r
:',
]NTRODUCCION A LA INGENIERIA BIOOU]MICA
;i i
i
t
tl
¡
s-^ B
1
v
¡NTRODUCCION A LA INGENIERIA BIOOUIMICA
w UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA OUIMICA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
I
ALBERTO DUARTE TORRES
{
Profesor Titular
¡
I
:
SANTAFE DE BOGOTA, JULIO DE 1995
-
TABLA DE CONTENIDO
Frólogo
...xvii
1. ¡NTRODUCCTON I.,t LA CELULA
-
!i
1.1,1 Tiposbásicosdecélulas ... .1.2 La información genética
1.2.1
i..,.
..,...
.2.1.1
2
3
.... ¿
Procesos de prodgcción de 1
i
2
1
1.2 METABOLISMOMICROBIA1
,
,r .
5
energfq,
Glucólisis
1.2.1.1.1 Ruta metabólica
7
I Embden
Meyerhof-Parnas.. 1.2.1.1.2 Ruta metaból¡ca del fosfato-pentosa . 1 .2.1.1.3 Ruta mstabólica Eatner-Doudoroff 1.2.1 .2 Respiración
I 11
12 13
1.2.1.2.1 Ciclo del ácido
... fosforilaciónoxidativa,..... tricarboxílico
1
13
.2.1.2.2 Transporte electrón¡co y
., 1.2.1.2.3
16
Reacciones de
oxidación-reducción
16
1.3
APLICACIONES DE LA INGENIERIA BIOOU]MICA .
1.4
CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE EL DISEÑO PRELIMINAR DE UN BIOPROCESO .
.
.
22
.
29
.
1.4.1 El biocatalizador 1.4.2 Cultivos de células y tejidos 1.4.3 El biorreactor 1.4.4 Esterilización
30
.
31
1.4.4.1 Esterilización de equrpo 1.4.4.2 Esterilización de medios 1.4.4.3 Esterilización de aire
1.4.5
35
;
.
Separación y purificación de productos de la ingenierla bioqufmica. . .
1.4.5.1
1.4.5.2
Separacióñdecélulas'..... Rupturadecélulas . . . . . . . i.
Productosextracelulares....;
1.4.5.3 Purificación final del
producto
1.4.5.3.1 Filtración de células
36 37
38
Productosint¡acelulares....i..
1.4.5.1.1 1.4.5,1.2
39 39
40 40 41
a
'través dé membranas 1 .4.5.3.2 Extracción líquido-líquido de antibióticos 1.4.5.3.3 Recuperáción de ' ant¡bióticos y protelnas mediante intercambio iónico
1.5
33 35
....;.
41
42
42
APLICACION DE LOS LENGUAJES DE
SIMULACIONENINGENIERIA..¡.J.II";
43
Etapas'en el planteamiento y la solución de un modelo' . . Lenguajes de simulación continua
43 45
1.5.1 1.5.2
BIBLIOGRAFIA.. .:...
46
2 2.1
BALANCE DE MATERIALES
52
BALANCE GENERAL DE MATERIALES
2.2 BALANCE DE ELEMENTOS OUIMICOS
53 54
.
2.2.1
Velocidad específica de consumo de sustrato, crecimiento de biomasa y formación de producto. 2.2.2 Balances de carbono y oxígeno
'
Ejemplo
2.1 Balance de elementos químicos enunafermentaciónanaerobia . . . . .. . . .
2.3 BALANCE POR EL METODO DE ELECTRONES DISPONIBLES
2.3.1 Grado de reducción 2.3.2 Bdance de electrones disponibles 2.3.3 Ecuación de crecimiento Ejemplo
2.2
Ejemplo
2.3
Determinación en un proceso Determinación en un proceso
de la ecuación de crecimiento aerobio de la ecuación de crecimiento anaerobio . . . .
Ejemplo 2.4. Determinación de la composición de un microorganismo
Ejemplo
2.5 Equivalencia de los factores
Ejemplo
2.6 Factores de rendimiento
62 64 66
70
70 70 71
.
71
de rendimiento
2.5.5 2.5.6
57
69
2.5 FACTORES DE RENDIMIENTO Rendimiento de sustrato en biomasa . . . Rendimiento de oxígeno en'biomasa Rend¡miento de electrones en biomasa . . Factores de rendimiento en el crecimiento aerobio
56
58 58 59
.
2.4 COMPOSICION ELEMENTAL DE LOS MICROORGANISMOS
2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4
54 55
en el crecimiento aerobio de S. cerevisiae .
Rend¡m¡ento de sustrato en producto Rendim¡ento máximo de sustrato en producto
72
.
.
74 75 76 ilt
2.5.7 2.5.8 2.5.9
2.6
77
Coeticiente de rendimiento verdadero en medios mínimos Rendimiento verdadero en medios complejos ...:... Rendimientoverdadero del oxígeno
78 79 79
FORMULACION DE ECUACIONES CTNETICAS Á PRNTIR OET BALANCE DE MATERIALES DE UN CULTIVO CONTINUO . .
Ejemplo
2.7
2.7
Evaluación del rendimiento máximo en la producción de ácido cltrico
Ejemplo
....
. . . . . 80
2.8 Formulación
de las ecuaciones cinét¡cas requeridas para el control de un cultivo continuo de células de S. cerevisiae.
80
88*
DISEÑO DE MEDIOS DE CRECIMIENTO Y PRODUCCION
2.7.1
88-
Requerimientos nutrimentales 2.7.1
.1
Requerimiento de elementos
89
gg
2.7.1.2 Fuentes de carbono y energía 2.7.1.3 Requerimientosmínimos . . . 2.7.1.4 Requerimiento de nutrimentos
90
específicos
92
2.7.2 Requerimiento de energía 2.7.3 Requerimientosambientales 2.7.4 Consideraciones técnico-económicas
2.7.5Agua 2.T.6Fuentesdecarbono 2.7.6.1 2.7.6.2 2.7.6.3 2.7.6.4 2.7.6.5
2.7.7
Hidrocarburos
2.7.7.2 Torta de soya 2.7.7.3 Licor de papa . tv
..:......:......97 ......98
Melazas, cebada.y extracto de malta Licor de sulfito Alcoholes sintéticos Aceites vegetales
Fuentes de nitrógeno inorgánicas y
......
sintéticas
93 94 94
98,100 100 101 101 101
1O2
'lO2
¡f
2.7
.7.4
2.7.7.5
Extracto fermentado de salvado y aceite de semillas Extracto de levadura
104 105
2.7.8 Medios de cultivo definidos 2.7.9 Control ambiental . .
106 107
.
2.8 FORMULACION DE MEDIOS Ejemplo
108
DE CULTIVO
2,9 Diseño preliminar
de un medio
PROBLEMAS... BTBLTOGRAFT1
3
1'14
..
116
120
TERMODINAMICA DE LOS PROCESOS BIOOUIMICOS
3.1 PRINCIPIOS DE LA TERMODINAMICA 3.1 3.1
.1 Conservación .2 Entalpfa
120 "t21
de energfa
123 124 124
libre 3.1 .4 Entropfa 3.1.3
Energla
3.2 ANALISIS TERMODINAMICO DEL METABOLISMO MICROBIAL . . 3.3 ENERGIA LIBRE ESTANDAR
3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5
3.1
132 133 134 137 138
Eficiencia de la célula en el proceso de captura de energfa en la reducción del piruvato hasta lactato . .
3.4 EVALUACION DE ENTALPIA Y CALOR
126 130
Energía libre estándar de hidrólisis de algunos compuestos fosforilados Energla libre estándar de algunas reacciones biológicamente importantes Ciclo energético de las células Energía libre estándar de hidrólisis del ATP Principio del intermediario qufmico común
Ejemplo
.
DE COMBUSTION
139
. . ..
140
3.4.1 3.4.2
Datos termod¡námicos de algunos compuestos representativos Calor de combustión
140 142
3.5 CALOR DE REACCION
145
3.6 DISIPACION DE ENERGIA Y EFICIENCIA TERMODINAMICA
146
3.6.1 3.6.2
Disipacióndeenergía termodinámica
.......r.
Eficiencia
146 146
'i
3.7 EFIC]ENCIA ENERGETICA DEL CRECIMIENTO MICROBIAL Ejemplo
149
3.2
Determinación del calor de combustión de las células y del calor generado por mol de O, consumido . Ejemplo 3.3 'Determinación de los calores de combustión de la biomasa y otros compuestos orgánicos. Ejemplo 3.4 Determinación de la producción de calor bajo represión por glucosa
3.8
FACTORES DE RENDIMIENTO DE ENERGIA EN BIOMASA
3.8.1
3.8.3
lbl 153
. . . . . . 154
Factores de rendimiento basados en el.calor producido
duranteel crecimientomicrobial
3.8.2
1S0
....
1Ss
Factores de rendimiento basados en la Factores de rendimiento basados en la
energíaliberadaporcatabolismo.,.:..
Ejemplo
1Sg
3.5 Evaluación de rendímientos basados en
energía
1
59
3,8.4
Factores de rendimiento basados en la generación de ATP 3.8.5 Factor de rendimiento de ATP en biomasa en el crecimiento asociado a la energía. 3.8.6 Rendimiento de ATP en biomasa en el crecimiento no asocíado a la energfá '3.8.7 Coeficiente de rendimiento verdadero 3.8.8 Rendimiento máximo de Afp en cétulas
vt
161 161
162 163 163
3.9 BALANCE DE ENERGIA
164
Balance general de energía Calor generado por la actividad rnetabólica . Calor generado por el metabolismo aerobio Calor generado por metabolismo aerobio en un reactor por lotes . 3.e.5 Calor generado por metabolismo
164 166 167
's,s.o aerobioenunreactorcontinuo
168
3.9,1 3.9.2 3.9.3 3.9.4
.
........
Evaluación experimental del calor generado por el metabolismo
Ejemplo
3,6 Balance
Ejemplo
3.7
"171
Balance de energía del proceso
anaerobio de obtención de etanol a partir de glucosa
174 178
PROBLEMAS
.,,.i..
BIBLIOGRAFIA..
CINETICA DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS
4.1
.1 Cofactores y coenzimas . .
4.1.2 4.1 4.1
lsoenzimas y enzimas
alostéricas
.3 Clasificación .4 lmportancia industrial
4.2 ACTIVIDAD ENZIMATICA. 4.2.1
185
186 187 187 1 88 191
Velocidad inicial de una reacción catal¡zada por una enzima.
Ejemplo
4.2.2
181
185
INTRODUCCION 4.1
169
de energla del proceso aerobio de producción de levadura a partir de
glucosa
4
167
4.1
Determinación de la actividad de la enzima B-glucosidasa
Número de
recambio
191
192 193
vil
4.2
Ejemplo
4.2.3
Determinación del nÚmero de
recambio , .
196
lnfluencia de los factores ambientales
4.2.3.1 pH 4.2.3.2 Temperatura
4.3
Ejemplo
4.3 MODELOS POR
194
i
196 196
.
Determinación de las energías de activación e inactivación de un sistema enzimático.
198
CINETICOS DE LAS REACCIONES CATALIZADAS
ENZTMAS
200
4.3.1 ModelodeMichaelis-Menten i"., 4.3.1.1
Ejemplo
4.4
Evaluación gráfica de los parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten.
2O4
Evaluación de los parámetros de la ecuación de Michaelis Menten para la hidrólisis del almidón.
206
4.3.1.2 ModelodeBriggs-Haldane 4,3.1.3 Simulación del modelo
vilt
2Og
212
Modelo tipo Michaelis-Menten para una reacción enzimática reversible
215
Ejemplo
4.5
Ejemplo
4.6
4.3.3 4.3.4
. . . .;.
Menten.
de Michaelis
4.3.2
2OO
Determinación de la relación entre el caudal y el grado de conversión, en la isomerización de glucosa, en un reactor empacado. Determinación de la relación entre la concentración de sustrato y el .. t¡empo de reacción, en un reactor por lotes, empacado con enzima
Modelo de inhibición competit¡va Modelo de inhibición no compet¡tiva. .
,
217
223 225
Ejemplo
4.7 Determinación
del tipo de reacción y enzimática evaluaci6n de las
constantescaracterísticas... 4.3.5
4.4
Modelo de inhibición por
REACTORES
4.4.1 4.4.2
ENZIMATICOS
Reactor por
lotes
Reactor continuo de flujo
Ejemplo
sustrato
4.8 Simulación
tapón
i....
ENZIMATICA EN FASE HETEROGENEA
4.5.1 lnmovilización por métodos qufmicos 4.5.2 Métodosfísicos :.... 4,5.3 Enzimas inmovilizadas sobre la superficie de una partlcula insoluble 4.5.4 Enzimas inmovilizadas Por copolimerización o microencapsulación 4,5.5 Balance de materia 4.5.6 Consumo de sustrato de acuerdo con la c¡nét¡ca de Michaelis-Menten
4.9
Determinación de la variación de la concentración de sustrato con respecto a la distancia radial para diferentes valores d'el modulo de Thiele. Efecto del modulo de Thiele sobre el factor de efectividad Para Paftlculas
esféricasinmovilizadas.
4.5.7 4.5.8
234 234
de la hidrólisis del
enzima¡nvertasa.
Ejemplo
231
233
azúcar de caña por acción de la
4.5 CATALISIS
226
".
Consumo de sustrato propol'cional"a la concentración de sustrato Consumo constante de sustrato
235 239
240 242 243 245 245 246
249 252 254
PROBLEMAS
255
BIBLIOGRAFIA
259
lx
ts
crNETrcA DEL cREC¡MrENTo DE BroMAsA, coNsuMo DE SUSTRATO Y FORMACION DE PRODUCTOS
5.1
263
CRECIMIENTO DE BIOMASA EN UN CULTIVO POR LOTES
264
Densidad de la biomasa Etapas del crecimiento 5.1.2 5.1 .3 Velocidad específica
264 264 266
5.1 .1
Ejemplo
5.1
Determinación de las velocidades especfficas de una fermentación.
267
Velocidad de crecimiento Período de replicación de bacterias y levaduras 5.1.6 Perlodo de replicación de los organismos f¡lamentosos
5.1.4 5.1.5
5.2
INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA VELOCIDAD ESPECIFICA DE CREC]MIENTO
269 271 27
.:. . .
..i..,. 5.2.1 Temperatura . .i.! . . r . . .,,. . .,, 5.2.2 Energfadeactivación. ./. . .,, ...., 5.2.3 Actividaddel agua 5.2.4 Tonicidad, osmolalidad y osmolaridad. . . 5.2.5 pH i.....
1
272
.
272 274 275 276 278
5.2.5.1 Efectos del pH del medio sobre 5.2.5.2
la velocidad de crecimiento de algunas bacterias. lnfluencia del pH del medio sobre la velocidad de un bioproceso
5.3 MODELOS CINETICOS NO ESTRUCTURADOS PARA CRECIMIENTO DE BIOMASA, CONSUMO DE SUSTRATO Y FORMACION DE PRODUCTO.
5.3,1
lnfluencia de la comBosición del medio sobre la velocidad específica de crecimiento. 5.3.1 .1 Modelo de Monod 5.3.1 .2 Modelo de Moser 5.3.1 .3 Modelo de Contois y Fujimoto
28O
281
282
283 283 285 246
286 286 287
5.3.1.4 Modelo de Teissier 5.3.1,5 Modelo de Konak 5.3.1,6 Modelo de Kargi y Shufer
5.3.2
lnfluencia de la concentración de biomasa sobre la velocidad específica de crecimiento: Modelo de Meyrath. 5.3.8 Período de adaptación: Modelo de Hinshelwood 5.3,4 Fase estacionaria: Modelo de La Motta 5.3.5 Fase de muerte microbial.
5.3.6
5.4
288 288 289 289
5.3.5.1 Modelo de Chiu 5.3.5.2 Modelo de Moser y Steiner
29O
endógeno
290
Metabolismo
289
MODELOS CINETICOS PARA LA INHIBICION DEL CRECIMIENTO
5.4.1 lnhibición por
.
sustrato
292
292 293 294 295
Efecto de'la fuente de carbono. 5.4.1.2 Efecto de la fuente de nitrógeno 5.4.1 .3 Modelo de Andrews 5.4.1.4 Modelo de Tseng y Waymann 5.4.1.1
5.4.2 lnhibición
por
producto
5.4.2.1 ModelodeHolzberg 5.4.2.2 Modelo de Ghose y Tyagi 5.4.2.3 Modelo de Jerusalimsky . . 5.4.2.4 Modelo de Bazua y Wilkie
5.4.3
5,5
Represión catabólica
..
,'....'i
.
aMODELOS CINETICOS PARA LA FORMACION DE PRODUCTO 5.5.1 5.5.2
Clasificación de los productos Modelos cinét¡cos .
5.5.2.1 Formación de producto asociada al crecimiento microbial, 5.5.2.2 Formación de producto no asociada al crecimiento microbial
292
.
295 295 296 296 296 297
. . . 297 298 299 299 300 xt
5.5.2.3 Formación de producto parcialmente asociada al crecimiento: modelo de Luedeking y Piret
5.6 EVALUACION DE PAR,AMETROS CINETICOS A PARTIR DE DATOS EXPER]MENTALES
5.6.1 5.6.2
Método integral de análisis Método diferencial de análisis . .
Ejemplo
5.7
Evaluación de los paiámetroi cinéticos de la Ecuación de Monod a part¡r de datos experimentales.
Reactor por
Ejemplo
5.3
lotes
3OB
322
de Aerobacter cloacae
.
lotes.
5.7.2 Reactor continuo de flujo tapón 5.7.3 Reactor continuo de mezcla completa (CSTR) 5.7.4 Productividadygradodeconversión . ... 5.7,5 Reactor por lotes con alimentación continua. Ejemplo
5.7.6
5.4
Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor por lotes con alimentación continua.
Reactor continuo de mgzcla completa con recirculación
5.7.7Fe¡mentadoresenseriei.... 5.7.8
Columnas de burbujeo y reactores con circulación líquida inducida
PROBLEMAS . . BIBLIOGRAFIA
xil
302 305
Simulación del crecimiento en un.reactor por
' '
301
CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE BALANCE DE MATERIALES, 322 CINETICA Y SIMULACION DE FERMENTAqORES
5.7.1
.
5.2
.
301
.
323 327 328 330 334
335 338 342 343 347 351
\
6
ESTERILIZACION
.
356
6,1 TNTRODUCCION
356
6.2 CINETICA DE LA DESTRUCCION MEDIANTE CALOR
6.2.1 6.2.2
.,. , . .
357
Energía de activación y coeficiente
deArrhenius....
359
Reducción fraccional de la población de microorganismos.
362
LOTES
369
6.3 ESTERIL]ZACION
6.3.1 6.3.2
DE MICROORGANISMOS
HUMEDO.
POR
Selección de! microorganismo de diseño. Diseño de ciclos de esterilización
Ejemplo
6.1 Determinación
Ejemplo
6.2 Determinación
Ejemplo
6.3
del perlodo de sostenimiento en una fermentación 371
por lotes, de la influencia del período de calentam¡ento sobre el período de sostenimiento. Determinación de la influencia del volumen del caldo sobre el perfodo de sostenimiento,
374 375
6.4 ESTERILIZACION CONTINUA 6.4.1 Esterilización mediante calentamiento directo por ínyección de vapor. Ejemplo
370 370
6.4 Esterilización cont¡nua
376
vaPor
mediante inyección de
6.5 ESTERILIZACION DE AIRE
375
380
,
384
6.5.1
Condiciones del aire reqüerido por la industria b¡oqufmica . . 6.5.2 Esterilización de aire por calor
6.5.2.1 Compresión politrópica 6.5.2.2 Calentamiento directo 6.5.2.3 Calentamiento ind¡recto con gasescombustibles, .
385
386 386 388
i!..,
388 xlil
6.5.3
Filtración
388
6.5.3.1 Filtros empacados 6.5.3.2 Filtros de vela 6.5.3.3 Filtros de'membrana
6.6 EFICIENCIA 6.6,1
389 391
392
DE LOS FILTROS FIBROSOS
393
Eficiencia de fibra
Ejemplo
6,6.2
393
6.5 Espesor
de un lecho empacado con fibras de vidrio
396
Determinación de la pérdida de presión en los filtros de fibra de vidrio
Ejemplo
398
6.6 Determinación
de la pérdida de presión del aire en un filtro de fibras de vidrio
399
PROBLEMAS
400
BIBLIOGRAFIA
402
7
FENOMENOS DE TRANSPORTE EN
BIOPROCESOS
7.1 REOLOGTADELCALDO
.....
7.1.1 FluidosNewtonianos.... 7.1.2 Plásticos Bingham 7.1.3 Comportamiento pseudoplást¡co .,,. 7.1.4 CuerpodeCasson.. .
7.2.1
potencia i entregada al fluido ! .:., ! , Evaluación de la
7.2.1
.1
7.2.1.2
7.2.2 xlv
Dispersión de
Agitación
.......,. ...:.
i
4Og 4Og
4,lO
:
41O
... ,i !
;....
406
4Ol
....,,,.
gases
Agitación de fluidos Newtonianos
nogaseados
406
.
412 413
...416
7.2.3 Agitación
de fluidos Newtonianos
gaseados
Ejemplo
7.2.4
t.2.5
7.1
4'19
Consurno de potencia por
..
422
Agitación de fluidos gaseados
.
423
TRANSFERENCIA DE CALOR EN FERMENTACION
424
7.3.1 Area de transferencia de calor 7.3.2 Balance de energfa . . . ¡ . 7.3,3 Coeficiente de transferencia de calor
425 428 429
7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.3.7 7.3.8 7.3.9
'
.
Reactoresequipadosconcamisa
Reactores equipados coh serpentfn . . . Reactores equipados con tubos verticales Reactores con serpentines de placa vertical lntercambiadores de superficie raspada Transferencia de calor en condiciones inestables en recipientes agitados
Ejemplo
7.4
421
Agitación de fluidos no Newtonianos
nogaseados
no Newtonianos
7.3
agitación
7.2
T¡ansferencia de calor en un reactor aeróbico
...,.
431 433 434 435 435
436 437
TRANSFERENCIA DE MASA
444
7.4.1 lntroduccién 7.4.2 Determinación
444
experimental del coeficiente de transferencia de oxlgeno
450
7.4.2.1
Método de oxidación de una solución de sulfito de sodio 7.4.2.2.Método del balance de oxlgeno 7.4.2.3 Método estát¡co 7.4.2.4 Método dinámico
Coeficiente de transferencia de masa Evaluación del coeficiente de transferencia de masa . 7.4.5 F¡acción volumétrica del gas en la fase dispersa.
7.4.3 7.4.4
450 451
452 455 457
460 462
7.4.5.1 7.4.5.2
7.3
Ejemplo
7.4.6
Dispers.ión de aire en
sistemas sin agitación mecánica Dispersión de aire en sistemas con agitación rrrecánica
Transferencia de masa en un reactor aeróbico . .
463
,
Evaluación de los gases producidos durante la fermentación en reactores a escala de laboratorio . . .
7.4
Ejemplo
7.4.7
467
...r?.
Transporte de oxfgeno en biorrggctoles
paraelcultivodeteiidosanimales .
7.4.7.1 Condiciones ambientales 7.4.7
.2
Sistemas de
cultivo
468
,
.,. ;.
.
;
7.5 Difusión 7.4.7
de oxígeno en frascos
.2.3
7.4.7.2.4 CAMBIO DE ESCALA
7.5.1 7,5.2 7.5.3
.
Transferencia de Transferencia de
Ejemplo
7.6
T..
Difusión de oxígeno a través de capilares
Microencapsulación
.
Agitación
480
típicas
7.4.7.2.1 Reactores agitados 7.4.7.2.2 Difusién de oxígeno en frascos T . . Ejemplo
465
Toma de muestras llquidas y gaseosas y evaluación de! caudal de gases producidos durante la fermentación
aceto'butllica,.....
7.5
462
480 481
.
482 482 485
487 490 4g1
calor masa
.....
492 493 496
Estudio del comportamiento de algunas variables en el procedimiento de
cambiodeescala
¡.i.r
498
.PROBLEMAS
502
BIBLIOGRAFIA
505
xvr
PROLOGO
Algunos problemas del hombre moderno tales como la alimentación, la recuperación y preservación de ecosistemas y el desarrollo de industrias no cOntaminantes, son Susceptibles de manejo o tratamiento con técnicas biológicas. Una porción crec¡ente de la tecnologla del próximo futuro dependerá de la utilización de recursos naturales renovables mediante el empleo de sistemas vivos, sus productos metabólicos o sus componentes.
salud, la
La lngenierfa Bioquímica integra la Bioqufmica y Eiología con la estrategia y metodología de la lngeniería Ouímica, aprovecha las capacidades degradantes
y sintéticas de los microorganismos, y aplica estos conocimientos en la producción, procesamiento y conserváción de materiales de valor económico, mediante agentes biológicos tales como microorganismos, células, enzimas, anticuerpos y tejidos animales y vegetales. El presente volumen está escr¡to como material didáctico para el curso
introductorio en lngeniería Bioquímica de la línea de profundización en bioprocesos del nuevo plan curricular de lngeniería Ouímica. Los estudiantes que siguen esta línea desarrollan normalmente su proyecto de grado en las áreas de lngeniería Ambiental, lngeniería de Alimentos o en lngeniería Bioqufmica.
Los principios de la lngeniería Ouímica son aplicables en todos los procesos que incluyen fenómenos de transporte, termodinámica y cinética' La mayorla de los textos tradicionales de lngenierla Oufmica están fundamentados en ejemplos recopilados de la industria petroquímica y los principales textos de lngeniería Bioquímica disponen de muy pocos ejemplos o carecen de ellos. y analizar información dispersa en físicos, químicos y biolÓgicos integrar los fenómenos una abundante literatura, y contr¡buir al desarrollo de la Biotecnología en nuestro medio, Más de cuarenta ejemplos resueltos y un número mayor de problemas de final de capítulo tienen el propósito de reforzar la experiencia del aprendizaie mediante una práctica guiada y detallada una vez expuesto cada nuevo principio. El objetivo de este libro es recopilar
xvil
Después de una introducción de los aspectos de la lngeniéria Bioqúimica el texto se divide en capltulos y secciones, algunos de los cuales corresponden
con otras asignaturas del plan de estudios tales como balance de materiales, balance de energía, termodinámica, cinética y fenómenos de transporte con el objeto de enfatizar las analogías y aplicaciones de la lngeniería ouímica en lngeniería Bioquímica. Asf, por ejemplo, la cinética de las reacciones catalizadas por enzimas y su aplicación en el diseño de reactores, la sección sobre catálisis enzimática en fase heterogénea y el efecto de la resistencia a la transferencia de masa, las secciones sobre agitación, aeración y dispersión, las secciones de transferencia de calor y transferencia de masa, la sección sobre difusión de oxlgeno en cultivos de tejidos animales y la sección sobre estrategias de cambio de escala, demuestran al lector la aplicación de los principios de la lngeniería Ouímica en el campo de la Biotecnología. La aplicación de los lenguajes de simulación digital constituye uno de los aspectos más importantes de la moderna educación en lngenierla, La disciplina lograda mediante el análisis de un comportamiento complejo, de acuerdo con la teoría disponible, expresada en forma de ecuaciones matemáticas, constituye
un medio valioso para entender la interacc¡ón entre causa y efecto en
un
sistema real. Este volumen incluye varios programas, algunos en lSlM, utilizado como ejemplo de uno de los lenguajes de simulación continua. Sin embargo, como su disponibilidad es bastante restringida comparada con la universalidad de otros lenguajes como el BASlc, los ejemplos en lSlM presentados-en este texto, excepto uno, son desarrollados simultáneañente en GWBASIC, con el objeto de confrontal estas dos herramientas de cálculo, facilitar el estudio de algunos de los modelos más importantes en lngeniería Bioquímica y motivar al lector hacia el desarrollo de nuevos programas. Esta obra es fruto de la ¡nteracción entre el Departamento de lngeniería Ouímica y el lnstituto de Biotecnología de la Universidad Nacionalde Colombia, y del Seininario sobre Biotecnología que ininterrumpidamente se ha desarrollado desde el año de 1983. Las diferentes llneas de investigación del lnstituto de
Biotecnologfa
y del Departamento de lngeniería
Ouímica han apoyado la
realización de numerosos proyectos de grado y constituyen la base del programa actual de postgrado en lngeniería Ouímica con área de énfasis en lngeniería Bioquímica.
XVIII
,
Agradezco a Myriam, mi esposa, y a mis hiios Alejandra, Ximena y Felipe por su paciencia y su estimulo mientras escribla este l¡bro. Tampoco serla posible esta obra sin la permanente colaboración de la Doctora Dolly Montoya Castaño, directora del lnstituto de Biotecnologla, del lngeniero Gustavo Buitrago Hurtado, subdirector del lnstituto de Biotecnologla, del lngeniero Luis A. Caicedo M., con quien comparto el curso de postgrado en lngenierfa Bioquímica, de todos los profesores del Departamento de lngenierfa Oufmica, de los profesores e investigadores del tnstituto de Biotecnologfa, y de los estud¡antes de los cursos pregrado y postgrado de lngeniería Ouímica quienes ayudaron a corregir y enriquecer los borradores del presente texto. Extiendo mis agradecimientos a los siguientes profesores, quienes a través de cursos y eventos nacionales e internacignales contribuyeron a mi formación en el área: Dr. Enrique Galindo Fentanes, Dr. Agfrstfn Lopez Munguia Canales, Dr. Rodolfo Ouintero Ramirez, Dr. Tonatiuh Ramirez, y demás profesores e investigadores del lnst¡tuto de Biotecnologla de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Al Dr' Carlos Rolz, investigador titular, y demás profesores e investigadores del lnstituto Centroamericano de lnvestigación y Tecnología lndustrial (lCAlTl) de Guatemala. Al Dr. Fernando Acevedo Bonzi, Dr. Andres lllanes V., y demás profesores e investigadores de la Universidad Católica de Valparafso, Chile.
Alberto Duarte Torres
xtx
CAPITULO
1
INTRODUCCION
La lngeniería Bioquímica integra los conocim¡entos de bioquímica y'biología con la estrategia y metodología de la lngenierla Ouímica, aprovecha las capacidades
degradantes y s¡ntét¡cas de los microorganismos y aplica estos conocimientos en la producción, procesamiento y conservación de materiales de valor económico, mediante agentes biológicos tales como microorganismos, células, enzimas y anticuerpos.
,."aro. químicos tradicionales principalmente en la sensibilidad de los reacfivos y los productos hacia las condiLos procesos bioquímicos difieren de los
cionss afñb¡Htales:y en la complejidad de las reacciones bioqulmicas que normalmente solo toleran pequeñisimos cambios de temperatura, pH e intensidad iónica. Cuando se examina el crecimiento de células separadas del organismo vivo tal como un cultivo de células vegetales, de células animales, o de organismos unicelulares, se.encueñfia que,lasaesfieohas oond¡cioñé§Arnbientales proporcio-
nada§ porel'organismo.vivo deben §ér-,pfovistas.Et*ficialrnente. Y aunque muchos reactores comerciales no requieren un control con estos limitados márgenes de tolerancia, las células deben ser protegidas de cambios repentinos en las condiciones ambientales, de los elevados esfuerzos cortantes producidos por la agitación del caldo y de los microorganismos extraños.
1.1 LA CELULA
La célula es la manifestación más sencilla de la vida. En la célula se unen átomos para formar moléculas, se conectan moléculas para formar estructuras, y se coordinan'estructuras para producir mas células. La célula crea y mant¡ene orden, organización, y complejidad.
De acuerdo con la §egunda Ley de la Termodinámica, la.éntropía aumenta invariablemente en cualquier lugar del universo. La estrategia de la vida es afrontar esta tendencia de la naturaleza hacia el azar y generar orden mediante la creación de estados inestables. Estos procesos requieren energía, ya sea directamente de la luz solar o de las sustancias nutritivas que rodean la célula.
1
.1
.1
Tipos básicos de células
Los dos t¡pos bás¡cos de células, Émaario(es : y eucdrjotesj d¡fieren en la complejidad de su organización celular (Figura 1.1). Las células eucarióticas tienen estructuras intracelulares limitadas por membranas, denominadas
Entre los orgánulos está el núcleo (contiene el genoma celularJ, los mitocondrios (sitio de sfntesis y tr'ansporte de energíaf , los lisosomas {eontienen las enzimas
degradantesl,
y los cloroplastos en los organismos fotosintéticos.
El úniiÉo
orgánulo común a procariotes y eucariotes es el ribosoma (s¡tio de síntesis de las proteínas). En la Tabla 1 .1 se presenta la clasificación de los microorganismos del reino prot¡sta. El reino de los protistas está formado por organismos dotados de una organización biológica muy simple comparada con la de las plantas y animales. Pertenecen a este reino fodos los organisrnos unicelulares, y los multicelulares formados por células del mismo tipo.
Figura 1.1 Representación esquemát¡ca de células "tfpicas". AI componentes de una célula tfp¡ca; Bl Paramecium, microorganismo, tipo animal, de una sola célula; Cl Euglena, microorganismo tipo vegetal, unicelular; D) Célula bacteriana. lPelczat, et al., 19771, CuerDo
de
GolQ¡
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Lrgsma
-Membraña celular
Rel¡curo
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ercoo¡ásmico
:
B
Svrco bucal
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Cromosoma Núqleo
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Vacuolas axrenttcias Crloprqio
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M[EÚÉriá
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c¡r,**--¡l\u,\tlt¡l¡,r,
r rrrrrr,-r,, "^.,onú"tí/"újrrrrr,. o r ri fij !!*, '
Ves¡cula
prn6rlós¡ca
Vacuola
o"
Vacuola
contráclil conlráct¡¡
Veslibulo. Eslrgma de
p¡gren¡o Gránulo de azulÉ
\
Pa¡ed celúla¡ Membrana aloplasmrca
Flib6omás
Gránulo lrgld¡co Gránu¡os de volulina
1.1.2
La información genét¡ca
E! ácido desoxirribonucleico, ADN, es
el depositario de la informaeión
que instruye a la célula sobre la disposición correcta de sus átomos; rnoléculas, cadenas y estructuras, para convertirse en una célula completa, transmitirse de generación en generación, y volver a iniciar el proceso. El ADN e una larga
cadena molecular formada por cuatro tipos de eslabones; adenina, guanina, citosina, y t¡m¡na. Estas cuatro bases, o letras, se unen formando secueñcias, o palabras, con las cuales puede escribirse el número infinito de frases que constituyen la información genética.
Tabla
1.1
Clasificación de microorganismos del reino Protista. (Bailey y Ollis, 1986).
Todas las cétulas contienen unos orgánulos denominadqs ribosomas.donde se copian fragment6s, o genes, de la información del ADN, con la ayuda de una proteína, enzima, que actúa como catalizador. Esta copia de la información es el ácido ribonucleico mensajero, ARN^. Es un mensajero porque transporta el mensaje de los genes, desde el núcleo, donde se encuentta el ADN, hasta el
citoplasma, espacio celular alrededor del nÚcleo, donde se encuentran los ribosomas. Las moléculas de ARN, más cortas que las de ADN, contienen uracilo en lugar de timina. En el ribosoma se lee la secuencia de los nucleótidos del ARN^ y se produce una proteína. Enzimas muy específicas unen cada aminoácido con una molécula pequeñá de ácido ribonucleico de transferencia, ARN. El ribosoma selecciona cada ARM con su aminoácido agregado, de acuerdo con el orden indicado en el ARN^ lefdo en ese momento. De esta manera, cada nuevo aminoácido, y su correspondiente .ARlú,, entran en el ribosoma y se sitúan de modo que diCho aminoácidO queda químicamente ligado con el arninoácidO que le precede en el ribosoma. Así, los eslabones quedan unidos secuencialmente, y cuando termina la lectura de la cadena del ARN^, se libera la cadena,protefn¡ca. Cada gene codifica una proteína.
4
Las proteínas son cadenas moleculares formadas por veinte clases de eslabones, los aminoácidos. El orden, o secuencia de los aminoácidos en la cadena es
exacto y determina eltipo de protefna. Cada proteína tiene funciones biológicas especiales. Así, por ejemplo, la hemoglobina es una protelna que se pliega según una configuración tridimensional, la única capaz de aceptar y liberar eloxígeno.
1.2
METABOLISMO MICROBIAL
La energía obtenida por la célula a part¡r de las sustancias nutritivas del entorno,
oife la luz solar, es utilizada en la realización de trabajo qufmico, en la biosfntesis de las proteínas, ácidos nucleicos, lfpidos, pbfisacáridos y demás componentes celulares importantes para su desarrollo y replicación. Tarnkién se requiere energía para la realización de trabajo osmótico, en el transporte de sustancias nutritivas a través de la membrana celular y en el trabajo mecánico de contracción y locomoción. Metabolismo es el conjunto de todas las secuencias de reacciones catalizadas ehzimáticamente que ocurren en la'célufa. Cada secuencia se conoce como ruta metabólica y los productos de estas reacciones son los metabolitos. un adecuado conocimiento de la estequiometrfa de las diferentes rutas metabólicas facilita la aplicación del análisis estadístico en la evaluación de los datos obtenidos durante el desarrollo de una fermentacióñ, Tsai y Lee, 1987. Algunos subproductos del metabolismo celular tales como alcohóles, ácidos orgánicos y los aminoácidos, son aparentemente innecesarios para la función celular, otros, como los ant¡biót¡cos y enzimas extracelulares, satisfacen un propósito. Desde el punto de vista de la Ingeniería Bioqufmica son importantes aquellas réácciones ceJulares biológicarñénté ' ineficientes' que producen sustancias bióiiulmicas en cantidades sulieriores a lds necesidades de lá célula. lnnumerables reacciones mantienen la vida'celular, en la Tabla 1.2 se presenta, a manera de ejemplo, un resumen de la actividad biosintética del Escherichía coli. En un medio de crecimiento rico en nutrientes y bajo condiciones ambientales apropiadas esta bacteria tiene un ciclo de replicación de veinte minutos, perlodo durante elcual ocurren con gran precisión, equilibrio y productividad, numerosas reacciones.
Catabolismo es Ja-fase dégradenterdet metabofismo.-Las moléculas o,rgánie6 nutcitiuas tales como hidratos de oarbono, hpidos y.p_roteínas, son,degradadds hasta productos firÍM.fdes como¡áeido láctico, áci_d_o,aeético, CO,2;jamoníaco y urea, En las reacciones oxidativas del catabol¡smo se !ibera la energía inherente a la compleja estructura de las macromoléculas orgánicas en la forma de trifosfáto de adenosine ATP.
Anabolismo es la fase de construcción,i las moléculas pequeñas de los precu rsores son ordenadas para f ormar.'lo§ com poFtenteso¡¡rolectfla resvelative rnenteglandes de la célula tales como polisacáridos, ácidos nucleicos, protefnas y lípidos. Las reacciones de biosíntesis del anabolismo requieren la energía libre aportada por la escisiín del ATP. El catabolismo se puede describir en tres fases tal como se muestra en la Figura
.2.-En la fase l, loq polisacáridos son degradados hasta pentosas o hexosas; los lípidos hasta ácidos grasos, glicerina y otros componentes, y las proteínas liberan, mediante hidrólisis, sus veinte aminoácidos componentes. Generalmente, los productos de la fase I son degradados en la fase ll hasta acetil-coenzima A. En la fase lll, el grupo acet¡lo del acetil-Co/ se incorpora al ciclo del ácido tricarboxílico y se oxida hasta CO, y agua. 1
anabolismo también ocurre en tres fases a partir de las unidades estructurales provenientes de la fase lll del metabolismo. La síntesis de las proteínas se inicia El
en la fase lll con la formación de o-oxácidos y otros precursores de los aminoácidos. En la fase ll los a-oxácidos son transtormados en o-aminoácidos, los cuales forman, en la Fase l, las cadenas polipeptídicas de muchas proteínas diferentes. Análogarnente, los gr:upos acet¡lo provenientes de la fase lll son transformados, en la fase ll, en ácidos grasos, con los cuales se construyen los diversos lípidos, Asf como las rutas catabólicas §on convergentes, las anabóticas son divergentes. Cada fase delcatabolismo o delanabolismo de una determinada biomolécula es catali.zada por un sistema multienzimático diferente. Generalmente la ruta catabólica, y la correspondiente, aunque opuesta, ruta anabólica, entre precursor y producto, difieren en sus metabolitos y en las enzimas catalizadoras de las. etapas intermedias. La fase lll del metabolismo es amfibólica, funciona catabólicamente en la degradación de las moléculas producidas en la fase ll, o anabólicamente en la formación de moléculas precursoras de la biosíntesis de las macromoléculas celulares.
6
Tabla
1.2 Actividad
biosíntetica durante los veinte minutos del ciclo de replicación de E. coli. (Lehninger, 19711
Componente
químico
Poreentaj de peso
e
geco
Peso
molecular aproximado
Número de mo1écu1as
por cé1uIa
¿,¡I
E
2-O0O.000-000
1
¿RN
10
1.000.000
15 - 000
Proteínas
70
60.000
1 .700 . 000
Lfpidos
10
1-000
15.000.000
200.000
39 - 000
Po]-igácáridos
Componente
qulmieo
ittolécuIas
sintetizadae por eegundo 0,00083
Protefnae
LÍpidos PoIi-sacáridos
Porcentaj e de Ia energría biosintética total
2,5
75 .000
3,1
1.400
2.120.OO0
88,0
12 .500
87.500
3,7
65.000
2,'7
'
ARN
Moiéculas de ATP, gintetizadas por segundo 60.000
ADN
1.2.1
.
5
1-2,5
2'
tr
Procesos de producción de energía
Las funciones espécff¡cas del metabolismo son: ohtei$d.éBéiOÉ WfraíGá del de les'§f,nítáncia§,éSgánic᧠nutritivaso¡& +a h¡z sotar;'tünvert¡r t''e¡óoÉniÑ, I éfiffiú :,"estruefti f alé§ ; dé' {bs
¡trtitffi
r
ebñrF6ñente§rinácród}oléeü]&gi€á iras 'céIulas; Éünir.:bé precffiúbré§'itáfa formar protelnas, ácidos nucle¡cos, lfpidos, pókácáiíüé§i} Otros ccñrB4*üñtés
€
celulafes; formar y degradar las biomoléculas necesarias para las funciones celulares especializadas. El propósito de esta Sección es presentar un resumen de los principales procesos mediante los cuales la célula obtiene energía.
1.2.1.1
Glucólisis
La glucólisis es una de las diversas rutas empleadas por diferentes especies dd
organisrtos para degradar anaeróbicaments h glucosa hasta ácidó iáct¡co,'üon: elobieto de obtener energía qufmica, Los carbohidratos constituyen la clase más importante de sustancias carbonaceas nutritivas para los microorganismos. Algunas especies metabolizan también aminoácidos, hidrocarburos, grasas y aceites. La mayoría de los microorganismos que metabolizan carbohidratos, fermentan la glucosa, según las rutas conocidas como Embden-Meyerhof:ty del fosfato pent6a. Otro tipo de fermentación anaerobia es la fermentación alcohólica, donde las levaduras degr:adan la glucosa hasta etanol y dióxido de carbono. Los organismos facultativos después de catabolizar la glucosa oxidan aeróbicamente los productos de la fermentación. La ruta anaerobia de escisión de la glucosa precede a la fase aerobia de la respiración. Este proceso es caracterlstico, no sólo de muchas bacterias, levaduras y hongos, sino también de las células aerobias de la mayor pafte de los animales superiores y de las plantas.
1.2.1.1.1 Ruta metabólica Embden-Meyerhof-Parnas
En la Figura 1 .3 se representa la ruta metabólica Embden-Meyerhof-Parnas, EMP, conocida también como la ruta del difosfato hexosa o ruta de la glucólisis. El piruvato formado en la ruta EMP es una fuente de precursores anabólicos claves y para los organismos aerobios constituye también un sustrato para la oxidación. Para los organismos anaerobios, el piruvato, o los productos de su transformación, constituyen los agentes reoxidantes de la forma reducida del nicotinamid-adenln-dinucleótido, NADH.
B
Figura
1.2
Fases del catabolismo y del anabolismo. Las rutas catabólicas son
representadas con flechas descendentes y las anabólicas mediante flechas ascendentes. La fase lll es amfibólica, constituye la ruta finalde la degradación de los alimentOs hasta COz la cual proporciona las sustancias precursoras de pequeño peso molecular para el anabolismo'
Polisacáridos
Protefnas
hexosas
aminoácidos
II
Fasel
il
pentosas
1t
lt
gliceraldehldo
3-fosfato
rt
fosfoenolpiruvato
Fase ll
Itr
piruvato
1l
Fase
lll
llr tt fumarato
succinatcí
CO,
La ecuación global de la glucólisis por la ruta EMP es:
t1 .11
2Hro'ao +2NADII +2ATP +2H2O +2H
Figura
1.3
Ruta metaból¡ca EMP. (Ratledge,
tg87)
l
i
Símbolos; Pr,ion fosfato; Pr fosfato; Pr:difosfato. Los pasos 6-10, incluyen 2 rholes deireactivos y productos por'mol.de:glucosa utilizada. Las enzimas que actúan en la ruta EMPson: (1)hexoqujnasa, (2) glucosa fosfato isomeraea, (31 fosfofructqquinasa, (4) aldolasa, (5) triosa fosfato isomerasa, (6) gliceraldehÍdo fosfato' deshidtogenasa, (7) 3-fosfoglicerato quinasa, (8) fosfo-gt¡ceromutasa,.
ATP
t2t
glucosa
glucosa 6-P
=...--
fructosa 6-P
ADP ATP
dihidroxiacetona 1-P
(s)
fructosa 1,6-P2
NAD*
ADP
(6)
gliceraldehído 3-P
glicerato 1,3-P2
NADH
+
HT
(9)
fosfoenol piruvato
+
H2O
glicerato 2-P ADP 110)
ATP
10
prruvato
glicerato 3-P
_
1.2.1.1.2 Ruta metabólica del fosfato-pentosa
La mayoría de los microorganismos metabol¡zan entre el 66Yo V 80% de la glucosa por la vla EMP y el resto por la ruta del fosfato pentosa, o ruta del monofosfato' hexosa. En la Figura 1.4 se muestran los pasos de !a ruta del fosfato pentosa.
Figura
1.4
Ruta metabólica del fosfato pentosa.
Símbolos: P, fosfato. Las enzimas que actúan en la ruta del fosfato pentosa son: (1) hexoquinasa, (2) glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, (3) fosfogluconato deshidrogenasa, (41 isomerasa, (51 epimerasa, (6) transquetolasa, (7)transaldolasa, (81 transquetolasa. (Ratledge, 1987) NADP (1)
glucosa
glucosa 6-P
ribosa 5-P
ribulosa 5-P
gluconato 6-P
I
xilulosa 5-P fructosa 6-P eritrosa 4-P piruvato
11
1.2.1.2
Respiración
La célula microbial tiene la capacidad de reproducirse a partir de sustancias nutrit¡vas simples. El número de rutas metabólicas utilizadas por una célula para lograr su reproducción es muy grande. Probablemente una célula bacterial contiene aproximadamente unas mil enzimas díferentes, y una célula eucariótica el doble. En todas las rutas metabólicas diversos sistemas enzimáticos transforman los sustratos con o sin cambio del esqueleto carbonado y los convierten en aminoácidos, lípidos, vitaminas y muchos otros componentes celulares y productos del metabolismo. Resulta imposible en un texto de nivel introductorio, describir las numerosas rutas metabólicas, su estudio corresponde a la bioqufmica general. Las principales rutas catabólicas descritas en la sección anterior conducen hacia la formación de piruvato y funcionan también durante la respiración. Las
reacciones tfpicas de la respiración parten de piruvato, como sustrato de la oxidación y como fuente de precursores anabólicos fundamentales. En la Tabla 1.3 se presenta una lista de algunos agentes oxidantes y reductores y de los correspondientes organismos que realizan la respiración. En ausencia de oxígeno e! proceso se denomina respiración anaerobia.
1.2.1.2.1 Giclo del ácido tricarboxílico
En la Figura 1.2 se muestra la admisión, a la Fase lll del catabolismo, de los grupos acetilo. obtenidos en la Fase ll, a partir de los carbohidratos, lfpidos y aminoácidos. La Fase lll está constituida por un sistema multienzimático, catal¡zador delciclo delácido tricarboxílico (Figura 1.61. Este ciclo se desarrolla en tres etapas: En la primera se forma Acetil-Co-A, a partir de la oxidación de piruvato, ácidos grasos y aminoácidos. En la segunda se producen CO, y átomos de hidrógeno mediante la degradación de los restos acetilo en el ciclo del ácido tricarboxílico. En la tercera etapa, los electrones equivalentes a los átomos de hidrógeno, son transportados mediante la fosforilación del ADP, hasta el oxígeno molecular.
13
Tabla
i .
1.3
Reductores y oxidantes en las respiracioneg bacteriales. (Sistrom, 1969),
Reductor
Oxidante P¡oductos
H2
02
'
(SO4)'?-
H2
Compuestos O,
orgánicos
, i'.
Oz '
NH,
,,
9rganlsmo
.' Bacter:ia§ de1
Hro
:"hidrógeno HrO
+ 52-
,QO,
+
Desulfovibrlo
ltrrO
(NOr) - + HrO
Muchas bacEerias todas 1as plant.as y animales ij
I ,
::i
:
Bacterias .'' ni,trifipant.es
ir,r,, ..,j
(NO;)- '
O,
CompuesEos (NO3) orgánicos
(NO3);-:'
t.
+ fLO
N, + CO,
Bacterias
denitrificantes :.
(Fe)
2t
02
Baeterias nitrif icanEes ';.. "'
1Fe)'*
- i-
¡
FerrobaciTLus (bacteria del
hierro)
s2-
02
(so{)'?- +
.
Hro,
rhiobaciflus ,(bgceeria de1 a.zufre) ii
La'reposición de los intbrmeUiarios del ciclo se reálizá' mediante reacciones eiri¡mát¡cas,¡üenoininada,é anapleróficas. Si se remüeve un iótermediario; no se sintetiza oxalacetáto. n¡ se régenera c¡trato. La reacción anaplerótica más amportánte es te carboxilación del piÍuvató para formar oxalacetato, poi acción de la enzima piruvato carboxilasa 14
En los organismos que se desarrollan con acetato, como única fuente carbona-
da, entra en juego la derivación del acido glioxflico (lfnea a trazos de la Figura y otros 1 .6), una variante del ciclo del ácido tricarboxflico, formándose succinato 'Muchas para ruta de otra disponen células intermediarios, a partir de acetato. receptor degradar glucosa, conocida como ruta del foSfogluconato, El electrónico de estas reacciones es el nicotinamid-adenfn-dinucleÓtido-fosfato, NADP. Su forma reducida el NADPH, es uno de los principales reductores en la sfntesis de moléculas ricas en hidrógeno tales como los ácidos grasos y el colesterol.
Figura 1.6 Ciclo del ácido tricarboxílico. (Ratledge, 1987).
Slmbolos: Las líneas a trazos corresponden a la derivaciÓn glioxilato; FAD, FADHr: flavin adenfn dinucleótido y su forma reducida; NAD, NADH: nicotinamid-adenín dinucleótido y su forma reducida; GDP, GTP: nucleótidos de la guanosina, difosfato y tr¡fosfato, respectivamente; ADP, ATP: adenosin difosfato y adenosin trifosfato, respectivamente; Co-A: coenzima A'
fosfoenolpiruvato
--->
azúcares
ATP (13)
malato
(10)
aconitrato
oxal-
acetato
(3)
NADH I (1 1
fumarato
FADI I
I
isocitrato
NADH CO,
Co-A
","",1',,,i1o'[ t7t
)
I
succinilCo-A
l(6) NAD*
15
Las,enzimas que intervienen en el ciclo del ácido tricarboxílico son; (1) citrqto
sintetasa; (2) y {3): aconitasa; (a} v {5) ,isocitrato deshidrogenasa; (6} 2 oxogluconato deshidrogenasa; (7) succinato tioquinasa; (8) succinato deshidrogenasa; (9) fumarasa; (10) malato deshidrogenasa; (,1,1) isocitrato liasa; (12) malato'sintasa; (1 3) fosfoenol piruvato carboquinasa.
1.2.1.2.2 Transporte electrónico y fosforilación oxidativa
y la fosforilación oxidativa representan la última fase de la oxidación biológica. Los electrones, separados de los intermediarios del ciclo del ácido tiicarbbxílics, fluyen por una cadena de múltiples eslabones, coiistituidos por las enzimas de transporte electrónico con niveles de energfa El transporte electrónico
'sucesiVamente menores, hasta alcanzar el oxígeno molecular, últ¡mo aceptante electrón¡co en la respiración. En este proceso se conserva la mayor parte de la energía libre de los electrones
mediante el proceso de fosforilación oxidativa, como energfa asociada al enlace fosfato del ATP. En los tejidos animales y vegetales, las enzimas catalizadoras del transporte electrónico y la fosforilación oxidativa están local¡zadas en los mitocondrios.
1.2.1.2.3 Reacciones de oxidac¡ón-reducc¡ón a
Numerosos procesos biológicos de conversión de energía incluyen reacciones de oxidación-reducción, Oxidación es una pérdida de electrones y ieducción es una ganahcia de electrones. Un sistema tfp¡co de oxidación-reducción (O,9) se puede expresar como: 11.2t
Donde, n: número de electrones transferidos en la reacción. si un electrodo de 16
metal inerte (platino o plata) se sumerge en un sistema OR, se establece una diferencia de potencial entre los electrones en la solución y los del metal, conocida como potencial de electrodo :
E = Eo
*
R'T ,nlox'l
n.F
t1.31
lred.l
Donde, Eo, es una constante espec¡al para un sistema dado, conocida como potencial de electrodo patrón, o fuerza electromotriz patrón; R : 8,314 J.(mol.K)-1: constante de los gases; F:96,485 kJ.(mol.V)'l: constante de Faraday; r: temperatura absoluta, Ki lox.l y lred.l: concentraciones de las formas oxidada y reducida del sistema Un electrodo sumergido en una solución de un sistema OR forma lo que se conoce como semipila, cuya diferencia de potencial es imposible de medir, ya que se trata de un electrodo simple. Para medirla se combina con otra semipila, obteniéndose entonces una pila completa. La diferencia de potencial entre ambas semipilas se mide con un potenciómetro. En la determinación del potencial de electrodo de un compuesto se requiere un
electrodo de hidrógeno como patrón de referencia cuyo potencial es arbitrariamente definido como cero. En lugar del electrodo de hidrógeno puede utilizarse un electrodo de construcción más sencilla, como el de calomelano, cuya diferencia de potencial con relación a la semipila de hidrógeno se conoce exactamente, Por consiguiente hay necesidad de definir un nuevo símbolo: En, donde h indica que elelectrodo de comparación ha sido calibrado con respecto al de hidrógeno:
En=E'Es
I1.41
Donde E, es el potenc¡al de electrodo del hidrógeno que, por definición, es cero.
Por tanto, la ecuación general para calcular el potencial de electrodo de un sistema OP es:
E¡=Eo.yr:*+H
t1.51
"t7
El valor.de E^ varía de acuerdo con el valor de la relación entre las concentrac¡ones de la forma oxidada y la forma reducida. Cuando estas concentraciones son
iguales: E¡
:
Eo.
Sí se conoce el valor de Eo, se puede calcular el potencial de electrodo del sistema en cualquier grado de oxidación o reducción. Por otro lado, el grado de oxidación se puede obtener a part¡r de la medición del potencial de electrodo. EI término E" se refiere a mediciones realizadas a pH cero. una condición difícil de lograr en la práctica. El término Eo' se utiliza Bara indicar. que el potenciat de electrodo patrón fue establecido a un dado valo|de pH.
El potencial de reducción de una media reacción, en la cual las formas oxidada y reducida están presentes en concentraciones no patrón, se calcula a partir de la ecuación de Nernst:
E=
E'* R'r ,n lox'l n.F lred.l
[1,6] .
Otra forma de la Ecuación [1.6] es:
-
(n.F.AE)) =
- n.T.ln K,
11.7t
Donde K. es la constante de equilibrio. El término de la derecha de la Ecuación [1.7] coincide con el mismo término de la Ecuación t1.31, portanto;
LG; =
-
n.F.A,E',
t1.81
Donde, n: número de electrones transferidos; F: constante de Faraday [F : 96,5 kJ.(mol.V)-l]; AEo': cambio de potencial estándar, V; AG"': cambio de energía !ibre estándar, kJ/mol. En la Ecuación [1.8] el valor de AE"'debe ser positivo, con el propósito de obtener un AG"'negativo, o sea, un valor positivo de AEo' indica una reacción
espontánea. De acuerdo con la Ecuación [1.8] el cambio de ener,gía libre estándar de una reacción puede calcularse a part¡r de la diferencia entre los valores de Eo'. De igual manera, puedecalcularse una variación deenergía libre para sistemas individuales y, de esos datos, calcularse una variación de energía libre de los sistemas combinados: 1B
^G;=^GA-^G;2
t1.91
En las reacciones de transferencia electrónica, como las que ocurren en la cadena respiratoria, los electrones son transferidos desde un donante, o reductor, hasta un aceptante, u oxidante. En algunas reacciones la transferencia se efectúa mediante átomos de hidrógeno. En este caso deshidrogenación equivale a oxidación e hidrogenación equivale a reducción.
- Reacciones ácido-base: Donanúe de Ptonnes
H
(===)
tl.101
+ Aceptanfc de protorus
- Reacciones de oxido-reducción:
tl.11I
e-
+ Acepttrúe de electrones
L" t"nd"n"ia de un reductor a perder electrones se expresa
mediante el potencial de reducción estándar, definido como la fuerza electromotriz, en Voltios, suministrada por un electrodo en una disolución de un reductor y de su oxidante conjugado, cuando la concentración de ambos es 1 M, a 25oC y pH 7,O. En la Tabla 1.4 se presenta un resumen de los potenciales de oxirreducción de algunas reacciones bioquímicas. En esta Tabla se observa que et acetaldehído tiene una tendencia muy alta a perder electrones y oxidarse hasta ácido acético, mientras que el agua tiene muy poca tendencia a perder electrones y formar oxfgeno molecular,
Cualquier sistema Or? puede ser oxidado por un sistema más positivo, esto es, situado en una posición más baja en la escala, Debe tenerse presente que frecuentemente se requiere un catalizador con el propósito de lograr una reacción entre ambos sistemas. La mayoría de los pares electrónicos que ingresan a la cadena resp¡ratoria proviene de algunas enzimas conocidas como deshidrogenasas ligadas a la piridina, catalizadoras de las siguientes reacciones generales:
19
susffato redrcifu + NAD'
(===) a1.12)
§/istrato oxidado + NADH + H.
t1'13I s'ustrato oxidado + NADPH +
.
r
H'
''';i
;-
Donde, NAD, NADH: nicotinamid-adenín-dinucleótido y sq.correspond¡ente forma reduc¡da; NADP, NADPH: fosfato de nicotinamid-adenfn-dinucleótido y su correspondiente forma reducida.
Tabla
1.4
Potencial de reducción estándar de algunas reacciones bioqufmicas, (Lehninger, 1973)
Reacción
Actividad unitaria de todos los componentes, Eo' pH: 7,0 éxcepto el H*. cuya concentraciOn'es tO:TM. Voltios .. Gases: 1 atmosfera de presión. acetato + CO, acetato
+
+ 2H* + 2e ->
zH.',
+
'2e
!..
ferredoxina- Fe*3
+
piruvato
-> acetaldehfdo
1e
+
2H*
+ 2e-->
electrones
- O,7O -
0;60
a
--> ferredoxina-Fe*z - 0,432
H*+1e--)O,5H, CO,
Dirección flrjo
- 0,42 formato
co-A " + 2H' + 2e--> malato
- 0,42
acetil-co-A + 2.H* + 2e--> acetaldehfdo +
- o,41
piruvato + CO,
-.9,33 Continúa
20
Tabla 1.4 (Continuación) Reacción
Actividad unitaria de todos los componentes, excepto gf H* cuya concentración es 10-7 M. Gases: 1 at¡nosfera de presión.
acetaldehído NADPT
+ 2H* + 2e -->
+
NAD*
+ 2H* + 2e -->
2H*
piruvato +
H-
oxaloacetato
-
r;,;,j*r.,""
+ 2H* + 2 e-->
+ 2H* + 2e--)
ubiquinona + .?H. crotonil-Co-A
-i*,o
malato
-,.o.32
-
ubiquinona-H,
+ 2 H* + 2e ->
butiril-Co-A
o,14
- 0,102 -
succinato
+ 2e -->
63
- 0,19
FADH2
+ 2H* + 2e -->
O,1
0,06
+ 0,03 + 0,10
+ 0,19
citocromo c-Fe*3
+
1e
->
citocromo c-Fe*2
. + 0,25
citocromo a-Fe*3
+
1e
->
citocromo a-Fe*2
+ p,29
:
:1'
0,5 02 + HrO + 2e --> HrO, Fe*3
+ 1 e-->
O,5 02
Dirección flujo electrones
- o,32
2H* + 2e --> lactato _NHs
fumarato
+
+ 2E--> NADH + H*
o-cetosrutarato r
FAD
¡-
etanol
NADPH
,Eo'. pH: 7,0 Voltios
Fe*2
+ 2H* + 2e --)
HrO
+ 0,30 +
O,771
+
O,816
21
Otras enzimas asociadas al transporte electrónico son las deshidrogenasas ligadas a la flavina, constituidas por flavin-adenín-dinucleótido IFADI o flavinmono-nucleótido IFMM. Los electrones y átomos de hidrógeno, participantes en las oxido-reducciones, son conocidos como equivalentes de reducción. La coenzima O, conocida como ubiguinona, por su ubicuidad en todas las células, es el aceptante de los equivalentes de reducción de las deshidrogenasas ligadás a la flavina. Lob electrones aportados por las flavin-deshidrogenasas son recogidos por la coenzima O. La velocidad de transporte electrónico se controla mediante las concentraciones de ATP
y ADP. Los citocrornos, grupo de
ferroproteínas responsables de la transferencia de electrones en las células aerobias, actúan secuencialmente en el transporte de electrones desde la coenzima O hasta el oxígeno molecular. Todos los componentes de la cadena respiratoria aceptan electrones de los compuestos precedentes en la cadena y los transfieren al siguiente eslabón.
1.3 APLICACIONES DE LA INGENIERIA BIOOUIMICA
Las aplicaciones de la ingeniería bioquímica son numerosas. En las Tablas 1.5
y 1.6 se presenta una lista de algunos productos industriales, diferentes de los antib¡ót¡cos, producidos por bacterias (Tabla 1,5), y por hongos (Tabla 1.61. En el Capítulo 4, se presenta una lista de aplicaciones industriales de las enzimas. La Tabla 1.7 es una lista de algunos productos, obtenidos a partir de bacterias y hongos, útiles comó ant¡b¡óticos.
Otros productos farmacéuticos obtenidos por biotecnología son: antígenos (sustancias que est¡mulan la respuesta de los anticuerpos); sustancias para diagnostico; endorfinas (neurotransmisores); gammaglobulina (prevención de infecciones); hormona de crecimiento humano; seroalbúmina humana (tratamiento de trauma físico); reguladores inmunitarios,insulina, interferón (tratamiento de infecciones); interleuquinas, limfoquinas (modulación de la reacción inmunitarial; anticuerpos monoclonales (diagnóstico y liberación de drogas); péptidos neuroactivos, vacunas, etc.
22
Algunas aplicaciones de la biotecnología en agricultura son: desarrollo de plantas
con mayor capacidad de fotosíntesis y fijación de nitrógeno; desarrollo de insecticidas biológicos, pesticidas, fungicidas y herbicidas, Algunas aplicaciones industriales de la biotecnología son: producción de ácido acético, acetona, butanol, etanol, gas carbónico, h'idrógeno, aminoácidos, enzimas, vitaminas, lfpidos, bebidas dlcohólicas, proteína unicelular, edulcorantes y biopolímeros; separación de minerales¿ coñc€fltración de metales; control de la contaminación; degradación de residuos tóxicos; recuperación de derrames de petróleo; producción de biosensores.
Tabla
1.5 Algunos productos industr¡ales,
diferentes de los antibióticos, producidos por bacterias. Pelczar, et a|.,1977.
PRODUCTO
MICROORGANISMO USOS
Butanolacetona
Clostrídium acetobutylicu¡n y otros
química
2,3 Butanodiol
Bacillus polimixa, Ent. aerogenes
Solvente, fiumectante, intermediario químico
Micrococcus
Ad¡tivo de alimentos
Lisina
Solventes, manufactura
glutamicus Dihidroxiacetona
G. suboxydans
Producto qulmico fino
Acido láctico
Lactobacillus delbruecckii
Productos alimenticios, text¡les y lavanderías, manufactura qufmica, curt¡do de pieles
Amilasa bacteriana
Bacillus subtilis
Modificador de almidones, encolado de papel, desencolado de textiles
Proteasa bacteriana
B. subtilis
Laminado de pieles, desencolado de fibras, quitamanchas, ablandador de carnes Continúa
23
Tabla
1.5
Continuación
PRODUCTO
MICRORGANISMO
usos
Dextrán
L.mesenteroides
Estabilizador de al¡mentos, sustituto del plasma sanguÍneo
Sorbosa
G.suboxydans
Manufactura ácido ascórbico
Cobalamina
olivaceus; Propioni' bacterium freuden-
reichii
Tratamiento de la anemia perniciosa; suplemento alimenticio
Acido glutám¡co
Brevibaéterium sg.
Aditivo de alimentos
Estreptoquinasaestreptodornasa
Streptococcus
Disolvente de coágulos sanguíneos
Tabla
S.
hemolyticus
1.6 Algunos productos industriales,
diferentes de los antibióticos, (Pelczar, et al, 19771 deriVados de los hongos.
PRODUCTO
M¡CROORGANISMO
Acido cítrico
Aspergillus niger
A.wentii
usos Productos alimenticios, citratos medicinales, en sangre p'ara transfusiones
Acido fumárico
Rhizopus nigricans
Manufactura de resinas alquÉ dicas, agentes humectantes
Acido glucónico
A.niger
Productos farmacéuticos, textiles, curtido de cueros, fotograffa
Acido itacónico
24
A. terreus
Manufactura de resinas alqufasentes nr."".¿:1";r"
Tabla
1.6
Continuación
USOS
PRODUCTO
MICROORGANISMO
Pectinasas
A.
1-y-hidroxiprogesterona
R. Arrhizus, Rhizopus
nigricans, olros
Acido giberélico
Fusarium monoliforme Guarnición de frutas, producción de semillas
Acido láctico
R. orizae
1
Tabla
1.7
wentii
A. aurcus
Agentes clarificantes en la industr¡a de jugos de frutas
lntermediario para 17 -yhidroxicorticoesterona
Alimentos y productos farmacéuticos
Productos metabólicos de bacterias y hongos Útiles como
ant¡bióticos (Pelczar, et al,, 19771
ANTIBIOTICO
DERIVACION
ESPECTRO
MODO DE
PRODUCIDO
MICROBIANA
PRIMARIO
ACCTON
Ampicilina
Penicillium sp
Bacterias gram positivas y gramnegativas
lnhibe sfntesis de la pared celular
Streptomyces nodosus
Varias micosis causadas por hongos
lnterfiere la función de la
Bacillus
Bacterias
subtilis
grampositivas
lnhibe síntesis de la pared celular
S. halstedii
Rickettsias, bacterias grampositivas
Amfotéricina
I
Bacitracina
Carbomicina (Magnamicina)
membrana
lnhibe la síntesís de protefnas Cqntinúa
25
Tabla 1.7 (Continuaciónl
ANTIBIOTICO
DER¡VACION
ESPECTRO
MODO DE
PRODUCIDO
MICROBIANA
PRIMARIO
ACCTON
Cefalosporina C
Cephalosporium
Bacterias
lnhibe síntes¡s
sp.
grampositivas
de la pared celular
Cloramfenicol (Cloromicetina)
S. venezuelae
Amplio espectro
lnterfiere síntesis de protefnas
Clortetraciclina (Aureomicína)
s_
Amplio espectro
lnterfiere sfntesis de proteínas
Colistín
B. colistinus
Pseudomonas spp.
Deteriora la
aureofaciens
(Colimicina)
membrana
celular Cicloheximida (actidiona)
S. griseus
Hongos,
lnhibe sfntesis
especialmente micosis de las
o" ,ro.r=tn". .
plantas,*'Cicloserina
Dimetil
:
S.orchidaceus, S. lavendulae
Mycobacterium tuberculosis
lnhibe síntgsis de la pared celular
S. aureofaciens
Amplio espectro
lnterfiere la sfntesis de proteínas
tetraciclina
mutant
Eritromicina (lloticina)
S. erythraeus,
Fumagilina
Aspergillus fumigatus
(Amebacilina)
Rickettsias, bacterias grampositivas Amebas
,
,'
,
lnterfiere la sfntesis de proteínas
lnterfiere la síntesis de proteínas Continúa
26
Tabla 1.7 (Continuación)
ANTIBIOTICO
DERIVAC¡ON
ESPECTRO
MODO DE
PRODUCIDO
MICHOBIANA
PRIMARIO
ACCrOñr
Griseofulvina
Streptomyces griseus
Hongos patógenos
lnterfiere la sfntesis de la pared celular del hongo y del ácido nucleico
Kanamicina
J. kanomyceticus
Myco-
lnduce slntesis de proteínas anormales
bacterium tuberculosis
Bacterias
Lincomicina
gramposit¡vas Meticilina
lnhibe slntesis de proteínas
Estafilococos'
lnhibe síntes¡s de la.pared celular
Bacterias gram positivas y gramnegativas; M. tuberculosis
lnduce síntesis de proteínas anormales
Bacterias
lnhibe polimerización
Neomicina
S. fradiae
Novobiocina (Catomicina)
S. griseus; S. niveus S.,spheroides
grampositivas
S. noursei
Candida
Daña la
intestinal; hongos
membrana celular
Rickettsias; bacterias grampositivas
lnhibe síntesis de proteínas
Nistatina
Oleandomicina
s. Antibioticus
del
ADN
Continúa 27
Tabla 1.7 (Continuación)
t ANTIBIOT]CO,
DERIVACION
ESPECT8O
MoDooE
PRODUCIDO
MICROBIANA
PRIMARIO
ACCTON
Oxitetrocielina
S. rimosus
Amplio espectro
(terramicinal'
Penicllina G
Polimixina B.
Estreptom¡oiña, '
Vancornicina
BacteriaS"' grampositivas
lnhibe síntes¡s de la pared celular
B. polymixa
Bacterias'"
gramnegativas
Deteiioiá la pared celular
Bacterias gram
lnduce i'
positivas y
protefnas
gramnegat¡vasi M. tubercülo:si§
anormales
S,
griseus
i'
S. aureofaciens
S. o¡Entalis
Amplio espectro
Bactdrias
grampos¡t¡vas
Neisseria, tetani('
Cl.
Viomicina
28
lnterfiere la síntesis de proteínas
chrysogemtm
P.
-{.1
Tetraciclina
,'
S. floridae
lnterfiere la síntesis de proteínas
lnhibe " síntesis de la pared celular
M.
lnterfiere la
tuberculosis
slntesis de protefnas
:
1.4 CONSIDERAC¡ONES
GENERALES SOBRE EL DISEÑO PRELIMINAR DE UN BIOPROCESO
Generalmente
un proceso bioquímico se puede descomponer en
etapas:
Breparacióñ dé materias primas; éster¡lización del e@po, del medio de fermentaóiOn y dei aire; biosíntesis; séfraraciórt y'PuÍificaciüh O" los pioducios di la fermentaCión; tratamiento de agua para consumo; tratam¡ento de aguas residuales, y tratamiento de los residuos sólidos y del aire efluente de la planta.
