La microbiologie du milieu hydrique Benabdallah.S DCE/M
Sommaire Quelques notions fondamental fondamentales es importante de la microbiolo microbiologie gie
Importance de l’étude approfondie des bactéries Les microorganismes du milieu hydrique Le contrôle bactériologique obligatoire et indispensab indispensable le Devenir des bactéries du milieu hydrique lors des étapes de traitement Méthodes d’étude des bactéries Le prélèvement prélèvement en bactériol bactériologie ogie – transport et et conservation conservation
Les méthodes en bactériologi bactériologiee de l’eau
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Sommaire Quelques notions fondamental fondamentales es importante de la microbiolo microbiologie gie
Importance de l’étude approfondie des bactéries Les microorganismes du milieu hydrique Le contrôle bactériologique obligatoire et indispensab indispensable le Devenir des bactéries du milieu hydrique lors des étapes de traitement Méthodes d’étude des bactéries Le prélèvement prélèvement en bactériol bactériologie ogie – transport et et conservation conservation
Les méthodes en bactériologi bactériologiee de l’eau
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Quelques notions fondamentales importante de la microbiologie Benabdallah.S DCE/M
Qu’est ce que la microbiologie ? La microbiologie : Science ayant pour objet l’étude des microbes
Microbe ou microorganismes : tous les organismes vivants, de petite dimension, qui nécessite pour leur observation un microscope Benabdallah.S DCE/M
Qu’est ce que la microbiologie ? La microbiologie englobe l’ensemble des disciplines biologiques qui concernent ces micro-organismes, notamment la bactériologie, la virologie et la parasitologie. La microbiologie, qui s’est développée avec la microscopie, microscopie étudie non seulement la morphologie des micro-organismes, mais également leur mode de vie, leur métabolisme, leur structure moléculaire, leurs éventuelles propriétés pathogènes et leurs caractéristiques antigéniques
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Naissance et essor de la microbiologie La naissance de la microbiologie correspond à la découverte, grâce au microscope, de l’existence d’une vie minuscule, notamment dans des gouttes d’eau ou autres surfaces : c’est le naturaliste hollandais Antonie Van Leeuwenhoek qui, le premier, en 1683, observe de tels micro-organismes (bactéries et protozoaires), qu’il baptise « animalcules ». Benabdallah.S DCE/M
Naissance et essor de la microbiologie Le développement de la microbiologie est tout particulièrement stimulé par les implications médicales de la microbiologie. (touche la santé humaine) Ainsi, les travaux des chercheurs permettent de mettre en évidence un certain nombre de micro-organismes pathogènes, des bactéries, des unicellulaires parasites, etc. De plus, Pasteur, fait admettre un principe capital pour l’avancement des recherches : les micro-organismes, comme tous les autres êtres vivants, n’apparaissent pas spontanément, mais à partir de « germes » existants
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Les microorganismes du milieu hydrique Les eaux des ressources naturelles superficielles ou souterraines à l’état naturel (sans traitement) contiennent toutes sortes de microorganismes :
algues microscopiques protozoaires (parasites) champignons bactéries virus Nécessité de les classifier
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Classification simplifiée Animaux
Eucaryotes Structure complexe et différenciée
Algues Protozoaires Champignons
Algues bleu vert
Procaryotes Structure simple et rudimentaire
Bactéries Eubactéries
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Principales caractéristiques des eucaryotes et procaryotes
Procaryotes
Eucaryotes
Bactéries
Algues –p rotozoaires – my cètes
T aille de la cellule
G é n é r a le m e n t 1 o u 2 µ m d e long
G é n é r a le m e n t 1 0 o u 1 0 0 µ m d e long
Métabolisme
Anaé robies ou aérobies
Aérobies
Organites
Peu ou pas
N o y a u - m it o c h o n d r ie s – chloroplastes
ADN
AD N cytoplasm ique circulaire
ADN très long contenant de n o m b r e u s e s ré g i o n s n o n c o d a n t e s
ARN et proteines
AR N et proteines synthétisées d a n s le m ê m e c o m p a r ti m e n t
A R N s y n t h é ti sé e t a s s e m b l é d a n s l e c y t o p la s m e
Cytoplasme
Pas de cytosquelette
C y t o s q u e l e tt e c o m p o s é d e filame nts proteiques
Division cellulaire
Par de scissiparité
P a r m i to s e
Organisation cellulaire
unicellulaire
Un icellulaire, et pluricellulaire
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Dimensions des microorganismes virus (10mµ) bactéries (1µ) cellules sanguines (10µ) protozoaires (1mm)
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Les algues microscopiques ou phytoplancton Non obligatoire à rechercher (normes) Mais elles sont recherchées en générale pour :
