Microbiologie La microbiologie est une sous-discipline de la biologie basée sur l'étude des micro-organismes. La microbiologie est une sous-discipline de la biologie la biologie basée sur l'étude des microorganismes. Les micro-organismes forment un groupe extrêmement diversifié d'organismes d' organismes microscopiques, unicellulaires et répartis dans les trois t rois domaines du vivant ( bactérie ( bactérie,, archée et eucaryote). eucaryote ). Ils se distinguent les uns des autres a utres par leur forme, leur taille et leur mode de vie. Les virus virus,, incapables de se reproduire sans détourner la machinerie cellulaire d'un autre organisme, ne sont pas reconnus r econnus par l'ensemble l'ensemble des spécialistes comme vivants. La microbiologie étudie quelquefois leurs actions sur s ur les micro-organismes mais n'a pas pour but de les étudier comme entités. Cette étude est réalisée dans da ns une autre discipline de la biologie : la virologie virologie.. On parle aussi désormais de «microbiologie moléculaire», dans le domaine des biotechnologies surtout[1]. Historique y
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Dès
l'Antiquité, on postulait l'existence d'agents infectieux transmissibles invisibles à l'il nu. 1546 : Jérôme Fracastor impute Fracastor impute la transmission des maladies à des germes vivants, qu'il appelait «seminaria ». 1677 : Découverte des bactéries par le microscopiste microscopis te hollandais Antoine van Leeuwenhk . 1828 : Christian Gottfried Ehrenberg utilise pour la premi ère fois le terme bactérie terme bactérie.. 1840 : Le pathologiste allemand Jacob Henle propose une «théorie des germes » pour les maladies. 1857--1876 : Louis Pasteur met 1857 Pasteur met en évidence les rôles des micro-organismes micro-organismes dans da ns la fermentation lactique et alcoolique. Il développe développe les techniques de pasteurisation et de stérilisation lui donnant la possibilité la mise en place de cultures pures de microorganismes. La possibilité poss ibilité de culture a permis de démontrer que la génération spontanée était une aberration. 1877--1895 : Louis Pasteur démontre 1877 Pasteur démontre que des maladies sont la conséquence de la présence de ces micro-organismes. micro-organismes. Premi Pr emi ères recherches systématiques sur l'origine de certaines maladies, mais aussi la vacc va ccination ination (connue depuis depuis Edward Jenner pour Jenner pour la variole - maladie virale). 1873--1882 : Robert Koch met en évidence le bacille responsable 1873 r esponsable de la tuberculose tuberculose (Mycobacterium tuberculosis). tuberculosis ). Koch a établi les r ègles (toujours utilisées) qui permettent de démontrer rigoureusement qu'une bactérie donnée est à l'origine d'une infection. 1884 : Hans Christian Gram développe une technique de coloration qui est la plus utilisée dans l'étude et la classification des bactéries en deux grands groupes : les bactéries à Gram Gra m positif et celles à Gram négatif.
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1912 : Paul Ehrlich découvre le premier traitement efficace (dérivé d'arsenic) contre la syphilis. C'est la premi ère fois qu'on traite avec a vec un agent chimiothérapeutique une maladie bactérienne. 1917 : Découverte des bactériophages par Frederick par Frederick Twort et Félix d'Hérelle. d'Hérelle. 1928 : Frederick Griffith découvre la transformation tr ansformation bactérienne et établit les fondements de la génétique moléculaire. 1929 : Alexande Alexanderr Fleming découvre les propriétés antibactériennes de la pénicilline la pénicilline produite par P enicillum. L'humanité entre dans l' ère des antibiotiques. P enicillum 1944 : Albert Schatz et Selman Waksman découvrent un autre antibiotique : la streptomycine qui sera bientôt utilisée contre la tuberculose. 1960 : François Jacob, Jacob, David Perrin, Carmen Sanchez et Jacques Monod proposent le concept d'opéron d'opéron pour le contrôle de l'expression des g ènes bactériens. 1977 : Carl Wse étudie l'ARN l' ARN ribosomique pour découvrir une troisi ème forme de vie, les Archæa, différente génétiquement des bactéries et des eucaryotes. 1986 : En utilisant une enzyme de la bactérie Thermus aquaticus , Kary Mullis invente la technologie de PCR (Polymerase ( Polymerase Chain Reaction). Reaction). La technique de PCR est devenue l'outil de base de la biologie moléculaire. 1995 : Séquençage complet du premier génome bactérien ( Hæmophilus influenzæ ) par Craig Venter et Venter et ses coll ègues du TIGR . La microbiologie entre dans l' ère de la génomique.