Los balances de materiales y de energía facilitan, en el caso de productos con rutas bioqufmicas conocidas o estudiadas, la evaluación de los rendimientos de sustrato en células, y de sustrato en producto, los requerimientos de oxígeno, y la formulación de los medios de crecimiento y producción, con el propésito de satisfacer las necesidades de formación de biomasa y de productos' Las velocidades de consumo de §ustrato y formación.de producto dependen del microorganismo especffi'co'y de lás condiciones dé crecimiento. Estas velocidád es geneialmenté son eva luada,s *Iyartir de datos experiinentaÍé§' o-tñecliante' l a analogía con procesos sirhitáre3. El rendimiento de sustrato en producto es afectado por el carácter lábil de las
biomoléculas suscept¡bles de degradarse en la etapa de separación y purificación, La baja concentración de producto en el efluente del reactor y la naturaleza
y
concentración de los contaminantes influyen desfavorablemente en
el
rendimiento del proceso. Una vez producida la ruptura de las células, si el proceso es intracelular, el producto aparece mezclado con otras biomoléculas con propiedades muy similares a las del producto final, lo cual dificulta su recuperación. La pureza inicial del producto depende de su localización intra o extracelular.Los altos requerimientos de pureza, en el casO de algunos productos farmacéuticos, pOr ejemplo, se traducen en un creciente nÚmero de etapas
y por consiguiente,
en un menor rendimiento del proceso.
29
1.4.1
El biocatalizador
Los recientes avances en genética
y
bioqufmica facilitan
la utilización de
enzimas, célulás y tejidos animales y vegetales para la producción de moléculas biológicamente activas. Uno de los aspectos fundamentales en el diseño de un bioproceso es el desarrollo de cepas de producción, Una cepa hiperproductora
crece usualmente a menor velocidad que una silvestre y generalmente es eliminada en el ambiente natural altamente competitivo. Además la célula esta sometida a estr¡ctos controles de tipo inhibitorio y represivo con el propósito de prevenir la sobreproducción de metabolitos y conservar los recursos para funciones más qsenciales tales como la reproducción, El desarrollo de nuevas cepas requiere la comprensión de los sistemas de control celular y el empleo de algunas herramientas de la biología molecular tales como genes mutadores, transposones y mutagénesis en sitios especlficos. Generalmente el biocatalizador seleccionado es una enzima cuando la conversión
de las mater¡as primas en productos útiles sólo requiere una o dos reacciones simples. Se prefieren enzimas solubles, si no son costosas o no es necesaria su remoción del producto final, como en el caso de la hidrólisis del almidón con o amilasa y glucoamilasa. En el caso contrario se prefiere la utilización de enzimas inmovilizadas, La población celular se mantiene en estado de crecimiento cuando el producto deseado es biomasa, como en el caso de producción de levadura de panadería o de protelna unicelular, o cuaQdo el producto es extracelular o cuando la forma-
ción de producto está asociada al crecimiento. Si hay necesidad de limitar la cantidad de materia prima, para facilitar la recuperación de producto, conviene utilizar una población celular en crecimiento estable o en crecimiento deten¡do. En este caso las células pueden inmovilizarse sobre soportes adecuados, Generalmente, si la formación de producto puede ser independizada completa o parcialmente del crecimiento, como en el caso de los cultivos con poblaciones bacteriales mezcladas en las plantas de tratamiento de agua, o.en la producción de etanol a pArt¡r de levaduras, se utiliza un reactor donde la población celular pueda mantenerse en un estado de crecimiento detenido con el propósito de disminuir el requerimiento de materias primas, facilitar la recuperación de producto y lograr mayores productividades.
30
1.4.2 Cultivos de células y tei¡dos
Las células inmOvilizadas de tejidos animales y vegetales pueden cultivarse y aumentar en número y tamaño fuera del cuerpo donante. Feder y Tolbert, 1 983, presentan algunas de las principales diferencias entre los cultivos de tejidos y los cultivos de microorganismos:
- Las células de tejldos animales y vegetales son de mayor tamaño que las células de bacterias y hongos. El metabolismo de las células animales y vegetales es más complejo y lento que el de las células microbiales, lo cual se traduce en una menor productividad
-
y en períodos más prolongados de esterilización. - Las células de tejidos de plantas y animales son más sensibles a los esfuerzos cortantes (agitación) que las células microbiales. Las células animales están envueltas en una delicada membrana plasmática. Generalmente estas células sólo crecen adheridas a una superficie.
Las células de tejidos animales y vegetales forman parte de un tejido organizado y no pueden considerarse como un organismo celular individual''
-
- Las células animales no metabolizan nitrógeno inorgánico y sus requerimientos nutricionales son más exigentes que los de los microorganismos' El medio de
cultivo requiere aminoácidos, vitaminas, hormonas, factores de crecirniento, sales minerales y glucosa. Uno de los medios más utilizados es el suero de Sangre, pero eS costoso y puede Ser fuente de Contaminación con virus y micoplasma. La naturaleza química del suero varía de uno a otro lote y la presencia de tantas protefnas diferentes en este medio complica los procesos de
separación y purificación del producto'
Los cultivos de tejidos de mamíferos son utilizados para la producción de Sustancias bioquímicas tales como la hormona de crecimiento, interferÓn, vacunas antivirales y ant¡cuerpos monoclonales. Algunas de estas sustancias inicialmente eran extrafdas de animales vivos y de cadáveres'
31
- .?
Cuando una sustancia extraña entra al cuerpo de un anirnal vertebrado, sus linfocitos segregan proteínas denominadas inmunoglobulinas o anticuerpos con la propiedad de reconocer algunos sitios de la sustancia extraña, los antígenos. El anticuerpo se liga al antígeno para neutralizar y eliminar la sustancia extraña. Los anticuerpos constituyen una herramienta poderosa en la identificación y detección de drogas, Broductos bacteriales y virales, hormonas y otros anticuerpos en muestras de sangre, Los cultivos,de tejidos vegetales constituyen una fuente valiosa de metabolitos secundarios. Estas sustancias facilitan la interacción de la planta con el medio ambiente y le permiten defenderse de 'microorganismos y predadores. Mientras los metabolitos secundarios son producidos en trazas, los metabolitos primarios tales como carbohidratos, aceites vegetales, proteínas y ácidos grasos son
producidos en grandes volúmenes.
Algunos metabolitos secundarios de interés comercial, obtenidos a part¡r de tejidos vegetales (Shuler, 1981, Sahai y Knuth, 1985) son;
- Colorantes : azafrán, antocianinas, betacianinas. - Edulcorantes: miraculina, monelina, taumattna. - Aceites esenciales: jazmín,limón, menta, naranja, ajo. =
Sabores: albaricoque, banano, cacao, durazno, frambuesa, fresa, manzana, piña, vainilla, uva, ceteza, espárrago, apto.
- Especias: cardamomo, canela, romero, safvia.
- Alcaloides: ajmalacina, atropina, codeína, Or,nina, morfina, escopolamina, serpenttna.
- Esteroides: digitoxina, digoxina, diosgenrna. - Otros: shikonina, saponina, ubiquinona.
'
Sustancias químicas para la agricultura: p¡retrinas, rotenona, sustancia químicas alopáticas.
32
1.4.3
El biorreactor
Los principios de la lngeniería Ouímica const¡tuyen el fundamento del análisis, díseñO y operación de los biorreactores. Sin embargo, deben tenerse presentes las siguientes restr¡cciones:
-
El caldo del fermentador es una mezcla relativamente compleja, durante'el proceso son sintetizados los catalizadores y generalmente hay un incremento de la biomasa microbial.
- La densidad aparente de las células y la del sustrato es usualmente slmilar a la del medio. El tamaño de las células es muy pequeño comparado con los catatizadores químicos. En condicíones normales las velocidades de flujo entre las fases continua y dispersa son relativamente peqÜeñas y difícilmente se logran condiciones de transferencia en flujo turbulento. - Los sustratos, poliméricos en algunos casos, los metabolitos y el crecimiento micelial de muchos microorganismos producen una mezcla viscosa de carácter no newtoniano que restringe apreciablemente la dinámica de fluio en el reactor. El crecimiento micelial de algunos microorganismos origina la formación de agregados celulares que dificultan la transférencia de masa y conducen al agota-
-
miento parcial de nutrientes y a la intoxicación por producto,
- Los biorreactores operan bajo condiciones moderadas de temperatura,
pH,
intensidad ionica y presión, pero estas condiciones deben controlarse cuidadosamente para prevenir daños en las células vivas y demás componentes lábiles esenc¡ales para el Proceso.
- La concentración de sustratos y productos es sustancialmente baja. consiguiente, se requieren grandes volúmenes
y
Por prolongados períodos de
retención. - La necesidad de mantener un solo tipo de microorganismo y eliminar todos los microorganismos indeseables impone restricciones adicionales al diseño del reactor.
33
Una de las etapas en el diseño de un biorreactor es la selección de las especificaciones del sistema: sistema viable o un sistema enzimático no vivo; sistema aeróbico o anaeróbico; condiciones asépticas o no asépticas; cultivos simptes o mezclados; células simples o agregados multicelulares; medios simples
o multisustrato.
Otra etapa es la selección del modo de operación: células suspendidas
,o
inmovilizadas; enzimas disueltas o inmovilizadas; sustratos_solubles o insolubles; sustratos monoméricos o poliméricos; operación continua o por lotes; procesamiento en tanque agitado o en flujo tapón; sistema sencillo o de multietapa; operación en corriente sencilla o con recirculación. Uno de los reactores más ampliamente utilizados en la industria bioquímica es
el reactor de mezcla completa (SIR) operado en forma continua (CSIR)
o
discontinua ldCSTRl. También son muy utilizados los reactores de lecho fijo en diferentes configuraciones tales como lecho empacado, el reactor con lecho formado por placas o láminas y el disco rotatorio. Los reactores impulsados por aire " airlift" utilizan aire para satisfacer la demanda
bioquímica de oxfgeno DBO,la demanda química de oxlgeno DOO, impulsar el contenido del reactor y satisfacer las necesidades de aeración y agitación en los cultivos aeróbicos,
Los reactores de lecho fijo y los de flujo tapón (PFB) son apropiados para aquellas reacciones inhibidas por la formación de producto. Los reactores agitados mantienen una concentración uniforme de sustrato y son apropiados para aquellas reacciones inhibidas por sustrato. Los reactores pueden ser operados en for'ma cont¡nua o por lotes y como lechos fijos, lechos fluidizados y tanques agitados. Los reactores operados en rnodo continuo conducen a una mayor productividad y a una util¡zación más eficiente
de¡ sustrato para la producción de biomasa, pero menos eficiente para la obtención de productos, cuandO se confrontan con los reactores operados por lotes.
Generalmente las plantas continuas funcionan óptimamente cuando Son diseñadas para un sólo producto. Las plantas multipropósito en la industria bioquímica son operadas por lotes. En algunos casos se ut¡l¡za una operación semicontinua por lotes alimentados lfedbatchl.
34
Algunos procesos requieren la recirculación del contenido del reactor. Las células son separadas del caldo mediante centrifugación, sedimentación y filtración y luego devueltas al reactor para mantener una elevada concentración celular.
Los reactores enzimáticos cqn enzimas inmovilizadas son operados de manera
similar a los reactores químicos catalíticos heterogéneos. En este caso es necesario determinar la vida media de la enzima y su desactivación en función del tiempo y los efectos de la transferencia de masa y de calor comg consecuencia de su inmovilización. La productividad de un biorreactor depende delt¡po de operación del reactor y de las velocidades de crecimiento de biomasa y de
formación de producto.
1.4.4
Esterilización
1.4.4.1
Ester¡l¡zación de equipo
Generalmente el equipo se esteriliza con vapor de agua a presión. Cuando las limitaciones de temperatura impiden la utilización de este método se emplean agéntes químicos líquidos y gaseosos de acuerdo con las circunstancias. La luz ultravioleta, las radiaciones ionizantes y las vibraciones ultrasónicas encuentran aplicación como agentes auxiliares potenciadores de otros procesos esterilizantes. Una combinación de diferentes métodos tal como vapor de agua, agentes químicos y radiación, es eficiente. En algunos casos una esterilización por etapas, donde se utilizan diferentes agentes esteril¡zantes en cada lote, puede
ser más eficaz que'cuando se empléan los mismos agentes. En cada caso especlfico deben óonsiderarse la naturaleza del equipo, los requerimientos de la esterilización y la economía del proceso. El agente o la condición esterilizante debe actuar eficientemente durante el proceso de esterilización pero una vez finalizado este proceso no debe presentarse una acción residual. En el caso de una fermentación industrial una posible acción residual puede ser tanto o más perjudicial para el proceso que la presencia de ciertos contaminantes.
35
1.4.4.2
Esterilización de medios
El objetivo de la esterilización de un medio es la remoción o eliminación de toda forma de vida animal o vegetal, macroscópica o microscópica, saprófita o no, existente en el medio. El grado de esterilización de un medio depende del proceso, Algunas aplicaciones como la fermentación láctica de hortalizas o el tratamientd biológico de residuos no requieren esterilización. En otros procesos las condiciones del medio favorecen la actividad del microorganismo deseado y afectan la'actividad de los contaminantes. Este es el caso de la fermentación alcohólica donde las condiciones normales de asepsia permiten eldesarrollo del proceso sin una reducción apreciable del rendimiento, En el caso de la producción de levadura para panificación, gracias al bajo pH requerido, basta una simple ebullición de la melaza y su posterior dilución con agua de buena calidad para una fermentación normal.
Por el contrario, hay procesos muy exigentes como los de producción de antibióticos, enzimas, vitaminas, acetona y butanol. La penicilina, por ejemplo, puede ser parcial o completamente destruida por la acción de la enzima penicilinasa producida por microorganismos contaminantes. Otro ejemplo es la fermentación de la melaza con Clostridium acetobutilicum para la producción de solventes: etanol, butanol, acetona, y gases: CO, y Hr. En este caso el microorganismo además de ser un anaerobio estricto es muy sensible a la acción de los bacteriófagos. La esterilización de medios a nivel industrial se realiza preferiblemente mediante
calentamiento con vapor de agua en los propios reactores o por separado.
En
el primer caso se esteriliza el equipo mediarite un proceso discontinuo de esterilización, y también el medio, con el propósito de evitar los riesgos de contaminación durante la transferencia del medio hacia el reactor. En la esterilización discontinua la temperatura del vapor de agua, del orden de 121 oC a 1 atmósfera de sobrepresión, garantiza la destrucción de las esporas. Sin embargo, el calentamiento del medio a elevadas temperaturas por períodos prolongados favorece la descomposición de los nutrientes. El proceso continuo de esterilización se realiza a mayores temperaturas, tlpicarnente entre 1 30 y 165 oC. El menor tiempo de esterilización se traduce en una menqr descomposición de nutrientes, una rnayor productividad del proceso, y un menor requerimiento de agua de refrigeración.
36
La esterilización continua se puede realizar mediante inyección directa de vapor
de agua a una presión entre 6,8 y 8 atmósferas, o mediante intercambiadores de placas o de tubos. En el primer caso debe preverse la dilución del medio, entre 10 y 15 o/o, por la condensación del vapor inyectado. El enfriamiento del medio esterilizado se logra en forma indirecta mediante camisas, serpentines o intercambiadores de calor.
1.4.4.3 Esterilización de aire
El punto de partida de la producción de ant¡b¡óticos, vitaminas y enzimas y muchos otros procesos de importancia industrial es una fermentación aeróbica donde se requiere un suministro continuo de aire libre de contaminantes que varia tlpicamente entre 0.5 y 1 volumen de aire por volumen de licor cada minuto. Todos los métodos de esterilización de medios pueden ser empleados con aire. Sin embargo, la esterilización de aire mediante calor no sólo es impráctica sino ineficiente debido a los bajos valores de la capacidad calorffica y de la conductividad térm¡ca del aire. Uno de los métodos más eficientes es la esterilización de aire con filtros fibrosos y filtros membrana. Se han ensayado diferentes tapos de materiales fittrantes tales como algodón, carbón, lana de vidrio, papel, nylon, teflón, polialcohol de vinilo, ésteres de celulosa, vidrio sinterizado, bronce sinterizado y materiales cerámicos. Actualmente los filtros más empleados son los de polialcohol de vinilo, formados por placas de I cm de espesor, de altura y diámetro variable desde 5 hasta 1 1O cm; los
filtros de placas de acetato de celulosa; los filtros de vela o cartucho de cerámica porosa y vidrio sinterizado; los filtros de membranas porosas de ésteres de celulosa, y los filtros de microfibras cillndricas de borosilicato envueltas en malias de polipropileno, En la práctica, el dimensionamiento de un filtro para un determinado caudal de aire, incluye la evaluación del espesor y área transversal del lecho, y la pérdida de presión del aire. Esta pérdida se relaciona con el consumo de la energía eléctrica requerida para comprimir el aire. En el caso de filtros empacados con lana de vidrio siempre existe la posibilidad de utilizar diferentes diámetros de fíbra, menor diámetro de fibra significa menor espesor del lecho. Por otra parte un aumento del grado de compactación de las fibras disminuye el espesor del lecho pero aumenta la pérdida de presión.
37
La vida media de un lecho depende de las condiciones de operación del filtro. Cada cuatro meses, aproximadamente, debe ejecutarse el cambio de lecho, Este costo adicional debe tenerse presente si se considera que el objetivo final del diseño el lograr el mejor filtro al menor precto.
1.4.5
Separación y pur¡f¡cac¡ón de productos de la ingeniería bioquímica
La aplicación comercialde los productos de la lngeniería Bioqulmica requiere uñ cuidadosa purificación qon el propósito de eliminar la actividad indeseable de
otras sustancias contaminantes. Generalmente las reacciones catalizadas por células y enzimas ocurren en una solución acuosa diluida, el producto se encuentra en muy baja concentración, en muchos casos de sólo partes por millón, y su separación requiere la remoción de grandes cant¡dades de agua, Usualmente la corriente afluente a la etapa de bioqeparación es la corriente efluente del biorreactor constituida por una mezcla diluida y compleia de dos o más fases formada por células, un líquido acuoso, nutrientes y productos del metabolismo celular. Los requerimientos de pureza del producto y la naturaleza de las materias primas
empleadas constituye la príncipal diferencia entre una bioseparación y una separación"en la lngeniería Ouímica tradicional. El gradq deseable de pureza de los productos bioquímicos significa su separasión de otros contaminantes de estructura química similar. , En algunos casos la obtención de una proteína particular significa su separación de una mezcla compuesta por las centenares
de proteínas normalmente producidas por la célula, La dificultad aumenta cuando hay necesidad de distinguir entre.estereoisómeros para obtener una preparación ópticamente pur.aLa ausencia de modelos predictivos para la mayoría de las operaciones unitarias y el gran número de alternativas disponibles, dificulta la selección de un modelo apropiado para la separación y purificación de productos. La selección del
diagrama de flujo de las etapas de separación generalmente en los.siguientes enfoques:
38
y purificación
se fundamenta
- Remover primero el contaminante más abundante. - Separar primero el contaminante más fácil de remover. - Dejar para el final del proceso las.operaciones más diffciles y costosas., - Seleccionar, el proceso basado en las mayores diferencias entre las propiedades
del producto y las de sus contaminantes,
El producto deseado puede ser intracelular o extracelular, usualmente los productos extracelulares son de bajo peso molecular (1 00 - 700 : aminoácidos, antibíóticos, esteroides), o de alto peso molecular (1000 - 100000: péptidos y enzimas), y están acompañados de una menor cantidad de contam[nantes.
1.4.5.1 Productos ¡ntracelulares
Generalmente la mayoría de las protelnas producidas por bacterias manipuladas genéticarnente no son excretadas al licor sino que precipitan dentro de la célula. Los lfpidos y algunos antib¡ót¡cos también púeden ser productoS intracelulares.
1
-4.5.1 .1 Separación de células
El criterio empleado con mayor frecuencia para la recuperación de células es la
remoción inicial del componente más abundante. La centrifugación és una operación unitaria eficiente en la separación de partículas de tamaño mayor que 5 /m y densidad ligeramente mayor que la del agua. En el caso de partfculas más pequeñas pueden usarse técn¡cas de coagulación y flocul'ád¡On. Las pérdida de células durante Ia centrifugación varfa entre 1 y 5'o/o. La filtración recupera todas las célu'las, excepto cuando hay ruptura o lisis. Generalmente las células son separadas mediante centrífugas de disco, microfiltros y ultrafiltros.
39
1.4.5.1.2 Ruptura de células
Las proteínas intracelulares pueden estar presentes en forma natural
o
desnaturalizadas. Los productos desnatural¡zados generalmente son insolubles. Algunos productos intracelulares están localizados en el espacio periplásmico
entre la membrana
y la pared celular. La ruptura de las células se logra
mediante homogenizadores de alta presión (500 de bolas, o choque osmótico.
-
1000 atmósferas), molinos
Después de romper las células y liberar el producto se requiere la remoción de
los restos celulares mediante una o varias de las siguientes operaciones unitarias: centrífugación, microfiltración, ultrafiltración, destilación y filtración (filtro rotatorio, filtro prensa). Si el producto es soluble se recupera del efluente de la centrífuga o delfiltrado. Si el producto es insoluble generalmente hay necesidad de resuspender y centrifugar repetidamente la fase pesada. Cuando no es Suficiente el lavado con agua se emplean detergentes en Solución para remover simultáneamente otros contaminantes.
1.4.5.2 Productos extracelulares
Uno de los criterios empleados con mayor frecuencia para la recuperación de productos extracelulares es la remoción inicial de contam¡nante más fácil de separar. Los productos extracelulares usualmente son separados mediante
centrffuga de discos, filtro rotatorio al vacío, microfiltración, ultrafiltración y flotación. En algunos casos la separación del oroducto eh un filtro rotatorio requiere la utilización de ayudas filtrantes y la formación de una precapa. En algunos casos la cantidad de ayuda filtrante es igual o mayor que la cantidad de producto recuperado. El principal inconveniente del filtro rotatorio es la separación o la disposición final de la mezcla de precapa y producto. La centrífuga produce usualmente una pasta formada por 57 - 70 o/o en volumen de sólidos y el resto líquido. El producto se recupera mediante sucesivos lavados y centrifugaciones. .40
1.4.5.3 Purificación final del ptoducto
Las etapas de purificación depbnden del grado de pureza requerido. Generalmente los productos'farmacéuticos requieren alta pureza. En otros casos la purificación final se límita a un secado o a una remo6ión de solventes'
Los procesos.y operacioneS unitarias empleados usualmente en lngeniería BioquíÍrica en la purificación de productos son: filtración, microfiltración, ultrafiltración, ósmosis inversa, evaporación, destilación, deshidratación, extracción, inteicambio iónico, adsorCión, Separaciones cromatográficas, esterilización y estabil¡zación del producto.
1.4.5.3.1 Filtración de células
a través de membranas
Las membranas const¡tuyen una alternativa a la separación de células mediante centrifugación. Entre los tipos de células separados usualmente por membranas están los virus, hongos, levaduras y células de tejidos animales. El flujo de una
suspensión a través de una membrana puede ser perpendicular o tangencial a la superficie filtrante. La filtración con propósitos de esterilización se realiza generalmente mediante flujo perpendicular y las partículas de mayor tamaño quedan retenidas sobre la superficie del filtro'
En la filtración en flujo tangencial el fluido se desplaza paralélamente a la superficie filtrante. Las partículas de tamaño mayor que el diámetro de poro al ser arrastradas por el fluido limpian la superficie del filtro, En la remoción de cétulas se logran caudales entre'1O0 y 1'000 veces mayores en flujo tangencial que en flujo perpendicular. La filtración a través de membrana§ es un sistema hermético ritil para ptevenir la formación de aerosoles en el sitio de la operación, aspecto muy importante cuando se manejan microorganismos patógenos O recombinantes,
41
1.4.5.3.2 Extracc¡ón líquido-líquido de antibióticos
Una etapa importante en la producción de antibióticos es la recuperación del producto presénte en el caldo de fermentación. La extracción líquido-líquido es un método efectivo y económicp para la recuperación y concentración de un número importante de antibióticos. Estas separpciones son realizadas en unidades dg contacto centrífugo como el extractor de Podbielniak diseñado para manejar en condiciones de hermeticidad sistemas altamente ernulsificados y líquidos con pequeñas diferencias de densidad. Los cortos tiempos de residenc¡a característicos de estos equipos, previenen el riesgo de degradación del producto por acción del calor, por hidrólisis, o por reacciones enzimáticas indeseables durante la operación de extracción.
1.4.5.3.3 Recuperación de ant¡b¡óticos y proteínas med¡ante ¡ntercambio iónico
La secuencia de operaciones para tra recuperación de antibióticos y proteínas mediante intercambio iónico en lechos fijos o en lechos fluidizados es similar a la empleada en la industria qufmica: Después de cargar el intercambiador y realiza¡ el contacto con el caldo de fermentación se remueve et caldo residual
mediante lavado, A continuación, una o varias etapas de contacto con el solvente apropiado remueven el antibiótico, El solvente residual se remueve media.nte lavado. Finalmente se regenera el intercambiador para emplearlo en,un nuevo ciclo después de un nuevo lavado para remover el medio regenerante. Los intercambiadores ionicos ut¡l¡zados normalmente en la remoción.de antibióticos y proteínas son macromoléculas hidrofílicas basadas sobre celulosa natural regenerada o modificada tales como carboximetil, dietilaminoetil, sulfopropil y derivados cuaternarios.
42
1.5
APTICACION DE LOS LENGUAJES DE SIMUTACION EN INGENIER!A
La aplicación de los lenguajes de simulación digital constituye uno de los aspectos m᧠imilortantes de la moderna éducación en ingeniería. El estudiante plantea las ecuaciones de balance de materiales, balance de energfa, cinét¡ca y fenómenos de transporte, que a su juicio, representan mejor el comportamiento de un proceso, El lenguaje de simulación provee medios simples y directos para resolver los conjuntos de ecuaciones simultáneas que conforman el modelo básico.
Aunque los resultados de una simulación constituyen probablemente sólo una primera aproximación del comportamiento del sistema real, estos resultados confrontados con los datos experimentales, aumentan el grado de comprensión del sistema real y ayudan a mejorar el modelo. Además la disciplina lograda mediante el análisis de un comportamiento complejo, de acuerdo Con Ia teoría disponible, expresada en forma de ecuaciones matemáticas, constituye una herramienta poderosa para entender las interacciones entre causa y efecto en un sistema real. El éxito de esta metodología se basa en la posibilidad de obtener una solución numérica inmediata, los detalles del procedimiento numérico son manejados por el computador, mientras el usuario concentra su atención en los aspectos relevantes del problema real de ingeniería'
1.5.1
Etapas en el planteam¡ento y Ia solución de un modelo
El procedimiento de formulación
y
simulación de un modelo comprende
usualmente las siguientes ot¡pas: - Definir los límites de la región de
control. Estos límites pueden ser las paredes
del recipiente o una superficie de separación entre fases. - Examinar diferentes modelos físicos y especificar los objetivos del proceso de simulación con el propósito de plantear el problema.
43
-
Expresar:
la tegría disponible mediante relaciones matemát¡cas tales como
ecuaciones diferenciales simultáneas y ecuaciones algebraicas. Estas ecuaciones son generalmente ecuaciones de balance para cada una de las propiedades extensivas del sistema tales como masa, energía, o elementos químicos; ecuaciones de velocidad de transferencia de masa, de energía y de flujo de componentes individuales a través de los límites de la región de control; ecuaciones d.e generación o de consumo de especies individuales dentro de la región de control; y ecuaciones que relacionan las propiedades termodinámicas tales como presión, temperatura, densidad y concentración ya sea dentro de la región de control, ,como en el caso de las leyes de los gases, o a uno u otro lado de un llmite entre fases, como en el caso de la ley de Henry.
- Especificar el conjgnto de variables del modelo. Estas variables corresponden a las del problema pero están restring¡das de manera que sólo pueden cambiar de acuerdo con las ecuaciones del modelo.
- Verificar la validez de los datos producidos por el computador, en forma de tablas o de gráficas, con los valores teóricos o experimentales expresados, La validez de la solución obtenida depende de la conformidad del modelo con el sistema real.
La solución de ecuaciones por simulación digital se realiza med¡ante
una
secuencia de operaciones lógicas y aritmét¡cas sobre lps variables del proceso. La solución de ecuaciones diferenciales se asocia con métodos numéricos de integración y rutinas tales como las de Runge-Kutta-Merson, Gill y Gear, etc. El usuario del lenguaje de simulación, de acuerdo con la dificultad del problema, selecciona la rutina adecuada. Durante el proceso de integración son evaluadas simultáneamente las velocidades diferenciales de cambio de todas las variables del modelo, con el propósito de obtener nuevos valores de las variables mediante pequeños incrementos en el tiempo o en la longitud de la etapa de integiación. Generalmente las fallas del procedimiento de integración están relacionadas con el tamaño de esta etapa, ajustable de acuerdo con algún criterio de error.
44
1.5.2
Lenguajes de simulación continua
La mayoría de los lenguajes de simulación digital están constituidos por los nombres de las variables y conjuntos de operadores FORTRAN, BASIC, qASCAL. Estos lenguajes de simulación continua IACSLI provéen al programador de la potencialidad del lenguaje estandarizado de alto nivel, junto con las características de cada lenguaje part¡cular.
El lenguaje /S/M, (lSlM, 1983. Simulation Sciences, 36 Ladybridge, Ave' Worsley, Manchester M28 5 BP. Salford University Business Serv Ltd. lnglaterra), utilizado en algunos ejemplos de simulación en este texto, es un lenguaje similar al FORTRAIy', con la estiuctura básica de un lenguaje ACSL caracterizado por tres regiones: lNlTlAL, DYNAMIC V TERMINAI, además de una región opcionalde control. En la región lNlTlAL se anotan los valores de las constantes y se efectúan los cálculos previos a cada ejecución del programa, Las ecuaciones del modelo se escriben en la región DYNAMIC, y en la región TERMTNAL se desarrollan los cálculos y se obtienen resultados en forma gráfica
mediante el comando GRAPH, o tabular, mediante el comando ouTPUT.
El programa tSlM resuelve ecuaciones diferenciales por diferentes métodos seleccionables con el comando ALGO. Así, ALGO : 0: corresponde al método de Runge-Kutta de 5o orden de intervalo variable; ALGO : 1: Runge-Kutta de 40 orden de intervalo fiio; ALGO : 2: Runge-Kutta de 20 orden, intervalo fiio; ALGO : 3: Runge-Kutta de 2o orden implícito. En la solución de algunos de los ejemplos desarrollados en este libro se utilizan simuftáneamente los programas lSlM V GWBASIC con el propósito de confrontar estas dos herramientas de calculo, facilitar el estudio del comportamiento de
algunos de los modblos más importantes en lngeniería Bioquímica y mot¡var al lector hacia el desarrollo de nuevos pfosFamas' La discusión de algunos temas como la evaluación de parámetros cinéticos a partir de datos experimentales, en el Capftulo 5, perderfa su enfoque práctico sin la ayuda de programas como el tStM, GWBAS|C y AUATTRO.
45
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51
-t
CAPITULO 2
BALANCE DE MATERIALES
Las consideraciones estequiométricas constituyen elfundamento del diseño
mdios de-c*ecimienb del @ntrol de
bioproeesos Bor computador,
é:¡
y de los
requerimientos de.transf_erencia de,cakmy d,e r.R_asa,.{Cooney et a|.,1977}. Un adecuado conocimiento del metabol¡smo conduce a la determinación de los compuestos que intervienen en el balance de materiales de un bioproceso. Las reacciones,,del anabolismo ut¡l¡zan los materlales producidos en el catabolismo de la fuente de carbono. Los átomos de los diferentes elementos son reordenados en los procesos metabólicos y la cant¡dad total de cada elemento, incorporada en la célula, es igual a la cantidad removida del ambiente.
En la concentración de células generalmente están incluidas las grandes moléculas complejas formadas en el anabolismo. La concentración de biomasa es el punto de partida para la evaluación del consumo de sustrato. Todos los elementos requeridos para la formación de compuestos tales como ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico), o para la formación de productos, o de subproductos part¡culares del metabolismo, deben tenerse en cuenta én la ecuación de balance. 52
,<
2.1
BALANCE GENERAL DE MATER¡ALES
l-a ecuación general de balance para los componentes representados en la Figura
2.1, es: (velocidad de act¡mulación de componente i) = (velocidad de entrada de i al s¡stema) - (velocidad de salida de i del sistema) + (velocidad de generación de ... a2.11 componente il - (velocidad de consumo de componente i)
Figura
2.1
Corrientes utilizadas en los balances de masa y energía de un reactor microbial.
Blomosq
Fuente de corbono
Pnoducto cu2
0xigeno
La aplicación de la Ecuación [2.1] requiere el conocimiento de todas las reacciones metabóticas que ocurren en la célula. Esta dificultad desaparece si en el balance se ut¡lizan elementos, con la ventaja de que estos no se pueden generar ni consumir:
(velocidad de acumulación del elemento i) = (velocidad de entrada de i a! ..-12.21 sistema) - (velocidad de salida de i de! sistema) En el caso dL procesos continuos, o de procesos por lotes a una escala de t¡empo mayor gue un lote, la ecuación anter¡or se convierte en, (Burns, 1989): (velocidad de entrada de elementos al sistema) = (velocidad de salida de elementos del
sistema)
-.-12-31
53
-r 2.2
-
BALANCE DE ETEMENTOS.OUIMICOS
Aunque las células contienen muchos elementos, un análiqis elemental demuestra que el 95o/o del flujo de materia puede explicarse únicamente con cuatro elemenros: c, N, H y o, {Roels, 1980) . El azufre y el fósforo entran en el balance de mater¡ales de los procesos donde se forman prodqctos consti-
tuidos por cantidades,apreciables de estos elementos.
2.2.1
Velocidades específicas de consumo.de sustrato, crec¡m¡ento de biomasa y formación de producto
'r
Las siguiente ecuación, válida para medios mínimos, donde.la fuente de carbono
es ut¡lizada en la producción de biomasa y energía, reemplaza las ecuaciones estequiométricas globales (Ecuaciones 2.1, 2.2 y 2.3]r:
As+AOz=Lr+ACO2+Lp
12.4'l
Donde, s, Or, x, CO2, pi concentración de sustrato, oxfgeno, células, COr, y t producto, respectivamente.
t4;7frr-1dx'+1dco2*L@x & x ú Í & x ú x, & .
t2.s1 ..:-
Los diferentes térm¡nos de la Ecuación t2.51 son conocidos como velocidddes especlficas:
1ds v,=;e
12.61
Donde, ¡r.: velocidad específica de consumo de sustrato, (moles sustrato).(mol células.h)-1, o en (g sustrato).(g cél.hora)-1. . l
1 doz .. lro" = ; dt 54
fz.7.l
v
.r Donde, plOzi: velocidad especlfica de consumo de oxfgeno, (mol Or).(mol células.hora)-1
,
1dx ,r=;A Donde,
t2.81
pr: velocidad especffica de crecimiento de biomasa, hora-l. llcoz =
1 ;
dCOz
t2.91
d,
Donde, U(.COrl: velocidad especlfica de producción de COr, (mol COr).(mol células.horal-1
.
1do pr=iá Donde,
/r:
12.101
velocidad especffica deformacióh de préducto, (mol producto).(rnol
células. hora)-1.
Cuando las velocidades especfficas, definidas en las ecuaciones anteriores, son reemplazadas en la Ecuación [2.5], se obtiene la siguiente expresión para el balance de materiales; Fs
2.2.2
.t l¡o, = l¡¡ * Vco, +
Fe
12.111
Balances de carbono y oxígeno
El balance de carbono, expresado en términos de la Ecuación 12.1 11, es: ds.F.y =
dx.lrx + uc,fco¿ + cr.l¡r
12.121
Donde, os, oy, o¿, opi carbono en el §ustrato,'en las células, en el CO, y en los
pfoducto§, respeclivamente, g c/mot,
55
El balance de oxfgeno, expresado en térm¡nos de la Ecuación f2.1 11,. es:
[or=A.Vs -B.Fx -C.ltp
t2.131
Donde,4: oxfgeno requerido para la combustión del sustrato hasta CO, HrO y NH, si el sustrato contiene nitrógeno. mol O./mol sustrato; 8: oxlgeno requerido para la combustión de las células:,secas hasta CO2, H2O y NH3, mol Orlmol células; C: oxlgeno requerido para la combust¡ón de los productos hasta COr, H! y NH., si los productos contienen nitrógeno, mol Orlmol producto, La Ecuación t2.131 es útilpara conocer un cociente metabólico no determinado éxperimentalmente, Por ejemplo, puede calcularse la velocidad de consumo de
sustrato de un microorganismo, si se conocen
Ejemplo
lx
y /(Oz) cuando /p es cero.
2.1 Balance de elementos quím¡cos
en una fermentación
anaerob¡a
En la producción de etanol mediante cultivo continuo entran al reactor glucosa
y amonlaco en condiciones estériles y salen biomasa y etanol. Las células crecen y se reproducen continuamente para reponer la biomasa retirada. Determinar los requerimientos mfnimos de amonfaco y glucosa, para producir 7666 litros/dfa de etanol, (densidad: p : 789 kg/m3). Suponer que un mol de . glucosa se convierte en
0,7 moles de producto y en biomasa, CO, y
Suponer que la fórmula de los microorganismos es
agua,
CH1,e4Oo,2eNo,2E.
Solución:
- La ecuación de balance de biomasa es: aC.H,rOu.+
bNHr:
cCH,,roOo,rnNo,r,
+
dCH3CHTOH
+ eCO2 + f H2O
- La velocidad de flujo molar de etanol es:
¿=
da ms 7gg&- not T6ñtuo dla W s 1000 linos ¡s O,W kg d
56
= 1,522 mol etanol/s
,,, .
De acuerdo con las condiciones del problema:
: i -
1
tr
iai
,, _---_t
.,
d
,52210,7 :'2,174 mol glucosa/s.
-
0,7 a. Por consiguiente: a
:
- Ecuaciones de balance de elementos quím¡cos:
C: H: O: N:
.
Y-
'
6a: c+zd+e 12a+ 3b:1,94c+6d+2f 6a=O,29c+d +2e+f b:0,25c b : 1,839 mol amonfaco/s c:7,356mo1 células/s e : 2,644 mol COrls
,
. ''lr
L'
2.3 BALANCE POR EL METODO DE ELECTRONES DISPONIBLES
'¡/
Los eleegones disponib.les para la transfesencia de oxfgeno en la combustióa de un o@rnpuesto hasta C0r;.1ügua y amonlaco, son los ocupantes de los orbitales'electrónicos externos; los de mayor energfa, en el átomo. Estos electrones son intercambiados eh las reaeciones qufmicas normales. En términos generales, los microorganismbs, en condiciones estables, obtienen
carbono, nitrógeno y energia, del ambiente.'Además, en el crecimiento aerobio los microorganismos óbtienen del ambiente un aceptante electrónico oxidado, el oxfgeno.
Lq energía requerida para impulsar el proceso de la vida es geneiada por el aceptante de los electrones, al recibir los electrones provenientes del sustrato, fuente de carboho y energía, o de la fuente de nitrógeno, para luego retornarlos al ambiente en una fqrma reducida.
57
Además, p!99g-g-u,onerse que er número totar de electrones_exter.os se conserva' por tanto, er número de equivarentes erectrón¡"o. ¿Lpo^;;,r;; ,; fórmula de un compuesto orgánico es 4 para C, 1 para H, _ 2 para Oy _ 3 para
//. El número de erectrones disponibres es una medida der contenido de energfa de un compuesto,
2'3'1
Grado de reducción de un compuesto orgánico
El grado de reducción de un
compu ae#fjtrefumO el número de equivalentes de#trones disponibles por cons¡gu,"^i", ., dB# ," fórmula elementar de un compuesto es : c"HnooNn,,,entonces ,
Nu El
gradodo,r.e&rccisry
er número de
Nro, es:
f,
=
4.c + ht2-o - 3.n
,
12.141
de este compuesto hipotétíco es:
))"
2.3.2 Balance de electrones
12.151
disponibles
El balance de electrones disponibles de un proceso aerobio sín formación de prciductos no celulares tal como el proceso aerobio de obtención de levadura de panaderla a.partir de glucoSa,.se expresa como:
0¡.I5 * 0o.Io Donde, Q5, o6,
ó*-I, J
t2.16I
<0,: verocidad de flujo de sustrato, oxígeno y céruras, respectiva, mente,.mol s-l; l-s, l-q, l-r: grado de,reducción del sLstratá, orfgeno y células, respectivamente, {mol electrón disponible).(mol).r.
58
r El CO2 obtenido a partir del sustrato en el crecimiento anaerobio, sin la presencia aparente de un aceptante de los electrones, eS por lo menos formalmente, el
aceptante de lpS electrones. ESte CO, es luego transfofmado en productos con mayor grado de reducción. Un ejemplo tlpico es el proceso de formación anaerobia de etanol, a part¡r de glucosa, mediante una levadura. En este caso el balancé de electrones disponibles se expresa como:
Qs.Is =
0¡.I* * XQr,'L, I
f2.171
Donde, Oo,: velocidad de flujo de producto i; mol.s-l; l-0,: grado de reducciÓn del i-ésimo producto, en (mol electrón disponibfe).(mol producto il1. Los eiectrones nO conservados en la biomar. ,on transferidOs al aceptante de electrones:
0¡¿ = Os-Is
- 0*.I*
12'181
Donde,
2-3.3
y el aceptante de los
Ecuación de crecimiento
En el crgcimiento de una célula intervienen numerosas reacciones químicas cuya suma es la ecuación de crecimiento. Esta'ecuac¡ón incluye la fórmula de la
, célula, las sustancias nutrit¡vas particu-lares, los sustratos ut¡lizados como fuente de carbono o de energía, y los pro.ductos del metabolismo:
CHr"O',!{o, + o 02 1 Y' 4rC II t p o,N n,
a NII1
=
* t Y' on"C H 4,9 onNr,
t2-191
i I
+wH2O+cCO2
Esta expresión es una forma de la eCúaCión de Crecimiento, con amonlaco como
fuente de nitrógeno y ningún factor'tie crecimiento. Donde: o, a,Y"v¡s,Yr,¡"' w'
59
+ c: coef¡cientes estequ¡ométr¡cos para 02, Nl-{r, biomasa, el i-ésimo producto, agua y COr, respectivamente; hs, 05, n": átomos de hidrógeno, oxfgeno y nitrógeno en el sustrato; h¡, o¡, fl¡r átomos de hidrógeno, oxígeno y nitrógeno en las.células; ho¡, ori, ne¡: átomos de hidrógeno, oxígeno y nitrógeno en el iésimo producto. El superíndice c en los factores de rendimiento de sustrato en
biomasa, Y'¡7s, y sustrato en producto i, Y'r¡s, enfatiza el hechp de que la Ecuación 12.191está escrita sobre una base molar arbitrariamente seleccionada de 1 mol de carbono. Esta ecuación, de carácter general, puede incluir otros elementos, Además, en
: 0, asl como Yloirs = 0 para En'el método de efu:tronss dis-ponibleg aerobios. numerosos microorganismos ry oxígenq Bor las'dificehade§ de hidtágeao ñb se,'iflfliár I experimentales para la detección de cambircs er¡Ja concentración de agua. el caso de microorganismos anaerobios, o
El balance elemental de carbono se expresa como:
1=Y'fls+EY'r{s+c
t2.20t
El balance elemental de nitrógeno se expresa como:
ts' + a ='Y"fls.nx + EY"r4s.fipi
f2.211
Las siguientes ecuaciones expresan el grado de reducción del sustrato, las células y el iésimo producto:
rs=4*ñs-2.or-3.n,
12.221
I¡ =4+hx-2.o*-3.n*
12.231
Ío1 =
4 a hpi -
2.oo¡
-
3.noi
,
12.24)
El balance de electrones disponibles de la Ecuación t2.191:
12.251
Ld3'Ecuaciones [2.20], Í2.211y 12.251, incluyen las incógnitas: o, a, Y",75, c, Y varios coeficientes Y"o,,r, .según el número de productos orgánicos. Ya se menciqnó que en este enfoque el coeficiente h/ no es de interés. por ser el agua
60
* abundante y diflcil de medir experimentalmente. En el caso de las fermentaciones aerobias, generalmente Y"pirs es cero, y en el de fermentaciones anaerobias,
o =.0. Aún en estos casos, quedan cuatro incógnitas de interés y solo tres ecuaciones para relac¡onarlas. Una posible solución de este problema requiere la determinación experimental de Y"¡¡s, €l part¡r de la representación gráfica de los datos del carbono celular sintetizado en función del carbono en el sustrato consumido. Otra posible solución es la determinación de Y"¡¡s, a partir de datos de la bioquímica molecular.
Los sustratos orgánicos pueden ser ut¡l¡zados p¡¡r un microorganismo para síntesis celular, para la obtenciÓn de energía, o para la formación de productos orgánicos no relacionados con el metabolisrno de energía, como en el caso de una proteína recofnbinante. El siguiente balance de carbono expresa el fraccionamiento del
sustrato, (Lynd,
1'989):
1=Y'fls+EY"r¡¡s+f"
12.261
Donde, Z Y"o,,s: fracción de carbono en el sustrato, incorporada en el producto orgánióoi no relacionado con el metabolismo de energla, El subfndice/ es un subconjunto de i; f": fracción de carbono en el sustrato ut¡lizada para catabolismo. púede ser ut¡l¡zado por la célula para sintetizar nuevas células o para.sintetizar productos no relacionados con
á ATP disponible de los procesos cataból¡cos
el metabolismo de energía, (Lynd, 1989).
f,G.^o = :-
'dAt?
-» :, * 'ptlAT?
12,271
Donde, Go-r: número de moles de ATP sintetizados/mol de carbono en el sustrato catabolizado, o ganancia de ATP¡ Y^,orr: relación entre el carbono celular sintetizado y los moles de ATP disponibles de los procesos catabólicos: Yx¡erp: O,4O4 mol C en células/mol ATP, (Ecuación 3.80); Yp¡rere: rendimiento de ATP en producto, mol C en productolmol ATP.
61
El térm¡no f".Go,, representa la producción total de ATF por mol de carboñU&n el sustrato uti¡izado. Los términos de la derecha de Ia Ecuación Í2.271indican los requerimientos de ATP para síntesis de células y formación de producto, respectivamente.
En aquellos casos donde los coeficientes Y"p¡ls son nulos o despreciables, entonces: f -' 'l - Ycx/s, según la Ecuación f2.261, y cuando se sustituye esta " expresión en [a Ecuación 12.271, se obtiene, (Lynd,1989): .t2.281
Las ecuaciones deducidas en esta Sección permiten la determin¡ción de los coeficientes estequiométricos de la ecuación de crecimiento, en el caso de' crecimiento aerobio sin formación apreciable de productos orgánicos, y en aquellos casos de crecimiento anaerobio con formación de un solo producto. En el caso-de reacciones más complicadas biológicamente, como la fermentación anaerobia con formación de diferentes productos orgánicos, o la producción de una protefna recombinante, en cantidades no proporcionales a la producción de células, resulta' difícil considerar la estequiometría, desde un.punto de vista teóricb, y los cálculos y diseños de estos procesos, dependen riormalmente de resultados experimentales.
Eiemplo
2.2
Deterrninación de la ecuación de crecimiento en un pfoceso aefob¡o :
",,
Hallar la ecuación de crecimiento correspondiente al proceso.aerobio de producción de levadura a partir de glucosa. Suponer que se emplea NH, como fuente de nitrógeno y que no se obtienen otros productos orgánicos. La fórmula de los rnicroorganismos, es: CH,,roOo,.No,ar, y elrendimiento de ATPe¡ células: Yxtt¡p : 0,404 mol C en céllmol ATP, lEcuación 3.80). Solucióri:
62
,
La
de respiración de la glucosa, de acuerdo con los 1987; Bailey y Ollis, 1986; Atkins, 1983, es :
C,f~O& + 6 0 2 .+ 36 ADP
+
3Q P¡ "" 6 C02
+
38 ATP
+
siguiente~
44 H2 0
[2.291 GATP =
38 mol ATP mol glu. mol glu. cataboliwda 6 mol e
=
6133 mol ATP mol e
- El coeficiente estequiométrico de la biomasa, Y\ 15 , en la Ecuación [2 .19), o rendimiento de sustrato en biomasa, se calcula mediant'e la Ecuación [2.28]: ycx!a =
6,33(0,404) = O, 719 mol e en cél . 1 . + 6,33(0,404) mol e ·en'. sustrato
- Una forma de la Ecuación [2.29], expresada con la notación de la Ecuación [2.191, sobre la base de 1 mol de C, es: (11
. . .~Glucos '>-. a .: .e
-2=4
~
"
.
Células: CH,, 94 0 0 .3No.2s
r x = 4 + 1,94 - 0,3(2) -· 0,25 (3) = 4,59
..
Oxígeno:
·0 2
r
=
-2 (2)
= -
4
- Balance de carbono, (Ecuación 2.20):
1=Y\ - Balance
d~
15
+e=0,719 +e ;e:::
0,2~1 ~
nitrógeno, (Ecuación 2. 21 ): a=" YºXJs·nx = 0,719(0,25) = 0,18
- Balance de electrones, (Ecuación 2.25):
63
.
~
_,*_=+
- De acqerdo con los resultados obtenidos, la ecuación de crecimiento, (1), se conüerte en:
cHro + 0,175 o, + 0,18 NH3 : 0,7'19 CH1,s4go,3No,ru
*
0,281,COz
...12¡.
De acuerdo con los conceptos mencionados anteriormente, por ser el agua difícil de evaluar experimentalmente,'nó se realizan los balances de H v O. La forma final de la ecuación de crecimiento se obtiene mediante la multiplicación de la Ecuacián l2l por el nrfmero de átomos de carbono en el sustrato: --
C6H,2O6
.Ejemplo
+
1,05 O,
2.3
+ 1,08 NH3 :4,31
CH1.s4Oo,3No,r,
*
1,69 COrz ...(3)
Determinación de la ecuación de crecimiento en un roceso anaefob¡o ,
I
¡ l
Hallar la ecuación de crecimiento co.rrespondiente al proceso de obtención de etanol a partir de glucosa mediante fermentación anaerobia. Suponer la fórmula de los microorganismos: CH1.s4Oo,3NO,25,'v el rendimiento de.4IP en células: Yxrrrp : O,4O4 mol C en céll mol AIP.(Ecuación 3.80).'suponer también que se emplea NH. como fuente de nitrógeno y que no se obtienen otros prodúctos. Solución:
- La ecuación global de la fermentación alcohólica, (Ratledge, 1987; Bailey y Ollis, 1986; Atkins, 1983I; es: C6H12O6
+ 2Pi + 2ADP:2CzHsOH + 2CO2+ 2ATP + 2HrO ,..t2.301
- La ganancia de ATP, es: G,ttp
=
2 mol ATP mol glu. cataboüzada
mol ATP mol C
- Coeficiente estequ¡ométrico de la biomasa, Y"x/s, o rendimiento de sustrato en biomasa, (Ecuación 12.2il1:
64
'
0'3flg.(0'404) Y", #' = 1
+ 0,3ff1.(O,M)
=0.119
wol C cél t@l C swfrcto
Una forrna de la E [2.30], expresada con la notac¡ón de la Ecuación t2.191, sobre la base de 1 mol de C, es:
-
CHrO + a,NH3
Y"ro CH1,e4Oo,3No.r,
]
*
Y9evs
CH3Oo,s
+
cCO,
..,(11
- Grado de reducción:
Glucósa
fs:4 *2-2=4.
CH,O
Celul᧠CH1,s4Oo.3No,;s
lx: 4 + 1,g4- 0,3(2) - 0,25.(3) = 4,59 ..
Etanol
fo:4+a-0,1,{2) :'6:
CH3Oo,s
¡tl
f. + o.fp, = Y"xrs'Fx * Y"oi¡s..fri :4 + 0 :'0,119(4,59) 'J/:l
Y"o,§.! 0,576, y oe ta ecuación
de-
balance de C:
c
: '"*[il l:'
+ Y"pirs.(6
:
' -
0,305
-'De acuérdo cori los:iesultados obtenidos, la ecuación de crecimiento, (1), se' óonvierte en:
cHro + o,o298NH.
:
b,ttgcH1,;4oo,3Nó,25
+
0'576 CH3Oo,s + 0'305
CO2
...12t_
65
'_:--7
- La forma final de la ecuación de crecimiento se obtiene mediante la multiplicación de la Ecuación l2l por el número de átomos de carbono en el sustrato:
__
cor-+i2o6
+ 0,17g NH. =
o,714cH1,e4oc,3N o,ru + yácrHuoH + ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
?-
2.4
__
Áro, ||||||||||||||||||||||||| nt ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
nZ¡(
COMPOSICION ELEMENTAL DE LOS MICROORGANISMOS
Los análisis de células realizados con técnicas estandarizadas de microcombustión demuestran que no hay una fórmula única para un microorganismo. En la
Tabla 2.1 se muestra como sólo 22, de los aproximadamente 100 elementos químicos hallados en la corteza terrestre, son componentes esenciales de los organismos. Los últimos 6 elementos (& Al, V, Ma, l, Sr) de la Tabla 2.1 , son esenciales sólo para c¡ertas especies. Además, la distribución de elementos en los organismos yivos, en la litosfera, y en la atmósfera, es diferente. En la Tabla 2.2 se presenta la composición elemental de la bacteria Escherichia coli. El carbono es un elemento gue por su versatilidad para ligarse covalentemente
con otros elementos y formar enlaces simples, dobles y triples, ocupa una posición fundamental en la qulmica de los seres vivientes. El carbono al unirse con otros átomos de carbono forma los esqueletgs lineales, ramificados y cíclicos de las biomo!éculas. La asimetría producida por la unión de un áto4o de carbono con cuatro grupos funcionales diferentes tiene consecuencias biológicas. En la mayoría de las reacciones, altamente especfficas, solo puede ut¡lizarse un estereoisómero del compuesto. El mismo grado de especificidad de una reacción se aplica a los isómeros crs y trans que pueden existir en las biomoléculas con enlaces dobles entre carbono y carbono. lArmstrong,
1
983).
En la Tabla 2.3 se presentan datos sobre los constituyentes inorgánicos de diferentes microorganismos. El agua es el compuestro sencillo más abundante en todos los tipos de células y organismos, constituye aproximadamente el 70 o/o del peso total. En la Tabla 2.4 se presentan datos sobre la composición elemental de diferentes microorganismos. Se observa que la composición varía con la velocidad de crecimiento y con el sustrato limitativo del crecimiento
66
rz
fubv\rr()u
\
-+ '4 *C¿ [i1"-'\1
g(t.c
Tabla 2.2
fabLa 2.L El-ementos de Ia materia orgfnica, (Lehninger, 1973 ) r
Composición
elemenEal de1 E. coli, (Luria,1950)
t
Elemento
o
c
,'H
N
Carbono Oxfgeno
P
Nitrógeno Hidrógeno Fósforo Azufre Potasio
s
Iones monoat.ómicos:
Na., K-,
Nlg'-
,
Ca'-
,
--?
CI
peso 6eco 50 20 1,4
I
3 1 1
'1
Sodio
Calcio
ELement,os que se
or5 o,5
Magnesio
encuenEran en Erazas:
W7, Fe, Co, Cu,
Cloro
O,5
Hierro
o,2 o,3
Ot.ros
Zn
i
B, Al-, v, Mo, I, Si
Tabla 2.3 Constituyentes inorgánicos de d¡ferentes mtcroorganrsfno§,, en (gramos)/(100 g de peso) seco {Aiba, S.. Humphrey, A.E., and Millis, N.F.,
1973)
:,
Elemento
Bacterias
Fósforo Azufre Potasio
2,0 0,2 1, 0 0,1 0,5
Magnesio Sodio
Calcio Hierro Cobre Manganeso
Molibdeno Ceniza total
-
3,0 1,0 -. 4,5 - o,s - 1,0 0,01 - 1,1 0,02 - 0,2 0,01 - 0,02
0,4 0,1
0'2 0,1 0
,02
0,1 0,1
o, 001- o, o1
-7
-2t
Levaduras
Hongos
2'
4,5 0,5 2,5 0,3 0,5 L,4 0,2
0., 1 0; 01 0,002 0, 0005 q, oool 0,8 0, 1, 0, 0,
5
01 00 10 01
2,6 0,24
4,0 0,5 0,1 0,3 0,5 0,01
0,007
0,0002 -L0
67
Tabla 2.4 Datos de la composición elemental de diversos microorganismos; p: velocidad especlfica de crecimiento de biomasa; M: peso "molecular" (Atkinson
y Mavituna, 19831.
Mí'cioorganismo Sustrato limitativo
Bacteria
(1
p h-1
)
Bacteria
Fórmula química emplrica".
K.
aerogenes
Glicerol
0,
K.
aerogenes
Glicerol
0,.85
1
2A,7
cH2No,25Oo 5 '
25,5
L'.
cH1,78No 24Oo,33
22,5
cH1,74No,22Oo,43
23,7
cH1,73N0,240o.43
24,O
Leyadura (3)
cHr,66No,13Oo40
Levadura
cHl,7sNo,r 5Oo,s
,(4) '-.:Candida utitis Levadura
'1i
:
I
cH1,66No'2Oo,27
'
Aerobacter l2l aerogenes
M
,
23,5 23,9 26,9
't-"G¡u"o."
0,08
GH1"B2No,;eOo.47
24,O
Candida
utilis
Glucosa
o,45
CH,';oNo,rOo,r.
25,6
Candida
utilis
Etanol
o,06
cH1,82No,1sOo,46
23,9
Candida
utilís
'Etanol
0,43
cH,,3aN6,2Oe,55
25.5
Observaciones:.
(f):
Porcentale en peso de cenizas 8% (2): Porcentaje en peso de cenizas 8,g% (3): Porcentaje en peso de cenizas 87o (4): Fórmula química:'CH1,64No.16Oo,rrPo,o,So,oo.
68
=
Eiemplo
2.4
Determinación de la composición de un -1 microorganismo l'1. lJ 'i) U.
a
En la Tabla 2.6 se presenta un resumen dól procedimiento seguido usualmente en la determinación de la fórmula de un microorganismo tlpico, En la segunda columria se anota elporcentaje de cada elemento ségún los resultados de Un
análisis cuant¡tativo, La composición de! microorganismo, segtin los Valores obtenido3 en la últ¡ma columna de la Tabla 2.5,
es:
CH1,s36Oo.2erNo,rr,, u-l^
Tabta
2.5
Determinación de la fórmula de un microorganismo tfpico.
Eemplo 2.4. o/o
Eiemento.
c:
'
v.í
PGSo SeCo.,
.
49,3
moles/mol C
moles/100 g
+10
1
1,21
0,295
14,5.
1,O3
o,251
8,0
7,94
1,936
3,3
0,1_1
i'/
o
',:
19,4 ,
N.
.
H
: s
.1,:2
K
1,1
0,03
0,6
0,o3
Na
.
0,04
'o,o27 9,76.1
'
0:3
7,32,10'3 7,32.10'3 2,44.7;Ü3
Ca
0,6
Mg
0,5
o,o2
4,88.10'3
ct
0,5
0,01
2,44.1o-3
Otros
'1,0
-l-
69
7
2.5
FACTORES DE RENDIMIENTO:
El concepto de rendimiento es un aspecto ¡mportante en la evaluación econórnica del potencial de un sustrato orgánico para la producción de biomasa o la formación'de subproductos. La definición del factor de rendimientc util¡zada
por Monod (19421, de naturaleza macroscópica, ha sido modificada para cuant¡f¡car rendimientos en células, en subproductos e inclusive en energía.
2.5.1 Rendimiento
de sustrato en b¡omasa
La factibilidad económica de algunos procesos, como el de producción de proteína unicelular, depende básicamente del costo de la materia prima. En la práctica, la.selección de un microorganismo con un, elevado rendimiento.de sustrato en biomasa favorece la productividad del proceso y disminuye el costo de remoción de calor. Generalmente, cuando el sustrato es el factor limitativo del crecimiento, la cant¡dad de biomasa producida es proporcional a la cantidad de fuente de carbono consumida: dx
tYy¡o= - ^ ' ts
=
_& ds
f2.311
dt Donde, Yr,.: factor de rendimiento de sustrato en bíomasa r*, rr: verocidades de formación de biomasa y consumo-de sustrato, respeetivamente, g.(litro.hl-r; t s: concentraciones de biomasa y de sustrato, respectivamente, g.litro-1.
2.5.2 Rendimiento
de oxígeno en b¡omasa
El oxígeno.. representa el valor global de la activ¡OaO cata¡Olica cuando las reacciones productoras de energía ocurren principalmente por la vía de la.fosforilación oxidativa. El factor de rendimiento de oxlgeno en biomasa, y*,o, se define como:
70
dx v_l txlo
'ro-
-
t.,
__
-
dt
do
f2.32'l
dr
Donde, rr, ro: velocidades de formación de biomasa y de consumo de oxfgeno, respectivaménte, g,(litro.h)-1; x, O: concentrac¡ones de biomasa y de oxfgeno, respectivamente, g,litro-1.
2.5.3 Rendimiento
de electrones en b¡omasa
El factor de rendimiento de electrones en biomasa fué definido por Payne (1970):
v.r, -MrQ* -
I"
t2.331
O,
Donde, Yr,.: rendimiento de electrones en biomasa, (g células).1"¡"61¡6¡)1; M¡: peso molecular de las células, (g cél).(mol)-l; F.: grado de reducción del sustrato, electrones disponibles (mol sustrato)-1; Or: velocidad de flujo de masa de sustrato, mol.s-'; tDr: velocidad de flujo de masa-de células, mol.s-1. En lugar de tas velocidades de flujo pueden utilizarse las respectivas concentracionés de sustra-
to, s, y células, x, mol.litro-l
2.5.4
.
Factores de ¡endimiento en e! crec¡m¡ento aerobio
En la Tabla
2.6 se presenta un resumen de los factores de rendimiento, en
el
crecimiento aerobio de diferentes microorganismos en diversos medios mínimos (la fuente de carbono se ut¡lizada para la producción de biomasa y energía).
71
En algunos casos los factores de rendimiento son aproximadamente constantes para un determinado microorganismo en un sustrato específico. En estos casos la estequiometría provee una metodología útil para relacionar los factores de rendimiento con las diferentes variables de un bioproceso y prever, por ejemplo, la influencia de los cambios de la composición del sustrato, o de la concentración de algún producto, sobre la composición de la biomasa o la generación de calor.
En otros casos los factores de rendimiento, empíricamente definidos como relaciones estequiométricas aparentes, no son constantes para un determinado microorganismo en un sustrato específico. Pueden observarse variaciones del factor de rendimiento con la velocidad específica de crecimiento, como una respuesta de los microorganismós a ta alteración de su ambibnte (temperatura, pH, concentración de sustancias nutritivas, activ¡dad del agua, etc). Cada conjunto de condiciones ambientales significa una variación de las cantidades relativas de sustrato asimiladas en masa celular o ut¡lizadas en la síntesis de productos, o consumidas para satisfacer las necesidades de energía de las células,
Ejemplo
2.5
Equivalencia de los factores de rend¡m¡ento
Demostrar la equivalencia de los rendimientos expresados en las diferentes columnas de la Tabla 2.6 con los datos de crecimiento de Candida uflr.s en glucosa:
72
Electrones disponibles de ta glucosd, C6H12O5, (Ecuación 2.141: Ne¿
= 6. l4l + 12-8.(21 =24
Yxr = 91,8 (g.cétlmot gtu).(mol gtqlil24 Y*,=
Tabla
2'6
:
e)
3,82 (g.células)/{electrón disponible)
Factores de rendimiento en el crecimiento aerobio de diferentes
microorganismos sobre diversas fuentes de carbono. (Nagai, 1g7g). Yx§
Yxrs
Yr.
Yro
YxE
glg.c
glg
glg.c
1, 03
3,11 3,67 3,77 3,00
Organismo
Sustrato
glg
g/mol
Aerobacter
Maltosa Manitol Fructoaa
749,2 95,5 75,1 72 ,7 g1,g
7,28
1,50 1g 7,46 1,11 L,32
77,1,
1, 08
L,
Candida
Glucosa
0,45 0,52 0,42 0 ,40 0,51
PeniciTlium
Gl-ucosa
o,43
Pseudomonas
Glucosa
0,38 68,4
0
Rhodopseudo- Gfucosa
0,45 91,0
1,!2
!,46
3,37
s0 4,35 0,25 0 ,45 0,18 o,20 0, 18
90, 0
L,25
3,75
53,2 29,7 4L,8 75,6 77,g 10, 5
,62 ,75' 0 ,46 o ,49 0,43
0,9:l 0, gg 0,62 0,97 0,37 0,48 0,31
aerogenes
Glucosa
ut.iTis
chrysogenum
f l-uorescens monas
1,32 1, 05 1, 01
,95
L,
35
3,92 3
,22
0.95 2,93
spheroides
S..,cerevisiae
Glucosa
Aerobacter
Ribosa Succinato
aerogenes
GIicerol
IJactato
Piruvato
Acet,ato
0,
0, 88 0 1
,66 2,L2 2,gg 1,39 7,79 1,31 2
Continúa 73
Tabla
2.6
Continuación
Yr.
Yo"
Yo"
Yro
Yrr.
g/mol
glg.c
g/g
g/g.e
0,70 2,62
Organismo
Sustrato
glg
Candida
Acetato
0,35 2L,0
0, 90
Pseudomonas
Acetato
,28 L6 ,8 ,49 22 ,5 0.,69, 3L,2
0,70 0, 93 1,30
Kl.ebsieLLa Metanof
0,38
]-2,2
1, 01
0,
MethyTomonas Metanolsp.
'0,'4.9
,4
1,,28
0,53. 2,3é
Pseudomonas Metanol sp.
0,4L 13;1
1, 09
o,44 2,lg
MethyTococcus sp.
1,
,34
o,29 2,02
utífis
f-Zuorescens
Etanol-
ntanoI.,
Candida
uti-Lis sp.
Metano
0 o
15
01 L6,2
7
0
,46
2 ,1,0
. 0,42 7,P7 .0,51 2,60
56 2,03
Pseudomonas Metano sp.
0,80 72,9
1, 06
0,2a 1,60
s eudomona s Metano sp.
0,50
9,6
0,80
0,
Pseudomonas
0,s5
9,0
0,75
o,77 I,L2
P
methanica
Metano
19
,-
Ejemplo
2.6
7
,20
t__t ,, \
Factores de rendim¡ento en et crecimiento aerobb de Saccharomyces cerevisiae
calcular los factores de rendimiento en el crecimiento aerobio de Saccharomyces cerevisiae en glucosa y comparar los valores obtenidos con los correspondientes datos de la Tabla 2.6. Solución: 74
: i ='
Para el crecimiento aerobio de Saccharomyces cerevisiae en glucosa se utiliza la siguiente ecuación, Battley, 196O):
uH,rO,
+ 3,84 O, + O,29 NH3 : 1,95 CH1,72Oo,onNo,,. + 4,09 CO2 + 4'72 H2O + 2005'1 ,
kJ
- Rendimiento de sustrato en células: Yxrs
:
(1,95 mol cél/mol sustrato).(22,86 g céllmol cel)
=3,?-g céllmol sustrato; Tabla 2'6: Y*,": 90 g/mol - Rendimiento del oxígeno en células:
v =rxlo
Yxto
2,,ü g cét. mol O" 32 g o, o, 3,u ^rt.éL ^rt 1,95 mot cét.
=H, tfft
rabb 2.6: Yilo = o,g7
tt
- Rendimiento de los electrones en células: - Electronss en la glucosa: N.o : 6. (4) Yx¡e
:
44,6 lg céilmol glu).(mol
Tabla 2.6:
2.5.5
Yxr
:
+ 12' (11 ' 6. l2l :
24
glut} e) = 1,858 g céllelectrón
3,75 g célle
Rendimiento de sustrato en producto
La evaluación del factor de rendimiento de sustrato en producto es complicada
y algo incierta en el caso de metabolitos cuya biosfntesis, o es muy compleja, o no está bien definida (Acevedo,1987; Gommers et al., 1988)' El factor de rendimiento de sustrato en producto se define como: 75
dP
dt y_.=_rr.=_ rt¿ rs
ds
e.g4l
dt Donde, rr, r.: velocidades de síntesis de productoo y de consumo de sustrato, respectivamente, g.(litro.hora)-1 ;s, p: concentración del sustrato y del producto, respectivamente, g.litro-1. La evaluación de Yr,", basada en la estequiometría de
la reacción global desde sustrato hasta producto es sencilla en el caso de productos con rutas biosintéticas conocidas,
2.5.6 Rendimiento máximo de sustrato
en producto
El límite superior del rendimiento en producto de un sustrato orgánico depende
de su grado de reducción, Bailey y Ollis, (1986):
,,=R+-
12.35t
Donde, fr: fracción de los electrones disponibles en el sustrato, presentes en el producto; op, osi fracciones de carbono en el producto y en el sustrato, respectivamente; fp, f-": grados de reducción del producto y del sustrato, respect¡vamente (Ecuación 2.15l.; Yr,r: rendímiento del sustrato en producto. Si se tiene en cuenta que las energías del sustrato y del producto son aproximadamente proporcionales a su contenido de electrones disponibles, el término fo
puede ¡nterpretarse como un rendimiento en el contenido de energía del producto a partir del sustrato. Por consigu¡ente, el valor máximo de fo es la unidad:
o"'4 (Yil*- or.4
76
t2.36I
,o
Donde, (Yp7s).6,: rend¡miento máximo de sustrato en producto, g producto/g sustrato. En la Tabla 2.7 se presenta un resumen de valores d€ (Yp¡s),¿,, calculados a partir de la Ecuación t2.361, para diferentes productos obten¡dos a partir de diferentes sustratos,
Tabla2.7 Llmite superior delrendimiento de sustrato en producto, g producto/g sustrato, calculado a part¡r de la Ecuación t2.361, (Eroshin y Minkevich, 1982)' Sustrato Producto
a-alcanos
Etanol
Glucosa
Acido cltrico Polisacáridos Acido ácét¡co
4,55
Lisina
2,23
2,77 1,96 1,96 1,36
1,42 1,00 1,00 0,70
3,21 3,21
0,66
Estreptom¡c¡na Etanol
Triglicéridos
1,64 1,18
..,
0,51
o,72
0,37
Los vatores de Yr,, sirven como referencia para evaluar el comportamiento de un determinado proceso y adoptar decisiones sobre la acción a seguir' Así, por eJemplo, un Yp/s muy alejado de (Yprs).a., indica que ese proceso puede mejorar mediante la inversión de recursos adicionales en investigación y desarrollo' Por el contrario, los valores de Yr,. próximos al máximo respaldan la decisión de suspender inversiones en la optimización del proceso.
Ejemplo
2.7
Evaluac¡ón del rendimiento máximo en la producc¡ón de ácido cítrico
Calcular el rendimiento máximo de sustratO en producto, (Yp7s).¿,, en el proceSo de producción de ácido cltrico a part¡r de etanol'
77
Solución:
- Producto: Acido cltrico: C.HBO, Peso molecular:
192 glmol
Grado de reducción: fe:f4.(6) +B-7.(2llt6 Grado de reducción: Fp = 3 (Ecuación 2.15! Fracción de carbono: o : 112, 16111192 : 0,375
- Sustrato: Etanol: Peso
C2H6O
molecular:
46 g/mol : [4. (2) +
Grado de reducción: f" Fracción de carbono: o"
:
- 2lt2 :6 1"12. 1211146 : 0,522 G
- Rendimiento máximo de sustrato en producto (Ecuación 2.361: (Yp¡s).¿,
:
1O,522. (6)1/t0,375, (3)l
2.5.7 coeficiente
: 2,78l9 acido)/{g
etanot}
de rend¡m¡ento verdadero en medios mínimos
Los rendimientos definidoS en los numerales anteriores como relacio¡iés estequiométricas aparentes, son considerados constanteé, pa'ra un organisrño dado en un medio espécífico y en unas condiciones ambientale§ determinadai: En un proceso real de fermentación, el rendimiento dépende de diversas variables ffsicas, q.ufmicas y biológicas tales como temperatura, pH, actividad
de agua, la cepa, el sustrato, la velocidad específica de crecimiento,
tas
concentraciones de sustrato, de biomasa y de productos, las relaciones entre elementos como c/N y P/o, el tipo'de reactoi,, las condididnes de operación:y el tiempo medio de residencia. El coeficiente de rendimiento verdadero de sustrato en biomasa, (y*r.lu, para
medios mínimos, donde la fuente de carbono es utilizada en la síntesis de células, sin descargar productos no celulares al medio, se calcula mediante la siguiente ecuación, (Nagai, 1979):
78
P"=ñ"*{"¿u, 1
Í2.371
Donde, ¡r": velocidad específica de consumo de sustrato, molsustrato (g cél.h)-1;
m.: coeficiente de mantenimiento basado en el sustrato, mol sustrato (g células.hora);1; (Y,,,.)u: coeficiente de rendimiento verdadero de sustrato en biomasa, g biomasa (mol sustratolt; lt*: velocidad especlfica de crecimiento de biomasa, hora-] .
