a un paciente, resuelta evidente que el preparado debe contener las menores cantidades posibles de material extraño para evitar probables efectos secundarios. Producción de aminoácidos enzimáticamente La producción de aminoácidos mediante tecnología con enzimas está adaptada convenientemente. Aunque se pueden sintetizar empleando un proceso químico, se debe señalar que en este caso se obtiene una mezcla de D y L isómeros. Puesto que solamente el L-isómero es biológicamente activo, la mezcla debe ser separada en sus dos componentes. Este proceso puede llevarse a cabo mediante el empleo de la enzima aminoacilasa. Una vez sintetizado, la mezcla del DL aminoácidos se acetila. En la producción de otros aminoácidos se han incluido también una etapa mediada por enzimas, incluyendo a la D-feniglicina, utilizada en la síntesis de penicilina semisintética, y en el caso del L-triptófano, un aminoácido esencial que puede sintetizarse a partir del indol. Estas son dos áreas importantes en el desarrollo de esta tecnología. En términos de aplicación a gran escala, la producción de aminoácidos esenciales como suplementos dietéticos presenta una importancia particular. Si unas proteína celular sencilla queda establecida en los mercados de alimentaciónanimal y humana, se puede esperar que la demanda para aminoácidos esenciales incrementaría, ya que muchas proteínas microbianas son deficitarias en algunos de estos residuos cruciales. Tratamientos terapéuticos con enzimas.-" El fundamento de esta forma de terapia es simplemente la administración de una enzima concreta a un paciente, esperando con optimismo que produzca una progresiva mejoría en el mismo. El problema principal relacionado con este método es que las respuestas defensivas del organismo inactive o eliminen los compuestos extraños incorporados. En consecuencia cualquier tratamiento que utilice la administración de una enzima, bien por vía sanguínea o por cualquier otra, debe tener en cuenta este posible inconveniente."(9) Organos artificiale.- "Para sustituir algunas funcionesdel riñón y el hígado se han desarrollado órganos artificiales que contienen enzimas. Una lesión renal crónica se trata con hemodiálisis periódica, a menos que sea posible el transplante del órgano. El hígado es un órgano multifuncional y sería imposible conseguir un sustituto artificial con la tecnología disponible actualmente. Sin embargo, sí puede reproducirse una función importante del hígado: la desintoxicación. A partir de células hepáticas se pueden obtener varias enzimas microsomales capaces de llevar a cabo la desintoxicación de una gran variedad de compuestos."(10)

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Aplicaciones Analíticas.- "En la medicina moderna, el análisisde las distintas muestras fisiológicas tiene un papel clave y, dentro del mismo el uso de las enzimas(tanto en forma libre como inmovilizadas) constituyen un aspecto muy destacado. Los tipos de aplicación de las encimas al análisis se pueden dividir en dos granes grupos. El primero de ellos recije aquellos métodos que miden directamente un compuesto, mientras que el segundo lo hace con aquellos que utilizan una enzima para amplificar otra respuesta (por ejemplo inmunoencarios con enzimas acopladas)."(11) Antibióticos semi-sintéticos.- Las penicilinas semisintéticas son los principales productos farmacéuticos obtenidos por tecnología enzimático. El método de fermentación tradicional permite producir la bencil-penisilína (penisilina g) como la fenoximetil- penisilina (penisilina b) y en el pasado estos dos antibióticos con gran éxito. Sin embargo, estos compuestos presentan limitaciones en su eficacia contra ciertas bacterias patógenas Esteroides.-" Los esteroides se utilizan en un gran número de preparados farmacéuticos (por ejemplo la píldora contraceptiva y los antinflamatorios), por lo que los procesos empleados en la producción de estas sustancias presentan una considerable importancia económica."(12)

2.5. FUENTES DE ENZIMAS

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Las fuentes de enzimas pueden ser de tipo vegetal, animal y microbiana. Las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las porteasas, carbohidrasas ( las cuales descomponen residuos de azúcares de carbohidratos superiores, aamilasas y b-amilasa Entre las enzimas de tipo animal están las esterasa ( Lipasa se produce en la mucosa gástrica, el páncreas y las semillas de ricino, fosfotasas: Se obtiene de tejidos animales óseo, muscular, tripsina y quimotripsina se produce en el páncreas y , pectasas ) Las enzimas del tipo microbiano provienen de. Bacterias, hongos.

2.6. MECANISMO DE BIOSISTESIS DE ENZIMAS La degradación de compuestos requiere enzimas. Los agentes que afectan a la presencia o actividad de las enzimas afectan también al crecimiento de los organismos. Las enzimas constitutivas se producen estén presentes o no los substratos (ej. glicolisis). Las enzimas inducibles sólo se producen cuando los substratos están presentes. El control de enzimas es por medio de actividad o síntesis. Generalmente, el control de actividad de las enzimas es por encendido o apagado de las enzimas y está asociado con enzimas alostéricas durante la inhibición de feedback:V. Cuando los productos en una vía aumentan, ellos mismos producen feedback a la primera enzima de la vía y cierran la síntesis de los productos finales e intermedios. 23

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Vías ramificadas Feedback acumulativo: ni F ni H pueden reducir separadamente por completo la actividad de e1, posiblemente cada uno puede lograr una reducción parcial pero juntos pueden pararla totalmente.

