Subiecte practic microbiologie 2011 1. Efectuati si colorati un frotiu din cultura bacteriana Prin examinarea unui frotiu ne intereseaza: celularitatea, forma bacteriilor, tinctorialitatea. Exista 2 posibilitati de efectuare a preparatelor microscopice: preparate proaspete native si frotiuri (preparate uscate, fixate si colorate). Frotiurile se pot efectua din diferite produse care contin germeni microbieni: direct dintr o cultura sau dintr un prelevat de la bolnav (puroi, sputa, sange). Tehnica efectuarii frotiurilor cuprinde mai multe etape: Intinderea Uscarea Fixarea Colorarea Intinderea: se face pe o lama curata pe care se pune cu ansa bacteriologica sterilizata o picatura de ser steril; se sterilizeaza din nou ansa si apoi se descarca cu ea o pic foarte mica din cultura de studiat. Se omogenizeaza bine cu serul. Se lasa sa se usuce la temperatura camerei. Dupa uscare trebuie sa aiba aspectul unei pelicule fine. Prin fixare se realizeaza aderarea preparatului pe suprafata lamei pentru a nu se indeparta prin spalare, cu pastrarea structurii celulare a microorganismelor. Celulele bacteriane fixate au o tinctorialitaet mai maro decat celulele vii ce sunt impermeabile la coloranti. Fixarea se realizeaza prin caldura, trecandu se lama desupra flacarii unui bec de gaz de 2-3 ori. Colorarea poate fi: Simplacu albastru de metilen Dublacoloratia Gram sau coloratii speciale: May-Grunwald, Giemsa, col pt capsula, spori, cili. Coloratia cu albastru de metilen: Se acopera frotiul cu albastru de metilen 3-4 min, apoi se spala cu apa distilata; se usuca la temp camerei sau cu hartia de filtru si se examineaza la microscop. Coloratia Gram: Se face din cultura; germenii gram + apar colorati in violet, deoarece violetul de Gentiana este retinut in interior datorita acidului muramic din peretele bacterian. Germenii gram – se coloreaza in rosu pentru ca au mai
multe structuri lipidice, iar preparatul solubilizat cu alcool si acetona pierde violetul de Gentiana si ulterior se coloreaza in rosu cu fuxina. Germeni gram +: coci (stafilococ, streptococ, pneumococ), bacili (antrax, tetanic, gangrenei gazoase) Germeni gram -: coci (meningococi, gonococi), bacili ( shigella, salmonela, klebsiela, brucela, bordetela) Se acopera frotiul cu violet de gentiana 1-1,5 min; se spala cu apa din abundenta; se pune fixatorul (sol lugol) un timp dublu, se spala bine; se pune decolorantul (sol alcool-acetona) maxim 10 min; se spala si se acopera cu fuxina 1 min; se spala si se examineaza. Coloratia Zeihl-Neelsen: Se utilizeaza pt evidentierea BAAR (tbc, leprae) Frotiul se acopera cu fuxina fenicata, se lasa 10 min, se incalzeste in flacara de 3-4 ori pana se emana vapori. Nu se fierbe. Se spala bine, se acopera cu alcool-acid clorhidric si se lasa 1 min. Se spala si se examineaza. Apar rosii doar BAAR. Se pune albastru de metilen pt a aparea BAAR pe un fond albastru.
2. efectuati si colorati un frotiu din produs patologic idem 1 3. colorati prin metoda Ziehl-Nielson un frotiu din sputa Prin examinarea unui frotiu ne intereseaza: celularitatea, forma bacteriilor, tinctorialitatea. Se practica in diagnostiul TBC. Bacilul tuberculos este BAAR datorita peretelui celular f gros si nu permite efectuarea unei coloratii obisnuite. Aceasta coloratie se utilizeaza pentru evidentiarea BAAR. Frotiul se acopera cu fuxina fenicata concentrata, se lasa 10 min; in acest timp se incalzeste la flacara de 3-4 ori pana se emana vapori. Nu se fierbe. Se spala bine, se acopera cu sol alcool-hcl si se lasa 1 min. Se spala, se pune albastru de metilen 1 min, se spala. Se examineaza. BAAR apar rosii pe un fond albastru.