2.5.8
Rendimiento verdadero en med¡os complejos
En un medio complejo la fuente de carbonp es desasimilada completamente en
los procesos de producción' de energía. Según Nagaí, 1979, la siguiente ecuación define el rendimiento verdadero:
u"={t*Y*'F*
t2.38I
Donde, mr: coeficiente de manten¡miento basado en la generación de calor, kJ.(g cél.horal-1; AH.: calor de combustión del sustrato, kJ.(mol sustrato)-l; Ysv: sustrato catabol¡zado por act¡vidad biosintética verdadera, molsustrato (g células)-1; /x: velocidad específica de crecimiento, hora-1;pr: velócídad especffica de consumo de sustrato; {mol sustrato).(g cél.horal-1 .
2.5.9
Rendimiento verdadero del oxígeno
Nagai (19791, supone que los procesos de producción de energía están dominados principalmente por la fosforilación oxidativa y que la mayor parte del oxígeno es consumida mediante sistemas via oxidasa en lugar de la fosforilación
7g
a nivel de sustrato. En este caso el coeficiente verdadero se calcula mediante la siguiente ecuación, (Pirt, 1965):
Fo=mo*
I
{r¡r.u,
t2.391
Donde,I/o = velocidad especffica de demanda de oxígeno, (mol Or).(g cél.hora)'; mo: coeficiente de mantenimiento (mol Or).(g cél,hora)-1; (Y,,o)u: coeficiente de rendimiento verdadero del oxígeno, (g cél)/(mol Orl; tty: velocidad específica de crecimiento de biomasa, hora-1 ,
2.6
FORMULACION DE-ECUACIONES CINETICAS A PARTIR DEL BALANCE DE MATERIALES DE UN CULTIVO CONTINUO
La medición de algunas de las variables más importantes de un proceso continuo
de fermentación tales como concentración de biomasa, concentración sustrato, consumo de oxígeno y producción de CO, es el punto de partída
de de
un balance de materiales con el propósito de formular las ecuaciones cinéticas requeridas para controlar un cultivo.
Ejemplo 2.8 Formulación de las ecuac¡ones cinéticas reqüer¡das para e¡ control de un cult¡vo cont¡nuo de células de S, cerevisiae.
En la Tabla 2.8 se presentan datos obtenidos experimentalmente (Mor y Fiechter, 1968), en un reactor continuo de mezcla completa (CSffl. En el proceso aerobio crecen células de Saccharomyces cerevisiae en un medio compuesto por etanol como fuente de carbono.
80
Tabla 2.8 Resultados experimentales de un proceso cont¡nuo de fermentación con células de Saccharomyces cerevisiae en un medio limitado por etanol, (Mor y Fiechter, 1968). Y*,.
020 3, 93 0, 0s5 4 ,70 0, 095 4 ,75 0,115 4,L4 0, 119 2 ,92 0,
0, 10
o,02 0, 06 ,54 2 ,59 0
t l0zl
0,4t4 19,5 0,49t 4l.,5 0,498 63,9 0,462 77 ,8 0 ,422 80 ,7
ttl0,02l Ct
11,
l_
23 ,8
,9 38,2 38,3 32
0,56 0,54 0,5L 0 ,49 0 ,47
o/o
C en ' células (base secal
50,05 49,29 49,70 48 ,98 49 ,9a
Donde;
:
ltxi velocidad de dilución, hora-1; pr: velocidad especffica de crecimiento de células, hora-1; D = UV; O: caudal, m1/hora; V: volumen ocupado por el líquido en el reactor, m3; x:concentrac¡ón de biomasa en el reactor: (g cé|. secas)/litro; s: concentración de etanol en el reactor, g etanolilitro; so: concentración de etanol en el alimento a¡ reactor: 10 g etanol/litro; Yr,r: rendimiento delsustrato en células, (g cél secas)/(g etanol); ttlOrl: oxlgeno en el aire estéril alimentado al reactor, ml O, /g cél,hora; a(COrl: CO, formado, (ml COr)/{g cél.horal; Cr: cociente respiratorio, (ml CO, formadol/(m! O, consumido).
D
Determinar:
1- La posibilidad de formación de productos ng celulares y, en el caso positivo, calcular la cantidad descargada al medio en cada ensayo.
2- El coeficiente de mantenimiento de oxfgeno y el coeficiente de rendimiento verdadero de oxígeno. 3- Formular las ecuaciones cinéticas requeridas para Controlar un cultivo similar de microorganismos. Solución:
81
- Balance de carbono - En la Tabla 2.9 se presentan los resultados del balance de carbono, evaluados según la Ecuación f2.12):
'
,'
or.Fs = dx. lrx
*
úc.Fco2
+ up.pp
(1)
Donde, os, oy, os, op; Contenido de C, en sustrato, células, CO, y producto, respectivamente, g Clmol; lts, lte, UlCOrl: velocidad especlfica de consumo de sustrato, de formación de producto y de producción de cor, respectivamente; mmol/g cél.h; p, : D: velocídad especffic¡í de crecimiento de biomasa y velocidad de dilución, respectivamente, h-1.
- Muestra de cálculos para D
:
0,115
h-1:
Pr=;l As Af =;(s,-§r.1, 1
Fs
-
- 0,6f) .8 !.tanol oj15 hora-1 gr,"él litro 4,14
(10
lttTo
g etangl mol,etaw! lIACD y- = e-15, ' g cé|. h 46 etarul nnlmntol e
l¡s = 5,65
mmol etanol
g
cét.h
:)
os
:
os.tts
ax
:
ox.ltx
oc
a2
:
24 (g.C).(mol etanol)-l
:
(24)(5,65)
'
= 135,6 (mg C).(g cél.h)-1
':
0,5 (S O.(S cél)-1: (última columna de la Tabla 2.8)
:
0,5 (g C/g céll(O,1 15 h-1)(1000 mg/g)
12 (g C).(mol
CO2)'1
:
57,5 (mg Cl.(g cét.h)'1
s,c.r(co) 'r e =
c 1 mol .u,z.^l co" P.nolg CO, 22,4 litro g cél.h
''P(CO)=
ZO'aS'ffi#
or.pr: C en productos no celulares descargados al medio de cultivo, Ecuación (1):
oe.!e
:
135,6 - 57,5 - 20,46
= 57,64 mg C/(g cél.h)
- Balance de oxígeno: t.
,i:
En la Tabla'2.1 0 se presentan los rá§ultados del,balance de oxfg€no, evaluados de acuerdo con la Ecuación t2.131:
tzt
For=A.ltr:B.Fr-g.¡Ln
,:,
Tabla 2.9 Balance de carbono durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae Gn,rrn cultivo cootinu) lirnitado por etanol. Ejemplo 2.8. \1
Fx
Fs
ds.lts
dx.Fx
o..ylCOrl oe.Fp ,r.p, ds-ls
0
,020
1, 09
0, 05s
2
0,095 0, 115 0, 1l-9
4,32 5,65 6
',54
,48
,2 6L, O 103 ,7 135,5 155, 5 26
10,
0
,5 4't ,5 57,5 59, 5
27
5, 95
t2;75" 17,62 20 ,46 20
,52
t0,25 20;7s 3e, sá 57 ,64 75 ,48
0,391 0
,'340
,372 0,425 o
0,4.85
83
Tabla
D=
2.10
Fx
Balance de oxfgeno durante el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en.,un cultivo continuo !imitado por etanol. Ejemplo 2.8.
plo2l
A.Irs
Q.Fc
(mmolOr).{g cél.h)-1
h-r 0
B.p,
3,27 ,62 L2,96 16,95 L9 ,44
,020
0, 055 0,095 0,115 0, ll9
0,87 1, 85 2,85 3,47 3,60
7
4,5'7 5,53 5,73
A.ps
A.lts
C.ttp
,440 ,409 0,427 0 ,469 0,520
7,44 3,72 5,54 7 ,95 10,1
0.96 2,65
c.vP
1, 83 4, 50 7 ,42 9, 00 9,33
0
0
Donde: .
A, B, C: oxígeno requerido para la combustión del sustrato, las células y los productos, respect¡vamente, hasta CO2, l.l¡O y NH¡ (si el sustrato y los productos contienen nitrógeno), en (mol Orl.(mol sustrato)-1.
- Muestra de cálculos para D C2H6O
Por tanto:
:
0,115
h-1;
+ 3 O, :2COz + 3 H2O
A : 3 moles Orlmol sustrato. A.uIr
mol o' :r.U rurc| etomt g cél.h mol eunol
=,
= 16,95
mmol
g
o'
cél.h
Se supone la fórmula de la biomasa: CH,,,rrOo,ooNo.,,, (Battley 1960). Por consiguiente, el o¡ígeno requerido para la combustión de las células, es: CH1,72O..44N0.,,
*
1,1
02: CO, + 0,15 NH3 + 0,635
Por tanto:
B = 1,1 '
84
no! oz=!::l=-cél mol cé122,86
g lgfrcnrno] mol
=
8,12
H2O
B.tt,
=
4si2# t
Tabla 2.8, para D
:
o,tts á-r = s,5o
(O)
-
77,8^l
#
O:
8cü
0,115 hora-l.
tt(o)
=
77,8 I
^lrrOr"
CCt.N)r4
It(o) = S,Ol
1 mol ?2,4 lina¡
ffi
C.gr: oxígeno en los productos no celulares descargados al medio de cultivo, Ecuación (2):
C.lt,
:
A.tt"- B.ttx- ltlOzl
:
16,95 - 5,53 - 3,47
-
7,95 mmol/g cél,h
-
Los valores de ls..prlllos./s), anotados en la iiltima columna de la Tabla 2.9, y los correspondientes a la penúltima columna de la Tabla 2.1O, lC.ttrlllA.ltsl, demuestran que en todos los ensayos hay formación de productos no celulares en cant¡dades equivalentes a 40 - 50 7o del etanol consumido.
- La Figura 2.2 es una representación gráfica de los datos de pl02l, en (mmol Or)/(g cél.hora), (Tabla 2.10l., y los datos de A.p" - C.lte, en (mmol O2lllg cél.hora), en función de los valores correspondientes de px en hora-l. Las relaciones lineales observadas en la Figura 2.2 confirman la validez de la Ecuación [2.39]:
tL(o)=n"*Oh;+,
(31
85
: .i
2.2 Determinación gráfica de los coeficientes de mantenimiento y rendimiento verdadero Üét'bxígeno, durante el ,crecimíento de .S. cerevisiae en un cultivo continuo limitado por etanol. Ecuación (3): p(or) vs lJx; Ecuación (4): (A./s - C.ltrl vs pr. Ejemplo 2,8. Figura
- (mmol oxigeno)/(g
ceLh)
,U_
a
{*:, 2 o
o
o,o2
0,o4
0,06
0,o8
0,1
0,12
Velocldad de dllucion, 1/h.
Si/(Or) se reemplaia en la ecuación de balance de oxísenó, Ecuación (2), se obtiene:
A'.tt"
-
*, . (o*),"
¿.11, =
t4t
Et coeficiente de mantenimiento de oxfgeno, mo, calculado como el valer promedio del intercepto, Ecuaciones (3) y (4), Figura 2.2, es:
,
m.
:
O;326 (mniot O2lllg cét.hora)
El valor del coeficiente de rendimiento verdadero del oxígeno, calculado a partir de las pendientes, Ecuaciones (31 v (a), Figura 2.2, es:
(Yvo)u
86
: 40,6
(g cél)/(mol Or)
Figura 2.3 Variación del contenido de oxígeno de los productos no celulares con el coCiente respiratorio , lC.Pp vs Crl, durante el grecimiento de S' cerevisiae en cultivo cont¡nuo limitado por etanol.
t2
(mmol oxigeno)/(9. celulas.hora) \i
,
.\_-i
10
\:l
"i'
:\
,
......'.-----...-....-.--i..-.-\sr---.-..-.....--"""'+'--'
i\i :\i
i\i
-?---.--..--'-""""í'-"'-""'--"""'--'\""'i
"
o o,4
:ii\ 'ii "'--" ¡'-'--'--."'----""-"'-"--'1"""" ,i: jri
o,44
""
""' - --"'+":"'
o,48
o,52
o,56
o,6
Cociente res?iratorio, Cr
- La Figura 2.3 es una representac¡ón gráfica de los datos deloxígeno presente (mmol en los productos no celulares descargados al medio lC.ltpl,f abla 2.10, en Orl/(O cél.hora), en función de los respect¡vos vglores del cociente respiratorio,
cr, Tabla 2.8. La relación lineal observada corresponde a la ecuación:
C.ttp=kr-4-C,
(5)
54,95 (mmol de productosl/(g cél.horal; kz : 90,5 ml O, (mmol productos)/ml COz(g cél.hora); Cr: cociente respiratorio, (ml'CO, formado)/(ml paraO, consumido). El consumo de oxígeno puede medirse con un analizador magnético de oxígeno, y la producción de CO, con un anal¡zador infrarroio de COr. Los valores del coCiente resp¡ratgrig, C/, demuestran que esta variable es apropiada para controlar el cultivo. Donde,
kr
:
- Las ecuaciones, (3, (4) y (5), también se pueden expresar respectivamerite como:
r, = (Yp)
".ro,
-
x.m¡(Y4o)"
87
7
],
:i
r" =
*(r.^, *(,
_
#,.r
)
_
" r)
1,. ,o=i(kr-k2.Cr).x -dxdoz-ds-dp ro"='r=A dt
'"=- ü
'r=á
Donde, rx; ro; rs y r": velocidades absolutas de crecimiento de biomasa, consu-
modeoxfgeno,consumodesustratoyformacióndeproducto,enmol/l,h. Estas ecuaciones cinétícas son indispensables para el control del proceso de crecimiento de S. cerevisiae en un cultivo continuo limitado por etanol.
2.7
DISEÑO DE MEDIOS DE CRECIMIENTO Y PRODUCCION
Uno dá'ios fadtbib's^pps r¡nortalles fermentación es el diséño del medio dé
e'n
creci
{ff
p*roceao'#
ión.! El medio no
sólo debe satisfacer los requerimientos nutrimentales y ambientales microorganismo, sino también las restricciones técnicas y económicas
.
É'
del del
proceso, con el propósito de minimizar los costos.de separación y purificación .y obtener un producto de máxima calidad al menor costo posible.
2.7.1
::' Requerimientos nutrimentales
Las consideraciones estequiométricas sobre crecimiento
y
formación
de
producto (Ecuación 2.1 9l constituyen el punto de partida hacia la determinación
de los requerimientos nutrimentales y ambientales y la composición de los medios de crecimiento.
88
-
Tabla
2.11 composición
química de los principales productos de la fermentación. (Cooney, 1 982)
Antib¡ót¡cos
Bacitracina Cefalosporina C Eritromicina Peniciliná G Estreptomicina Acido Acido . Acido Solventes
cítrico gluBónico láctico
Acetona Butanol Etanol
C6sH1o3N17Or6S
C16H21N3O.S Ca7H67NO13
'C,6H18N2O4S
C,
H3eN7O12
CuHrO, C6H12O,
C.H'O. CaH6O C4HroO C2H6O
Vitaininas y amínoáiidos
B',, Ríboflavina Acido glutámico Lisina Triptófano
Cu.HrrCoN,oO,oP Cr7H2oN4O6
CsHsNO4 C6H14N2O2 C1r H12N2O2
l
2.7.1.3
Requerimientos mínimos
En términos generales, los requérim¡entos rhínimos de un nutrimento son calculados esfequiorhétricamente. La necesidad de una sustancia nutritiva de interés se evalúa expeiimentalrhente mediante unalserie de ferm"entaciones por lotes, en las cuales esa sustancia se suministra en cantidades timitadas mientras Jos
otros nutrimentos son suministrados en exceso. 'l-a'.Figura 2.4 es una
representación esquemática de los resultados dq este tipo de ensayo. Eventualmente, a medida que aumenta la concentración de la sustancia nutritiva, esta se hace disponible en exceso y alguna otra sustancia se vuelve limitativa del crecimiento.
90
ocasionalmente, cuando tal experimento se realiza, el intercepto (curvas A y B de la Figura 2.41 no coincide con el origen. La curva A se obtiene cuando hay traspaso del nutrimento ensayado desde el cultivo semilla. Otra situación se presenta cuando hay necesidad de una concentración crft¡ca del nutrimento, ya sea porque el nutrimento se liga con algún material celular y forma un precipitado o un complejo, o si se destruye, o si su concentración disminuye durante la esterilización. En el balance de materiales deben tenerse presentes los requerimientos nutrimentales interdependientes. Por ejemplo, el sodio puede satisfacer parcialmente la necesidad de potasío. otros elementos como el calcio, no son esenciales para el crecimiento pero pueden ser necesarios para la estab¡lidad del producto.
Muchos microorganismos, heterotrofos, requieren una fuente orgánica de carbono que simultáneamente cumple la función de fuente de energía. Los microorganismos fotosintéticos y los autotrofos, utilizan carbono inorgánico: CO2, H2{COg)- y (COr}2- y una fuente separada de energía, puede ser la energía luminosa o la proveniente de la oxidación de un compuesto inorgánico.
Tabla2.12 Principales tipos de nutrición de las bacterias. (Pelczar, et at., 1977t Tipo
Fuente de
Fuente de carbono
Ejemplo del género
energla
Fotolitotróficas (Autotróficas)
Luz
CO,
Chromatium
Fotoorganotróficas (Heterotróficas)
Luz
Compuestos orgánicos
Rhodopseudomonas
Ouimiolitotróficas (Autotróficas)
Oxidación de compuestos inorgánicos
CO,
Ouimioorganotróf¡cas (Heterotróficas)
Oxidación de compuestos orgánicos
Compuestos orgánicos
Fototróficas
Ouimiotróficas Thio-
bacillus Escherichia
9t
Figura 2.4 Representación esquemática de la influencia de la concentración de un nutr¡rnento sobre la concentración final de células. La curva A se obtiene
cuando hay traspaso de nutrimento desde el cultivo semilla. La curva representa la necesidad de una concentración crít¡ca de nutrimento.
B
Concentracion de celulas
Concen traclon de nu trimen to
En la Tabla 2.13 se presentan los resultados de un análisis realizado por Haggstrom (1975), quien examinó la literatura y confrontó la composición elemental de las células con la cantidad de cada nutrimento añadida al medio.
2.7.1.4 Requerim¡ento de nutrimentos
específ¡cos
Muchos microorgairismos tienen requerimientos nutrimentales especlficos como consecuencia de su incapacidad para sintetizar algunos factores de irecimiento tales como vitaminas, aminoácidos y nucleótidos. La identificación de estos
nutrimentos se logra, generalmente, mediante procesos experimentales de eliminación. Una vez identificados los requer¡m¡entos, estos son calculados estequiométr¡camente a part¡i de datos sobre la'iomposición celular. En la fabla 2.13 se observa que algunos elementos generalmente son añadidos en exceso lP,nK, Cll , mientras otros son suministrados en cantidades próximas:a su valor límite,
: 92
Tabla 2.13 Concentración relativa de elémentos en las células y en los medios de'cultivo más utilizados. Las cifras representan los valores promedio de los datos publicados para bacterias Gram positivas y Gram negativas crecidas en
un medio mineral, X: proporción del elemento con respecto al nitrógeno; n: número de referencias consultadas.(Haggstrom, 1 975). Elemento
Medios
Células
x
x
N
100
100
P
23
25
776
66
K
L4
24
20L
't
s9
6s 70
27
15
74
B
66
4L 47
Fe
8,9 4,9 3,2 3,0 2,5 0,3
Zn
0, 14
Cu
0, 03 0, 05 0, 003 0, 002 0, 006
s Mg Na Ca
cl
Mn Co Mo
B
2.7.2
25
t_1
3
)-23
20 5
2t 20 2 3
11
29'"
2,2
50
0, 13 0, 04 0,15 0 ,02 0,09 0, 01
26
27 26 13 L7 9
Requerim¡ento de energía
Lá energía requer¡da por una célula ¡iará
ta ,rnr"",a
de tnasa celular, manten¡-
miénto y formación de producto, generalmente esta asociada con la utilización de la fuente de carbono. La oxidación de la fuente de carbono en el metabolismo anaerobio, piovee energla y genera Compuestos que sirven como aceptantes de los electrones generados en el proceso de oxidación.
93
El rendimiento de un sustrato en células se calcula a partir de datos experimen= tales, o del rendimiento de ATP en células, Y,orr. Además, se ha encontrado que la relación Y*)o* es constante e igual a 10,5 (9. cél).(molATPfl = O,4O4 (mol C en cél). (mol ,4TPl-1, (Ecuación 3.80). En aquellos casos donde un producto es el resultado deseado de una fermentación, hay que utilizar la fuente más apropiada de carbono para la síntesis del producto. La demanda de sustrato es (pr.x)/Yrs, donde p, es la velocidad especlfica de formación de producto, x es la concentración de célulaS, y Yp¡s el rendimiento de sustrato en producto (Secciones 2.5.5 v 2.5.6, y Tabla 2.7l,.
2.7.3 Requerim¡entos amb¡entales
Las sustancias nutritivas deben suministrarse a la célula en una forma y en un ambiente apropiados para su eficiente utilización. Entre las variables ambientales más importantes están la temperatura, pH, actividad delagua, concentración de nutrimentos, concentración de oxígeno disuelto (en el caso de fermentaciones aerobias) y presión parcial de COr. Sin embargo, es necesario insistir en el hecho de que los valores óptimos de estas variables no necesariamente coinciden para crecimiento y para formación de producto.
2.7
.4
Considerac¡ones técnico-económ¡cas
Entre las principales consideraciones técnico-económicas del diseño de medios de crecimiento y producción están los costos y la disponibilidad de materias primas, la necesidad de fuentes especlficas de carbono y nitrógeno, los costos de
separación y purificación de productos y todos los aspectos del control ambiental, La función objetivo primario de una fermentación es la minimización del costo del producto. Un aspecto ¡mportante en el estudio de factibilidad técnico-económica de bioprocesos es la minimización del costo de los nutrimentos, ya que estos representan entre el 1O y el 60 % de los costos de manufactura de un producto.
94
2.14 Materias primas utilizadas con mayor frecuencia en las industr¡as de procesos bioquímicos. (Precios de 1988: valor promedio en dólares EE. UU.lkg (Petrides et al., 19891. Tabla
Mater¡a prima
Precio
Comentarios
US §/kg
Fuente de carbono: Dextrosa monohidrato
Dextrosa anhidra 95%
0,50
Glucosa
Solución 70% peso/vol.
o,32
Jarabe de maíz
95o/o, equivalente de
0,40
dextrosa
o,28
Miel de maíz Melazas de remolacha
Sólidos totales: 70% Azúcares fermentables : 50
Melazas de caña
Similar a las de remolacha
0,09
Aceite de soya
Refinado
0,80
Aceite de maíz
Refinado
o,82
Etanol
Grado USP, libre de impuestos
0,56
0,1 0 o/o
Metanol
0,19
n-alcanos
0,50
Fuente de nitrógeno:
.
Anhidro: grado fertilizante
o,20
Acuoso: 29,4o/o, base NH,
o,21
Harina de soya
P¡oteína: 44o/o
o,24
Semilla de algodón
Harina: 62Yo Protefna
0,51
Licor de la maceración del maíz
Nitrógeno: 4, 5% peso/peso
0,1 5
Caseina
N:
2,40
Sulfato de amonio
Grado técnico
Nitrato de ámonio
Grado fértilizante, 33o/o de en volumen
Amoníaco
13,5o/o peso/Peso
o,12 lÚ
0,14 Continúa 95
T
abla 2.1
4 Continuación
Materia prima
Comentario
Precio
US $/ks
Urea
Grado: agrieultura N: 460/o
o,20
Levadura
Cervecerla, sin sabor amargo.
2,40
Suero
Seco: 4,57o lú, peso/peso
o,45
KH2PO4
Grado USP, gránulos
1,65
K2SO4
Puro, gráhulos
2,20
.
Fuente de P, S, Mg, Ca, K, Na:
NarHPOo
1,29
MgSOo.THrO
0,33
ZnSOo.THrO
Grado: agricultura, polvo
0,50
Otros matériales y sustancias qulmicas para reactores: Ampicilina
295,00
Penicilina
25,00
Estreptomicina
49,00
Medio celular animal, total, Antiespumante
Medio dqfinido. Escala que 1 m3/día.
mayor
1,00 0,75
El costo de la fuente de carbono y energfa es el factor más importante én la evaluación del costo de las sustancias nutritivas, (Tabla 2.141. Las fuentes de carbono utilizadas con mayor frecuencia son: almidón de maÍ2, dextrosa (de ma[zl , melazas, aceites vegetates, manteca de cerdo, metanol, n-parafinas, celulosa y lactosa. La segunda contribución importante al costo de las materias primas corresponde a la fuente de nitrógeno. Generalmente las fuentes compleias son más convenientes para la fermentación que las.sencillas como el amoníaco o las sales de amonio.
96
Las fuentes de nitrógeno ut¡lizadas con mayor frecuencia son: licor
de
maceración de maí2, harinas de soya y de pescado, hidrolizados y extractos de levadura, hidrolizados de protefnas, úrea, amoníaco gaseoso y los productos solubles de las destilerías. Materiales como el licor de cocimiento de maí2, los hidrolizados de protefnas y los extractos de levadura incrementan los rendimientos y productividades de un proceso, pero contienen otros materiales no utilizables, que deben separarse del producto final y luego tratarse con los efluentes de la planta. A medida que se conocen con mayor detalle los mecanismos de regulación metabólica, aumenta la tendencia hacia la utilización de fuentes definidas de nitrógeno, mediante la regulación de la velocidad de adición de compuestos específicos, en lugar de la utilización de materiales complejos.
2.7.5
Agua
El agua se ut¡l¡za en la preparación de medios, en los procesos de separación y purificación de los productos de la fermentac¡ón, en los procesos de refrigeración, desinfección y esterilización, y para el lavado de equipos, En algunas localidades la calidad del agua es variable y, por tanto, debe controlarse por métodos físicos, qufmicos y biológicos.
Estos tratamientos se dividen en cuatro categorías: 1- Ajuste de la composición química, o sea, la remoción de hierro, cloro libre, ácido carbónico y de la dureza del agua.
2- Remoción de sustancias suspendidas en el agua mediante floculación, sedimentación, filtración, centrifugación, y otros métodos de separación. 3- Remoción de microorganismos mediante filtración, desinfección y esterilización.
4- Remoción de coloides mediante floculación, coagulación y sedimentación filtración, o mediante ósmosis inversa.
o
97
Las trazas de amonfaco en el agua indican contaminación. simitarmente, las sales de los ácidos nitroso y nftrico afectan desfavorablemente el estado fisiológico de los microorganismos.
Las sales de hierro, en altas concentraciones, originan la decoloración de algunos microorganismos como las levaduras, inhiben la bigsíntesis de algunas sustancias corno en el caso de los antibióticos y causan la corrosión de tuberías
y eqr¡ipos. Las aguas con un recuento bacterial menor que 20
- 100 gérmenes por ml, son
consideradas como aguas de alta calidad, Las fluctuaciones de la dureza del
agua
y de los niveles de los cationes presentes,
especialmente calcio y
magnesio, afectan los rendimientos de sustrato en producto, En algunos casos, generalmente a escala de laboratorio, se utiliza agua desmineralizada o deioni-
zada para agregarle todas las sustancias necesarias en las proporciones adecuadas.
2.7.6
Fuentes de carbono
2.7.6.1
Melazas, cebada y extracto de malta
En la preparación de medios de cultivo complejos se ut¡lizan desechos o subproductos y extractos naturales tales como melazas, licor de maceración de malz, extracto de levadura y otros. La composición química de estos medios es variable, contienen diversas fuentes de iada elemento y generalmente deben ser complementadas con otros compuestos para proveer las cantidades adicionales de N, Mg, Py otros elementos. En la Tabla 2.15 se presenta un resumen de la composición de las melazas de remolacha y caña, obtenidas como subproducto de la elaboración de azúcar. La cebada (Tabla 2.1 6) es una fuente tradicional de carbono en cervecerfa y en la producción de levadura. La malta (Tabla 2.171 se prepara mediante germinación de la cebada. En la cervecería Ia malta se tritura, se mezcla con agua y se mailtiene a una temperatura elevada, para que las enzimas, amilasas y pectinasas, puedan degradar el almidón de la malta, 98
Tabla 2.15 Composición de las melazas de remolachE y caña (White, l g48l. Componente
Melazas
Remolacha %
Caña
Peao seco
7g
,0
85,
0
Total de carbohidratos
48,0
58,
0
N
0,2
PrO, CaO
0,01 0,15 -
Mgo
0, 0l_ -
KrO
2,2 0,1 0, 00s-
4r5
0, 001-
o
sio, AI2o3 'i{
'r
'
FerO.
28,O
C
Cenizas
4,O
2,8 0 ,02 0,7 0,1 0,5 o, úÉ ]
,02
34,0, 8,0
i it
.,.,.
o/o
78,0 - 95,0 50,0 - 59,0 0,08 - .0,s 0,009- 0,07 0,1s -_ q,8 0,25 - 0,8 0,8 - 2,2 0,05 - 0,3 0,01 - 0,04 0, 0q1- 0,01 28 ,0: - 33;,0 3,5 - 7,5 ,
Tabla 2.16 Monosacáridos y oligosacáridos en la cebada. (Sikyta, 1983). Carbohidrato
Peso seco mg.g-r
Glucosa
t.
Frúetosa
-
';'
Maltosa Sucrosa .Raf inosa
.Cetosa
0,2 - 0,93 0,33 - r;5g 0,0 - ,1,35 3,Atr = tr6,90
0,70'0,97 0,40 1,44
;
i:
"Fructosanod: solubles en etán'ol Fructosanos solubles en aquá
lr^
.
8."32
4,33 5,35 9,0
99
Tabla 2.17 Composición de extracto de malta en polvo. (Sikyta, Componente
Maltosa Hexosas (glucosa y fructosa) Sucrosa
Dextrina Otros carbohidratos ProteÍna Ceniza
1
983).
%
52,2 t9 ,11r8 15, 0
3,8 4,6 1r5
2.7.6.2 Licor de sulfito
El licor de sulfito es un subproducto de la industria de pulpa y papel, contiene entre 1 I V 20 o/o de minerales, y entre 80 y gO o/o de sustancias orgánicas. Su composición varía con el tipo de proceso de obtención de la pulpa. El licor con un pH entre 1 ,5 y 3,2, se neutraliza con hidróxido de calcio o con carbonato de calcio. Estas sustancias forman sales insolubles con la mayoría de los ácidos presentes en el licor,
2.7.6.3 Alcoholes sintéticos
Otras materias primas potencialmente importantes son los alcoholes s¡ntéticos. Las ventajas del etanol son: disponibilidad, precio razonable, calidad estandariza-
da, homogeneidad y solubilidad en agua. Entre las desventajas están
las
pérdidas por evaporación, que pueden alcanzar el 10 o/o del volumen total, y sus propiedades como sustancia de superficie activa que contribuye a la formación
de espuma en el medio, aunque es una espuma delgada que facilita
la
distribución de aire en el lfquido. La presencia en el etanol de sustancias como el croton-aldehfdo inhibe el crecimiento de microorganismos. El metanol comparte algunas propiedades con el etanol pero es más tóxico y más volátil.
100
2.7.6.4 Aceites
vegetales
Algunos bioprocesos, especialmente los de bioslntesis de antibióticos, utilizan aceites vegetales como fuente de carbono. Los microorganismos metabolizan fácilmente la mayorfa de los aceites vegetales, que por otra parte tienen amplio uso como antiespumantes.
2.7.6.5
Hidrocarbu¡os
Los microorganismos tienen la capacidad de utilizar, en mayor o menor extens¡ón, todos los hidrocarburos. La mejor fuente de carbono, entre los hidrocarburos, son los n-alcanos. El metano es asimilado por muchas bacterías pero no por las levaduras. Un kilogramo de metano produce 0,8 kg de células secas. Generalmente los microorganismos crecen mejor en una mezcla de' alcanos que sobre un solo compuesto.
2.7.7 Fuentes de nitrógeno inorgánicas y sintéticas
Muchos microorganismos, especialmente los hongos, se proveen de nitrógeno amonio. Generalmente los m¡croorganismos que asimilan nitrógeno inorgánico crecen con mayor rapidez en presencia de una fuente de nítrógeno orgánico. El sulfato de amonio, uné'de tos iümpue§tos'rhás económicos, se utiliza junto con el hidróxido de amonio y el amonfaco gaseoso como regulador del pH. La úrea constituye una fuente apropiada de nitrógeno, pero es costosa y se descompone a elevadas temperaturas, razón por la cual se esteriliza mediante filtración. El fosfato ácido de diamonio, fuente de nitrógeno a partir de las sales inorgánicas de
y de fósforo, se disuelve en agua formando un lodo voluminoso, diffcil
de
sedimentar compuesto por fosfato de calcio y fosfato ferroso. El amonfaco se utiliza en forma gaseosa, o en solución acuosa al 25 o/o. La solución acuosa libera amonfaco gaseoso y por consiguiente las tuberfas y equipos deben ser a prueba de gases y estar constru¡dos con mater¡ales anticorrosivos. 101
2.7.7.1 Licor de maceración de rnaíz
El licor de maceración de maíz es un subproducto del procesamiento de maí2. su composición (Tablas 2.18 y 2.1 g) depende del t¡po de proceso, de la calidad del malz, y de algunos procesos microbiales que tienen lugar durante la maceración, como es el caso de la fermentación del ácido láctico. Un criterio importante en la calidad del licor es la relación entre nitrógeno amino.y nitrógeno total. Esta relación indica la intensidad de la fermentación láctica durante la maceración y su valor debe estar alrededor de o,4, o sea, aproximadamente un 2 o/o de nitrógeno amino en la materia seca.
2.7.7.2 Torta de soya
La torta de soya es una importante fuente de nitrógeno.
de protelna; 0,5
contiene:44 - 47
- 1,2 o/o de grasas; 5;5 . 6,6 % de celulosa; 31 -..32
o/o
o/o
de
sustancias libres de nitrógeno disuelto; 5,5 - 6,0 o/o de cenizas; o,3o/o de calcio; 0,62 - 0,65 % de fósforo; 2,O - 2,5 7o de fosfatos. Los constituyentes principales son proteínas, grasa y fósforo. La torta sé obtiene mediante extracción del aceite del frijol soya y su calidad depende de la fuente del frijol y del proceso de extracción.
2.7.7.3 Licor de papa
El líquido residual obtenido al prensar la pulpa de papa .en la producción de almidón se somete inicialmente a sulfuración y fermentación láctica, mediante un cultivo de Lactobacillus delbrückii y luego se seca.. El calentamiento del licor (Tabla 2.201 por encima de l0OoC y su subsiguiente enfriamiento origina un prec¡p¡tado blanco-grisáceo, formado principalmente por fosfatos de calcio y magnesio, que interfiere la medición del crecimiento microbial.
102
Tabla 2.1 I Cornposicíón química promedio del licor de maceración de mafz. (Liggett,y Kgffler, 1948)
(§ardinal y Hedrick,
45,0
1
948)
¡rr.
edinoácido t de nitrógeuo N¡tes de Deepuée de
t
Couponente
Agua
Tabla 2.19 Aminoáóidos présentes en el lícor de maceración de maí2.
55,
0
htdr6lisis
htclrótr f
Leucina
5,86
4
,80
sie
N total
2,7
4,5
fsoleucina
3,42
2
,80
N amino
1,0
1r8
Valina
3,88
2
,85
Aeido
7
Sustancias 0,1 reducEoras
Acido
5,0
Ceniza Acidos volátiles
9,0 0,1
so,
-
11,
0
15,
0
glutámico
Treonina t'
1áce{co
lt.
,97
5,.44
Lisina
3
0,3
Arginina
8,23
q;009 -
'0,
ejta
Ca Cu0-
0,5
1r5
Histidina Profina Penil
Fe ItIg
0,01 0, 05 -
Mn
o, 004
P
2,0
3,0
Metionina Acido aspártico Cisteina Alanina
K
lr0
2,0
Tirosina
s
0, 34
Zn
0, 0s
10,
0
1i.5
0,
001-
,. .9, 05
1r0
alanina
3,0
,9'7
4,75 2,05 1,07 L,6B 1-,22 27 ,'7
0,7'4
103
Tabla 2.2O Composición del licor de papa. Sikyta, 1983.
Componente'
Sin fermentación Iáctica
Coh fermentación láctica
i
Peso seco Nit.rógeno total
72,'7
Nitrógeno amino Sustancias'reductoras Acido láctico
5,1 7,9 27 ,5 5,0
Cenizas
20 ,8
2.7.7.4 Extracto fermentado
,5 6,0 2,4 12 ,5 9,7 22,2 52
de salvado y aceite de semillas
El extracto fermentado de salvado y aceite de semillas (Tabla 2.211 se prepara
con salvado de avena, semillas molidas, agua, ácido láctico y superfosfato. Después de seis días de fermentación láctica a 50oC, el llquido se filtra y luego se evapora al üacfo.
Tabla
2.21
Composición del extrácto de salvado y aceite de semillas (Zelinka, 1 960)
Componente
Peso seco
Nitrógeno total Nitrógeno amino Sustancias reductoras Carbohidratos no reductores Total de carbohidratos
104
7o peso/volumen
70,0 4,6 2,0 19,2 4,2 23 ,4
2.7.7.5 Extracto
de levadura
extracto de levadura (Tabla 2.221 se prepara mediante autólisis o plasmólisis de la levadura de panaderfa o de la levadura de cervecerfa, El sabor amargo de lá levadura de cervecerla se remueve mediante tavado a pl'l entre 6,5 y 7,0; Las células de la levaduia se mantienen viables durante las operaciones de tavado y filtración para prevenir la pérdida de componentes celulares. El
Tabla2.22 Composición tlp¡ca de un extracto de levadura. (Bridson y Brecker,
Componente
mg.g-1
Nitrógeno totaf Nitrógeno amino Cloruros, como NaC-].
75 34-48 0,7 -
Peso seco Fosfatos , coÍro Carbohidratos
105 13
300 PzOs
38 82
lva
56
K
30
Ca
0r
Fe
0, 05
Mg
2
Cu
0, 05
zn
0, 05
Mn
0, 005
Co
0, 005
1
La autólisis se realiza en grandes recipientes bajo agitación continua. La temperatura se incrementa gradualmente hasta 48 - 50oC y luego se mant¡ene en este nivel durante varias horas. Después de la autólisis las enzimas son inactivadas mediante calentamiento halta 75oC. La levadura entonces es 105
transfer¡da a un rec¡p¡ente que contiene cloruro de sodio para inducir la plasmóli-
sis.
El extracto cont¡ene entre 3O y 40 o/o de cloruro de sodio, en peso. Finalizada la plasmólisis, las mer.nbranas y las paredes celulares son separadas de la solución mediante filtración o centrifugación. El lfquido se concentra rápidamente, a temperaturas menores que 37oC, con el propósito de prevenir la contaminación y la degradación de las sustancias termolábiles, Una de las principales razones del interés de los industriales en fuentes de carbono tales como metanol, etanol y ácido acético, es su pureza. El costo por unidad de masa de estos nutrimentos es mayor que el de los tradicionales, pero los costos de recuperación y limpieza son mucho menores. En la preparación de medios de cultivo definidos se ut¡l¡zan compuestos puros tales como glucosa, sulfato de amonio, met¡onina y fosfato monoácido de potasio. La composición quÍmica de estos medios es conocida y reproducible, generalmente contienen una sola fuente de cada elemento y los nutrimentos requeridos en cada caso particular. Estos medios son utilizados en investigación básica y aplicada, y en el desarrollo de procesos de fermentación.
Una clase especial de medio definido es el denominado medio mlnimo, constituido por una fuente de cada elemento y libre de otros nutrimentos no esenciales. Un medio mlnimo contiene, por ejemplo, glucosa, sulfato de amonio y otras sales minerales. En la Tabla 2.23 se presentan dos ejemplos de medios definidos. La preparación de estos medios facilita la exclusión de sustancias tóxicas, o inhibitorias, y la inclusión de sustancias precursoras, o inductoras, en las concentraciones adecuadas. Por esta razón cuando se utiliza un medio definido, en lugar de uno complejo, se logra mayor productividad en los procesos que requieren control ambiental estricto.
2.7.8 Medios de cultivo definidos
Los medios de cultivo complejos contienen grandes cantidades de materiales no
fermentables tales como sales inorgánicas, carbohidratos no ut¡lizables, n¡trógeno y fósforo. Alfinalizar la fermentación estos materiales deben separarse de los productos y tratarse, factor que contribuye a la elevación de los costos de control ambiental.
106
2.7.9 Control
ambiental
En el diseño de una nueva planta de fermentación, entre el 10 y el 15% de la inversión de capital, y una porción similar de los costos de operación, están asociados con el tratamiento de efluentes (Cooney, 1982).
El estudio de las materias primas adecuadas para un proceso es un aspecto importante de! estudio de los costos de tratamiento de efluentes. La tendencia en la industria de la fermentación es considerar globalmente el proceso e incluir en el estudio de factibilidad técnico-económica los costos de preparación de materias primas, esterilización, fermentáción, sepáración y purificación de productos y tratamiento de efluentes,
2.23 Ejemplos de medios definidos. A: medio mlnimo calculado para una concentración celular de 6 g/litro, con (NHo)rSOo como sustrato limitativo y biomasa con 7,5o/o de lú; B: medio para el eRsayo de lisina. (Difco Laboratories lnc.) Tabla
A:'
g.litro-1
Glucosa
B
g.litro-1
18,0 3,2 0,39
MgSOo
KH2P04
0, 68
IqHPO4
5,0 0,4 1,2
NACl
0, 008
NaCl-
o
FeSOn .'lH2O
0
,002
FeSOo .7H2O
0,02,
CuSOn.sHrO
0, 001 0, 003
CH3-COONa'
15 aminoácidos
o, 1Ü- o,
0, 028 0, 0002
4 nucleótidos 10 vitaminas
,002 2.10-6 - 2.ao-3
(NH4 )
'SO{
MgSOn.TH2O
ZnSOn -7HzO
CaC1,
CoCIr. MoO,
SHrO
GLucosa NHAC1
50,
0 I
,02
40,
l
0 6
o
0, 00001
107
En el diseño de medios de cultivo se logra un efecto regulador del pH, mediante la adición de componentes con este propósito. Por ejemplo, una mezcla de K2HPO4
2.8
y
KHTPO. permite el ajuste del pH alrededor de 7,O.
FORMULACION DE MEDIOS DE CULTIVO
prlmer paso,en la formr¡lacirin de.medbs.de G€{tivoes Ia determinación & l.a' eonc*n8aeión celular desedaen el fermentador.,"En la Tabla 2.24 se presenta
f[
un resumen de los intervalos de concentración celular más utilizados.
El
segundo paso es el conocimiento de la composición elemental de la biomasa {Sección 2.4 y E¡emplo 2.4l.. Eltercer paso es la determinación de las fuentes de cada elemento, utilizadas como nutrimentos, y la necesidad de factores de crecimiento. La cantidad requerida de una sustancia nutritiva se evalúa a partir del cono-
cimiento previo del rendimiento de sustrato en células, Y*,., (Sección 2.5 y Tabla 2.61. Pueden obtenerse experimentalmente valores de Y^,r, mediante la relación entre el incremento de biomasa y el sustrato consumido en un determinado período. En un cultivo alimentado por lotes son fundamentales las masas y no las concentraciones, ya que el volumen del cultivo varfa con el t¡empo. En un cultivo continuo, en un reactor de mezcla completa (CSIR), operado como quimióstato, el valor de Y*,. es el cociente de la división del valor de la concentración de biomasa, x, por la diferencia entre las concentraciones de nutrimento en la alimentación y en el efluente. El valor de Yr,, depende de las condiciones del cultivo. En aquellos casos donde no se dispone de datos experimentales, hay que calcular o,estimar este valor, según la ecuación: olo
Yrtt
o/o
cn la biomas en el nutrimetfu
elcmento
el¿mento
12.41t
En esta ecuación se supone que toda la sustancia nutritiva es utilizada en la sfntesis de biomasa. Por tanto ninguna porción de esta sustancia, en el caso de la fuente de carbono y energía, se emplea para mantenim¡ento y producción. 108
La evaluación de Yr,, para la fuente de carbono y energfa se fundamenta en el
concepto de electrones disponibles y grado de reducción'(Sección 2.3). Un procedjmiento alternativo es la evaluación delcoeficiente de rendimiento vérdadero de sustrato en células, (Y¡7s),, en medios mlñimos y en medios complejos (Sección ?.5.7 v 2.5.81. La cantidad de cada nutr¡mento se calcula a part¡r de la definición del factor de rendimiento: §o=§,F-
xF'
xo
Yrtt
12.43t
Donde, s: concentración del sustrato, g litro-l; x: concentración de biomasa, g litro-i; el subíndice o se refiere a la concentración inicial y el subíndice F a la concentración final, ,
lnicialmente se asigna un valor de cero a s.. Entonces los valores de s. obtenidos son multiplicados por un factor que oscila entre 1 ,5 y 2, excppto en el caso del sustrato limitativo (Acevedo, 1987), Otro paso en la formulación de medios de cultivo es la deterrÍ¡inación de los rendimientos de sustrato en producto, Yr,., (Secciones 2.5.5 y 2.5.6). Un enfoque alternativo es la evaluación de Yr," mediante los conceptos sobre electrones disponibleS y grado de reducción (Sección 2.3). La optimización de un medio de cultivo, dado el elevado número de variables, se realiza con la ayuda de procedimientos estadlsticos tales como el de BoxWilson (Box y Wilson, 1951) o elde Plackett-Burman, o mediante métodos evoItrcionarios, como el Evop Simplex (Sierra y Acosta, 1987).
Ejemplo
2.9
Diseño prel¡m¡nar de un medio de cultivo
Realizar el diseño preliminar de un medio de cgltivo con el propósito de alcanzar
una concentración de 14 (g células secasl.(litro de medio)'1, a partir de la composicióñ elemental de una cepa de mícroorganismos, columnas 1 y 2 de la Tabla 2.25, y de las materias primas anotadas en Ia columna 3 de la mísma Tabla.
110
Tabla 2.25 Diseño preliminar de un medio de cultivo. Columna 1: élerhénto; Columna Z g ele'mento (g células)-t; Columna 3: materia prima seteccionada y respectivo peso molecular (entre paréntesisl; Columna 4: (g elemento),(g nu-
trimento)-r; Columna 5: (g células).(g nutrimentol-1; Columna mento).(litro de medio)-1.
6: (g nutri-
+rry,"vv I \tb 1
2
4
3
N[^-'" C
0
o
¡I
0
,
,493
c5H1206'
(180)
0, 145 0, 0g
P
12.l_0-3
(NH4 )
(L32, 'SO4 t) Na2HP04
" (1-42)
Ca
FE
2L.10-3
9,576
P: 0,218
Pz 78,17
O,'77L
P: 8,48
'1,652
,6.10-3
(\7 4 ,21
I(:
CaCI, -2H2O
ca.0,273 c7:o i48z
Ca.45,5
0,308
5 - l-0-3
IUg:0;099 .S: 0, 130
M9=7,9,8
O,'t[l
(246 ,4)
2.L0-3
FeSOn.TH"O
Fe:0,20).
Fe:100,5
0,139
Cut 0 ,254 0 , L28
Cü32540
5,51.10-3
,246
Mn;492O
2,84.10-3
Co:
1,13'. 10-4,
MgSOn.TH2O
1.10-4
CuSOn.5HrO
(24e Mrl
lV: 1,46
Pz 0,178
IqHPO4
,.Q77,9) Cu
N: 0,21-2 .9: 0,242
Na.0,324
lt47l Mg
C: O,49 28,747
,194
H
P
(0,4).f = 0,24
5 . L0-s
, g),
MnSOn .4HrO
0
§:
,449
0,.115
,S:
Iutn:0
.9: 0 ,]-44
(223)
rr
Co
2.L0-6
CoCJ-,.5H,O
(237 ,8)
Co:0,248 C7:0,298
i
)-24000
Continúa
) 111
Tab1a 2.25 ConLinuación
L234's s
K Na c1
-¡
.'
12 - 10-3
11.10-3 5.10-3 5 - 10-3
Otros: 7,85.10
i
I i
i i
,
3
Solución: 1- En los numerales anteriores se anal¡za la necesidad de optimizar el medio de cultivo y de seleccionar las materias primas por métodos estadfsticos a partir de datos obtenidos en el laboratorio y Ia planta piloto después de un estudio de la factibilidad técn¡co-económica del proceso.
El propósito de este ejemplo es realizar una pr¡mera aproximación hacia la del medio, sin considerar los aminoácidos, vitaminas y otros "omposición nutrimentos específicos, ni las restricciones técnico-económicas. 2- La demanda de fósforo, 33.10-3 ¡g de Pi.(O células)'1, columna 2, se reparte en dos fracciones: 12.10-3 v 21.10-' g.g-', p"r" rár."utisfechas por los fosfatos ácidos de sodio y de potasio, y atender simultáneamente las necesidades de P,
i
3- Los elementos H y O, aportados en exceso por elagua y los otros nutrimentos, no figuran en el balance.
4- En la columna 3 figuran las materias primas preseleccionadas y sus respectivos pesos moleculares.
112
5- En la columna 4 figuran los resultados obtenidos al dividir el peso de cada elemento por el del respectivo compuesto seleccionado como fuente del elemento.
6- En el caso del rendimiento de glucos"a en carbono (fila 1 y columna 4, Tabla 2.25!., el resultado obtenido al dividir el peso de carbono en la glucosa por el peso molecular de la glucosa, se multíplica por 0,6, En un proceso'aerobio, aproxima@mente un 60 o/o de carbono es incorporado a la biomasa, mientras el 40 % restante es liberado como COr, ya que la glucosa es también fuente de energfa. En un enfoque atternativo, cuando se conocen más datos del proceso, se ut¡l¡zan las ecuaciones de crecimíento (Sección 2.3.3).
7- En la columna 5 figuran los resultados obtenidos al dividir los valores de la columna 4 por los correspondientes de la columna 2: g'eleruenu
g rutrir,¿rtto _ g células g ebnento g ruttrimenn g céfulas 8- En la columna 6 figuran los resultados obtenidos al dividir la concentración deseada de células, 14 (g cé|. secas).(litro)-1, por los correspondientes valores de la columna 5: 14 g céL. lítro netlio g ca. g unilúo
g runinento
lit¡o
medio
-
9- Determinación del contenido de sodio:
s NqIPo+ o.gz4 s Na ,.n., ' ttttüirnottto lit¡o
mtlb
s
I,
14 S céL. litro nudio
cel.
113
10- Et conten¡do de K, Cl y S, se evalúa de manera similar al del sodio. Los elementos Cl y S son aportados simultáneamente por diversos nutrimentos y l¿ cantidad total, calculada, de estos elementos en el medio es:
K:
0,0529
I §
K=
,
11.10-3
céL.
'
s
céL.
'
g
céL.
PROBTEMAS
2.1 En la Tabla 2.8 se presentan los resultados experimentales de un proceso cont¡nuo de fermentación con células de Saccharomyces cerevisiae en un medio limitado por etanol. Calcular el coeficiente de mantenimiento de etanol, ms, en
(mmol etanol).(g cél,hora)-l, y el coeficiente de rendimiento verdadero de sustrato en células, Y*,r, en (g cél).(mol etanol)-l .
2.2 Se utiliza un reactor de mezcla completa para producir anaeróbicamente en cultivo cont¡nuo etanol a part¡r de glucosa. El alimento libre de células y de productos contiene glucosa y amonfaco. En el efluente del reactor salen continuamente etanol, COr, agua y células (composición promedio: CH1,BlOo,s1N;1). Calcular los requerimientos mfnimos de amonfaco y glucosa para producir 5 kg/minuto de etanol. Suponer que por cada mol de glucosa, 0,7 moles son convertidas en etanol y el resto en células, CO, y agua. 2.3
Se utiliza un reactor de mezcla completa para producir en cultivo continuo, bajo condiciones anaeróbicas, glicerol a partir de glucosa y amoníaco. Suponer
que el rendimiento de glucosa en CO, es de 0,54 moles de CO, por mol de
114
glucosa. Calcular los rendimieñtos de glucosa en producto, en (g glicerol)/(S glucosa) y de sustrato en células (composición: CH,,,r,rOo.u.,No,r,l en (g célulasl/(g glucosa), y las velocidades de alimentación de glucosa en (kg de glucosa)/(hora) y de formación de células en (kg células)/(hora), requeridas para producir 12 (kg de glicerol)/(hora),
que el rendimiento de glucosa en células glucosa). (mol Calcular los rendimientos de de de células)/(mol es de 1,8 glucosa, respectivamente. glucosa en COr, agua y glicerol en moles/mol
2.4 Suponei en el problema anterior
Calcular el rendimiento máximo de sustrato en producto, (Yrr.l6;^, en el proceso de producción de ácido cítrico a partir de glucosa.
2.5
Calcular el rendimiento máximo de sustrato en producto, (Yr,")ror, en el proceso de producción de ácido acético a partir de etanol.
2.6
Se utiliza un reactor por lotes para producir ácido cftrico a part¡r de glucosa. El rendimiento de sustrato en células es O,22 (g células)/(g glucosa) y el de
2.7
sustrato en producto 0,58 (g ¿cido)/(g glucosa). Calcular el volumen de aire estér¡l lf : 22 oC, presíón : 16 psia) requerido para obtener 4800 kg de ácido cítrico por lote.
2.8 En un proceso aeróbicO se obtienen células y un producto orgánico , a taz6n de 1 mol de producto orgánico por.cada 3,4 moles de células, a,partir de glucosa y amonfaco .como sustfato. Hallar la ecuación de crecimiento correspondiente a este proceso si se supone un rendimiento de ATP en células Yxr¡rp : O,4O4 (mol C en células)/(mol / Tn : Yp¡rrp : O,4O4 (mol C en producto)/(mol ATPI. La formula global de las células es CHl,r,Oo,srNo,zz y la del producto orgánico es CH,,,uroo,.rNo,rr. ,
115
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119
CAPITULO 3
TERMODINAMICA DE LOS PROCESOS BIOOUIMICOS
3.1
PRINCIPIOS DE LA TERMODINAMICA
La termodinámica qufmica estudia los diferentes aspectos que tornan realidad
y
hacen que la misma se realice en térm¡nos de las variaciones de energfa con ella asociadas. Estas variaciones en un sistema que experimenta cambios qufmicos deben interpretarse en términos de una redistribución de su contenido energético entre las diversas formas de la energía presente en el sistema, (Crocomo, 1975).
una reacción qufmica
Un sistema es el conjunto de materia objeto de estudio. Todo lo demás en el universo que no hace parte de ese sistema part¡cular es el medio. El sistema y el medio forman el universo termodinámico. En ese universo la energía puede pasar del sistema hacia el medio, y de este regresar al sistema. Ese flujo de
energía puede analizarse termodinámicamente en términos del contenido energético del estado inicial del sistema, incluido el medio, y del estado final después de alcanzar el equilibrio. Los atributos mensurables del sistema tales como temperatura, presión, volumen, masa y otros, responsables del contenido energét¡co de cada estado, pueden relacionarse termodinámicamente mediante una ecuación de estado.
120
La termodinámica utiliza parámetros macroscópicos para analizar las variaciones
de energla y, por tanto, no requiere del conocimiento de la composición molecu-
lar del sistema o su medio, o del mecanismo molecular mediante el cual un proceso tiene lugar. Un análisis termodinámico de las variaciones de energla tiene en cuenta so¡amente los estados inicial y final del sistema, y es independiente de la velocidad de los procesos que ocurren, aspecto que debe ser estudiado por métodos cinéticos. Un sistema puede ser aislado, cerrado o abierto. Un sistema es aislado cuando no intercambia matgria ni energla con su medio. Es cerrado cuando no intercambia materia con su medio pero la energfa es libremente ¡ntercambiada. El análisis de los sistemas cerrados es relativamente simple porque sólo depende de los estados inicial y final después de alcanzar el equilibrio. El estado de un sistema puede definirse en términos de su presión, temperatura y composición. Las variaciones de energía están d¡rectamente rélacionadas con los intercambios en la composioión material cuando la presión y la temperatura permanecen
constantes.
3.1
.1
Conservación de energía
La primera ley de la termodinámica establece que "la energla totalde un sistema aislado es constante, independientemente de las variaciones de su forma dentro de ese sistema". En otras palabras, la energfa no puede ser creada ni destruida pero puede sufrir transformaciones de una a otra forma como energfa calorífica,
luminosa, eléctrica, mecánica o qulmica. El principio de conservación de la energfa incluye no solamente los sistemas aislados sino también los intercambios de energla entre un s¡stema cerrado y su medio, una vez que el sistema cerrado más su medio, forman un sistema aislado, La diferencia entre la energía potencial de los reactivos y la de los productos, en una reacción qufmica, es la energía liberada o absorbida por la reacción. La magnitud de esta energía depende de la naturaleza qufmica de los reactivos y de los productos. Una parte de la energla es liberada como calor y otra como trabajo, pero la suma de estas dos cantidades es siempre igual para una dada cantidad de reactivo:
121
A,U=Ur¡*t-Un,a
t3.11
Donde AU es la variación de energfa cuando el sistema cambia desde el estado inicial hasta el final.
Un sistema ierrado realiza diversos tipos de trabajo sobre su medio, cuyas cantidades pueden ser sumadas baio el término W (trabajol. La energía totaf gastada por el sistema para realizar trabajo es. - W. La variación de la energfa interna de un s¡stema isotérmico, a presión (p) constante, que simultáneamente pierdé energfa (- w) para su medio, y adquiere ener§ía bajo la forma de calor (+ O) a partir de su medio, es:
Donde,
w: trabaio realizado por
LU = Q -
W
el sistema;
o: calor absorbido por el sistema.
f3.21
La transferencia de energía entre dos sistemas se realiza medíante flujo de calor o de trabajo. La energía es una propiedad caracterfstica de un sistema. Elflujo
de calor o el trabajo no son propiedades de un sistema. uno de los tipos de trabajo más importantes en una reacción qufmica es el resultante de una variación def volumen del sistema, generalmente conocido como trabajo presiónvolumen (trabajo PV). La variación de la energía de un sistema isotérmico que sólo realiza trabajo derivado de la expansión sobre su medio, es: a - volumen constante;
4U=Q"
t3.3I
¿,U=eo_p.^V
f3.41
b - presión constante:
Donde, Ou: calor absorbido bajo volumen constante, sin expansión
y
sin
realización de trabajo; oo: calor absorbido bajo presión constante, cuando él'
único trabajo realizado es el trabajo de expansión présión-volumen; p.aV: trabajo presión-volumen reatizado por el sistema sobre su medio como consecuencia de la expansión; aU: incremento de la energía interna del sistema. 't22
Cuando se consideran otras formas de trabajo (W'), la primera ley de la Termodinámica se expresa como:
Finalmente, si
AU=Q-P.LV-fl
t3.51
LU=Q-P.AV
t3.61
W':0:
3.1.2' Entalpía
La energfa interna (U) .de un sistema es un atributo que depende del estado presente del sistema, por ser una fpnción de estado. No se puede medir e.l valor
de U de un sistema cerrado en cualquier estado, pefo sí es posible medir la diferencia que U adquiere entre dos estados. En condiciones de presión constante, el valor de Qo se calcula a part¡r de la Ecuación [3.4]:
Qo=(Ur-Ut*P.Vz-P.Vt) .¡?
Qo =
\U, + P.Vz) - (U, + P.Y1l
t3.7I t3.81
)
(-O, es una función de estadúy, por consigu¡ente, puede calcularse como
la diferencia entre los valores de una propiedad de estado, entre los estados inicial y final.
(U + P.V) es la entalpfa (H) del sistema. La entalpía es una función de estado. De acuerdo con la ecuación anterior, la variación de entalpía de un proceso que se desarrolla a presión constante es: La función
¡H=Qp=Hz-Ht
t3.91
El término AH expresa el calor liberado o absorbido por un proceso que se desarrolla a presión constante. Si se libera calor hacia el medio la entalpía del sistema disminuye (AH es negativo) y la reacción es exotérmica, Si el sistema absorbe calor (AH es positivo) y la reacción es endotérmica. 1-23
3.1.3
Energía libre
La segunda ley de la Termodinámica fija algunas limitaciones a los tipos de transformaciones de energía que ocurren en los procesos químicos o físicos, De acuerdo con esta ley "las reacciones espontáneas realizan trabajo útil cuando ocurren bajo condiciones apropiadas". Ese trabajO út¡l se expresa mediante la energía libre (G). Generalmente Se supone que un Sistema experimenta una reacción espontánea cuando pierde calor hacia su medio baio condiciones de temperatura y presión constantes. Si este fuera el caso, todas las reacciones exotérmicas serían espontáneas. Además se supone que las reacciones endotérmicas no ocurren espontáneamente. Ninguna de estas suposiciones es correcta. La variación de entalpía, AH, que acompaña una reacción no es una medida de la capacidad de la reacción para real¡zar trabajo útil. Por otra parte el cambio de energía libre, AG, que acompaña una reacción es una medida de la capacidad de la reacción para reahzar trabajo adicional además del trabajo PV. Cuando AG es negativo el sistema pierde energía fibre, que puede ser ut¡lizada en la realización de trabajo. Cuando AG es posítivo, el sistema recibe energía libre y la reacción no puede realizar trabajo, De acuerdo con la segunda ley, una reacción espontánea se caracteriza por la pérdida de energía libre. La segunda
ley predice la dirección de una determinada reacción, pero no predice su velocidad. Cuando AG es negativo, la reacción es exergónica. Si AG es posítivo, la reaeción es endergónica. Cuando AH es negat¡vo, la reacción es exotérmica. Si AH es positivo la reacción es endotérmica.
3.1.4
Entropía
una reacción exergónica no necesariamente es exotérmica, pero es espontánea bajo condiciones de temperatura y presión constantes. Por consiguiente, la cant¡dad'de calor absorbida o generada por una reacción, cuando no realiza trabajo útil, AH, generalmente dif¡ere del valor de AG.
124
Esa diferencia comúnmente es tan grande (Crocomo, 1975) que convierte a AH en un término sin valor como lndice de espontaneidad de la reacción. Por tanto,
debe ocurrir otra variación en la distribución de la energía, independiente de la variación de la energla libre. De hecho, la díferencia entre los valores de H y G, puede atribuirse a una variación s¡multánea en el valor de otra función de estado del sistema, la entropfa.
La tercera ley de la Termodinámica establece que "en el cero absoluto, los cristales perfectos de todos los compuestos tienen entropía nula". O sea, cuanto más ordenado es un sistema, menor es su entropla. La entropía (S) es una medida de la desorganización de un sistema y es un valor que determina la magnitud de la porción de la energla de un s¡stema que es incapaz de producir trabajo útil. Bajo unas condiciones dadas de temperatura y presión, la variación de entropla, AS, es igual a la suma de las entropías de los productos menos la suma de las entropfas de los react¡vos. La expresión que relaciona el cambio de entropla con los correspondientes cambios de energía libre y entalpfa, es:
AG=LII-T.LS
t3.10I
Todo proceso tiende hacia la dirección donde la entropía delsistema, más la del medio, aumenta, hasta alcanzar el equilibrio, punto en el cua! la entropía tiene el máximo valor posible bajo las condiciones dadas de presión y temperatura. El equilibrio puede definirse como un estado más allá de cual ninguna variación física o qufmica tiene lugar y en el cual la temperatura, la presión y la concentración, permanecen constantes en todo el sistema. En otras palabras, en un si*e¡oe--en,equilibrio se agota la capacidad de-l sistema
-p37áEa[egr1¡gutjo
sojlg_su_CIgdio. Un proceso que ocurre con aumento de entropía y alcanza el equilibrio no puede sufrir una reversión espontánea y regresar a su estado ¡nicial ya que ese paso requeriría una disminución de la entropfa. Todo proceso que ocurre con aumento de entropla es irreversible, mientras que los procesos que ocurren sin variación de entropía son reversibles. En nuestro mundo físico todos los procesos reales, incluida la vida, son irreversibles. Las reacciones bioqufmicas tienen lugar en soluciones acuosas diluidas, bajo condiciones de temperatura, presión y volumen constantes. Por consiguiente,
si el término P.AV es cero, entonces AH
= AU, y la Ecuación t3.101
se
convierte en:
125
AG=AU-T.AS
t3.111
AU=A,G+I.As
13.121
Las dos ecuac¡ones anter¡ores son válidas para cond¡ciones de temperatura, presión y voluinen constantes. A medida que el s¡stema se aBroxima hacia el equ¡librio la énergla libre AG disminuye hacia su mínimo valor. Un sistema bajo condiciones constantes de lemperatura y presión, intercambia libremente energía con el medio, sin intercambio de masa. Cuando un sistema sufre una variación que lo lleva al equilibrio, la energfa total del sistema más la del medio permanece constante, aunque la energía del sistema solo, puede crecer, permanecer constante o disminuir. Simultáneamente, el sistema puede cederle calor al med¡o, o recibir calor del rnedio. Ya se mencionó que la entropía del sistema, más el medio, aumenta hasta alcanzar un máximo en el punto de equilibrio. La entropía de un sistema que se dirige hacia el equilibrio no siempre aumenta. Su valor puede aumentar, permanecer constante o disminuir Sllg entropíá del -cistema disminuye, en@ta ellqna. sant¡dad
tal que la suma de las variaciones de entropfa del sistema, más el
,yñAlr.Ñ,ir]ñ¿61ósorffi
medio,
.r"n,i6ilir_dili*y.!"ro
la del medio aumenfá.
3.2
ANAL¡SIS TERMODINAMICO DEL METABOLISMO MICROBIAL
La termodinámica analiza las transformaciones de la energía, su metodología se fundamenta en la posibilidad de definir la calidad y la cantidad de energía de un sistema mediante las funciones de estado, energfa interna U y entropía S, l-os organismos vivos transforman la energfa radiante en los procesos fotosintéticos, o la energía química en los procesos bioquímicos, en otras formas de energía. En estos procesos la energla fluye desde una forma de alta calidad, o de menor entropía, hasta una forma de menor calidad, o de máyor entropía y, de acuerdo con la primera ley de la termodinámica, los procesos que ocurren en el sistema no alteran la cantidad total de energía.
126
Para realizar su actividad metaból¡ca los organismos intercambian energfa con el ambiente en la forma de sustancias químicas y calor. En la Figura 3.1 se representa esquemát¡camente un sistema microbial con elpropósito de analizarlo macroscópicamente. Las velocidades de flujo de masa de las sustancias químicas son representados por (Di, mol i.s-1; el qJa molar parpial, h;, kJ/(mol i), v s,, kJ. (mol i. K)-1. El calor intercambiado con el ambiente se define como Oo, kJ.s1. Todos los
flujos son definidos como positivos cuando se dirigen hacia
sistema. Los subÍndices ".4" y
Figura
"F
3.1 Análisis termodinámico
el
indican afluente y efluente respect¡vamente.
de un organismo, representación
esquemática
Micr oongonismo
En la descripción macroscópica de un sistema, el cambio con respecto
al
t¡empo, de las denominadas cantidades extensivas tales como masa y energía, puede expresarse mediante ecuaciones de balance, En el caso part¡cular de la energfa interna U, la respectiva ecuación de balance es:
Ut=¡v-4u
t3.13I
Donde, U': velocidad global de cambio en U, kJ.s-t; nu: velocidad de producción
de energla de los procesos que ocurren en el sistema; {Dr: velocidad de transporte de energía hacia el sistema. En condiciones estables U' es igual a cero. Además, de acuerdo con la primera ley de la Termodinámica, los procesos de transformación dentro de un sistema cerrado no alteran la cantidad total de energía, de manera que rru : 0 y la ecuación anterior se convierte en: 127
t3.141
0u=0
Según esta écuación, el flujo total de energía que un sistema en condiciones estábles intercambia con el ambiente es cero.
Pueden distinguirse'diferentes contribuc¡ones cqntenida.en las sustancias químicas:
a
tDu:
el calor y la
energía
t3.151
0u=Óo+»(rt¡.Qr)
Donde, rDo: velocidad de flujo de calor hacia el sistema, kJ.s-1; h,: entalpía molar parcial, kJ.(mol i)-1; O¡: velocidad de flujo de masa de i, mol i.s'l.
Si en la ecuación anterior se reemplaza Q, = 0 se obtiene la ecuación
de
intércambio de energfa entre un sistema en condiciones estables y el ambiente:
0a=-8,(ñ,'0,)
t3.161
La ecuación de balance de entropfa es:
S/
=
rs
t3.17I
+ 0s
Donde, S'; velocidad de cambio de entropía, kJ.(s.K)-1; nr: velocidad de próducción de entropfa; tD": velocidad de intercambio de entropía entre el sistema y el ambiente. En condiciones estables, S': 0, y:
ro=-0s De acuerdo con la segunda ley de la Termodinámica
t3.18t
n
debe ser mayor que cero
para que el proceso ocurra y, en consecuencia,
.,=t:alg¿'§¡)
128
t3.19I
Donde s,: entropfa molar parcial, kJ.(mol i.K)-1;
velocidad de flujo de masa de
i, (mol i)/s;
negat¡vo) desde un sistema donde ocurre un proceso, como en e! caso de una reacción bioqufmica en un organismo. Roels (1987) al referirse a la Ecuación [3.19], expresai "MientÍas los procesos aerobios son impulsados por la producción de calor, los procesos anaerobios son impulsados por las diferencias de entropía de las sustancias qulmicas intercambiadas entre el sistema y el ambiente"
Los procesos endotérmicos donde el calor fluye desde el ambiente hacia el sistema son posibles (Qo positívo) por la contr¡bución de los flujos molares parciales de entropía, que hacen negativo elflujo total Os. Cuando se reemplaza rDq, de la Ecuación [3,16], en la Ecuación t3.191, se obtiene: (o"gJ 0¡=- D
t3.201
Donde, gi: entalpía libre molar parcial, kJ.lmol ¡)-r , def¡n¡da como:
&=h¡-I's,
t3.211
Donde, h,: entalpía molar parcial, kJ.(moli)-1; s,: entropía molarparcial, kJ,(mol i.K)1. De las ecuaciones t3.181 y 13.191, y la restricción impuesta por la segunda ley, se obtiene;
E¡(0¡.8J > 0
f3.221
Esta ecuación expresa las restricciones de la primera y segunda leyes de la Termodínámica al intercambio de sustancias químicas entre un sistema en condiciones estables y el ambiente, como en el caso del metabolismo microbial. Una conclusión muy importante, impllcita en la Ecuaciónf3.221, está relacionada con aquellos compuestos que no manifiestan intercambio neto con el ambiente. esto es, compuestos para los cuales O¡ es cero y, por tanto, no afectan esta ecuación.
129
En la descripción de los procesos que ocurren en un sistema microbial hay numerosos compuestos que en situaciones normales no están sometidos a intercambio con el ambiente, es el caso de los transportadores de energía, ATp y NADH. En un análisis termodinámico detallado de las diversas rutas bioquímicas estos compuestos aparecen, pero en un tratamiento macroscópico. acorde con la Ecuación 1,3.221, estos compuestos no intervienen.(Roels, 1987).
