WOLLJUNG Florian
VINCENT Quentin
Rapport de travaux pratiques de MICROBIOLOGIE DES EAUX USEES Génie Biologique – Génie de l’Environnement
WOLLJUNG Florian VINCENT Quentin GB2-GE-TPB
Dates : 11, 14 et 16 mars 2011 Page 1 sur 7
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I – But de l’expérience : Il s’agit d’étudier la population bactérienne d’eaux usées traitées biologiquement en les évaluant quantitativement et qualitativement. L’étude quantitative se porte sur l’évaluation de la concentration bactérienne des eaux et l’étude qualitative sur l’indentification de quelques souches. Le milieu dans lequel vivent les bactéries est la boue activée. Au niveau de la station d’épuration, elle se situe dans le bassin d’aération. Ce sont ces bactéries qui dégradent la matière organique et assainissent l’eau. Leurs contrôles dans une station d’épuration est essentiel afin de garantir une bonne épuration c’est pourquoi nous sommes amenés à étudier cette population. Nous nous cantonnerons à des analyses simples en vue d’une première approche de ces boues activées.
II – Principe : L’analyse quantitative de la concentration bactérienne se fait par dilution en cascade. Le principe est de diluer régulièrement un millilitre de boues activées et de compter le nombre de bactéries en ensemençant les dilutions. Comme une colonie provient d’une bactérie initiale, le comptage de colo nies sur les boites nous permet de savoir la concentration bactérienne dans les boues activée (on dénombre plutôt des UFC (Unité Formant une Colonie) car deux bactéries proches peuvent former une grosse colonie, ce qui fausse les résultats). L’indentification de certaines souches bactériennes se fait par la détermination de leurs caractères culturaux, morphologiques et biochimiques. Leurs caractères culturaux se déterminent par l’observation à l’œil nu de différents paramètres concernant l’aspect des colonies. Les caractères morphologiques s’établissent à travers quelques observations et test rapides (coloration de Gram). Les caractéristiques biochimiques vise à déceler la présence ou non d’arsenal enzymatiques en mettant la souche bactérienne avec différents substrats (éventuellement en rajoutant des molécules permettant la visualisation coloré d’une réaction (indicateurs de pH, d’oxydoréduction …))
III – Matériels et Méthodes : 1) Le dénombrement : Il s’agit de prélever 1 mL de boues activée s et de l’introduire dans 9 mL d’eau -1 physiologique (dilution au 10 ). Après homogénéisation, on préleve 1 mL de la -1 -2 dilution au 10 que l’on introduit dans 9 mL d’eau physiologique (dilution au 10 ) -7 etc… Nous réalisons des dilutions en cascades jusqu'à 10 . On ensemence ensuite Page 2 sur 7
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avec 0,1 mL des dilutions 10 10 10 10 et 10 , une boite de PCA (Plate Count Agar) pour chaque dilution, par étalement en surface.
2) L’identification: Il s’agit dans un premier temps de purifier la souche. Comme dans les b oues activées la population bactérienne est dense et variée, nous devons impérativement purifier la souche que l’on souhaite identifier. Pour cela, on réalise des isolements répétitifs jusqu'à obtenir une souche pure. Les caractéristiques morphologiques seront établies par l’observation du type de colonie, grâce à l’état frais et la réalisation de la coloration de Gram. Mis à part le test de la respiration enzymatique, les caractères biochimiques seront déterminés par l’ensemencement d’une micro -galerie API.
IV – Résultats : 1) Observations générales : Avant tout dénombrement ou identification, nous sommes amenés à observer à l’état frais et par une coloration de Gram un échantillon de boue activée. A l’état frais, nous observons beaucoup d’eucaryotes mobi les et de procaryotes immobiles. Il y a présence de grand filament qui est surement de la matière organique sous forme de floques. A la coloration de Gram, nous constatons à la fois des bâtonnets roses (Gram –) et des coques violet (Gram +).