4. insamantati un produs patologic pe o placa petri cu geloza in vederea izolarii germenilor Insamantarea si izolarea germenilor are drept scop obtinerea unor populatii microbiene suficiente cantitativ, evitarea contaminarii produsului cu agenti straini si izolarea fiecarei tulpini
microbiene. Se realizeaza in conditii de riguroasa sepsie; ansa bacteriologica se sterilizeaza la becul de gaz pana la inrosire, apoi se ia recipientul din care vom recolta produsul, se scoate dopul. Se trece gatul recipientului prin flacara si se ia cu ansa o portiune de inocul. Se flambeaza din nou recipientul si se inchide dopul. In cazul tehnicii dispersiei cu ansa pe medii solide se procedeaza astfel: cu ansa bacteriologica incarcata cu cultura sau produs patologic se descriu pe suprafata unui mediu solid, turnat intr o placa petri, straturi paralele de linie franta ce apar sub forma unui poligon neinchis cu 5-6 laturi. Dupa descarcarea fiecarei laturi, ansa se sterilizeaza prin incalzire pana la incandescenta. Se poate realiza si cu ajutorul unui tampon incarcat cu produs patologic (exudat faringian) care se descarca bine pe toata suprafata placiise obtin colonii izolate, portiuni mici ce se obtin pe suprafata unei geloze. In functie de aspectul coloniei izolate se poate preciza specia si daca este virulenta sau nu. 5. antibiograma difuzimetrica. Principiu, interpretare Antibiograma reprezinta studiul sensibilitiatii unei tulpini bacteriene fata de agentii antimicrobieni terapeutici. Antibiograma este indicata in infectiile bacteriene cu tulpini care au o sensibilitate variabila la antibiotice. Este indicata in infectiile severe care necesita tratamente masive, in infectiile localizate cu tendinta de colonizare pentru combaterea infectiilor din spital etc. Nu este indicata atunci cand agentul etiologic are o sensibilitate cunoscuta, in caz de infectie usoara cu tendinta de vindecare fie spontana, fie in urma unui tratament standard. Germentul testat pentru sensibilitatea la antibiotice, incriminat in etiologia infectiei trebuie sa fie din cultura pura. Antibiograma se realizeaza in vitro, prin urmatoarele metode: difuzimetric si metode cantitative ce folosesc tehnica dilutiilor in medii de cultura lichide sau solide.
Metoda difuzimetrica: sensibilitatea bacteriei la un anumit antibiotic este apreciata dupa marimea diametrului zonei de inhibitie a cresterii, din jurul antibioticului respectiv. Metodele difuzimetrice constau in insamantarea bacteriilor pe suprafata unui mediu solid pe care se vor aplica antibioticele. Sensibilitatea bacteriei la un anumit antibiotic este apreciata dupa marimea diametrului zonei de inhibitie a cresterii din jurul antibioticului respectiv. Mediul utilizat este mediul Muller-Hinton, deoarece valoarea sa nutritiva permite cultivarea majoritatii germenilor si nu contine inhibitori pentru substantelor antimicrobiene. Mediul trebuie turnat gros, nu mai mic de 4 mm. Inoculul bacterian standardizat se insamanteaza prin inundarea si scurgerea de exces si prin insamantarea uniforma cu tamponul de vata sau pipeta Pasteur. Dupa ce suprafata mediului s a uscat, cam dupa 20 de min, se depun microcomprimatele cu o pensa presand usor fiecare antibiotic pe suprafata si avand grija ca intre fiecare sa fie o distanta de 3 cm si 1,5 cm fata de marginea placii. In functie de germenul studiat se alege un anumit tip de antibiotice care se testeaza. Pe fiecare microcomprimat este inscris simbolul antibioticului respectiv si un nr. Se lasa placile pe masa la prodifuzie 15 min. Apoi se rastoarna placa si incubeaza la 37 de grade celsius, 18-24 de h. In jurul fiecarui antibiotic apare o zona de inhibitie a cresterii. Citirea se face masurand cu rigla gradata in 2-3 directii diametrul fiecarei zone. Se recomanda replicarea coloniilor aparute in vederea retestarii la antibiotice. Exista tabele care se refera la numarul antibioticului, la simbol, cantitati, rezistenta la antibiotic in functie de diametru: rezistent, intermediar, sensibil. Erorile pot aparea datorita: inoculului prea sarac sau prea bogat, datorita mediului prea gros sau pastrarii necorespunzatoare a antibioticelor, sau pot fi erori de citire.