3,3
ENERGIA LIBRE ESTANDAR
Las molécutas orgánicas complejas tienen ,n eleraOo nivel de energla potencial originado en su alto grado de orden estructural. Cuando la molécula de glucosa se oxida hasta CO, y HrO, cede energla libre, esto es, la forma de energía capaz de realizar trabajo en condiciones de presión y temperatura constantes. Esta energía química se recupera al sintetizarse, de nuevo, el trifosfato de adenosina, ATP, formado a partir de difosfato de adenosina, ADP y el fosfato inorgánico, Pi, en una reacción enzimática. El ATP, asl formado, se difunde hacia aquellos puntos de la célula,. donde se requiere su energía. La célula utiliza esta energía para realizar tres tipos de trabajo: síntesis química de moléculas grandes y complejas, transporte hacia el interior y hacia el exterior
de la célula o de sus orgánulos internos, de sustancias iónicas y neutras, y trabajo mecánico requerido para el movimiento y la división celular. El cambio de energía libre, AG', de la reacción química:
t3.231 Se expresa como:
L,
G'= A Go' + R.T ln d6.e" a" -bi -
Ig.24t
Donde: a, b, d,e: denotan las concentraciones molares de los compuestos A, B, D, y E AG"': cambio estándar de energía libre en kJ.(mol)-1, cuando los reactivos y los productos de la Ecuación t3.231 están presentes a temperatura y presión normales, en concentración 1 M, en una solución acuosa de pH : 7. 130
Por esta razóniel últ¡mo término de la Ecuación t3.241 no ¡n"i.iye las concentraciones de agua e H*, aún en el caso de que estas dos sustancias sífiguren en la ecuación t3.231. El superíndice prima denota evaluación en una solución
acuosa a pH : 7i o, B, 4 e, son los coeficientes estequiométricos de la Ecuación 13.231; F: constante de los gases, F = 8,314 J.(gmol.K)-1; T: temperatura absoluta, K. Las soluciones biológicas son tlpicamente d¡luidas, y por consiguiqnte, la Ecuación 13,241se expresa en términos de concentraciones molares en lugar de las correspondientes actividades. La reacción expresada mediante la Ecuación t3.231 se desarrolla en un sistema
cerrado de izquierda a derecha, si y sólo si AG' es negat¡vo. Además, AGo', denota el cambio de energía libre estándar de la Ecuación t3.231 en una solución acuosa neutral con todos los reactivos y productos presentes en concentración 1 M. Esta consideración es una aproximación, ya que, ni la célula es un sistema
cerrado ni los reactivos están presentes en concentración 1 M, (Lehninger, 19711. En el equilibrio, AG' = 0, y la Ecuación t3,241se convierte en;
AGo=-R.TlnK,
t3.25I
Donde Kr, es la constante de equilibrio. Esta constante incluye las concentraciones de agua e H*, a pH 7, cuando estas sustancias participan en la reacción. Debe tenerse presente que la dirección de una reacción aislada no indica la dirección de la ruta metabólica. Asl, por ejemplo, en la siguiente reacción, (Bailey y Ollis, 1986), el cambio negativo de energfa libre favorece la formación de fosfato de dihidro-oxiacetona:
CHO I
AG"'
CHOH
- - 7,658 kJ/mol
I
t3.261
cH2o- P g1
iceraldehfdo-
3
-
fosfato dihidro -oxiacetona- fosfato
Donde P denota fosfato. Si se analiza la ruta Embden-Meyerhof-Parnas, EMP, (Figura 1.3), el gliceraldehído 3 fosfato es remo'.rido cont¡nuamente mediante reacciones que lo convierten finalmente en ácido pirúvico y la reacción t3.26I es forzada a realizarse de derecha a izquierda para mantener el equilibtio.
131
3.3.1
'
Energla libre estándar de hidrólisis de algunos compuestos
fosforilados
En laTabla 3,1 se presentan valores de la energía libre estándarde hidrólisis de
algunos compuestos fosforilados. Las reacciones qufmicas exergónicas (variación de energla libre estándar negativa) se verifican en la dirección en que se hallan escritas si se inician con todos los componentes en concentración 1 M.
Tabla
3.1 Energía libre estándar de hidrólisis
de algunos compuestos
fosforilados. (Lehninger, 1973)
AG'', kJ
Compuesto
Fosf 1.3
oenol-piruvato
67,9
-Difosfo-glicerato
49 ,4
Fosfocreatina
43,1,
AcetiLfosfato
42 ,3
Fosfoarginiha
32 ,2
ATP
30,5
Glucoso-1-fosfaEo
20 ,9
fosfato
Fructoso-
6
-
Glucoso-
-
fosfato
1- f osf
6
ato de gI iceri
Dirección de transfelencia de! grupo fosfato
1_5
,9
13,8 l-o
9,2
El calor sólo se,,.convierte en traba.io cuando fluye desde un cuerpo a mayor temperatura hacia otro a menor temperatura, pero los organismos vivos son esencialmente isotérmicos y, por consiguiente, la energla liQgrada en la oxidación de un combustible tal como la glucosa, se conserva en forma de energla química para realizar trabajo rltil en condiciones isotérmicas.
132
- .i ?
3.3.2 Energía libre estándar de algunas reacciones biológicamente ¡mportantes En la Tabla 3.2 se presentan valores de la energÍa libre estándar de algunas
reacciones biológicamente importantes. Se observa, en la Tabla, que las reacciones de oxidación, son las reacciones productoras de energía más importantes del metabolismo, ya que se realizan con disminución relativamente grande de energfa libre estándar. Tabla
3.2
Variación de la energfa libre estándar de algunas reaccíones qulmicas (pH = 7,O;f = 25oC). (Lehninger, 1973). AG"., KJ
Reacción
Hidrólisis:
- ¡nhtdridoE de ácl,do - EBüereE Acetato de etilo + HrO --> etanol + acetato Glucoso-5-fosfaEo + HrO -> glucosa + fosfato - Anldag Glicilglicina - Gluc6sidog
+ HrO ---> 2 glicocola
Sacarosa + HrO ---> glucosa + fructosa
- L9,7 - 13,8 -
9,2
- 29,3
ReordenacLón:
Fructoso-6 fosfat.o -- > glucoso-6-fosfato Elinl.naci6n: Malato -> fumarato + H2O
- 1,7 + 3,1
Oxldaci6n:
Acido pal-mÍt,ico + 23 O" --> 16 CO, + 16 HrO
- 9784,5 133
3.3.3 Ciclo eirergético dé'las"células
tos tres núcleótidos: ATP, ADP Y AM? representados en la Figura 3.2, están presentes en todas'las células. La suma de sus concentraciones es relativamente constante, en la niayorfa de las células varía entre 5 y 15 mM.
Figura
3.2 ATP, ADP v AMP,
a pFt ZO. Los enlaces ricos en energfa apárecen representados por el sirñbOlo -,(Lehninger, 1973).
o- o-
o-
o1l
oil
llt o-P,-.o-P:o_cH, -g-Poil
1.,
K.,H
OH
O}I
ATP
Complejo de
Mg" y ATP
,MS:'
ttr
-O-P - O-P - O-P-O-
llillr ooo
Ribosa-Adenina
sin embargo, las proporciones relativas de ATp, ADp
y AMp en la célula varían considerablemente de acuerdo con su estado metaból¡co. Los nucleótidos ATp y ADP están presentes en la célula como complejos: MgATp2- y MgADp-, a causa de la afinidad de los grupos pirofosfato por los cationes divalentes y por la elevada'concentrac¡ón de Mg2* en el fluido intracelular.
134
Un indicativo útil del estado energético de una célula es la carga energética (Atkinson, 19771: corga energéti* =
¡3.271
ffi
Asl, por eiehplo, una célula "plenamente cargada" con ATP como
único
nucleótido tiene una carga energética de 1,0. Si las concentraciones de los tres nucleótidos son iguales:
\ATPI:IADP):IAMP) y la carga de energía es 0,5, (Bu'lock y Krístiansen, 1987). ,l En la mayorfa de las células el valor de la carga energética varía entre 0,87 y 0,94. La carga energética alcanza su mfnimo valor cuando las células están en la fase exponencial del crecimiento, en este caso el ATP es ut¡lizado tan pronto como se forma. A medida que la velocidad de crecimiento disminuye, aumenta la cantidad relativa de ATP, y la máxima carga eriergét¡ca se alcanza cuando las células termidan su crecimiento y todo su ADP y AMP es convert¡do en ATP. La posición intermedia del trifosfato de adenosina, ATP, en la escala termodiná'
mica de energÍas del enlace fosfato (Tabla 3.1) y la especificidad de las enzimas
de transferencia del fosfato hacia el difosfato de adenosina, ADP, o hacia el ATP, demuestran que el sistema ADP-A IP es el intermediario común obligatorio en el transporte de los grupos fosfato, desde los fosfatos de elevado ninel energético formados durante el catabolismo, hasta los receptores de fosfato de baio nivel energético. El 1 ,3 difosfoglieerato y el fosfoenolpiruvato, formados durante la degradación
anaerobia de la glucosa hasta ácido láctico, en lugar de experimentar hidrólisis en la célula intacta, ceden su grupo fosfato mediante enzimas especlficas, para forma¡ ATP:
l,3difosfoglicerato + ADP
fosfoenolpiruvato
(:=)
+ADP (::)
3fosfoglicerato + ATP
aG"':-18,9kJ
t3.281
piruvato +ATP AGo'
= - 31,39 kJ
I3'29I
135
Donde la reacción t3.281 es catalizada por la enzima fosfoglicerato-quinasa y la t3.291 por la piruvato quinasa. La.energfa liberada por los ésteres fosfórjcos provicrie, no de los enlaces que se rornpen, sino del hecho de que los produc,tos tidm¡i,'rnenor energíb lhre flotafi¡iie tos reactivos ,. ,t Q o'1o v z ty't a cr Hay muchas enzimas que catal¡zan la transferencia de un grupo fosfato, desde el ATP hasta aceptantes específicos de fosfato; para formar compuestos de ba.io contefl¡do de energía:
ATP + glicerina --gliceroguinasa--> ADP + l-glicero-3-fosfato
...AG"': -21,3kJ ATP + D-glucosa --hexoquinasa--->
t3.301
ADP + D - glucoso-G-fosfato ...4G"': - 16,7 kJ t3.311
La variación de la energÍa libre total de una reacción es la diferencia entre las energfas libres estandarizadas de hidrólisis de los reactivos y de los productos. Así, por ejemplo, en el caso de la reacción [3.28], los valores de AG"' para 1,3 difosfo glicerato y ATP, son respectivamente, - 49,4 y - 30,5 kJ/mol, (Tabla 3.1). Por consiguiente, el cambio de energía libre de esta reacción es: - 49,4 (- 30,51 = - 18,9 kJ.
y D-glucoso-6(Tabla fosfato, son respectivamente 30,5 y 13,8 kJ,(mol)-J, 3.1). Por consiEn el caso de la reacción t3.311, los valores de AG"' paraATP
guiente, el cambio de energía libre de esta reacción es: - 30,5 -(- 13,81
:
-16,7
KJ,
Generalmente el ADP es el producto de las reacciones gue utilizan ATP en la célula, y el ADP es el aceptante direqto del fosfato en las reacciones que ceden energía. Algunas reacciones utilizan ATP y dan lugar.a la formación de monofosfato de adenina ÁMn y pirofosfato lPPil, como en el casode la activación enzimática de un ácido graso para formar su éster con el coenzima/:
+ CoA-SH+ATP (::> ácido coenzima graso A
R.COOH
136
AMP+PPi +
R-CO-S-CoA
Acil-CoA del ácido
graso ---l
...t3.321
El pirofosfato inorgánico experimenta h¡dról¡sis, por acción de la pirofosfatasa,
y forma dos moléculas de ortofosfato inorgánico:
PPi
+ H2O ---> 2 Pi
En las reacciones de biosfntesis el .4 TP cede energía med¡ante la liberación de un grupo ortofosfato, Pi, o de un grupo pirofosfato, PPi, para convertirse en ADP o en AMP, respectivamente. El AMP se refosforila hasta ADP por acción de la enzima adenilato-quinasa, conocida también como mioquinasa:
AMP+ATP <::)
3.3.4
2ADP
...t3.34I
Energía libre estándar de hidrólisis del ATP
La hidrólisis enz¡mát¡ca del grupo fosfato terminal del ATP da lugar formación de ADP y su fosfato inorgánico P/: ATP + HOH.> ADP + Pi
...AG'' = - 30,5
kJ/mol
a la
t3.351
Análogamente, la hidrólisis del ADP da lugar a la formaci6n de AMP y su fosfato inorgánico Pi:
ADP + HOH.> AMP + Pi
...4G"'= -30,5 kJ/mol
t3.361
Donde el valor de la energía libre estándar de hidrótisis del ATP, o del ADP, LG' : - 30,5 kJ/mol, supone que el pH es 7 ,O; la temperatura 37 oC; que hay iones Mg2* en exceso, y que los reactivos y productos están presentes en concentración lM. EI valor estándar de AGo' = - 30,5 kJ, no es aplicable en las condiciones de la célula ¡ntacta, donde el pH y la concentración de Mg2* difieren
de las condiciones estándar. Además, las concentraciones de ATP, ADP y
'137
fosfato en la célula intacta no son 1 M. El valor de la energta libre de hidrólisis delATP en una célula intacta, en condiciones reales, es - 52,31 kJ, (Lehninger, 1973l., valor obtenido después de efectuar las correcciones para pH, y concentraciones de Mg2*, ATP, ADP y fosfato, en elfluido intracelular. La energía libre de hidrólisis del ATP no es constante sino que varía con la edad y el sitio dentro de la célula y con las concentraciones locales de Mg2* , ADp y fosfato,
3.3.5 Principio de! intermediario químico común
ATP actúa en la célula como un intermediario qufmico común al conectar las reacciones liberatorias de energla con las reacciones que la precisan. Este mécanismo se muestra en las dos ecuaciones siguientes, donde Xrepresenta un donante de grupos fosfato, I es un aceptante, Er y E, son las enzimas específicas que transfieren fosfato, y P representa el grupo fosfato: El
--) X + ATP
t3.371
ATP + Y --E, --> ADP + Y-P
t3.381
X-P + ADP -- E1
La ecuación t3.351 muestra que la hidrólisis del ATP libera una elevada cantidad de energfa libre y, al invertir la reacción y añadir fosfato al ADp, se almacena energía libre para ser util¡zada posteriormentg. El concepto de intermediario qufmico común se ilustra a continuación mediante
un ejemplo tomado de la ruta Etnbden-Meyerhof-Parnas (Figura 1.3). En este caso se utiliza la oxidación de un aldehído, en medio acuoso, hasta ácido carboxílico, reacción que produce un cambio de energía libre de 29,3 kJ/mol, energía qufmica que sería disipada en una solución aislada:
R-CHO
138
+
HOH
--> 2H + R-COO-+ H* ..AGo' = - 29,3 kJ/mol t3.39I
Esta reacción no ocurre en la célula viva, En la oxidación bioquímica, cuando el 3 fosfogliceraldehído se convierte en ácido carboxflico (3 fosfoglicerato), se recupera enzimáticamente ATP a parltir del ADP. Por consiguiente, la oxidación del aldehfdo hasta ácido carboxílico se realiza prácticamente sin cambio de energfa libre:
R-CHO
+
H{PO4)2-
+
ADP3'
---> 2H + RCOO +
ATP4-
AG'': 0
t3,4OI
La energía capturada por la célula se obtiene al restar la Ecuación 13.391 de la Ecuación t3.401: ADP3-
Ejemplo
3.1
+
H(PO4)2-+ H*
-->
+ HOH AG"': + 29,3 kJ/mol ..t3,41I
ATP4-
Eficiencia de la célula en el proceso de captura de energía en la reducción de pituvato hasta lactato
Los microorganismos obt¡enen energía mediante la degradación delácido láctico,
en el proceso anaerobio de reducción del piruvato hasta lactato, por acción de la enzima lactato deshidr"ogenasa:
2 Piruvato + 2 NADH
+2H'->
2Lactato + 2 NAD*
...13.421
Calcular la eficiencia de la célula en el proceso de captura de energía.
Solución:
- La ecuación global de la glucólisis por la ruta EMP es: Glucosa
+'2 NAD* + 2 ADP + 2 Pi ---> 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2'H2O + 2Ht
...t3.431
139
- La ecuación global hasta lactato es la suma de las dos ecuaciones anteriores:
Glucosa
+ 2ADP + 2Pi --> 2Acidoláctico + 2ATP + 2H,O AG"': - 135,6 kJ.(mol glu.)
1
...f3.441
- Esta ecuqción se descompone en dos procesos: a- degradación de la glucosa:
Glucosa
--> 2 Acido láctico AGo'= - 196,7 kJ.(mol glu.)1
...t3.45I
b- energía capturada por la célula:
2Pi + 2ADP-> 2ATP + ZHrO AG"': + 61,1 kJ'(mol glu.)-l ..'t3.461 Aparentemente la ef¡ciencia de la célula para capturar energla es: (61 ,11196,71x100 = 31 ,1 o/ó. La eficiencia real del proceso és, aproximadamente, 53 o/o. Este valor se obtiene mediante la corrección de los datos de energía libre para las concentraciones y pH predominantes en el sistema vivo. (Bailey y Ollis, 1986).
3.4
EVALUACION DE ENTALPIA Y CALOR DE COMBUSTION
3.4.1 Datos termod¡námico5 de algunos compuestos repf esentativos
La evaluación numérica del balance de energía de un proceso bioqufmico sólo es posible mediante datos de entalpfa y contenido de entalpía libre de los compuestos que participan en el metabolismo. En numerosas aplicaciones del
balance de energía se util¡zan valores de las cantidades termodinámicas en qondiciones estándar de temperatura y presión (generalmente 298,1 5 K y 140
101,325 kPa, respectivamente) con los reactivos en concentración 1 M' Estas
condiciones. no son apropiadas para describir la energfa de un sistema microbial, donde las concentraciones del ion H* y la del agua difieren ampliamente del
valor 1 M.
Tabla
3.3
Datos termodinámicos de algunos compuestos representativo§' (Roels, 1987). ago
Compuesto
ago
kJ/mol
Acido fórmico Acido acético Acido palmftsico Acido ]áctico Acido glucónico Acido oxáIico Acido succfnico acido máIico Acido cftrico Glucosa Metano Etano Pentano Metanol
cH2o2
28L
CxHaO2
8
94,
c]6H3202
9800
c3H603
L377 2667
c6Ha2o.7
327 1599
c2H2o4 c4H604
L444 2L47 2872
c4H6os c6H8o7 c6H12o6
8L8
CHn
1467 3385 693
CrH.
CrH., cH4o
EtanoI
c2H6o
13 19
GIiceroI
c3H803
l-643
Amonio
NHnt
Acido nitroso Acido nÍtrico Sulfuro de H Acido sulfuroso Acido sulfúrico
HNO,
Biomasa
cHl,
355
8L,4 7,3
HN03
323
H,S
-249 -507
H2S03 H2SO4 8oo . sNo
,2
54L
236 844 9583 L322
255 876 9989 1359
2593
238 1500 1345 1998 2843 813 14 5 8 3367 682 1308 1629 316 41
246 1493
7329 ]-963 2807 892 1-562
3533 728
1369 1663 383
,5
- 32,5 243 -329 -587 536
-
30
247
-329 -602 56 0
141
Los datos termodinámicos basados en cant¡dades molares parciales no son una propiedad de una sustancia dada. Estos datos están relacionados con las propiedades de una mezcla integral y con las concentraciones de los componentes presentes en el punto donde ocurren las reacciones químicas. Por consigu¡ente, en diversas aplicaciones, las condiciones estándar son modificadas de manera que la entalpía libre y la entalpía del agua son evaluadas como las correspondientes al agua líquida libre, y para la concentrac¡ón de ion hidrógeno se utiliza el valor correspondiente a pH 7,0. Estas consideraciones sólo afectan los cambios de entalpfa libre, ya que los cambios de entalpla son menos dependientes de la concentrac¡ón de los reactivos involucrados. En la Tabla 3.3 se presenta un resumen de datos termodinámicos de algunos compuestos representativos. En la Tabla: ago, es la entalpía libre de combustión referida a condiciones estandarizadas en el sentido estricto, kJ.{mol) 1; ago', es
la entalpía libre referida a las concentraciones modificadas de ion H* y agua; AHo, es el calor de combustión evaluado bajo condiciones estándar.
3.4.2
Calor de combustión
Diferentes autores (Erickson, 1980; Ho y payne,lg.7g), han observado que el calor de combustión de la biomasa microbial por electrón disponible, aHr,r, es prácticamente constante. Ho y Payne (1 979), informaron un valor promedio de - 26,8 (kcal)/(electrón equivalente), (- 112,2 kJ/electrón), dentro de un intervalo entre - 26 y - 31 kcal/electrón. En ausencia de datos experimentales, el calor de combustión de las cétulas y el
de otros compuestos orgánicos, se calcula como la energla obtenida por la transferencia de electrones, desde un compuesto con grado de reducción l-, hasta compuestos como el co, y el agua con grado de reducción cero. Roels (1987), presenta las siguientes ecuaciones para estimar datos termodinámicos con una razonable aproximación:
kl
^fl,=-(115)r mol C
142
kI AII"=-(115).lVEd ' 'molfucompucsto
^c:=La
Ecuació
(94,¿.f + 86,6) k/ t¡wl C e¡ cl comptusto
n ,r.OT expresa la proporcionalidad
13.471
t3.48I
directa entre el calor
de
combustión del compuesto (por mol de carbono) y sus respectivo grado de reducción, o sus respectivos electrones disponibles, Nro. La Ecuación t3.481 permite calcular la entalpfa libre de combustión (por mol de
C en el compuesto). Estas ecuaciones indican que las entalplas libres de combustión de los compuestos con menor grado de reducción, como la del ácido oxálico, exceden los respectivos calores de combustión, mientras que lo contrario ocurre con los compuestos con alto grado de reducción, como en el caso del metano. Este comportamiento se explica por la contribución de la entropía a la entalpía libre de combustión (Ecuación 3.211.
El calor de combustión de las células y de otros compuestos orgánicos se calcula a partir del oxígeno requerido para su combustión, según los conceptos mencionados anteriormente sobre energla disponible por electrón equivalente:
r, _
A rlzt6
A
4E
L,H^ 'v=
26,8 keal
112,2kJ
el¿ct¡ón
electrón
t3_49I
kJ .l_*"t gn* - 112,2 elcct¡ón mol O,
t3.50I
LHo =
- ffi,74
H mol O, consumido
Donde, AHo: es el calor de combustión evaluado sobre la base del oxígeno consumido.
[3.50], es un valor promedio, similar a los 443,7 valores teór¡cos informados: v 452,1 kJ.(mol Orl-'y cercano del valor determirrado experimentalmente: 5'19,1 kJ.(mol Or)'', (Nagai, 1 979). El valor de AHo dado por la Ecuación
143
L~s. Ecuaciones [3.491 y [3.501 expresan el calor producido en cualquier clase de cultivo, sumergido o. semisólido, cuando 'en el proceso únicamente se produce biomasa sin la formación de productos no celulares .
.
Servizi y Bogan ( 1961 ), observaron que la energía estándar libre de combustión, t.Gº, de numerosos compuestos tales como carbohidratos, intermediarios del ciclo del ácido tricarboxílico y algunos productos de la glucólisis, es:
AG"
= -
(485,6).M0
kJ
(3.51J
mol sustrato
()onde, M 0 : moles de oxígeno requeridos _para la oxidación completa de 1 mol de su~trato. La energía estándar libre de combustión de los compuestos aromáticos, alcohóles y ácidos alifáticos, es:
AG" = - (435,3).M0
kJ
(3.52]
mol sustrato
Según Hattori (1973), el valor de M 0 es:
Mo=~ 32
(3.53)
Donde, DQO: demanda química de oxígeno, gramos de oxígeno por mol de sustrato. La energía estándar libre promedio de sustratos combinados se calcula mediante la siguiente ecuación: [3.54) s se calcula a panir de reducción de la Donde: M;: moles del i-ésimo sustrato; t.Gº;: energía completa del sustrato i.
144
(A HJc =
3,5
CALOR DE REACCION
cultivo industrial es un ya que este calor y fermentador, un de operación diseño aspecto importante del para mantener la temperatura óptima de crecidebe removerse continuamente miento. Sin embargo, la determinación experimental del calor producido en una El conocimiento previo de la producción de calor en-un
fermentación sólo es posible a pequeña escala, debido prácticas del análisis calorimétrico'
a las dificultades
*'1'J ni"L-{"< (ti'""l r,:4l'irl,#7, 7a; 'o@fot
'¿'
producido'durante el )%?ra" La determinación indirecta del calor de reacción, aa¡lian+a .,^ l..atan¡a ¡la entalpía: anfrlnía' a) -^^l:-^ - -- -r-.-'---L^^ de un balance se realiza mediante crecimiento microbial, -:^-^L:^l
A
HR =
A I¡,.(-As)
- »AEP.AP -
AII,,AX
t3.s5I
Donde, AH^: calor de reacción qeatoñp¡edr*c(o.durantael-clecirnieotQ, kJ.l-1; y AH*: calor de combustión del sustrato, los productos y las células, aHs, ^Hp respect¡varnente, kJ/mol; As, Ap y Ax: concentración del sustrato, los productos y las células, respectivamente, mol/litro. La ecuación [ 3.55], escrita sobre ia base de 1 mol de C en el sustrato, se convierte en: (^
nJ.
=
(A
¡rJ. - (rpd". (a Ep), - (yxd". (L rr )"
13.561
Donde, (AH*)": calor producido durante el crecimiento microbial, o calor de reacción, evaluado sobre la base de 1 mol C en el sustrato, kJ.(mol C en el sustrato)-1. (Y*,.t": rendimiento de sustrato en células, mol C en cél.(mol C en el sustratol-1; (Yr,r)": rendimiento de sustrato en producto, mol C en producto.(mol C en el sustrato)'1; (AHs)", calor de combustión del sustrato, kJ'(mol C en el sustrato)'l; (AHr)": calor de combustiÓn del producto, kJ.(mol C en producto)-1, {valores de la Tabla 3.3 divididos por el número de átomos de C en el respectivo compuestoli AHxr = -26,8 (kcal)/electrón: -112,2 kJ/electrón; (AH*)": Calor de combustión de las células en kJ.(mol Cen cél)'1. El calor de combustión de las células se calcula a partir de la Ecuación [3.49] y el grado de reducción de Ia biomasa:
(^ H)" = -
112,2
#r-
elcctrón
mol C cél
t3.571
145
f t'
\
il' J
3.6
§
3.6.1
D¡SIPACION DE ENERGIA Y EFICIENCIA TERMODINAMICA
Disipación de energía
f( ,L,V
r\
(.
Los electrones no'conservados en la biomasa constituyen la fuente de energfa disipada en el proceso de crecim¡ento (Roels, 1987):
<
{ \ { \ *
T.tr, = (a c'')r¿.(0r.I,
-
0x.Ix
'Á*.) )'A-'
t3.581
Donde, nr: producción de entropla, kJ.K'1.s'1; (Ag"')ro: cambio de entalpía libre para la transferencia de un mól de electrones entre el sustrato y e¡ aceptante de
los electrones, kJ.(mol electrón)'1, (Tabla 3.4); T: temperatura absoluta, K. Roels (1987)¡-define la energfa,disipada en el proceso de crecimiento mediante la función de disipación D:
D=+=(Le")r¿.
t3.59I
Donde, D: función de disipación, kJ.(rnol C en cél)-1; tD*: velocidad de flujo de células, mol cé|, s-1; M,.: peso moíeiular de las células, (g cé|. secas).(mol C en cél)-r; Y*,..: factor de rendimiento de los electronps disponibles, g cé|.(mol electrOnl¿lrJfcuación 2.331; l-^: grado de reducción de la biomasa: electrones dispgnibles (mol C en células)'1.
3.6.2
Eficiencia termod¡nám¡ca
flujos de materia que abandonan un sistema no puede exceder la entalpía libre de los flujos combinados de materia que entran al sistema. La energla y una función de estado derivada, tal como la entalpfa libre, no tienen un valor único y sólo pueden determinarse con respecto a un nivel de referencia. El contenido de entalpía libre de los
146
Una base realista para el nivel de referencia de los microorganismos, es la energfa contenida en una mezcla deCO", HzO, N2 y Oz, ya que en ausencia de otras formas de energía,- diferentes de la energla qulmica, los organismos no pueden obtener energla útil de tal mezcla para su metabol¡smo. La entalpla libre o contenido de entalpfa de un compuesto qufmico con respecto a este nivel de referencia es, por tanto, igual a la entalpía libre o entalpla (calorl de combustíón hasta COr, HrO, y Nr. Una vez definido el sistema de referencia, la eficiencia termodinámica se define como la relación entre la entalpía libre de fós flujos de materia que salen del sistema y la correspondiente entalpía libre de los flujos combinados de materia que entran al sistema. Roels (1987), define la eficiencia termodinámica, con respecto a la producción
de biomasa, como:
rlr
(Le') =
(ag")",
cx
t3.601
+D
Donde, (Ag"').*: entalpía libre de combustión por mol de C en la biomasa, kJ.(mol C en cél)-1, (Ecuación 3.48); D: función de'disipación, kJ.(mol C en célulasl-1, (Ecuación 3.59). En la Tabla 3.4 se observa, en el caso de crecimiento aerobio, que el cambio de entalpla libre por la transferencÍa de un mol de electrones, Ago'¡¿, es prácticamente igual al cambio de entalpfa (calor de combustiónl, (Ah"').¿. La producción de calor es casi iguaf a la disipación de energía libre y un tratamiento en funcién
de calores de combustión es suficientemente exacto, En el
crecimiento anaerobio, los valores de (Ag"'le¿ son mayores que los de (Ah"')e¿, (Tabla 3.4). Si además se considera que la disipación total es similar, tanto en los procesos aerobios como en los anaerobios, entonces la producción de calor por unidad de
biomasa producida es menor en los procesos anaerob¡os. En la Tabla 3.4 también se observa que el crecimiento aerobio sobre sustratos altamente reducidos tales como metano, metanol y etanol, se desarrolla con mayor producción de calor y por consiguiente con menor eficiencia termodinámica,
147
Tabla,3.4 Disipación de calor y de entalpía libre, y rendimiento en biomasa de los electrones disponibles, para diversas combinaciones entre el sustrato y el aceptante de los electrones. (Ah")rr: disipación de calor bajo condiciones normalizadas de temperatura y presión con los reactivos en concentración 1 M; Yr,ro: rendimiento de los electrones en biomasa, g células. (electrón dísponiblel-1;
(Ag.'lro: cambio de entalpla libre baio condlciones modificadas (la entalpía del agua se toma como la del agua líquida libre y la concentración de H* es la corres-pondiente a pH 7; (Roels, 1987).
Sustrato
Aeeptante de Ios electroneg
o2
111,5 LzL ,3 ]-t4 ,1
u2
L18,I
Metano
o2
Metanol EtanoI
o2
icerol Acido Iáctico Gl
Glucosa
ecldo succfnico Acido cítrico Acido má1ico Acido fórmico Acido succÍnico lcido succfnico Acido succfnico
Affru kül (nol
o2 w2
o2 o2
o, ñ v2
(NO3)- --> (NO2)- -->
N2
114,1 1t6 ,7 L06 ,6 109,1 110,8 127,5 100,6
N2
A9"'¡.i
Y4¡a
electr6n) 9/e 101, 6 1]-3,7 109, 0 l]-6 ,4 110, 1 118,5 ]-07,L 111, 0
LL2,t 118,0 100,6 727,0 107,1
1
,56
2,27 , 2 ,l'7 3,55 ,26 ,84 2 ,90 3,09 , 3, 18 3 3
3,t7 2,28 2 ,77-
Glucosa, Glucosa Glucoga
CO, (etanol) * CO, (ácido láctico) CO, (propiónico/
2,9 2,9 7,6
t2,9
2,76 3,26 0,88 0,81 7,48
Glucosa
ácido acético) Co, (metano/ ácido acético)
6r7
i4 ,4
1, 63
-2 ,0
3,9
0,36 0, 91 0 ,27 0 ,4L
Gfuconato
Acido acético Metanol
Acido fórmico Acido propiónico
o2
106,6
7L7
o2
CO, (metano) CO, (metano) @, (métano) CO, (metano)
9r
8
l-5,0 -2 ,3
|I
9,5 8r3
t2;0 : 16,4 4,0
- Los productos del metabolismo anaerobio figuran entre paréntes¡s
148
3.7 EFICIENCIA ENERGET]CA DEL CRECIMIENTO MICROBIAL
La generación de calor por la actividad catabólica se define como:
LHar, = A¡Ir.(-As)
- E t'ttr't'P t3.611
AHor=Atrf¡+AHr'LX Donde, aH"or: calor generado por catabolismo, kJ/litro; aH^: calor de reacción, kJ.litro-l; aHx , aHs, AHr: calor de combustión de las células, sustrato y producto, respect¡vamente, kJ.(mol)-1; Ax, As, Ap: concentración de células, sustrato y producto, respectivamente, mol/litro. La ecuación t3,61lexpresada sobre la base de 1 mol Cse convierte en:
(LHc^)" = (AEJc
- E(yow)c.(A,rrr)c
13.621
La eficiencia energética del crecimiento microbial es la relación entre la energía
de enlace qufmico incorporada en las células y la energía de enlace químico disponible de los procesos catabólicos, (Lynd, 1989):
rlx
gs)"-(LH)c =
13.631
(r*d".(ÁHr)c + (AflJs El calor de reacción por mol de C en el susirato consumido depende de la eficiencia energét¡ca del crecimiento microbial y de la energía potencialmente disponible para crecimiento, (AH.or)":
(LH),
= (1
- ¡r)-(Aflc.J.
t3.64I
149
Ejemplo
3.2 Determinación del'calor de combustión de las células y del calor generado por mol de O, consumido
Las siguientes ecuaciones estequiométricas del crecimiento de Saccharomyces cerevisíae (Battley, 1960) sirven como ejemplo para 'analizar la producción de calor durante el crecimiento;
- Crecimiento anaerobio con glucosa como sustrato: C6H'2O6
+ O,12 NH3 : 0,59 CH1,7sOqorNo,, + 1.3 C2H6O
glucosa
células
etanol
r 0,43 CaH8O3 + 1,54 CO, + 96,3 kJ glicerol - Crecimiento aerobio con glucosa como sustrato: C6H,2O6
+ 3,84 O, +
O,29 NH3
=
1,95
..,t3.OSl
"
CHr,72Oo,ooNo,,r
células
+ 4,09 CO, + 4,72H2O + 2005,1 kJ ...t3.66I - Crecimiento aerobio con etanol como sustrato: C2H6O
+ 1,82 O, + O, 15 NH3 =
1,O3
CHr,72Oo,44No,r5
+ 0,97 CO, + 2,31 l-l20 + 853,9
kJ
...t3.67I
Calcular el calor de combustión de las células y el calor generado por mol de oxígeno corlsumido, en el crecimiento-de Saccharomyces cerevisr,ae, (Ecuaciones 3.65,.3.66 y 3.621. Solución: El calor de combustión de las células, según la Ecuación t3.551, es:
LHx
150
=
Aflr.(-As) - E ÁH".Ap - AH, A¡
El calor generado por mol de oxígeno consumido AHo es: a
¡no =
afl^
¡i
Donde, AH^: producción de calor durante el crecimiento; AO: moles de oxígeno consumido. En la Tabla 3.5 se presenta un resumen delprocedimiento seguido y los resultados obtenidos para As : (1 mol de sustrato).(litrol-l.
Ejemplo
3.3 Determinación
de los calores de combustión de la biomasa y otros compuestos ofgán¡cos
Calcular el cator dé combustión de la biomasa y el de los compuestos orgánicos que intervienen en las Ecuaciones de crecimiento [3.65], [3.66] y [3.67], y confrontar los resultados obtenidos, con los anotados en la Tabla 3'5.
Sotución: A continuación se presenta la muestra de cálculos para la biomasa en la Ecuación t3,671. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 3.6.
- Número de electrones disponibles, Nro, (Ecuación 2.14}.: Ne¿
: 4 + 1,72 - l0,44ll2l
- (0,15)(3)
:
4,39
- Oxígeno requerido para la combustión de 1 mol de células hasta CO, y agua: CH1,72Oo,44No,.,u
*
1,1 Oz
= CO, + 0,15 NH3 + 0,635
H2O
- Calor de combustión de la biomasa, AH^, (Ecuación 3.471:
aHx
:
aH"
:
- (115)(4,39)
:
- 504,85 kJ/mol
- Calor de combustión de la biomasa, AH*, (Ecuación 3'50):
AHx: AHo:
-1448,74l'1',1,1)
= -493,6kJ/mol 151
: ,
Tabla 3.5 Determinación del calor de combustión de las células, AHr, y del calor
generado por mol de oxígeno consumido, en las ecuaciones de crecimiento Saccharomyces cerevisrae, [3.65], t3.661 y t3.671.
aH"
o1, Ecuacl.ón
kil,/mol
kü/1ttro .
6s]
96
,3
fa.bIa
aH,
aP
fu/mol
mo1,/1itro rnol/liEro
1359 J.663
1,3
3 .3
2807
0,59
.
[3
.56]
2005,1
2807
1, e5
13.67)
8s3,s
L369
1,03
PeEo
k,r/mol [3
.
6s]
36s
41:-;Z
[3.56] f.3
,9
.57)
s00
,
1
AH,
cé1u1ae
g/mo1 23
,7s
22,86 22
,86
kú
l1t
0,43
-\
AO
AHo
mol/litro
kü/¡ro1
15,41
L7,.99 I s,84
s22,2
21,,88
469 ,2
1.82
3.6
Determinación del calor de combust¡ón de las células compuestos orgánicos por d¡ferentes métodos, Ejemplo 3.3:
Tabla
Cou¡lueeto
N"o O, para Eeu. conbuetl6n: 12..L41
moleg : c.H,,o" 24 Etanol: C,H.O t2 Glicerol: C=H'O. 14 Gl-ucosa
Biomasa
152
3 3,5
y
otros
Calor de cobuEtión kü/nol
Ecu. t3 .471 27 50 .?807 1369 1380 7663 1610 Tabla 3
.3
Ecu. t3 .50I 2692
,4
L346,2
7570,6
.
cH1,r2oo,44No,1s
4'39
---
arr
[3
Eeuaclón At!
de
1'1
550
504'8
493'6
De acuerdo con Baileyry Ollis (1986), el peso de las células secas, evaluado experímentalmente, incluye aproximadamente un 10% de cenizas. Por tanto:
AHx
:
- (493,6)(0,9) = - 444,24 kJ/mol
AHx
:
l- 444,24 kJlmollll22,86 g.cé|./mol)
:
- 19,43 kJ/g
Según Kargi y Moo-Young (1985), los valores tlp¡cos de AH^ se encuentran entre 20 y 25 kJ/(g.células).
3.4
Eiemplo
Determinación de Ia producción de calor bajo repies¡ón por glucosa
El efecto de la represión por glucosa queda demostrado en el crecimiento aerobio de S. cerevisiae, en medios con altas concentraciones de azúcar, donde se forman productos no celulares aún en condiciones de plena aeración. En este
caso el sustrato es metabolizado por dos caminos separados: uno es la ruta gluculítica, donde se forman productos no celulares, tales como etanol, glicerol y COz, el otro es la ruta oxidativa donde el agua y el CO, son los productos finales. Evaluar la producción de calor bajo represión por glucosa en el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, Ecuaciones [3.65] v t3.661. Solución: - El coeficiente estequiométrico y la fórmula de los microorganismos se ajustan a 0,61 CHr,72Oo.44No,1s, ofl la Ecuación [3.65], con el propósito de simplificar cálculos.
- La ecuación de crecimiento de S.cerevisiae, bajo represión por glucosa, es promedio aritmét¡co de las ecuaciones t3.651 y t3,661: C6H12O6
+
0,65
1,92 O, + 0,21
C2H6O
+ 0,215
NH. : 1,28 CH',rrOo,noNo,,u
C3HBO3
+ 2,82 CO, + 2,36
el
+
H2O
+
105O,7 kJ
't53
:l
- El calor generado en 9l proceso de crecimiento de S- cerevisiae, bajo represión por glucosa, puede calcularse como el promedio ar¡tmético de los calores de
reacción correspondientes a las Ecuaciones t3.651 y t3.661, (1050,7 kJ), o calcularse mediante la Ecuación t3.5SI: AHB
:
AH.
-
(AH.l.(-As) -
t
AHp.Ap - AHx.Ax
2807 - (0,65)(1369) - (0,215)(1663) glicerol
sustrato etanol - 1.28(365,9 +
41
1,2112
:
.-
AHR
:
1O62,26kJ
cé[ulas
Los calores de combustión del sustrato y demás compuestos orgánicos fueron tomados de la Tabla 3.3, El calor de combustión de las células es el promedio arimét¡co de los valores calculados para las Ecuaciones t3.6Sl y t3.661, tal como se muestra en la Tabla 3.5. El valor calculado 11062,26 kJ), coincide con el valor promedio (1OEO,7 kJ), obtenido de las Ecuaciones t3.651 y t3.661. por consiguiente la Ecuación t3.S5l
es apropiada para evaluar la producción de calor bajo represión por glucosa.
3.8
FACTORES DE RENDIMIENTO DE ENERGIA EN BIOMASA
Los balances de entalpla expresados en las ecuaciones t3.ssl
y t3.61I const¡tuyen la pase de los factores de rendimiento de energía en biomasa: LHR=
^flr.(-As)
-XL,Hr.h,p - AH,.Lx
LH"^, = Alls.(-As)
-t
[Ecu.3.55]
AHr.Áp t3.61I
Atn=AIl¡+LHx.Lx
154
Donde, AH^: calor de reacción o calor producido durantb el crecimiento, kJ.(litro) 1; AHs, AHp y AH*: calor de combustión del sustrato, los productos y las células, respectivamente, kJ/mol; As, Ap y Ax: concentración del sustrato, los productos y las células, respectivamente, mol/litro; AH.or: calor generado por catabolismo, kJ.(litro)-1.
3.8.1
Factores de rendimiento basados en e¡ calor producido durante el crecimiento m¡crobial
El factor de rendimiento basado en el calor de'reacción, o calor producido durante el crecimiento microbial, se define como: (Ynol^ =
*k t3.681
(Ynrl*
=
Lx
A¡rr.(-As) - E
tH,tp -
LH*.Ax
Donde, (Y*,rr)^: rendimiento basado en el calor de reacción, (g células secas)/kJ. En el caso de crecimiento aerobio sin formación de produetos no celulares, Ap 0, y la ecuación anterior se convierte en:
:
(Ysol*=ffi
t3.691
Esta ecuación también'se expresa como:
t3.70t
Donde, Yro: rendimiento del sustrato en célutas, (g células)'(mol sustrato)-1; AHr: calor de combustión del sustrato, kJ/(mol sustrato): AH,,: calor de combustión de las células, kJ.(g cél)-r, (Tabla 3.3).
155
Generalmente los hidrocarburos producen más calor que las especies parcialmente oxigenadas-. ,fsl, Oor ejemplo: (Yvrrl",rr^¡,o¡ ) (Y¡¡¡¡)ys1¡¡6 Por consiguiente, los reactores que contienen sustratos con mayor grado de reducción requieren mayores remociones de calor, aspecto muy importante en el estudio de factibilidad económica de un proceso (Bailey y Ollis, 1986). El calor de reacción,
o calor producido durante el crecimiento microbial, en
el
crecimiento aerobio sin formacíón de productos no celulares, puede calcularse, aproximádamente, a partir del oxígeno consumido (Ecuación 3.50):
.^HR = LHo.LOz
=
t3.71I
*ol o' kI - ffi.74 ' mol 02. Lo^' Iitro
3.8.2
Factores de rendimiento basados en la energía total disponible en el med¡o
El factor de rendimiento basado en la energía total disponible en el medio se
define como: (Y¿o),
Lx LHr,+ AHx.Lx
13.721
Donde, (Yr,*r)r: rendimiento basado en la energla total d¡sponible en el medio, (g células secas)/kJ. El primer término del denominador de esta ecuación expresa la energía liberada por catabolismo y el segundo la energía incorporada biosintéticamente en el material celular. Si la expresión para AH"o, (Ecuación 3.61) se remplaza en la ecuación anterior se obtiene:
"(Ytr),
156
=
A¡ LH*.Ax + AIls.(-As)
-»
LHp.LP
Yilt
t3.73I
L,II..Y4s a AtrI5 -» AHP.Y4I
Donde, Ax, As, Ap; concentración de células, sustrato y producto, respectivamente, g.litro-l; AHx, AHs, AHr: calor de combustión de las células, sustrato y producto, respect¡vamente, kJ.g-t; Yro, Yr,.: rendimiento de sustrato en cétulas y de sustrato en producto, respectivamente, g.(g sustratol'1, En un medio complejo prácticamente toda la fuente de carbono es util¡zada en la producción de energfa y una porción muy pequeña de la fuente de carbono es asimilada en células (Bauchop y Elsden, 1960). En un medio mfnimo una porción de la fuente de carbono es metabolizada por las vías b¡os¡ntéticas y el resto por las vfas catabólicas. La fracción del sustrato convertido en células es:
(As)ce¿ =
2 c1
f3.74t
^,
Donde, As"rrl sustrato convert¡do en células, (mol sustrato).(l¡tro)-1; Ax: concentración de células, (mol células). (litrol-1; o2i (g C en células). (mol células)-1 ; a1: (g Cen sustrato).(mo! sustrato)-t. La fracción del sustrato convertida en energfa, es:
(As)." = ' 'q
6t
r _ uz.Ax) c1.AsJ t
t3.751
¡1
El calor generado por las reacciones de catabolismo en un medio mínimo, (AH6¡1).., (Ecuación 3.61), se define como:
(LHc^)^= aas.as.(, -
Z "r,)
E,
ta,.tp
t3.761
157
Y el factor de rendimiento basado en la energía total disponible en el medio mfnimo es:
(Yxu),
A¡ AHur + L,H*.Ax
=
13.77t
yrt, AHx.Yx^ a
AII¡
I
l,\ar- I "o,) » !np.yils
3.8.3 Factores
de rendimiento basados en la energía liberada por catabolismo
Elfactor de rendimiento basado en la energía liberada por catabolismo se define como:
( Yrw )o,
=
Ax
AHr.(-As)-Etnr.tp
A.r
LII^ + AH*.Ax t3.781
Ynt
Afl, - E AHr.Y$ Donde, aH^: calor de reacción o calor producido durante el crecimiento, kJ.(l¡tro).1; AHs, AHp y AFlr: calor de combustión del sustrato, los productos y las células, respectivamente, kJ/mol; As, 4p y Ax; concentraeión del sustrato, los productos y las células, respectivamente, rnol/l; Y¡¡s, YpTs: rendimiento de sustrató en células y de sustrato en'producto, respectivamente, g. (g sustrato)-1 . El factor de rendimiento basado en la energía liberada por catabolismo, en el crecimiento aerobio sin formación de productos no celulares, se puede calcular a part¡rde la siguiente ecuación obtenida alreemplazar Ia Ecuación t3.71len la Ecuación t3.781:
158
(Ysr)"
,
=
LH^ A,H- + ------" ^ yrto
Donde, AHo: - 448,74 kJ.(mol O, consumidol en células, (g cél).(mol Or)1.
Ejemplo
3.5 Evaluación
'
t3.791
; Y*,o: rendimiento de oxígeno
de rend¡m¡entos basados en energía
Calcular los factores de rendimiento basados en energfa para el crecimiento aerobio de Saccharomyces cerevisiae en etanol. Suponer que la ecuación de crecimiento aplicable a este problema (Battley, 1960) es: C2H6O
+
1,82 O, + 0,15 NH3 : 1,03
CH1,72Oo,44No,ts
+ 0,97 CO, + 2,31
H2O
+
853,9. kJ
- Datos: - calor de combustión del sustrato:
aHs':
- Calor de combustión de las células: AH*
1-369 kJ/mol'
-
500,1 kJ/mol,
(Tabla 3.3) (Tabla 3.5)
- Producción de caibr durante el crecimiénto microbial calor de reacción: AHR
:
853,9 kJ/litro.
- Concentración del sustrato: As
=
1 mol/litro.
- Peso molecular de las células: 22,86 (g cél)/mol. - Concentración de células: Ax
Ax
:
=
1,03 mol/litro.
(1,03 mol/litrcl122,86 g/mol) : 23,54 g células/litro 159
-
Concentración de los productos: en este caso no se forman productos no
- Rendimiento del sustrato en células: Yxrs
=
1,03 mol cél/mol sustrato
- Rendimiento de oxlgeno en células: Yxro
:
(1,03/1
,821:0,567
mol céllmol O,
Solución:
-Rendimientobasadoenelcalorqueacompañaelcrecimientomicrobial,(calor de reacción), (Ecuación 3.68): (1,03 nnl
(Ynul^
cé04fi3
=O'O27699f ';
Este factor también se puede calcular a partir de la Ecuación [3.70]:
(Yno)*=
ffi.ou,
cél = O.O27S s = 1369(1,Gt).(22,86) (1,03).(500,1) H -
- Rendimiento basado en la energÍa total disponible en el medio. De acuerdo con la ecuación de crecimiento no se.forman productos no celulares,
(Ap = g¡. Por consigu¡ente, (Ecuación t3.731:
Yr{t tY \ -Vxlktlt LHx.Ygs * aIIs
_
160
(1,03).(22,86) (500,1).(1.03) +
= o.O12S
1369
s
cél
H
- Factor de rendimiento basado en la energfa liberada por catabol¡smo: forman productos no celulares' De acuerdo con la ecuación de crecimiento no se
(Ap = 0), Por consiguiente, (Ecuación [3'78]:
!r,t-Y"
Vr¿¡)am
-
LH"
(1,09).(22,86)
1369
-E
Aflr.yw
= O.OflZ
I
,c!l
kt
t3'791: Este factor también se puede calcular a part¡r de la Ecuación
(Y*,)o,
=
W,74 kJlmol 02 0,566 mol céltmol O"
(Yw\o,
= 7.73.10-a
(Yru\o, = O,O1T1
g.8.4
»,86
#
4
#
Factores de rendimiento basados en ¡a generac¡ón de ATP
y 12'6 (g células Bauchop y Elsden (1960), obtuvieron valores entre 8'3 generación de ATP en el secasl/(mol ATP), para los rendimientos basados en la donde prácticacrecimiento aerobio de microorganismos en medios complejos, producción de energfa' El mente toda la fuente de carbono es utilizada en la sustrato número de moles de ATP sintetizados por mol de carbono en el partir del conocimiento a calculable catabolizado, o ganancia de ATP, G¡1p, eS en un orden de la ruta catabólica. Los valores de GATP varían aproximadamente cada micro' de magnitud, segrfn el sustrato y el metabolismo de energfa de organismo. 161
3.8.5 Factor
de rendimiento de ATP en biomasa en el crecimiento asociado a la energía
Un término útil en la evaluación del rendimiento de sustrato en biomasa, Yr., es la relación'entre el carbono celular sintetizado y el AIP disponible de los procesos catabólicosi Y^r¡rr. Para numerosos procesos microbiales, se ha encontrado que la relación Y^,o-,
es constante, con algunas excepciones (Stouthamer, 1973), e igual a 10,5 (g células)/(mol ATPI, con una desviación estándar de + 0,3 g/mol. Además, si se ut¡l¡za un contenido representativo de carbono en la célula de 46,2 o/o, porcentaje en peso seco, con una desviación estándar de2,3 %o, se obt¡ene:
yxun =
to,s
ffi
.
@,4,2)
mol C
s
cét{.
12gc t3.801
=
3.8.6
El
mol C O.44 '
cél'
mol ATP
Rendimiento de ATP en biomasa en el crec¡m¡ento no asoc¡ado a la energía
factor limitativo de algunos procesos es la velocidad de formación de uno o
más compuestos esenciales para la bioslntesis celular, en lugar de la velocidad
de formación de ATP. El exceso de energla es desechado como calor y el crecimiento no está asociado a la energía. Es el caso del metabolismo anaerobio de carbohidratos, donde con frecuencia los microorganismos siguen utilizando los carbohidratos, aún despues de cesar su crecimiento. En la producción de sake a partir de aftoz,la producción de alcohol y ql consumo de sustrato prosiguen después de detenerse el crecimiento de S. cerevisiae y el' exceso de ATP es desechado como calor. En este caso el caldo se refrigera para favorecer la productividad de alcohol (Nagai, 1979).
162
3.8.7 Goeficiente de rendimiento verdadero
Las células consumen sustrato para asimilarlo en masa celular, proveer energla para la sfntesis celular y proveer energía para mantenimiento. El término mante-
nimiento expresa la energla requerida por la célula para satisfacer act¡vidades tales como transporte act¡vo de iones y otras especies a través de las membranas celulares, reemplazar los const¡tuyentes celulares degradables Y preservar el estado celular.
As =
As¡¡ua¿rcroN
+ ASro"*
* ASrum*',,,noo
t3'811
Donde, As: concentración del sustrato, g.litro-1 , Esta ecuación es válida para organismos quimiotrofos, que utilizan el mismo sustrato como fuente de carbono y de energía. Si la ecuación anterior se divide por la concentración de biomasa, Ax, en (g células secas)/litro, por ejemplo, se obtiene:
1_1*A"*4" (Yn), (r*rr), a*,
Ax*
Í3.821
Donde los subíndices: V, A, C, M, indican respectivamente, verdadero, asimilación, crecimiento y manten¡miento. En esta ecuación el término (Y"¡s)¡, es una cant¡dad relativamente constante, estequ¡ométricamente def inida, mientras (Yx/s),, el coeficiente de rendimiento vefdadero, no lo es. La distribuc¡ón de! sustrato en los tres componentes indicadoS en la Ecuación t3'811 es variable. Una población en rápido crecimiento consume más sustrato para asimilaCión y crecimiento, en tanto que una población en reposo con§ume una mayor proporción de sustrato para mantenimiento'
3.8.8
Rendimiento máximo de ATP en células
El factor de rendimiento de sustrato en ATP, Yorr,", se evalúa a partir de información sobre las rutas bioquímicas establec¡das" o se calcula a partir de datos experimentales sobre la fuente de energfa utilizada, o sobre los productos 163
finales formados. El rendimiento máximo de ATP en células, {Y*ro.r}ro, evalúa mediante la ecuación, (Nagai, 1979):
Qlw -
frATP +
t3.83I
Donde, (Y^,^rr)r^r: rendimiento máximo de ATP en células, (g cél)/(mol ATH; Oorr: velocidad específica de formación de ATP, mol ATPllg cél.hl; rr.t.qrp: coe'ficiente de mantenimiento basado en la geneiación de ATP, mol ATp lg' cél.h)-1; p: velocidad específica de crecimiento de biomasa, h-1.
3.9
BALANCE DE ENERGIA
Las células consumen los sustratos que proveen la energía y las materias primas requeridas para la síntesis de nueva masa adicional. La energía libre de las sustancias nutritivas utilizadas es mayor que la de las células y productos del meta-
bolismo, Las células utilizan eficientemente la energfa química, pero, como en todos los procesos reales, parte de la energla disponible en el sustrato es liberada como calor. El balance de energía de un proceso es uno de los aspectos importantes de la lngeniería Bioquímica por la necesidad de mantener una temperatura óptima para
crecimiento o para formación de productos. Las dificultades prácticas del análisis cálorimétrico, especialmente en cultivos aerobios, limitan la determináción experimental del calor generado a los procesos a escala de laboratorio y de planta piloto.
3.9.1 Balance general de energía
una forma de la ecuación general de balance de energía aplicada a un caldo de fermentación; es: 164
Qutt * Qrc = Qrc + 4wt + Qrut + Lsnt
t3.841
- e¡¡rriveloc¡dad de generación de calor por la act¡vidad metabólica, kW
(:
kJ.s-
'). El término qr* describe el calor asociado con el crecimiento y mantenimiento de los microorganismos y también con la formación de productos. - qoo: velocidad de generación de calor por agitación mecánica y por aspersión de gáses.
- qo": velocidad de acumulación de calor. En condiciones estables. Q¡c : 0. En condiciones inestables, la qiguiente ecuación general describe la velocidad de acumulación de calor en un reactor:
qrc=E
!!P
t3.85r
Donde, l/: volumen ocupado por el caldo, litros; c,: concentración de componente ¿ kg.litro-1; H,: entalpfa del componente i, kJ.(k0)'1; t: tiempo, s.
En el caso de un reactor por lotes, bien agitado, la ecuación anter¡or se convierte en:
e^, =
Mr(C)".#
t3.86I
Donde, M,: masa total del caldo de fermentación, kg; 7: temperatura, oC; (Cr)-; capacidad calorífica media del caldo, kJ.(kg.oC)-1. En el caso de un reactor continuo de mezcla completa
(CSIA
ta gcuac¡On t3.85I
se convierte en:
Q,tc=Fu.G)^.Fq-T4)
t3.871
Donde, Fr: velocidad de flujo de masa del caldo, kg.s-t; To,, Trr: Temperatura media, del afluente al reactor y del efluente, respectivamente, oC.
165
- qrNr: velocidad de transferencia de calor entre el reactor y los alrededores o entre el reactor y el intercambiador externo. En condiciones establesi gr¡¡r : Qrver
*
Q¡c.
- erv¡pi velocidad de pérdida de calor por evaporación. El térm¡no qruo, incluye las pérdidas de calor producidas por la evaporación del agua en el aire dispersado en,las fermentaciones aerobias. Estas pérdidas son apreciables, especialmente cuando el aire dispersado se seca durante la compresión. Este efecto se evalúa a partir del balance de entalpla del aire que pasa.por el fermentador. Las pérdidas por evaporación se pueden eliminar, en el caso de cultivos aerobios, mediante la utilización de aire saturado a la temperatura del caldo de fermentación.
-
Qseri úelocidad de cambio de la entalpía sensible de las corrientes líquidas y gaseosas que entran o salen del bioreactor a temperaturas diferentes de la de
fermentación. El término q"., incluye los efectos sobre el calor sensible del equipo producidos por los cambios de temperatura.
3.9.2
Galor generado por la actividad metaból¡ca
El calor generado por la actividad metabólica,
qrrr, se evalua part¡r de la Ecua-
cién t3.841, después de calcular la magnitud de los términos restantes. Otro procedimiento consiste en evaluar qr* mediante datos de entalpía y contenido de entalpla fibre de los compuestos presentes en el metabolismo:
eam =
»
(FMi.H)s
- D (FMi.H)p
t3.871
Donde, Fr,: velocidad de flujo de masa de componente 4 kg/s; H,: entalpía del i-ésimo componente, kJ.(kg)-l; Los subfndices s y p se refieren al sustrato y a los productos, respectivamente. Los productos pueden ser celulares (biomasa) y no celulares. La Ecuación [3.87], expresada en términos del calor de reacción, se convierte en:
166
husr =
V'AH*'r,
t3'88I
Donde, V: volumen del caldo de fermentación, litros; AH^: calor de reacción (Ecuación 3.64), kJ/(mol C en el sustrato); r": velocidaQ de consumo de sustrato, (mol C en el sustrato).litro-1.s-1.
3.9.3 Calor generado por e! metabolismo aerob¡o
1
La velocidad de producción de calor por el metabolisme aerobio ha sido relacionada con la velocidad de consumo de oxlgeno por Cooney et a|.,{.1968!., para elcrecimiento de numerosos microorganismos con diferentes sustratos, en cualquier clase de cultivo, sumergido o semisólido, cuando en el proceso sólo se produce biomasa sin la formación de productos no celulares (Ecuación 3.50): ea¿r = (ffi,74).Qo2
t3.89I
Donde, e(O)r: velocidad de consumo de oxígeno, (moles de O, consumido)/s; qr.r: calor generado por el metabolismo aerobio, kJ.s-1 .
3.9.4 Calor generado por metabolismo
aerob¡o en un reactor por
lotes
La velocidad instantánea de generación de calor por metabolismo aerobio en un reactor por lotes (Bailey y Ollis, 1986), es:
,wr
=
Y.lt.r.á
t3.90t
167
:2 '
Donde, (Yr,*r)*: rendimiento en células del calor producido durante el crecimiento .t aerobio (Ecuación t3.70l), g céll(kJ); qrur: velocidad instantánea de generación de caor en el metabolismo aerobio, kJ.sl; V: volumen del caldo de fermentación, litros; ¡r*: velocidad específica de crecimiento, s-l; x; concentración de biomasa, (g cé|. secasl/litro.
3.9-5 Calor generado por metabolismo,
-
-
aerob¡o en un reactor
cont¡nuo -a
La velocidad instantánea de generación de cálorpor metabolismo aerobio en un reactor continuo agitado (C.SfPl en condicíones de flu;jo estable, (Bailey y Ollis, 1
986) es: (Ydu)R.(cMÉr)
= V.tr*, t3.91I
= (",
- ").r.(Y¡,) -
xrk¡.V
Donde, (Y¡7rr)^: rendimiento en células del calor. próducido durante el crecimiento aerobio (Ecuación 3.70), (g células).(kJ)-1; qr.r: velocidad instantánea de genera-
ción de calor en el metabolismo aerobio. kJ.s-1; V: volumen del caldo de fermentación, litros; p^: velocidad específica de crecimiento, s-l ; x: concentración de biomasa, fg células secas)/litro; so, s: conóentración del sustrato en el afluente y en el reaCtor, respectivamente, (g sustrato).litro-1; Y*,.: rendimiento del sustrato en células, (g células).(g sustrato)-1; F: caudal afluente al reactor, litro/s; k.: velocidad específica de metabolismo endógeno, s-'. Otra forma de la ecuación anterior es:
ryY Donde,
168
= F,
- s)'D'(rrJ (Yao)*
D -- F/V : velocidad de dilución, s-l.
¡'ft,
r3.e21
t
-,
-
3.9.6 Evaluación experimental delcalor generado por metabolismo
El calor generado por metabolismo o calor de reacción puede calcularse a partir
de una serie de mediciones de la temperatura media del caldo dé fermentación en un reactor operado en condiciones inestables. En la Figura 3.3 se muestra esquemáticamente un montaje experimental para la evaluación del calor generado por metabolismo, qrrr. El reactor es un tanque provisto de agitador y sensor de temperatura. Las pérdidas de calor por radiación y evaporación son despreciables. El intercambiador de calor puede ser un serpentfn colocado dentro del tanque, o una camisa alrededor del tanque, o un ¡ntercambiador de doble tubo, o de coraza y tubos instalado fuera del tanque. En la Figura 3.4 se muestra esquemáticamente la variación de la temperatura del
reactor
y su contenido durante la fermentación. El sistema de reactor e
intercambiador funciona inicialmente en condiciones estables, fiT/dil = 0, en el perlodo comprendido entre los tiempos t = A y t : B. El intercambiador remueve el calor generado en el reactor, La ecuación de balance de energía, aplicable en esta etapa del ensayo es:
gucr + Qte = Qntr = Ftu.Cil.(To
- Tr)
t3.93I
Donde, Qrurr, Qre, q,nr: calor generado por metabolismo, calor generado por agitación y dispersión de gases y calor intercambiado, respectivamente, kW (: kJ.s'1); Fro: velocidad de flujo de masa de agua, kg.s-'; cro: calor especlfico del agua, kJ.kg-1 oC-l ' Trr, Tro: temperaturas del agua efluente y afluente, respectivamente, al intercambiador, oC. En el tiempo t = B se desconecta el intercambiador, q,* - 0. El calor generado por metabolismo se acumula en el sistema balance de energía, aplicable en esta etapa del ensayo es:
Qtur + Qrc'=
y la ecuación
de
Q,rc
t3.94I
dT V. = LIIn.ts Qtc = V.Cp. dt
169
Donde, qo":calor acumulado en elreactor, kw; dr/dt: variación de-la temperatura del caldo de fermentación con el tiempo, oc.s-t, es la pendiente de la curva de la Figura 3.3 entre t : B y t : c; cr: capacidad calorífica global del reacror, kJ.litro-l.o6-t, (Tabla 3.h; v: volumen delcaldo, litros; rr:velocidad de consumo de sustrato, (mol C en sustrato).litro-l.s-l; AH^: calorde reacción, kJ.(mol Cen sustrato)-1
.
La Ecuación [3.94], utilizada en la'determinación del calor de reacción, o dbt calor generado por el.,metabolismo, a partir de una serie de'mediciones de temperatura y tiempo, se conoce como.aproximación de uhlich; Moser (1g8Bl. El intercambiador se conecta nuevamente en el tiempo t i= tc, (Figura 3.4), el calor acumulado en el reactor es removido del sistema y la ecuación de balance de energía, aplicable en esta etapa del ensayo, inrnediatamente después de t :
t",
es:
{3.9st
Lrc=4m
3.7 Datos tlpicos de calor específico y capacidad qalorlfica en fermenta(Cooney ción. et al., 1968). Tabla
Medio,
Calor
Gapacidad
especlfico
calorlfica
kJ.(kg. "G1.1
kJ.(litro.9,C)-1
Caldo de fermentación
4,186
4,228
Material de vidrio
0,837
0,290
Material de acero
0,502
o,039
Valor global total
170
4,504
Figura 3.3 Montaje experimental utilizado en la evaluación del calor generado por metabolismo. T"o, Tro: Temperaturas de los fluidos, caliente (caldo) y frío (agua), respectivamente, afluentes al intercambiador; T"r, Trr: Temperaturas de los fluidos, caliente y frio, respectivamente, efluentes del intercambiador.
Figura 3.4 Variación de la temperatura, T, del caldo con el tiempo, f, del ensayo. El sistema de reactor e intercambiador funciona inicialmente en condicionesestables, @T/dil - O,entre lostiempost: Alt: B. Enel : : B el intercambiador se apaga; y en el tiempo t tiempo t C se prende nuevamente.
Reqctor
Intercqnblodor
Figura 3,3
c
Tierrpo
t
Figura 3.4
zH"rrl-r;L, , oHcv*¡o.,tün , 414a.t.c4b Ejemplo 3.6 Balance de energía delproceso aerob¡o de producción de levadura a part¡r de glucosa Realizar el balance de energía del proceso aerobio de producción de levadura a partir de glucosa, analizado en el Ejemplo 2.2 y calcular: el calor de reacción, el
calor generado por las reacciones de catabolismo, la eficiencia del crecimiento microbial, la eficiencia termodinámica y la disipación de energía, 171
Solución: 1- Eeuación de.órecimiento, (Ejemplo 2.2l,:
+ 1,05 O, + 1,08 NH3 :4,31
C6H'2O6
*
CH1,e4Oo,3No,ru
1,69
CO,
2- La ecuacíbn de crecimientó'iescrita sobre la base de 1 mol '0" C sustrato; es:
óHro + 0,r75 o, + 0,18
NH3
:
0,719 cH1,s4oo.3No,r,
*
0,281
"n
co2
3- El calor de reacción, o calor producido durante el crecimiento
...(11
A '' ...i.21
microbial
(Ecuación 3.56), es:
(aH*)": (aHs)"-(Yp/s)".(AHp)"-(Y¡¡5)",(AHxl" '
Donde:
(YxrJ: = O,7"19 (mol C en células).(mol C en glu.)1 (Yp¡s)"
{AHs)"
:
0: (no hay formación de productos)
: l-2807tül : - 467,83
kJ.(mol Cen glucosa)'1 (Tabla 3.3},
Grado de reducción de las células:
CHr,e4Oo,3No,2E
f* :'4 + 1,94 - (0,3).(2) - (0,25).(3) : Calor de combustión de las células, (Ecuación
4,59
3,49): ,
,
AH *,,
= - 26,8 kcal/electróñ = - 112,2kJlelectón
(AHx)"
= (- 1l2,2kJlelectrón).{4,59 electrón/mol
:
C)
- 515 kJ.(mol C en".cél)'.
Calor de reacción, Ecuación (3): (AtlR)"
172
l.
.
.rt
:
- 467,83 - {10,719).(- 515) = - 97'54 kJ.lmol Cen glu,)1
:
(- 97,54).(6)
-
- 585,24 kJ.(mol
glu)-1
..
..(gl
<
4- Calor generado por las reacciones del catabol¡smo (Ecuación 3.62):
(AHcAr)": (AH5}"-E(Yoys)".(AHpi).
.,.(4)
Si se considera que no se forman productos no celulares: (AHcAr)"
:
(AHs)"
= - 467,83 kJ.(mol
C en glucosa)
5 - Eficiencia del crecimiento microbial, (Ecuación 3.63):
(Y4)c'(^II)c ñ (rryJ..$H)" + (A,H)¿ 'l¡
(0,719),(515) =0.79 n'' _ (0,719).(510 + 97,il 6 - Rendimiento de electrones en biomasa: De acuerdo con la Ecuación (2). elrendimiento de sustrato en biomasa es: (Y¡,51,
= O,719
(mol C en cétulas), (mol C en glucosa)-1. Por tanto:
(yt), = 0.719 nul C cü nol C gb
4
2.,24 g cél mol C slt nol C cél 4 ct¿ct¡,
s cél elecúon dirynibl¿ por
nnl C cn gfu.
7 - Energla disipada en el proceso de crecimiento, (Ecuación 3.591:
D=+ =t^e\. (# D=
',)
- l1o,s .(?f - o,*) = - r14,e #;A
173
,r
_
114,9
mol C
W cél
0,719 mol
mol C
C cél
glu
82§
_
kJ
mol C glacosa
Donde, M,: peso molecular de las células, 22,24 (g cé|. secas).(mol C en cél)-l; Ag"': cambio de entalpía por la transferencia de un mol de electrones entre el sustrato y el oxfgeno: 118,5 kJ.(mol electrón)-1 (Tabla 3.4); Yr,ro: factor de rendimiento de los electrones dispo¡ibles, (4 g cél).(molelectrón)-1; l-r: grado de reducción de la biomasa: (4,59 electrones disponibles).(mol C en células)-1.
I
- Eficiencia termodinámica, (Ecuación 3.60):
rlr
=
(as')cx (Ago)"* + D
(Ag')cx = 94,4.fr *
86,6
(Ág')cx = (94,4).(4,59) + 86,6 =
.,.(Ecu- 3,481
-
519,9
519.9 n- = -------l-lJL" 519,9 + 114,9 = O-[lB.
Donde, (Ag"'1.*: entalpfa libre de combustión por mol C en la biomasa, kJ.(mot C en células)'l, (Ecuación 3.48); & función de disipación, 114,9 kJ.(mol C en células) t.
Ejemplo 3.7 Balance de energía delproceso de obtención de etanol a part¡r de glucosa
Realizar el balance de energfa del proceso anaerobio de obtención de etanol a partir de glucosa, analizado en el Ejemplo 2.3 y calcular: el calor de reacción, el
calor generado por las reacciones de catabolismo, la eficiencia del crecimiento microbial, la eficiencia termodinámica y la disipación de energía.
174
Solución: 1- La ecuación de crecimiento (Ejemplo 2.3), es: C6H12OB
+ O,179 NHr: O,714 CH;,rooo,.No,rt
+ 1 ,728 C2HEOH +' 1,83 CO2
.,
...(1
)
2- La ecuación de crecimiento, escrita gobre la base de 1 mol de C, es: CHrO + 0,0298 NH3 : 0,119
CHr,s4Oo,3No,2s
+ 0,576
3-
El calor de reacción, (Ecuación 3.56), es:
:
(AHB). Donde, (Yx,.l.
:
CH3O.,5
+ 0,305
CO2
...121
o calor producido durante el crecimiento microbial
(AHslc - (Yr/slc.(AHp)6 -
(Y¡¡s)6.(AHx)c
..(31
0,119 (mol C en céll.(mol C en glu.)'1;
:
(Yp,s)"
0,576 (mol C en etanol).(mol C en glr"osa)-;
Calores de combustión,. (Tabla 3.1):
(AHslc
: l- 2807til : - 467,83
(AHplc
= (- 1369/21 =,o.684,5 kJ.(mol
Grado de reducción de las células:
f^ :
4"
kJ'(mol C en glucosa)-l C en etanol)''
CH1,e4Oo,3No,2s
+ 1,94' (0,3).(2) - (0,25)'(3) =
4,59
Calor de combustión de las células,.lEcuación 3.49): AHxie
(AHx)c
:
(-
11
:
- 26,8 kcal/electróo = - 112,2kJlelectrÓn
2,2kJlelectrón){4,59 electrón/mol O
:
- 51 5 kJ.(mol Cen
cél}-1
175
Calor de reacción, Ecuación (3): (AHR).
: - 467,83 - 0,'119(- 515) - {- 684;5 x 0,5761
: - 12,27 kJ.{mol C en glucosal-1 : l- 12,27!.(6) :
- 73,64 kJ.(mol glucosa).1
4- Calor generado por las reacciones del catabolismo (Ecuación 3.62):
AHcAr)c
:
(AHs). - (Yp/s)c.(AHp)c
:
(AHnlc
+
(Yx/s).{AHxlc
"'l4l (AHcAr)c
:
: -
- 467,83 - [- (684,50. (0,576]l 73,56 kJ.(mol
: - 12,27 + t- (515).(0,119)I
Cl-1.
5 - Eficiencia del crecimiento microbial, {Ecuación 3.63):
t^ _
(Y$s) c.(^ Hx) c
(Yxs)c.$Hx)c + (Aa"¡"
(0,119).(515) =on?? - vr(,go
Rendimiento de electrones en biomasa De acuerdo con la Ecuación (2), el rendimiento de sustrato en biomasa es: (Y*,.)"
