I.
JUSTIFICACIÓN La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a - C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos. Para medir la actividad enzimática de la a-amilasa, se utilizará un test colorimétrico que detecta el almidón. Para ello se contará con una solución de iodo/ioduro de potasio (I2/IK), ya que el almidón en presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: el iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la a-amilasa a -amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de I2/IK ya no dará una coloración azul. Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparición de sustrato (evidenciada por el test colorimétrico) para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos cómo afectan las distintas condiciones en que actúa la enzima (pH, temperatura, concentración de NaCl), así como los efectos que pueden causar diferentes pretratamientos (proteinasa, calor).1
II.
OBJETIVOS Terminando la práctica estaré en condiciones de:
Determinar la actividad enzimática.
III.
MATERIAL Y REACTIVOS Reactivos
Solución de amilasa salival al
20%
10%
IV.
Materiales
Sol de cloruro de sodio al 0,15
Ácido tricloroacètico
Tubos de ensayo
M
Buffer fosfato pH = 6,6
Solución de almidón al 10%
Agua destilada
Frasco lavador
Solución NaOH 1N
Mechero de alcohol
Solución CuSO 4 20%
Vasos de precipitación
Solución HCl 3N
Solución HCl 0,05 N
Solución yodada
Pipetas Gradillas
Pinzas Trípode y rejilla metálica
PROCEDIMIENTO COMPONENTES
I
II
III
IV
V
VI
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
NaOH 1N
-----
2,4mL
-----
-----
-----
-----
HCl 3N
-----
-----
2,4mL
-----
-----
-----
Ácido
-----
-----
-----
2,4mL
-----
-----
-----
-----
2,4mL
-----
2,4mL
-----
-----
2,4mL
Solución de amilasa al 10%
tricloroacètico CuSO4 20% Buffer fosfato pH 6,6
-----
-----
Dejar los tubos I al V en reposo reposo durante 10 minutos a la temperatura del ambiente y el tubo VI en baño de agua hirviendo por el mismo tiempo.
Después de este periodo de tiempo se observó todos los cambios
producidos (Anexo visual 1)
Tubo I Luego de verter 1ml de amilasa al 10% al tubo (con ayuda de la pipeta) se agregó el buffer fosfato pH 6.6, puesto que cada enzima actúa a un pH determinado (normalmente en 6-8, superando este intervalo tiende a desnaturalizarse e inactivarse). Al utilizar esta sustancia amortiguadora (buffer fosfato) nos permitirá, que la enzima no se desnaturaliza.
Tubo II Una vez vertida la amilasa al 10%, posteriormente se agregó NaOH 1N (con ayuda de la pipeta), este por ser una base fuerte tendera a producir la desnaturalización de la enzima (amilasa) por lo cual no actuara. No se observara cambio de color de la solución.
Tubo III Luego de verter la amilasa, pasamos a agregar HCl 3N (con ayuda de la pipeta), al ser este un ácido fuerte va alterar la conformación de la amilasa y esta tendera a desnaturalizarse; sin embargo no presenciamos cambio de color de solución.
Tubo IV Al haber agregado amilasa, procedimos a verter 2.4 ml de Ac. Tricloroacético (con la pipeta), el cual siendo un ácido débil, procederá a desnaturalizar a la enzima (amilasa).
Tubo V A este tubo con amilasa se le agrega sulfato de cobre al 20% (utilizando la pipeta), el cual por ser una sal pesada generara un cambio en la enzima.
Tubo VI Luego de agregar la amilasa al tubo (con la pipeta) se agregó el buffer fosfato pH 6.6, se lo coloco en agua hirviendo.
Durante este lapso constituir el siguiente sistema: Sistema B COMPPONENTES/
I
II
III
IV
V
VI
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
5mL
5mL
5mL
5mL
5mL
5mL
TUBOS Solución de almidón 1,0% Buffer fosfato pH 6,6 NaCl 0,15 M Agua destilada
1,4mL 2mL
1,4mL 1,4mL 1,4mL 1,4mL 1,4mL 1,4mL 1,4mL 2mL
2mL
2mL
2mL
2mL
En este sistema se utilizaron 6 tubos más, a los cuales se les agrego los reactivos indicados en el recuadro. (Anexo recuadro. (Anexo visual 2)
Tubo I Se le agrego 1mL de solución de almidón al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH 6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).
Tubo II Se le agrego 1mL de solución de almidón al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH 6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).
Tubo III Se le agrego 1mL de solución de almidón al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH 6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).
Tubo IV Se le agrego 1mL de solución de almidón al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH 6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).
Tubo V Se le agrego 1mL de solución de almidón al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH 6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta).
Tubo VI Se le agrego 1mL de solución de almidón al 1,0%, 5mL de buffer fosfato pH 6.6, 1.4mL de NaCl 0.15 M y 2mL de agua destilada (con la pipeta). Luego se puso a incubar este sistema por dos minutos a 37ºC. Después se agregó 0,6mL de la enzima tratada en el paso anterior a su tubo correspondiente y dejar en incubación a 37ºC por 20 minutos.