6. imunograma. Principiu, interpretare. Se mai numeste hipersensibilitate celulara sau raspun imun mediat de celule. 7. diagnosticul bacteriologic in infectiile streptococice Streptococii piogeni: sunt sferici, dispusi in lanturi, imobili, nesporulati. In cultura proaspata poseda capsula. Se recolteaza exudat naso-faringian, secretie otica, puroi, sputa, urina, sange, secretie conjunctivala. Probele de laborator care nu se pot insamanta in timp util se introduc in medii de conservare si imbogatire. Examenul microscopic se efectueaza pe frotiuri din produs patologic, coloratie Gram sau cu albastru de metilen. Se pun in evidenta coci Gram +, asezati in lanturi mai lungi sau mai scurte. Se cultiva pe medii de cultura imbogatite, pe mediul geloza-sange prin tehnica poligon deschis. Se descarca tamponul pe suprafata unui mediu geloz-sange din placa petri, apoi diseminarea se face cu ansa. Dupa incubare la termostat 37 de grade timp de 18-24 h se face citirea rezultatelor. Dupa caracterele activitatii hemolitice avem: streptococ de tip beta, alfa, alfa’;sau nu produce hemoliza:gamma. Exista mai multe tipuri de colonii: Mucoase, rotunde, regulate, cu suprafata bombata, lucioase sunt caracteristice streptococilor virulenti. Mate, rotunde, de consistenta apoasa, regulate, cu aspect de harta. Colonii rotunde, mici, bombate, translucide, cu forme mai putin virulente. R, uscate, cu margini neregulate, cu suprf mucoasa. Grupurile serologice A,B,C,G se identifica prin metode biochimice, serologice, enzimatice. Testul la bacitracina se foloseste pt A; se realizeaza inhibarea streptococilor de tip A cu bacitracina. Antibiograma nu se realizeaza pentru grupul A, deoarece este sensibil la penicilina. In cazul persoanelor alergice, antibiograma se realizeaza. Identificarea serologica a grupului se
realizeaza prin reactiile de precipitare in tuburi. Extractul de antigen care contine carbohidratul de grup, se pune in contact cu seruri specifice de grup. Apare un inel de precipitare dupa 10-20 de min. Pentru identificarea tipului serologic se utilizeaza: Reactia de aglutinare pe lama cu seruri specifice Reactia de precipitare. Diagnosticul imunologic: se realizeaza reactia ASLO si se mai evidentiaza anticorpii antipolizaharid C sau M. Diagnosticul biologic consta intr-o serie de teste cutanate pentru decelerarea imunitatii antitoxice sau a starii de hipersensibilitate la antigene streptococice (streptolizina O). Streptococus pneumoniae: Pneumococii: coci ovalari, dispusi in diplo, imobili, nesporulati, gram +, tulpinile virulente poseda capsula. Descompun glucoza pe cale fermentativa. Produs patologic: sputa, aspirat bronsic, exudat faringian, pleural, puroi, urina, sange. Probele de laborator care nu se pot insamnta in timp util se introduc in medii de conservare si imbogatire. Sputa in infectiile pneumococice este visinie, puroiul este cremos, verzui. Frotiurile se coloreaza Gram si cu albastru de metilen. La microscop se evidentiaza coci ovalari, dispusi in diplo, imobili, nesporulati, gram + cu aspect de vf de lance. Daca in produs exista pneumococ se efectueaza identificarea tipului serologic prin reactia de umflare a capsulei; se realizeaza cu preparat proaspat ser specific si albastru de metilen. In cazul prezentei tipului corespunzator serului imun se observa aglutinarea germenilor si marirea in volum a capsulelorapar nijte halouri cu margini bine delimitate. Se face insamantarea pe medii de cultura solide (gelozasange), imbogatite cu sange si in atmosfera de CO2; coloniile sunt mici, sub 1 mm, transparente. Pe mediile lichide se tulbura mediul cu formare de depozit pe mediile cu sange, coloniile sunt inconjurate de o zona de hemoliza de tip alfa. Se poate inocula