:
0,119 (mol C en cél).(mol C en glu.)-t. Por tanto:.
tv | vdBtc
0,119 mot
C
cél 22,24 g cél nol C gtt¿ ' r*t C cét 4 tnr. "t
y_ lDc-
176
O,ffigcél por nol C en glacosa
el¿ctrón disponiblc
: , '*
7 - Energía disipada en el proceso de crecimiento,(Ecuación 3.59):
,=+=(as.)uÍ# =
_
r4
H - 9.s - .(2''24 - 4.s9) = - 2TG.52 nolCcél \0,66 )
_
H . 0,119 mol C cél _ _ 32,9 H mol C cél mol C ght mol C ght. 276,52
Ago': cambio de entalpla por la transferencia de un mol de electrones entre el sustrato y el etanol: 9,5 kJ.(mol electrónl'1 {Tabla 3.4}; Yxeo: factor de rendim¡ento de los electrones disponibles, 0,66 (g cél).(mol electrónl-1; l-r: grado de
reducción de la biomasa: 4,59 (electrones disponibles).(mol C en células)-l.
8 - Eficiencia termodinámica, (Ecuación 3.60):
rr =
(Lgolcx
(A,g")"* + D
(Ás")cx = 9l,4.Ix *
86,6
.....(r¿¿. 3.¡18)
(Ag')r = (*,41.(4,59)+ 86,6 = - ,,ll*9,Y
=
,,=gffi=o'65 519.9
Donde, {Ag''}"r: ehtalpla libre de combustión por mol de C en la biomasa, (kJ).(molCen cél)-1, (Ecuación 3.481; D:función de disipación,276,52 (kJ).(mol C en cé1.) 1.
177
PROBLEMAS
3.1
Se utiliza un reactor de mezcla completa para producir en cultivo continuo (composición de las células: CH1,B1Oo,51No,zr) bajo condiciones anaeróbicas, 12 (kg de glicerol)/(hora), a partir de glucosa y amoníaco. Suponer que el rendi-
miento de glucosa en CO, es de 0,54 moles de CO, por mol de glucosa. Calcular el calor generado en kJ/(mol de glicerol).
3.2
Suponer en el problema anterior que el rendimiento de glucosa en células
es de 1,8 {mol de células}/(mol de §'lucosa}. Calcular el calor generado en kJ/(mol de glicerol).
3.3 Se utiliza un reactor
por lotes para producir 4800 kg de ácido cítr¡co a partir glucosa. El rendimiento de de sustrato en células es 0,22 (g célulasl/(g glucosa) y el de sustrato en producto 0,58 (g ecidoli(g glucosa). La aeración se realiza con aire estéril lT: 22 oC, presión : 16 psial. Calcular en el calor producido por el cultivo en kJ/lote. Este calor debe ser retirado por el sistema de enfriamiento del reactor.
3.4 Fermentación alcohólica:
La ecuación global,de la glucólisis por la ruta EMP
ES:
Glucosa
+ 2 NAD* + 2 ADP + 2Pi ---> 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP +2H2O + 2H*
..,(1)
En el proceso de ferm.entación alcohólica las levaduras cultivadas inicialmente en un ambiente aerobio'son luego somet¡das a condiciones anaerobias para degradar la glucosa hasta etanol y COr. El piruvato formado por la vía EMP se convierte en acetaldehído, por acción de la enzima p¡ruvato descarboxilasa:
2 Piruvato ---> 2 Acetaldehído
't78
+ 2CO,
,,,121
Glucosa
+ 6O, +.38ADP + 38Pi--> 6CO, + 38ATP + 44H2O
,
,,,(21
Bajo condiciones anaerobias, el NADH y el piruvato, son totalmente consumidos
sin oxidación neta, y estos dos moles de ATP representan el máximo rendimiento alcanzado (fosforilación a nivel de sustratol. La Ecuación (1 ) puede descomponerse en dos procesos: a- oxidación de la glucosa: Glucosa
+ 6 O, ---> 6 CO2 +
b- energía capturada por la célula: 36 ADP
6H2O
+ 36 Pi ---> 36 ATp + 36 H2O
calcular la eficiencia de la célula en el proceso de captura de energía y confrontar el valor calculado con la eficiencía real del proceso lmavo¡ .que 7oo/o, Bailey y ollis, 1986) obtenida mediante la corrección de los datos de energía libre para las concentraciones y pH predominantes en,el sistema vivo, la energía restante se disipa como calor que debe retirarse del sistema para mantener la temperatura óptima requerida por las células.
3.6 Calcular el factor de rendimiento de glucosa en células, basado en la energía total disponible en el medio mínimo, a partir de la siguiente ecuación estequiornétrica del crecimiento anaerobio de Saccharomyces cerevisiae,lBattley, 1960):
CBH12O6
+
glucosa
O,12 NH,
-
0,59
Cl=ll,7sOo,ouNo,,
células + 0,43
CaHBO3
+ 1,3 C2H6O
+
etanol "1,54
CO, + 96,3 kJ
glicerol
3.7 En la Figura 3.5 se presentan datos obtenidos por de Vries et a\.,1970, en el crecimiento anaerobio de Lactobacillus casei, en un medio. complejo con glucosa como fuente de energía.
Calcular el coeficiente de mantenimiento, ffirrp máximo en la generación de ATP, lYy¡a,pl¡¡¡. 180
y el factor de rendimiento
y.
3.5
Representaiión gráfíca de la velocidad especffica de formación de ATP, o.¡1p, en función de la velocidad especlfica de crecimiento de eélulas, p,,, de Vries et al., 1970. Problema 3.7. Fígura
28
(mmol ATP) /(9. celulas.hora)
24
20 16 12
a 4
o
o
o,t
o,2
0,0
0,4
0,6
0,6
Velocldad especiflca de creclmlento, l/h
0,7
0,a
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I r :':
1184
:
CAPITULO 4
CINETICA DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS
4.1
TNTRODUCCTON
Las enzimas son proteínas elaboradas por las células a paftir de aminoácidos. Cada enzima es una molécula especializada catalizadora únicamente de un t¡po específico de reacción química. Secuencias de reacciones enzimáticas son
catalizadas en fracciones de segundo con un rendimiento de 1OO 7o sin formación de subproductos. El propósito de este capítulo es realizar una descripción de las caracterlsticas generales de las reacciones catalizadas por enzrmas. El grado de especificidad de una enzima, con respecto a la reacción catalizada, o a la función de los react¡vos, depende de su función biológica. El sitio act¡vo de una enzima es una región tridimensional formada por unos pocos aminoácidos orientados en la dirección apropiada para permanecer biológicamente activos y ligarse con el respectivo sustrato. Generalmente aún no están completamente elucidados los mecanismos de enlace y la acción catalítica en el sitio activo, pero el concepto básico de formación de un complejo enzimasustrato es el fundamento de las ecuaciones de velocidad de muchas reacciones enzimáticas.
185
4.1.1 Cofactores y coenzirnas
Las enzimas son proteínas constituidas por una o más cadenas polipeptídicas,
algunas contienen otro componente químico necesario para su ,actividad, denominado cofactor, Tabla 4.1., o una molécula orgánica compleja, llamada coenzima. Algunas enzimas requieren cofactor y coenzima, Frecuentemente el cofactor está ligado con la porción proteica de la enzima, en cuyo caso recibe el nombre de grupo prostético. Las enzimas son los catallzadores de las millares de reacciones químicas, conocidas colectivamente como metabol¡smo intermediario de las células. Las enzimas denominadas con el mismo nombre, pero obtenidas de diferentes microorganismos, frecuentemente tienen distintas secuencias de aminoácidos y diferentes propiedades y activ¡dades catalíticas.
Tabla
4.1
Algunas enzimas que contienen o requieren iones metál¡cos como cofactores. (Bailey y Ollis, 1986)
o-Amilasa (páncreas de cerdo)
Ca2t
Colagenasa Lipasa
Nucleasa micrococal Co2 *
Cu2* (Cu*
Glucosa isomerasa lBacillus coagulansl (También requiere Mg" ) I
Fe2* o Fe3*
Galactosa oxidasa Catalasa
Citocromos Peroxidasa
Mg3t
Desoxirribonucleasa (páncreas .bovino)
Mn2*
Arginasa
Nat
ATPasa de la membrana del plasma (También requiete K* y Mg")
Zn2*
Alcohol deshidrogenasa Fosfatasa alcalina Carboxipeptidasa
186
4.1.2
lsoenzimas y enzimas alostéricas
Algunas enzimas existen en formas múltiples, llamadas isoenzimas. La forma de la isoenzima cambia durante el desarrollo del organismo y segÚn el téj¡do del cual formaft parte. Las enzimas poseen trna conformación tridimensional
especlfica que usualmente cambia durante el ciclo catalítico, somet¡endo la molécula a tensión, y haciéndola susceptible a la reacción. Las enzimas reguladoras o alostéricas son estimuladas o inhibidas por la unión con alguna molécula, el efector o modulador, generalmente un producto metabólico, cuya concentración en la célula es crltica.
4.1.3 Clasificación Crueger y Crueger, 1984, clasifica las enzimas disponibles comercialmente en: - Enzimas industriales tales como amilasas, proteasas, glucosa isomerasa, lipasa,
catalasas, y penicilin-acilasas.
-
Enzimas analíticas tales como glucosa oxidasa,. galactosa oxidasa, alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muramidasa, y colesterol oxidasa'
- Enzimas médicas: asparaginasa, proteasas, lipasas, y estreptoquinasa. La Comisión lnternacional de enzimas clasificó en 1964 las enzimas en seis clases principales de acuerdo con la sustancia sobre la cual actÚan y con la naturaleza de la reacción catalizada, fabla 4.2. Cada clase principal puede contener subctases y sub-subclaseS. Por consiguiente, cada enzima es designada por un.,eódigo numérico. Así, por ejemplo, según Bohinski, 1970, la alcohol deshidrogenasa tiene el código 1 .1 .1 .1 : 1.1: La enzima actúa sobre el grupo de sustratos caracterizados por: :CH-OH' '1.1.1:La enzima requiere NAD* o NADP* como aceptante
d;l hidrógeno.
1.111.1: El sustrato específico de la enzima es el alcohol etílico. 187
Tabla
4.2
Clasificación internacional de las enzímas. (Lehninger, 1973l.
. Oxidoreductasas Reacciones de transferencia electrónica 2. Transferasas Transfieren gfupos funcionales 3. Hidrolasas Reacciones de hidrólisis 4. Liasas Adicién a los dobles enlaces 5. lsornerasas Reacciones de isomerización .Forrnacién 6. Ligasas de enlaces con escisión de ATP 1
4.1.4 lmportancia
industria!
En la Tabla 4,3 se presenta un resumen de las principales enzimas y sus aplicaciones industriales. Todas las enzimas son producidas a partir de organismos vivos, plantas, animales, o rñicrob¡os. .
Tbbla
4.3
Algunas enzimas de importancia industrial. (Arima, 19641
Nombre
Aplicación y comentarios
Fuente
Amilasas licuificadoras del almidón
Diastasa
Malta
Takadiastasa
Aspergillus
Ayuda digestiva; suplemento del pan; jarabes,.Tiene act¡vidad o-amilasa y actividad B-amilasa
orizae
Ayuda digestiva; suplemento del Ban; jarabes' Contiene muchas enzimas diferentes: proteasa, RNAsa
Amilasa
Bacillus subtil¡s
Desencolado de textiles; jarabes; industria de la fermentac¡ón de alcohóles; producción de glucosa. La preparación cruda contiene proteasa Continúa
188
Tabla 4.3 (Continuación) Nombre
Fuente
Aplicación y comentarios
Amilasa ácido resistente'
Aspergillus niger
Ayuda digestiva; pH óptimo: 4,5
Amilasas sacarificadoras del almidón
Amiloglucosidasa
Rhizopus niveus, A.niger. Endomicopsis fibuliger
Producción de glucosa
Tripsina
Páncreas de animal
Uso médico; ablandador de carne; remueve turbiedad de la cerveza
Pepsina
Estómago de
Ayuda digestiva; ablandador de
animal
carnes
Estómago de
Usos médicos
a-Ouimiotripsina
animal
Cuajo
Estómago de ternero
Manufactura de queso
Proteasa del páncreas
Páncreas de animal
Ayuda digestiva; limpieza; laminación de pieles; remoción de pelo; mejorador de alimentos
Papalna
Papaya
Ayuda digestiva; usos médicos; remoción de la turbiedad de la cerveza; ablandador de carnes
Bromelina,
Piña, higo
Ayuda digestiva; usos médicos; remoción de la turbiedad de la cerveza; ablandador de carnes
ficina Proteasas microbiales Proteasa
A.
Proteasa
A. niger
Álimentos para animales; ayuda digestiva. Resistente a los ácidos; pH óptimo: entre 2 y 3
Proteasa
B. subtilis
Detergentes; remoción de la gelatina de las pelfculas (recuperación de plata); ablandador de carnes; pH
orizae
Saborizante del sake; remocién de la turbiedad del sake
óptimo: 7,O
Continrla 189
Tabla 4.3 (Continuación) Nombre
Fuente
Aplicación y comentarios
Proteasa
SÜeptomyces gnseus
Detergentes; remoción de la gelatina de las películas (recuperaciónde plata);-ablandador de carnes; pH éptimo: 8,O
Varidasa
streptococcus sp.
Uso médico.Lederle
Estreptoquinasa Streptococcus sp.
Prof ibrinolísina
Algunas otras enzimas comerciales Lactobacillus brevís, Arthrobacter simplex,
Glucosa -->fructosa. Novo, lCl, Gist
Penicilinasa
B. subtilis, B. cereus
Remoción de penicilina. Takamine, Schenley
Glucosa oxidasa
Aspergillus niger, Dee O, Dee G
Remoción de oxígeno o de glucosa de diversos alimentos; indu§trialización del huevo seco. Takamine
Glucosa tsomerasa
Actinoplanes missourensis
Penicillium chrysogenum Hialuronidasa Lipasa
Determinación de glucosa. Nagase Co.
Animales, bacterias
Uso médico
Páncreas,
Ayuda digestiva; saborizante de productos lácteos
mohos lRhizopusl
Citocromo c
Brocades
Levadura
)
Uso médico. Sankyo Co.
lCandidal Catalasa
Esterilización de leche
Oueratinasa
Streptomyces fradiae
Remoción del pelo de las pieles. Merck Co.
b l-ostodi-esterasa
Penicillium citrínum; S. griseus B. subtilis
Manufactura de ácido inosínico y de ácido guanílico (5'nucleót¡dos). Yamasa Co., Takeda Co. :
Acido adenílico
A.
AMP --> lMP. En Takadiastasa.
orizae
deaminasa
Continúa 190
Tabla 4.3 (Continuación) Nombre
Fuente
Aplicación y comentarios
Cuajo mícrobial
Mucor sp.
Manufactura de queso. Meito Sangyo Co.
Naringinasa'
Aspergillus niger
Remoción del sabor amargo de los jugos cítricos. Rohm & Haas.
Laccasa
Coriolus versicolor
Secado de lacas.
Celulasa
Trichoderma koningi Trichoderma viride
Ayuda digestiva; pH óptimo: 4,6 Hidrólisis de la celulosa. Mezcla de enzrmas
lnvertasa
Saccharomyces cerevisiae
Confitería, previene la cristalización del azúcar; chocolates; melazas de alto grado
Pectinasa
Sclerotina libertina, Coniothyrium diplodiella
Clarificación de jugos; remoción de pectina; concentrac¡ón de café. Scrase (Sankyo);"Pectinol (Róhm & Haas); Takamine. Rohm & Haas; Takamine Pectinasa Clarasa (Takamine) Filtragol (1.G. Farben)
A. orizae A. niger A. flavus
4.2
ACTIVIDAD ENZIMATICA
4.2.1 Velocidad inicial de una reacc¡ón catal¡zada por una enz¡ma
Un experimento típ¡co para medir la velocidad de una reacción catalizada por una enzima pura consiste en mezclar las soluciones de sustrato y de la enzima pura apropiada, tiempo cero, en un recipiente bien agitado, en condiciones isotérmicas, con una solución amort¡guadora (buffer) para controlar el pH. 191
sustrato y de producto es registrada en diversos momentos mediante técnicas espectrofotométricas, manométricas, polarimétricas, electrodos y métodos de muestreo y análisis. La concentración de
La variación inicial de la concentración de sustrato, o de producto, con respecto
al t¡empo, puede calcularse a partir de la ecuación:
=l #L. = I'r=o
t4.1I
Donde, p, s, ei concentración de producto, sustrato, y enzima, respectivamente; r: tiempo de reacción; v: velocidad inicial de la reacción. Para t : 0: e : eo,
P: P.YS:
so'
Generalmente, la representación gráfica de los datos de un experimento típ¡co para medir la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente indica, como en el caso del Problema 4."1, algo de producto en el tiempo registrado como cero y, por consiguiente, este t¡empo realmente no es el tiempo inicial de la reacción; Además, cuando una enzima se remueve de su ambiente biológico nativo y se cgloca en un ambiente acuoso "extraño", pierde gradual-
mente su actividad catalít;ca. Sin embargo, a pesar de estas dificultades, el método de determinación de las velocidades iniciales de la reacción, es razonablemente reproducible. Las unidades de actividad indican la cantidad de enzima que produce una determinada actividad catalltica bajo un conjunto definido de condiciones estandarizadas para esa enzima particular. Generalmente se encuentran diferentes definiciones de actividad para la misma enzima estud¡ada bajo diferentes conteitos.
Ejemplo
4.1 Determinación
de la actividad de la enzima B-
glucosidasa
Lee; 1992, describe el siguiente procedimiento experimental, con el propósito de medir la actividad de una enzima y la velocidad inicial de la reacción: Se agregan 5 ml de celobiosa (concentración: 1 0O pmol/mll a 44 ml de solución amortiguadora (buffer) en un recipiente agitado. Se agrega entonces, para iniciar la reacción, 1 mlde solución de la enzima (B-glucosidasa, concentración: 0,1 (mg
192
enzima)/ml y se toman muestras (Volumen: 0,1 ml) de la mezcla a los 1, 5, 10,
15 y 30 minutos. Los datbs del contenido de glucosa de cada muestra
se
presentan en la Tabla 4.4.
Calcular: (1) La velocidad inicial de la reacción; (21 La actividad de la Bglucosidasa expresada como la cantidad de enzima que produce 1 (pmol glucosa)/minuto.
Tabla
4.4
Determinación de la actividad de la enzima B-glucosidasa, Lee, 1992. Concentración de glucosa en /mol/ml
Tiempo en minutos
0, 05 0,23 0,38 0 ,52 t-, 03
1
5
10 15 30
Solución: - Los datos de la Tabla 4.4 son representados en la Figura 4.1. La velocidad inicial de la reacción se calcula a part¡r de la pendiente de la lfnea a trazos: vctocidad iniciut =
Affi
4.2.2
*3
= (o,o4sg).(so
= o,o45e
n[
##f
= 2,288
W,
Número de recambio
Elnúmero de recambio, N, de una enzima (Tabla 4.5) es el número de moléculas de sustrato transformadas por unidad de tiempo por una molécula de enzima, o por cada centro catalítico, cuando la enzima es el factor limitativo de la velocidad.
193'
: ,.
Figura 4.1 Determinación de la velocidad inicial de.la reacción entre ta B-glucosidasa y una solución de celobiosa. Ejemplo 4.1.
-
_ Glucoso producido,
enzima
micromol/ml.
^c-'
0.5 o.4 0.3 Q.2 0.1
o
o
5
10
15
Tiempo de reoccion, mÍnutos +
Ejemplo
4.2
Dotos experimentoles '--- - Tendencio inicÍol
Determinacién'del número de recámbio
Hallar el número de recarnbio de una enzima (peso molecular: M : 1 16OO0), si 12 Ug de enzima transforman 32 micromoles de sustrato por minuto.
Rcconbio
_
Moléculas d¿ sustrao transformadas
(ticmpol.(noUcub de ewimal
Por consiguiente el número de recambio es;
32.10-6 mol sustrato 11ñ0O e ¿nzima (niruao).(l2. 10-6Sr euinw) mol e¡uima Nún¿ro d¿ ¡econbio =
194
mal s+rao minuto.mol etuims
[email protected],3
v
Tabla 4.5 Número de recambio.de algunas reacciones catal¡zadas por enzimas y catal¡zadores sólidos. (Maatman, 1973); ly': número de moléculas por sitio activo por segundo. Enzima
Reacción
lntervalo de los valores de /V informados, entfe 0 y 370C
Ribonucleasa
Transferencia del fosfato de un polinucleótido
2
- 2.10-3
Tripsina
Hidrólisis de péptidos
3.10-3
- 1 .102
Papaina
Hidrólisis de péptidos
8.10'2
-
Bromél¡na
Hidrólisis de péptidos
4.10-3 - 0,5
Anhidrasa carbónica
Hidratación reversible de los compuestos de carbonilo
9.10'1 .6.105
Fumarato
L-malato Hro
hidratasa
:
fumarato +
1
1
.103 (hacia la
derecha)
3.103 (hacia la iz-
quierda)
Catalizador sóHo
Reacción
s¡o2 - Al2o3 (impregnado)
Destilación fraccionada del cumeno
3.10-8
2.104
420
Zeolita decationizada
Destilación fraccionada del cumeno
-
325
Deshidrogena-
7.10-11
ción del ciclohe-
102
vro,
N
10e 108
Temperatura,
oc.
25
25
25 350
xeno
Cu.Au tratado
ción de HCOrH
Alcl3-Al2o3
lsomerización de n-hexano
Deshidrogena-
(líquido)
2.107 3.1010
1.10'2 1,5.10-2
25 327 25 60
19s
4.2.3 lnfluencia
de los factores ambientales
En la célula se forman continuamente centenares de enzimas que funcionan coordinadamente para fomar productos en la proporción correcta y aprovechar,
sin desperdiciar, los nutrientes disponibles. La estructura de una
enzima depende de numerosos enlaces débiles no covalentes. Por esta razón la enzima tiende a perder su conformación o a desnaturalizarse, La actividad específica de una enzima es perturbada por factores ambientales como pH, temperatura, los esfuerzos cortantes, la intensidad iónica del medio y el estado de la enzima en el reactor (en solucíón, o inmovilizada sobre un soporte). Estos factores deben
tenerse en cuenta en el diseño de reactores para la conversión de sustrato en productos útiles. EI propósito de esta Sección es describir el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimát¡ca,
4.2.3.1
pH
En la Figura 4.2 se muestra la influencia del pH sobre la actividad de tres enzimas, Hay un valor óptimo de pH para el cual la actividad enzimática es máxima. La influencia del pH se debe a los grupos ionizables presentes en el sitio activo de la enzima, estos grupos pueden tener una carga positiva o negativa, de acuerdo con el pH del medio, pero el s¡tio act¡vo debe estar en la forma iónica adecuada para tener actividad catalítica, Ennis y Maddox, 1987t Bahlet al., 1982.
4.2.3.2 Temperatura
La temperatura, en el intervalo adecuado, favorece inicialmente la activación de
la enzima y luego cuando es demasiado alta la inactiva o desnaturaliza. A medida que la temperatura aumenta, aumentan la velocidad de reacción y la 196
frecuencia de las colisiones entre moléculas de enzima y de sustrato. Esta velocidad atcanza un máximo a la temperatura óptima para la actividad de cada enzima particular. Un incremento adicional de temperatura reduce gradualmente la velocidad de la reacción catalizada a causa de la ruptura de los enlaces covalentes dentro de la molécula de enzima. Un aspecto fundamental en el diseño de reactores enzimáticos es el logro de un microambiente apropiado para la enzrma.
Figura 4.2 Efecto del pH sobre la actividad enzimática de tres enzimas: pepsina, descarboxilasa y arginasa' (Fruton y Simmonds, 1953)'
too
Actividod relativo, %
ao 60 40
20 o
17
pH
Los recientes avances en biologla molecular están dirigidos hacia la modificación de la estructura de la enzima con el propósito de retener su activídad dentro de ün intervalo más amplio de temperatura y de pH, 'y aurnentar así su campo de
aplicación. Generalmente, la influencia de la temperatura sobre la activación o inactivación de un sistema enz¡mát¡co, puede describirse mediante la ecuación db Arrhenius:
ft
= .r{.exP-
(#,)
f4.21
197
Donde: Eo: energla de activación, J.mol-l; R: constante de los gases, R : 9,314 J.mol-l .K-l ;T: temperatura absoluta, K; A:factordefrecuencia, s-1; k: constante de velocidad, s-1.'
Ejemplo
4.3
Determinación de las energías de activación e inactivación de un s¡stema enz¡mát¡co
Sizer (1944), estudió la activación e inactivación del sistema catalasa-peroxido de hidrógeno. La catalasa utilizada fue extraida del hlgado de vaca y luego recristalizada. En este caso la actividad de la enzima se define mediante la velocidad de producción de O, (convertida a temperatura normal) del sistema catalasa-Hror. La velocidad de producción de gas se evalúa con un manómetro Warburg-Barcroft en el intervalo de temperatura entre 0 y 60oC.
La Figura 4.3 es una representación gráfica de los datos experimentales.
La
ordenada representa el logaritmo de la velocidad de producción de oxígeno, en (mm)3/(minuto), y la abcisa representa el recÍproco de la temperatura absoluta. Calcular las energlas requeridas para la act¡vac¡ón e inactivación del sistema. Solución:
- Los valores experimentales obtenidos aparecen repartidos en dos grupos en la Figura 4.3. El primer grupo está relacionado con la activación de la enzima en el intervalo de temperatura entre 0 y 53oC (correspondiente a valores de 1/T entre 3,66.10'y 3,O7.10-3 K-1), El segundo gruBo está relac¡onado con ]a inactívación de la enzima a mayores temperaturas, hasta 66oC {correspondiente a valores de 1/T : 2,95.103/K.
- La ecuación
de Arrhenius describe adecuadamente la dependencia de la temperatura de muchas reacciones catalizadas por enzimas, y la descomposición del HrO, const¡tuye un buen ejemplo. La pendiente de la curva ln k vs 1/T es
198
-
(EA/R), Ecuación t4.21:
::t
lnt, = ln,lr-{fi lntz=lná por tanto.' Ea
EA
"- nJ,
2,303 (og
&-log tt)
R.. IT1 + -
(1t
T2
Y
4.3 Representación gráfica de la influencia de la temperatura, en grados K, sobre la activación e inacfivación del sistema catalasa-peróxido de hidrógeno.
Figura
Velocidad de la reacción: velocidad de producción de 02, Bn, (mm)3/(minuto), Sizer, 1944.
^=-Loo, velocidod de reoccion 25 z.J
7.9
t7 1.5
2.9
3
3.
1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
J.7
3.8
Parala rama derecha de la curva (Fig¡ra 4.3): log
k, : 2,4i
1lTl-
=
3,25.10-3
: 2,1'
1lT1
:
3,61.10-3
log k,
199
: ''
Si se reemplazan estosvaloresen la Ecuación (1), donde R
se obtiene la energla de activación: E^
= - 15.956
=
8,314J.mo|-l.K-1, *
J.mol-1.
Similarmente, paÍa la rama izquierda de la curva (Figura 4.3):
.
log
kz: 2,2i
1lT2
log
k,: 1,7'
llT
:
j:
2,985.103 2,94.103
Si se reemplazan estos valores en la Ecuación (1), se obtiene la energía
de
activación:
E¡=-212.746J.mo|'1 La energfa de inactivación
los valores anteriores de AHd
4.3
:
Al{., de la enzima es elvalor absoluto de la suma
de
Eo:
15.955,9 + 212.746
:
228.70"1,9 J.mol-l
MODELOS CINETICOS DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS
4.3.1 Modelo de Michaelis-Menten
Un modelo es un conjunto de relaciones entre'las variables de interés del s¡stema estudiado. Estas relaciones pueden expresarse mediante ecuaciones, gráficas o tablas. En el caso de la cinética enz¡mát¡ca homogénea, las variables de interés tales como ternperatura, concentración, pH, oxígeno disuelto, velocidad de reacción, son generalmente uniformes en la región de control considerada,
200
Michaefis y Menten (Bailey y Ollis, 19861 hicieron importantes contribuciones a la deducción de las ecuaciones de velocidad de la reacción irreversible:
s--k-->
t4,31
P
para la cual se plantean los siguientes mecanismos:
S + E --- k,, --)
ES
S+E (--kr--
ES
t4.3.al
ES ---k.--) P+E
t4.3.bl
Donde: S, P, ES, E, indican el sustrato, el producto, el complejo enzimasustrato, y la enzima respect¡vamente. La ecuación anterior supone que cada molécula de enzima acomoda sólo una molécula de sustrato, aunque hay moiéculas de enzimas con varios sitios activos disponibles para ligarse con mriltiples moléculas de sustrato,
Sise supone que la ecuación t4.3.al está en equilibrio, o en otras palabras, que equilibrio se logra rápidamente si se-compara con la menor velocidad de'la reacción [4.3.b], la velocidad de la reacción [4.3], es:
'el
.
rs=
-#=rr=#
=kr(cs)=r
14.41
Donde: s, p, (es), representan la concentración molar de sustrato, de producto y de complejo enzima-sustrato respectívamente; rs: velocidad de consumo de sustrato; rr: velocidad de formación de producto. La ecuación de balance de materiales de la enzima es:
eo=e+(es)
t4.51
Donde: oo, o, os, representan la concentración molar de la enzima cargada al reactor, de enzima libre, y de enzima ligada al complejo respectivamente. Si la ecuación anter¡or se divide por eo, se obtiene:
1
=fs*fs
t4.61
201
Donde: f, : eleo, fEs : (es)/eo: representan la fracción de la enzirna total presente en forma libre y la fracción de enzima ligada al complejo, respectivamente. Después de reemplazar
fr. en la Ecuación
14.41, se obtiene:
r = h.e"-fo
f4.71
Además si en la reacción t4.3.al se supone que el complejo está en equilibrio con los componentes libres se obtiene;
e.s=k_kc,s
t4.81
K1
¿_ t,§-
t4.9t
fts*s
Donde k. es la constante de disociación del complejo enz¡ma-sustrato.
Si la velocidad de formación de producto está contolada por la velocidad k., entonces k3 < < k, Y k. = Kr,¡, donde K, es la constante de Michaelis-,Menten. Si la fracción fr. de la Ecuación 14.91 se reemplaza en la Ecuación t4.71 se obtiene: f=
Vx's
t4.101
Kr*s í
Donde la máxima velocidad de la reacción se define como:
vv = 4-e"
14.11'-L
En la Ecuación [4.10] conocida como ecuación de Michaelis-Menten, V, es la velocidad máxima o velocidad limitante y K* es la constarfte de Michaelis. Puede observarse que K, es la concentración del sustrato para la cual la velocidad de la reacción es la mitad del valor máximo. El valor de K, varla ampliamente de acuerdo con la fuente de la enzima. Cuando la concentración del sustrato es alta, s > > Kr, la velocidad de la reacción
202
enzimática es prácücamente iguala la máxima velocidad y es independiente de un incremento de s:
t-Vu
f4.12t
Si s < ( Kr, la velocidad de la reacción, r, es muy sensible a los cambios de concentración del sustrato:
¡=¿Vu's Ku
t4.131
Figura 4.4 tnfluencia de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimát¡ca de hidrólisis del almidón con o-amilasa,.Dawes {1967)' La concentración, eo, de la enzima, Se mantiene constante. DatOs de !a Tabla 4.6. 140
velocidod relotivo de lo hidrolisis
20
oo ao 60 40 20
12 I 6 3 concentrocion de sustroto, mg/ml
En la Figura
4.4 se representa
15
la ecuación de Michaelis-Menten, la concentración
de la enzima se mantiene constante cuando se estudia el efecto de la concentra-
ción de sustrato sobre la velocidad de la reaciión catalizada'
203
- Representación gráfica de Lineweaver-Burk:
1 *Ku r - Vx Vus
1
1
Í4.141
- Representación gráfica de Langmuir:
!-Ku * 1" rVaVM
14.151
- Representación gráfica de Eadie-Hofstee:
r=Vu - KuL s
t4.161
En el método de Lineweaver-Burk, Ecuación f4.141 los valores de 1/r son representados gráficamente contra los correspondientes datos de 1/s, obteniendose una recta, de pendiente K¡¡/Vp¡, e intercepto 1/Vr. Los válores de r determinados con mayor exact¡tud, o sea, aquellOs correspon-dientes a elevadas concentraciones de sustrato, para las cuales el cambio de la concentración de sustrato s con respecto al tiempo es muy pegueño, son los puntos cgn los mejores datos, pero estos quedan agrupados cerca del intercepto, y la pendiente queda determinada, predominantemente, por los
valores menos exactos. Por esta razón no debe utilizarse, con estos datos, el ajuste de valores por mfñimos cuadrados
[4.15], por-elcontrario, tiende a esparcir los puntgs de datos,haCia mayores valores detr, y, por tanto, la pendiente 1/V* puede catcularse con mayor exactitud, páro el ¡ntercepto KM/VM, generalmente queda muy cerca del origen y la determinación de K, puede estar sometida a El método de Langmuir, Ecuación
errores.
205
En el método de Eadie-Hofstee, Ecuación t4. 1 61, los valores de r son representa-
dos gráficamente contra los correspondientes datos de r/s,la variable medida, r, aparece en ambas coordenadas y los grrores cometidos en la determinación de K, y V, pueden ser grandes. Una metodología apropiada consiste en evaluar Vr, por uno de los métodos anteriores y luego construir una gráfica de r vs s, similar a la Figura 4.4, con el propósito de hallar la concentración del sustrato para la cual la velocidad r esY*12. Como se mencionó anteriormente, este valor de la concentración de sutrato s es el correspondiente a Kr.
Ejemplo
4.4
Evaluación de Ios paiámetros de la ecuación de Michaelis-Menten para la hidrólisis del almidón
En las dos prímeras columnas de la Tabla 4.6 se presenta un resumen de los datos experimentales de la hidrólisis del almidón con o-amilasa, obtenidos por Dawes (1967). Determinar la constante de Michaelis, Kr, y la velocidad máxima, Vr.
Solución: - Los datos de la Tabla 4.6 son representados gráfieamente^en las Figuras 4.4,
4.6,.4.7 y 4.8.
- De
la, Figura 4.6, representación gráfica de !a ecuación de Lineweaver-Burk (Ecuación 4.141, se deduce: Kr,r : 3,57 mg/ml; Vu : X29,9
- De la Figura 4.7, representación gráfica de la ecuación de tangmu¡r (Ecuación t4.151), se deduce: Krv : 3,5 mg/ml; Vy = 129,4. - De la Figura 4.8, representación gráfica de la ecuación de Eadie-Hofstee tEcuación'4.16), se deduce: Ku : 3,43 mg/ml; Vu : ;128. : ,
206
i
/
/
Tabla 4.6 Datos de la hidrólisis del almidón con o-amilasa, Dawes, 1967¡ r: velocidad relativa de la hidrólisis; s: concentrac¡ón del sustrato, mg/ml. 1/s
1lt
s/r
r/s
10r_, 0
0, 080
0,124
,2 ,4 90, 0 82 ,7
0,089 0, 111 0 ,]-23 0, 158
,04 8,74 10,27
79,1-
0, 178
io,g
0,,234 0,28]. Q ,427 1,000
0,0099 0, 0L01 0,0108 0, 0111 0 ,072]. 0 ,0L26 0, 0141 0, 0154 0,0193
I
s
L2,56 L7- ,24 9, OO' 8,)-2 6,33 5 ,61 4 ,28 3, 55 2,34 1,00
98 92
55,0 51 ,7 28 ,8
0, 114 0, 097' 0,090 0.076 0, 071 0,050 0, 055 0, 045 0, 035
0..n0347 ,.#f
.
8
1r-, 08
13,05 7-4,)-O
].6,56 ]-8,26 22, Q9 28,80
ii
4.6
Representación gráfica de Linewaver-Burk de los datos experimentales obtenidos por Dawes (1967) en la hidrólisis del almidón con a-amilasa'
Figura
1,/, o.o3
o.o2
o.o I
o
-o.4
-o.2
l/Km
0.4 o.2 1/s, ml/mg
o.6
207
4.3.1.2 Modelo de Briggs-Haldane
1925, aplicable al complejo intermedio, ES, es válido para reacciones en un sidtema cerrado, siempre que so > > eo. La reacción 4.3.a, no alcanza elequilibrio sila velocidad de descomposición del compleio ES, hásta producto y enzima libre, es rápida, comparada con la veloeidad de disociación de ES, hasta E + S. El modelo propuesto por Briggs y Haldane,
En un sistema con una concentración inicial de sustrato mucho mayor que la concentración iniciaf de enzima, puede aplicarse la aproximación de estado cuasiestable, dbd/dt : 0. al complejo intermedio'
4.7
Representación gráfica de Langmuir de los datos experimentales obtenidos por Dawes (1967) en la hidrólisis del almidón con a-amilasa. Ftgwa
0.
l4
0.12 o.1 --i-...--¿
0.08 0.06 0.04
'm/Vrnax
o.o2 o
-2 -4 - Km
208
0
2
4 6 s, mg/ml
I
to
12
14
En la Figura 4.9 se muestran los resultados obtenidos con el prograrna C:\lSlM\MENTEN.SIM, resumido en la Tabla 4.7, o con el programa C:\GWBASIC\MENTEN.BAS, resumido en la Tabla 4.8, Los dos programas producen resultados similares.
Figura 4.9 Variación de las concentraciones de sustrato, enzima y complejo enz¡má-sustrato, de acuerdo con elmodelo de MicháeJ¡s-Menten. Representación gráfica de los resultados obtenidos con los programas C:\lSlM\MENTEN,SIM y C:\GWBASIC\ M ENTEN. BAS.
o,3
Si;ustrato,
Producto
Enzima, Enzima, Complejo Cometeio ES
o,o3
En la Figura 4.9 se observa que la suposición de estado cuasiestable, dbd/dt : O, constituye una buena aproximación después de un breve periodo inicial, cuando la relación entre los valores de las concentraciones iniciales de sustrato y enzima, so/eo, es muy grande En una célula viva las concentraciones de sustrato y de enzima son del mismo orden, y no se aplica la aproximación de estado cuasiestable. Si en la Ecuación t4.181 se reemplaza dbs)/dt : 0, y se eliminan e y s mediante la Ecuación [4.5], se obtiene (Bailey y Ollis, 1986]:
210
t4.19I
De acuerdo con la Ecuación constante dé Michaelis, es:
14.1 11,
Klt
V, : kr.eo. Por consiguiente Kr, la
kz*h =
k"
= ¡t. + --:
"t,
k1
14.201
Donde k. es la constante de disociación del complejo enzima-sustrato defin¡da en la Ecuación t4.81. En la deducción de Michalis-Menten, la constante de Michaelis,
K¡y¡,
es igual
la constante de disociación, K, - ks = krlk,, mientras que'en la deducción Briggs-Haldane, K, : (k2 + k3)/kr. Estos valores de K, coinciden sik2 > >
a
de ks;
lo cualsignifica que la etapa de liberación de producto es más lenta que la etapa de disociación del ccítnplejo enzima sustrato,
Si se reemplazan k,eo y K* en la Ecuación t4.191 se obtiene laecuación de Michaelis Menten (Ecuación 4.10): i-=--=-
"
dS
Vx.s
dt
Ka*s
cuando esta ecuación se integra entre obtiene:
*, ,.(|) .
t:
".
0, s
:
-s=Vil.t
so,
Yt : t, con s = 9, s€ f4.211
Donde t es el tiempo requerido para alcanzar una concentración dada de sustrato.
211
4.3.1.3 Simulación del modelo de Michaelis-Menten
fabla
4.7
Simulación del modelo de Michaelis-Menten. Programa C:\lSlM\MENTEN.SIM
:MENTEN,SIM
:Simulacion del modelo de túichaelis-Menten Ei-ir
'
CONSTANT VM:0.01: mg/(ml.minuto) | ;" CONSTANT KM :0.1 : mg/ml CONSTANT E0:O.01 : mg/ml CONSTANT S0= O.Q: mg/ml : ,. CONSTANT ESO:0 CONSTANT PO:O CONSTANT CINT:0.01: Paso de integracion CONSTANT TFIN: 100 : Valor final de la variable independiente SIM
lNlTlAL : Condiciones iniciales
S:
SO
ES
:
P:
PO
ESO
DYNAMIC E: EO-ES : Balance de materiales :Constantes
K3-VM/EO; K3:VM/EO:1
K2:10*K3: K2 >> K3;K2:10 Kl =K2IKM:
K1
:10/(0,1)=100
: Ecuaciones diferenciales K2*ES-Kl *E*S; Ecuacion 14.171 ES' : K1 *E"S-(K2 + K3l"ES: Ecuacion t4.181 P' : K3*ES: Ecuacion [4.4] S'=-1 *P'
S':
212
: Salida de resultados en forma de tabla OUTPUT T,S,P,ES,E
: Control de salida de datos (En este caso cada 1000.C|NT) NOCI : 1000.0
S VAL
Tabla
4.8
Simulación del modelo de Michaelis-Menten. Programa C
-
:\GWBASI C\M ENTEN. BAS
1O REM MENTEN.BAS
20 REM Simulacion del modelo de Michaelis-Menten 30 KEY OFF 40 CLS 50 NN:1 60 REM Escribir las constantes: 70 VM:.01 ' 80 Kl = 100 90 K2:10 100 K3=1 110 KM=.1 12O E0 =.01
)
130 REM Paso de integracion: T1 140 T1 =.01 150 REM Valor final de la variable independiente: T2
160T2:1OO 170 REM lntervalo de impresion de los resultados: T3
180T3=10 190 PRINT "MENTEN.BAS" 2OO PRINT
k
210 220 230 240 250 260 270 280
PRINT "Simulacion del modelo de Michaelis-Menten" PRINT
PRINT PRINT "T: variable independiente (tiemÉo, minutos)" PRINT "Valor final de ¡, ¡2="¡T2 PRINT "T1: paso de integracion, T1 =";T1 PRINT "T3; intervalo de impresion, T3-";T3 PRTNT
213
: .;
'
290 PRINT "PULSE ENTER !" 300 ANS$: INPUT§(1) 3IO CLS 320 PRINT "RESULTADOS" 330 PRINT 340 PRINT "T: tiempo, minutos" 350 PRINT "O(1): concentracion de sustrato, mg/ml" 360 PRINT "O(2): concentracion de complejo enzima-sustrato, mg/ml" 370 PRINT "O(3)i concentracion de producto, mg/ml" 380 PRINT "E: concentracion de enzima, m§/ml!: 390 PRINT 400 REM Numero de ecuaciones diferenciales: 410 N:3 420 REM condiciones iniciales: Ol :S;O(2):ES;O(3):P;O(4):E j 430 O(1)=.3 440 O(2)=0 450 0(3):0 460 REM Subrutina de Runge-Kutta de orden 4; , 47O Í :lNT(T2fr1 +.5):T1 :f2lT:l = INT(T3/T1 +.5):T3 :T"T1 :T :0:T4 480 T8:1 :GOTO 720 490 IF(T-T4 +T1 l'l0)< 0 THEN 530 500 T4:T4+T3:T5 :lNT(TiT1 +.5):T:T5*T1 : GOSUB 780 510 1F(T-T2 +T1l10l<0 THEN 530 520 LOCATE 23,1:END 530 0N T8 GOTO 550,590,630,670 540 PRINT"** ERROR **':STOP 550FORT5=1 TON 560 T0(TS) :T1 *l(T5):T6(T5) : O(T5):O(T5) : O(T5) + T0(T5)/2 570 NEXT T5 580 T:T+T1 l2:T8:2:GOTO 72O 590 FORTS:1 TO N 000 T7 =T1 *l(TS):T0(TS)=T0(T5) +2*F7:OlT S):T6(T5l +T7t2 610 NEXT T5 620 T8:3:GOTO 720 630 FOR T5:1 TO N 640 T7 :T1 *l(T5):T0(T5l :TO(T5) + 2+T7:O(TS) -T6(T5) + T7 650 NEXT T5 660 TB =4:T =T + T1 i2:GOTO 72O 670 FOR T5=1 TO N 680 0(T5) :T6(T5) + (T0(T5) +T1 *r(T5))/6
,
,
t
214
:0
¿
690 NEXT T5 7oo rB: 1 :GoTo 720 710 REM ECUACIONES DIFERENCIALES: 72O 73O
tll l: K2*O(2)-K1 *(EO-O(2))*O(1)
ll2l:
K1
*(E0-O(2))'O(1l-lK2+ K3)"O(2)
740 l(3)= K3+O(2) 750 E = E0-O(2) 760 GOTO 490 770 PRINT TEOPR|NTSpC(3);"T = ";T;SPC(3);"O(1) = ";O(1);SPC(3);"Ol2l =" t0l2l;SPC(3) ;"O(31 : ";O(3);SPQ(J);"E: ";E
790NN=NN+1 8OO RETURN
4.3.2 Modelo tipo Michaelis-Menten para una reacción enzimática fevefsible
El modelo considerado en esta Sección, para una reacción enzimátÍca reversible,
tipo Michaelis-Menten, se fundamenta en las siguientes ecuaciones:
S + E---k,---)
ES
S + E <--k2----
ES
ES--k3---> E +
Í4.221
P
ES(---ko--. E+P La velocidad de esta reacción es:
¡=-'i ds dt' =h.s.c-k.@l
t4'231
Cuando se aplica la aproximación de estado pseudoestable alcompleio enzimasustrato, (es), se obtiene:
215
14.24t i -
i; ,:',
.
'.
.n::
Ecuación La ecuación de balance de materiales para la enzima, '1 I
'
[4.5], es:
(es)+€:@o Y, de acuerdo con las dos ecuaciones anter¡ores: 14.25t
Finalmente, si las concentraciones de e y (es), definidas en Ias dos ecuaciones anteriorés, son sustituidas,en la Ecuación 14.2Ol;
r =tq.".[r, VN
Kx 1i
Donde: V, =
(rs)]
- k.(*1"'' VP
§
jltrr
f4 26t
KP
P -§-'+ Ka KP
[Ecu. 4.1 1]
kr.eo
-K*-\:
Vr=fk^ .Yu h
fEcu. 4.201
K, =
k.
t.k"
t4.271
dLteüt¡ación t4.261 es la"expres¡óri de la vélócidad-de una reacción enzimát¡ca reversible.
216
Eiemplo
4.5
Determinación de la relación entfe el caudal y el grado de conversión, en la isomerización de glucosa, en un feactor emPacado
Determinar el caudal afluente a un reactor (diámetro interno: 0,085 m; altura del lecho: O,425 m) empacado con glucosa isomerasa inmmovilizada sobre alÚmina o/o de glucosa en con tamaño controlado de poro, necesario para Convertir 40
fructosa. El reactor se alimenta, durante su instalación, a ¡azón de 6 ml/s,.con una mezcla
: compuesta por 36 Yo len peso) de glucosa pura (densidad de partícula: p, o/o dela 1544 kg/m3, y agua pura (p : 1000 kg.m3) encontrándose que el24 glucosa es convertida en fructosa. Solución:
1. Velocidad de la reacción. La isomerización de glucosa hasta fructosa es una reacción enzímática reversible catal¡zada por la enzima glucosa isomerasa. En condiciones de equilibrio la
mezcla de glucosa y fructosa está formada por 52 7o de glucosa y 48 % de fructosa. Las constantes KM y K, son aproximadamente iguales a 0,005 M, (Atai, 1989). Si se reemplaza, Kn
:
Kr, en la Ecuación ta.26l:
- Vp.p Kr+s+P
Vu.s
En el equilibrio,
r = 0, por tanto:
sE.V¡y
= P6'Ve
(1)
l2l
Donde, s¡ y pr: concentraciones de glucosa y fructosa, respectivamente, en el equilibrio. El balance de materiales del sustrato, es:
So:S+P
(3)
217
Oohde so;,§;,p: l'conéifti'rcñéñ,frñtFHf cle Strrstrato, de s'mtráüflibd y de susttqto snr'los;Éro(fuctG,. fespectivmrente.¡ i;.-'rij r '., i i, ,::;-'.ü:'
.\:.:'j6.
r \'-,..,.
Cuando se reemplazan las dos ecuaciones anteriores en la Ecuación (1), se obtiene:
Kr.+ §,
-',
,=-J"-.["-o.(",-")] \ ' Kx+sot \,' ds
dt
-
vx Klt *
so
,:
.ls.á -
l.
(5t
c)
Donde: úi. Q=-:-=
1
§.
P"
Además: s
:
so, ofl
t:
0; s = s, €o t
tI
J
: t.
Portanto:
,,trx *.s,
J
(6t
,,
h!'-á-" =:'', s.b-c Ko+so t=k,.t
t
La Ecuación (6) es la ecuación de diseño üe un reactor Je ¡ujo táDBn.
2.'volumentai'¡étná
r = f,.a2t '218
i
I
.'i,:.'::i,
=
.1.,
t,
I
r' | 1'f-l
f.{o.geslz.o,
, :; ".-
..
zs = 2,41.10-s ms
3. Tiempo de retención
v t=L=
2.41 -"'==4O1
o
6.1n-3
.7
s,
4. Concentrac¡ón del sustrato Base de calculo: 1 kg de mezcla (36 %, en peso;,de glucosa, y el resto agua)'
0,38 kg gfu.
* 1w ks.m-3 -o "-=
0,64 kB agua
looo kg
= g.73.16-4 m3
22-s
0'S ,=412,3kg.^-"
g,7g.lo-4
5. Concentración del sustrato efluente para una conversión de 24 7o de glucosa en fructosa: s : O,76.s..
6. Constante de velocidad, k (Ecuación A=
6):
:.
O,52 's¿= ---:---l -p. 0,48 = 1,08ÍB '
b = 1 + a = 2,0833:. c = d.so = 1,083Íl.so 2,0833.so -'-- - -. 1,0838.so , , ln "' (2,083ft). (0,76).s,.- 1,0833.s,
=k'.4O1,7
s
:;
k' = 1,7?f -1@ 0,"-t =,0,1035 (nhwo)-1 7. Velocidad máxima, V, (Ecuación 6):
b'v, K*+so Donde
i
b
- 2,OOS| I
-
L,
§, = 4123 g.(litrol-r
219
K¡r = 0,005 nol.180 c.(mol)-1 = g,g e.(litro)-l
vy = o34
d;Á
Puede obaeivarse, gn"este ejemplo particular, so So/K¡v
=
412,310,9
:
))
458,1
8. Caudal correspondiente a una conversión de 40 En la Ecuación (6) se réemplaza
.
s
-
"
o/o
de glucosa en fructosa:
0,6.so:
rn@ .:"@ñf=l't*Ó'I,--'t r = 1038.34
Kr:
-
Q = 2,g2
=tz)sto-s
V
141 litres''
oa
. 10-s litro §
9. lnactivación de la enzima. .i
--
Suponer que la actividad de la enzimá'inmovilizada en !a'columna disminuye gradualmente de acuerdo con'ta ecuación: ln (k/k") ': - ko.t. Hallar la velocidad de degradación, ko, de la enzima si la actividad enzimática, después de 60 dfas de operación, disminuye a\72,3 % del valor inicial.
m
*Ko = -
ko.t =
o'7?.3'k' 1¡1
tp = 5,4.10-s
Ko
=
- tp.fl)
(ilo\-1
Si el objetivo del proceso es mantener constante la calidad del producto, la velocidad de alimentación a la columna sé debe reducir al 72,3 % del valor inicial, después de 60 dlas de operación.
220
-
4.6
Determ¡nación de la relación entre la concentración de sustrato y el tiempo de reacción en un reactor por lotes empacado con enzima inmovilizada sobre un soporte Ejemplo
Calcular e! tiempo de reacción requerido para convenir 40 % de glucosa en fructosa, en un reactor operado por lotes. El reactor contiene 12 litros de una mezcla formada por 36 o/o, én pesO, de glucosa, y el restO agua pura. Realizar cálculos para so : 0, 1.Ky; so : K^r; so = 10.Kr; s" = 100.Kru y so : 458,1.KM. Solución
1. Velocidad de reacción. La ecuación de velocidad aplicable a este proceso es la Ecuación (6) del Ejemplo
4.5. Sin embargo, k' : Constante.
debe tenerse presente que en el Ejemplo 4,5, so
))
Krrr
y
2. Tiempo de reacción correspond¡ente a so = 0, 1.Kr. Los siguientes datos fueron tomados del Ejemplo 4,5: O,342 g.litro-1.s-l; c : (1,0833).s";b : 2,0833).s".
K, = 0,9 g.litro-l; V,
=
40 o/o de conversión de glucosa en fructosa os: s : 0,6.s". Cuando estos valores son remplazados en la Ecuación (6) del Ejemplo 4.5, se obtiene: La concentración de sustrato correspondiente a
,t'=0,7196t t=2,49s
221
S.fiempo de reacciónco[rgspondier-¡e a so =
:i
Kur
=
o,9
s.l{1ro]r1.
,'.1,ro='k,.t=#*#, .
k'=
0,3958
i
,
,,_'
t = 4,53 s
4. Tiempo dq reacción correspondienite,F so = 10.KM = 9 g.(litro)-r. I
1,792 =
*,., = 2'o9-'o'lP., 0,9+9
t'=0,07196i t=24,9s ,,: .,
5.'Tiempo dé reacci6n correspond¡éate'a.-s" ,:l
:
1OO.K^¡
:,rl
-r 1,7e2=fr'.r= 2'ffi';0#.,
I
+
9O g.{litro)
i"i
.:!
1".
i.
'
a ':; : . t,
i
k'=7,837.1O-s; t
r,
=228,7 s
,1_::-.
i
j
6, Tiempo de reacción correspondiente a s" = 458,1.K¡,,, = 412,29 g/litro. 1.792 = p,., ._
i..,
., = 2,083'0,u2 + 0,0
412,N
,,
x'=t..,7?7,{-3i r = 10,3§#s Este tiempo de reacción es igual áJ,t¡empo de retención en el reactor de flujo continuo descrito en el Ejemplo anterior. .tr.ir
tz?2
_l
4.3.3 Modelo de inhibición
competit¡va
La inhibición es un mecanismo fundamental de regulación qulmica de la actividad enzimática, En el caso de inhibición competitiva el inhibidor y la molécula de.,sustrato compiten por el mismo sitio activo de la enzima. El inhibidor que puede ser una especie inerte, un producto de la reacción, o el mismo sustrato, se une con la enzima, en el sitio act¡vo, formando un complejo no reactivo. El modelo de inhibición compet¡t¡va, considerado en esta Sección, se fundamenta en las siguientes ecuaciones:
ES
E+ ES
I (==:) --k-->
EI
P+
KS
K
t4.281
E
Donde, S, E, ES, l, El, P: representan elsustrato, la enzima, el compleio enzímasustrato, el inhibidor, el complejo enzima-inhibidor y el producto, respectivamente; K., K,: constantes de disociación de los complejos enzima-sustrato y enzima-inhibidor, respectivamente. La ecuación de balance de materiales de la enzima es:
co=e+(cd)+(es)
t4.291
Donde, eo, e, (ei), (es): concentración inicial de la enzima, de la enzima libre, de la enzima en el complejo enzima-inhibidor y de la enzima en el complejo enzimaSustrato, respectivamente. Si la ecuación anterior se divide por eo, se obtiene:
1--fB*fa*Fs
fr=
e eo
ifer=*rrr= ?
t4.301
fs=1-(fw*f'') 223
Si las reacciones que conducen &.la{ftrmación de ltis:compléjos,,(eil, Í.(es), están en equilibrio, la velocidad de la reacción, en condiciones estables, es:
¡=-ds
.dtd .:
. -:,
,.1t
,ifs
, = Its
=+=k.co.f6,
¡ .
O.ls,
:.r' i'..¡ tF.r =
: !
,.)
l,
Urr,
Eondé, bi i: cáncéntacióh motar dÉ'sustráto étnhiU¡Uor, reépectiváinente. .-¡lj:,'",
De
.\
/
fs*fn=f"-l 'o 'u 'D (rr" *-!-l Kr)
t4.321 '¡i
,,!
t4.33I
+- s x. i
:- ,-,.*
,t
-
,
\i j arr"-il
¡:t_
§i f.. de ta ecuación ante¡ior se reemplaza en la.ecüacióá de la velocidad..de reacción, Ecuación [4.35], se obtiene: t.
'it-
r = k.eo.fu = li
".r, Kn"
224
Vv's
cr.s
s+K*¿ (r
,É)
! *; (' .¿)
f4.341
Donde,Vr:k.eo,(Ecuación4.14t.; Kr.:constantedeMichaelis.modificadapara inhibición competit¡va. Elefecto de la inhibición competitiva es aumentar el valor de la constante aparente de Michaells, sin alterar el valor de la velocidad máxima, Vr, de la reacción.
4.3.4 Modelo de inhibición
no compet¡tiva
En el caso de inhibición no competitiva la enzima se une en sitios act¡vos diferentes con el sustrato y el inhibidor., Frecuentemente el inhibidór se une con la enzima en un sitio esencial para su función. Las reacciones básicas del modelo considerado en esta Sección, son:
S + E (::=) E+I
€¡+
(===) -" ='
ES EI ?
+.e EIS
rA)
Ks
t4.35.a1
K
t4.35.bI
Ks
t4.35.c]
K
t4.35.dI
Donde, S, E, ES, l, El, EIS: representan el sustrato, la enzima, el complejo enzima-sustrato, elinhibidor, elcomplejo enzima-inhibidor, y elcomplejo enzimainhibidor-sustrato, respectivamente. Se supone que la presencia de sustrato o de inhibidor en el entorno de la enzima no interfiere la unión del sustrato o del inhibidor con la enzima. Por consiguiente, las constantes de disociación, K. y K,, de los respect¡vos complejos binarios (Ecuaciones 4.35.a y 4.35.b) son idénticas a las constantes, K. y K,, de las reacciones 4.35.c y 4.35.d. La ecuación de balance de materiales de la enzima, es:
eo=€+(ci)+1¿s)+(eis)
t4.36I
225
Donde, €o, e, (es), (eil, (eis): concentración inicial de la enzíma, de enzima libre, de enzima'en el complejo enzima-sustrato, de enzima en el complejo enzima-inhibidor, y de enzima en el complejo enzima-inhibidor-sustrato, respect¡vamente. En condiciones estables la ecuación de la velocidad de la reacción se obtiene mediante un procedimiento similar al de la Sección 4.3.3:
Va's
.t| +-
Kr Vaxc-s Ks*s - Ks*s
a4.371
Donde:
14.37.A1
Donde, Vrr.: es la máxima velocidad de la reacción. La inhibición rio compet¡tiva disminuye la velocidad máxima, Vr, por el factor (1 + i/Kr) sin afectar el valor de la constante aparente de Michaelis.
Ejemplo
4.7
Determinación de! tipo de reacc¡ón enzimát¡ca y evaluac¡ón de las constantes características
En las-dos primeras columnas dd las Tablas
4.9 y 4.1O se presenta un resumen de los datos experimentales de la hidrólisis del almidón con o- amilasa, obtenidos por Dawes (1967). l-ss datos de la tabla 4.9.corresponderi a la hidrólisis en presencia de maltósa como inhibidor (concentración i : 12,7 mg.ml-1). Los datos de la Tabla 4.10 corresponden a la hidrólisis en presencia de a-dextrina como inhibidor {concentración i : 3,34 mg/ml}. Determínar, a part¡r de la representación gráfica de los datos por el método de Lineweaver-Burk, el tipo de inhibición, compet¡tiva o no, y las constantes características, K, y V* en cada caso.
226
4.9 Datos de la hidrólisis del almidón en presencia de maltos¿ li = 12,7 mg/ml), (Dawes, 1 967); s: concentración delsustrato, mg/ml; r: velocidad relativa de la hidrólisis. Tabla
I
s
10, 00
,0 7! ,4 62 ,5 7'7
7,70 5,26 4 ,55 3,33 2 ,0,4
58, 9 57 ,4 38,9
.
1,89 L,67
1/s
1l¡
0, 10 0, 13 0,19 0,22
0,013 0, 014 0, 016
o,ol7
0,30,
0, 019
,49 o, 13 0,50
0
0
,0 34,2
37
,026
,0 , 027 0
,029
Figüra 4.10 Representaci6n gráfica de t-ineweaver-Burk conespoñdiiinte a fa hidrólisis del almidón con o-amilasa. Llnea continua: hidrólisis en presencia de maltosa. Línea a tra.zos: hidrólisis en ausencia de inhibidor (Figtrra 4.6). t
,.?o
1,/,
o.o3
o.o2
o.o1
o.2
-o.2 7
248
0.4
/s, m//mg
,i
El intercepto sobre
el e¡e l/s, !ínea a trazos de !a Figura 4.11, es:
- (1/KMl = - O,28. Portanto:
Krvr
:
3,57 mg/ml.
Él'intercepto sobre el eje l/s,línea continua de la Figura 4.11, es: ' : (1 lK,,l : - 0,2. Por tanto Kr,¡ = 5. Puesto que la inhibición es competitiva, este valor corresponde a la constante de Michaelis modificada para inhibición competitiva, Kr", El valor de la constante K, según la Ecuación
4.34, es:, i'¡
K¡rc
=r,.(1 .
É)
=
t ={s,sz).(r.?)
Kt = 8,34 nglrnl
:
4.10 Hidrólisis del almidón en presencia de a-dextrina (i 3,34 mg/ml), (Dawes, 1967): s: concentración del sustrato, mg/ml; r: velocidad relativa de la hidrólisis.
Tabla
s
33,30 20, 00 L2 ,90 10, 00 6 ,06 3,,.64
,82 ,84 1,60 t ,43
2
L
I l_16 , 0
109,0 L02 ,0 85, 5 '7]- ,5 55,6 4'l ,6 35, 5 32,2 29,5
1ls 0,030 0, 050 0 ,077 0, 100 0, 165 0,275 0.355 0, 543 0
o
,625 ,599
llt
,
8,62,L0
3
9,17.10-3
9,80.10-' 11,70.10-3 13,99.10-3 17, 98 . 1o'' 21, 00 .10-' 28, 09.10-3 31, 05.10-3 33, 90 .10-3
229
2, lnhibición por o-dextrina.
La Figura 4.1 1 es un diagrama de Lineweaver-Burk, constru¡do con los datos de la Tabla 4. 1 0. La curva correspondiente a la a-dextrina se representa junto con
la curva obtenida en ausencia de inhibidor, (Figura 4.6, Ejemplo 4.4l..
Figura.,4.11 Representación gráfica de Lineweaver-Burk correspondiente a la hidrólisis del almidón con o-amilasa. Lfnea continua: hidrólisis en presencia de o-dextrina, Lfnea a trazos: hidrólisis en ausencia de inhibidor (Figura 4.6), o.o4
1/r
o,o3
o,o2
o.o
1
o.2 0.4 1/s, ml/mg 4.11 puede observarse como la presencia de a-dextrina origina un mayor valor de la pendiente y un menor valor del intercepto sobre el eje l,/s, sin En la Figura
afectar el valor del intercepto sobre el eje I /r. Por consiguiente, la inhibición es competitiva. El intercepto sobre eleie l/r, de las dos curvas de la Figura 4.11, es (1/V") : O,OO77. Por tanto: V,u : 129,9 (sin inhibidorl.
230
4.3.5 Modelo de inhibición por sustrato
La inhibición por sustrato es uno de los mecanismos comunes de regulación de la actividad enzimática de la célula. Generalmente a bajas concentraciones, la unión de una'molécula de sustrato con la enzima, en uno de sus sitios activos,
aumenta aparentemente la afinidad de la enzima por otras moléculas de sustrato, incrementandose la velocidad de la reacción catalizada hasta alcanzar una máxima concentración de sustrato. Cuando se sobrepasa esta concentración crftíca, disminuye la velocidad de la reacción. En algunos casos el exceso de sustrato influye sobre la presión osmótica y la consigu¡ente desh¡dratación de la célula inhibición por sustrato, considerado en esta Sección, se fundamenta en las siguientes ecuaciones: El modelo de
S+
E--->
S+
ES
--->
ES
SES
t4.38.a]
kl k2
ES -k-->E+P
t4.38.b] t4.38.c]
Donde, S, E, ES, SES, P: representan el sustrato, la enzima, el complejo enzimasustrato, el Complejo Sustrato-enz¡ma-Sustrato, y el producto, fespect¡vamente;
kr y k, son las constantes de disociación del complejo enzima-sustrato y
del
complejo sustrato-enz¡ma-sustrato, respectivamente. La ecuación de balance de mater¡ales de la enzima es:
€n=c+(es)+(ses)
't4.391
Donde, eo, e, (es), (ses): concentración inicial de enzima, de enzima libre, de enzima en el complejo enzima-sustrato, y de enzima en el complejo'sustratoenzima-sustrato, respectivamente. Si la Ecuación t4.391 se divide por eo, se
obtiene:
¿
,r-=f¿*frs*fses
231
Dickensheets et al., 1977, simplifican la ecuación de Andrews para el caso de inhibición a elevadas concentraciones de sustrato:
lsl r Kr.V*
Vx
t4.431
La representación gráfica de 1lr vs s, corresponde a una recta cuya pendiente
es: 1/(K,.Vrr).y cuyo ¡ntercepto es 1/Vr' sustrato, s6¡, €n el modelo de inhibición por sustrato, se alcanza en el punto correspondiente a dr/ds = 0. Por consiguiente, de la Ecuación 14.411: La concentración crítica de
d, =o ds
=
--
"
(+
.i. r)'( 3 . +)
Pa¡a: ü = O :,s=.scn ds
k1 V'-:='s2k2 Por
4.4 REACTORES
1
14.41
tantot sc¡ = $:1, = ,lk.t*,
ENZIMATICOS
El propósito de esta seciión es analizar algunos factores tales como caudal, tiempo de retención y productividad, relacionados con el diseño y operación de reactores donde ocurren transformaciones bioquímicas orig.inadas por la acciÓn de enzimas. Se supone que la reacción enzimática se desarrolla de acuerdo con el modelo de Michaelis-Menten. En el Cápítulo 5 se analizan algunos reactores doñde ocurren fermentaciones cuya cinética corresponde al modelo de Monod'
233
permanece constante en cada punto con respecto al tiempo. En este caso la concentración de sustrato sa evalua de acuerdo con la Ecuación t4.451. Sin embargo, como la operación es continua el tiempo de retención se calcula según la ecuación: Y
t4.46t
F Donde, V: volumen útil del reactor, litros; F: caudal, (litros)/minuto.
Ejemplo
4.8
Simulación de la hidrólisis del azúcar de caña por acc¡ón de la enz¡ma invertasa
La hidrólisis del azúcar de caña (sacarosa) por acción de la enzima invertasa,
obtenida
a partir de levadura, produce
canti{ades iguales de glucosa y
fructuosa:
C6H12O6 sacarosa (PM : 342,31
+
glucosa (PM.
:
180,16)
c6H12o6
fructosa (PM : 18O,16)
-
14.471
Suponer qué por las necesidades del mercado se requiere la producción de 84O0 kgidía de producto (glucosa + fructosa) a partir de una soluiión deosacarosa (concentración 80 g/litro). Se dispone de varios reáctores de 4000 litros de volumen efectivo operados en forma continua como reactores ideales de flujo tapóñ.
Deducir la relación entre el número de reactores, el caudal, el tiempo de retención y la productividad, con el propósito de alcanzar un porcentaje de conversión de sacarosa en producto superior at 95 %. Solución En la Tabla 4.11 se presenta el programa C:\|SIM\INVTSA1.SlM, y en la Tabla
4.12 el programa C:\GWBASIC\INVTSA1.BAS, elaborados a part¡r de la ecuación de Dickensheets et'a1., 1977 y los siguientes parámetros obtenidos mediante regresión lineal de los datos suministrados por Bowski et al.. 1971, para la enzima invertasa en solución (Tabla 4.15 y Problema 4.5):
235
: /'
'Vn
-
0'99 gi(litro'minuto)
K, : 123 gr/litro Kr = 177 gllitro
Los programas INVTSAl .SlM e INVTSAl .BAS producen resultados similares, los
cuales'son representados gráficamente en las Figuras 4.12,
y
4'13'
Tabla 4.1 1 Simulación de la hidrólisis del azÚcai de caña por acción de la enzima invertasa a bajas concentraciones de sustrato. Modelo de Michaelis-Menten, Programa C:\lSlM\ lNVTSAl,SlM.
:IÑVTSAl,SIM :Cinetica de la invertasa a bajas concentraciones :de sustrato. Modelo de Michaelis-Menten :Simulacion de un reactor ideal de flujo tapon CONSTANT CONSTANT CONSTANT CONSTANT CONSTANT CONSTANT CONSTANT CONSTANT
KM
:
VM
:0.99: g glucosa/(litro.minuto)
1
23: g/litro
:'177 : g/litro V0=4000: Volumen efectivo del reactor, litros P0:840O: Demanda de producto, kgidia S0 = 80: g sacarosa/litro T0 = 0.1 E-4:Tiempo inicial, minutos Kl
CINT:
O.O1
SIM INITIAL
S=S0
V: V0 T:TO DYNAMIC
S'= RS *2lKlll: Ecuacion de Andrews, 14.421 RS =-VM*S/(KM + S + (S* X:100"(SO-S)/S0: Porcentaje de conversion de sacarosa P :2* 1 80. 1 6"(S0-S)/342.3: Producto, gilitro 236
F:Y
lT: Caudal, litros/minuto :60*P/T:Product¡vidad del reactor, (g producto)/(litro.hora) NUM:O.Ol O4T"PO1|PD +0.00001):Numero de reactores (de 4000 litros c/u)
PD
OUTPUT T,S, P,X,NUM, PD,
§ VAL § vAL
TFIN = NOCI
F
600.00 1000.0
Simulación de la hidrólisis del azúca¡ de caña por acción de la enzima invertasa a bajas concentraciones de sustrato. Modelo de Micha'elis-Menten. Programa C:\GWBASIC \INVTSAI 'BAS. Tabla
4.12
1O REM INVTSA1.BAS
20 REM Cinetica de la inveftasa a bajas concentraciones de sustrato' 30 REM Modelo de Michaelis-Menten 40 REM Simulacion de un reactor ideal de flujo tapon 50 KEY OFF 60 CLS 70 NN:1 80 REM ESCRIBIR LAS CONSTANTES: 90 KM:123
VM:,99 110K|:177 100
120 P0:8400 130 V0:4000 140 S0:80 150 REM PASO DE INTEGRACION: T1 160 T1 :.01 170 REM VALOR FINAL DE LA VARIABLE INDEPENDIENTE: T2 180 T2:600 190 REM INTERVALO DE IMPRESION DE LOS RESULTADOS: T3 200 T3:20 210 PRINT "INVTSAI .BAS" 220 PRINT 230 PRINT "Cinetica de la invertasa a bajas concentraciones de sustrato" 240 PRINT 250 PRTNT 260 PRINT "T: variable independiente (tiempo)" 270 PRINT "Valor final de ¡ , ¡) =";f 2 237
: '
280 PRINT 'T1 : paso de integracion, T1 : ";Tl 290 PRINT "T3: intervalo de impresion, T3:'l;T3 3OO PRINT
310 PRINT "PULSE ENTER!" 320 ANSS : INPUT$(1) 330 CLS 340 PRINT "RESULTADOS" 350 PRINT 360 PRINT "O(1): concentracion del sustrato g sacarosa/litro" 310 PRINT "P: concentracion de producto, g/litro" 380 PRINT 'CS: Porcentaje de conversion de sacarosa" 390 PRINT "F: Caudal, litros/minuto" 400 PRINT "NUM: Numero de reactores" 410 PRINT "PD:Productividad del reactor, (g productoli(litro.hora) 420 PRTNT 430 REM NUMERO DE ECUACIONES DIFERENCIALES: r' 440 N=1 450 REM CONDICIONES INICIALES: 460 0(1):80 470 REM SUBRUTINA DE RUNGE-KUTTA DE ORDEN 4: 480 T: INT(T2[T1 +.5):T1 :T2|T:T: INT(T3/T1 +.5):T3:T"T1 :T =0:T4:0 490 T8: 1 :GOTO 730 500 |F{T-T4 +T1110)<0 THEN 540 510 T4 =T4 +T3:T5 : |NT(T/T1 + .5):T:T5*T1 : GOSUB 920 520 |F(T-T2 +T1110)<0 THEN 540 530 LOCATE 23,1:END 540 0N TB GOTO 560,600,640,680 550 PRINT"** ERROR """;STOP i 560 FOR T5=1 TO N 570 T0(T5) :T1 *l(T5):T6(T5) : O(T5):O(T5) : O(T5) + T0(T5)/2 580 NEXT T5 590 T=T+T1 |Z:T9:2:GOTO 730 600 FOR T5:1 TO N 610 T7 =T1 *l(T5):T0(T5) : T0(T5) + 2"T7:O(T5) :T6(T5) +T712. 620 NEXT T5 630 T8:3:GOTO 73O 640 FOR T5:1 TO N 650 T7 :T1 "t(TS):T0(T5) :T0(T5) + 2"T7:O(T5) :T6(T5) +T7 660 NEXT T5 670 T8:4:f :T +T1i2:GOTO 730 .,1
¡
238
680 FOR T5=1 T0 N 690 O(T5) :T6(T5) + (T0(T5) +T1 *l(T5))/6 7OO NEXT T5
710 T8: 1 :GOTO 730 720 REM ECUACIONES DIFERENCIALES: 730 l(1 ) :-VM*O(1 )/(KM + O(1 ) + (O(1 ).O(1 )/Kl)) 7 40 P : 2* 1 gO.1 6* (S0-O( 1 » t342.3 750 CS : 1 0O"(S0-O(1 t)/So 760 rF T:0 THEN T:.00001 77O PD:60*P/T 780 F:Vo/T 790 lF PD =0 THEN PD: '00001 800 NUM:.01042*PO/PD 810 GOTO 500 820 PRINT 830 PRINT SPC(3); "T : " ;T;SPC(3);'O( 1 ¡ : " ;O( 1 );SPC(3);
:
"
;CS;SPC(3)
840 NN:NN+ 850 RETURN
4.5
;
" NUM : "
; NUM;SPC(31;' PD
:
"P
"; PD;SPC(f, ); " F
: " P; SPC(3); "CS :" F ;
;
1
CATALISIS ENZIMATICA EN FASE HETEBOGENEA
Una enzima inmovilizada es una enzima física o químicamente asociada, o contenida, en un soporte o matr¡z, usualmente sólido, no. esencial para su actividad, Woodward, 1 985; Fukushirna et al., 1988. Generalmente los sistemas de inmovilización de enzimas suelen clasificarse de acuerdo con eltipo de interacción entre enzima y soporte en químicos y físicos. .