pediastrum duplex
•Déterminer le degré trophique ou de pollution des eaux superficielles susceptibles d'être utilisées pour l'alimentation humaine •Contrôler l’efficacité des stations de traitement à éliminer le plancton
oocystis lacustris
•Rechercher les causes éventuelles de goût et d'odeur dans l'eau Benabdallah.S DCE/M
Les œufs de parasites Non obligatoire à rechercher dans l’eau potable (normes) Mais elles sont de plus en plus recherchées en générale pour Strongles
Larves
•Déterminer une présence suspecte surtout des espèces parasites pathogènes comme giardia et cryptosporidium • Détecter un problème de fonctionnement de la station de traitement notamment les filtres
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Les œufs de parasites (obligatoire- eau usée) Le laboratoire de microbiologie procède régulièrement à la recherche et dénombrement des œufs d’helminthes dans les eaux usées pour : vérifier la conformité de ses eaux par rapport aux recommandations de l’OMS visant la protection des agriculteurs et des consommateurs Le renforcement du contrôle de la qualité des eaux traitées. Le contrôle de l’efficacité des stations d’épuration Benabdallah.S DCE/M
Les champignons microscopiques Non obligatoire à rechercher dans l’eau potable (normes) Actuellement des études sont en cours pour déterminer leur action sur les goûts et odeurs dans l’eau Leur éventuelle toxicité Benabdallah.S DCE/M
Les virus Non obligatoire à rechercher dans l’eau potable (normes) Actuellement beaucoup d’études visent à rechercher les entérovirus et les bactériophages
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Les bactéries Plan réglementaire : obligatoire à rechercher dans l’eau potable (normes marocaines )
L’absence de bactéries (germes tests témoin de contamination fécale) indique la potabilité d’une eau Benabdallah.S DCE/M
Importance de l’étude approfondie des bactéries
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Qu’est que les bactéries ?
Protistes inférieurs ou procaryotes invisibles à l ’oeil nu peuvent être détruites par stérilisation peuvent être responsables de certaines maladies... les bactéries sont les plus petits organismes connus, doués de métabolisme, capables de croître et de se diviser au dépend de substances nutritives minérales ou organiques l ’ordre de grandeur est le micron mais certaines bactéries peuvent atteindre 50 µm. elles sont dans ce cas proches des algues
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types de bactéries Il est possible de classer les micro-organismes selon leur capacité à provoquer ou non des maladies infectieuses. Certains microbes sont inoffensifs ou même utiles : c’est le cas de ceux utilisés pour la fabrication de produits alimentaires (fromage, vin, etc.) D’autres sont pathogènes car ils peuvent provoquer des maladies infectieuses s’ils sont transmis à l’homme (bactérie diphtérique, virus de la rage, etc.)
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Place des bactéries dans le monde vivant Exigence nutritionnelle simple Pouvoir de multiplication considérable Les bactéries Représente une grande partie de la biomasse terrestre Plusieurs critères les différencient les unes des autres
Nécessité de classifier les bactéries
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Classification des bactéries Dans la classification standard du monde vivant les bactéries constituent celui des procaryotes, qui se distinguent des eucaryotes par le fait que leur matériel génétique (ADN) n'est pas isolé du reste du contenu cellulaire par une membrane. On connaît environ 1 600 espèces de bactéries, parmi lesquelles on distingue deux grands groupes : les archéobactéries et les eubactéries. Benabdallah.S DCE/M
Origine de la classification des bactéries Les bactéries, sont généralement classées à partir de différents critères morphologiques ou physicochimiques : •la structure de la paroi cellulaire, qui permet de distinguer les bactéries à parois fines, de type Gram négatif (Gram -), celles à paroi épaisse de type Gram positif (Gram +), les formes dépourvues de parois et enfin, celles qui présentent des parois constituées d'un matériau différent du polypeptide typique de la plupart des bactéries ; • leurs besoins en oxygène : les bactéries aérobies se développent en présence d’oxygène, et les anaérobies en l’absence de cet élément ; • leur aptitude à former des spores, qui permettent à certaines espèces de résister à des conditions extrêmes ; • leur forme : sphérique (cocci ou microcoques), en bâtonnet (bacilles), ou spiralée (spirochètes).
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Critères de classification des bactéries Morphologiques structurale Tinctoriaux Trophique Métabolique Sensibilité Résistance
Aspect des cellules ... Aspect de la paroi ... Coloration de Gram... Aérobies, anaérobies, hétérotrophes ... Action sur les glucides, les lipides….