produsul patologic la soarecii albi, care dupa 24-48 de ore fac septicemie. Identificarea pneumococilor se face cu teste biochimice sau serologice: Biloliza: pneumococul este sensibil la actiunea sarurilor biliare si se diferentiaza de genul Viridens care ramane opalescent. Testul sensibilitatii la optochim: pneumococii sunt f sensibili si dau o zona mare de inhibitie. Fermentarea inulinei: zaharul este fermentat doar de pneumococ si se produce un viraj de culoare din albastru in galben. Identificarea serologica se realizeaza prin reactia de aglutinare si prin umflarea capsulei. Streptococii sunt sensibili la penicilina, eritromicina, tetraciclina. 7. reactia ASLO. Principiu, interpretare Este o reactie antigen anticorp. Anticorpii antitoxici antistreptolizina O sunt decelati pt diagnosticul infectiilor streptococice. Streptolizina O este o enzima produsa de streptococi, care lizeaza hematia. Majoritatea bolnavilor prezinta o crestere a tritrului antristreptolizinei O (ASLO), iar reactia de punere in evidenta este ASLO. Titrurile de pana la 200 de U ASLO/ml de ser sunt considerate normale. Valoarea crescuta a ASLO se mentine in mod normal 3-5 sapt de la debutul infectiei streptococice. Persistenta anticorpilor in titruri inalte timp indelungat sugereaza hipersensibilitate la antigenele streptococice, urmata de instalarea complicatiilor poststreptococice. Principiul reactiei: punerea in contact a anticorpilor ASLO cu streptolizina O duce la neutralizarea activitatii sale hemolitice. In acest scop, intr un sir de eprubete se pun : ser de cercetat in dilutii succesive, streptolizina O, hematii (flosite ca indicator).
Reactia negativa este data de prezenta hemolizei, indicand absenta anticorpilor ASLO, astfel ca ciclul litic al SL O asupra hematiilor nu este anihilata. Reactia pozitiva este evidentiata prin absenta hemolizei si indica prezenta anticorpilor ASLO ( se formeaza butoni de hematii). Ultima eprubeta unde nu apare hemoliza indica prezenta anticorpilor ASLO. Normal trebuie sa fie mai mic de 200 U ASLO. In practica se fac 3 determinari si se urmareste curba anticorpilor. Se folosesc 5 tuburi care contin: cantitate standard de streptolizina O, hematii si dilutii din serul pacientului: 1/100, 1/250, 1/500, 1/800, 1/1250. ASLO se foloseste pentru diagn si pentru monitorizarea tratamentului. 8. diagnosticul de laborator in infectiile stafilococice Diagnosticul imunologic nu este concludent, pentru ca sunt foarte raspandite in natura. Exista 3 tulpini: stafilococul alb (epidermis), galben si auriu. Cel care determina cele mai multe imbolnaviri:acnee vulgara, furuncule, abcese, flegnoane, infectii urinare, toxiinfectii alimentare etc. Caractere generale: coci sferoizi, dispusi in gramezi neregulate, imobili, nesporulati, gram +. Produse patologice recoltate: puroi, sputa, exudate, urina, materii fecale, sange. Puroiul este de consistenta groasa, de culoare aurie. Se executa frotiuri colorate Gram sau cu albastru de metilen se observa la microscop coci grupati in ciorchini, leucocite. Puroiul dintr o leziune inchisa se insamanteaza pe mediu de geloza si se observa forma coloniilor, pigmentul produs si hemoliza. Daca puroiul provine dintr o leziune deschisa se insamanteaza pe medii hiperclorurate (7,5% NaCl) care inhiba majoritatea bacteriilor cu exceptia stafilococilor. Se foloseste
mediul de imbogatire Chapman. Coloniile stafilococice sunt de 1-3 mm, in jurul lor aparand zone clare de hemoliza, relativ mici. Identificarea: pe frotiu colorat gram, prin caractere de cultura (colonii S) Caractere biochimice: testul coagulazei: stafilococii patogeni au proprietatea de a coagula plasma. Coagulaza poate fi libera, recoltata pe un anticoagulant sau legata la nivelul peretelui bacterian testul de fermentatie a manitolului: stafilococii patogeni sunt manitolopozitivi lizotipie testul fosfatazei: stafilococii secreta fosfataza care scindeaza fosfatul de fenolftaleinaculoarea mediului vireaza spre roz. Se efectueaza antibiograma, pentru testarea sensibilitatii la agentii terapeutici. 10. identificarea serologica a unei tulpini bacteriene izolate prin hemocultura la un bolnav febril Izolarea prin hemocultura se realizeaza astfel: se recolteaza de 3-4 ori sange in pusee febrile, fara a se adminstra antibiotice, folosind un sistem de circuit inchis. Apoi se insamanteaza pe mediu lichid. Se pune la termostat si urmareste timp de 10 zile. Daca exista inmultire microbiana, mediul devine tulbure. In acest caz se face trecere pe mediu solid, obtinanduse culturi pure. Tulpinile prezinta un comportament biochimic de gen salmonella, pe mediile diferentiale multitest, vor fi obligatoriu identificate serologic cu seruri imune de diagnostic anti salmonella. Aceste seruri sunt: ser anti-VI (antigen de virulenta pseudocapsular si datorita acestuia sunt invazivi) ser polivalent O anti-salmonella