239
Figwa 4.12 Representación gráfica de la productividad, el porcentaje de conversión y el número de reactores en función del tiempo de retención. Simulación de la hidrólisis delazúcar de caña por acción de la enzima invertasa a bajas concentraciones de sustrato. Programas: C:\lSl M\l NVTSA 1,SlM y C:\GWBASIC \lNVTSA1.BAS., elaborados según el modelo de Michaelis-Menten. 250
25
200
150
'1
00
50
0
100
200
300
Trempo de rele
4.5.1
nc io
400 n,
m in
500
utos
lnmoVilización por métodos quím¡cos
- Enlace covalente: La inmovilización se realiza mediante el enlace covalente de moléculas de la enzima vía residuos aminoácidos no esenciales a soportes funcionalizados insolubles, Los grupos funcionales de los residuos aminoácidos no esenciales apropiados para el proceso de inmovilización sgn los grupos libres a, B o r carboxilo, los grupos a y B amino, y los grupos fenil, hidroxil, sulfidril
o imidazol. Otra
variación de la inmovilización por enlace covalente es la
copolimerización de la enzima con un reactivo monómero. Según Zaborsky, 1973, los soportes insolubles en agua, empleados con mayor frecuencia para
la unión covalente con la enzima, son los soportes naturales tales como
la
agarosa (sefarosal, celulosa, dextrano (sefadex), vidrio y almidón, y los soportes sintét¡cos tales como los polímeros basados en acrilamida, en anhídrido maleico,
240
en ácido metacríl¡co y estireno, y los polipéptidos. Normalmente los polímeros naturales y sintéticos antes de agregarse a la enzima son activados mediante un tratamíento con reactivos. Otros polímeros como los copolímeros del anhídfido maleico sólo requieren entrar en contacto de la enzima para inmovilizarla.
-
Entrecruzamiento de la enzima con un reactivo multifuncional como el glutaraldehfdo con el propósito de producir un derivado insoluble. - Adsorción de la enzima sobre la superficie de un soporte insoluble seguida de
un entrecruzamiento intermolecular para ¡efo¡zar la unión. Los adsorbentes empléados con mayor frecuencia (Zaborsky, 1973) son: alúmina, resinas de intercambio iónico, carbonato de calcio, carbón, celulosa, arcilla, colágeno, tierra de diatomeas e hidroxiapatita.
4.13
Representación gráfica de las concentraciones de sacarosa y de producto y del porcentaje de conversión en función del tiempo de retención. Simulación de la hidrólisis del azúca¡ de caña por acción de la enzima invertasa a bajas concentraciones de sustrato. Programas: C:\|SIM\INVTSAl.SlM y C:\GWBASIC\INVTSAl .BAS., elaborados según el modelo de Michaelis-Menten. Figura
100
Co ncentracro n, g/ lrtro
'r
00
200
300
400
50c
Trempo de retencion, mrnutos
241
4.5.2 Métodos físicos
- Adsorción física de la enzima mediante el contacto de una solución acuosa de la enzima con el adsorbente. Elestado de inmovilización de la enzima depende del pH, intensiijad iónica y temperatura de la solución. El proceso es reversible
pero el enlace con el soporte es débil y la cantidad de enzima cargada por unidad de masa de soporte es usualmente baja.
-
Confinamiento de la enzima dentro de rnicrocápsulas de una membrana semipermeable. La solución acuosa de la enzima se agrega al reactor agitado que contiene el solvente orgánico con un copolímero y un agente de superficie. La membrana de polfmero se forma en la superficie de separación lfquido-lfquido mientras la fase acuosa queda dispersa en pequeñas gotas. Este método de inmovilización preserva las propiedades intrfnsecas de la enzima. El confinamiento de la enzima también se puede lograr mediante su inclusión en
una matriz (gell, tal como el gelde poliacrilamida utilizado en la inmovilización de glucosa isomerasa, glucosa oxidasa, alcohol deshidrogenasa, ureasa y otras enzimas. En la mayorfa de los métodos de inmovilización la enzima se encuentra asociada
a un sopofte sólido. Por consigu¡ente, estos sistemas deben analizarse como un proceso de catálisis heterogénea dado que reactivos y productos se encuentran en fases distintas. Además, el microamb¡ente del catalizador dífiere de las propiedades del seno del liquido donde son evaluados los efectos de la reacción. La cinética de enzimas inmovilizadas es la resultante de la superposición del fenómeno cinético "intrínseco" de la enzima en su microambiente, del fenómeno
de transporte de reactivos desde al seno del llquido hacia la superficie del biocatalizador y viceversa. Estos fenómenos combinados matemáticamente originan las expresiones cinéticas representat¡vas de la acción de la enzima inmovilizada.
242
4.5.3 Enzimas inmovilizadas sobre la superficie de una partícula insoluble
Cuando la enzima se inmoviliza sobre la superficie de una.partícula insoluble, la resistencia a'la transferencia de masa entre el seno del fluido y la capa lfquida relativamente no mezclada alrededor de la partícula se agrega a la resistencia por difusión a través de esta capa.
La velocidad de transferencia de masa es proporcional a la diferencia de concentración:
/Vr=fr./.(s,-s)
14.481
Donde, N.: velocidad de transferencia de masa, (mol sustrato)/s; Kr: coeficiente de transferencia de masa, m/s; A: área superficialtotal de las partículas, m2; so: concentración del sustrato en el seno del fluido, (mol sustrato)/m3; s: concentra-
ción del sustrato en la superficie de la partícula.
La velocidad suministro de sustrato per transferencia de masa, durante la reacción enzimática, es igual a la velocidad de consumo de sustrato. Por consiguiente, en el caso de una reacción enzimática que sigue la ley de Michaelis-Mentenl
r"
=
K".c.(so - s)
Yu.S =
Ky+§
f4.491
Donde, r.: velocidad de la reacción, (mol).m'3.s-'; Vr,¡: velocidad máxima de la reacción, mol.m-3.s'1; Kr: constante de Michaelis-Menten, mol.m-3; a : A/V; Á: área superficial total, m2; V: volumen de la solución, m3. La ecuación anterior expresada en forma adimensional se convierte en:
1-z
B.z
DA =1+B.Z
t4.50I
243
Donde
Z=~;
so Donde, el número de Damkóhler, DA, es la relación entre la máxima velocidad de reacción y la velocidad de transferencia de masa. En el caso de DA < < 1 predomina la velocidad de transferencia de masa sobre la velocidad de la reacción y la reacción global es controlada por la reacción enzimática:
[4.511
Si DA > > 1, preqomina la velocidad de reacción sobre la velocidad de transferencia de masa y _la reacción global es controlada por la velocidad de transferencia de masa:
[4.521
La disminución de la velocidad de reacción por la resistencia a la transferencia dJ3 masa se expresa mediante el factor de efectividad IJ, definido como la relación entre la velocidad real de la reacción y la velocidad de la reacción no frenada por difusión:
TJ =
V.11.S
B.Z
K 11 +s
1 + B.Z B 1 +B
V.w.SB KM +ss
[4.531
Si Z = 1 , la concentración sustrato en la superficie de la partícula es igual a la concentración de sustrato en el seno del fluido, /J = 1, no hay limitación por transferencia de masa. Si Z - > O, /J - > O y la velocidad de transferencia de masa es muy !enta comparada con la velocidad de la reacción.
244
4.5.4
Enzimas inmovilizadas por copolimerización o microencaPsulación
En el caso de enzimas inmovilizadas por copolimerización o microencapsulación
se presenta una res¡stencia adicibnal interna a la transferencia de masa que afecta la actividad interna de la enzima inmovilizada'
4.5.5
Balance de materia
El siguiente modelo, denominado "modelo
d¡stribuido" se fundamenta en las si-
1 - La reacción ocurre en cualquier punto de
guientes suposiciones {Lee, 1 992): la enzima; 2- La cinética de la reacción es similar a la observada con la enzima libre; 3- La transferencia de masa en la enzima inmovilizada ocurre mediante
difusión molecular; 4- No hay limitación a la transferencia de masa en la superficie exterior de la enzima inmovilizada; 5- La enzima inmovilizada es esférica. El balance de materia, en condiciones estables, correspondiente a una partícula esférica permeable de radio Ro entre R y (R + dR), si se supone constante la
difusividad efectiva D., del sustrato dentro de la partícula, se expresa mediante la ecuacién:
(-
4,-R1^ ( # " =
r"
#a-r-n'z),¡+df,)
(4.n.R2.dn)-r,
f4.541
Si esta expresión se divide por 4.n.dR y se reordena:
,,.[^'.4) 'I d/r*.*r l*'.*)l \ di*l=R2-rs dR
245
Y en el límite cuando dR
-.)
O
(n'.e )=n,..-¡ D-.d "dR\ dR)
'' (#.*#)=,,
t4.s5I
4.5.6 Gonsumo de sustrato de acuerdo con Ia cinética
de
Michaelis-Menten ta vel¡¡c¡dad de consumo de sustrato, si se supone que la cinética ¡ntríQseea de
la reacción local de la enzima inmovilizada sigue la.ecuación de MichaelisMenten, es: [4,561.
'
Vu=e.P.g
.
:':
Donde, Vr: velocidad máxima de la reacción; e: actividad de la enzima inmovilizada, (pmol sustrato convertido).s-l.(gmol enzima)'l; p: densidad del soporte, (g soporte).(volumen de soporte)-l; q:; carga,.de enzima, (¡rmol enzima).(g soporte)-1 Si se reemplaza la Ecuación t4.561 en la Ecuación [4.55] resultado en forma adimensional, se obtiene:
d"z
dtr
246
z - n?.r, *zT dz = 9.ó2 dT 1+B.Z Ds.s,
y se expresa
el
r4.s7l
Z=§
§o
ó=
B= s
T=R
KL'
Ro
( v" \'o 3
R'
l\Ds.r¡f
t4.s8l
)
Donde, ó: modulo de Thiele; Ro: radio de la partícula esférica (soportel. Las condiciones de frontera asociadas con la Ecuación [4.57] son:
(*^)r=o=o I s=soen R=Ro Estas condiciones expresadas en forma adimensional se convierten en:
(4\=o \dr )
. en r=R" Ro
.'1
Z=1 ,enT=1 Donde, R": radio crft¡co; la concentración de sustrato es
s
:
0 en R
:
Rc.
La velocidad global de consumo de sustrato en una partícula esférica con enzimas inmovilizadas es:
vn=+''(#)*-o,
t4.59t
Donde, V^: velocidad observada de consumo de sustrato; Ar/Vr: relación entre el área superficial y el volumen de la partfcula, (ApNp) : 3/R" para partículas esféricas. La Ecuación t4.591 expresada en forlna adimensional se convierte en:
3.s..Dt (¿2 \ vn=_#l= | ^ RÍ \drltr-t
t4.601
247
La Ecuación t4.561 expres.gda en forma adimensional se conviefte en: Vo=
Yy.§o Kr+so
Yx.Bo
1+Bo
t4.61I
Donde, Vo: velocidad de la reaccíén correspondiente a la concentrac¡ón de sustrato So prevaleciente en el seno del fluido. La velocidad máxima de la reacción, expresada en función modulo de Thiele, es:
Ro'.v* nl .vu.n" t2=g4.Kr= e g-Dr*,
Vv=
9.S2.Dr.s,
f4.621
n3-n,
La velocidad de la reacción no frenada por difusión se obt¡ene mediante el reemplazo de V^, de la Ecuación f4.62) en la Ecuación [4.61]: Bo ,, _ 9.Q2 .Dr.so'1-4
"-
*?"4
t4.6sl
Elfactor de efectividad, n, se define comó la relación entre la velocidad real de la reacción (Ecuación t4.601) y la velocidad de la reacción no limitada por difusión (Ecuación t4.631):
(**),=, 14.64t
fl
'*H"] 248
4.9
Determinación de la variación de la concentración de sustrato con respecto a la distancia radial para diferentes valores del modulo de Thiele. Efecto del modulo de Thiele sobre el factor de efectividad para partículas esféricas inmovilizadas, según la cinática de Michaelis Menten Ejemplo
Solución: La Ecuación 14.571, ecuación diferencial no lineal, se resuelve convirtiendola en dos ecuaciones diferenciales simultáneas de primer orden: dY
9.2.02
{T -=
1+B.Z
- 2.r T t4.651
dz dT
=y
sometidas a las siguientes condiciones de frontera:
R^ .sRY=O,'RsoR enT=-!i Z=ZO=-2,cn T=--Y=TO Z=1,en T=1 ,Donde: Z=!so Donde R": radio crít¡co; ZO
:
Sc/S".
La concentración de sustrato es S = S" en R : Rci S": concentración de sustrato en R = R". La concentración de sustrato es S : 0 para R < R.. El programa THIELE.SIM, resumido en la Tabla 4.13, resuglve el problema de valor límite planteado en la Ecuación [4;65]. El método numérico empleado convierte el problema de valor límite en un problema de valores iniciales. El programa requiere la suposición de los valores iniciales de ZO y TO de manera que Z = 1 enT:1. La instrucción: 1 SIM;INTERACT;RESET;GOTO /, asigna nuevos valores a las condiciones iniciales sidespués de cada simulación se ejecuta la instrucción GO.
249
-?
Este procedimiento, usualmente muy lento, sqacelera con la instrucción V/L. Esta instrucció.n permite al usuario del prggrama alimentar nuevos valores de las
condiciones iniciales de acuerdo con los resultados obtenidos al final de cada simulación. La simulación termina cuando los resultados obtenidos se ajustan a las condicionés de frontera, que en este ejemplo part¡cular correspénden aZ : 1 en T : 1. Los resultados obtenidos con elprograma THIELEI.SlM son'presentados en las Figuras 4.14 y 4.15. En la Figura 4.1 4 se presenta la variación de la concentración de sustrato con la posición radial en una partícula esférica para diferentes valores del modulo de
Thiele, Q, y de la relación BO
:
S"/Ku, según la cinética de Michaelis Menten.
4.15 se presenta el efecto del modulo deThiele, é, sobre el factor de efectividad, y diferentes valores de la relación BO : S./KM, según la cinética de Michaelis Menten, para enzima inmovilizada en partículas esféricas. En la Figura
Tabla
4.13
Programa C:\lSlM\THlELEl.SlM: Determinación de la variación de la concentración de sustrato con la posición radial en una partfcula esférica. Efecto del modulo de Thiele, É, sobre elfactor de efectividad según la cinética de Michaelis Menteri.
1:THlELEl.SlM 2: 3
:
Enzimas inmovilizadas
4:por copolimerización o microencapsulación 5:
6:Consumo de sustrato según Michaetis-Mgnten
8 CONSTANT CINT :O.OO1,T :O.OO1,TFIN = 1 9:
10 1 SIM;INTERACT;RESET;GOTO t 11 INITIAL 12 Y:0 1
3
T:TO
14ZO:ZO+AF '¡5 Z:ZO 16 B:BO 17 DYNAMIC 250
:
".
,i
4.5.7 Consumo de sustrato proporcional a la concentración
de
sustrato
La velocidad de consumo de sustrato expresada como una reacción de primer orden con respecto a la concentración de sustrato, es:
rs: K.S válidaParaS <<
t4.66I
KM
Donde, K: coeficiente de velocidad de primer orden, s-t; S: concentración de sustrato, g/litro.
Figura 4.15 Efecto del módulo de Thiele, Q, sobre el'factor de efectivr'dád, y diferentes valores de la relación BO : s./Kr. datos obtenidos con el programa THlELEl.SlM, según la cinética de Michaelis Menten, para enzímá inmovilizada en partículas esféricas, Efectlvidad
¡ \\r \
\:\ \\
:\ \
!\
Ll!!j.::.i: -t-¡-l
I
::ail
l"i"i"i'l{
o,ot o,o1
o,1 -E-BO-t
252
1
to
Modulo de Thlele
--+-8O.6
-4-AO -tO
100
14.711
t''e*),,=,, '
La velocidad de la reacción no frenada por difusión en los poros es K.so. Por consiguiente, después de diferenciar la Ecuación [4.70] 6on respecto a T y sustituir ta expresión resultante en la Ecuación 14.711se obtiene:
-
4.5.8
_ 3.0r.coth (3.Q,)-
1
14.721
Consumo constante de sustrato
Si la velocídad de consumo á" ,r"trrto es constante con respecto a
la
conceniración de sustrato (cihética de orden cero);
rs
= Ko paras > 0; válidaparas >>
t4.73)
KM
Donde, Ko: coeficiente de velocidad de orden cero.
Si K. se reémplaza eñ'la Ecuación t4.551'se obtiene: 'd?s
*2
d.R2,
ds
-Ko =O .R dR Ds
:
¡,q,1+l
:'i, i s > 0. Donde la concentración de sustrato s está limitada a medida queRtiendeaceroys: soen R: Ro; Ro: radiodelapartículaesférica. Por consiguiente: ,
Válida para
s
1 K".R:
14 s, 6 s,.D, l¡,2
254
=
_'.| ) )
-,
[4.75t
EI radio crft¡co R" por debajo del cual s vale cero se obtiene mediante el reemplazo de (s/s") : 0 en la ecuación anterior:
/
6.s-.4-
&=R.11-----s-i
t
r,''u
\12 I
f4.76t
)
La velocidad real de la reacción es:
* " (*: - nl ).r"
14.771
U
La velocidad de la reacción no frenada por difusión es:
14.78t
f,.".nl,.x,
Por consiguiente, el factor de efectividad, n, definido como !a relación entre las dos velocidades anteriores es:
q
=1-l-t rR r
f
t4'7el
/
Y después de sustituir la Ecuación f4.761en la ecuación anterior:
r¡=1_['H)-
t4.801
PROBLEMAS
4.1 La Figura 4.16 es una representación
gráfica de los datos obtenidos en un reactgr por lotes para la hidrólisis de almidón al3OYo con glucoa¡nilasa (6OoC, eo : 11600 unidades, volumen del reactor: 1 litro). Bailey y Ollis, 1986.
255
Calcular; (1) [a velocidad iniciá] de la reacción; l2l La unidad de actividad de glucoamilasa exprésada como la cAntidad de enzima que produce un mieromol de glucosa por minuto en una solución de almidón de Lintner al 4Yo a 60oC y pH 4,5, Figura 4.16 Representación gráfica de los datos obtenidos en un reactor por lotes en la hidrólisis de almidón al 30 % con glucoamilasa. Bailey y Ollis, 1986.
Glucoso producido, rng/rnl zvv
20
o
100 40 80 60 .Tiempo de reoccron, mrn.
120
140
,
4.2
El siguiente modelo c¡nét¡co describe la hidrólisis de la lactosa mediante lactasa obtenida a part¡r de Aspergíllus niger, Scott er a/., (1985):
---) ES ES --- k, ---) E + S E
+S
---k,,
ES ---kr---) E+P+O E+
EP '
i
-¡!
P---ko---) --- k,
---)
EP
E
+
P r
-
.
Donde, E, S, P, O: indican enzima libre, lactosa, galactosa y glucosa, respectivamente. ,
256
:
- Deducir la ecuación de velocidad para la producción de galactosa según el modelo de Briggs-Haldane, e indicar si la galactosa es un inhibidor competit¡vo o no compet¡tivo.
4.3
El siguiente modelo cinético describe la hidrólisis de la lactosa mediante lactasa obtenida a partir de Aspergillus niger, Yang y Okos, 1989:
E
+ S ---k,
---) ES
ES --- k, ---) E + S ES --- k. --) EP + O EP --- ko ---) E + P E + P --- k,
---)
EP
Donde, E, S, P, O: indican enzima libre, lactosa, galactosa y glucosa rbspectivamente. En este modelo primero se libera glucosa a part¡r del complejo enzimasustrato, y luego se libera galactosa a part¡r del complejo enzima-galactosa.
- Deducir la ecuación de velocidad para la producción de galactosa según el modelo de Briggs-Haldane.
4.4
En la Tabla 4.14 se presentan los resultados obtenidos por Eadie, 1942, en la hidrólisis de una solución de acetil col¡na (sustrato) con suero de sangre de perro (fuente de la enzima). La tercera columna de la Tabla presenta la velocidad inicial de la reacción en presencia de prost¡gm¡na como inhibidor, concentración: 1 , 5. 1 0-7 (moll/(litro) .
- Evaluar la constante de Michaelis y la máxima velocidad de la reacción de hidrólisís sin inhibidor mediante: (a) una gráfica de Langmuir, (b) una gráfica de Lineweaver-Burk, (c) una gráfica de Eadie-Hofstee. -
Evaluar la constante de Michaelis y la máxima velocidad de la reacción de hidrólisis en presencia de inhibidor mediante (a) una gráfica de Langmuir, (b) una gráfica de Lineweaver-Burk, (c) una gráfica de Eadie-Hofstee y determinar si la prost¡gm¡na es un inhibidor competitivo o no compet¡t¡vo.
257
Tabla 4.14 Datos experimentales de la velocidad inicial de la reacción de hidrólisis de acetil colina en presencia y en ausencia de un inhibidor, Eadie, 1942. Concentración de sustrato
mmol/litro
Velocidad inicial de reacción
mmol/{litro.minuto) Sin inhibidor
3,2 4,9 6,2 8,0 9,5
111 148
r43 766 200
Con inhibidor 59
7l 91
L11
r25
4.5
En la Tabla 4.15 se presenta información sobre la velocidad inicial de la reacción de hidrólisis del azúcar de caña por acción fle la en4ima invertasa a diferentes concentraciones de sustrato, obtenida por Bowski et al., 1971, con la enzima invertasa o B-fructofuranosidasa lE.C. 3,2,1 ,26) obtenida a partir de levadura. l-a cinética de la reacción a baias concentraciones de sustrato s¡gue el modelo de Michaelis-Menten. Sin embargo hay una concentración crítica de sustrato, entre 66 y 104 g/litro, según la cepa de levadura empleada como fuente de invertasa, por encima de la cual la velocidad de reacción es inhibida por el sustrato. Realizar un,análisis de regresión lineal con los 6 primeros datos de la tabla, y calcular la velocidad máxima V, de la reacción y la constante Kr, de Michaelis-
Menten: a) por el método de Lineweaver-Burk; bl por el método de EadieHofstee; c) por el método de Langmuir-Hanes; c) Dor elmétodo de Dickensheets et al., (Ecuación 4.43l.. Realizar un análisis de regresión con los últimos 5 datos de la tabla y calcular la constante de inhibición, K,, de la_ecuación de Dickensheets et al., 1977, (Ecua-
ción 4.43)
258
Bailey,
J.
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CAPITULO 5
CINETICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA, CONSUMO DE SUSTRATO Y FORMACION DE PRODUCTOS
El conocimiento de la cinética del cultivo permite predecir el desarrollo de la fermentación y evaluar rendimientos y productividades, datos importantes en el diseño de estrategias de producción y opt¡m¡zación de procesos. Las células consumen las sustancias nutritivas requeridas para crecimiento y las
convierten en nuevas células y productos metabólicos. La velocidad de estos procesos varfa con el desarrollo del cultivo.
A medida que las células crecen se acumulan en el medio los productos finales del metabolismo celular, Frecuentemente, estos componentes alteran el pH y la reologfa del medio, factores decisivos sobre la actividad celular y los mecanismos de transporte. Además, la población celular en crecimiento es heterogénea, y en cualquier momento, en cada punto del fermentador, coexisten células de
diferentes edades, con diversas funciones y act¡v¡dades metabólicas.
5.1
CRECIMIENTO DE BIOMASA EN UN CULTIVO POR LOTES
5.1.1 Densidad de la biomasa
La masa de una muestra se expresa como biomasa seca, esto es, la masa residual obtenida después de.someter la muestra a, un procedimiento estandarizado de secado, por la dificultad técn¡ca para remover el agua adherida a la superficie de un biomater¡al, sin retirarle tam.bién el agua interior.. La densidad de un biomaterial es la calltidad de biomasa seca presente, por unidad de volumen de biomaterial húmedo. Generalmente, el,agua constituye aproxinladamente el 8O% de la masa total y la densidad verdadera de un biomaterial, o sea, la masa total por unidad de volumen de biomaterial húmedo, es similar a la del agua. Por consiguiente, la densidad de un biomaterial es aproximadamente 200 kg.m-3 y su volumen específico es aproximadamente 0,005 m3.kg-l, (Fredrickson y Hu, 1989).
5.1.2
Etapas de! crecimiento
La evaluación del crecimiento microbial requiere la normalización de métodos experimentales para la obtención de datos confiables. En el cultivo por lotes, después de proveer las sustancias nutritivas al fermentador y suministrar los materiales y la energía requeridos para la síntesis de biomasa, se inocula el medio con una determinada cantidad de células viablés. El cultivo se desarrolla sin intercambío de materiales con los alrededores, excepto por la transferencia de gases tales como aire, CO, e Hr. El desarrollo de un cultivo por lotes bajo condiciones fisicoqulmicas adecuadas en un sustrato simple y homogéneo, libre de gradientes de concentración y de sustancias inhibitorias, donde las células se reproducen a intervalos regulares, puede representarse mediante una curva típica, similar a la Figura 5.1, en la cualse observan las diferentes etapas representativas de los qambios de la biomasa y de su ambiente.
264
5.1.3 Velocidad
específica
En los procesos de fermentación los microoorganismos desarrollan su a'ctividad vital en medios de elevada complejidad. El agente responsable de la transformación es una célula viva que asimila diversos materiales, se reproduce y produce otras sustancias, algunas de interés económico. uno de los aspectos más importantes del estudio de la cinética de estos procesos es la selección de métodos analíticos seguros para evaluar confiablemente las sustancias consumidas y producidas por el microorganismo y lá variación de su concentración con el tiempo.
La concentración de céfulas en el medio constituye una medida adecuada de la concentración del sistema enzimático responsable de la transformación. ,por esta razón las velocidades de consumo de sustrato y de formación de producto generalmente son expresadas como velocidades específicas referidas a la concentración de células:
l¡x
=
1dx xdtx^
1
t5.11
Donde, p^: velocidad específica de crecimiento del ffiicrg9¡96¡ismo, h-l; x: concentracién de células, (g células secas).litro-l; r¡: velocidad de crecimiento de las células, g.litro-t.h-1 . l¡s
=
1.& =1.r^ xúro
Í5.21
Donde, s: concentración del sustrato, (g sustrato).1¡tro-1; r": velocidad de consumo de sustrato, g.litro,l .h-'; /s: velocidad específicdde consumo de sustra.
to,
h-1;
1b 1 u,=;'á=;'',
i 4.
r
t5'3I
Donde, pr: velocidad específica de formación de producto, hora-l; p: concentración,del producto, (g producto).litro-1; rr: velocidad de formación de producto, g.litro-l.h-l.
266
Ejemplo
5.1
Determinación de las velocidades específicas de una fermentación
En las FigurEs 5.2, 5.3 y 5.4, se presentan los resultados obtenidos en una fermentación alcohólica, Borzani, 1975. Calcular las velocidades especfficas de crecimiento de levadura, consumo de azúcar y producción de etanol en el
tiempot:5horas. Figura 5.2 Representación gráfica de los resultados obtenidos en una fermentación alcohólica. Variación de la concentración de levadura, Borzani, 1975.
X, g/titro
4s6' Tiempo,
+
X vs t
:h
'--- dx/dt
t
:
3,45 g.litro-1. La concentracjón de células en el instante = 5 horas, es: x Figura la velocidad de crecimiento De acuerdo con la Ecuación t5.11y la [5.2], de levadura es:
.
dx _ (3,9
dt
- 2,6) g = 0.438 g.cé|. lino.h - 3)á
(1t
litro.(6
267
i1,
lrx
=
djf,33 3,45
=
0,126 ¡-r
Figura 5.3 Representac¡ón gráfica de los resultados obtenidos en una fermentaéíón alboh6lica.'variaciún de ta concentración de sustrato. Borzani, 197s,
34567 Tiempo, h
+
S ys t
---- ds/dt,
De acuerdo con la Ecuación t5.21 y la Figura [5.3], la velocidad de consumo de sustrato es:
_
ó = 100 - 70 =7j g. ulcar ú 7-9,2 "v ütro.h tzt
rt'=# |
( .
,
=2'ͧ ¡-t
,'1,-
De acuerdo con la Ecuación tb.31 y ta Figura [S.4], las velociiiades de produc_ ción de etanol sonl
4I-'= 20 - Ot = ¿75, g ctanot dt 8,2 - 3,5 "- lfuo.h
268
(3)
tx= dr = l¡r.x & Donde,
t5.4I
k¿.x
x: concentración de la masa celular, (g biomasa
seca).litro-r; r*:
velocidad de formación de biomasa, (g biomasa seca).litro-1.h-l; t: tiempo, horas; g^: velocidad específica de crecimiento de biomasa, h-1; ko: velocidad específica de muerte celular y metabolismo endógeno, h-1. Para un cultivo en la fase exponencial del crecimiento,
p* > >
kd, y: l¡t* - kol = El valor de px, constante durante el período de crecimiento exponencial, corresponde al valor de la pendiente de la curva de crecim¡ento en esta etapa:
!x,
añ la Ecuación
[5.4].
v-=+*=*u"o x=xo.en t=tue i t,=x,€n t=t Por tanto: ¡
= r,.€Xp
15.51
[pr. (r - tun))
Donde, tloo: duración de la fase de adaptación; xo: concentración de biomasa al final del periodo de latencia, (g biomasa seca).litro-1. Si la velocidad de crecimiento se caracter¡za por el número de células, en lugar de la masa celular, la ecuación anter¡or se convierte en: IV = /V,.exp [rrr.1r
- h")]
Donde, N: número de células o microorganismos viabres al tiempo número de células o de microorganismos viables al tiemBo t : tue.
15.61
t : t; No:
La ecuación [5.6] expresa el crecimiento exponencial de Ia biomasa cuando la concentración de sustancias y las condiciones fisicoquírnicas det medio de crecimiento permanecen constantes. En un cultivo por loteg los microorganismos modifican continuamente estas condiciones y afectan la concentración de biomasa.
270
dM
ú
= pu.4tc.R'?# = b.,.(S .n.p*)'o .uE'
Donde:
b. =
# i
bz =á1.(36.n
.pul'F t5.81
Portonto: M=(
"r^-?)t'
Donde, 9r y bz: constantes; Mo: masa de la pelotilla en el tiempo t : 0; t: intervalo de tiempo. La Ecuación [5.8] concuerda con observaciones experimentales según las cuales el crecimiento de los organismos filamentosos es proporcional al cubo deltiempo. La diversidad de la anatonomfa microbial y de las condiciones de crecimiento afecta la velocidad de crec.imiento. Generalmente, entre mas complejo es un rñicroorganismo, mayor es su tiempo de división celular. En la Tabla 5.1 se presentan datos delperiodo de reproducción de algunas especies de bacterias.
5.2
INFLUENC¡A DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA VETOCIDAD ESPECIFICA DE CRECIMIENTO
5..2.1 Temperatura
La'temperatura afecta la velocidad de Ias reacciones eelulares, la naturalezadel metabolismo, los requerimientos nutricionales y energéticos, y la composición de. la biomasa. Generalmente los microorganismos crecen en un intervalo de temperatura ambiente entre 25 y 3O'C. Sin embargo, existen microorganismos que se desarrollan a temperaturas inferiores a 0"C y otros a temperaturas superiores a 93"C.
272
É
El requisito fundamental es la presencia de agua lfquida. En la Antártida hay bacterias que se reproducen a 7"C, pero que se desarrollan a mayor rapidez a temperaturas entre 20 y 30"C, (Pelczar, 19771' En la Tabla 5'2 se presenta una clasificación de los microorganismos en términos de la dependencia de la velocidad de crecimiento con la temperatura.
Tabla
5.1 Periodo 1
de reproducción de varias especies de bacterias, Spector,
956.
Bacteria
Temperatura Periodq
Medio
oC
Caldo
37
B. thennophiTus Caldo
, 55'
BaciTTus mycoideis
de
reprodücción minutos 28
18,3
Escherichia coli
Cafdo Leche
37 37
t7
Lactobacíllus
Leche
37
65-
87
M. tubercuTosis
Sintético
37
192 -
932
Rhizobium Japonicum
Sales minerales + levadura
25
344 - 46].
12,5
acidophiTTus
Extracto
+
manitol
StaphyTococcus caldo:
37
2'7 -
¡0
aureus
Streptococcus lactis
Caldo + lactosa
leche
37 37
48 26
Trepoñema
Testículos de
37
1980
paTTidum
conej o
273
5.2.2 Energía
de activación
La temperatura, en el intervalo adecuado, inicialmente estimula el crecimiento de los microorganismos, y luego, cuando es demasiado alta, los destruye. La
ecuación de Arrhenius constituye una hipótesis apropiada para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento:
v¡¡=A.exp
(*) -r,.r* e)
t5.9I
Donde, ¡rr.: velocidad efectiva del crecimiento, veloc¡dad de síntesis menos velocidad de muerte, h-'; A, AD: factores de frecuencia, s-1; Eo: energía de activación'para crecimiento, kJ.(mol)-1, es la energía requerida para llevar las moléculas a un estado de energía en el cual puedan reaccionar; Eo: energía de act¡vación para muerte térmica, kJ.(mol)-l; R: constante de los gases, R : 8,314 J.(mol.K)-1; T: temperatura absoluta, K. La aplicación de la ecuación de Arrhenius a un proóeso microbiológico es un procedimiento cinético formal. Sin embargo, la complejidad del crecimiento microbial, entendido como una secuencia de reacciones, permite prever desviaciones de este comportamiento, Moser, 1988.
5.2 Clasificación de los microorganismos'de acuerdo con la dependencia la velocidad de específica de crecimiento con la temperatura, stanier, et al., 1 975. Tabla
Temperatúra oC Gtupo
Mfnimo
Termófilos
40
45
Mesófilos
10
r5
Sicrófilos obligados
-5 -5
Facultativos
274
5
5
Optimo 55 75
Máximo
60
80
30 15 25
35 19 30
47
45 18
30
22 35
Finalmente es necesario recalcar, en la optimización de procesos, que la tempe-
ratura puede afectar de manera diferente las velocidades de crecimiento de biomasa y de formación de producto. Por tanto, estas dos funciones obletivo deben optim¡zarse independientemente.
5.2.3 Actividad del agua
El agua es el
compuesto más importante para los organismos vivos. Las fuerzas
de atracción, en forma de puentes de hidrógeno, entre moléculas de agua, explican los valores relativamente elevados del punto de fusión, punto de ebullición, calor específico, calor de vaporizacíón, y tensión superficial del agua. La polaridad del agua y su facilidad para establecer enlaces de hidrógeno, la convierten en un excelente disolvente de muchas moléculas iónicas y neutras. El agua también aglomera moléculas amfipáticas tales como jabones y llquidos polares, en forma de micélas, donde los grupos hidrófobos se sitúan hacia el interior del agregado, y los grupos hidrófilos hacia el exterior.
Algunas propiedades del agua tales como el punto de fusión, el punto de ebullición, la presión de vapor y la presión osmótica, conocidas como propiedades coligativas, son modificadas por la presenciade solutos disueltos. La disolución de un peso molecular gramo (1 mol) de un soluto ideal en 1000 gramos de agua (disolución 1 molal), a presión atmosférica normal, disminuye el punto de congelación del agua en 1,86 oC, eleva 0,543 oC el puntb de ebullición, y ejerce una presión osmótica de 22,4 atmósferas, Un soluto ideal no se disocia en dos o más componentes, ni se asocia para disminuir el número total de partÉ culas. Las leyes coligativas solo se cumplen con exactitud en soluciones muy diluidas, Los efectos de los solutos sobre las propiedades del agua tienen una importancia biológica considerable. Asf, por ejemplo, los peces pueden permanecer activos a temperaturas de congelación, y la presencia en la sangre de solutos incapaces de atravesar membranas como en el caso de las proteinas, confiere a la sangre una presión osmót¡ca mayor que la del fluido.extracelular rl el agua presente en este flu¡do tiende a difundirse hacia los capilares sangufneos.
275
Elagua constituye en promedio el 80 % de peso de la célula, interviéne en la reacciones de hidrólisis y en la reducción del oxígeno en la cadena de transporte de electrones. La actividad del agua se define como: i l
A,
=
I!p_
ts.10I
Donde, Pr: presión del vapor de agua de una solución a una temperatura dada;
Pr: presión de vapor del agua a la misma temperatura Según la ley de Raoult, la disminución relativa de la presión de vapor del solvente, en una solución de una sustancia.no electrolítica ideal, es igual a la fracción molar de soluto en la solución:
Pw-Ps Pv
n+N
[5.11]
Donde, n: número de moles de soluto; y'ú: núlñero de moles de agua en la solución. Cuando el soluto es un electrólito, se reemplaza z.rl e¡ lugar de n, donde z es el número de iones por molécula. Cuando el soluto no se comporta idealmente, se reeemplaza Q.z.n, en lugar de n, donde Q es el coeficiente osmótico.
5.2.4 Tonicidad,
osmola!¡dad y osmolar¡dad
El valor de la actividad del agua en los medios de cultivo
diluidos difiere muy pgco de la unidad, por esta razónla acción del agua se expresa en términos de la tonicidad del medio. Una solución de NaCl al9 o/o, en agua, es isóosmótica e isotónica. Aunque isotónico e isoosmótico son términos sinónimos, términos como toniciuad e isotonicidad son utilizados generalmente con los líquidos fisiológicos. Una solución hipotónica tiene una presión osmótica menor que la I de los llquidos'corporales, o la del NaCl al 9 o/o.
276
,Un osmol es la cantidad de soluto que provee un número de Avogadro, 6,02.1023 partlculas en solución, y que al disolverse en un kilogramo de agua, genera un ¡ncremento de 22,4 atmósferas en la presión osmótica. La solución J de un electrólito como el NaCl, representa un ion Na y un ¡on Cl, o sea, 2 osmoles. Por consiguiente, 1 osmol de NaCl corresponde a 29,1 g de NaCl, Una Lobción 1 osmolal contiene 1 osmol de soluto por kilogramo de agua, en tanto que una solución 1 osmolar contiene un osmol de soluto por litro de solución. Los valores de la actividad del agua o de la tonic¡dad del medio son útiles en los estudios de crecimiento de microorganismos en medios concentrados, en los estudios de contaminación microbial, y en el estudio del crecimiento de hibridomas, metabolismo y producción de anticuerpos, Ozturk, S.S., y B.O. Palsson, 1991. Las bacterias son mas sensibles a la actividad del agua que los mohos, Los métodos de prevención de la contaminación de los líquidos están basados en este comportamiento. Si se reduce la actividad del agua, A*, por debajo de
0,95 las bacterias no crecen y para valores de la actividad del agua, A*, por debajo de 0,7 no crecen los mohos. En la Tabla 5.3 se presentan datos del valor óptimo de la actividad del agua, y su Correspondiente tonicidad, para el crecimiento de algunos microorganismos.
Tabla
5.3
Actividad y ton¡cidad del agua. Pirt, 1975' Tonicidad
Actividad del agua (m"-l Organismo
optimo
Mlnimo
optimo
Pseudomonas f Tuoresc ene
0,999
0,960
0,05
2,30
KlebsieTTa aerogenes
o
,999
0,950
o,
05
2,9O
0
,994
0,950
0,,28
2
o
,994
0,860
o,28
A,4O
AspergiTTue niger
o
,975
0,860
l,2a
a
AepergiTTus a¡nsteTodilni
0,950
0,700
2,Ls
19,80
céluJa's f, de ratón
0, 99s
0, 993
0,30
0,40
SaTmoneTTa S
neryort
taphyT o coccus a.ureus
Máximo
,90
,40
* Osmolalidad real 277
l,-n¿
En la Figura 5.5 se presenta elefecto de la actrvidad delagua sobre la velocidad
de diversos procesos físicos,"químicos y enzimáticos. La actividad se determina experimentalmente con un higrómetro, o mediante la evaluación de la disminución del punto de congelación, (Bol et al., 1980). En términos generales la velocidad relativa de los procesos indicados en la Figura 5.5 es proporcional a la actividad del agua,
5.2.5
pH
El agua ioniza ligeramente, formando íones hidronio (HrO*), e hidróxilo (OH). La concentración de estos iones en una disolución acuosa diluida, se determina
mediante la expresión:
K*=ln-llon l= 1..10-14
t5.121
Donde, K*; producto ión¡co del agua, a 25 oC, es el fundamento de Ia escala de pH, definida como pH : - logro [H*]. La actividad metabólica de los.microorganismos es muy sensible a los cambios 'de pH. según Ia teoría de Brónsted-Lowry un ácido es un donante de protones,
(H*), y una base es un aceptante, (A-), de protones. Un pai ácido-base
conjugado (HA) se define como un donante de protones con su correspondiente aceptante. La constante de disociación, K'o, a una temperatura dada, indica la tendencia de un ácido, en solución acuosa, a donar protones: K¿, =
f¡rl tá-l
t5.131
IHA) En la Tabla 5.4 se presentan los valores de pH de algunos fluidos. Se observa que el jugo gástrico, los refrescos a base de cola y el jugo de limón tienen un pH bastante bajo. Los ácidos débíles como el ion amonio manifiestan una alta afinidad por sus pro-
tones y tienen una considerable importancia biológica, ya que actúan como amortiguadores para resistir los cambios de pH, y mantenerlo en un nivel adecuado, en el organismo.
278
Figura 5.5 lnfluencia de la actividad del agua, a temperatura constante, sobre Ias velocidades relativas de diversos procesos. Curva 1 : Destrucción de clorofila en espinaca a 37 oC; Curva 2: Degradación del ácido ascórbico; Curva 3: Oxidación de astillas de papa almacenadas a 37 oC; Curva 4: lnactivación de fosfatasa en leche desnatada; Curva 5: lnactivación del ClosÜidium botulinum; Curva 6: Secado de glucosa a 30 oC. (Thijssen, 1979).
Vet'ocldad relatlva
o,3 0,4 0,5 0,6
0,7
o,8
o,9
Actividad del agua
La ecuación de Henderson-Hasseltialch permite calcular el valor de pK,
log.,o
K') de cualquier ácido, a partir de la relación molar entre la
pH
=
pK'. bg
#
(pK':
-
especie
t5.14I
Los fluidos intra y extracelulares de los organismos vivos contienen pares con-
jugados ácido-base que actúan como athortiguadores. El principal sistema amortiguador intracelular es el par conjugado HrPOo- - HPO42', IBK' *'7,21'. también contiene amortiguadores muy act¡vos. Si sd añade mlde HCl, 0,1 N, a 1 litro de suero fisiológico (NaCl, 0,15 M)a pH 7,0, el pH desciende hasta pH 2, ya que la solución de NaCl no posee capacidad amortiguadora. Sin embargo; si se añade 1 ml'de HCI, 10 N, a 1 litro de plasnia sangulneo, a pH 7 ,4, el pH desciende hasta pH 7 ,2, El plasma sanguíneo
1
279
Tabla
5.4
pH de algunos fluidos. (Lehninger, 1973) pH
Fluido
Plasma sangulneo
7,O - 7,5 7,4
Fluido interstic¡al
7,4
Agua de mar
Fluidos intracelulares Músculo
6,1
Hlgado
6,9
Jugo gástrico Jugo pancreáüco
1,2 - 3,O 7,8 - 8,O
Saliva
6,35 - 6,85
Leche de vaca
6,6
O¡'ina
5
Zumo de tomate
4,3
Zumo de toronja
3,2
Refrescos a base de cola
2,8
Zumo de limón
2,3
-8
5.2.5.1 Efectos delpH delmedio sobre la velocidad de crecimiento de algunas bacter¡as
Elvalor óptimo de pH, entendido como el valor para el cual la velocidad de crecimiento es máxima, varía entre 6,5 y 7,5 para bacterias, entre 4 y 5 para fevaduras, y entre 5 y 7 paramohos. En la Tabla 5.5 se presentan los valores mínimo, óptimo y máximo, para el desarrollo de algunas especies de bacterias. El pH del medio de cultivo cambia como respuesta a la actividad microbial: se genera H* durante la demanda de NHo*; se consume H*, en el metabolismo de NO.-; se consume H* en la utilización de aminoácidos, como fuente de carbono.
280
-
cultivo, usualmente med¡ante la adición de ácido clorhídrico o sulfúrico, y una de las bases: hidróxido de sodio, de potasio o de amonio, al medio. Se prefiere el amonlaco gaseoso en lugar del hidróxido de amonio, por la posibilidad de contaminación, de este último compuesto con esporas bacteriales.
Tabla
5.5
Valores de pH para el desarrollo de varias especies de bacterias.
Límite inferior
Bacteria
Optimo
Límite superior
0, 5
2, o -
4,o - 4,5
5,4 - 6,3
7 -
4,2
7,O - 7'5
9,3
5,5
7'i O - 7 .5
8,
ChTorobium TimicoTa
6,0
5,8
7'O
Thermug aquatieue
6,0
'7,5 - 7,8
9,5
ThiobaciTTus thiooxidans Acetobacter
aceti
StaphyTococcus aureus Azotobacter
spp.
3
,5
5
8
5
Fuente: Datos tomados del Manual of Determinative Bacteriology de Bergey. 8a ed. Williams & Wilkins. Baltimore, 1974,
5.2.5.2 lnfluencia del pH del medio sobre la velocidad de un bioproceso
Generalmente hay un valor del pH del medio para el cual la veloqidad de un bioproceso es máx¡ma. Valores de pH menores que el máximo estimulan la velocidad y valores mayores la inhiben. Humphrey 11977 , 1 978) presenta la siguiente ecuación:
28'l
fi = f¡max
1r,.s¡(r.*.8)
t5.151
Donde: r,: velocidad de producción o de consumo de la especie i. El subíndice irepresenta uria concentración, en g,.litro'l . AsÍ e, X, o, pt s, h*:concentrac¡ón de enzima, de masa celular, de oxfgeno, de producto, de sustrato, y de ion hidrógeno, respectivaméflt€i [¡,.o: máxima velocidad de producción o de consumo de especie i; K.,: constante c¡nét¡ca, rbpresenta elefecto estimulante del pH sobre la velocidad de un bioproceso, en g.litro-l; Kr: constante cinética, representa el efecto inhibitorio del pH sobre la velocidad de u4 proceso, g.litro-].
Otros autores, (Andreyeva y Biryukov, 1973), presentan la influencia del pH sobre la velocidad de un bioproceso mediante una curva de ajuste:
r,=r,*[t Donde:
5.3
so + s.1 .@Hl x
"2.bfl\2.,)
t5.16I
q: coeficientes de un polinomio.
MODELOS CINETICOS NO ESTRUCR'RADOS PARA CRECIMIENTO DE BIOMASA, CONSUMO DE SUSTRATO Y FORMACION DE PRODUCTO
Fredrickson , et a|.,1 970, clasifican los modelos de crecimiento de una población microbial en estructurados y no estructurados. El modelo estructurado considera algunos aspectos básicos de la estructura celular e identifica una o dos especies químicas claves dentro de la célula, quizás aquellas que pueden extraerse a escala comercial, y agrupa los demás componentes de la célula, en una o dos clases generales tales como proteínas y lfpidos. Sin embar(¡o, para muchos propósitos tecnológicos es suficienté un modelo no estructurado, donde el microorganismo o la célula se considera como gn componente simple, generalmente con una composición química fija. Los modelos segregados óónsideran la población celular como una colección heterogénea de entidades discretas, en
282
tanto que en un rnodelo no segregado, el comportamiento de la población celular se aproxima al de una célula promedio.
En un fermentador real el crecimiento es estructurado
y segregado.
Sin
embargo, cuando la heterogeneidad celular no afecta los procesos cinéticos.de interés, son válidos los conceptos de célula promedio y modelo no segregado. En el estado de crecimiento,csnocido como balanceado todas las act¡vidades de sfntesis celular esiári csóiÉhÉdas de manera que la composición celular promedio no se afecta por la proliferación de la población. En este caso un modelo adecuado no requiere la con§ideración de la naturaleza multicomponente de la célula.
'] 5.3.1 lnfluencia
de la compos¡ción del med¡o sobre la velocidad específ¡ca de crecimiento
5.3.1
.1 Modelo de Monod
El efecto de la'composición de un medio de cultivo libre de sustancias inhibitorias sobre la velocidad específica de ,clecimiento fué estudiado por Monod (19581. Las ecuaciones básicas que describen la interacción entre el crecimiento de los microorganismos y el sustrato limitativo del crecimiento son:
!d, xdt I
o ^
=
lLx
'ds -
--
dt
= llu
s+Ks
1
dx
Yus dt
t5.1 7I
t5.181
Donde, s: concentración del sustrato limitante, (g).litro-l ; r": velocidad de consumo de sustrato, (g sustrato).(litro.hora)-'; Yxi":factor de rendimiento de sustrato en producto, (g células).(g sustrato)-1; x: concentración de biomasa, (g células secas).litro 1; p*: velocidad específica de crecimiento, h-'; /rr: velocidad específica máxima de crecimiento, h-l ; K": constante de saturación, g.litro-l; K.:
283
es la concentrac¡ón del sustrato para la cual la velocidad específica crecimiento es la mitad del valor máximo, pr'
de
En la Tabla 5.6 se presentan los valores de la constante de saturación, Kr, correspondientes al crecimiento de algunos microorganismos en diversos sustratos. Los valores relativamente altos de K" de la glucosa indican que este sustrato es una de las fuentes de carbono y energfa "preferidas" por muchos micrOorganismos. Sin embargo, para otros miCroorganismos existen mejores sustratos que la glucosa.
Tabla 5.6 Valores de la constante de saturación_, K., para el crecimiento de microorganismos sobre diversos sustratos (Cooney, 1982l .
organlsmo (genua)
Escherichia Escherichia Escherichia AspergiTlus Candida Escherichia Saccharomyces Pseudomonas Pseudomonas KTebeieLla Escheríchia KTebsieLLa Klebsiefla KfebsielTa Candida Candida AspergiTTus Escherichia 'Escherichia Cryptococcus 284
Sustrato glucosa manitol glucosa glucosa glicerol lactosa glucosa met,anol meLano Co, iones fosfato iones magnesio iones potasio iones sulfato gxÍgeno oxfgeno arginina tript,of ano tr:iptof ano Eiamina
Kr, mg,/Iítro 6,8 .10-'z 2,0 4,0 5,0 4,5 20,0 25,o 0,7 0,4 0,4 a,6 5,6 .10-l 3,9.10-1
2,:l 4,5.10 4,2.10
I 2
5, 0.10-l 1, 1 . 10-3
,9 .!0'4 L,4 .10-1
4
En el caso de medios con múltiples fuentes de carbono, una vez agotado un sustrato, la célula adapta sus "rutas metabólicas", catalizadas por enzimas, a la siguiente fuente de carbono y, después de un nuevo periodo de adaptación, se reinicia el crecimiento. Este fenómeno se conoce como crecimiento diauxico.
5.3.1.2 Modelo de Moser
Con el propósito de lograr la representación de los datos experimentales con un mayor grado de ajuste, diferentes investigadores han propuesto otros mÓdelos como alternativa a la ecuación de Monod. Las ecuaciones presentadas en esta Sección corresponden a modelos cinéticos no estructurados, considerados como una buena aproximación cuando la composición celular es independiente del
tiempO, cuando el crecimiento es balanóeado, o cuando la composición celular no es importante a escala industrial. El modelo propuesto por H. Moser (19581, se expresa mediante la ecuaciÓn:
Px =
l¡¡¿
§' Ks * sn
t5.19I
Donde, n: constante empírica. Las variables tienen el mismo significado que en lás Ecuaciones [5.17 y 5.181.
La expresión logarítmica de la Ecuación t5.191 es útil en la evaluación de los parámetros n y Ks del modelo:
bg
---IrPr-Px
= ,r.logs
- log¡,
t5.19.a]
La representación gráfica de log tpx/fun - ltx)l en las ordenadas versus log s en y [aS abcisas corresponde a una línea recta cuya pendiente es n cuyo intercepto
es L log
Kt.
285
.) 5.3.1.3 Modelo de Contois y Fuiimoto
El modelo propuesto por Contois, (1959)
.
y
Fujimoto, (19631, se aplica en
sistemas donde prevalecen altas concentraciones de biomasa cuyo crecimiento está acompañádo por la producción de metabolitos o inhil¡idores tóxicos: rrx =
pll.I,jls
ts.zol
Donde las variables t¡enen el mismo significado que en e! modelo de Monod, Ecuaciones Í5.17 y 5.181.
v
5.3.1.4 Modelo de Teissier
La ecuación que expresa el modelo propuesto por Teissier (1936), es:
Fr=Fv
['
-"'e(¿)
]
Donde las variábles tienen el mismo significado que en el modelo de Ecuaciones [5.17 y 5.18].
'u"' Monod,
5.3.1.5 Modelo de Konak El modelo propuesto por Konak 119741, se expresa mediante la ecuación:
*
286
= k'(vx - F, )o
15'221
r-
k :, l/fu*Kt; p: coftstante
empfrica.' Las variables tieneh el rnismo que Monod,.Ecuaciones t5.17 y 5.181,.,.Además, de modelo en el significado la ecuación de Monod, que en esta ecuación se convierte Konak demostró Ecuación 15.17l,para p : 2, Y en la ecuación de Teissier, Ecuación [5.2O], para Donde,
p:
1.
5.3.1.6 Modelo de Kargi Y Shuler
El modelo propuesto por Kargi modelos mencionados:
y Shuler (1979), es una generalización de
los
15.231
En la Tabla 5.7 se presentan los valores de las constantes K'
m y p, correspon'
dientes a cada modelo.
Tabla 5.7 Valores de tas constantes de la Ecuación [5.2O]. Moser, 1988' Modelo
K
m
p
Monod
t/rx
0
2
Moser
1-t/n
)- + L/n
Teissier
n/ (K")'/" l/K*
U
1
Contois
t/ (K,.x)
0
2
Konak
k. p,
p
p
247
S.g.zlnfluencia de la concentración de biomasa sobre la velocidad específica de crecim¡ento: Modelo de Meyrath
Meyrath (1973), considera la influencia de la concentración de biomasa sobre la velocidad específica de crecimiento como una consecuencia de la limitación por sustrato. Sien un medio de crecimiento se mantienen constantes las condiciones fisicoquímicas y la concentración de nutrientes, la velocidad especlfica de crecimiento es aproximadamente igual a su valor máximo, pr. Los microorganismos formados modifican continuamente las condiciones del medio y alteran la concentración de biomasa.
f5.24t
[x = ]la, Ks*
1; Las demás Donde, so: concentración inicial del sustrato limitante, (mg).litro variables t¡enen el mismo significado que en el modelo de Monod, Ecuaciones
f5.17 y 5.181.
5,3.3
PerÍodo de adaptación: Modelo de Hinshelwood
El período de adaptación de la célula a los cambios de su ambiente fisicoqufmi-
co, conocido también como perfodo de latencia o perfodo lag, puede calcularse por el método de Hinshelwood (1946), o de Lodge v Hinshelwood'(1943):
tt=t-
1x Fr --ln
-xo
Donde, t,_ : perfodo de adaptación; xo: concentración de biomasa en concentrac¡ón de biomasa en la fase exponencial en t : t.
288
t5.2sI
t:
tr; x:
:
5.3.4
Fase estacionaria: Modelo de La Motta
La Motta (1976), utilizó la ecuación loglstica de Kendall (1949) para cuantificar
el crecimiento de biomasa en los cultivos continuos después de un prolongado periodo de fermentación como en el caso de algunos procesos de tratarñiento
biológico de aguas residuales y de algunos procesos de producción de ant¡bióticos, donde la formación de producto ocurre después de cosar el crecimiento:
fx=
t5.261
ff=u*'*'['*t)
Donde, xM: concentración de'biomasa en la fase estacionar¡a, g.litro'l
5.3.5
Fase de muerte microbial
5.3.5.1 Modelo de Chiu
La importancia de la fase de muerte microbial es directamente proporcional al tiempq de residencia gnrlos.pro@sos con perfodos prolongados de retención como en el caso deltratamiento b¡ológico de aguos residuales. Las ecuaciones que describen este modelo, empleado exitosamente en el procesg de lodos act¡vados, según Chiu, et al., (1972), son:
r§
--
-ds - 1 -r-^ dt Yn,
- -dx = px.x ^ú
kD.X
15.27.a|
.Í5.27.bl
289
Donde, rr: velocidad de consumo de sustrato, g.litro'1.h'1; r^: velocidad de crecimiento de biomasa; Y*,.: rendimiento del sustrato en células,
19 céluias)/(O
sustrato); ¡,rr: velocidad especffica de crecimiento, h-1; x: concentración de biomasa, (g biomasa secal,litro-l; ko: velocidad especffica de muerte celular y metabolismo endógeno, h-l .
5.3.5.2 Modelo de Moser y Ste¡ner
La aplicación del modelo de Monod (Ecuaciones 5,17 V 5.18) puede conducir a valores falsos, e inclusive negativos de Kr, cuahdo se ignora el valor de la constante ko. Moser y Steiner (1975), presentan la siguiente ecuación para modelar la fase de muerte microbial:
1 = L* Vx * ko l¡¡r.s
.
t
f5.28t
Fa
5.3.6 Metabolismo endógeno
La disrninución de la masa global de células en los procesos con períodos prolongados de retención obedece a dos factores independientes: la muerte celular y el metabolismo end,ógeno:
Ko=Kl+K,
f5.291
Donde: Ko: velocidad específica de muerte celular y metabolismo endógeno; h-1; Koo: velocidad verdadera de muerte, h-1; Kr: velocidad especffica de metabolismo endógeno, h-l.
290
Las constantes de veloc¡dad, Ko, y K, generalmente son evaluadas por el método recomendado por S¡nclair y Topiwala, '1970, a part¡r de la representación gráfica de la Ecuación f2.371, (Figura 56): lL, =
1 il" * ("rJ.u,
IEcu.2.37l
Donde, p": vélocidad específica de consumo de sustrato, {mol sustrato). (g cél.h)'
de mantenimiento basado en el sustrato, (mol sustrato).(g cél.hora)-1; p^: velocidad especlfica de crecimiento de biomasa, h-'; (Yrs),: coeficiente de rendimiento verdadero de sustrato en biomasa, g biomasa (mol
'; m.: coeficiente
sustrato)-1.
Figura
5.6
Evaluación de las constantes de velocidad del metabolismo endógeno. Sinclair y Topiwala, 1970,
Volocldad especlflca de consumo de sustrato, l/hora
o
Velocidad especi flc"a de crecirrllento, l/h
La Figura 5.6, representación gráfica de la Ecuaci 6n 12.371, ¡lustra el método de
Sinclair y Tofiwala, 1970:
-
El coeficiente de rendimiento verdadero de sustrato en bisrñasa se evalua partir del valor de la pendiente,
a
291
-
El valor de la velocidad verdadera de muerte, ¡ntercepto con el eje de las x.
Ko, es el correspondiente al
-
El valor del coeficiente de mantenimiento es el correspondiente al ¡ntercepto con el eje y. El valor de la velocidad específica de metabolismo endógeno, Kr, se calcula a partir del intercepto con el eje de las y:
t5.301
5.4
MODELOS CINETICOS PABA LA ¡NHIBICION DEL CRECIMIENTO
5.4.1
lnhibición por sustrato
5.4.1,1 Efecto de la fuente de carbono
Los valores de la constante de saturación, K", para diversas fuentes de carbono, (Tabla 5.6), varían tfp¡camente entre 1 y 10 mg.litro'l. Estos valores significan
que las células crecen a su máxima velocidad cuando la concentración de la fuente de carbono excede 1 0,Ks, o sea, entre 1 0 y 1 00 mg.litro'1. Para todos Ios nutrientes hay un valor de la concentración que al ser sobrepasado origina una disminución de la velocidad de crecimiento. Este efecto, conocido como "inhibición por sustrato" puede presentarse en el caso de carbohidratos alrededor de 50 g.litro-1, aunque generalmente, solo se manifiesta entre 100 y 150 g.litro-1. Usualmente un incremento de la concentración de sUegglo ínfluye sobre la presión osmót¡ca y causa una deshidratación parcial de la célula.
292
Otros sustratos como el fenol, el tolueno o el butanol, extraen componentes de la célula y deterioran la membrana celular cuando su concentración es de unos pocos g,litro-1 I
.
En la inhibición competitiva la sustancia inhibitoria compite con el sustrato limitante del crecimiento. En la inhibición no compet¡tiva, la sustancia inhibitoria reacciona o se combina con la biomasa sin afectar su afinidad por el sustrato. Otros modelos de inhibición incluyen características tanto de la inhibición competitiva como de la no competitiva.
5.4.1.2
Efecto de la fuente de nitrógeno
Los microorganismos metabol¡zan prácticamente todas las formas orgánicas e inorgánicas de este elemento para proveer las protefnas intracelulares, los ácidos nucleicos, y las proteínas que conforman la pared celular, El nitrógeno const¡tuye hasta el 12o/o del peso, base seca, de las bacterias, y el 1Oo/o del peso de los hongos. Los valores de la constante de saturación, K", para los aminoácidos, varlan entre 0,003 y 0,2 mg.litro-'!, y para amonfaco entre 0,1 y
l
mg.litro-1.
Estos valores de K. demuestran la capacidad de los microorganismos para crecer a su máxima velocidad con muy bajas concentraciones de nitrógeno. Generalmente la concentración de los compuestos nitrogenados en el ambiente es baja
y aquellos microorganismos capaces de crecer a estas concentraciones tienen una apreciable ventaja competitiva. Frecuentemente, cuando se provee demasiado nitrógeno, se originan problemas de inhibición por sustrato. El amonfaco causa inhibición a concentraciones superiores a 3 - 5 g.litro-l. Al agotarse.la fuente de carbono en un medio de
cultivo, en presencia de aminoácidos, los microorgan§mos consumen el esqueleto carbonado de los aminoácidos y se acumula arhonfaco. Cuando se ut¡lizan nitratos como fuente de nitrógeno, estos compuestos son parcialmente reducidos hasta NOr, sustancia que puede ser tóxica para las células.
293
5.4.1.3
Modelo de Andrews
Andrews, '1971 , recomienda la siguiente ecuación para la inhibición pirr sustrato de un cultivo en'un reactor de mezcla completa:
'^ '-
[5'31]
'
r*K§*'§' § K¿s
Donde, !x, !¡¡i velocidad específica y velocidad específica máxima de crecimiento; Kr: constante de saturación, mg/litro; K,.: constante de inh¡b¡ción por sustra-
to, mg.litro-l ; s: concentración de sustrato,
mg,litro-1
.
Edwards. (1970). confronta la Ecuación t5.311 y las deducidas por otros aujores, (Noack, 1968, Aiba er at., 1968; Yano ét al., 1966; Webb, 1963, óon datos experirnentales y deduce que todas estas ecuaciones conducen a resultados similares. El valor de la concentraqión del sustrato, corespondiente a part¡r de la Ecuación t5.311:
lr,
se'obtiene
*=o=py.(,.+.*)'(_:.*) .
De dondc
:
s = (K"
. Xo)'o
*
-:,
a
.
15-.32'l ,
Y a! reemplaza¡ la concentración de sustr,ato s, en la Ecuación [5,31]:,
'
lu
Í5)'o
1 + 2,1-
(r"
/ \ )
294
t5.33r"
5.4.1.4
Modelo de Tseng y Waymann
En algunos casos el patrón de la inhibiciÓn por sustrato difiére del expresado por
Ecuación t5.311 y demuestra un decrecimiento lineal de la velocidad específica de crecimiento, /.rx. Tseng y Waymann, 1975, presentan una ecuación, válida para concentraciones de sustrato mayores que un valor crftico,
la
sci )L
= Fu-
Kt*s
Kr.(s - S.
)
t5.34I
5.4.2 lnhibición por produeto
Los modelos c¡néticos de inhibición por producto presentados por diferentes investigadores ajustan los datos experimentales de acuerdo con el patrón específico de comportamiento de cada proceso. El decrecimiento de la velocidad específica, /x, puede ser lineal, exponencial, por etapas, etc., y, generalmente el cambio de una cepa o la modificación de las condiciones experimentales alteran los resultados.
5.4.2.1 Modelo de Holzberg
Holzberg et al., (1967), presentan un'modelo cinético válido en aquellos casos donde la velocidad específica de crecimiefito, ltx, decrece linealmente;
Vx=Va-f,t.(p-Kz) Donde,
0;
ts.3sl
¡rr: velocidad específica máximg4e crecimiento, h-r, evaluada con p
p: concentración del producto, g.(ñtrol-'; K,,: constante cinética, litro.g-1 Kr: constante cinética, g.(litro)'l
:
.h-1;
.
295
5.4.2.2. Modelo de Ghose y Tyagi Ghose y Tyagi, 1979, presentan un modeto para evaluar la' inhibición del crecimielto de revadura
*'*;"1'-r.r, \
.
-.cx)l
Donde, c: concentración media del productoi producto a la cual las células son aun viables.
cr,¡r:
r5.s6,
máxima concentración de
5.4.2.3. Modelo de Jerusalimsky El modelo propuesto por Jerusalimsky, 1967, es uno de los modelos utilizados con mayor frecuencia en la evaluación de los resultados de la c¡nética de inhibición por producto en cultivos discontinuos:
=r"'t'[
#
Donde, K,, es la constante de inhibición por
t5'37]
ptoducto. \
5.4.2.4. Modelo de Bazua y Wilkie Bazua
y Wilkie, 1977,
ajustaron los datos experimentales obtenidos en la
c¡nét¡ca de inhibición delcrecimiento de levadura en cultivo continuo, por etanol,
mediante la siguiente ecuación:
t
-
\t/2
r¡r=r¡c.ll*'c cx)I
t
296
t5.381
Donde, pr: velocidad especlfica máxima de crecimiento, cc: concentración media del producto en cultivo continuo, g.litro-1; ¡r.: velocidad específica de crecimien-
to observada a la concentración c..
5.4.3.
Represión cataból¡ca
Un cultivo de microorganiSmos en un medio compuesto por diversas fuentes de
carbono utiliza selectivamente aquella que !e permite una mayor velocidad de crecimiento y reprime catabolicamente los nutrientes menos Útiles. La represión cataból¡ca es un fenómeno importante en algunas fermentaciones industrÍales como en la producción de levaduras y de algunos ant¡bióticos, y cuando hay crecimiento diauxico y formación de metabolitos secundarios. Moser, 1988, recomienda el siguiente modelo de represión catabólica: ft=ltv
(,*".[r.¿)
t5.391
Donde, r,: velocidad de formación, o de consumo, de componente i, g'litro-1.h-1; x: concentración de biomasa, (g células secas).litro-1; s; concentración de 1. sustrato, g.litro-l; KR: constante de represión, g.litro
5.5
MODELOS CINETICOS PARA LA FORMACION DE PRODUCTO
Normalmente los microorganismos convierten la fuente de carbono en biomasa y producen so.lo la mfnima cant¡dad de metabolitos esenciales y posiblemente pequeñísimas cant¡dades de metabolitos secundarios o no esenciales. La optimización de la productividad de un proceso para la obtención de metabolitos secundarios usualmente incluye la interferencia de los mecanismos de regulación 297
metabólica del microorganismo, para convertirlo en sobreproductor del compues-
to deseado, además de ensayos con microorganismos mutados en diferentes condiciones ambientales,
5.5.1.
Clasificac¡ón de los productos
Los microorganismos utilizan el sustrato en la síntesis de nuevo material celular
y de productos extracelulares,
para obtener la energfa requerida por las reacciones de síntesis y recirculación de materiales, y para mantener las sustancias dentro de la célula en un nivel de concentración generalmente diferente de la concentración de estas mismas sustancias en el ambiente. La energla que impulsa los procesos celulares es la energía qulmica del ATP, o
de sustancias similares, obtenida mediante la oxidación del sustrato por el oxígeno molecular hasta CO, y agua, proceso conocido como fosforilación oxidativa. Otro proceso de obtención de energla es la fosforilación a nivel de sustrato mediante la degradación del sustrato hasta productos mas simples como etanol, ácido láctico, ácido cftrico, CO, y agua. Estos productos excretados por la célula, mediante fosforilación a nivel de sustrato, son conocidos como productos del tipo 1. Los productos del tipo 2 son compuestos extracelulares tales como exoenzimas, polisacáridos y metabolitos especiales, Las exoenzímas degradan las moléculas
del sustrato demasiado grandes para atravesar la pared celular. Los polisacáridos como la celulosa y el almidón, cumplen funciones estructurales en la agregaoión de células, y como reserva de alimentos. Los metabolítos especíales como
los antibióticos, evitan la competencia de otros microorganismos,
'/
7
En algunos casos donde el medio contiene un exceso de fuente de carbono y cantidades limitadas de otros sustratos como nitrógeno o magnesio, pueden obtenerse productos del tipo 3. Los productos del tipo 3 como el glicógeno y las grasas, actúan como depósitos de energía y pueden ser o almacenados o excretados por la célula. Los productos del tipo 4 son los constituyentes celulares tales como el núcleo, los cromosomas, el citoplasma, el lisosoma y las membranas celulares.
298
Gaden, (1959), distingue cuatro tipos de formación de producto de acuerdo con
la relación cuantitat¡va entre la cantidad de producto y el crecimiento
biomasa.
de
.
- Tipo 0: Las células en reposo utilizan pequeñas cantidades de sustrato para su propio metabolismo y funcionan como transportadores de enzimas. Como ejemplos puéden mencionarse la transformación de esteroides y la slntesis de vitamina E por Saccharomyces cerevisiae.
-
1:
La formación de producto está directamente asociada con el crecimiento. Es el caso de los metabolitos primarios en los cuales la formación del producto está asociada con el metabolismo de energía. Como ejemplos
Tipo
pueden mencionarse la producción de alcohol y ácido glucónico, y el tratamiento biológico de aguas residuales.
2:
No hay una relación entre el crecimiento y la formación de producto. Como ejemplos pueden mencionarse la producción de penicilina y de estreptomicina. - Tipo
- Tipo 3: Hay una relación parcial entre el crecimiento y la formación de producto y por consiguiente una relación indirecta con el metabolismo de energía. Como ejemplos pueden mencionarse la producción de ácido cítrico y la de algunos aminoácidos.
5.5.2. Modelos c¡nét¡cos 5.5.2.1 Formación de producto asociada al crecimiento m¡crobial
Algunas de las ecuaciones que describen la formación de producto asociada al crecimiento microbíal son: dP rp=E
=
(Yn*).r*
=
(Yrt*).
dx.