Feedback secuencial: F y H provocan feedback en e4 y e6 respectivameante provocando la acumulación de D. D entonces produce feedback sobre e1.

Feedback multivalente: ni F ni H por separadoproducen efecto alguno en e1 pero juntos tienen actividad inhibitoria.

Pero también puede darse un control de la síntesis de enzimas a nivel genético (operón). Inducción El gen regulador sintetiza un represor activo. En ausencia de substrato (inductor), el represor activo se une al operador e impide a la ARN polimerasa unirse al promotor para la transcripción del mRNA. Si el substrato está presente se une al represor activo que se inactiva y permite la transcripción del mRNA. Represión del producto final 24

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El gen regulador sintetiza un represor inactivo. Si hay poca cantidad de producto final el represor inactivo no se une al operador y permite la transcripción del mRNA. Si el producto final es abundante se une al represor inactivo que se activa y ahora el represor activo se une al operador y previene la transcripción del mRNA.

2.7 PRODUCCION DE ENZIMAS A GRAN ESCALA "La producción de encimas para empleo industrial y como alimento se ha desarrollado en forma independiente en diversas industrias. La fuente original de enzimas de cereales, principalmente de las distintas clases de malta, es la industria de la malta de cebada. Las proteasas de las plantas, como la papaina, bromalaeina y ficina, que se emplean en los estados unidos son de omportanción, y generalmente los importadores tienen poco control sobre las condiciones del proceso de producción."(15) La industria empacadora de carnes es la fuente principal de las enzimas derivada del páncreas, estómago e hígado de los animales. Finalmente, las enzimas de fuentes microbiológicas: Bacterias, Hongos y levaduras, se producen en la industria de la fermentación. Los procesos microbianos en los que el hombre controla las condiciones del desarrollo microbiológico, se llaman fermentaciones."(15) 2.7.1 Medios de fermentación Las fermentaciones con células libres constituyen todavía el método mas utilizado. Su manipulación es relativamente fácil, y, en algunos casos no requiere un medio de cultivo estéril. Ya que las células se producen con la misma rapidez con la que son eliminadas del reactor, existe una síntesis constante de nuevo catalizado. De esta forma, y suministrando al reactor condiciones apropiadas para el crecimiento, la fermentación puede transcurrir en un estado estacionario en el que la eficiencia catalítica no cambia. Además, a partir de la degradación catabólica de los nutrientes, la célula que crece activamente es capaz de suministrar la energía necesaria para la síntesis. Sin embargo, el mayor número de reacciones requeridas para el metabolismo significa también aumento de probabilidades para la formación de productos secundarios no deseados. Este hecho, junto con la producción de un exceso de biomasa, limita el rendimiento del medio del cultivo y, por consiguiente la economía del proceso. La células inmovilizadas pueden considerarse como un estado intermedio entre la fermentación, la células libres y las enzimas inmovilizadas. En algunos casos las células se destruyen antes de inmovilizarlas y se utiliza un solo componente enzimático, por lo que, en ellos, la distinción entre células y encimas inmovilizadas constituye una cuestión puramente semántica. 2.8 RECUPERACION DE LAS ENZIMAS La presencia de sustancias pépticas en las frutas origina importantes problemas en su procesado industrial para la obtención de zumo, debido a que retienen parte del zumo durante el prensado de la fruta, aumentando considerablemente su 25