À certains agents : oxydants, antibiotiques ... Benabdallah.S DCE/M
Structure des bactéries capsule (éventuelle) paroi cellulaire membrane cytoplasmique ribosomes mésosome appareil nucléaire granules cytoplasmiques vacuoles cytoplasme corpuscules métachromatiques flagelle (éventu
el)
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Morphologie des bactéries d ip lo c o q u e
s tre p to c o q u e
d ip lo s t re p t o c o q u e
e n t é t ra d e
d i p lo b a c i lle
s t r e p t o b a c ille
b a to n n e ts incurvés e x : V i b r io n
s p i r il l e s
en grappe e x : s ta p h y lo c o q u e
e x e m p le s d e fo r m e s fo r m e s s p h é riq u e s C O C C I
e x e m p le s d e en batonnets B A C IL L E
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multiplication des bactéries
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Les bactéries pathogènes Le pouvoir pathogène des bactéries varie considérablement en fonction des espèces et dépend à la fois de la virulence de la souche bactérienne et de l'état de l'organisme hôte, c’est-à-dire de l’efficacité de son système immunitaire. Il existe environ deux cents espèces de bactéries pathogènes pour l'espèce humaine. Parmi les germes responsables des maladies les plus graves, on trouve les bactéries du choléra, de la fièvre typhoïde … Benabdallah.S DCE/M
Les microorganismes du milieu hydrique
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Les bactéries du milieu hydrique : 3 origines Origine purement aquatique : parfaitement adaptées aux conditions de température et aux concentration des différents nutriments
Origine terrestre avec des facultés d’adaptation ou de résistance qui leur permettent de survivre et même se développer dans le milieu aquatique Origine animale ou humaine : ce sont des germes de contamination le plus souvent fécales dont la température normale de développement est de 37 °C environ et qui sont accoutumées à un milieu nutritif riche en matière organique. On parlera de survie de ces microorganismes dans l’eau et non de multiplication ou développement
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transmission des microorganismes La transmission par contact entre un sujet infecté et un sujet sain Le contact est direct lorsqu’il y a attouchement entre un sujet malade et un sujet sain Le contact peut-être indirect, lorsqu’un objet a servi de lien entre le sujet malade et le sujet sain. (seringue, …) Les autres voies de transmission – par aérosol ; Dans ce cas, les micro-organismes pathogènes sont transmis par des gouttelettes de mucus émises lorsque le sujet infecté tousse, éternue ou parle. Exemple : la grippe. – par l’eau ; De nombreux germes pathogènes sont transmis par l’eau : choléra, amibes, poliomyélite, etc.
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transmission des microorganismes – par l’alimentation ; Le lait et les produits laitiers provenant d’animaux infectés transmettent la tuberculose bovine, la brucellose. – par le sol ; Le sol héberge de nombreux micro-organismes qui peuvent être transmis : agents du charbon, du tétanos, etc. – par des vecteurs animaux. Il peut s’agir d’un simple transfert de microbes d’un animal infecté sur un sujet sain ou sur un objet : la mouche transporte ainsi, sur ses pattes, des microbes qu’elle récupère quand elle pond sur des matières fécales. L’organisme est ainsi constamment confronté à la possibilité de pénétration (contamination) d’éléments émanant de son environnement.
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vie survie et mort des bactéries dans l’eau Dans les eaux naturelles (souterraines ou de surface), dans les eaux traitées (avant ou sans traitement)
La variété des bactéries rencontrées est infini
Sur le plan santé publique :
Pathogènes Indicateurs de pollution Bactéries hétérotrophes
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vie survie et mort des bactéries dans l’eau Pathogènes
Peuvent survivre + ou – longuement mais jamais se multiplier
Indicateurs de pollution
Ex : E Coli : survivent + ou – durablement
Bactéries hétérotrophes
Appartiennent à plusieurs espèces et groupes donc impossible à classifier dans ce sens Benabdallah.S DCE/M
caractéristiques des micro-organismes Persistance dans l ’eau dès qu’ils quittent l ’organisme hôte les µorg pathogènes perdent graduellement de leurs vitalité et de leur pouvoir infectant . Leur persistance dans l’eau dépend de plusieurs facteurs comme la température, les UV…
dose infectante en général dans l ’eau les pathogènes sont très dispersés
valeur guide les pathogènes ne sont pas en solution mais sous forme de particules séparées les pathogènes sont agglomérés et s ’attachent aux solides en suspension la relation des doses à effet des pathogènes n ’est pas cumulative ect...