&
t5.401
299
1dP
xú
=r¡¿=
rp
=
v,,il.! ff=vri.v*
(Yrts).""
= (Yry, ).
ds
ú
t5.411
t5.42)
Donde: rp, r¡, rsi velocidad de formación de producto, crecimiento de biomasa, y consumo de sustrato, respectivamente en g.litro-1.h-,; x, p, s: concentración de células, producto, y sustrato, respectivamente en g.(litro)-1 ; ¡rr: velocidad específica de crecimiento de biomasa, h'1 ; ltpi velocidad específica de formación de producto: (g producto).(g células)-1.h-1. La siguiente ecuación relaciona los factores de rendimiento de las tres ecuaciones anteriores: t5.431
Donde, Yor: rendimiento del sustrato en células, (g células)/(g sustrato); yr,.: rendimiento de sustrato en producto, (g producto)/(g sustrato); Y"rx: rendimiento de biomasa en producto, (g producto)/(g biomasa).
Moser, 1988, presenta la siguiente ecuación, Tipo Monod, para la formación de producto asociada al crecimiento: fP=fp,ti.
s.r Ks *s
15.441
ponde, rr: velocidad de formación de producto, g.litro-, .li1 ; pr*: velocidad especffica máxima de formación de producto, (g producto).(g células.h)-r.
5.5.2.2. Formación de producto no asociada al crec¡m¡ento microbial Generalmente, la cuantificación de la forma",on ,, producto no asociada al crecimiento es una tarea diflcil. En algunos casos el siguiente modelo ajusta los datos obtenidos experimentalmente, Moser, 1 g8B:
300
\
rt = x'Ky
t5.451
Donde, rp: velocidad de formación de producto, g.litro-1 .(hora) 1; ,t Jón""nrr"-
ción de biomasa, g.litro-l; Kr: constante de ve¡oc¡dad para formación
de
producto: (g producto).(g células.h)-l.
5.5.2.3
Formación de producto parcialmente asoc¡ada al crec¡m¡ento: modelo de Luedeking y Piret
El modelo propuesto por Luedeking y Piret, (1959), para la fermentación del ácido láctico, es una combinación de las ecuaciones t5.411 y [5.45], y por tanto, es un modelo para la formación de producto parcialmente asociado al crecimiento:
f¡¡ = f¡r.
(Y^) + K,
t5.461
Donde, !p, Kpi velocidad especifica de formación de produeto y constante de velocidad de formación de producto, (g producto).(g células.h)-1; p*: velocidad
específica de crecimiento de biomasa; h'l; Yrr*: rendimiento de biomasa en producto, (g producto).(g biomasa) 1.
5.6
EVALUACION DE PARAMETROS CINETICOS A PARTIR DE DATOS EXPERIMENTALES
El modelo de Monod (Ecuaciones t5.171 y t5.181) describe la interacción entre el crecimiento de microorganismos en un cultivo por lotes y la utilización del sustrato limitativo del crecimiento en aquellos sistemas donde prácticamente todo el sustrato es transformado en biomasa:
301
-
¿x
dt
_ Pu-b.r) Ks*s
dsldx dr Y*1, df
15.171
15.181
Donde, Y^,=: factor de rendimiento de sustrato en producto, (g células).(g sustrato)-1; s: concentración del sustrató limítante, g.litro-l; x: concentración de biomasa, (g células secas).litro-'; lt*: vetocidad específica m{xima de crecimiento, hora-l; Kr; constante de saturación, g.litro-l; K.: es la concentración del sustrato correspondiente a una velocidad especffica de crecimiento igual a la mitad del valor máximo, !u.
5.6.1 Método integral
de análisis
El método integral de análisis del modelo de Monod.(Ecuaciones ts.17l y [5.18]], propuesto por Ong, (1983), se fundamenta en.un algoritmo de búsqueda unidimensional y en un procedimiento de ajuste por mlnimog cuadrados. El punto de partida del método es la siguiente ecuación obtenicla mediante integración de la Ecuación [5.18]:
x=Ío+Y*lr Gr-")
Í5.47t
Donde,, xo, so: cóncentración inicial de biomasa y de sustrato limitativo'del crecimiento, respectivamente. Si la Ecuación'[5.47] se sustitu'ye én la Ecuación t5.171 se obtiene:
#
302
=
#*
l*o
* Yn,' t", -'l l
ts.481
ds __ dt
+ffi[r'
* Í*¡"'(s' -s)]
Kr+s
.ds=- P, la
I " [r, * Yrr-. (", - ")
]
Jo
1. s .1Lnfi., +a.dll '. -t ln- =D. . -so o..=
!s!.
rrr.
-c
.
t5.491
á
[5.50]
t5.511
xo
b=1
+ Yr¡r. s,] +=l=: [x, Yv*'Kr t "
t5.521
"=#["*r'r¡'"']
t5i53I
¿=(so-s)
t5.541
La Ecuacióo tS.SOL Ceducida,por @eory Marlar,, (1968); iedba, una,felaci6n lineal entre los términos {(1lt}iIn (s/so}}y {(1/t).ln (1 + a,d)}, Gate&y Mar'lar, (1968), sugieren un procedimiento basado en la representación gráfica de estos térm¡nos para diferentes va[ores supuestos del parámetro a. Los valores de ¿, b, y c, asociados con la tnejor,[aea rebta obteirida, son seleccionados como los mejores estimativos y- son los utilizados en la evaluacíón de pu,'K. y Y*,., a '' i .' j partir de las Ecuaciones [5.51], [5.52] y [5.531: |Ú-u=
c
b-1
ts.55I
303
_1 *sa Ks=
t5.561
a
b-1 t5.57I
Yr6=a.xo Los parámetros c¡néticos de la ecuación de Monod,
/¡¡ y
Ks, no pueden
estimarse con la misma facilidad que los de Michaelis-Menten en una reacc¡ón enz¡mática. En el caso de una reacción enzimática, la velocidad inícial de una reacción se mide en función de la concentrac¡ón de sustrato a part¡r de una serie de varios ensayos por lotes. En un cultivo de microorganismos la velocidad
inicial de una reacción siempre es cero por la necesidad de una fase de adaptación durante la cual no se aplica la ecuación de Monod. Además, estas ecuaciones, aunque similares, son diferentes:
- Michaelis-Menten dP
d,
fx's _-,r- - Kr*,
t5.581
- Monod
!d* =! 'fx= xdt x
l¡¡r. s
Ks*s
t5.591
De acuerdo con Ong, 1983, el coeficiente de correlación R, describe el grado de ajuste de una lfnea recta. Por consiguiente el coeficiente R correspondiente a la relación lineal expresada en Ia Ecuación [5.50] es:
R2=
(n.E;.r - E¡.Ey )2 I n.Ex2 - (E* f )l".Dy' -(EyÉ]
15.601
Donde:
-_ln(1
+a.d) t
Donde, n: número de datos analizados; y: ordenada; x: abcisa.
304
t5.61I
t5.62I
En las tres ecuaciones anteriores se conocen todos los términos, excepto el parámetro a. La función objetivo es minimizar (- R2l. Esta función objetivo es unimodal gara a > 0, esto es, solo tiene un valor óptimo local igual al óptimo globat, El algoritmo mencionado en esta Sección es una modificación de la técnica de búsqueda unidimensional de Powell desarrollada originalmente para la solucíón de un problema de programación no lineal no restringida descrito por Rskbitas
et al., 1983. El progiama C:\GWBASIC\MONOD.BAS, resumido en la Tabla
5.12, constituye un ejemplo de la aplicación del método integral de análisis de datos en la evaluación de los parámetros cinét¡cos de la Ecuación de Monod.
5.6.2 Método diferencial de análisis
Elobjetivo del método diferencial de análi§is es la evaluación de las velocidades de crecimiento de biomasa y de consumo de sustrato a partir de un conjunto de datos experimentales de las concentraciones de biomasa y de sustrato en función deltiempo en un cultivo por lotes. Aunque existen numerosas alternativas pára la evaluaclon de estas velocidades, los siguÍentes procedimientos han sido utilizados coil alguna frecuencia: - Et procedimiento geométr¡co de diferenciación de una función experimentalen un punto, propuesto por Leduy y Zaiic, 1973. En el programa C:\GWBAS|C\IEDUYZAJ.BAS,'resumido en la Tabla 5.13, se aplica la subrutina de Leduy y Za¡ic, en la evaluación de la velocidad de crecimiento de biomasa a partir de un conjunto de valores de la concentración de biomasa (variable dependiente) en función del tiempo.
305
- El procedimiento
propuesto por Tao, 1987, fundamentado en arreglos de
polinomios de la forma:
flxl = a(i) + b(i).¡ * c(i).x2 * d(i\.xi Donde, x: variable dependiente;
t5.63I
t: variable independiente.
El programa i:\GWBASIC\SPLINE.BAS, resumido en la Tabla 5.14, evatúa tos coeficientes de la curva de ajuste para cada intervalo de la variable independiente (tiempo). La variable dependiente en la ecuación t5.631 es la concentración de biomasa. En elprograma se obtienen las derivadas de los polinomios en
cada punto de la curva. Los valores de los parámetros Ir¡¡ y Ks son obtenidos a part¡r de las siguientes relaciones lineales, deducidas de la ecuación de Monod, una vez conocidos los
valores de la velocidad de crecimiento de biomasa consumo de sustrato r":
r, y de la velocidad
de
- Lineweaver-Burk:
1_ 1 *5r
lL Fx Vus
ts.64l
La representación gráfica de 1lp versus l /s, en el caso de microorganismos que
se comportan de acuerdo con el modelo de Monod, corresponde a una línea recta, cuyo intercepto es 1lp* y cr,rya pendiente es Kr/gr.
La evaluación de lrr,¡ y Ks por el método de Lineweaver-Burk depende
las
mediciones realizadas a bajas concentraciones de sustrato. Sí se considera que et valor de 1lU tiende a infinito a medida que la concentraciórÍ de sustrato disminuye, los puntos correspondientes a estos valores afectan ta pendiente y el intercepto.
- Langmuir:
sKsl l¡
306
Va
+-.s Fu
ts.651
La representación gráfica de slp versus s, en el caso de microorganismos que se comportan de acuerdo con el modelo de Monod, corresponde a una llnea recta, cuyo intercepto es K./¡r,, y cuya pendiente es 1lp*,
- Eadie-Hofstee:
l¡=prr- fs .tr"
t5.66I
La representación gráfica de p versus ltls, en el caso de microorganfsmos que se comportan de acuerdo con el modelo de Monod, corresponde a una línea recta, cuyo intercepto es /rvr y cuya pendiente es - Kr. La principal limitación del método diferencial de análisis en la determinación de parámetros c¡nét¡cos es la d¡ficultad para la realización de ensayos en un reactor continuo de mezcla completa (CSTRI donde existe la posibilidad de mantener un medio ambiente estable para los microorganismos. En los ensayos por lotes pueden utilizarse matraces para realizar simultáneamente múlt¡ples ensayos con diferentes condiciones ambientales. Los ensayos en reactores continuos requieren tanques de reserva de nutrientes y de producto cónectados asépticamente alfermentador. El control delcaudal efluente se dificulta en algunos casos por la formación de espuma y por el taponamiento del ducto de salida con aglomerados de células. La duración de un ensayo puede prolongarse durante varios dfas, e incluso semanas, y aumentar el riesgo de
contaminación y de mutación de la cepa por su adaptación a las nuevas condiciones ambientales. Las diferentes condiciones ambientales en un ensayo por lotes y en una fermentación continua afectan la validez del modelo cinético desarrollado en un reactor continuo para la predicción del comportamiento de una fermentación por lotes y vicéversa. Por consiguiente, estos parámetros requieren una verificación cuidadosa con el propósito de evaluar la confiabilidad del modelo establec¡do.' El Ejemplo 5.2 muestra la evaluación de los parámetros cinét¡cos de la Ecuación
de Monod a part¡r de un conjunto de datos experimentales. Los programas LEDUYZAJ,BAS y SPLINE.BAS obtienen las velocidades de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato; los parámetros I/M, K. y Y¡¡s, son calculados mediante un análisis de regresión de las ecuaciones de Lineweaver-Burk, Langmuir y Eadie-Hofstee, con el programa C:\OUATTRO\MONOD.WO1. Los parámetros de la ecuación de Monod también son obtenidos por método integral de análisis con el programa GWBASIC\MONOD.BAS. 307
Ejemplo
5.2 Evaluación de los parámetros cinéticos
de ra Ecuación de Monod a partir de datos experimentales
En la Tabla 5.8 se presentan datos obtenidos experimentatmente en un cultivo porlotes de Aerobacter cloacae en un medio qulmicamente definido, compuesto por glícerol como sustrato limitativo del crecimiento. Evaluar los parámetros cinéticcis: /rrr, Ks y Yvs, de la ecuación de Monod mediante los métodos integral y diferencial de análisis de datos.
r
.5.8
Evaluación de las velocidades de crecñniento de biomasa y de consumo de sustrato a part¡r de datos experimentaleS. Análisis de regresión realizado con el programa C:\OUATTRO\MONOD.WOI Tabla
/ f
ABCDEF
.
.
Tiempo BiomaEa Sustrato horas mg,/Iltro mg/litro
dx/dt LD-Z
.o,52 q. 86 r;19' l;1r3 t.74 2,06 2,37 2,48
15,54 L9 ,25 22,og 23,07 L7 ,43 5,40 L,O2
7_
22,5 28 , q 35,3 4L,L 48 ,2 53,0 54,4 54,5
60,5 ,2 36,5' 25,5 11, 0 3,1 0,4 49
o
dx/dt
s.promedio
SPLINE
15,90 ,63 22,2s 23,92 20 ,,20, 9,a2 1_,66.
54,90
L9
42 ,85
31,00 1,A,Zs 7 , 05
7,,15
,
-
,2
OEIiTKL. d¡/dt P_Iom
LD-Z
'
14,500 L7 ,395 20 ,670 22,58O 20 ,250 l_1,415 3,270
dx/dt Prom.
(t/s)
t4,o70 L7,765 20 ,950 23,l.05 22,060 L4,660 5,390
0,0149 o, 0182 0 , 0233 o,0323' 0, 0548 0,1418 0,5?t4
x prom.
LL LD-Z
tL
SPIJINE
SPIJINE
19,00, 25" 55 31, 95 38,20 44,65 50, 50 53,10
o,75j.2 0,6808 0 ,5459 0:,5g,!1 o, 4535 o ,2256 o,os98
0,7405 o, ais: O
,
6560
0,6C48
,4s4t ,28s7 0,1004 0 0
Continúa 308
Tabl¡ 5.8 ConEinuación ü
o
N
(a/ p)
(t/
TrD-Z
SPI,INE
1,310
L,469 L ,546 L,692 2 ,205 4 ,433 L6,'129
0,0113
L,524
0, 0151 0, 0191 o
ot24
, 0249
0, 0320
,4s2 ,963
I p
o,
1, 653 2, O24 9
(tt/
(p/ a) frD-Z
tt)
1, 350 1, 438
3
P.
0
, 0342
(e/ p)' LD-Z
E)
SPIJINE
88;121 80,638 66 ,234 52,445 40,240 3L,251_ 29 ,276
0, 01:_0 o , oL27 0, 0153 0, 0195 o,
o27!
0, 0411 O
, O.S?4
Prom.
L/ ¡.t. prom. I¡DZ-SPfr
p
prom.
IJDZ -
S
PIJ
o,752
1, 330
0,
0, 688 0, 651
L,453 1,535 L,672
0,0152
0,598 o ,'47 4
o,258 o;o8o
2,Lt4 '3,942 ]-3,,346
y.)
eO, 814
78,958 55,318 5'1 ,
253
36,938 24,334 1,7 ,43s
v
T
LEZ-SPL
le/
.SPIJINE
0112 0, 0125
o, 0193 , 0260 0, 0355 0, 0458 o
/e
s/ pprom. LDZ-SPL 89 ,467
79,798 65,?75 5)-,849 38, 589 27,'192 23
,355
Observaciones:
A, B, C : datos experimentales. La concentrác¡ón inicial de biomasa: (mg 15,50 de biomasa seca)/l¡tro, corr'esponde a la concentrac¡ón de biomasa' después del pe¡fodo de adaptación, esto es, la concentrac¡ón al comienzo de la fase exponencial. - Columnas
- Cotumna D: Velocidad de crecim¡ento de biomasa obtenida con et proErama C:\GWBASIC\LEDUYZAJ.BAS, flabla 5.13), a part¡r de la información de las columnas A y B.
- Columna E: Velocidad de crecimiento de biomasa obten¡da con el prograrna C:\GWBASIC\SPLINE.B'AS, (Tabla 5.14), a part¡r de la informac¡ón de las columnas A y B.
- Columnas F, G, H: Valores promed¡o de las columnas C, D y E, respectivamente; Columna l: Recfproco de los valores de la columna
F.
309
- Columna J: Concentración de biomasa. Promedio de los,valores anotados en la columna B en cada intervalo de tiempo. Columnas K, L: Velocidad específica de crecimiento de biomasa, calculada'con los valores de la columna J, y las columnas D y E respect¡vamente, en (horas)-1. - Columna S: La velocidad especlfica promedio / prom es el promedio aritmético de los valorcsranotados en las columnas K y L qn cada ¡ntervalo de tiempo
Tabla
5.9 Resultados obtenidos mediante
análisis de regresión de los valores
anotados en la Tabla 5.8 aon el programa C:\OUATTRO\MONOD.WOl
Y
R2
¡ErY
m
ErrX
75,4252 27,73AA. 21-,5820
o, 0990
Lineweaver-Burk, Ecuación [5.64]:
sPL t,1699 LDZ O,8026 PROM O,9862.
,
O , 0492 0,1,769 O,0678
0, 9998
O,9992 0,9998
Langmuir, Ecuaeión [5.65] z
0,3559 0,L364
,
SPIJ 16,2L30 LDZ 24,9965 PROM 20,6048
0,8319 2,3695 1,,3236
Eadie-Hofstee,
Eeuación [5.66]
0,9992 0, 9916 0,9978
!,1_278 0, 9560 1, 0419
0,0138 O, 0394 0
, 0220
:
sPI+. 9,8723
-0.,014s 0,9,pqg -13r7?O.7 0,343s,..."i. IJDz.L,o.l25.o,o55oo,g624-zl,+i.gs2,427o pRoM 0,948': o,orez:: ois'ddl;,,,-,aa,;de?4,' o,sosz,', l't
'
Observaciones:
i
-
-
Y:lntetceptoconelejoY;Y:var.iab1edependiante',:.' 1-;
:
.,
'I
:
..
-,
Err Y: Error estándar de los valores estimados de Y.
$:,coeficiente de correlación linear; R2: coeficiente de delerminación, (steel y Torrie, 19"80). ,: I :
m: Valor de la pendiente o coeficiente de X; X: variable independiente. ,
Err
X: Error estándar de los valores estimados,de X.
310
:1
'v
Lin'eweaver-Burk, Ecuación t5.641: Variable independiente: datos de la columna I (Tabla 5.8); Variable dependiente: columna N: método Spline; columna M: método de Leduy y Zaiic; columna T: método de la velocidad'específica Promedio de crecimiento.
--
-- Langmuir, ,Ecuación t5.651: Variable independiente: datos de la columna F (Tabla 5.8); Variable dependiente: columna R: método Spline; columna O: método de Leduy y Zgiic; columna V: método de la velocidad especffica
,
l l l
:
promedio de crecimiento.
?
columnas velocidad dependiente:
- Eadie-Hofstee, Ecuación t5.661: Variable independiente: datos de las
P, O y U (Tabla 5.8) para los métodos de Sptine, Leduy y Za¡ic, y
específica promedio de crecimiento, respect¡vamente. Variable datos de las columnas L, K y S (Tabla 5.81 para los métodos de Spline, Leduy y Zajlc, y velocidad específica promedio de crecimiento, respect¡vamente.
Tabla 5.10 Parámetros de la Ecuación de Monod obtenidos a part¡r de los valores anotados en la Tabla 5.9, (Método diferencial de análisis); R: coeficiente de correlación.
Lineweaver-Burk, Ecuación [S.S¿]
..+,
spline Leduy y za)ic Promedio
r¡r = 0,8548
Fu = 1,2459 ru = 1,014
Langrmuir, EcuaciÓn [5 .55]
= 0,886'7
P¡r
Promedio
ltu=9,9598
F¡ = 1,0450
Eadie-Hofstee, Ecuación [5.56]
spline
Leduy y zalie
Promedio
= 0,8723 P¡r = 1 ,0725 llu = 0,9483
Fu
Ks = 13,185 IG = 34,560 IG = 21 ,884
R: 0'9999 R = 0,9996 R=0 '9999
G = L4'376 IG' = 26 't47 Ks =\9,776
R = 0'9996 R = 0 '9958
IG = 13,72t Ks = '27,439 Iq = L8,8a7
R - 0,9984 R = 0' 9810
:
spline
Leduy y zajic
:
R=0'9989
:
R:0'9982
311
l
)
l
Tabla 5.11 Parámetros de la Ecuación de Monod obtenidos con el programa C:\GWBASIC\MONOD.BAS. resumido -e¡ la Tabla 5.12, pata el conjunto de valores expefirnentales de la Tabla 5.8.
:, , ;
!u: 0,8528 (hora)-1 Ke .: 12,326 (mg gliceroll/(litro
,
gttos valores coinciden con loi informados por Herbert et al., 1956: Yx/s : 0,53 g/g;lrrrr : 0,85 (hora)-l; K, = 12,3 mg/litro.
de medio)
5.12 Programa C:\GWBASIC\MONOD.BAS. Gates, W.E', y Marlar, 1968; Moser, 1988; Rekla¡t¡s, G.V., Ravindran, A., and Ragsdell, 1983; Ong,S.L.
Tabla
1983) Rolz Carlgs, 1989. 1O CLS
20 PRINT "MONOD.BAS: METODO INTEGRAL DE ANALISIS" 30 PRINT "EVALUACION DE LOS PARAMETROS DE LA ECUACION MONOD"
, r i
; i I
i ' ; i ;
4o,PRINT
:
50 PRINT "REFERENCIAS:" 60 PRINT 70 PRINT "Gates, W.E., y Marlar, J.T., Water Poll." 80 PRINT "Contro! Fed. 40: R 469, 1968" 90 PRINT 100 PRINT'Moser, A., Bioprocess Technology, Kinetics" 110 PRINT "and Reactors, Springer Verlag, 1988" 120 PRINT 130 PRINT "Ong, S.L., Biotechnol. Bioeng. 25: 2347, 1983" 140 PRINT '150 PRINT "Reklaitis, G.V., Ravindran, A. and Ragsdell," t60 PRINT "K.M., Engineering Optimization, Methods and" 170 PRINT "Applications, John Wiley & Sons. 1983" 180 PRINT t 90 PRINT "Rolz Carlos, Curso: lngenieria de'RQacciones" 2O0 PRINT "y Procesos Biologicos. lnst¡tuto Centroamericano" 210 PRINT "de lnvestigacion y Tecnologia lndustrial,'lcaiti," 220 PRINT "Programa: MOINTXS.BAS, 1989"
312
DE
v
4
;¿
230 PRINT 240 PRINT "PULSE ENTER !" 250 ANS§ : INPUTS(1) 260 CLS 270FOR X:1 TO 10000 280 NEXT X 290 CLS:KEY OFF 3oo GosuB 1o5o 310 CLS 320 WHILE CMD < >3 330 0N CMD GOTO 360,640 340 WEND 350 GOTO 1030 360 PAGINAo/o =1 370 GOSUB 1200 380 REM SUMINISTRAR DATOS Y CONSTANTES 390 PR!NT 400 INPUT "Conc.inicial de biomasa y sustrato ";CXo,CSo 410 PRINT 42O INPUT "Numero de pares de datos, incluir datos para t=0 ";N 430 PRINT 440 l=N 450 Dt M CS(t),T(t), CX(t l,X(t),y(t),A (t), E1 (tl,XX(D,TTill 460 FOR l:1 TO N 470 INPUT "Conc. bio.masa, sustrato, tiempo ";CX(l),CS(l),T(l) 48O NEXT
I
490 PRINT., 500 cLS 510 REM ESCRIBIR LOS DATOS EXPERIMENTALES LEIDOS 520 PRINT SPC(1 0);"DATOS EXPERIMENTALES" 530 PRINT 540 PRINT SPC(5);"Conc.biomasa";SPC(5);"Conc.sustrato";SPC(5);"Tiempo" 550 PRINT
560F1$:" ,
##"+" ###.##'+SPACES(S)+" ###.## "+ SPACES(SI+
###.##" 570 FOR l=1 TO
580 v
N
PRINT USING Fl $;l,CX(l),CS(ll,T(l)
590 NEXT I 600 PRINT 610 PRINT "PULSE ENTER t" 313
620 ANS$ : INPUTS(1} 630 CLS 640 lF PAGINATo>1 THEN PRINT CHR$(12); 650 GOSUB 1200 660 REM CALCULO DEL RENDIMIENTO CELULAR 670 YE : (CX(N)-Cx0)/(CS0-CS(N)) 680 REM CALCULO DE AP 690 AP:YE/CXO 7OO REM CALCULO DE X'S E Y'S SEGUN ONG
:. "
710FORt:1TON
72O 730
X(t):LOG(1 +Ap*(CSo-CS(|)l)/Tfl)
Yfl) : LOc(CSfl)/CSo)/Tfl) 740 NEXT I 750 REM SUBRUTINA DE AJUSTE POR MINIMOS
760 770 780 790 800 810
L:2
INPUT "Criterio de convergencia, (se sugiere 1E-3): ";E E1
:.5
GOSUB 1740
GosuB 1230 REM CALCULO DE MUMAX Y KS
82O MUMAX :A(2)/(A(1
830 840 850 860 870
.
CUADRADOS
)-1
)
KS = ((1 /AP) + CS0)/(A(1 )-1
)
PRINT
PRINT "Criterio de convergencia usado: ";E PRINT
PRINT "El valor calculado del rendimiento
y es: ";yE
88O PRINT
890 PRINT "Velocidad maxima de crecimiento, MUMAX ,';MUMAX 9OO PRINT
,
'
910 PRINT "El valor estimado constante Ks. es: ";KS 920 PRINT 930 PRINT "Desviacion estandar del ajuste ", 940 pRtNT tNT(1 0000000#*D)/1 0000000# 950 PRINT 960 PRINT "Numero de iteraciones requeridas: ";M 970 PRINT 980 PRINT "PULSE ENTER !" 990 ANS§ : INPUTS(1) l OOO WHILE CMD < > 3 1010 0N cMD GOTO 290,290 314
.
,,
1O2O 1O3O 1O4O 1O5O
WEND
1060 1070 1080 1090
PRINT
END
REM VENTANA DE MENU PRINCIPAL PRINT "MENU PRINCIPAL"
"1. lngreso datos experimentales" PRINI "2, Reiniciar calculo con nuevos valoresn PRINT "3. Terminar el calculo" PRINT
11OO PRINT
1110 INPUT "Favor seleccione numero y luego pulse ENTER !:",CMD' 1 120 PRINT 1130 PRINT "PULSE ENTER !" 1 140 WHILE CMD < > FIX(CMD) OR CMD < 1 OR CMD > 3 11
50
160 1 170 1 180 1 190 1
BEEP
PRINT
SPC(40);
';
INPUT "Favor entre 1 ,2 o 3 : ",CMD WEND RETURN
12OO PR]NT'CALCULO DE PARAMETROS DE MONOD' 1210 RETURN 1220 REM SUBRUTINA DE AJUSTE DE LA CURVA POR MINIMOS CUADRADOS
1230 FOR r:1 TO L 1240 E1(r) : E1 1250 NEXT I 1 260 M:O 1270 REM FIJAR RESIDUAL PARA EL ENSAYO 1280 Ll =1000000! 1290 REM RECORRER TODOS LOS PARAMETROS 1300 FOR r:1 TO L 1310 A0:A(r) 1320 REM OBTENER EL VALOR DEL RESIDUAL 1330 A(r):A0 1340 GOSUB 1s90 1350 REM ALMACENAR EL RESULTADO EN MO 1 360 MO :12 1370 REM REPETIR PARA M1 1 380 A(r) :A0*(1-E1 (t)) 1390 GOSUB 1590 1400 M1 =L2 315
-?
1410 REM CAMBIAR EL INTERVALO SI ES NECESARIO
1420 REM St LA VARTANZA AUMENTA, DtVtDA E1(l) EN DOS
PARTES
IGUALES 1430 tF M1 >M0 THEN E1(t):-El(t)/2 1440 REM SI LA VARIANZA DISMINUYE, AUMENTE E1(I)
1450 lF M1
MO THEN A(II:AO 1 480 tF M 1 > M0 THEN GOTO 1 340 1490 NEXT I 15OO REM FIN DE UN PASO COMPLETO 1 510 REM ENSAYO DE CONVERGENCIA
1520M:M+1 1530 IF L2:O THEN RETURN 1 540 IF ABS((11 -LzIILZI < E THEN RETURN 1550 REM SI ALCANZA ESTE PUNTO, SE REOUIERE OTRO PASO 1 560 L1 :12 1570 GOTO 1300 15BO REM SUBRUTINA DE GENERACION DE RESIDUAL
590 L2:0 600 FOR J:1 TO N 1610 X:X(J) 1620 REM OBTENCION DE LA FUNCION 1630 GOSUB 1690 * 1 640 L2 : L2 + (Y(J)-Y) (Y(J )-Y) 1650 NEXT J 1660 D=SOR(L2|(N-L)) 1670 RETURN 1680 REM SUBRUTINA DE FUNCIONES 1690 Y:A(11"X-A(2) 1 1
17OO RETURN
1710 REM LECTURA ESTIMADOS DE PARAMETROS INICIALES 1720 ANSS : INPUTS(1) 1730 CLS 1740 INPUT "Estimado inicial de Ks para iniciar calculo:";KS 1750 PRINT 1760 PRINT "Estimado inicial de Ks: ";KS 1770 Al1) : (1 + (CXo + YE*CSoI/(YE"KS)) 1780 PRINT 1.790 INPUT "Estímado inicial de MUMAX para iniciar calculo:";MUMAX 316
-
- ) -.
1800 PRINT "Estimado inicial MUMAX: ";MUMAX 1 81 0 A(21 : MUMAX* (CXO + YE*CSO)/(YE*KS) 1820 RETURN
Tabla 5. 1 3 Programa C:\DOS\GWBASIC\LEDUYZAJ.BAS. Leduy, A.L.,y Zatic, J.E., 1973; Oner, M.D., et al., 1986; Rolz, Carlos, 1989.
fO CLS 20 PRINT "LEDUYZAJ.BAS: METODO DIFERENCIAL DE ANALISIS" 30 PRINT 40 PRINT "PROCEDIMIENTO GEOMETRICO DE DIFERENCIACION DE UNA" FUNCION EXPERIMENTAL EN UN PUNTO 50 PRINT " 60 PRINT 70 PRINT tr 80 PRINT "REFERENCIAS: 90 PRINT 100 PRINT'Leduy, A.L.,y Zajic, J.E., Biotechnol, Bioeng. 1 1O PRINT " 1 5: 805, 1 973 120 PRINT 130 PR|NT "Oner, M.D., et al., Biotechnol. Bioeng. " 140 PRINT "28:902, 1986 150 PRINT rr 160 PRINT "Rolz Carlos, lnstituto Centroamericano de 170 PRINT "lnvestigacion y;fecnologia lndustrial. lCAlTl " 180 PRINT "Curso de lngenieria de Reacciones y Procesos rr 190 PRINT "Biologicos, Guatemala, 1989. Programa: DIFLEZ.BAS" 'ir
2OO PRINT
210 PRINT "EVALUACION DE LAS VELOCIDADES DE CRECIMIENTO
DE
BIOMASA "
220 PRINT "Y DE CONSUMO DE SUSTRATO A PARTIR DE DATOS MENTALES" 230 PRINT 240 PRINT "PULSE ENTER
250 ANS§ : INPUT§(I} 260 CLS 270 FOR X:1 TO 10000 280 NEXT X 290 CLS:KEY OFF
EXPERI-
!'
317
300 GosuB 790 310 CLS 320 WHILE CMD < >3 330 0N CMD GOTO 360,440 340 WEND 350 GOTO 770 360 PAGINAYo:1 370 REM SUMINISTRAR DATOS
: ,
{'i
38O PR]NT 39O INPUT "Numero de valores de la variable dependiente ";V 4OO PRINT
41O
W:V+3
42O DIM TETA(W),CX(WI,ZMAB(W),ZMBC(W},DCX(W),CXCR(W),ZMNO(W ,ZNNO(W}
430 DIM ZMMO(W),ZNMO(W},TETAC(W) 440 FOR l=1 TO V 450 INPUT"IND,DEP';TETA(ll,CX(l) 460 NEXT I
.
47O REM ESCRIBIR DATOS EXPERIMENTALES
480 CLS 490 PRINT SPC(1 6l;'DATOS EXPERIMENTALES" 5OO PRINT
0 PRINT SPC(5); "Variable independiente" ;SPC( 51;"Variable dependiente" 520 PRINT 530 Fl$=1 ## "+" ####.#### "+SPACE§(10)+" ####,#### I 540 FOR l:1 TO V 51
550
.
PRINT USING
Fl9;l,TETA(l),CX{l)
560 NEXT I 570 PRINT 58O PRINT "PULSE ENTER !"
590 ANSS : INPUTS(1} 600 IF PAGINA% > 1 THEN PRINT CHR${1 2}; 610 CLS 620 PRINT SPC(1 0);"DATOS CALCULADOS" 630 PRINT 640 PRINT SPC(S);"lND";SPC(1 7);"DERIVADA" 650 PRINT 660 GOSUB 930 670 F1$:" ##.## "+SPACE$(8)+" ####.## 080 FoR l:1 TO v 318
,
r
690
PRINT USING F1§; TETA(|),DCX(I)
7oo NEXT I 71O PRINT
720 PRINT "PULSE ENTER !" 730 ANS$ : INPUTS(1} 740 WHILE CMD < > 3 750 oN.CMD GOTO 290,290 760 WEND 770 CLS 780 END 790 PRINT "MENU PRINCIPAL" 8OO PRINT
2r
81O PRINT
820 830 840 850
PRINT PRINT
"1. lngreso datos experimentales" "2. Reiniciar calculo" "3. Terminar calculo"
PRINT
INPUT "Favor seleccione numero : ",CMD WHILE cMD < > FIX{CMD) OR CMD< 1 OR CMD> 3
j60 870
BEEP
880 INPUT "Favor entre 1 ,2 o 3: ",CMD 890 WEND 9OO RETURN
r
910 PAGINAo/o: PAGINAo/o + 1 920 REM SUBRUTINA LEDUY Y ZAJIC 930 l:1 940 DCX(l) : (CX(l + 1)-CX(l))/(TETA(l + 1 )-TETA(ll) 9S0 ZMAB(t+ 1):(CX(t+ t )-CX(D)/(TETA(I+ 1]-TETA(|)) 960 zMBC(l + 1 ) = (CX(l + 2)-CX(l + 1 ))/(TETA(| + 2)-TETA(| + 1 )) 970 lF ABS(ZMAB(I + 1)-ZMBC(l + 1 ))< : .001 THEN 980 ELSE 1030 980 DCX(t+ 1):.5"(ZMAB(|+ 1)+ZMBC(l+ t )) 990 l:l+1 1000 lF {l + 2} < : V THEN 1010 ELSE 1O20 1010 GOTO 950 1O2O IF I
060
y
1O7O TETAC(|+
)
1):
))-ZMMO(|
(ZNNO(l+ 1)-ZNMO(l+ 1))/(ZMMO(l+ 1)-ZMNO(l+ 1)) 319
1080 cxcRfl + 1 ) :zMMo(r + 1 I"TETAC(I + 1 I +ZNMO(I + 1 ) 1090 DCX(l + 1 ¡ = (TETAC(l + 1 )-TETA(l + 1 ))/(CX(l + 1 )-CXCR(l + 1 )) 1 1 o0 GOTO 990 1 1 10 DCX(l + 1 ) :(CX(l + 1 )-CX(l)l/(TETA(! + 1 )-TETA(l)l 1 1 20 GOTO 990 1 1 30 RETURN
Tabla
5.14
Programa C:\GWBASIC\SPLINE.BAS. Rolz, C., 1989; Tao, B.Y., 1
987.
1O CLS;KEY OFF
20 PRINT "SPLINE.BAS: METODO DIFERENCIAL DE ANALISIS" 30 PRINT 40 PRINT 50 PRINT "EVALUACION DE LOS COEFICIENTES DE LA CURVA" 60 PRINT "DE AJUSTE DE UNA FUNCION EXPERIMENTAL 70 PRINT 80 PRINT''REFERENCIAS: 90 PRINT 100 PRINT "Rolz Carlos, lnstituto Centroamericano de" 110 PRINT "lnvestigacion y Tecnologia lndustrial, lCA.lTl" 120 PRINT "Curso de lngenieria y Procesos Biologicos" 130 PRINT "Guatemala, 1989" 140 PRINT 1 50 PRINT "Tao, B.Y., Chem. Eng. Octobe¡ 26, p. 109, 1987" 160 PRINT 170 PRINT 180 PRINT 'EVALUACION DE VELOCIDADES DE CRECIMIENTO" 190 PRINT "DE BIOMASA Y CONSUMO DE SUSTRATO A PARTIR" 2OO PRINT "DE DATOS 210 PRINT
EXPERIMENTALES
II
220 PRINT "PULSE ENTER !" 230 ANS§ : INPUT$(1} 240 CLS 250 INPUT "NUMERO DE PUNTOS DE DATOS ";NUM 260 PRINT 270 PRINT "X: variable independienfe: Y: variable dependiente" 280 PRINT 320
Y
290 DlM XDATA(NUMI,YDATA(NUM) 3OO FOR I:O TO NUM-I 31O INPUT"X,Y";XDATA(II, YDATA(I)
32O
NEXT
I
330 GOTO 390 340 OPEN "O",#1,N$:WRITE #1, NUM 350 FORN= 0TONUM-1 360 WRITE #1, XDATA(N):WRITE #1, YDATA(N)
370
NEXT
N
380 CLOSE 390 GOTO 480 400 oPEN "1",#1,N§
4lO
INPUT #1,NUM
420 DIM XDATA(NUMI,YDATA(NUM)
43O FOR I:O TO NUM.I 44O ]NPUT #1, XDATA(I):INPUT 450 NEXT
#1,YDATA(I)
I
460 470 480 490
CLOSE
ANS§ = INPUTS(1) N=NUM:CLS PRINT "RESULTADOS"
5OO PRINT 510 PRINT
52O PRINT "X: Variable independiente" 53O PRINT "Y: Variable dependiente" 540 PRINT "B: primera derivada" 550 PRINT "C,D: coeficientes"
560 PRINT 570 DIM A(N),8(N),C(N},D(N), P(N), O(N),R(N},S(N), STEPSIZE(N} 580 REM XDATA(n!, YDATA(nI son arreglos de n puntos de datos 59O REM A(N),8(N),C(Nl,D(Nl son arreglos de coeficientes polinomiales 600 REM en la forma f(x)=¿1¡¡+b(i)+x+c(i)*x^2*d(i)*x^3 610 REM PASO 1 DEL ALGORITMO 620 O(0) : 1 :O(N) : 1 :R(0) :0:S(0) =0:S(N) :0:C(N) :0 630 FOR !=O TO N:A(l):YDATA(I):NEXT I 640 REM PASO 2 DEL ALGORITMO
650 FORr:0TON-1 660 STEPSIZE(I) : XDATA(I + 1)-XDATA(|)
6"70
§_
NEXT
I
'680 REM PASO 3 DEL ALGORITMO 321
690 FOR|:1TON-1
: i
7OO A(I.
-
71
1)
0
P(l):3"((A(l+1)*STEPSIZE(l-1))-(A(ll*(XDATA(l+1)-XDATA(l-1)))+(-
*STEPS¡ZE(I))I/(STEPSIZE(I-1 *STEPSIZE(I)} }
O(l) =2*(XDATA(I + 1 )-XDATA{|-1 ))-(STEPSIZE(I-1 }*R(l-1 )} R(l) = STEPSIZE(l)/O(l)
720 730 S(r) : (p(¡)-(srEpstzEfl-1)"s0-1 ))t/o(l) 740 NEXT I
75O REM PASO 4 DEL ALGORITMO
760 FOR r:0 TO N-1 77O J : N-1-l 780 C(J):S(J)-(R(J)*C(J+l)) 790 B(J) = ((A(J + 1 l-A(J))/STEPSIZE(J))-(STEPSIZE(J)*(C(J 800 D(J) : (C(J + 1)-C(J))/(3.STEPS|ZE(J)) 810 NEXT I
+
1)
+
2*C(J))/3)
820 REM IMPRIMIR LOS COEFICIENTES DE CADA INTERVALO FOR r:0 TO N-1 PRINT "¡:";XDATA(|);SPCt3);"Y:";YDATA(!); SPC(3);"8:";B(l); SPC(3);"C : ";C(l);SPC(3);" D : ";D(l)
830 840 850
NEXT
I
860 END
5.7
CONSIDERAC¡ONES GENERALES SOBRE BALANCE DE MATERIALES, CINETICA Y SIMUTACION DE REACTORES
El propósito de esta sección es analizar algunos biorreactores donde ocurren reacciones bioquímicas orlginadas por la acción de células vivas.
5.7.1
Reactor por lotes
En un reactor por lotes normalmente equipado con un agitador y un sistema de
control de pH la composicíón det caldo es uniforme. Por consiguiente, si .el 322
"
-
modelo de Monod describe adecuadamente elcrecimiento de biomasa en la fase exponencial de crecimiento:
rr=v-x = P¡¡'x'§
:
&*
t5.67I
Las células iriician su crecimien,o del perfodo de adaptación "*ron.ncialdespués :: una vez inoculado el caldo con un cultivo semilla:
1d*
=\
, [4=far=t_to JJ 'x
[5'68]
,o
Donde, t.: perlodo de adaptación; t - to: período de retención en el reactor por lotes: se representa gráficamente como el área baio la curva' 1/r, vs x, (Figura 5.8, Ejemplo 5.3).
Ejemplo
5.3 Simulación
del crecimiento de Aerobacter cloac'ae en un reactor por lote§
Herbert et al., 1956, informan los siguientes datos correspondientes a la cinética de crecimiento de Aerobacter cloacae en un medio de crecimiento con glicerol como sustrato l¡mitativo: pr: 0,85 hora-l; Kr: 0,Ol 23 gllit¡o; Yr.: 0,53 (g biomasa seca)/(g glicerol).
Simular el crecimien to de Aerob!"t", en un reactor por lotes |¡€n .un "tor"ae reactor de flujo tapón. Representar gráficamente el tiempo de retención. Solución
- La simulación del crecimiento de Aerobactr, ,tor")" se
realiza mediante el programa C:\GWBASIC\HERBERTl .BAS, resumido en la Tabla 5.1 5.
323
- La Figura 5.7 es una representacién gráÍica de la variación de las concentraciones de glicerol y de microorganismos con respecto al tiempo de retención
-
En la Figura 5.8 se representa gráficamente el t¡empo de retención como'el área bajo la curva 1/r* vs x.
Tabla 5.1 5 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor por lotes, programa: C:\GWBASIC\HERBERTl .BAS. 1O CLS
20 PRINT "HERBERTI .BAS' 30 PRINT 40 PRINT "Cinetica de crecimiento de Aerobacter cloacae" 50 PRINT 60 PRINT 70 PRINT "CRECIMIENTO POR LOTES SIN FORMACION DE PRODUCTOS" NO CELULARES" 80 PRINT " 90 PRINT 1OO PRINT "PULSE ENTER !" 1O ANS§ 1 20 CLS 1
: INPUT$(1
)
130 NN=1 140 REM Escribir las constantes: UMX:1/hora;KS:g/litro 150 REM Y:g microorganismos/g glicerol 160 REM S0: g glicerol/litro; X0: g microorganismos/litro 170 UMX:.85 180 KS:.0123 190 Y:.53 200 REM Paso de integracion: T1 210 T1 : .01 220 REM Valor final de la variable independbnte: T2 230 T2:3.5 240 REM lntervalo de impresion de los resultados: T3 250 T3:.1 260 PRINT "HERBERTl .BAS" 270 REIU Simulacion del crecimiento por lotes sin formacion de producto 280 PRINT 290 PRINT "T: variable independiente (tiempo, horas)"
324
300 PRINT "Valor final de T, T2:";T2 310 PRINT "T1: paso de integracion, T1 :";T1 320 PRINT 'T3: intervalo de impresion, T3=";T3 330 PRINT 340 PRINT "PULSE ENTER I" 350 ANSS : INPUT§(1 ) 360 CLS 370 PRINT "RESULTADOS" 380 PRINT 390 PRINT "T: tiempo, horas" 400 PRINT "O(1): concentracion de glicerol, g/litro" 410 PRINT "O(2): concentracion de microoorganismos, g/litro" 420 PRINT "l(2): velocidad de crecimiento de microorganismos, g/litro"
\=
440 REM Numero de ecuaciones diferenciales: 450 N:2 460 REM condiciones iniciales: O1 :S;O(2):X 470 0(1):3 480 0(2):.1 490 REM Subrutina de Runge-Kutta de orden 4: 500 T: INT(T2ffl + .5):T1 :TZ|T:T: INT(T3iT1 + .5):T3:T*T1 :T:0:T4 =0 510 TB:1:GOTO 750 520 IF(T-T4 +T1 110)<0 THEN 560 530 T4 :T4+T3:T5 =lNT(T/Tl +.51:T:T5"T1 : GOSUB 800 540 |F(T-T2 +T1t10)<0 THEN 560 550 LOCATE 23,1:END 560 0N TB GOTO 580,620,660,700 570 PRINT"** ERROR """:STOP 580 FOR T5:1 TO N 590 T0(T5) : T1 *l(T5):T6(T5) : O(T5]:O(T5) = O(T5) + TO(T5)/2 600 NEXT T5 610 T:T+T1 l2:f9:2:GOTO 750 620 FORTS:1 TO N 630 T7 :T1 *l(T5l:T0(T5) =T0(T5) + 2*T7:O(T5) :T6(T5) +f7 2 640 NEXT T5 650 T8:3:GOTO 750 660 FORT5=1 TO N 670 T7: Tl *l(T5l:T0(T5) :T0(T5) + 2*T7:OlT 5) :T6(T5l + T7 680 NEXT T5 690 TB :4:f :T +T112:GOTO 750 325
7OO FOR
T5:1 TO N
0 O(T5) :T6(T5) + (T0(T5] +T1 *l(T5))/6 720 NEXT T5 730 T8: 1 :GOTO 750 740 REM ECUACIONES DIFERENCIALES: 750 r(1t:i|tztry 760 tlzl:U*Q(2) 71
77O
U:
(UMX*O(1 ))/(KS + O(1))
780 GOTO 520 790 PR]NT SO0PRINTSPC(31;"T: ";T;SPC(3);"O(f )= ";O(l );SPC(31;"Ol2l:";Ol2l;SpC(3);
"l(2l.:";ll2l
810 NN:NN+1 820 RETURN
Figuta 5.7 Resultados obtenidos en la simulación delcrecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor por lotes, programa: C:\GWBASIC\HERBERTl .BAS. Varia-
ción de la concentración de células y de sustrato con respecto a¡ tiempo de retención.
Concen tracion, g/l i tro
326
Figura 'i
5.8
Resultados obtenidos en la simulación delcrecimiento de Aerobacter
cloacae en un reactor por lotes, programa: C:\GWBASIC\HERBERTI.BAS. tiempo de retención requerido corresponde al área bajo la curva 1/r* vs x. 10
El
l/Rx
o,5
1
1,5
Concentracion de biomasa, g/litro
5.7.2
Reactor cont¡nuo de flujo tapón
Eri el reactor continuo de flujo tapón los nutrientes y los microorganismós-entran
por un extremo, las células crecen a medida que avanzan dentro del reactor, y las células junto con los productos del metabolismo salen por el extremo opuesto. La ausencia de agitación impide la mezcla completa del contenido del reactor. La concentración de células, de sustrato y de producto varía en las direcciónes axial y radial. Si el reactor es operado en condiciones estables y se desprecia la variación de la concentración en la dirección radial, entonces estas concentraciones cambian con respecto a la pos¡ción axial dentro del reactor pero permanecen constantes en cada punto con respecto al tiempo. Las concentraciones en cada punto del reactor en la dirección axial son similares a las alcanzadas en un fermentador por lotes en igual tiempo de residencia.
321
En la práctica el comportamiento de los fermentadores de lecho empacado y multietapa se aproxima al de flu.io tapón (PFR). Por consiguiente, las ecuaciones correspondientes a un reactor porlotes (Ecuaciones t5.67ly t5.681) son aplicables al reactor de flujo tapón. Sin embargo, como la operación es cont¡nua, el tiempo de retención se calcula como: V L
--
F
t5.691
En la Figura 5.8 se representa gráficamente elt¡empo de retención como el área
bajo la curva 1/r* versus x.
5.7.3
Reactor cont¡nuo de mezcla completa (CSTRI
El reactor continuo de mezcla completa (CSTRI es uno de los equipos más utilizados a escala industrial, tanto para fermentaciones aeróbicas como anaeróbicas, con microorganismos y con células animales y vegetales. Una selección adecuada del impulsor y de la velocidad de agitación permite el control de la intensidad de la mezcla. El sistema de cultivo continuo operado como quimiostato o como turbidostato mantiene la población microbial en un estado de crecimiento exponencial durante períodos prolongados de tiempo. En el quimiostato el caudal suministrado por la bomba se mantiene en el valor
deseado y la velocidad de crecimiento se ajusta a este valor. El turbidostato mantiene constante la turbidez del caldo mediante un sensor óptico y un sistema de control para ajustar el caudal.
Aunque el quimiostato es un sistema fácil de operar, se recomienda el' turbidostato cuando hay necesidad de ajustar la fermentación a velocidades de dilución cercanas al punto de lavado. En estQ punto la pérdida de célulás en el . efluente supera el crecimiento de las mismas en el fermentador, fenómeno que puede prevenirse mediante la regulación del caudal.
328
Figura
5.9
Representación esquemát¡ca de un reactor continuo de mezcla
completa (CSTR).
CSTR
La ecuación de balance de microorganismos en el reactor continuo de mezcla completa (Figura 5.9), es:
Entradas
-
Salidas
+
Crecimiento
F.x^-F.x+V.rx
=
:
Y.4 &
Acumulación t5.701
Donde, F.x^: microorganismos en elafluente: F: caudal, m3/s; x^: concentración de microorganismos en el afluente, kg célutas/m3; F.x: microorganismos en el efluente; x: concentración de celulas en el reactor; V: volumen del caldo, m3; r*: velocidad de crecimiento de las células en el fermentador; dx/dt: camb¡o con respecto alt¡empo de la concentrac¡ón de células en el fermentador. En condiciones estables, los microorganismos crecen a una velocidad suficiente para reemplazar los que salen en el efluente (dx/dt = 0). Además si el alimento es estér¡! (x^ : g¡ la ecuación anter¡or se convierte en:
f=-
x tx
t5.711
329
Donde, rn,: tiempo de residencia en el reactor cont¡nuo de mezcla completa (CSTR). De acuerdo con esta ecuación el tiempo de residencia es igual al área de un rectángulo de anchura x y altura 1lr*, tal como se indica en las Figuras 5.10 y 5.11.
:
Figura 5.10 Rápresentación gráfica de los resultados obtenidos en la simulación
del crecimiento de Aerobacter cloacae, con et programa: C:\GWBASIC\HERBERTl .BAS. Eltiempo de retencíón requerido en un reactor continuo de mezcla completa (CSTRI para alcanzar una concentrac¡ón de producto x, corresponde alárea de un rectángulo de anchura X¡ = 1,687 (g producto)/litro y altura 1/r* : 1,947 (litro.hora)/g. 7/Rx
o,5
1
Concentracion de biomasa,
1,6
g,/l
i
tro
5.7.4 Productividad y grado de conversión
La productividad, P,, de un proceso, se define generalmente como la masa de producto,¿ obtenida por unidad de tiempo y unidad de volumen, kg.m-3.s-1.
330
:
La Figura 5.12 es una representación gráfica de los resultados obtenidos en la simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor cont¡nuo de mezcla completa (CSTR). Las condiciones de operación del reactor, catculado con los datos del Eiemplo 5.3, son evaluadas a partir de la representación gráfica de la velocidad de formación de producto, r*. La máxima productividad es igual a la pendiente de la lfnea tangente a la curva de concentración de producto. Los valores,óptimos de la concentración de producto (x : 1,586 g producto/litro) y de tiempo de retención (t : 1,25 horasl coinciden con los obtenidos en la Figura 5.11. Un proceso discontinuo requiere un perlodo de adaptación, t¡, para cosechar-el producto, limpiar, esterilizar, inocular y arrancar el proceso. La tangente lrazada desde el punto: t : t¡, c : 0, hasta la curva, c¡ vs r, corresponde a la máxima productividad de un proceso discontinuo:
f5.721
Donde, (P,)0": productividad del proceso discontinuo, en producto j; cojr concentración inicial del producto j; cr,: concentración final del producto; tA: período de adaptación; tr: tiempo de reacción requerido para alcanzar la concentración final c, de producto. La tangente trazada desde el origen de la curva, cj vs
curva, corresponde
a la
f, Figura 5.12, hasta la
máxima productividad de un proceso continuo
equivalente:
t5-73I
Donde, (P¡)": productividad del proceso continuo en producto ción de producto j, alcanzada en el t¡empo de reacción t,.
f
c,,: concentra-
Si se considera que en un proceso continuo no hay período de adaptación:
(P)" > (P)e
332
desustratos muy costosos, el proceso se prolonga hasta la completa utilización del sustrato. En este punto la productiv¡dad teórica del proceso es ceto. En el casO
El grado de conversión de sustrato en producto se define como: 15.741
Donde, C,.: grado de conversión del sustrato; sio: concentraciÓn inicial del sustrato r, en el t¡empo f : 0; sit: concentración final del Sustrato en el tiempo t : t. La definición del grado de conversión (Ecuación 5.74) supone que el volumen de líquido en el reactor permanece constante.
Figura 5-11 bimulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor continuo de mezcla completa (CSTR), calculado con los datos del Ejemplo 5.3' Los valores óptimos de la concentración de producto (x : 1,586 g producto/litro) y de t¡empo dé retención (t = 1,25 horas) coinciden con los obtenidos ert la Figura 5.1 1 . Concen traci on, g/l i tro
1,5
o,5
Sustrato o ^oF
o,5
o,75
1,25 Tlempo de retencion, horas 1
1,5
1,75
333
En algunos casos
elgrado de conversión se expresa como una cantidad relativa:
Pv=
ci"
(P)"n
t5.75I
Donde, P,,: productividad relativa'del proceso en producto i; C,.: grado de conversión deliustrato en producto r; (P,)ro*: máxima productividad del proceso en producto i.
5.7.5
Reactor por ¡otes con al¡mentación cont¡nua
Uno de los métodos empleados con mayor frecuencia en la operación semicontinua de fermentadores es la "operación de un reactor por lotes con atimentación continua (fed-batch) ilustrado en la Figura 5.13. Sila concentración delalimento es alta el volumen efectivo del caldo en el reactor no cambia apreciablemente. A causa de la baja solubilidad deloxfgeno, la operación semicontinua, en el caso de fermentaciones aeróbicas, incluye generalmente la modalidad de alimentación continua de aire o de oxígeno.
Figura
5.13
Representac¡ón esquemática de un reactor por lotes con alimentación continua.
o.
334
Generalmente se util¡za una de las siguientes estrateg¡as de alimentación con el propósito de controlar el reactor: - Alimentación con caudal constante o con caudal linearmente creciente.,,
-
Alimentación con caudal exponencialmente creciente con el objeto de mantener cqnstante la concentración de sustrato y alcanzar un crecimiento exponencial.
:.' - Alimentación con caudal controlado por alguna respuesta del sistema como, por ejemplo, el cociente respiratorio, la composición de los gases efluentes, o la concentración de algún producto,
- Alimentación
o en lotes repetidos.
Después de cada período de operación el reactor se desocupa parcialmente y entonces se alimenta sustrato para recuperar el volumen inicial.
clclica
:
Ejemplo
5.4 Simulación
de! crecimiento de Aerobacter oloacae en por lotes con al¡mentación continua un reactor
Simular el crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor reactor por lotes con
alimentación continua. ltt¡¡ : 0,85/hora; Ks : 0,0123 gllitro; Yr,.': 0,53 0 I biomasa seca/g glicerol; F : 160 litros/hora, so = 3 gramos glicerol/litrol. \
Solución :
,t-
La simulación del crec¡m¡ento de Aerobacter cloacae se realiza mediante'el programa C:\GWBASIC\HERBERT2.BAS, resumido en la Tabla 5.16: En la Figura 5.I4 se representa elvolumen de caldo en el reactor, yla variación de la masa de glicerol y de microorganismos con respecto al tiempo de retención,. Los resultados obtenidos con el programa C:\HERBERT2,BAS, en elcaso de F : O, concuerdan con los obtenidos con el programa HERBERT1.BAS.
335
: .,
Tabla 5.16 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en uñ reactor por lotes con alimentación continua, programa: C:\GWBASIC\HERBERT2.BAS' 1O CLS
20 PRINT "HERBERT2.BAS" 30 PRINT 40 PRINT "Cinetica de crecimiento de Aerobacter cloacae" 50 PRINT 60 PRINT 70 PRINT "CRECIMIENTO POR LOTES SIN FORMACION DE PRODUCTO" CON ALIMENTACION CONTINUA" 80 PRINT " 90 PRINT' SiN FORMACION DE PRODUCTOS NO CELULARES" 1OO PRINT.
110 PRINT "PULSE ENTER I" 1 20 ANSS = INPUT$(1 l 130 CLS 140 NN:1 150 REM Escribir las constantes: UMX:1/hora;KS:g/litro 160 REM Y:g microorganismos/g glicerol; Vo:volumen inicial, litros 170 REM SO: g glicerol/litro;XO: g microorganismos/litro 180 REM Fícaudal, litros/hora; MX: masa de microorganismos, g 190 REM MS: masa de sustrato, g 200 UMX:.85 210 KS:.0123 220 Y: .53 230 V0:100 240 SO:3 250 X0 = .1 260 F:160 270 REM Paso de integracion: T1 280 T1 :.O1 290 REM Valor final de la variable.independiente: T2 : 300 T2:6.5 310 REM lntervalo de impresion de los resultados: T3 320 T3 =.5 330 PRINT " HERBERT2. BAS" 340 PRINT 350 PRINT "T: variable independiente (t¡empo, horas)" 360 PRINT "Valor final de ¡,¡l:";T2 370 PRINT "T1: paso de integracion, T1 :";T1 336
Y
380 PRINT "T3: intervalo de impresion, T3:";T3 390 PRINT 4OO PRINT "PULSE ENTER !"
410 ANS§ = INPUTS(1) 420 CLS 43O PRINT "RESULTADOS"
=,
44O PRINT 45O PRINT "T: tiempo, horas" 460 PRINT 'V: volumen del caldo, litros" 470 PRINT "X: concentracion de celulas, g/litro" 480 PRINT "S: concentracion de glicerol, g/l¡tro" 490 PRINT "MS: masa de sustrato, g" 500 PRINT "MX: masa de celulas,g 510 REM Numero de ecuaciones diferenciales: 520 N:5 53O REM condiciones iniciales: Ol :S;O(2):X; O(3): volumen s40 0(1):s0 550 O(2):X0 560 0(3t:v0 570 0(4):V0*S0 58O
=
O(5):V0*X0
590 REM Subrutina de Runge-Kutta de orden 4: 600 T: INT(T2/T1 +.5):Tl =T2|T:T =INT(T3/T1 +,5):T3 :T*T1 :T=0:T4 610 T8= 1:GOTO 860 620 IF(T-T4 +T1t10)<0 THEN 660 630 T4:T4 +T3:T5 = INT(T/TI +.5):T=T5*T1 : GOSUB 960 640 |F(T-T2 +T1l1O)<0 THEN 660 650 LOCATE 23,1:END 660 0N T8 GOTO 680,720,760,800 670 PRINT"*" ERROR **":STOP 680 FORTS:1 TO N 690 TO(T5) :T1 *l(T5):T6ff5) =O(T5):O(T5) : Offs) +TO(T5)/2
:0
7OO NEXT T5
710
T:T +1112:T8:2:GOTO T5:1 TO N
860
72O.FOR
730 740 750 760
\i
T7:T1 "l(T5):T0(T5l :T0(T5) +2*T7:OlT5) :T6(T5) +T712 NEXT T5
T8=3:GOTO 860 FOR T5=1 TO N 77OT7=T1*|(T5):T0(T5)=T0(T5)+2*T7:OIT5)=T6(T5)+T7 337
780 NEXT T5 790 TB :4:T:f +T1|2:GOTO 860 BOO FOR
T5:1 TO N
810 O(T5) =T6(T5) + {T0(T5} +T1 "l(T5))/6 820 NEXT T5 830 T8:1 :GOTO 860 840 REM ECUACIONES DIFERENCIALES: 850 REM l(1 ):RS; l(2):RX; l(3):F;l(41 :MS';l(5) =MX' 860 l(1 I =1l2lN 870 tl2l: u"o(2) 880 r(3) : F 890 U : (UMX*O(1 lli(Ks + O(1 )) 900 1(4) :O(3)*l(1 ) + 3*l(3) 910 l(51=O(3)*l(2) 920 0(1):O(4)/O(3) 930 0(2):O(s)/O(3) 940 GOTO 620 950 PRINT
:'
960PRlNTSpC(3); "T ;T;SPC(3); "V : ";O(3);SPC(3); "X = ";O(2);SpC(3);'S ";O (1 );SPC(31;"MS : ";O(41;SpC(3);"MX= ";O(5)
97O
:
-
NN:NN+1
980 RETURN
5.7.6
Reactor cont¡nuo de mezcla completa con tec¡rculación
Cuando se disminuye el tiempo de retención en un reactor continuo de mezcta completa (CSTR) aumenta la productividad celular hasta alcanzar un valor máximo. sin embargo, sieltiempo de retención disminuye ligeramente después de alcqnzar este valor máximo, la velocidad de generación de células es inferior a la velocidad de salida de células en el efluente del reacior y la prodr.rctividad disminuye rápidamente debido al 'lavado" de las células del reactor.
338
5.14 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor por 3 gramos/litro!, totes con alimentación continua (F : 160 litros/hora, so = Figura
'programa:
C:\GWBASIC\HERAERT2.BAS.
!1
Masa, gramos , ¡---------------
Vol
2úúú
:
..:
umen efec tlvo, I i tros
2000
1
600
1
000
500
.5
45
o
Tlempo, horás
Figura
5.15
Reactor continuo de mezcla completa con recirculación
CSTR
F¡ltroclon tongenctol
339
Un procedimiento para aumentar la productividad es recircular las células después de separarlas del efluente mediante un filtro u otro sistema de separación (Figura 5.15). La vefocidad de crecimiento es proporcional a la concentración de células, x, y al aumentar x aumenta la productividad. Por consiguiente, el reactor CSTR se puede operar en condiciones estables sólo si hay una recirculación parcial y una corriente efluente, E, tal como se muestra en la Figura 5.1 5. En este caso, el balance de materiales del fermentador es:
F.r^ - E.x + V.1t.x = v-&
t5.76t
dr
Donde, F: afluente
al reactor, litros/hora; E: efluente del reactor; xo, x:
concentración de células en el afluente y en el reactor, respectivamente, g/litro; V: volumen de caldo en el reactor, litros; p: velocidad específica de crecimiento
de células, (hora)-1; dx/dt: incremento de la concentración de células en
el
reactor, g/(litro. hora). En condiciones estables, dx/dt : ecuación anterior se convierte en:
0, y con alimentación estéril, xo : 6,
E =3=P ;l¡=
FD
!;,=#,i=,
¡¿
ls.771
Donde, r: tiempo de retención, horas; D: velocidad de dilución, hora-1; relación de recirculación. Si B : 1, no hay recirculación y D : p.
B;
Sila velocidad de crecimiento sigue la c¡nética de Monod se obtiene la siguiente ecuación para evaluar la concentración de sustrato después de reemplazar P : B.D en la ecuación de Monod:
B.& t.lt,o -
15.781 B
Esta ecuación es válida para r.p > B. La concentración de células en el reactor se calcula a partir del coeficiente de rendimiento Y*,.:
340
vtrls -
E
s¡
-s
F
| . = +.(s¡
- ")
t5.791
Figura 5.16 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor cont¡nuo de mezcla completa (CSTR) con recirculación (F : 160 litros/hora, so = 3 gramos/litro), Efecto de la relación de recirculación B sobre la concentración de células y la productividad.
3,5
i,
(e=o,o); concdntraolon de celütas, gllltro
2,5 l::i
tili
1,5
tlvldad, g/(litroihora) .-.:::__--___]] vidad, g/(litr
o
o
46
a
Tlempo de retencion, horas
En la Figura 5.16.se presenta el efecto de la relación de recirculación sobre la concentración de células y la productividad en la símulación del crecimiento de Aerobpcter cloacae en u.n reactor cont¡nuo de mezcla completa (CSTR) con recirculación (F : 160litros/hora, sc : 3 g/litro). En elcaso especial de B : 1, no hay recirculación de células yi ! = D = 1lr. La concentración de células y
la productividad se duplican en el caso de B
:
O,5, lp
:
B.D
: Bltl.
341
5.7.7
Fermentadores en serie
Las siguientes conclusiones generales pueden deducirse de la confrontación de las Figuras 5.8, 5.10 y 5.1 1, para un sólo fermentador:
- El reactor continuo de mezcla completa (CSTR) operado a una concentración de producto correspondiente a (1/r¡1.¡^¡.o. es el sistema más productivo ya que requiere el menor tiempo de residencia (Figura 5.1 1).
- Cuando hay necesidad de alcanzar una concentración de producto
(células), X¡, €n el perfodo de crecimiento estac¡onario, se logra mayor productividad en
el fermentador por lotes (Figura 5.8) que en el sistema de reactor continuo de mezcla completa (Figura 5.10).
- La selección del sistema óptimo de fermentación depende de la forma de la curva 1/r^ versus x y de los requerimientos del proceso, tales como el grado de conversión deseado o la concentración final del producto. Si la concentración final de producto es menor que la correspondiente a (1/rxl.in¡^o, es más eficiente un sólo fermentador que dos conectados en sene.
- sin embargo, si la concentración final de producto (xr) es mucho mayor que la correspondiente a (1/rr),,n,-o, la mejor combinación para rograr er mínimo tiempo de retención es un reactor cont¡nuo de rirezcla completa (CSTR) operado
a una concentración de producto, xópti.o, valor correspondiente a
(1/rx).rn¡.o,
seguido de un reactor de flujo tapón (PFR), (Figuras 5.17 y S.181. - Aunque la Figura 5,18 ilustra el procedimiento de evaluación delt¡empo total de retención del sistema de reactores csrR y pFR en serie, debe tenerse presente que en el caso particular de la simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae, xF = xópti-o, y, por consiguiente, sólo es necesario un reactor.
- De las Figuras 5.10 y 5.19 se deduce que un reactor continuo de mezcla completa (CSTR) operado a una concentración de producto correspondiente a (1/r*).,^,.o seguido de otro reactor csrR conectado en serie (Figura s.1g) es un sistema más eficiente que un sólo reactor CSTR {Figura S.10).
342
Figura
5.17 Representación esquemática
de dos fermentadores conectados en
serie: Reactor continuo de mezcla completa (CSTR) y reactor de fluio tapón (PFR).
o
Xe Se
Pe
CSTR
5.7.8
Reáctor de FtuJo topon
Columnas de burbujeo y reactores con c¡rculación líquida inducida
En términos generales los costos de obtención de un producto y todos los costos fijos y variables disminuyen al aurnentar la capacidad del reactor. Esta tendencia requiere grandes biorreactores, diffciles de construir y manejar. .Se presentan considerables problemas de construcción con los reactores agitados mecánicamente de capacidad superior a 1000 m3, además los requerimientos de potencia resuhan muy elevados cuando el criterio de cambio de escala es mantener la potencia por unidad de volumen constante. Este aspecto significa elevados costos de energía y de agua de refrigeración y problemas de remoción
de óalor. Por otra parte se dificulta la distribución uniforme de oxígeno, de sustrato y otros nutrientes y el control de pH y de agentes antiespumantes.
343
Figura 5.18 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae, programal C:\GWBASIC\HERBERTI.BAS. Tiempo total de retención requerido por un fermentador cont¡nuo de mezcla completa (CSTR) y un reactor de flulo tapón (PFR) conectados en serie.
to
1/Rx
0,6 Concentracion
1 de biomasa,
1,5 g,z/i
tro
Figura 5.19 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae, programa: C:\GWBASIC\HERBERTI.BAS. Tiempo total de retenc¡ón requerido por dos ferrhentadores continuos de mezcla completa (CSTR) conectados en serie. 7,/RX
1 t,6 0,6 Concentracion de blomhsa, 9,4/tro
344
5.20 Representación esquemática de algunos reactores de columna: Acolumna de burbujeo; B- columna de platos perforados; C- columna con Figura
rec¡rculación; D- lecho empacado. Co(unnq de Jeo
ptotos
A¡re
rforodos
Colu¡rno con
rec¡nculqclon
Alre
Por consiguiente se han desarrollado nuevos tipos de reactores que ofrecen ventajas técnicas, económ¡caS y, en algunos casos, biológicas sobre el fefmentador estándard de tanque agitado, Schügerl (19821. Elfermentador más sencillo es el fermentador de columna o de torre de burbujeO, formado por un recipiente cilfdrico provisto de un sistema de aspersión de gas en el fondo (Figura 5.201. Las burbujas de aire o de oxígeno a medida que ascienden mezclan el contenido del reactor y sat¡sfacen la demanda de oxígeno de las células. Este tipo de ferrnentador sólo tiene aplicación en fermentación aeróbica. La elevada demanda de aire de las células cuya velocidad de sed¡mentación es
mayor que la velocidad de ascenso de las burbujas, concentradas en el fondo de la columna, favorece la formación de e§puma y la retención de burbujas, fenómeno que disminuye la productiv¡dad del reactor. Las condiciones de diseño de los fermentadores de columna limitan su aplicación a un estrecho intervalo de,condiciones de operación.
345
Figura 5.21 Representación esquemática de algunos reactores de columna: AReactor con circulación lfquida inducida por aire; B- Columna de burbujeo de sección transversal variable; C- Reactor con circulación lfquida inducida por
agitación mecánica.
Reqcton 'o¡r-ltFt' Cotu¡rnq de burbuJeo Clrculoclon lnducldq de seccton tronsversql
Atre
Chculoc¡on ¡nduc¡do
Atre
La columna de burbujeo de área transversalvariable (Figura 5.21.bl.satisface la necesidad de una mayor velocidad del aire en la porción inferior de la columna donde la concentracíón de células es mayor. Las columnas de burbujeo con placas perforadas (Figuras 5.20.b y 5.20.c) favorecen eí gas:llquido.
"ont""to una bomba Además, el contenido del reactor puede recircularse mediante (Figuras 5.20,c y 5.20.d).
En la Figura 5.20.d se representa esquemáticamente un reactor de lecho empacado provisto de un circuito externo de bombeo. Las partlculas del lecho sirven como soporte para inmovilizar las células. Además, el fermentador puede operar como reactor de lecho fluidizado si la velocidad ascendente del fluido supera el valor de la velocidad mlnima de fluidización. En el fermentador de circulación llquida inducida por aire "airlift" el aire gue sale del aspersor'y asciende por el tubo central origina una diferencia de densidad entre la porción de caldo saturado de burbujas dentro del tubo y la porción de
346
5.2
Monod, 1958, presenta los datos anotados en la Tabla 5.18 sobre el crecimiento de Escherichia Colien un cultivo por lotes con un medio qulmicamente definido, con lactosa como sustrato limitativo del crecimiento. La concentración inicial de biomasa: 15,5 (mg de biomasa seca)ilitro, corresponde a la concentración de biomasa después del período de adaptación o a la concentración al comienzo de la fase exponencial. Evaluar los parámetros cinéticos: y diferencial de análisis de datos.
pr,
Ks
y
Yxvs, mediante
los métodos integral
5.18 Datos delcrecimiento de Escherichía Colien un cultivo por lotes, en un medio compuesto por lactosa como sustrato l¡m¡tat¡vo del crecimiento, Tabla
Monod, 1958. Tiempo, horas
U
15,
,54 0, 90
23 ,0
o
I,23 l-,58
l_, 95 2 ,33
2,70
#-5.3
Concentración de células, mg/litro 5
30,0 38,8 48 ,5 58,3 6t ,3 62 ,5
Concentración de lactosa, mg/litro
151,0 L23 ,0 105,0 75 ,0 43,s 74 ,5 3,5
0,s
Simular el crecimientode Escherichia Coli en un reactor por lotes, Utilizar
los parámetros c¡néticos l,r¡y¡, K. y Yru., obtenidos en el problema anterior. Representar gráficamente el tiempo de retención. Simular el crecimiento de Escherichia Coli en un reactor de flujo tapón. Utilizar los parámetros cinéticos /u, Ks y Yxr., obtenidos en el problema 5.2. Representar gráficamente el tiempo de retención.