2) Le dénombrement : Dilutions Nombre d’UFC
-3
10 30
-4
10 3
-5
10 1
-6
10 0
-7
10 0
Dans l’analyse des eaux usées, il n’y a pas de normes concernant le nombre d’UFC nécessaire ni de limites à prendre en compte pour les résultats. Nous pouvons alors déterminer le nombre d’UFC par mL de boues activées:
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Avec : ∑c : somme des colonies présentes sur la boîte à prendre en compte n1 : nombre de boîtes à prendre en compte à la première dilution effectuée n2 : nombre de boîtes à prendre en compte à la deuxième dilution d1 : première dilution effectuée V : volume de l’inoculum en mL A.N : 5
[UFC] = (30+3+1) * -3 (1+0,1*1)*10
1 = 3,1. 10 UFC/mL de boue. 0,1
3) L’identification : Lorsque nous avons fait le premier ensemencement, nous avions obtenue différents type de colonies. Nous avons sélectionné deux types de souche que l’on nommera A et B. Après purification, voici leurs caractéristiques culturales et morphologiques :
Caractères culturaux Souche
A
B
Milieux
PCA
PCA
Pureté
Pure
Pure
moyenne
petite
ronde
ronde
bombée
bombée
réguliers
réguliers
lisse
lisse
crémeuse
crémeuse
Taille Forme Surface Bords Aspect Consistance Odeur Pigmentation Type
1
1
Pas d’odeur particulière Pas d’odeur particulière
crème
crème
S
S
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: La notion de pure indique qu’il n’y a qu’un seul type de colonie sur la gélose et que les caractéristiques à l’Etat Frais et à la coloration de Gram montre nt un
même type de souche. Nous constatons que les caractères culturaux sont quasiment identiques entre les deux souches étudiées A et B. Leurs différences s’observe nt plus lors dans les caractères morphologiques. Caractères morphologiques
Manipulations Souche
Etat frais /Gram Morphologie
Etat frais Mobilité
Gram Coloration
Gram
A B
bâtonnet bâtonnet
mobile immobile
rose rose
Gram Gram -
La différence entre les deux souches est leur mobilité. Afin de poursuivre l’indentification, il faut déterminer les enzymes que possèdent les souches : il s’agit des caractéristiques biochimiques. Caractères biochimiques Test de l’enzyme respiratoire : Comme nous avons des bâtonnets Gram -, le test oxydase est obligatoire. Nous avons tout de même effectué un test catalase. Enzyme testée
Souche
Observations Interprétation Conclusion Coloration rose du Oxydation du A Oxydase + disque paraphénylène-diamine Oxydase Coloration rose du Oxydation du B Oxydase + disque paraphénylène-diamine Apparition de A 2H2O2 2H2O + O2(gaz) Catalase + bulles Catalase Apparition de B 2H2O2 2H2O + O2(gaz) Catalase + bulles Aucune différence n’est encore visible puisque les enzymes respiratoires sont identiques. Comme il s’agit de
bâtonnet Gram – et Oxydase +, nous choisissons une galerie
API 20E. Normalement, nous aurions du utiliser une galerie API 20 NE (Non Enterobactérie) car les Enterobacteries ne possède pas l’oxydase. Mais une galerie API 20E ou 20NE ont principalement les mêmes caractéristiques.
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Microgalerie API 20E :
Fiche API de la souche A
Fiche Api de la souche B
Les deux souches identifiées sont : Souche A = Aeromonas hydrophila (76,5%) Souche B = Pasteurela multocida (99,4%)
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V –Interprétations : 1) Le dénombrement : La normalisation concernant la concentration en population bactérienne n’est pas établie. En fait, ce paramètre est pris en compte dans la législation à travers les caractéristiques physico- chimique des boues, c’est à dire la Matière Organique (la MVS=Matière Volatile Solide est le caractère le plus représentatif de la biomasse épuratoire). Concernant la concentration obtenue, on a pu constater que les dilutions effectuées étaient trop élevée. En effet, les eaux usées de la station de Drunsenheim sont faiblement chargées en matière organique (résultats en adéquation avec ceux obtenue en TP eaux usées) et de telle dilution n’était pas nécessaire.
2) L’identification: Aeromonas hydrophila est une souche très répandue dans les boues de stations d’épuration. Aeromonas hydrophila a une répartition géographique mondiale dans les eaux douces, les eaux de faible salinité, la vase, les sédiments et, d’une manière générale, l’environnement aquatique constituent l’habitat principal de ce germe. Avec Pseudomonas sp. il s’agit d’un germe lipolytique : il dégrade les graisses présent dans les eaux usées. Leurs présence est donc habituelle et indispensable (P.CHAPPE La microflore des boues aérobies acclimatées à des teneurs élevées en graisses ).
Cependant, l’indentification de Pasteurela multocida est beaucoup plus douteuse. Ce germe n’est pas une bactérie habituellement rencontré e dans les boues de station d’épuration. En effet, les Pasteurella sont des hôtes obligatoires des animaux, des vertébrés surtout, chez qui ils se comportent comme des commensaux de la cavité buccale et qu'on isole de la salive. Elles peuvent survivre quelque temps dans le milieu extérieur mais ne s'y développent pas. De ce fait, leurs présences dans les boues activées aérobie est surprenante. Nous supposons donc que l’i dentification est incertaine. Il faudrait donc refaire une galerie API20E pour vérifier ce résultat.
V –Conclusions : 5
La concentration bactérienne dans les boues activées est d’environ 3.10 UFC/mL de boue. Parmis la variété de souche présente dans les boues, nous avons indentifié ème Aeromonas hydrophila et Pasteurela multocida (l’identification certaine du 2 germe reste sous réserve). Page 7 sur 7