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Sistema C COMPONENTES/TUBOS COMPONENTES/TUBOS HCl 0.05 N Tubos de reac. Del
I
II
III
IV
V
VI
5mL
5mL
5mL
5mL
5mL
5mL
0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
sistema B Solución yodada
0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
Al ya tener los tubos en donde están actuando la enzima (amilasa) del sistema A con el sustrato (almidón) del sistema B, se procede a verter el volumen de cada reactivo indicados en el recuadro del sistema C. (Anexo visual 3)
Tubo I Se agregó 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reacción del sistema B y 0.5mL de solución yodada.
Tubo II Se agregó 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reacción del sistema B y 0.5mL de solución yodada.
Tubo III Se agregó 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reacción del sistema B y 0.5mL de solución yodada.
Tubo IV Se agregó 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reacción del sistema B y 0.5mL de solución yodada.
Tubo V Se agregó 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reacción del sistema B y 0.5mL de solución yodada.
Tubo VI Se agregó 5mL de HCl 0.05 N, 0.5mL de los tubos de reacción del sistema B y 0.5mL de solución yodada.
V.
RESULTADOS
Tubo I: Como resultado se observó que el primer tubo nos mostró un color amarillento.
Tubos II-VI: Se observó que los tubos restantes (II-VI) presentaron un color azul marino oscuro.
VI.
DISCUSIÓN
En el tubo I Como se presentó un color amarillento es signo que la enzima no ha sufrido ningún tipo de cambio (desnaturalización) y la gran parte del sustrato se ha convertido en producto ya que el lugol no ha encontrado al almidón y además porque no hemos agregado ácidos ni sal.
En los tubos II-VI En cambio es estos tubos se presentó un color azul marino oscuro ya que el lugol si ha encontrado al almidón, lo cual nos indica que gran cantidad del sustrato no se ha activado con la enzima.
VII.
CONCLUSIÓN Al término de esta práctica se concluyó que:
Con esta práctica se ha demostrado con es que la enzima (en este caso la amilasa) tiene que estar en un medio adecuado para poder actuar, y por el mismo hecho de ser esta una proteína tiende a desnaturalizarse fácilmente si son expuestos a factores como: PH fuera del rango 6-8, temperatura, ácidos y bases tanto débiles como fuertes.
VIII.
BIBLIOGRAFÍA 1. http://www.monografias.com/trabajos916/actividad-enzimaticaamilasa/actividad-enzimatica-amilasa.shtml#ixzz4uNbifDGl 2. https://es.scribd.com/doc/39218792/COFACTORES-Y-COENZIMAS 3. http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#t 4. http://lccbtis7.blogspot.pe/2011/06/enzimas.html 5. http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/velocidad%20reaccion% 20enzimatica4.html 6. https://cienciaencomun.wordpress.com/2016/01/26/quimica-rotuladorbilletes-falsos/ 7. http://laurafitness.es/7-mejores-enzimas-vegetales-y-su-funcion/ 8. https://elvagodelbarrio.wordpress.com/2011/11/22/importancia-de-lasenzimas/ 9. http://www.wobenzym.de/lang/es/mas-informacion/como-actuan-lasenzimas/ 10.https://www.academia.edu/15 10. https://www.academia.edu/15310442/Factore 310442/Factores_que_afectan_la_ac s_que_afectan_la_activida tivida d_de_las_enzimas 11.. https://www.hsnstore.com/blog/las-enzimas-digestivas-su-importancia/ 11
IX.
ANEXOS
1. ¿Cuál es el mecanismo mecanismo de acción acción de las sales sales pesadas sobre sobre la proteína (amilasa)? Las sales pesadas actúan sobre las enzimas desnaturalizándolas. desnaturalizándolas. En el caso de esta práctica la sal pesada que se utilizo fue el CuSO4 y la enzima fue la amilasa, al reaccionar origina que de la sal se desprenda un ion cúprico el cual une el coo- de la enzima a los grupos de las cadenas laterales originando la ruptura de los puentes salinos.
2. ¿Cómo actúan los ácidos y las bases fuertes sobre la proteína (amilasa)? – ejemplos. La exposición a los ácidos y bases fuertes a la amilasa tienden a desnaturalizar a la proteína. Estas tienden a precipitarse de la solución acuosa por la adición de ciertos ácidos y bases. Ejemplo:
Ácidos fuertes: disminuyen el PH: HCL, ATCA Bases fuertes: aumentan el PH: NaOH 3. ¿Qué cofactor es necesario para mayor mayor eficacia actividad actividad enzimática de la amilasa saliva? La amilasa, es una enzima que se encuentra en la saliva y su función es desdoblar almidón hasta glucosa. Esta enzima utiliza iones cloro como cofactor, la ausencia de este, ocasiona que la velocidad de catálisis enzimática disminuya. 2
4. ¿Cómo actúa la temperatura sobre la estructura proteica de la enzima? Con la acción de la temperatura elevada, también aumenta la energía cinética de las moléculas que conforman la enzima. El aumento de la temperatura también destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la
proteína, de tal forma que el interior hidrófobo interacciona con un medio acuoso y se reproduce la precipitación de la enzima desnaturalizada.