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infections d ’origine hydrique les germes pathogènes ont le pouvoir de s ’implanter, de se multiplier chez l ’homme et de produire des troubles
dans le cas des maladies hydriques les agents contaminateurs proviennent habituellement du tube digestifs de l ’homme ou de l ’animal et sont éliminés principalement dans les matières fécales
pour déclencher une infection intestinale aigue, le microorganisme doit coloniser le tube digestif et à des doses ingérées infectieuses Maladies / troubles / signes cliniques
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Les micro-organismes pathogènes de l ’eau M a la d ie s
A g e n ts
O r ig i n e b a c t é r ie n n e F i è v r e s ty p h o î d e s e t p a r a ty p h o i d e s
S a l m o n e l la t y p h i S a l m o n e l l a p a r a ty p h i A e t B
D y s e n t e r ie b a c illa i re C h o l é ra G a s t r o - e n t é r iq u e s a i g u e s e t d i a r r h é e s
S h i g e l la V ib r o c h o lé r a e E . c o li e n t é r o to x i n o g è n e C a m p y l o b a c t e r je n u je n i / c o l i Y e r s i n i a e n t e r o c o l it ic a S a lm o n e l la s p S h i g e l la s p
O r ig i n e v i ra l e H é p a tit e s A e t E P o l io m y é l i t e s G a s t r o - e n t é r it e s a i g u e s e t d i a r rh é e s
V i r u s h é p a t it e A e t E V i r u s p o l io m y e l it iq u e V ir u s d e N o r w a l k R o t a v ir u s Astrovirus C a l ic iv i r u s C o r o n a v i ru s E n t é r o v ir u s Adénovirus R é o v ir u s
O r ig i n e p a r a s i t a ir e D y s e n t e rie a m ib ie n n e G a s t r o - e n t é r it e s
E n t a o m o e b a h i s t o l y ti c a G ia r d ia la m b lia C r y p t o s p o r id i u m
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Le contrôle bactériologique obligatoire et indispensable Benabdallah.S DCE/M
nécessité du contrôle bactériologique parmi
tous les critères physiques, chimiques et microbiologiques qui permettent de juger si une eau est potable , les critères bactériologiques sont indispensables. l ’eau destinée à la consommation humaine ne doit pas contenir de micro-organismes pathogènes, agents d ’infections humaines redoutables
la
grande majorité de ces µorg nocifs diffusent dans l ’environnement aquatique par l ’intermédiaire de souillures fécales humaines ou animales. Benabdallah.S DCE/M
nécessité du contrôle bactériologique Les µorg pathogènes pour l ’homme, susceptible de souiller l ’eau de boisson sont par exemple : •
les salmonelles, •les vibions cholériques, •Yersinia •entérovirus •giardia •kystes amibiens ...
Ces µorg sont difficiles à mettre en évidence dans l ’eau car ils sont peu nombreux et parce que la souillure n ’est le plus souvent qu ’intermittente
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nécessité du contrôle bactériologique Les µorg pathogènes sont difficiles à mettre en évidence dans l ’eau car ils sont peu nombreux et parce que la souillure n ’est le plus souvent qu ’intermittente
ces agents pathogènes sont d ’origine fécale
nécessité de trouver des germes plus facile à rechercher et ayant la même origine fécale
germes témoins de contamination fécale leur présence dans l’eau : doute sur la potabilité germes accompagnent les germes pathogènes )
(en général, ces
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germes témoins de contamination fécale Les µorg les plus représentatifs sont : les coliformes totaux les coliformes fécaux ou thermotolérants les streptocoques fécaux
grande importance sanitaire spécificité et une sensibilité différente
recherche simultanée permet une meilleure interprétation des résultats NB. L ’analyse est complétée généralement par la recherche de BHR (37°C et 22°C)
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Choix des germes témoins de contamination fécale en fonction de leurs exigences
épidémiologique :
les études devraient établir la relation qui existe entre un indicateur, sa nature, son taux et la probabilité d ’apparition d ’infections dans une population
écologique :
doit être spécifique d ’une contamination fécale, et être toujours absent d ’un environnement non pollué. Doit exister avec d ’autres germes et être sensible son taux doit être élevé , plus que celui des pathogènes
bactériologique :
il doit être plus résistant aux désinfectants que les pathogènes. Il sera incapable de se multiplier dans l ’eau
taxonomique :
il doit être parfaitement reconnu et classé en tant qu ’espèce selon les critères bactériologiques en cours
techniques :
doit être facile à détecter, rapidement et au moindre coût. Doit être capable d se X°sur des milieux usuels sélectifs ou non doit être identifiable sans ambiguîté à l ’aide de réaction ou de tests simple. (Cf. techniques)
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les coliformes totaux Ceux
sont des Enterobacteriacea bacille GRAM négatif non sporulés oxydase négative aérobies ou anaérobies facultatif capable de se multiplier en présence de sels biliaires capables de fermenter le lactose avec production d ’acide et gaz en 48 heures à une température de 35 à 37°C il existe dans ce groupe des bactéries d ’origine fécale et des bactéries d ’origine non fécale limite l’utilité de ce groupe comme indicateurs de pollution fécale
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les coliformes fécaux Ceux
sont des Enterobacteriacea bacille GRAM négatif non sporulés oxydase négative aérobies ou anaérobies facultatif capable de se multiplier en présence de sels biliaires capables de fermenter le lactose avec production d ’acide et gaz en 48 heures à une température de 41 à 44°C ( germes thermotolérants) exclusivement d ’origine fécale groupe le plus important comme indicateurs de pollution fécale
l ’identification poussée des espèces est importante, elle permet de classer ces CF selon leur origine
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classification traditionnelle des coliformes d ’origine fécale
Genre
espece
Escherichia
E.Coli
Klebsiella
K. pneumoniae K. oxytoca
Enterobacter
E. cloacae E. aerogenes
Citrobacter
remarque
rare
rare
C. freundi C. koseri C. amalonatica
seul un petit nombre de genre et d ’espèces sont répertoriés dans ce tableau en réalité les données taxonomiques modernes (nouvelles techniques de biologie) montrent que ce nombre est beaucoup plus élevé : + de 50 espèces
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classification moderne des coliformes d ’origine fécale C o l i f o r m e s d ’ o r ig i n e fécale
C o lifo rm e s d ’o r ig in e a q u a tiq u e o u t e llu r iq u e
E s c h e r ic h i a E .C o li C C C C E E E
i t ro b a c t e r . f ru n d ii . k o s e ri . a m a l o n a tic u s n t e ro b a c te r . c lo a c a e . a e ro g e n e s
K l e b s i e ll a K . o x y to c a K . p n e u m o n i a e s a lm o n e l l a Y e r s i n ia Y . e n t e r o c o litic a
S e r r a t ia
T h e r m o to p h e s o u th e r m o t o lé r a n t s
C o l if o r m e s i s o l é s e n c l in i q u e : c o lo n i s a t e u r s o u p a th o g è n e s opportunistes E . f e r g u s o n ii E . h e r m a n ii E . v u l n e r is
E E E E
. . . .