seruri de grup O, ser AO, BO, DO, EO seruri monovalente flagelare anti H de faza specifica: a, b, c, d, i, r seruri monovalente flagelare ani H de faza nespecifica: 1, 2, 5 Se pot face reactii de aglutinare pe lama ce pot fi executate din cultura pura geloza inclinata, nu de pe mediu selectivdiferentiale. Se fac reactii de aglutinare in tuburi. Se face intai aglutinarea cu ser fiziologic pentru a indeparta tulpinile degradate antigenic si avirulente de tip R. Tulpinile S ce nu aglutineaza cu ser fiziologic, se vor testa cu serurile polivalente si anti VI. Salmonella Typhi fara Ag de invelis VI se va aglutina cu ser polivalent si nu aglutineaza cu serul anti VI; tulpinile cu Ag VI partial degradat vor aglutina cu ambele seruri, iar tulpinile cu Ag VI intact vor aglutina numia cu serul anti VI. Dintre toate genurile de salmonella, salmonella typhi va aglutina cu serul specific de grup DO si cu serul flagelar ani alfa. Identificarea celorlalte serotipuri se face prin determinarea structurii antigenice: aglutinarea tulpinii cu ser polivalent confirma diagnostic de gen aglutinarea cu seruri somatice de grup precizeaza serogrupul din care face parte aglutinarea cu serurile flagelare precizeaza apartenenta la un anumit sero-tip deci identificarea serologica a salmonelelor vizeaza determinarea genului, sero-grupului si sero-tipului. 11. identificarea serologica a unei tulpini bacteriene izolate prin coprocultura de la un bolnav cu sindrom dizenteric Germenii genului shigella produc la om dizenteria bacilara si toxiinfectiile alimentare. Identificarea serologica a unei tulpini de shigella vizeaza stabilirea structurii antigenice a tulpinii de bacil
difteric, izolata dintr un produs patologic si urmareste incadrarea intr una din cele 4 subgrupe antigenice: subgrupa A: corespunde shigellei dysenteriae, are 10 serotipuri subgrupa B: corespunde shigellei flexneri, are 6 serotipuri principale si mai multe subserotipuri subgrupa C: corespunde shigellei boydii, are 15 serotipuri subgrupa D: corespunde shigellei sonnei (tip S sau R) Identificarea serologica a germenilor shigella se face prin reactia de aglutinare pe lama utilizant seruri aglutizante antidizenterice. Reactia se executa cu tulpini dezvoltate pe mediul multitest TSI. Se folosesc urm seruri aglutizante antidizenterie: seruri pt subgrupa A, B, C, D. Se executa aglutinarea pe lama fata de serul fiziologic in vederea selectarii formelor S. Aceasta reprezinta martorul negativ. Dupa aceea se face aglutinarea pe lama cu tulpini care se cerceteaza cu serurile: serul polivalent anti flexneri, serul anti sonnei S si R. Daca reactia este pozitiva, se mai face inca nu test de confirmare: reactia de aglutinare in tuburi. 12. caracterizati comportamentul biochimic al unei enterobacterii insamantate pe medii diferentiale Familiei enterobacteriilor ii apartin grupele: escherichia, shigella, salmonella, klebsiella, proteus, yersiniae. Caracterele biochimice servesc la identificarea bacteriilor, in functie de unele enzime pe care le detin. Caracterul biochimic reprezinta comportamentul unor bacterii fata de diverse reactii chimice aparute sau nu in metabolismul lor in functie de mediul pe care au fost insamantate. Medii multitest: AABTL: mediu albastru-verde, vireaza spre galben in urma fermentarii lactozei
TSI: triplu sugar MIU: mobilitate, indol, uree; mediul este galben, vireaza spre rosu datorita producerii ureazei Testul Simons: de la verde vireaza la albastru. Escherichia Coli Se insamanteaza pe AATBL si pe ADCL. Este lactozo +, glucozo +, degajare de gaz. Nu produce hidrogen sulfurat. Pe MIU uree -, produc indol, unele tulpini sunt mobile. Pe Simons nu foloseste citratul de Na ca sursa de carbon. Klebsiella Se insamanteaza pe medii lactozate, pe care apar colonii mucoase. Pe baza caracterelor biochimice se face diferentierea intre specii de klebsiella: Klebsiella pneumoniae: lactozo +, glucozo + cu producere de gaz, foloseste citrat de Na ca sursa unica de carbon. Klebsiella ozenae: lactozo +, glucozo + fara degajare de gaz, foloseste citrat de Na. Klebsiella rhinoscleromatis: lactozo -, glucozo – si nu foloseste citratul de Na. In general Klebsiella este germene lactozo + si vireaza culoarea AABTL de la verde-albastru la galben. Shigella Se insamnateaza pe TSI, MIU, Simons Este lactozo -, glucozo +, fara producere de gaz, nu fermenteaza zaharoza si nu produce H2S. Este uree -, nu produce indol, este imobila. Nu foloseste citratul de Na ca sursa unica de carbon. Salmonella Pe mediul Willson Blair: colonii mici, negre, aderente la mediu cu luciu si halou metalic Pe ADCL: la 18 ore: colonii lactozo -, de talie mica si mijlocie cu margini semitransparente care nu modifica nuanta mediului.