Classification
L'analyse de l'anatomie des différents micro-organismes recensés a permis per mis de les classer en deux grands groupes : les procaryotes (munis d'un proto-noyau) et les eucaryotes (possédant un vrai noyau) y
procaryotes (groupe polyphylétique comprenant en fait des taxons de rangs différents) archæa, (anciennement archéobactéries) eubactéries eucaryotes (groupe monophylétique ou taxons simples) algues unicellulaires champignons unicellulaires protozoaires o o
y
o o o
Des
analyses génétiques ou prouvé que les archæa sont sont aussi différentes des eubactéries que des eucaryotes d'un point de vue phylogénétique vue phylogénétique,, mais on ignore toujours quel a été le point de départ de la différenciation de ces trois groupes.
Caractéristiques Les procaryotes
Les procaryotes P rokaryota rokaryota ou P rokarya), rokarya), du grec pro (avant) et caryon (noyau) , sont des organismes dont la cellule ne poss ède pas de noyau noyau cellulaire ni d'autres organites, ils appartiennent à au moins deux taxons différents : y
Les archéobactéries ou archées sont un groupe spécifique, car il ne comprend principalement que des esp èces anaérobies (n'ayant pas besoin d'oxyg ène, ou alors
y
fréquemment ne tolérant pas l'oxyg ène), vivant dans des environnements extrêmes : on parle d'organisme extrémophile. Les environnements environnements extrêmes sont à la limite des conditions tolérées par les cellules biologiques (milieu salin particuli èrement acide ou particulièrement alcalin, a lcalin, milieu à température proche proc he de l'ébullition). l'ébullition). Les archéobactéries ne sont pas que des extrémophiles, ce sont aussi des organismes plus communs qui vivent dans des conditions de vie classique comme les marais ou les rumens des ruminants. Il ne faut pas associer toujours t oujours archéobactéries à des organismes extrêmes même si on retrouve parmi eux la majorité des extrémophiles. On retrouve les eubactéries dans notre quotidien, sol, nourriture... Ce sont les bactéries les plus connues. Cependant certaines eubactéries sont s ont aussi extrémophiles.
Ces micro-organismes ont des mécanismes méca nismes pour résister à ces conditions. Autres
règnes
La systématique moderne moderne phylogénétique am ène à reclasser parmi les procaryotes des esp èces jadis classées dans le r ègne animal, végétal, ou même fongique (normalement des esp èces toutes eucaryotes selon la classification class ification moderne du vivant). De
plus, les esp èces eucaryotes multicellulaires (végétales comme animales) ne peuvent vivre sans la présence prés ence de certaines bactéries dans le milieu intercellulaire intercellulaire ou dans des organes cavitaires : elles participent à la synth s ynthèse (surtout chez les plantes fourrag ères qui utilisent des bactéries de la famille Rhizobium pour la synth èse et l'assimilation de l'azote) ou la dégradation (par exemple pour la digestion) de certains composés organiques ainsi qu'à la lutte active contre d'autres esp èces bactériennes ou virales (pathog ènes à cause de leur développement anarchique non symbiotique). De
même la microbiologie s'intéresse de plus en plus aux «esp èces» pseudo-cellulaires (organites organites)) présentes dans le noyau ou le cytoplasme de l'ensemble des eucaryotes et la plupart de procaryotes, où ils «vivent » en symbiose endogène (endocytose (endocytose), ), et sert à penser que leur origine est celle des archéobactéries ou d'esp èces toujours plus anciennes. Ce mode de colonisation des êtres cellulaires eucaryotes ou procaryotes est proche proc he de celle utilisée dans un autre domaine domaine du vivant, les virus virus,, toujours classés dans aucun r ègne, actuellement étudiés activement par la virologie moderne, en particulier pour les besoins de la médecine (traitements antiviraux, ou thérapie génique), mais également en botanique et zoologie pour les besoins agricoles (organismes (orga nismes génétiquement modifiés). Occasionnellemen, des bactéries sont utilisées comme c omme vecteurs de culture et de transport de ces virus (fréquemment aussi auss i génétiquement modifiés) chargés d'opérer les modifications génétiques génétiques cellulaires. L'étude principale des procaryotes est principale par conséquent pour comprendre comprendre l'évolution de l'ensemble des autres esp èces des cinq r ègnes classiques et s'appuie aussi désormais désor mais sur la recherche plus récente en virologie et biologie moléculaire. Les eucaryotes
Les eucaryotes ont un dispositif membranaire interne enfermant des organites ( noyau noyau,, plaste plaste,, mitochondrie... mitochondrie ... ) ; ils ils présentent un cytosquelette interne (actine, tubuline) tubuline) absent chez les procaryotes, qui leur conf ère une taille fréquemment plus importante que les procaryotes.