a m n ig e n u s d i s so l v e n s in t e rm e d i u s nim ipressularis
K . p l a n t ic o l a K . t e r ri g e n a
Y . a ld o v a e Y . b e r c o v i e ri Y . f re d e r i k s e n i i Y . in t e rm e d i a Y . k r is t e n s e n i i Y . m o lla r e ti Y . rohdei S . f o n t ic o l a S . g r im e s i i S . liq u e f a c i e n s S . p l y m u t h ic a S . p r o te a m a c u l a n s S . r u b id e a B u d v i c i a a q u a t ic a B u t ti a u x e l l a a g r e s t is H a f n a i a lv e i L e c le r c ia a d e c a r b o x y la t a P a n to e a a g g l om e ra n s P . d is p e r s a R a h n e l l a a q u a t il i s T r a b u l s i e l la g u a m e n s i s
P s y c h o tr o p h e s o u psychotolérants
E E E E E
. . . . .
a s b u r ia g e r g o v ia h o rm a e c h e i s a k a z a k ii taylorae
K . o r n i t h i n o l y t ic a K. ozenae
S . m a rc e s c e n s S . o s o r if e r a
E K K K
w i n g e l la a m e r i c a n a lu y v e ra a s c o r b a t a . c ry o c r e n s e n s o s e r e l la t r a b u l s i i
M é s o p h ile s o u t h e r m o t ro p h e s o u psychrotrophes
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les streptocoques fécaux on distingue 2 genres streptococcus enterococcus témoins plus résistants E.Coli ceux sont des germes témoins de contamination fécale ils se multiplient rarement dans l ’eau indicateurs supplémentaires de l ’efficacité du traitement
groupe indicateurs supplémentaires pour des résultats douteux pour les CF
les SF étant trés résistants à la dessiccation ils peuvent être utile pour les contrôles à la suite de la pose de nouvelles canalisations ou lorsque des réparations ont été effectuées dans le réseau
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les clostridiums sulfito-réducteurs appelés aussi : Cl anaérobies sulfito-réductrice ou Cl perfringens est habituellement pris en compte dans les réglementations destinées à garantir la potabilité des eaux ne sont pas d ’origine exclusivement fécale les spores de Cl survivent dans l ’eau (+ que les CF) ils résistent à la désinfection (+ que les CF ou SF)
groupe indicateurs supplémentaires pour des résultats douteux pour les CF et SF capables d ’indiquer une pollution intermittente ou à distance OMS ne recommande pas de faire leur recherche en routine
les Cl étant résistants à la désinfection, leur présence dans les eaux désinfectées peut indiquer un traitement déficient et que des pathogènes ont pu également survivre
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les bactéries hétérotrophes revivifiables appelés aussi : germes totaux 2 types fondamentaux
les germes saprophytes qui se développent à 22°C (ge rmes spécifiques à l ’eau) les germes dits « pathogènes » qui se multiplient à 37°C (germes d ’origine fécale, se X°à 37°C)
le dénombrement des bactéries est souvent considéré comme accessoire comparativement aux autres tests donnent une indication sur la salubrité général du milieu
une seule numération des BHR est non significative c ’est la comparaison des chiffres obtenus sur des échantillons de la même eau prélevée à des moments différents de l ’année dans des conditions différentes peut apporter des éléments d ’appréciation sur la protection de la nappe ou du réseau de distribution
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Devenir des bactéries du milieu hydrique lors des étapes de traitement
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Les caractéristiques propres aux microorganismes tendance à se fixer, à décanter à s’agréer ….