Pe ADCL: la 48 de ore: colonii lactozo -, cu centrul negru datorita prod de H2S. Pe TSI: glucozo + cu producere de gaz, degajeaza H2S. Pe MIU: uree -, nu produce indol si este mobila. Yersinia Este lactozo -, glucozo -, nu fermenteaza zaharoza, fara H2S, sunt imobili si uree -. Proteus Este lactozo -, pe TSI este lactozo + si glucozo -, produce gaz si H2S. Pe MIU este f mobil, uree +. Pe ADCL este lactozo + si vireaza spre rosu (neg nu vireaza), produce H2S. 13. testul ELEK. Principiu, interpretare Principiu: intr o placa petri cu geloza se face un sant central. Se scoate geloza din santul respectiv si se toarna un strat subtire de geloza pe fundul santului. Dupa ce s a intarit geloza in sant se pune ser antidifteric. (antitoxic). Pe restul placii se insamanteaza tulpinile de bacili difterici de studiat, in striuri perpendiculare pe santul central. De asemenea se insamanteaza si o tulpina martor sigur toxicogena. Se incubeaza placa timp de 24 de ore la 37 de grade. Interpretare: tulpinile de bacil difteric crescand la termostat elibereaza toxina ce va difuza in gel, iar din santul central anticorpii antidifterici vor difuza perpenticular. La locul de intalnire a antigenului cu anticorpii va aparea o linie de precipitare vizibila. Aparitia la anumite unghiuri dintre tulpina insamantata si santul cu ser antidifteric a unei linii de precipitare arata ca tulpina este producatoare de toxina. 14. reactia ASCOLI. Principiu, mod de lucru, interpretare Reacţii de precipitare în inel Reacţia de precipitare în inel, constă în punerea în contact a Ag şi Ac astfel încât să nu se amestece; reacţia care apare la
interfaţa dintre Ag şi Ac se concretizează printr-un inel de precipitare albicios. Se utilizează pentru identificarea originii petelor de sânge (reacţia Uhlenhut, în medicina legală) şi pentru identificarea provenienţei unor preparate pe bază de carne (în industria alimentară). Demonstrativ, în cursul lucrărilor practice, reacţia de precipitare în inel (reacţia Ascoli) se poate utiliza pentru identificarea prezenţei antigenului cărbunos (Ag obţinut de la Bacillus anthracis). Istoric, soluţia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splină) recoltate de la un animal care a decedat şi pentru care se suspecta că decesul a fost produs de o infecţie generalizată cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojara în soluţie de clorură de sodiu sterilă, adăugându-se ulterior câteva picături de acid acetic, apoi se menţinea la temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. După decantarea şi alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea şi rezulta soluţia antigenică. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacţie şi 2 tuburi martor. În primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticărbunos şi 0,5 ml soluţie salină fiziologică iar în al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal şi 0,5 ml soluţie de antigen. În ceea ce priveşte tubul de reacţie trebuie să pipetăm întâi 0,5 ml din serul anticărbunos, urmând ca soluţia de antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent, eventual prin “scurgere picătură cu picătură” pe peretele interior al tubului, în aşa fel încât cele 2 soluţii să nu se amestece. În cazul reacţiei pozitive (prezenţa Ag cărbunos în soluţia antigenică), după circa 5 minute, la interfaţa dintre cei 2 reactivi apare un “inel” de precipitare. 15. reactia Bordet-Wasserman. Principiu, interpretare Este o reactie de fixare a complementului ce foloseste drept Ag cardiolipina. Acesta se foloseste in diagnosticul serologic al sifilisului (treponema pallidum). Este o reactie semicantitativa ce determina gradul de pozitivitate.