On estime que chaque groupe d'eucaryotes a eu un ancêtre parmi par mi les procaryotes (archéobactéries ou eubactéries), et que les mitochondries (et peut-être aussi d'autres organites comme les chloroplastes chloroplastes)) présents dans le noyau des eucaryotes actuels ont ont aussi eu au moins un ancêtre procaryote différent qui aurait colonisé cette ancienne a ncienne bactérie pour vivre en symbiose (endosymbiose (endosymbiose)) avec elle et former l'ensemble des eucaryotes qui ne peuvent plus vivre sans elles. En effet, on retrouve dans les mitochondries un cytosquelette interne spécifique, s pécifique, une structure membranaire externe complexe, un matériel génétique interne spécifique logé dans une zone plasmique nommée proto-noyau (dépourvu de membrane mais tout de même structurée), même si les mitochondries ne peuvent se multiplier seules sans le concours de la cellule hôte (les mitochondries auraient perdu leurs facultés de reproduction qui ne leur étaient plus nécessaires, puisque la cellule hôte leur apporte quasiment tout le matériel indispensable à leur croissance et leur division). di vision). Algues
Contrairement aux champignons ainsi qu'aux protozoaires, les algues ont des pigments des pigments chlorophylliens leur servant à réaliser la photosynth èse. Elles sont par conséquent des organismes vivant immobile et autotrophes autotrophes.. Les algues sont présentes dans le sol, les plantes, l'eau douce et l'eau de mer. Champignon
Les champignons sont présents dans le sol, plantes, plantes , débris végétaux, lichen, parasites de l'homme, des animaux et des plantes. : une levure levure,, eucaryote unicellulaire, est un champignon. champignon. Il existe de nombreuses esp èces de levures comme Saccharomyces cerevisi æ (levure de boulangerie), la famille des C andida andida (responsables des candidoses), Rhodotorula (quelquefois retrouvée dans la choucroute choucroute qu'elle colore color e en rouge), Schizosacc haromyces, etc. Remarque
Les champignons sont "absorbotrophes" : ils se nourrissent par absorption. Ils sécr ètent des enzymes qui digèrent des polymères dans le milieu extérieur, ce mécanisme chimique transforme par exemple les glucides en monomères (petites molécules) qui sont ainsi absorbés. Protozoaire
Les protozoaires sont des êtres unicellulaires dépourvus de paroi cellulaire (contrairement (contrairement aux algues). On en trouve dans le sol, l'eau douce, l'eau de mer, mais également comme parasites de l'homme et des animaux. Les protozoaires se nourrissent par pinocytose pinocytose et endocytose car ils n'ont pas de paroi cellulaire. c ellulaire. Autres
règnes
l es algues) et Bien que non classés parmi les microbes , les r ègnes végétaux (avec affinité avec les animaux (avec affinité avec les protozoaires) protozoa ires) sont aussi classés par mi des eucaryotes. eucaryotes. Ils ne sont pas classés class és comme micro-organismes micro-organismes car ils ne vivent pas ni ne se reproduisent à l'état unicellulaire.
La taille des micro-organismes Comme signalé au début, les micro-organismes sont de tr ès petite taille tail le (d'où leur nom) : y
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procaryotes ( bactéries) bactéries) : de l'ordre de 0, 5 à 3 µm (pour la largeur), pas de limite en longueur ; le pouvoir séparateur de l'il humain est de 100 µm (10 -4m soit 0.1 mm), ces micro-organismes sont par conséquent tous invisibles à l'il nu. eucaryotes : particuli èrement variable de 2 à 200 µm (pour la largeur), pas de limite en longueur longueur ; certains eucaryotes sont visibles à l'il nu (surtout les algues), d'autres ne sont visibles que sous forme d'agrégats (cas des champignons, dont les parois plasmiques émettent des filaments sur une grande gra nde longueur longueur assez à leur taille). L'ensemble des eucaryotes ne s'agr ègent pas ainsi (surtout les protozoaires, protoz oaires, invisibles à l'il nu).