va jouer un rôle très important dans leur devenir La paroi des bactéries (même les virus) chargée négativement permet la neutralisation des bactéries au cours de la coagulation /floculation par les colloïdes amenés par le traitement
une grosse partie des bactéries est donc éliminée dés les premiers traitement : décantation – coagulation et floculation
Remarque : en ce qui concerne les parasites l’effet mécanique de la filtration est nettement plus important que pour les bactéries et les virus étant donnée la taille des protozoaires
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mode d ’action des oxydants le mode d ’action est très mal connu car il y a un grand nombre de variables interférentes
nature de la cible de la concentration de l ’oxydant et du temps de contact des conditions expérimentales
mécanisme d ’inactivation des bactéries Le
mécanisme peut s ’opérer sur les différentes structures : la membrane cytoplasmique (cible préférentielle), augmentation de la perméabilité cellulaire, pénétration de l ’oxydant vers le cytoplasme
le enzymes intervenant dans le cycle respiratoire
les acides nucleiques (ADN et ARN)
-
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résistance des micro-organismes aux oxydants
La désinfection a pour ambition d ’inactiver les micro-organismes pathogènes
la résistance de certains micro-organismes aux désinfectants dépend de nombreux facteurs : la température la nature de l ’organisme son état physique ou physiologique (fixé, libre …)
les bactéries sont plus sensibles aux désinfectants que les virus
les virus sont plus sensibles aux désinfectants que les kystes de protozoaires pathogènes comme giardia ou cryptosporidium
les µorg fixés sur un support sont + résistants aux désinfectants que les µorg libres
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Méthodes d’étude des bactéries
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méthodes d ’étude des bactéries au laboratoire
Dans le but de connaître la forme, le métabolisme, la structure des bactéries … plusieurs techniques de plus en plus perfectionnées sont employées Microscopie photonique
Culture des bactéries au laboratoire
Microscopie électronique
Au laboratoire techniques d ’isolement , d ’identification et de conservation des souches
technique de la membrane filtrante technique du nombre le plus probable technique d ’incorporation en gélose technique d ’identification des entérobacteriacea par le système API 20 E
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étude des bactéries grâce au microscope Microscope photonique
observation à l ’état frais : une seule observation est possible avec l ’objectif X100 . Les bactéries sont montées entre lame et lamelles avec un liquide physiologique par exemple. Elle concerne la mobilité et la non mobilité des bactéries. Il n ’est pas possible de distinguer la forme
observation d ’un frottis : les bactéries sont séchées et fixées sur une lame puis colorées 2 types de coloration coloration simple : ex bleu de méthylène coloration complexe : coloration spécifique ou coloration de GRAM . On peut distinguer les colonies roses : Gram - et les colonies violet : Gram +
Microscope électronique Technique qui nécessite une préparation préalable fixation coupe ultra fine
visualisation de la structure interne et externe
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Examen des bactéries au microscope Le microscope est un instrument fondamental dans l'étude des bactéries. Cette technique fut déterminante dans l'étude et l'identification des bactéries. La préparation est d'abord déposée sur une lame de verre, puis colorée après séchage pour être plus facile à observer. Les colorations utilisées peuvent avoir une relative spécificité. Le microscope électronique, grâce à ses grossissements beaucoup plus importants que ceux des microscopes ordinaires, a aussi constitué un progrès considérable. Benabdallah.S DCE/M
Coloration de gram
La méthode de coloration mise au point par Hans Christian Gram (18531938) permet de distinguer deux types fondamentaux de bactéries : celles dont la paroi est épaisse (comme Lactobacillus acidophilus qui apparaît ici en bleu foncé), ou bactéries Gram positives, et celles dont la paroi est très mince, les Gram négatives.
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étude des bactéries grâce à la culture au laboratoire l ’étude des bactéries a connu son plein essor à partir du moment ou furent mises au point les techniques d ’isolement au laboratoire
découverte des milieux de culture liquide et solide
les milieux de culture liquides ou solides contiennent des substances nutritives indispensables à la croissance des bactéries les milieux liquides sont réparti dans des tubes les milieux solides sont réparti dans des boites de pétri
la croissance des bactéries se manifeste par un trouble du milieu liquide et par la présence de colonies caractéristiques dans le cas des milieux solides
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les milieux de culture Leur composition varie en fonction du but que l ’on veut atteindre (mettre en évidence tel ou tel germe) et des besoins que requiert la bactérie
milieu d ’isolement : mise au point de milliers de milieux de culture empiriques.ces milieux de culture sont commercialisées sous forme de poudre ex : le bouillon nutritif milieu simple très riche en composants nutritif, très utilisé en analyse bactériologique extrait
de viande de bœuf trypsique chlorure de sodium peptone
milieu sélectif ou d ’enrichissement il s ’agit de milieux qui favorisent la multiplication de telle ou telle bactérie en mettant dans le milieu des nutriments « spécifiques » de la bactérie ou en mettant un inhibiteur chimique.
ex : le tergitol 7 TTC milieu simple qui permet la recherche des bactéries coliformes
tergitol 7 , a un effet bactéricide sur les germes GRAM TTC permet la reconnaissance rapide des colonies jaune avec halo jaune
le
milieu d ’identification : milieux qui servent à mettre en évidence 1 ou plusieurs propriétés chez les bactéries ex : Kligler pour la recherche de la fermentation d ’un sucre. Actuellement les galeries de type API 20E, système perfectionné est de plus en plus utilisé
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culture des bactéries
Les bactéries peuvent être cultivées en milieu liquide, dans un flacon — dans ce cas, elles se dispersent dans le milieu , ou
sur milieu solide, généralement une boîte de Petri, comme sur cette photographie.