Principiu: este similar cu o reactie de fixare a complementului avand 2 faze. Ag (cardiolipina) se pune in contact cu o cantitate titrata de complement si cu ser de la bolnav inactivat 30 de min la 56 de grade. Dupa ce s au pus in contact cele 3 componente, putem avea 2 posibilitati: reactia este pozitiva, adica in ser exista Ac si s au format complexe cardiolipina-Ac de care s a legat complementul (complementul se leaga de Ag numai daca acesta s a legat de Ac). Reactia este negativa: in ser nu exista Ac, iar cardiolipina este libera. Peste reactia anterioara se adauga sistem hemolitic, format dintr o suspensie de hematii ce au Ac fixati pe suprafata lor. Pentru ca rezultatul reactiei sa fie corect trebuie ca aceasta suspensie de hematii sa nu se autohemolizeze. Interpretare: daca reactia este pozitiva, complementul este legat de complexul Ag-cardiolipina si nu va liza hematiile nu se produce hemoliza. Daca reactia este negativa, complementul este liber si va liza hematiile se va produce hemoliza. Putem avea si o hemoliza partiala, deoarece dupa fixarea complementului de complexul Ag-cardiolipina, poate ramane o cantitate de complement libera care va produce hemoliza. 16. exudatul faringian. Mod de recoltare, insamnatare, interpretare Modul de prelevare a produselor patologice destinate examinarii bacte-riologice conditioneaza in mod direct eficienta etapelor ulterioare, in final, obtinerea unui rezultat fidel. Reguli generale: prelevarea trebuie executata de catre medic sau cadru medical mediu, sub directa supraveghere a acestuia, in conditii stricte de asepsie,
prelevatul sa fie obtinut direct din leziune, astfel incat produsul patologic sa contina portiunile cele mai caracteristice ca semnificatie etiologica, prelevarea sa fie executata inainte de inceperea terapiei cu antibiotice sau la 48h de la intreruperea ei. Pe buletinul de trimitere se va specifica tipul antibioticului si doza aplicata, e necesar a se recolta cantitati suficiente de produs, pentru a face posibile toate examenele, inclusiv cele indicate ulterior, fiecare produs trebuie recoltat in recipiente sterile, de unica folosinta sau recipiente de sticla sterile, fara urme de antiseptice, - un recipient va contine un singur produs: proba unica recoltata de la un singur bolnav, recipientul care contine produsul va fi etichetat: nume, prenume pacient; pavilion, salon; pentru fiecare proba se intocmeste Buletin de trimitere - Buletinul de analize contine rubrica cu rezultatul examinarii. - recipientele in care se recolteaza produsele de examinat, sunt: * sterile, inchise etans, * din material transparent( sticla, mat. plastic), * dop, capac ce se deschid prin desurubare, * cu sau fara medii de conservare si transport, * pentru germeni anaerobi, conditii speciale de recolta, cu evitarea contactului cu aerul atmospheric. TRANSPORTUL PROBELOR catre laboratorul de microbiologie se efectueaza in cel mai scurt timp posibil de la momentul recoltei,
- se efectueaza in recipiente sterile, insotite de buletine de analiza corect completate, Lcr si hemoculturile se transporta imediat, la temperatura corpului,constituind urgente majore, in suspiciune de flora anaeroba, produsul se transporta in seringa, cu evitarea contactului cu aerul atmospheric, in cel mai scurt timp,se folosesc la nevoie medii de conservare si transport: Stuart, Amies, Cary- Blair. se efectueaza doar de catre persoane instruite in acest scop, timpul maxim admis de la recoltarea produsului este de 1 ora, dupa