Le rapport surface sur volume est directement influencé infl uencé par la taille : si on consid ère une forme simple telle que la sphère re,, la surface surfac e est proportionnelle proportionnelle au carré de la taille (4 r ² si r est le rayon de la sph ère), tandis que le volume est proportionnel au cube de la taille (4/3 r ³), ³), le rapport surface/volume est par conséquent inversement proportionnel à r (3/r ). ). Ceci conditionne la vitesse à laquelle le micro-organisme se nourrit : la nourriture passe à travers la membrane plasmique, par conséquent la vitesse vitess e d'absorption est proportionnelle à la surface, mais la quantité à nourrir est proportionnelle proportionnelle au volume. La vitesse à laquelle entrent et sortent les nutriments et les déchets est par conséquent inversement proportionnelle à la taille. Par conséquent plus la bactérie ba ctérie est petite, plus elle va pouvoir se nourrir à grande vitesse. Elle compense sa petite taille par une multiplication à particuli èrement grande vitesse (taux de croissance particuli èrement rapide).
La culture des micro-organismes Richesse du milieu
Les micro-organismes ont besoin : y
D'une source d'énergie. o
o
y
D'une o o
y
De
Pour les chimiotrophes, elle provient de la dégradation de composés chimiques (par exemple du glucose) Pour les phototrophes, de la lumi ère. source de carbone Pour les autotrophes, il suffit de CO 2 atmosphérique (carbone minéral). Pour les hétérotrophes, elle provient de molécules organiques (CH 4, oses... )
macroéléments (Ainsi nommés à cause de leur concentration dans le milieu de culture)
C, H, O, N N,, S, Na Na,, Mg Mg,, P, K Les éléments carbone, azote, phosphore doivent être présents aux a ux proportions 100/10/1 pour un milieu correct. y
De
microéléments
Cu,, Co Cu Co,, Zn Zn,, Cl Cl,, Fe Fe... ... y
D'une
source d'azote d' azote
D'origine y
De
minérale (sel d'ammon d'a mmonium) ium)
facteurs de croissance
Vitamines,, acides aminés Vitamines y
De
dioxygène ou oxygène moléculaire
Pour les aérobies strictes ² ou ² d'absence de dioxyg ène (ou oxyg ène moléculaire) anaérobies stricts; strict s; pour ces microorganismes, le peroxyde d'oxyg ène (H2O2) constitué par la réaction entre l'O 2 et l'H l'H2O les empoisonnent, car ils ne poss èdent pas une catalase dégradant H2O2 à l'inverse des individus aérobies. Il existe aussi des micro-organismes aérobies a érobies facultatifs capables de se multiplier en présence ou en l'absence d'oxyg ène grâce à leur capacité à utiliser la fermentation et des bactéries microaérophiles qui ne se développent développent qu'à une certaine pression en dioxyg ène. y
De
facteurs physico-chimiques : Pour le facteur température dist ingue trois catégories de micro-organismes facteur température, on distingue selon leur optimum de croissance. Les psychrophiles Les psychrophiles ont leur optimum à 15 °C, les mésophiles à 37 °C, les thermophiles à 65 °C. Il faut descendre au a u-delà de -18 °C pour arrêter toute croissance microbienne. microbienne. À 3 °C il y a peu de risques lié aux bactéries pathog ènes (mésophiles, par conséquent virulentes à la température du corps) ou toxinog ènes, seules quelques bactéries vivant à ces températures peuvent être dangereuses (listéria). Pour le facteur p p H , on considère que les bactéries préf èrent la neutralité excepté pour les bactéries lactiques. Pour les levures et moisissures, le pH optimum est plus acide. a cide. (pH=5) o
o
Diversité
du milieu de culture
On peut distinguer deux sortes de milieux de culture : y
y
Synthétiques : milieux dont on peut donner la composition chimique compl ète. Les milieux synthétiques sont utilisés en recherche r echerche principale. Empiriques : milieux dont on ne connaît que partiellement la composition.
i es 2 t es de milieux, il existe des milieux sélecti s (qui vont permettre de et sélectionner le t pe de micro-organismes qu i pourront s'y multi p plier). On peu t ainsi choisir de ne laisser se développer qu'un genre de bac tér ie donné (ex: milieu mFC pour les coli ormes fécaux ou gélose au sang pour cer tains pa thogènes) ou au contra ire de fac ilit er le développemen t des levures-moisissures en a joutan t un anti b biotique au milieu. La température à laquelle on incubera les milieux inoculés forme auss i un facteur de sélection comme menti onné plus haut. Les milieux de cu lture peuvent contenir des ex tra its de levure (cellules de levure déshydra t ées et lysées) qu i fournissent une source d'ac ides aminés, de vitamines et d'azote, des extraits de malt appor tant une source de carbone, des pep tones (protéines animales, de poisson, de caséine de lait) source d'azo te organique qu i intéresse les individus hétérotrophes.