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Présence des bactéries dans l’eau Vie et présence Des bactéries
Colonies
Se manifeste par : augmentation de la taille mais aussi du nombre de cellules
Trouble du milieu
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Le prélèvement en bactériologie
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le prélèvement en bactériologie on dit très souvent : l’analyse commence au prélèvement . L’importance de l ’échanti ’échantillonna llonnage ge est capitale : a quoi serviraient les efforts prodigués pour avoir des moyens analytiques fiables , précis précis et reconnus si l ’échant ’échantillon illon est contestable contestable ou si le résultat résultat ne peut peut être être relié relié de façon façon sûre sûre à la matiè matière re d ’ori ’origin ginee dont dont on recher recherche che les les caractéristiques ??? le prélèvement bactériologique bactériologique est très important car il faut veiller veiller à ce que les échantillons soient le plus représentatifs trois types de questions questions se posent :
quelles es quell
précautions préc autions prendr prendree pour que le le prélèvement prélèvement destiné à l’analy l’analyse se soit so it corre correcte cteme ment nt repr représe ésenté nté ?? Comment
éviter que que l ’échanti ’échantillon llon soit modifié modifié avant son arrivée arrivée au au laboratoire ?? Quelless Quelle
informations informatio ns doivent être consigné consignées es par écrit pour s ’assurer de de la répon réponse se aux aux deux que questio stions ns précéd précédent entes es ??
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Précau Pré cautio tions ns à pre prendr ndree I -
Flacons de prélèvements
- les flacons flacons en verre ou en matière matière plastique plastique conviennent conviennent - le lavage et rinçage rinçage des flacons ne doit doit pas laisser de résidu résidu toxique ou inhibiteur pour les bactéries - le volume volume l plus plus fréquent fréquent est est 500 mL mL - le bouchon bouchon doit être parfaitemen parfaitementt étanche et ne doit doit pas fuir sous sous la pression stérilisation par la chaleur : - l ’aut ’autocl oclava avage ge (121° (121°C, 20 minu minutes tes en vapeu vapeurr humide humide)) - le chauff chauffage age en chaleu chaleurr sèche sèche pendant pendant 1 heure heure et demi demi à 2 heures heures à 175°C est le plus plu s commode commo de pour pou r la verrer verrerie ie vide vid e CQA
: - un CQA CQA perme permettan ttantt d ’ass ’assurer urer le lavag lavagee adéqu adéquat at et la bonn bonnee stérilisation doit être effectué
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Prélèvement au robinet - les conditions conditions d ’aseps ’asepsie ie maximum maximum doivent doivent être assurées assurées : propreté propreté des mains, protection contre les courants courants d ’air, protection contre contre les éclaboussures…
- aucun aucunee souillure souillure ne doit doit aller de la surface surface extern externee du robinet robinet vers l ’écha ’échantillo ntillon n d ’eau : enlev enlever er les saletés saletés,, les brises brises jets
- un flambage du robinet assure une désinfection externe
- laisser couler couler l’eau l’eau en débit débit maximum pendan pendantt 5 à 10 secondes secondes puis puis laisser laisser coulerr à débi coule débitt moyen moyen pendant pendant 2 à 3 minutes minutes puis faire faire le prélèvement prélèvement..