care, rezultatul este compromis. ● Exsudatele si transsudatele seroaselor (lichide pleurale, peritoneale, articulare): recoltarea se efectueaza prin punctie cu seringa, in conditii riguroase de asepsie, necesari 10- 15 ml, in cazul lichidelor pleurale si peritoneale si 4- 5 ml pentru cele articulare, pentru suspiciunea etiologiei cu flora anaeroba, produsul patologic ramane in seringa impins pana la ambou, fara contact cu aerul atmosferic, inchis ermetic, este total contraindicata recoltarea florei anaerobe cu tamponul. ● Exsudatul naso- faringian: dimineata pe nemancate (in absenta unui gargarism cu antiseptice), sau, cel putin dupa 4 ore de la ingerarea de alimente, persoana, pe scaun, in pozitie sezanda, cu capul aplecat pe spate, cu fata indreptata spre o sursa de lumina puternica, se deschide gura la maximum, se apasa limba, se vizualizeaza peretele posterior al faringelui, amigdalele, pilierii si valul paltin, recoltarea se efectueaza cu tampoane de vata sterile, insistandu- se asupra zonelor cu eritem, punctelor de puroi, secretiei mucopurulente, pseudomembranelor,
se recolteaza cel putin 2 tampoane (frotiu Gram pentru diagnosticul asocierii anaerobe fuso- spirilare, Angina PlautVincent)), in caz de suspiciune de difterie, se recolteaza 3 tampoane faringiene si 2 tampoane nazale, daca leziunea este profunda, in fosele nazale, recoltarea secretiilor este efectuata de catre specialist ORL, prin rinoscopie anterioara, cu speculul nasal, este indicat ca pe buletinul de trimitere sa se specifice examenul solicitat, 17. urocultura. Mod de lucru, insamnatare, interpretare in prealabil se face o toaleta a organelor genitale exterioare, cu apa si sapun, stergerea cu tampon de vata imbibat in solutie salina sterila, prelevarea se face din jet mijlociu, direct in vas steril, cu gatul larg, volumul necesar unei examinari uzuale este de 10- 15 ml. in prezenta unei simptomatologii caracteristice, se recolteaza 1- 2 urini la interval de 24 ore, la bolnavi asimptomatici sunt necesare 2-3 probe de urina repetate, numai obtinerea aceluiasi rezultat de mai multe ori are semnificatie etiologica. in infectia gonococica recoltarea urinei se face in aceleasi conditii, cu mentiunea ca se retine primul jet de urina, urocultura in leptospiroza: se recolteaza urina dupa prima saptamana de boala, in conditii aseptice, dupa o administrare timp de 24- 48 ore de regim alimentar alcalinizant, urocultura in tuberculoza renala: prelevatul de electie il constituie urina recoltata dimineata, din jetul mijlociu, timp de 3 zile consecutiv. Pana la obtinerea celei de a 3- a probe, urina se pastreaza la frigider.
18. coprocultura. Mod de lucru, insamantare, interpretare recoltarea materiilor fecale se realizeaza in recipiente speciale (coprorecoltoare) din material plastic transparent, sterile, cu capac etans, indepartat prin desurubare, produsul care permite cele mai multe izolari este scaunul emis spontan, proaspat, la bolnavii cu scaune diareice, in perioada de stare, se recolteaza cu lopetica recoltorului portiuni de scun cu mucus, sange, sau esantioane din 2- 3 locuri diferite, la bolnavii cronici, purtatori, persoane nespitalizate, scaunul va fi provocat prin purgativ salin ( sulfat de Na si Mg), pentru controlul purtatorilor de bacilli tifici, prelevarea se face timp de 3 zile consecutiv, dupa administrare unica de purgativ, in cazul purtatorilor cronici de bacilli dizenterici, se folosesc sonde Nelaton nr. 16- 18, conservare in mediu Cary- Blair sau transport imediat,