Ces milieux sont soit liquides, soit solides. Pour so lidif ier le milieu on utilise souvent la gélose ou agar-agar , un polymère de sucre tiré d'une a lgue rouge présen tant la propr iété de former avec l'eau un gel solide si la température es t infér ieure à 60 °C.
L
ili
i
ilisation est l'opéra tion qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un ob jet et ce, de La stér ili ilisation est d'une par t maîtr iser les manière durab le. En microbiologie, l'ob jectif de la stér ili micro-organismes introdu its dans le milieu d'étude, et d'autre par t éviter la contamination du ticle sur l'hyg milieu ext ér ieur et des personnes (vo ir aussi l'ar ti hygiène ène). ). iliser un milieu de culture. Une des truction par la chaleur, par Il existe trois façons pour s tér ili iltration ou par l'emploi de radiation et d'agent chimique (gaz) une méthode de f ilt L
h l
On peut distinguer les procédés à cha leur «sèche» ou «hum ide».
ilité d'un bec Bunsen. Figure 1 : Zone de stér ilit y
Chaleur sèche : o
Bec Bunsen : tout l'a ir qui se trouve dans un g lobe vir tuel de 15 cm de rayon de la f lamme d'un bec Bunsen, es t passé une fois dans la f lamme. Ceci crée
une enceinte fictive stérile. Les microbiologistes microbiologistes travaillent avec a vec une flamme oxydante qui crépite. Four Pasteur ou four Poupinel : C'est un four classique utilisé à 180°C pendant 90 minutes au minimum. Chaleur humide : Autoclave : cette technique consiste à faire bouillir de l'eau dans une enceinte close pour augmenter la pression press ion et par conséquent dépasser les 100°C d'ébullition (principe de l'autocuiseur). Ceci est réalisé à 134°C pendant 18 minutes. o
y
o
Cas
spécifiques : la pasteurisation pasteuris ation et tyndallisation tyndallisation
La pasteurisation La pasteurisation est un procédé pour la conservation des aliments par lequel un aliment est chauffé à une température définie pendant une période de temps définie avant d'être refroidi rapidement. Les températures de pasteurisation fluctuent entre 70 °C et 85 °C. Cette C ette technique ne détruit qu'une partie de la flore bactérienne. Ce n'est , en aucun cas, une technique de stérilisation.. stérilisation La tyndallisation est une série de chauffages brefs à des températures te mpératures de 70°C à intervalles réguliers (3 chauffages d'une heure, 24 h entre 2 chauffages), ceci pour laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. A titre d'exemple, la destruction des germes pathog ènes du lait se fait par un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15 minutes. L'ébullition L'ébullition n'est pas une méthode de stérilisation. Les formes for mes sporulées des bactéries peuvent résister jusqu'à 8h30 à 100°C. La filtration
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les pores ont un diam ètre de 0, 2 µm ; les micro-organismes sont trop tr op gros pour passer et sont par conséquent retenus par le l e filtre. Pour forcer ce liquide à traverser traverser le filtre filtr e on utilise deux solutions : y y
mise en pression pr ession du liquide par l'intermédiaire d'un piston. aspiration du liquide en créant par exemple une enceinte dépressurisée de l'autre côté du filtre.
Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits produits thermolabiles (c'est-à-dire qui ne résistent pas à la chaleur) comme certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques. Cependant les filtres de 0.2 µm colmatent vite. On peut contourner contourner ce probl ème en augmentant la surface du filtre ou en utilisant un procédé de filtration tangentielle. Occasionnellemen le filtre ayant servi à stopper st opper les micro-organismes micro-organismes peut être déposé sur un milieu de culture solide pour permettre la multiplication des germes, ceci dans l'objectif de procéder à leur dénombrement ainsi qu'à leur identification. identification. Radiation et agent c himique
Ces techniques sont utilisées par les industries dont l'alimentaire. Elles sont particuli èrement pénétrantes car les radiations et certains gaz traversent tra versent le plastique et tuent les micromicroorganismes. Les rayons ultraviolets ne sont cependant pas une bonne technique de stérilisation car ils sont non pénétrants, pénétrants, par conséquent ils ne passent pas au travers tra vers de matériaux matériaux comme le plastique et le verre. Qui plus est certains micro-organismes s ont capables de réparer les dommages infligés par les ultraviolets si le produit est éclairé apr ès application de rayons ultraviolets; c'est le phénom ène dit "de photo-réparation". On peut occasionnellementutiliser le rayonnement gamma, bien plus pénétrant et puissant que les ultraviolets. Notion
de culture pure
Technique des stries
Elle est basée sur la notion d'UFC (Unité Formant une Colonie). Chaque unité cellulaire (une (une cellule, un groupe de cellules ou un morceau d' hyphe hyphe)) va donner une colonie. Sur un milieu de culture, il y a formation d'un monticule de bactéries ou de levures avec une forme spécifique (la colonie). La forme de ce monticule est déterminée par l'organisation de la colonie, qui elle-même est déterminée génétiquement. Les champignons vont, eux, développer développer un thalle c'est-à-dire ce qu'on peut par exemple observer sur les confitures ayant "moisi". L'UFC est utilisée aussi pour le dénombrement bactérien en utilisant des cultures s ur boîte à partir de tubes préparés par dilutions en cascades de la suspension bactérienne m ère. L'observation macroscopique de l'aspect des colonies sert à différencier les colonies de bactéries contaminantes de celles qu'on cherche à isoler. Technique de su spension dilution dilution
Cette technique permet de évaluer le nombre de microorganis microorganismes mes qui se trouvent dans un milieu liquide (eau de puits, boissons, eau de piscine... ) ou dans un milieu solide (sol, aliments... ). Elle peut aussi servir à isoler une souche pure à partir d'un mélange. Il s'agit simplement d'une suite de dilutions suivie d'un prél èvement d'un aliquot qui sera étalé sur un milieu de culture qui pourra être sélectif ou non. Il suffira ensuite de compter le nombre de colonies, et connaissant le volume de l'aliquot (en général 1 mL sur une boîte), on en déduira la quantité approximative de bactéries dans le milieu (on consid ère qu'1 UFC correspond à 1 bactérie).
Identification des bactéries L'identification des bactéries se fait suivant une clé dichotomique qui va des caract ères les plus vastes aux plus pointus pour aboutir à une esp èce bactérienne donnée. C ritères
morphologiques
L'étude de la morphologie morphologie bactérienne est le premier acte a cte effectué par un laboratoire de diagnostic pour identifier une bactérie. L'observation L'obser vation de la morphologie morphologie bactérienne permet une orientation préliminaire du diagnostic. Macroscopique
À l'il nu, on peut distinguer les caractéristiques d'une colonie : y y y
La forme du relief La taille La couleur
y y y y
L'aspect (collant, filamenteux... ) L'odeur La transparence L'allure des contours
Il existe trois grands types de colonies : y
y
y
colonies de TYPE S (Smooth=lisse) : contours lisse lisse et réguliers, semi-bombée, semi-bombée, surface brillantes, crémeuses. colonies de TYPE M (Muqueux) (Muqueux) : contours lisse et réguliers, réguliers, trés bombées, bombées, surface trés brillantes, filantes. colonies de TYPE R (Rough=rugueux) (Rough=rugueux) : contours contours irréguliers, plates plates rugueuses et mates, sèches.