- ne pas remplir au au maximum le flacon, le 1/4 doit rester vide vide pour pouvoir pouvoir effectuer une agitation avant analyse
- le rebouchage doit doit être immédiat et ne pas se servir du flacon pour faire les autres param paramètres ètres sur place (T°, pH…) pH …)
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prélèvement dans les puits et forages connaître la nappe : il faut d ’abord remplacer l ’eau du puits par l ’eau de nappe, aussi, il faut faire un pompage prolongé. La législation préconise 30 heures au début d ’utilisation du puits. Il faut obtenir 2 ou 3 renouvellement du volume dans le puits au minimum avant de prélever par immersion d ’un flacon lesté
qualité de l ’eau chez l ’usager : cette qualité ne dépend pas de la qualité de la nappe car des modifications microbiologiques prennent place dans le puits lui même. Par ailleurs des contaminations externes ( oiseaux ruissellement, rongeurs, seaux …) peuvent survenir si des précautions ne sont pas prises
les flacons lestés qui sont utilisés sont stérilisés ( flacons +lest + corde) sont stérilisés Remarque : si les puits ou forage sont équipés d ’une pompe de refoulement, le prélèvement est réalisé comme décrit pour un robinet
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prélèvement dans les lacs, rivières, mer…usées L’une des principales sources de variation tient à l ’absorption préférentielle des particules sur les particules fines. Les praticiens recommandent de plonger le flacon de prélèvement col vers le bas jusqu ’a 20 à 30 cm sous la surface puis de le redresser pour présenter le col vers l ’amont le flacon est maintenu en général à contre courant remarque : pour le prélèvement des eaux usées, il est en général recommandé d ’utiliser des gants stériles et ce pour éviter la contamination du préleveur Benabdallah.S DCE/M
fiche de prélèvement le prélèvement est toujours accompagné d ’une fiche de renseignement qui indique la localité ou lieu de prélèvement le point spécifique de prélèvement nature de l ’eau l ’origine date et heure du prélèvement nom du préleveur
et tous les résultats des PSP (température, pH…)
observations ou anomalie notées sur le lieu du prélèvement
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Transport et conservation des échantillons
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transport des échantillons l ’analyse bactériologique doit être commencée le plus rapidement possible après le moment ou l ’eau est prélevée dés la mise en flacon des phénomènes se produisent qui vont modifier sa teneur originelle en germes
la
température
Le prélèvement a une charge originelle en germes, avec l ’augmentation de la température, les bactéries exigeant une T°élevée po ur se X°et se développer au dépend des autres germes (ex: E.Coli). Le nombre d ’E.Coli va augmenter rapidement, alors que les bactéries saprophytes vont voir leur nombre baisser pour éviter tous ces phénomènes majeurs, il faut bloquer en maintenant l ’eau prélevée à une température telle qu ’aucune X°de germ es ne sera possible la température conseillée est de +4°C les échantillons peuvent être mis dans des glaciaires jusqu ’à arrivée au laboratoire
l ’analyse au labo doit être fait le + rapidement au maximum 24 heures après le prélèvement
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Conservation des échantillons la température de conservation conseillée est de +4°C les échantillons peuvent être mis dans des glaciaires jusqu ’à arrivée au laboratoire Veillez a ne pas contaminer l’échantillon
l ’analyse au labo doit être fait le + rapidement au maximum 24 heures après le prélèvement Benabdallah.S DCE/M
Conservation des échantillons il faut que l ’échantillon soit le plus représentatif du milieu, les changements à l ’intérieur de l ’échantillon doivent être réduits au maximum pour tous les types d ’eau traitée, naturelle, usée … l ’échantillon destinée à l ’analyse bactériologique ne doit pas être congelé les échantillons doivent être maintenus à une température basse de 4°C environ ( réfrigérateur pour la voiture) les analyses doivent commencer le plus tôt possible, immédiatement à l ’arrivée de l ’échantillon au laboratoire chaque retard doit être pris en compte dans l ’interprétation des résultats et signalé dans le rapport Benabdallah.S DCE/M
Les techniques d’isolement et d’identification des bactéries Benabdallah.S DCE/M
les techniques d ’isolement utilisation de méthodes normalisées normes marocaines normes françaises normes ISO… méthodes utilisées sont différentes selon le type d ’eau à analyser méthode de la membrane filtrante pour les eaux claires, potables, traitées méthode du nombre le plus probable pour les échantillons chargés en MO, eau trouble, eau brute, eau usées ces méthodes ont chacune ses avantages et ses inconvénients
ceux sont des méthodes simples employées universellement méthodes avec 2 tests : présomptifs et confirmatifs méthodes employant des milieux de culture liquides et solides
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méthode de la membrane filtrante Méthode qui consiste à filtrer un volume déterminé de l ’échantillon à travers une membrane de 0, 45 µm de porosité toutes les bactéries présentent sont retenues à la surface de la membrane cette membrane est ensuite mise sur des milieux de culture gélosé approprié incubation des boites aux températures différentes selon les germes recherchés Entonnoir réservoir
Membrane filtrante Plaque poreuse Support métallique
Robinet
Bouchon en caoutchouc
Fiole à vide
Vide
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méthode du nombre le plus probable Méthode statistique Méthode qui consiste à ensemencer un volume déterminé d ’échantillon ou ses dilutions dans des tubes contenant des milieux appropriés on place ensuite ces tubes à l ’étuve à des températures différentes selon les germes recherchés toutes les bactéries éventuellement présentes sont révélés par des propriétés caractéristiques qui leur sont propres exemple pour les coliformes , leur présence est révélée par la présence du trouble du milieu et la présence de gaz dans la cloche
on compte le nombre de séries de tubes positifs et le nombre de séries de tubes négatifs et on obtient les résultats en extrapolant sur une table statistique appelée : table de MAC CRADY
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