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viscosidad y disminuyendo así el rendimiento de la extracción. El desarrollo de la tecnología enzimática ha permitido la preparación de enzimas pectinolíticas inmovilizadas que pueden utilizarse repetidamente en operaciones simultáneas o de manera continuada, capaces de degradar estas sustancias pécticas. Con estas perspectivas, el objetivo principal en el trabajo fue la preparación de enzimas pectinolíticas estables, mediante técnicas de inmovilización por adsorción en geles de alginato de calcio, estudiando las características de los biocatalizadores inmovilizados en comparación con sus contrapartidas solubles, con objeto de mejorar y facilitar el uso de estas enzimas en los procesos de clarificación de zumos de plátano y de kiwi, estudiando además la posibilidad de reutilización de las enzimas. En relación a los principales resultados obtenidos al determinar las actividades enzimáticas de poliglacturonasa (PG), pectina liasa (PL) y endopectinasa (endoP), obtenidas de preparados comerciales (Rapidase C80, Biopectinase CCM, Pectinex 3 XL y Grindamyl 3PA, se puede concluir que :(i) cuando se inmovilizaban las pectinasas sobre geles de alginato, la PL y endoP de Rapidase C80 presentaban los niveles más elevados de actividad en los inmovilizados (7,2 % y 12,5% de inmovilización, respectivamente), mientras que el mayor nivel de inmovilización de PG (25%) se obtuvo con Pextinex 3XL . (ii) La aplicación de las enzimas a un biorreactor, que contenía una solución de pectina, confirmaba su idoneidad para reducir la viscosidad de la solución. Como tendencia general la eficacia de las enzimas inmovilizadas seguía el siguiente orden descendente: Rapidase>Biopectinase>Grindamyl>Pectinex. (iii) La regeneración de las perlas de alginato con Cl2 Ca y su reactivación con una nueva solución de enzima, permitía reciclar el mismo inmovilizado cinco veces consecutivas. Al aumentar la concentración enzimática, se reducían los tiempos de tratamiento y, con ello, la inestabilidad de las enzimas inmovilizadas, lo que aumentaba la operatividad del reciclado hasta ocho reutilizaciones. (iv) La posibilidad de reutilización de las enzimas inmovilizadas en los zumos de plátano y kiwi se veía limitada a tres, como consecuencia directa de la desestabilización del soporte de inmovilización por efecto de los componentes del zumo, lo cual podía reducirse o anularse modificando el soporte de inmovilización aplicado. (v) Por último, con vistas a la aplicación biotecnológica de ese estudio, podría concluirse que la inmovilización de enzimas pectinolíticas sobre geles de alginato de calcio optimiza la estabilidad operacional de las enzimas y permite su reutilización. Reduciendo los costes finales del proceso sin pérdida apreciable de la calidad y cualidades organolépticas de los zumos tratados. La presencia de sustancias pécticas en las frutas origina importantes problemas en su procesado industrial para la obtención de zumo, debido a que retienen parte del zumo durante el prensado de la fruta, aumentando considerablemente su viscosidad y disminuyendo así el rendimiento de la extracción. El desarrollo de la tecnología enzimática ha permitido la preparación de enzimas pectinolíticas inmovilizadas que pueden utilizarse repetidamente en operaciones simultáneas o de manera continuada, capaces de degradar estas sustancias pécticas. Con estas perspectivas, el objetivo principal en este trabajo fue la preparación de enzimas 26

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pectinolíticas estables, mediante técnicas de inmovilización por adsorción en geles de alginato de calcio, estudiando las características de los biocatalizadores inmovilizados en comparación con sus contrapartidas solubles, con objeto de mejorar y facilitar el uso de estas enzimas en los procesos de clarificación de zumos de plátano y de kiwi, estudiando además la posibilidad de reutilización de las enzimas. En relación a los principales resultados obtenidos al determinar las actividades enzimáticas de poliglacturonasa (PG), pectina liasa (PL) y endopectinasa (endoP), obtenidas de preparados comerciales (Rapidase C80, Biopectinase CCM, Pectinex 3 XL y Grindamyl 3PA, se puede concluir que :(i) cuando se inmovilizaban las pectinasas sobre geles de alginato, la PL y endoP de Rapidase C80 presentaban los niveles más elevados de actividad en los inmovilizados (7,2 % y 12,5% de inmovilización, respectivamente), mientras que el mayor nivel de inmovilización de PG (25%) se obtuvo con Pextinex 3XL . (ii) La aplicación de las enzimas a un biorreactor, que contenía una solución de pectina,confirmaba su idoneidad para reducir la viscosidad de la solución. Como tendencia general la eficacia de las enzimasinmovilizadas seguía el siguiente orden descendente: Rapidase>Biopectinase>Grindamyl>Pectinex. (iii) La regeneración de las perlas de alginato con Cl2 Ca y su reactivación con una nueva solución de enzima, permitía reciclar el mismo inmovilizado cinco veces consecutivas. Al aumentar la concentración enzimática, se reducían los tiempos de tratamiento y, con ello, la inestabilidad de las enzimas inmovilizadas, lo que aumentaba la operatividad del reciclado hasta ocho reutilizaciones. (iv) La posibilidad de reutilización de las enzimas inmovilizadas en los zumos de plátano y kiwi se veía limitada a tres, como consecuencia directa de la desestabilización del soporte de inmovilización por efecto de los componentes del zumo, lo cual podía reducirse o anularse modificando el soporte de inmovilización aplicado. (v) Por último, con vistas a la aplicación biotecnológica de ese estudio, podría concluirse que la inmovilización de enzimas pectinolíticas sobre geles de alginato de calcio optimiza la estabilidad operacional de las enzimas y permite su reutilización. Reduciendo los costes finales del proceso sin pérdida apreciable de la calidad y cualidades organolépticas de los zumos tratados.

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III. Anexos

Los quesos son producidos gracias a la actividad enzimática

Al igual que muchos productos en la industria la producción de vino se favorece con la tecnología enzimática

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La Naturaleza de Las Enzimas

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