Microscopique C oloration
de Gram
Les bactéries étant généralement généralement presque pr esque transparentes, on débute par préparer un étalement sur lame de microscope auquel on applique une coloration de Gram. Gram. Les bactéries à Gram positif apparaîtront positif apparaîtront mauves mauves tandis ta ndis que celles à Gram négatif apparaîtront négatif apparaîtront roses. Il existe d'autres colorations, comme par exemple celle au vert de malachite servant à mettre en évidence les formes sporulées. La coloration col oration de Gram sert à déterminer le type de paroi cellulaire. Forme
La forme est extrêmement diverse au sein du monde bactérien. Si on excepte les bactéries bactér ies dépourvues de paroi (Mycoplasmes ( Mycoplasmes), ), qui peuvent être particuli èrement polymorphes, la diversité est assez restreinte r estreinte pour les bactéries d'intérêt médical et vétérinaire. Parmi celles-ci, celles-ci, on distingue essentiellement des formes formes sphériques ( cocci cocci), ), cylindriques ( bacille ( bacille), ), spiralées (spirille spirille), ), enroulées (spiroch ète) à appendice bourgeonnante ou filamenteuse. Mode de groupement
Elles peuvent se regrouper en chaînes ( Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus ... ), en amas asymétriques ou grappes ( Staph ylococcus), en amas cubiques réguliers (sarcines), en palissades ou en paquets d'épingles ( C orynebacterium orynebacterium)... Le mode de groupement, à condition de l'apprécier sur une culture jeune effectuée en milieu liquide et de tenir compte de l'aspect prédominant, est aussi un élément important pour orienter l'identification.
Taille
Les plus petites bactéries ont une taille de 0, 1 à 0, 2 microm ètre (C hlamydia) tandis que certaines ont un diam ètre supérieur à 10 microm ètres. La plus grande bactérie connue (Thiomargarita namibiensis) peut atteindre un diam ètre de 750 microm ètres. Présence
de spore
Toutes les bactéries n'ont pas la possibilité de sporuler. La totalité des bacilles à Gram + sporulent en situation de stress. Pour mettre en évidence les spores au microscope optique, il suffit de les colorer au vert de malachite ou à l'encre de chine. Mais on peut les deviner à la coloration de Gram (absence (abs ence de coloration). Les spores s pores sont présents présents chez les Bacillus. Mobilité
Les bactéries peuvent être équipées d'un ou plusieurs flagelle (s) leur servant à se déplacer. Pour définir le mode de déplacement des bactéries, on parle de chimiotactisme. La bactér ie évoluant dans un milieu se déplace selon des gradients de concentration pour se rapprocher de sa "nourriture" Capsule
La capsule est constituée de polym de polymères (polysaccharides ou protides) disposés en couches couc hes à la périphérie de la bactérie. bactérie. Celle-ci autorise a utorise la bactérie d'adhérer d'adhérer aux surfaces (coloniser les surfaces) et d'échapper au dispositif immunitaire car les antigènes de surface sont recouverts par la capsule qui les rend indétectables (pouvoir pathog ène). C ritères
biochimiques
On identifie aussi une bactérie en observant observa nt si elle utilise tel ou tel substrat. On la met par conséquent en contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou d'autres substrats plus complexes. complexes. On peut révéler l'utilisation de ce substrat par virage (changement de couleur) d'un indicateur de pH car un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit basique, etc. Chaque famille de bactéries a des caract ères propres, on peut par conséquent les rassembler rass embler aisément avec des caractéristiques caract éristiques de base comme l'utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la réduction des nitrates, etc. Par la suite, on dispose de galeries d'identifications biochimiques qui sont quelquefois vendues vendues par des sociétés s ociétés spécialisées. Ces tests sont assez longs, d'un à deux jours. Critères
génétiques
On peut citer des techniques de génie génétique comme : y
y
la PCR PCR ((Polymerase Chain Reaction) Reaction) pour cibler un g ène présent seulement chez une famille ou un genre bactérien par réhybridation spécifique de courtes séquences d'AD N (oligonucléotides amorces) synthétiques précises. les puces les puces à AD N qui utilisent le même principe mais ayant une précision allant jusqu'à la souche même.