3
5. ¿Cómo repercute repercute la modificación de la estructura estructura proteica producida por agentes físicos y químicos sobre la actividad enzimática? La modificación de la estructura de las proteínas (desnaturalización) ocasiona que esta enzima se inactive y no tenga una actividad enzimática normal. Algunos agentes son más desnaturalizantes desnaturalizantes que otros, por ende la actividad de la enzima estará más inactivada si es sometido a altas alt as temperaturas.
6. ¿A qué clase de enzima corresponde corresponde la amilasa? Su nombre nombre y su código EC La amilasa forma parte de las peptidasas o proteasas a la cual estas son enzimas digestivas. Nombre α-amilasa (alfa-amilasa) es una enzima (EC 3.2.1.1) 4
7. ¿De qué manera influye el PH a la velocidad de una reacción enzimática? Efecto del pH en la ionización del sitio activo: la concentración de H+ afecta la velocidad de la reacción en muchas formas. Primero el proceso catalítico usualmente requiere que la enzima y el substrato tengan grupos químicos en una forma iónica particular para poder interactuar. Por ejemplo la actividad catalítica puede necesitar a un grupo amino, por ejemplo de una lisina en estado protonado (-NH3+) o no (-NH2+), el pH modifica este estado y por tanto a la velocidad de la reacción. 5
8. Explique el proceso por el cual el lugol tiñe de azul intenso al almidón.
La prueba del yodo es una reacción química usada para determinar la presencia o alteración de almidón u otros polisacáridos. ... Esta reacción es el resultado de la formación f ormación de cadenas de poliyoduro a partir de la reacción del almidón con el yodo presente en la solución de un reactivo llamado Lugol.
9. Haga la estructura química del almidón El almidón es un polímero de glucosa está formado de dos subpolímeros, uno lineal llamado amilosa y el de las ramificaciones se llama amilopectina. Las glucosas se unen por enlaces glucosidicos α-1,4- y en las ramificaciones por enlaces glucosidicos α-1, β-6.6
10. ¿Cómo se prepara una solución de lugol? Consiste en 20 gramos de yodo diatómico y 40 gramos de yoduro potásico, disueltos en un litro de agua destilada. El yoduro potásico facilita la dis olución del yodo diatómico, debido a la formación f ormación de iones triyoduro. iones triyoduro.
11. ¿Qué otros factores pueden considerarse para demostrar que las enzimas son proteínas? Las enzimas son un grupo de proteínas que tienen gran importancia en la vida. Gracias a ellas se realizan las reacciones químicas en las células. Todas las células contienen una enzima llamada catalasa que descompone al agua oxigenada (peróxido de hidrógeno). Cuando derramamos peróxido de hidrógeno sobre una herida abierta, se produce espuma por la acción de la catalasa presente en las células. El hombre ha usado enzimas desde los tiempos prehistóricos para producir vino, vinagre, queso, etc.
12. Mencione cuatro enzima que pueden extraerse vegetales 1) La planta de la piña contiene contiene altos niveles de una enzima digestiva digestiva llamada bromelina. 2) El kiwi también conocido conocido como la grosella china, contiene contiene una enzima enzima llamada proteasa actinidain. 3) La ficina es una enzima, enzima, una cisteinilproteinasa, aislada aislada del látex de algunas especies y variedades de higueras e higos. 4) La enzima papaína papaína se extrae del látex del árbol árbol de papaya. 7
13. Importancia de las enzimas Las enzimas son importantes ya que disminuyen la energía de activación, permitiendo acelerar todo tipo de reacciones químicas, ya que estas son muy lentas y requieren de mucha más energía. Las enzimas son esenciales en mucho de los procesos necesarios para la vida por ejemplo: digerir alimentos, regenerar tejido, degradar sustancias).
8
14. Buscar información i nformación sobre enzimas: ¿Qué son? ¿Cómo actúan? ¿Qué factores afectan su actividad? Las enzimas son compuestos químicos que mantienen el metabolismo en marcha. Las enzimas ayudan en las lesiones deportivas, cuando hay dolores articulares reumáticos y en muchos otros tipos de molestias. 9 Algunos factores que influyen en la actividad de las enzimas son: Cofactores y coenzimas, temperatura, pH, concentración del sustrato, inhibidores, mecanismos reguladores. 10
15. Buscar información sobre el enzima amilasa: ¿Qué reacción cataliza? ¿Dónde se encuentra? ¿Por qué es tan importante? La amilasa, es una enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1- 4 del componente α-amilasa al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. Se produce principalmente en las glándulas salivales (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. La amilasa es una enzima digestiva que ayuda al cuerpo a digerir los carbohidratos. Actúa sobre los almidones y los azúcares. Proporciona glucosa. 11
Anexos visuales 1)
2)
3)