Systématique bactérienne
La systématique permet d'identifier une souche bactérienne inconnue grâce à différents examens ainsi qu'à l'utilisation de milieux de culture spécifiques. La coloration de Gram et les tests de la catalase et de l'oxydase l' oxydase permettent de déterminer la famille. Des milieux de cultures spécifiques permettent d'arriver au genre ainsi qu'à l'esp èce. s upplémentaires taires tels t els que le sérogroupage peuvent être utilisés Des examens supplémen occasionnellemen. Coques y
à Gram positif et catalase positive
Famille des Micrococcaceæ Genre Micrococcus Genre Staphylococcus o o
Coque y
à Gram positif et catalase négative
Famille des Streptococcaceæ Streptocoques des groupes Lancefield A, B, C, D (Enterococcus Enterococcus), ), F & G o
Coque
à Gram négatif
Gram négatif regroupe les bactéries à paroi par oi fine qui ne retienne pas le bleu de gentiane/cristal gentiane/cristal elle apparaisse au microscope microscope optique en rose apr ès qu'on ajoute de la fushine (genre neisseria, par exemple). Bacille à Gram positif y y y
Genre Bacillus Genre Listeria Genre Clostridium
Bacille à Gram négatif Oxydase négative
Famille des Enterobacteriaceæ : y y
Genre des Salmonella Genre des Escherichia Sérogroupage des Escherichiæ Coli Sérogroupage Sérogroupage des autres a utres Escherichia Genre Shigella Genre Klebsiella Genre Enterobacter Genre Serratia Genre Proteus Genre Morganella Genre Providencia o o
y y y y y y y
y
Genre Hafnia
Oxydase positive y y y
Pseudomonas Vibrio Æromonas
Les agents antibactériens Les agents physiques
On peut citer les agents suivants : y
y y
y
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La chaleur : à partir de 65°C, les protéines sont dénaturées, cependant certains microorganismes sont capables de supporter supporter des températures plus élevées. Le pH Le pH : qu'il soit trop acide ou trop basique. Les hautes pressions press ions : à partir de 6 000 bars. Ainsi, c'est avec un traitement par la pression qu'on stérilise les jus de fruits produits en industrie. L'Aw : moins il y a d'eau libre dans un milieu, moins les bactéries pourront se développer ( Staph ylococcus aureus se développe à partir d'une Aw de 0, 83) Les UV : pour une longueur d'onde voisine de 260 nm, ils détruisent l'ensemble des micro-organismes. Peu efficaces efficac es à travers les plastiques, ils sont utilisés pour stériliser l'air. Les rayons gamma : comme les UV, ils sont particuli èrement efficaces. Ils peuvent traverser l'ensemble des plastiques et servent par conséquent à la stériliser les instruments comme les fls chirurgicaux par exemple. Leur utilisation a été tentée pour les produits alimentaires, sans succ ès aupr ès du public.
Les agents chimiques
à suivre
Les antibiotiques Les antibiotiques sont des substances chimiques qui ont une action spécifique avec le pouvoir de limiter la prolifération de bactéries bact éries spécifiques. Elles sont dépourvues de toxicité pour les autres cellules (champigno (cha mpignons ns et autres autr es eucaryotes). Ces molécules peuvent avoir une action drastique, c'est-à-dire bactéricide; leur efficacité peut être aussi limitée à empêcher le développement des bactéries (on parle alors d'action bactériostatique). V oir oir
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Les résistances aux antibiotiques oir V oir
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La croissance bactérienne
C'est le pouvoir ou la capacité des bactér ies à augment er leur nombre; il est selon le type de bactér ies (thermophyles / mésophyles / pscychrophy les / pscychro trophes / etc. ) Lors Lo rsqu quee des de s bactér ies sont incubées dans un milieu liquide correct, elles continuent le plus souvent à se multi p plier de façon exponen tielle jusqu'à ce qu'un fac teur indispensable à leur croissance approche de l'épuisement et devienne limitant ou que qu e des produ pr odu its métabolites inhi b biteurs (acides organiques, alcools, ammoniaque, etc. ) s'accumu lent exagérément. Cett e culture, pratiquée sans addition de nutr iment ni élimination de déchets en cours de cro issance, se nomme une culture en milieu discontinu ou en ba tch qui forme un dispositif clos. Une cu lture de ce type se compor te comme un organisme multicellulaire avec une limitation de croissance génétiquement déterminée. On peut représent er graphiquement la croissance d'une cu lture de ce type en por tant le logar it ithme du nombre de ce llules viab les selon le temps. La courbe ob tenue pourra être ithmique de x à divisée en qua tre phases : 1- phase de latence = x, 2- phase de cro issance logar it X, 3- phase s tationna ire = X et 4- phase de décro issance exponentielle de X à 0. Di
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4 : Courbe de cro issance dans un m ilieu contenant deux glucides (par exemp le: I utilisation du glucose et II : utilisation du lactose). i
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En présence de deux sources de carbone, les bact ér ies exhi ben bent une courbe de croissance bi phas phasique. Ceci s'explique par la consomma tion de la source de carbone la plus aisément assimilab le, puis une adaptation durant laquelle les enzymes servan t à dégrader la seconde source de carbone son t synthetisées, puis consomma tion de la deuxieme source de carbone. L'ana lyse de ce compor tement a permis à Jacques Monod de déf inir la notion d'opéron d'opéron..