&5.4 5.5
Simular él crecimiento de Escherichia Coli en un reactcr por lotes operado con un caudal constante de alimentación continua. Utilizar los parámetros cinét¡cos /rvr, Ks y Yxrs, obtenidos en el problema 5.2.
348
5.11 Simular el crecimiento de un microorganismo en un reactor por lotes. utilizar los datos del problema 5.1 0 y suponer un perfodo de adaptación de 1 ,2 horas. Evaluar la variación de la concentración de células, sustrato y producto en función del t¡empo. IEcu. 5.25]
Donde, tL: perfodo de adaptación.
5.12
simular el crecimiento de un microorganismo en un reactor por lotes. utilizar los datos del problema 5.10 e incluir en el modelo el efecto de la velocidad de muerte de los rhicroorganismos (ke = 9,921 (hora)-1). Evaluar la variación de la concentración de células, sustrato y producto en función del tiempo.
rx = (p
- kr).*
[Ecu. 5.27.b]
5.13 simular el crecimiento de un microorganismo en un reactor por lotes. utilizar los datos del problema 5.10 e incluir en el modelo et efecto del
metabolismo endógeno de los microorganismos [m, = O,O3g (g sustrato).(g células.hora)11. Evaluar la variación de la concentrac¡ón de células, sustrato y producto en función del tiempo.
rs=ms.x.(r*)
tEcu. 2.37I
5.14 simular
el crecimiento de un microorganismo en un reactor por lotes. Utilizar los datos del problema 5.10 e incluir en el modelo el efecto de inhibición por sustrato [k," : 0,8 (g sustrato).(litro]-11. Evaluar la variación de concentrac¡ón de células, sustrato y producto en función del tiempo. [r
Fa
t*&*1 §
k¡s
3s0
tEcu. 5.31I
la la
5.15
Simular el crecimiento de un rnicroorganismo en un reactor pOr lotes. Util¡zar los datos lel problema.5.10 e incluir en el modelo el efecto de la inhibición por producto [k¡p : O,12lg productol/(litro)]. Evaluar la variación de la concentración de células, sustrato función del tiempo, Px = l¡¡r.
s K,
_
Kn,
"-
K_
_l
y producto en [Ecu. 5.37]
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u
.'Jr
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Jap.,30,42.
r:
r ,d
.t§
'
355
1\
CAPITULO 6
ESTERILIZACION
6.1 INTRODUGCION
La mayorfa de Ias fermentaciones industriales ocurren como cultivos puros con
cepas cuidadosamente seleccionadas. La presencia de microorganismos extraños en el medio, o en cualquier parte del equipo, afecta el consumo de nutrientes y disminuye el rendimiento y la productividad del proceso' Además, los productos de estos microorganismos pueden ser nocivos para la cepa seleccionada y limitar su crecimiento, La esterilización destruye, inactiva o remueve toda forma de vida microbiana, y produce en los microorganismos una
pérdida irreversible de su capacidad de reproducción en el ambiente considerado, pero no significa la inactivación de las enzimas celulares y de las tox¡nas.
La esterilización se realiza mediante calentamiento {calor seco o hÚmedo), o mediante filtración en filtros de porcelana no vitrificada (filtro Chamberland), de tierra de diatomáceas (filtro Berkefeld o filtro Mandler), filtros de placas de amianto utilizables una sola vez (filtro Seitz), filtros de ésteres de celulosa (Millipore), filtros de placas de vidrio sinterizado, etc. Los microorganismos presentes en un medio también pueden removerse mediante centrifugación, agentes químicos, radiación (ultravioleta y rayos X), y medios mecánicos (vibraciones sónicas y ultrasónicasl. 356
El vapor saturado seco es el medio ideal para esterilización por su elevado contenido de calor por unidad de masa o de volumen, por ceder este calor a una temperatura constante y controlable, y por ser de fácil producción y distribución. El vapor saturado húmedo cede menos calor que el vapor saturado seco a la misma temperatura y contiene gotas de agua en suspensión que pueden originar problemas de contaminación.
A nivel industrial el método preferido de esterilización es el calentamiento mediante vapor de agua en el mismo recipiente de fermentación, o en un equipo separado. En este caso el aire presente en el equipo debe ser cuidadosamente purgado, La temperatura de una mezcla aire-vapor saturado no solo es menor que la del vapor sino que disminuye con el conten¡do de aire en la mezcla. Por consiguiente, si la esterilización se controla mediante la observación de la presión, la temperatura alcanzada puede ser inferior a la requerida por el proceso. Otro aspecto importante originado por la presencia de aire en la esterilización de equipo con vapor de agua es la diferencia de densidad. El aire más denso que el vapor fluye hacia el fondo del equipo originando gradientes de temperatura. La aplicación de calor seco mediante una llama o aire caliente, utilizada en la esterilización de equipo y de material de vidrio, es menos efectiva que el vapor de agua debido a la mayor resistencia de los microorganismos al calor seco. El endurecimiento de la capa externa de las células, ocasionado por la coagulación de'las proteínas que la conforman dificulta la tranferencia de calor.
6.2 CINETICA DE LA DESTRUCCION
DE MICROORGANISMOS
MEDIANTE CALOR HUMEDO
Generalmente la activación del crecimiento y de la reproducción de esporas puede representarse mediante una curva similar a la curva A de la Figura 6.1, donde el número inicial aumenta rápidamente hasta llegar a un máximo y luego disminuir aceleradamente. Ocas¡onalmente la velocidad de activación por calor al comienzo del tratamiento puede ser igual (curva B, Figura 6.11o inferior (curva C, Figura 6.1) a la velocidad de muerte.
357
!
Figura
'
6.1 Representación esquemática de la variación
- por la ácción del calo r. Richards,
- I - -r esporas
10
de la población inicialde ji 1
968..
N,lNoti,.,..:
1
o,
1
o,ol l,OOOE-03
t,oooE-04
|,oooE-05 t,oooE-06 t,oooE-o7
20
'
30
40 50 Tlempo
60. i
'
70
80
:
La Figura 6.2 muestra la curva de supervivencia de una pobpci ón de Escherichia coliala acción del calor. En la Figura 6.3 se represeñtan las curvas desupervivencia o de velocidad destrucción térmica de esporas de B. stearothermophitus.
El número ly' de microorganismos aún viables después de un tiempo rilización a ternperatura f constante, es: 1*. .,.
#=-*"'* .rv tn_= No
Válida para
T=
- Ko't
'
f de qstet6.11
t6.21
constante.
Donde, Kr: constante de velocidad de muerte térmica en s-1, o en (minuto) 1, valor de la pendiente de la curva de supervivencia; No: número de microorganismos viables en el tiempo t : 0.
358
Figura
6.2
Velocidad de muerte delEsc/rerichia calia diferentes temperaturas,
Aiba et al.¡ 1973. N/NO 1
o,
1.
o,o
1
l,OOOE-03
t,oooE-04 l,OOOE-06
6.2.1
Energía de activación y coef¡c¡ente de Arhen¡us
La ecuación de Arrhenius generalmente describe el efecto de la temperatura T
sobre la constante de velocidad de muerte térmica
Ku:
16.31
t6.41
Donde: Ko: Constante de vetocidad de muerte térmica, s-l; Koo:'Coeficiente de Arrhenius, s-l; Er: Energla de activación requerida para llevar las moléculas a un estado de energía en el cual pueden reaccionar, J/(mol); T: Temperatura absoluta, oK; R: Constante de los gases, R : 8,314 J.(mol.K)-1. 359
El valor de la constante de velocidad de muerte térm¡ca, Kr, a una temperatura dada es el varor de ra pendiente de ra curva de supervivenciJ
{r;guras 6.2 y 6.3}. Asf, por ejempro, si los varores de Ko der g. stearothermophirus, obtenídos a partir de ra Figura 6.3, son representados en ra Figura 6.4 como rn Ko versus 1ff , se obtiene ra energía de activación Eo del B. stearothermophirusa part¡r de
la pendiente,
-
EDIR, de esta tfnea:
pcttdictttc
u( =
ED =
2 = 3445¡6,6'tr'
--Eo
n
(A4fi,6).(8,314) = 2EO4t2 J
gÍtol
Figura 6'3 Velocidad de muerte de esporas de B. stearothermophitus FS 7gs4 en agua destilada a diferentes temperaturas, Aiba et al., 1g73.
N/No
360
Si se reemplazan en la Ecuación 6.3 los valores de Eo/R, Ko y su correspondiente ternperatura T, se obtiene el coeficiente de Arrhenius Koo del Bacillus stearothermophilus. La ester¡l¡zación por lotes tiene la ventaja de ser un proceso sencillo
con algunos inconvenientes tales como la destrucción de muchas vitaminas y la desnaturalización de protelnas por el calentamiento a altas temperaturas' La destrucción de estds componentes sigue frecuentemente la misma cinética
de muerte de los microorganismos. Además, de acuerdo con la Tabla 1, las energlas de activación de estas reacciones laterales indeseables son típicamente menores que las requeridas para esterilizaciÓn. Con el propósito de prevenir las reacciones indeseables el proceso de,esterilización debe operar a la máxima temperatura factible durante el mínimo tiempo
requerido para destruir los microorganismos. Los prolongados perlodos de calentamiento y enfriamiento de la esterilización por lotes impiden el logro de estos obietivos, Jacobs et al,, 1973.
6.4
Determ¡nación de la energía de'activación Eo Y del coeficiente de Arrhenius Koo de las esporas de Bacíllus stearothermophilus FS 7954, Aiba e¡
Figura
al., 1973. 10
Velocldad de muerte, Kd, l/(m¡nuto) l--:.*........-.... ¿ ____\!
-.
-.
-............
- -
-.. -. - : i
i
---
-'.
-
-.. -.. ---.-...-........-'-'+.-........-1'..-
- -
-
---
-
1- - -
t.
i.+..,-..
i-
.-.+....-.-'---.....-.."....
-. -... ----... -'-..-
o1
o,o
I
1
2,54
2,56
2,58
2,6
2,62
2,64
2,66
(7OOO/T) = (|OOO)/(T, grados Kelvin)
361
Tabla
6.1
Valores aproximados de la energÍa de activación de algunas ,reacciones, Bailey y Ollis, 1986. Energla de activación
cal/gmol Acido fólico Alcohol d-pgntot.enil
Destrucción de vit.amina
Hidrocforuro de t.iamina Cianécobalamina
B,
Destrucción de ribofl-avina Desnat.uralización de peroxidasa - Pardeado o reacción de Maillard entrerproteÍrias y carbohidratos : Bacilfus stearothermophi)us Anaerobio putr,efactivo NCE 3679 eabi-Z-Lus
subtiTis
CTostridium botulinum
J/gmol
16800 21000 21000
7
22000 23100
92092 96697
23600 23500
987 90 987 90
31200
130603 283392 303066
677 00
72400 76000 82000
0325
87 906 87 906
3
1813 6
343252
En la Tabla 6.2 se presenta el efecto de la temperatura y del tiempo de esterilización sobre la destrucción de t¡am¡na por la esterilización de un caldo hasta un nivel constante de la relación entre esporas de B. stearothermophilus, viables al final del proceso e inicialmente viables, N/No : 10-16, Humphrey, 1989, Mulley et al., 1975, estudiaron la cinética de degradación de tiamina por acción del calor.
6.2.2 Reducción fracciona! de la población de microorgan¡smos
Eltiempo requerido para la reducción fraccional de la población de microorganismos a cualquier temperatura deseada se calcula a partir de las ecuaciones [6.2]
y t6.31:
Y=ln
362
No
lV
= Ko.t = Ko,.r.exP
t6.5I
v La eneigía de activación, Ep, y el coeficiente de Arrhenius, Kpo, caracterizan la destrucción de un microorganismo dado bajo las condiciones del ensayo.
Hasta ahora se ha considerado la muerte térmica de una sola especie de microorganismos. En la práctica la población está mezclada, aunque una o dos especies generalmente predominan. En la Figura 6.5 se representa el tratamiento con calor de'un cultivo mezclado en el cual la especie menos resistente A, de menor energía de activación, es la más abundante inicialmente, No : 1000 microorganismos. La especie B más resistente al calor es la menos abundante inicialmente, No : 100 microorganismos. La curva C de la Figura 6,5, que representa la disminución total de microorganismos de ambas especies, es la suma de microorganismos aún viables de cada especie en un momento f dado. En la práctica curvas similares a C indican una población mezclada.
Tabla 6.2 Efecto de la temperatura sobre la destrucción de tiamina por la esterilización hasta un nivel constante de la relación entre esporas de Bacillus stearothermophilus viables después de un tiempo t e inicialmente viables, N/No : 10-16, Humphrey, 1989. Temperatura de esterilización
oc
Tiempo en minutos requerido para alcanzar una relación N/No
:
100 110
t20 130 140 150
Pérdida de tiamina o/o
10-16,
843 75
7,6 0,8s1 0,107 0, 015
99 89
,99
27 10 3 1
La Figura 6.6 enfatiza elhecho de que una llnea recta no siempre indica una sola especie de microorganismos. En este caso la especie B, más resistente al calor,
es la más abundante inicialmente, No : 900 microorganismos. La línea C obtenida al sumar sobrevivientes de A y B en cada t¡empo r es prácticamente recta y no indica una población mezclada.
36s
Figura6.5 .Representación esquemática delefecto de la esterilización por calor sobre un cultivo." rnezclado. l-a población inicial menos resistente es la más abundante. Richards, 1968.
Numero de éobrevi vien
16
Figura
,
6.6
tooo
te;s
20 26. 30 fiemBo, minutos
40
35
45
Representac¡ón esquemática del efecto de la esterilización por calor de r.m cultivo mezclado: Richards, 1968
Numero de sobrevi vientes
100
10
o510
364
50
20 25 Tlempo, minutos
15
30
35
El factor Del, definido en la Ecuación [6.5], constituye una metodología apropiada para casi todos los propósitos de la esterilización por calor con temperatura variable. Si, por ejemplo, se desea esterilizar 10000 litros de un caldo de fermentador con una población inicial de 10O0 esporas/ml, el número inicial de esporas es No : (104 litros),(103 esporas/mll.(103 ml/(litro) : 1010 esporas, y si se acepta que el número final de esporas viables es N : 0,00O1 , entonces:
v = tn
\ = ¿, 10'o' = ln 101a = 32,236 N 10-4
t6.61
Este valor corresponde a la reducción fraccional de microorganismos en el proceso de esterilización:
Y total =Y calent- + V sosf¿¿. + Y et{riam.
t6.71
EI valor de la reducción fraccional de microorganismos durante el período de sosten¡miento a temperatura constante se calcula a partir de la ecuación:
Y sos@nimiento = Ko.ts
16.81
Donde, t.: Período de sostenimiento en minutos; Ko: constante de veloc¡dad de muerte térmica evaluada a Ts, s-1, o en (minuto§)-1; Ts: temperatura de soste-
nimiento, oC. El diseño de los ciclos de esterilización se fundamenta en los valores de la energla de activación, Ep, y del coeficiente de Arrhenius, Koo, del microorganismo formador de esporas más resistentes probablemente presente en el medio. En la piáctica este método es muy adecuado para eliminar microorganismos muy res¡stentes tales como el B. stearothermophitus s el Clostridiurn botulinum. La inaitivación dg esporas depende de la naturaleza del medio en el cual se calientan. En general, no solo hay que esterilizar un líquido sino preservar s¡multáneamente su valor nutritivo como ocurre con los caldos de fermentación, Chopra et al., 1981. 365
La Figura 6.7 representa una curva tfp¡ca de variación de Ia temperatura T con
t para el caldo de un fermentador. La reducción fraccional de microorganismos durante los perlodos de calentamiento y enfriamiénto son obtenidos mediante integración de la Ecuación [6.5]: el tiempo
Y=Koni*(
?).
t6.9t
Generalmente los sistemas de esterilización por lotes incluyen por lo menos una de las siguientes fuentes de calor: burbujeo de vapor vivo a través del medio, calefacción eléctrica y calentamiento o enfriamiento con un intercambiador.
Figura 6.7 Curva típica'de variación de la temperatura T con el tiempo el caldo de un fermentador.
t40
Temperatura,
t
para
C,
120
too
Calentamlen
i,riaml'ento
i
ao 60 40
20 o
40
80
100 120 140 Tiempo, m¡nutos
160
200 220 240
Deindoerfer y Humphrey, (1959), asociaron para cada sistema de transferencia de calor un perfil particular temperatura-tiempo. Estas funciones se presentan en la Tabla 6.4. La,integralde la ecuación t6.91se evalúá'mediante segmentación en tres intervalos: calentamiento, sostenimiento y enfriamiento. En la Tabla 6.3 se presentan cuatro soluciones de la integral, una para condiciones estable§ (temperatura constante) y tres para condiciones inestables (distribución hiperbólica, lineal y exponencial).
366
Dotde: , =
,
R.T, " Continúa
367
T¿blar
6.3 Continuacién
Lineal creciente:
Dottdc:_____ c=
Donde
En
es la integral
ED
R'To
exponencial:
a
,.,0=|(+)
tG
l4l
Donde: n = número de microorganismos. Los sublndices "o" y "F" indican condiciones iniciales y finales respect¡vamente; ED: energla de activación; Koo: coeficiente de Arrhenius.
Tabla
6.4
Variación de la temperatura con el tiempo de esterilización por lotes, Deindoerfer y Humphrey, 1959.
- Burbujeo de vapor,
(hiperbólical: , T=Tol1 *; o.t\ 1 I *b.t)
t6.151
o=Jé!-; á=* M.CP.T,' M' - Calefacción eléctrica, (lineal):
T=7.11 o \ +a.d
a=
Q
M.cp-To
16.16I
Continria
368
Tabla 6.4 Continuación - lntercambiador de calor con vapor de agua como fluido caliente, (exponencial); T = Tc .(1
* b.e-o")
U.A
To-7"
M.C,
Tc
a=-'.o=
16.171
- lntercambiador de calor con un refrigerante como fluido frio, (exponenciall: T=
,
Tr
(1 + b.e-"'); b
To =
-
Tr^
t6.18I
TF'
Do,t&;a=#[, "*( #*r)
Donüá, h: Diferencia de entalpla entre la correspondiente al vapor de agua a la temperatura del d¡stribuidor y la temperatura del medío, J/kg; S: Velocidad de flujo másico del vapor, kg/s; M: Masa inicial del medio, kg; To: Temperatura inicial del medio, oC; Q: Velocidad de transferencia de calor, J/s;' U: Coeficiente global de transferencia de calor; J/(m2.s.oC); A: Area de transferencia de calor, m2; Tr: Temperatura de la fuente de calor; w: Velocidad de fluio másico del oC; Cr: Calor refrigerante, kg/s; Tro: Temperatura de entrada del refrigerante, oC). especlfico del refrigerante, J/(kg. oC); C": Calor especffico del medio, J/(kg.
6.3
ESTERILIZACION FOR LOTES
La concentración de microorganismos sobrevivientes a una esterilización por lotes se calcula mediante la Ecuación t6.91 y las Tabtas 6.3 y 6.4' Otro enfoque del problema es la integración gráfica.
369
6.3.1
Selección del microorganismo de diseño
Es improbable que en un fermentador la naturaleza del medio y el número y clase de microorganismos presentes puedan permanecer constantes de un lote
a otro. La época del año, la naturaleza y la fuente de las materias
primas
empleadas cambian la población y los requerimientos de la esterilización. Lo apropiado, entonces, es seleccionar un microorganismo formador de esporas resistentes al calor y diseñar el ciclo de esterilización sobre esta base. Deindoer-
fer y Humphrey, (1959), sugieren la utilización del Bacillus stearothermophilus como el organismo de diseño, La experiencia indica que este mecanismo es apropiado para el diseño de la esterilización de caldos de fermentación. La concentración total de microorganismos presentes en el medio se determina
a part¡r de la incubación de muestras del caldo del fermentador, sin distinguir entre las diferentes especies, Esta cifra de la población bacterial total se utiliza en el diseño del ciclo de esterilización como si todos los organismos fueran 8. stearothermophilus. Aunque este fenómeno conduce a un sobrediseño, el problema no es serio a menos que el medio sea part¡cu¡armente sensible al calor.
6.3.2
Diseño de ciclos de esterilizacaún
Generalmente el período de incremento rápido en el valor de la reducción fraccional de microorganismos está lim¡tado al punto de esterilización que ocurre alrededor de 100 oC y se comete un error muy pequeño al considerar lineales las curvas de calentamiento y enfriamiento alrededor de 100 oC. Además, se pueden despreciar las secciones de estas curvas por debajo de 1 00 oC, ya que la esterilización por debaio de esta temperatura no es apreciable. Si se tienen en cuenta estas aproximaciones y se supone una velocidad de calentamiento de
l oCl(minuto), pueden calcularse los valores de la reducción fraccional de
microorganismos obtenidos después de alcanzar cada temperatura a esta veloci-
dad. Además, se supone que el valor obtenido para la reducción fraccional microorganismos cuando se alcanza una temperatura de 100 oC es cero. 370
de
6.5 presenta los valores, calculados a part¡r de las ecuaciones t6.31 v [6.5], de la velocidad de destrucción y de la reducción fraccional de B. stea-
La Tabla
rothermophrTus, durante el calentamiento o enfriamiento a razón de
Ko
= Kna.exe(
#)
Y=tn*=",,
1
oC/minuto:
lEcu. 6.31
IEcu. 6.5I
Donde, Kpo : (9,509).(1O3i' (minutos)'r :; E : 283392 J/gmo!, (Tabla 6.1!.: B. stearothermophilus; R = 8,314 J.(gmol.K)'1: constante de los gases.
Ejemplo
6.1
Determinación del período de sostenimiento en una fermentación por lotes
Los perfodos de calentamiento y enfriamiento en un fermentador por lotes de 60.000 litros de capacidad son:
- Calentamiento de 100 hasta 121 oC en 26 m¡nutos. - Enfriamiento desde 121 hasta 10O oC en 18 minutos. - Tres muestras sin esterilizar, tomadas de diferentes lotes de materia prima, dieron los siguientes recuentos bacteriales: 6.106; 1 ,1 .107 y 3.106/ml. Calcular el valor del perfodo de sostenim¡ento a 121 oC, si el calentamiento y el enfriamiento son realizados a razón de 1oC/minuto. Solución:
- En este caso se utilizan 1,1.107 (microorganismos)/ml como base del diseño del ciclo de esterilización. Continúa 371
Velocidad de destrucción y reduceióil'fraccional de Bacillus,,stearothetrnophrfus durante'el,calentamiento o enfriamionto a razón de 1-oC/minuto.
'fabh.6.5. :r;
Toc
kr.t:
Ko minuto-l
acumulado r_
101 1-02
103
L04
109 1r,0 11
tt2 113 +L4
0
,
9.r
18
L,3'?3
tL9
L,715
1,20 ].2.L,
722 L23
t24 L25 L26
t27 L28 129 130
i3i2
.
1"25áii-l-'
:I.ti 1,611
3,313 4, -
2 ,1,40
.
, 3,,319,
,126
5,359' ' 7, gg0
9,755 L2 ,054 L4 ,903 18,391
u
6 8
: 2,666,. 4
""
2,055 2 ,613
!s8
1-L7 r_
'
,444
0,700 0,877 1,099
1L5 116
0
0, 0€7 0, 110 0,139 Q,L75 ' 0,222 o ,'i8 o 0, 353
108
,079 ,12L 0,175 0,244 0,331 0,44L 0,580 0,756 0 ,979. 0
0, 059
105 106 107
t-
-----0 ,046
0,o20, 0 ,026 0, 033 0 ,042 0, 054
00
I
'
l_90
',2,-1,8
,66a ,376
10, 516 13,182 .16,501 20 ,627
25,752 32,lLL ,99]49,746 61, 810 76,71,3 95, 1'04'
.
,
39
" 'i
:i
Continuación (Ejemplo 6.1):
- Número iniciar de microorganismos viabres por lote: iv" = 60oo0 tinos.tú
=
6,6.t01{
ffi.fi,t.,,0r¡
orgaaisnos
- se supone
que el número aceptable de organismos sobrevivientes al tratam¡ento calorífico es 0,O0Ol organismos/lote.
v totat=rn
*=ln
ffi
=4Ít,st
- El valor de reducción fraccionar de microorganismos en ra etapa de carenta_ miento según la Tabla 6.S, es: Y calenamicno = 1g,tg2 Este varor de ra reducción fraccionar de microorganismos corresponde a catenta_ mrento a¡azón de 1 oCl(minuto), o sea, en 2l m¡nutor. Slg,jn las condiciones del problema el calentamiento ocurre et 26 m¡nutos:
v
cohttarnicrúo = (lg,1gzr.# = 16,32
- Análogamente para la etapa de enfriamiento: Y enfrianbno = (tg,tSa.# 11,00 =
-
El varor de ra reducción fraccionar de microorganismos en ra etapa de sostenimiento es:
y sosunimicno =v total _y catcn. _y crfriam. Vsosr. = /rc,33 _ 16,92 _ 11,90 ko.t = Donde er varor de Ko se evarúa a ra temperatura de sostenimiento de 121 0c.
373
Según la Tabla 6.5, KD sostenimiento es:
:
2,666 (minuto)-1, por tanto
vl*'=91
,=
Ejemplo
6.2
KD
2'666
=5,89
ef
valor del período de
minutos
Determipa,ción de la influencia del período de calentamie.nto sohre el período, de sostenimiento
Suponer que durante la etapa de calentamiento se presenta una falla en el control de témperatura dél ferrñentador del ejemplo anterior. La températura aumenta normalmente desde 100 hasta 112 oC,"permanece constante durante 14 minutos y luego sube hasta 121 oC. el valor del período de sosteni-
agl+tgl
miento. Solución
-
Ko
a 112 oC (Tabla 6.5): 0,353 (minuto)-1
-
Ko
a 121 oC (Tabla 6,5): 2,666 (minúto)-1
v = rl
.\
= Kz.tz = (0,353).(1a) = (2,666).r,
'z
':
= 1,85 mitutos l
Portanto 14 minutos a112 oC equivalen a 1,85 minutos a121 oC yelperíodo de sostenimiento se puede disminuir hasta: Período de sostenimiento
374
:
5,89 - 1,85
:
4,04 minutos.
Ejemplo
6.3
Determinación de la influencia del volumen del caldo sobre el período de sostenimiento
Suponer ahora que por ampliación de la planta se desea construir un fermentador similar al del Ejemplo 6.1 pero de 180.00O litros de capacidad. Los ciclos de calentámiénto y enfriamiento serán realizados en 30 minutos y 24 minutos respectivamente. Calcular el valor del período de sostenimiento a 121 oC.
-
El nuevo fermentador cón una capacidad tres veces mayor tendrá una 6.1: No : 6,6.1014.3 : 1,98.1015
población igual a tres veces la del ejemplo organrsmos. Y tout=
r,
1'99'1^o-.tt 0,0001
= 44,43
Por consiguiente:
Y calent. =13,182.
Y nfr. = (13,182)
V sosf. = 44,43
l=
6.4
-
18,83
-
30 21
= 18,83
.ff = t,oo 15,06 = 10,54
=
K».t
10,54 = 3,95 minutos 2,666
ESTERILIZACION CONTINUA
Los prolongados períodos de calentamiento y enfriamiento característicos de la esterilización por lotes producen la destrucción de vitaminas y la desnaturalización de las proteínas y otros componentes del medio. Las energías de acti375
vación de estas reacc.iones laterales indeseables (Tabta 6,'l ) son menores que las requeridas por la reacción de esterilización. Con el propósito de prevenir la alteración de los componentes susceptibles del medio, el proceso de esterilización debe realizarse a la mayor temperatura posible durante el menor tiempo, ffeifer y Vojnovich, (1952); Jacobs et al., 1923.
-La esterilización continua satisface estos requisitos además de proveer condiciones l:eproducibles y facilitar la recuperación del calor del medio esterilizado, Lin, 1975. El sistema de esterilización continua a alta temperatura y tiempos muy cortos es fundamental en la industria de alimentos donde el sabor y otras características del producto pueden ser afectados por pequeños cambios de temperatura durante el proceso. La esterilización continua por calentamiento indirecto se realiza usualmente en un intercambiador de placas o en uno de coraza y tubos, pero debe tenerse presente que los sólidos suspendidos en el caldo de fermentación pueden producir ¡ncrustac¡ones sobre la superficie de transferencia de calor. Las
condiciones de un proceso de esterilización continua de alimentos con partículas sólidas en suspensión fueron analizadas por de Ruyter y Brunet, 1973.
6.4.1 Esterilización mediante calentam¡ento directo por ¡nyecc¡ón de vapor
En la Figura 6.8 se muestra esquemáticamente uno de los sistemas
de
esterilización continua por calentamiento directo, mediante inyección de vapor
de agua al medio, seguida del paso del fluido caliente por la sección de sostenimiento y su posterior enfriamiento instantáneo con la ayuda de una válvula de expansión. El sistema de esterilización por inyección de vapor puede agregar exceso de agua al medio y favorecer la formación de espuma. En el sistema de esterilización continua, mediante inyección de vapor de agua (Figura 6,8), el medio caliente fluye en condiciones adiabáticas por la sección de sostenimiento diseñada como un tubo largo, Pick, 1982. El tiempo promedio
de residencia en ésta sección es;
376
tr=
L
t5.191
uM
Donde, ts: t¡empo de sostenimiento, s; L: longitud del tubo, media del caldo, m/s.
fili
urvr:
velocidad
Si la pérdida de calor en la seccíón de sostenimiento es despreciable puede suponerse temperatufa constante y la reducción fraccional de microorganismos se calcula a pan¡r de la ecuación:
Vs=ln&
=Ko.t" 16.20¡
vs
= K¡,o.eXp
( ,%) -
Donde, No: número de microorganismos viables a la entrada de la sección de sostenimiento; N: microorganismos viables a la salida; Kr: velocidad especffica de muerte, s-1; Koo: coeficiente de la ecuación de Arrhenius, s'l; Eo: energía de activac¡ón para la destrucción de células por acción del calor, J/gmol; T.: temperatura en la sección de sostenimiento, K.
si e! medio en la sección de sostenimiento se comporta como flujo tapón ideal, el tiempo de residencia es el mismo para todo el medio y la esterilización es uniforme, En el caso de flujo de fluidos newtonianos dentro de tuberías lisas de sección transversal constante, la relación entre la velocidad medía y la velocidad máxima del fluído es 0,5 cuando el fluido es laminar. Esta relación aumenta hasta 0,75 cuando elflujo se vuelve turbulento, y alcanza el valor de 0,87 para flujo con número de Reynolds mayor que'106 (McCabe, et al. 19g1), por
consiguiente, s¡ se utiliza la velocidad media del flúido en Ia Ecuación [6.19] para calcular el tiempo de sostenimiento, una porción del fluido puede quedar sin esterilizar y originar serios problemas de contaminación. Levenspiel, 1972, utiliza un modelo de dispersión para explicar las desviaciones delflujo tapón ideal ocasionadas por la mezcla axial. El balance de microorganismos suspendidos en el caldo de fermentación, en la sección de sostenimiento, en condiciones estables, es:
377
.
organismos = eliminados
organismos que entfan
or9anrsmos que salen
t6.211
La diferencia entre el número de microorganismos que entran y los que salen por
flujo volumétrico es: t6.221
Donde, ur: velocidad media del caldo de fermentación en la sección de sostenimiento, m/s; n: concentrac-ión de microorganismos en el caldo, (número de microorganismos)/m3; S: área'transversal deltubo, m2; x: dirección del flujo de microorganismos, m.
Figura
6.8
Representación esquemática de un sistema de esterilización continua mediante calentamiento directo por inyección de vapor de agua al medio.'
Voc¡o
Volvulo de
exponsioi Secc¡on
de sosten¡n¡ento Enfr¡odor Instonto Ited¡o
€ster¡l
378
La diferencia entre el número de microorganismos que entran y los que salen por dispersión axial es: - D. s.
!(
4
-[ - o.s.4. dxL b dr\- r. s.4\¿,] dx)
t6.23I
J
Donde, D: goeficiente de dispersión axial, m2ls. D : 0 significa que la distribución de vélocidades se aproxima a la de flu'jo tapón ideal. D --) o significa que el fluido dentro de la tuberla está perfectamente mezclado. En la Figura 6.9 se presenta !a correlación entre el grupo adimensional D/(u.d)
y el número de Reynolds en la tubería de sostenimiento, Si el número
de
microorganismos eliminados por esterilización es Ko.n, la ecuación final de balance de microorganismos se obtiene a partir de las Ecuaciones t6.201 y t6.23t:
4b.*)-+") e\ tu) &
-Ko.n=o
16.241
Donde, Kr: velocidad especifica de muerte, s-1; n: concentración de microorganismos, (número de microorganismos)/m3. Wehner y Wilhelm, 1956, presentan la siguiente ecuación como solución a la Ecuación f6.241:
"=(,
DAM =
K^.L _zuM
[6.25]
= Número dc Dmú,ñhl¿r
379
Pr=
ryl
= Núnrero de Pecl¿t
Figura 6.9 Relación entre el coeficiente de d¡spersión, expresado en el grupo adimensional (D/u".d), v pl número de Reynolds, Levenspiel, 1958.
D/(u,d) 1Q
\I:
\! i\
i
\.i )'-"'
o,
1
100000
10000
1000
100000
Reynolds
En la Figura 6.10, representación gráfica de la Ecuación [6:25], se expresa la fracción de microorganismos viables después del período de sostenimiento en función del número de Damkóhler para diferentes valores del número de Peclet.
Ejemplo
6.4
Esterilización continua med¡ante inyección de vapor
Se utiliza un sistema de esterilización mediante calentamiento directo por inyección de vapor de agua, seguido de un enfriamiento instantáneo (Figura 6.8), para esterilizar 0,41 kg/s de caldo de un fermentador. Los recuentos 380
bacteriales de tres muestras de caldo sin esterilizar dieron los siguientes resultados: 6,8.108; 1,7 1Oe y 3,4.108/ml.
Se requiere reducir la posibilidad de contaminación de manera que un solo microorganismo pueda sobrevivir después de cuatro meses de operación continua. Diseñar la esterilización sobre la base de que todas las esporas bacteriales resistentes a la acción del calor corresponden al B. stearothermophi /us (Ke" = 1,585.1036.s-1; Eo : 283,46 kJ/{gmol). La sección de sostenim¡ento del esterilizador es una tubería de acero de
3,068
pulgadas de diámetro interior, En la planta se dispone de suficiente vapor de agua saturado a una presión de 6 atmósferas con el propósito de calentar el caldo hasta una temperatura de sostenim¡ento de 128 oC. Las propiedades del caldo a esta temperatura son: densidadz p: 1000 kg/m3; viscosidad: 1,23.1O'3 kg.(m.s)-l; calor especlfico:4,187 J.(g.oC)-1. Calcular la longitud de la tubería de sostenimiento.
Figura 6.10 Fracción de microorganismos viables después del perlodo de. sostenimiento en función del número de Damkóhler para diferentes valores del número de Peclet, Aiba et al, 1973, 1,OOOE- 1 1
N/No
l,OOOE- t 2
t,oooE- t 3 t,oooE-
14
l,OOOE- 15 l,OOOE- 16 l,OOOE- 1 7 l,OOOE- 1A l,OOOE- 19
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 100
140
(Kd,L)/u
381
Solución
,,
"
,¿
¡-
|
1. Longitud de la tubería si el medio fluye en f¡ujo tapón ideal ,
0,41
'
!'
'
&=rCrOO4.O § -,i
mo
Q =O,4L 1O-3 !t3 = 1,410 ,43
s
lpra
- Microorganism s viables no=1,7.toezr-3.
no=1,226.1012 _,i
"
t.+tefi.z+
ffln
t= ?,,,h*=
1,384.10-rg
- Criterio de diseño
'nl, = tn
lt
- tn7'2N'10t'
= 29.61
- Velocidad especffica de muerte, (Ecuación 16.31):
Kr= 1,51,.10s's----1.
- Perfodo de sostenimiento
382
au
- Diámetro de la tuberfa (3,068).
(0,02il)
= 0,oT79 m
- Velocidad del medio
,
o,41
& ='*o
#
m?:u*
i(0,07le)2
ua =0,@6 mls - Longitud de la sección de sostenimiento:
L
=
u*.t"= 0,096 4.1tS7rS¡s = IO,SS m §
2. Longitud de tuberfa si se considera el efecto de la dispersión axiali (0'0779)'(0'086)-'(f000) - Rcvnlds: R,= ='ffi '
¡'
1,23. 10-3
- De la Figura 6.9: D
;n"
1
Pra
RE = 5i446
- Por consiguiente elcoeficiente de dispersbn, D
'
es:
'
1.(0,086).(0,0779) = 6,7.10-3 m2ls
- Número de Peclet Para el primer est¡mativo se supone una longiilO de la sección ¿"
to:L:14m.
'
*","nimien-
PÉ=+=W=.os.l
383
- Número de Damkóhler 0,188s-1-14rn D,,,=Ko'L =30.6 M uM - 0,086 m/s
- Fracción de microorganismos viables El
valorde n/n. correspondiente a P,
:
179,7 V Drrur
:
30,6, en la Figura 6.10,
es:
L . 3.10-12 > 1,384.10-13 no
Como la fracción de microorganismos viables es mayor que la fracción
r"Or"r,d.
por el proceso de esterilización, se supone para un segundo estimat¡vo una
longitudL:16m: Pz=2o5,4 i.
Dut=§
y de la Figura 6.3:
n no
=8.10-14 < I,gB4.lo-rg
Por consiguiente, Ia tubería de sostenimiento debe tener una longitud de 16 m.
Este valor es 2,5 m mayor que el calculado en el punto anterior, donde se desprecia el efecto de la dispersión axial y se supone flujo tapón ideal.
6.5
ESTERILIZACION DE AIRE
En el aire existen microorganismos üiables generalmente asociados con partlculas más grandes como polvo o polen. Las diminutas gotas que salen deltracto respiratorio al toser, o aún al conversar, son transportadores muy efectivos de microorganismos patógenos.
384
v
Según Aiba et al., 1973, las bacterias y esporas detectadas con mayor frecuencia en elaire son:. Aerobacter aerogenes, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacittus megaterium, Bacitlus mycoides, Bacillus subtilis, Micrócoccus aureus, Proteus vulgaris, y las esporas de: 8. megaterium, B. mycoides y B.subtilis. El tamaño de estos microorganismos varía desde O,5 - 2,1 pm de anchura, hasta
0,5 - 26 pm de longitud.
6.5.1
Condiciones del a¡re requer¡do por la industria bioquímica
El número de colonias detectadas por unidad de volumen de aire muestreado varía de acuerdo con el s¡tio y la actividad, desde aproximadamente 70 colonias/m3 a nivel del piso, hasta 12000 colonias/m3 en una fabrica. A falta de
información precisa un número confiable a suponer es del orden de 2000 colonias/m3, si el aire es tomado de un espacio abierto y limpio. La industria bioqulmica requiere aire y otros gases en condiciones estériles en diferentes etapas del proceso y con diferentes propósitos: - Salas estéríles: Se utilizan para realizar operaciones en las cuales debe evitarse la contaminación de los materiales manipulados con microorganismos potencialmente infecciosos. Una sala estéril no está completamente libre de microorganis-
mos, pero debe mantenerse escrupulosamente limpia y proveerse de aire estéril a una presión ligeramente mayor que la de las áreas adyacentes. Usualmente en las salas estériles donde se fabrican vacunas, materiales parenterales y se seleccionan y propagan cult¡vos, se requieren grandes volúmenes de aire estér¡l a baja presión (13,8 kPa, o 2 psig). Transferencia de llquidos: Los lfquidos son transferidos de un recipiente a otro por gravedad, por bombeo, o por transforte con aire u otros gases. Cuando la oxidación es un problema generalmente se emplea nitrógeno. En cualquier caso -
el gas 7
debe filtrarse cuidadosamente para remover partlculas inertes y mícroorganismos viables. Se requieren relativamente bajos voltÍmenes de gas estéril a presiones hasta 206,8 kPa (30 psig).
385
- Aeración de feimentadores: La mayoría de las fermentaciones aeróbicas a escala industrial requieren grahdes volúmenes de aire estéril para aerar y en algunos casos proveer agitacíón. Generalmente la fermentación requiere aeración aséptica durante períodos que oscilan entre tres y diez días a razón de o,5 - 2 vvm, lvolumenes de aire por volumen de licor cada minuto), si, por ejemplo, el fermentador tiene un diámetro de 3 m y la profundidad del licor en el fermentador.,es 3 m, los requerimientos de aire, a razón de 1 vvm, son:
o ,ú n=i.(3r)' 21,2
rlq = prz 4,.6s mln hr
=21,2m3
mo de aire cstéril
ho¡a
Teóricamente la entrada de un solo microorganismo puede infectar todo el lote. En consecuencia una planta de fermentación aeróbica requiere enormes cantidades de aire estér¡l a una presÍón que usualmente varía entre 137,g kFa.y 413,6 kPa (20 - 60 psi), según la naturáleza de la ¡nstalac¡ón, la resistenc¡a de los filtros y la profundidad del líquido en el fermentador, Stark y pohler, (1gso).
6.5.2 Esterilización
de a¡re por cator
6.5.2.1 Compresión politrópica
En muchos casos el.calor generado por la compresión es suficiente para esteriliqar el aire, de manera que no se requierpn otros medios de eliminación de microorganismos, Bruckshaw, 1973. El aire requerido para la aeración de fermentadores se comprime hasta 344,6 - 413,6 kpa (b0 - 60 psig), presión reque-
rida para vencer la cabeza hidrostática en el fermentador tuberías, accésorios, válvulas, etc.
386
y las pérdidas en
En condiciones normales, a escala industrial, la compresión del aire es politrópica, o sea, intermedia entre adiabática e ¡sotérmíca. En este caso;
rz=r,(f
t6.26I
)+
Donde: r: relac¡ón entre los calores específicos del aire a presión constante y volumen constante; r: 1,3 para compresión politrópica. Así, por ejemplo, la temperatura alcanzada mediante compresión politróp¡ca del aire en las condiciones de Bogotá (presión localatmosiérica:10,83 psi; temperatura 1 5 oC) hasta 1 50 psig, es:
z2=(zra.
ls).(%#Éq Tz =
)'*
= sos,7
r(
2€i2'7'c
Se ha demostrado que las temperatura§ del aire inferiores a 2OO oC son de poco
valor en esterílización, a menos que el aire se mantenga durante un período considerable, casi un minuto, a 150 oC. La esterilización de grandes volúmenes de aire debe satisfacer al menos dos condiciones:
- El aire normalmente debe comprimirse hasta una presión tres o cuatro veces mayor que la requerida por el proceso. - Un sistema de almacenamiento de aire, tipo serpentín, debe mantener el aire a elevada temperatura durante un tiempo adecuado. Así por ejemplo, la longitud de tubería aislada, de 15 cm de diámetro interior, requerida para almacenar 21,2 lm3 de aire)/(minuto) durante 30 segundos, es:
21,24
H.30s
=
f,.{o,rs ^)r.t
L = 599,84 m
387
6.5.2.2 Calentam¡ento directo
En este caso el aire se hace fluir por el espacio anular entre dos cilindros concéntricos de hierro. El cilindro interior se calienta con un quemador de gas. Estos hornos, que también pueden ser eléctricos, sólo son útiles para pequeños flujos de gas hasta 30 litros/minuto. Se han diseñado hornos eléctricos donde elaire se calienta hasta 700 oC en un tlempo de 0,4 segundos, con un consumo de potencia de 1,8 kW/(100 litros/minutol.
6.5.2,3 Calentam¡ento indirecto con gases combust¡bles
En este caso el aire fluye, separado del gas caliente, por serpentines o tubos, para prevenir la contaminación de los productos de la combustión o el agotarniento del oxfgeno. Las dificultades para diseñar y mantener una unidad de esta
clase son considerables y los costos de capital y operación son elevados. Por
esta razón el método no es compet¡t¡vo con el método de filtración. Con el propósito de prevenir excesivos períodos de sostenimiento el aire se calienta hasta 350 "C y se utiliza un serpentln como factor de,seguridad para evitar la supervivencia de aquellas bacterias enclaustradas o protegidas por sólidos.
6.5.3
Filtración
Los filtros cuyo propósito es remover microorganismos del aire pueden clasificarse en dos categorlas: aquellos cuyos intersticios son mas pequeños que las partículas a ser removidas y aquellos donde estos son más grandes. El primer grupo comprende los llamados filtros absolutos de cerámica, vidrio sinterizado, o metálicos, su eficiencia es prácticamente 1007o, pero cuando hay necesidad de esterilizar elevados volúmenes de aire, tienen la desventaja de ser costosos, además de originar altas pérdidas de presión.
388
Los filtros fibrosos de papel, algodón, lana de vidrio y lana mineral, no presentan esta barrera impenetrable a los microorganismos, los espacios entre fibras son
mayores que el tamaño de los microorganismos, pero son eficientes y originan
bajas pérdidas de presión, Chen, 1955; Davies, 1973; Decker et al., 1962; Decker et al., 1957, Conway, 1984; Esta eficiencia se explica por el hecho de que los microorganismos generalmente están asociados con partfculas de mayor tamaño.
6.5.3.1 Filtros empacados
filtro empacado. El lecho se para prevenir mantiene entre rejillas metálicas ajustables el movimiento de las fibras y el acanalamiento del aire a través del lecho. En algunos casos los materiales del lecho filtrante se pegan con resinas o se comprimen en bloques o láminas. En la Tabla 6.6 se presentan las caracterlsticas de uno de estos medios. En la Figura 6.1 1 se muestra esquemáticamente un
Figura
6.11
Representación esquemátaca de un filtro empacado
389
Tabla
6.6 Características de la lana mineral,'(Stilmed AST 1 3)-, Richards, .l 968.
Diámetro de fibra,
pm
<6
68 o/o
Distríbución
12 27 o/o
6-
18 4o/o 12 -
18 - 24 1
'o/o
El medio filtrante Stilmed AST/13 t¡ene una densidad aparente de 1 92,3 kg/m3. En la Tabla 6.7 se presentan datos de la pérdida de presión del aire a través de
este med¡o.
|
Tabla6.7Pérdidadepresióndelaireenunlechoempacadoconlanamineral, (Stilmed ASTi 13), Richards" 1968.
Velocidad
Pérdida de presión en mrn Hg
del aire
m/s 0, 15* ,23
0
0,30 0,38 0 ,45 0,60
*
Espesor "12,7 mm 7,5
tt,2 ,9 78,'t 22 ,4 29 ,9 74
El rnismo medio comprimido
hasta un espesor de 7,6 cm.
L2,t ,7 ,4 33,2 L8
25
Velocidad recomendada para producción continua de aire estéril.
El lecho filtrante se esteril¡za mediante flujo de vapor de agua a presión ligeramente mayor que la atmosferica durante 2 horas. Esta operación requiere una purga previa de todo el aire. Las elevadas temperaturas pueden afectar la resistencia de las resinas utilizadas para pegar las fibras. Algunos fabricantes garant¡zan sus medios filtrantes hasta temperaturas de 800 oC. Otro efecto de la ternperatura es la contracción del lecho, fenómeno que puede controlarse con
las placas metálicas desplazables. La esterilización del lecho con aire
a
temperaturas entre 160 y 20O oC durante 2 horas tiene la ventaja de prevenir la humedad residual del lecho después del procedimiento de esterilización.
390
_
6.5.3.2 Filtros de vela
Cuando se requieren volúmenes relativamente pequeños de aire se utilizan filtros vela absolutos (Figura 6.1 2) de cerámica porosa, vidrio sinterizado, metal, teflón
y
PTFE (politetrafluoroet¡leno).
Figura
6.12
Representación esquemática de un filtro de vela
#
+ 6.8 se presentan datos sobre la relación entre Ios caudales de agua y y de aire sus correspondientes pérdidas de presión en un-a vela de "Celloton". Este material, similar a la porcelana, se obtiene a elevada temperatura por la recristalización de una mezcla de ahf mina y sílice, produciendose una estructura muy poiosa (porosidad e = O,4). La limpieza de la vela se realiza con ácidos, con detergentes, o mediante ignición en un horno. La ester¡lización de la vela se realiza con vapor, con aire caliente o en autoclave. En la Tabla
391
Tabla 6.8 Pérdida de presión en una vela de "Celloton" de 10 pulgadas de longitud, 2 pulgadas de diámetro exterior y 1,5 pulgadas de diámetro interior. Richards, 1968. -Diámetro
de poro pm 1 1 1
2 2 2 2
Pérdida de presión psl
Caudal de agua
litros/hora
Caudal de aire
litrosiminuto
14
ZU 5
,45 ,77 18, 90 7 ,55
o 2¿ 4,L6 18 ,37
10 15
15 ,7-2 22 ,08
¿U
30,24
,64 ,29 22 ,6s 30,88
10 15
9
7
1-5
6.5.3.3 Filtros de membrana
Las membranas filtrantes de celulosa pura, ésteres de celulosa, nitrato de celulosa, acetato de celulosa, poliamidas etc, tienen entre 107 y 1011 poros por cada centímetro cuadrado de membrana filtrante, y por cada micrómetro de espesor hay alrededor de 100 capas o mallas f¡ltrantes. Las membranas de acetato de celulosa son compatibles con casi todos los líquidos farmacéuticos, no se deterioran con el óxido de etileno gaseoso, pero se disuelven con acetona, ésteres y álcalis fuertes. El ácido acético y el alcohol también las deterioran. Cuando hay necesidad de usar etanol o metanol se usan membranas de acetato
de celülosa. Los llquidos que pasan por el filtro membrana deben ser prefiltrados. El agua sale de estos filtros libre de sustancias orgánicas, iones y pirógenos. La retención bacteriana de las membranas es alta, hasta 107 bacterias/cm2. Las membranas se ensamblan en portacartuchos de acero inoxidable. Hay membranas hidrófobas y también hidrófilas. Las hidrófobas tienen la ventaja de no obstaculizar el flujo de aire después de permanecer en un autoclave a 138 oC, o del paso del vapor de agua.
392
6.6
EFICIENCIA DE LOS FILTROS FIBROSOS
6.6.1 Eficiencia de fibra
Los fenómenos básicos que explican la retención de las partfculas presentes en un fluido que se desplaza en una dirección perpendicular a la fibra cillndrica de un filtro, son:
-
Difusión: La partfcula que sigue la lfnea de corriente experimenta una
difusividad pequeña pero finita que significa una velocidad finita de recolección. Este movimiento de la partfcula se denomina movimiento Browniano. - lntercepción: Se supone que todas las partlculas que siguen lfneas de corriente que pasan a una distancia menor que la mitad del diámetro de partícula, dpl2,
son retenidas por la superficie del colector.
- lmpacto: Si la inercia de la partícula es grande, las fuerzas que permiten
al
fluido rodear la fibra son insuficientes para evitar que la partícula por su inercia, haga impacto sobre la superficie del colector y sea retenida. - Gravitación: La diferencia de densidades entre la partícula y elfluido origina el desplazamiento de la partlcula dentro del fluido y su posterior retencíón al salir de la lfnea de corriente.
- Fuerzas eléctricas: Las partlculas bajo la influencia de un campo eléctrico son desviadas delflujo en líneas de corriente y atra¡das hacia la superficie del colector. - otras fuerzas: Algunas fuerzas como las de London y Van der waals aceleran o retardan la cofección de partículas. Las siguientes ecuaciones, obtenidas analíticamente (Bailey y ollis, 1986), permiten calcular la eficiencia de recolección de partlculas por una fibra simple:
393
- Difusión: movimiento browniano
.l K''z )*
srB = o.s -'' '[r, .dF.dp.U)
16.271 ,
- lntercepción
,
p, = (1,,
(* I
t6.28I
- lmpacto ,t6.291
- Gravitación t6.30I
Donde, Bu: Eficiencia de recolección por difusión o movimiento Browniano; B,: eficiencia de recolección por intercepción; l3,r: eficiencia de recolección por impacto; Bo: eficiencia de recolección por gravitación; Ke: constante de Boltzmann: 1 ,38.1 O-23 JIK; T: temperatu¡a absoluta, Kj dr: diámetro de fibra, m; dr: diámetro de partfcula, m; U-: vetocidad superficial (o de torre vacfal del fluido, mls; pr'. densidad de partícula kg/m3; p" : viscosidad dei fluido, kg/(m,sl; g: acelpració¡r.de la gravgdad,,9,8 m/s2. M : pp- pri g\: densidad del
fluido,kg/m3.
i,
i
La ecuación para R, también se puede escribir como:
g, = (o,e). [(r,$. Además las'ecuaciones para
13,
y
tLr]N.(:,PEF
)-4
B, son validas para:
**-LP<1ipw=!L4rso 394
t6.31I
16.321
tlonde Ro : Número de Reynolds; P.r : Número de Peclet referido al radio la fibra; DF : Difusividad de partícula, m2ls:
de
t6.331
En un filtro real, la presencia de-otras fibras altera el campo de flujo en la proximidad de la fibra considerada y afecta su eficiencia individual de recolección, Fitzgerald y Detweiler, 1957. Este efecto se calcula mediante la ecuación: 9
¡ * 9t*
P¡¡ = 2,g.K;1F,P;4 * O,62.P61
* 1=ij'o.¡2.rn (r *Rr) - r +(r *R.)-2] 2'Ku L \ t6.341
.
!r(n')o . ] ;*[" (-, ,^", f + 1,24.(K u)-trz
.¡r
r¡-ttz. (R
{^*)'."')
")at
Donde; Br,: Eficiencia adicional de recolección por la interacción de fenómenos de intercepción y difusión (Bailey y Ollis, t 986); K, : Parámetro de Kuwabara:
13a2 I[ =--lna--+d,-'244
t6.351
Donde, o: Fracción volumétrica de fibras en el lecho; e : (1 _ o): porosidad del lecho; Rp, = dp/df : Relación entre los diámetros de partfcula y de fibra. Para números de Peclet mayores que 200 y valores de Rpr pegueños la Ecuación t6.341 se convierte en:
F¡*9¡*Fu= t6.36I
z,9.x;tts.r;4 * Kit.nfr.lt - c¡
395
medida que aumenta el caudal, aumenta la'importancia relativa de los términos Br, y Bn. La eficiencia total de recolección Rr se calcula según la ecuación:
A
9r=9s*9t*9u*Fzr*Fe
16.371
El espesor L de lecho filtrante requerido para lograr una determiñada remoción
de pártícülas se calcula mediante la ecuación:
t6.38I
Donde; N,, Nr: Número de microorganismos en el áfluente y en el efluente del filtro, respectivamente; L: Espesor del lecho, m.
Ejemplo
6.5
Espesor de un lecho empacado con f¡bras de vidrio
Hallarel espesor dellecho filtrante requerido para aeÉr un fermentador con 80 m3'de medío a razón de 20 m3/minuto de aire a 20 oC y 4 psig (presión barométrica : 10,83 psi) durante 100 horas. El aire contiene 1800 microorganismos/m3, lpp : 1000 kg/m3, dp : 0,6 Uml, y se acepta una probabilidad de hallar 0,001 microorganismos en el afluente durante las 100 horas. El lecho está compuesto de fibras de vidrio (d, : 19 pm, a : O,038). La velocidad superficial del aire, (/" : 1,85.10-5 kg/(m.s), es 0,46 m/s. Solución
1. Densidad del aire:
'
396
P,M R.T
=(!#f
)
uo',.szs
ur"¡.x
H t,t273 * 2OlK bnol.K '
8,314
3_
1,217
+m'
2.
Número de Reynolds:
^ dn.U-,pñE=-= l¡c
Xc =0'592<
1
*=#4=ffi; l
DP = 3,865 '10-t1
ú §
,,=#=ffi=r3.o6s,eo>50 D-
5.
Parámetro de Kuwabara:
'-
6.
Ev=-
tn, - I.
" - Í=o,941
Relación entre los diámetros de partlcula y de fibra:
.', 7.
i ú =0,(Bo
j'
Eéuación [6,361: g¿
,,ir¡
* Fr * Fa=12,S¡.iO,SA)-I4.(113.065,g8¡-zs *(o,923)-f .rO,oqer.t0,962|=2,$14.10-e
,
*
'
397
8.
Eficiencia de recolección por impacto: p
L
rM =
ug7s.tffi
Eficiencia de recolección
)'o
=
o,orro
por gravitación:
pn= (1@
- f ,2171.9,9.(0,6r.10-92 =2,364.10-5 18.(1,8.10-t).(0,¿O)
10.
Eficiencia total de.recolección:
0r
= 0,0197
1'1. Espesor del lecho: ln 1800.20.60.1@ _ 4.0,038.0,0197.¿
r.(rs.t0-6
0,001
I; = 0,52
6.6.2 Pérdida de presión
)
m
en los filtros de fibra de vidrio
Los filtros de fibra de vidrio son los más ulilizados en esterilización de aire para
las plantas de fermentación. Las fibras deben reemplazarse después de un período de operación que usualmente varía entre 1 y 2 años. El reemplazo es costoso y el empaquetamiento del lecho es relativamente difíc¡I. Además, los costos de producción de vapor y de aire caliente para la esterilización del lecho y subsiguiente secado.del mismo son considerables. La pérdida de presión del aire que atraviesa un lecho de fibras se calcula usualmente según el procedimiento de Kimura e linoya, 1959, estos autores recomiendan la Figura 6.1 3, construida a partir de valores experimentales, para gvaluar el coeficiente de arrastre Co, en función del número de Reynolds:
398
co*
rc
=
.9.-dr.
A
P
2-p.L.rÍ.0 - d^
t6.39I
Donde, dr: diámetro de fibra, m! gc: factor de conversión de unidades, 1 kg.m.s' 2.N-l;p¡: denSidad detfluido, kgim3; Uo: Velocidad superficial, o de torre vacla, del fluido, m/s; L: espesor del lecho, m; a: fracción volumétrica de fibras en el lecho: o : 11 - el; e: fracción volumétrica de vacios en el lecho. m = 1,35: fibras de vidrio; m : 1,45: fibras de algodón.
Ejemplo
6.6
Pérdida de presión del aire en un filtro de fibras de vidrio
Calcular la pérdida de presión del aire en el caso del ejemplo anterior.
- Número de Reynolds = 0,592 - Corur : 83:Figura 6.13, Para Re = 0,592 - m : 1,35: fibras de vidrio, dr : 19 /m - Pérdida de presión:
A P =#05,3
^p
=
(§É,-g-!ALf,A7
Pa
estl = 0,6s4 ps¡
399
Figura 6.13 Determinación de la pérdida de presión del aire que atraviesa un lecho de fibras según el procedimiento de Kimura e linoya, 1959. La ordenada es el coeficiente de arrastre Co, definido en la Ecuación t6.391 y !a abcisa es el número de Reynolds.
Coeticiente de friccion
Reynolds
PROBLEMAS
6.1 Los períodos de calentamiento y enfriamiento en un fermentador por lotes de 40 m3 de capacidad son: Calentamiento de 100 hasta 121 oC en 16 minutos; Enfriamiento desde 121 hasta 100 oC en24 minutos.
- Tres muestras sin esterilizar, tomadas de diferentes lotes de materia prima, dieron los siguientes recuentos bacteiiales: 8.1 06; i',6.10' y 3.1 06/ml. Calcular el valor del período de sostenimiento a 121 oC.
400
Durante la etapa de calentamiento se presenta una falla en el control de températura del fermentador del problema anterior' La temperatura aumenta a oC, permanece constante durante raz6n de 0,8 oC/minuto desde 1 00 hasta 108 oClminuto desde 108 hasta 121 oC. 8 minutos y luego aumenta a razÓn de 0,8 Calcular el valor del período de sostenimiento.
6.2
Suponer ahora que por ampliación de la planta se desea construir un fermentador similar al del problema 1 pero de 120 m" de capacidad. Los ciclos de calentamiento y enfriamiento serán realizados en 22 m¡nutos y 28 minutos oC. respectivamente. Calcular el valor del perlodo de sostenimiento a 121
6.3
6.4
Se utiliza un sistema de esterilización mediante calentamiento directo por
inyección de vapor de agua, seguido de un enfriamiento instantáneo (Figura 6.81, para esterilizar el caldo de un fermentador. Los recuentos bacteriales de dos muestras de caldo sin esterilizar dieron los siguientes resultados:8.1011; que 1 ,7.1O121m3. Se requiere reducir la posibilidad de contaminación de manera sólo 0,001 microorganismo pueda sobrevivir después de Un mes de operación continua. Diseñar la esteril¡zación sobre la base de que todas las esporas bacteriales resistentes a la acción del calor corresponden al B. stearothetmophi' /us (Keo = 1,585,1036.s-1; Eo: 283,46 kJ/(gmol). La sección delsostenimiento del esterilizador es una tubería de acero de 24 m de longitud Y 7,79 cm de diámetro interior. En la planta se dispone de suficiente vapor de agua saturado, a una presión de 6 atmósferas, suficiente para calentar el caldo hasta una temperatura de sostenimiento de 130 oC. Los periodos de calentamiento y enfriamiento son despreciables en este tipo de esterilizador. Las propiedades del caldo a esta temperatura son: densidad: 10OO kg/m3; viscosidad: 1,12.10'3 kg.(m.s)''; calor específico: 4,187 J'(g.oQ)'1' Calcular la cantidad de medio, kg/s, que puede esterilizarse: 1 - si se supone flujo tapón ideal; 2 - si se considera el efecto de dispersión axial. para esterilizar mediante filtración el aire necesario para aerar durante 960 horas un fermentador con 80 m3 de caldo a razón de 1,5 yym (volunren de aire por volumen de licor cada minutol. Se dispone de aire a 18 oC y 6 psig (presión bárométrica : 12 psi; viscosidad:p" : 1,85. 1 0{ kg. (m,s)-1). El aire contien e 24OO microorganismos/m3, (pp : t O00 kg/m3, dp : 0,6/m), y se acepta una probabilidad de hallar0,0o1 microorganis-
6.5 Hallar el espesor del lecho requerido
mos en el afluente al fermentador durante las 960 horas. El lecho está compuesto de fibras de vidrio (d, : 1 5 Ym, o = 0,03)' La velocidad superficial del aire es 0,46 m/s.
401
: .i
6.6 Calcular la pérdida de presión del aire en el lecho f¡ltrante descrito en problema
anterior.
el
!
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405
CAPITULO 7
FENOMENOS DE TRANSPORTE EN BIOPROCESOS
7.1
REOLOGIA DEL CALDO
Los caldos de fermentación están con§lituidos por agua, electrólitos, sólidos suspendidos (partículas, flóculos y máleriales filamentosos) y materiales disueltos. Estas sustancias determinan el comportamiento reológico y la tensión superficial del caldo e influyen sobre la transferencia de momentum, calor y masa en el biorreactor. r
Desafortunadamente la mayor parte de la i¡formación disponible sobre consumo de potencia por agitación, transferenclT de calor, cambio de escala y transferencia de masa, se fundamenta eR datos obtenidos con agua. El agua y las soluciones de electrólitos manifiestan un comportamiento reológico sencillo descrito por la ley de Newton, Bird et al., (1960). La mayorla de los medios de fermentación con bacterias y levaduras también manifiestan un comportamiento Newtoniano..Los medios donde partic¡pan células miceliales o donde se forman compuestos poliméricos se comportan generalmente como fluidos no Newtonianos.
406
7.1.1
Fluidos Newtonihnos
La viscosidad de un caldo Newtoniano no es afectada por la velocidad de agita-
ción: tz -
17.11
Donde, rxz: componente del tensor esfuerzo cor.tante en el plano XZ, N/m2; {dv./dx}: gradiente de velocidad del caldo, (m/s}/m; p: viscosidad del caldo, kg.(m.s) '. La ecuación antei¡or puede ser generalizada para incluir ftuidos con material suspendido o con macromoléculas disueltas: üE--
17.2t
La viscosidad aparente, por, kg.(m.s)-1, depende del gradiente de velocidad del fluido y de la temperatura y presión del caldo Y, Por consiguiente; no es una
propiedad del fluido.
La determinación del comportamiento r.eológico de un fluido reqtriere la construcción de un reograma a partir del ajuste de los datos obtenidos experimentalmente con un viscosimetro exacto dentro de un amplio intervalo de viscosidades. Metz, et al., (1979), describen algunos métodos de obtención de
las propiedades reológicas de los cultivos miceliales. Charles, M., (1978), clasifica los caldos de fermentación en tres'categorfas: cultivos miceliales, cultivos con polisacáridos extracelulares, y cultivos de bacterias y levaduras.
La Figura 7.1 es una representación esquemática de los reogramas típicos de algunos caldos de fermentación. Los resultados experimentales informados por
diferentes investigadores corresponden generalmente a datos obtenidos en diversos tipos de v¡scoslmetros, factor que influye ,sobre los resultados y dificulta la confrontación de estos valores, aun en el caso del mismo caldo.
407
¡
Figura
7.1 Reogramas
t
de fluidos con diferentes propiedades reológicas
Cue
Plqstlco Blnghorn
de
Cass
luldo Newtonlono
I
Esfuerzo
cortqnte
Futdo
drtot
Flu¡do
pseudoplos tlco
Grodlente de ve[ocldod Roels
et al., 119741presentan una lista de los modelos matemáticos empíricos
empleados por diferentes autores para describir la relación entre la viscosidad apafente, !¡p, y el gradiente de velocidad. La magnitud de los parámetros de los diferentes modelos depende de la concentración, de la morfología celulat, y de las condiciones del crecimiento, si es filamentoso o si es del tipo pelotilla. Los sustratos de alto O"ro *o,""ular como almidÓn de maíz disuelto en agua, o una elevada concentración de sólidos no disueltos, afectan la reología del caldo aun a bajas concentraciones celulares, La viscosidad es probablemente el factOr gue afecta en mayor grado el coeficiente de transferencia de calor, La disminución de este coeficiente es drástica a partir de viscosidades del orden de 0,5 kg,(m.sl-1, cuando la velocidad de aeración es alta.
Xueming et al., 1991, estudiaron el efecto de la víscosidad en caldos de fermentación de polisacáridos (goma xantana) sobre el coeficiente de tranferencia de calor. En el caso de caldos con una concentraclfln de 27 (g de goma)/li,tÍo, aEitados con turbinas Rushton, el valor de este coeficiente puede ser tan bajo como 6 % del valor en agua.
408
u*=*"(*)" ' -,.(*)'
17.51
El comportamiento pseudoplástico ha sido observado por Tuffile y pinho, (1'970), en caldos de s. aureofaciens; por Deindoerfer y weót, (1 960l, en caldos de c. helleboií y en caldos de Penicillium chrysogenum, y por Taguchi et al., (1968), en caldos de Endomyces.
7.1.4.
Cuerpo de Casson '1
,
La viscosidad aparente de un líquido que se comporta como cuerpo de Casson es inversamente proporcional al gradiente de velocidad y depende, además, de un esfuerzo constante inicial. Este comportamiento ha sido observado por Roels et al., 11974!., en caldos de P. .Chrysogenum:
("=)'P
l*=1
7.2
"(*)'
=
("")'o . *"
+
(*)"
K"'("t1P'(*)' -K:
t7.61
17.71
AGITACION, AERACION Y DISPERS¡ON
El calor añadido al sistema cuando el caldo es agitado para piomover la mezcla y la tranferenciá de calor y de masa, qoe, puede determinaÍse experimentalmente para diferentes valores de la velocidad de agitación y del flujo de aire, o evaluarse mediante correlaciones entre los números de potencia y de Reynolds,
410
(Perry y Chilton, 1973). Generalmente la agitación se realiza mecánicamente pero también se puede lograr mediante dispersión de aire. En la práctica la potencia suministrada por agitación a un reactor varía entre 1 y 5 W.(litro)-l, donde aproximadamente 85 - 95 % de este valor corresponde a agitación mecánica y el resto a la energfa cinética y expansión isotérmíca del
gas dispersado.
términos cualitStivos aproximados se considera que un sumistro de potencia al líquido menor que 0,2 W.(litro)1 proporciona una agitación moderada, entre 0,6 y 0,8 W.(litro)-l la agitación es vigorosa, y para 1 W.(litro)-1 o más, la agitación es intensa. Estas cifras están relac¡onadas con la potencia realmente entregada al lÍquido y no incluyen las pérdidas en sellos, cojinetes y otras ¡neficiencias eléctricas y mecánicas, (McCabe, Smith, y Harriot, 1991). En
Las pérdidas por fricción en sellos, cojinetes, bandas y poleas, generan calor y
contribuyen a la disminución de la eficiencia de transmisión de potencia, eo, entre el motor y los impulsores. Harmes 119721encontró una pérdida de 3O% de potencia, entre el motor y el impulsor, en un reactor de 270 litros. La energía mecánica suministrada puede alcanzar hasta un 25o/o de la carga calorífica total que debe ser removida de un biorreactor para mantener la temperatura óptima, (Charles, M., 1985). Las pérdidas por fricción en un fermentador de laboratorio pueden alcanzar hasta el 75 o/o del total consumido por el motor. A nivel piloto estas pérdidas pueden llegar a ser del 30 % con respecto al consumo total. A nivel industrial la fricción representa sólo el 5 % de la potencia consumida por el motor,
7.2.1 Evaluación
de la potenc¡a entregada al fluido
La velocidad de un agitador se mide directamente con un tacómetro conectado
al eje, La señal eléctrica se utiliza para controlar la velocidad de agitación y asegufar una adecuada transferencia de masa. La medición de la potencia entregada a un impulsor depende de la escala de operación. La lectura de un
411
vatímetro acoplado al motor del agitador proporciona datos exactos a escala industrial y de planta piloto:
P = I.Vu.er.oos$
17.81
Donde, P potencia, W; /: corriente, Amperios; Vor: potencial eléctrico aplicado, V; er: eficiencia del motor; cos tD: factor de potencia. La potenc¡a entregada al fluido a escala de planta piloto se determina directamente mediante dinámómetros de torsión y detectores de esfuerzo, (Aiba et al., 1973; Nienow y Miles, 19691:
t7.9t
P=(r),f Donde, r: momento de torsión. N.m;
u¿:
velocidad angular del agitador, radian/s.
La potencia entregada al fluido en un fermentador pequéño se evalúa preferen-
cialmente por el método de detectores de esfueeo Gtrain gaugesl y no por el método del momento de torsión, por la desproporcionada cantidad de energía disipada en los sellos del agitador. Similarment€,; no se recomiendan técnicas eléctricas de evaluación de potencia a escala de laboratorio (P < 1 kW o V < 50 lítros),'porque las pérdidas en et cílcuito pueden ser mayores que la potencia I¡ transmitida al fluido. ,
7.2.1.1 Dispersión de gases
La potencia entregada a un fluido por la dispersión de un gas se calcula mediante la ecuación:
(o'), - (r'), R.r . ¡_ln
_f
[
412
2.s.
Ms
P¡ P¿
t7.10I
Donde el primer térm¡no de esta ecuación representa el cambio de la energfa cinética del gas: v,: velocidad del gas en la tuberfa, rr.s-1i v,: velocidad del gas en el reactor; g": factor de conversión de la ley de Newton (1 kg.m.s-2.N-l). El segundo térm¡no de la Ecuación Í7 .101 representa la expansión isotérmica del gas, desde el punto de salida de gas por la tobera hacia el líquido, donde ia presión es'p,, hasta el punto de salida de gases del reactor donde la presión es p";
R: constante de los gases,8,314 kJ.kmol-1.K-1; M.: peso molecular del gas (I\lo,.r: 29 kg.kmol-tl I T: temperatura absoluta delgas, K; F.: velocidad de flujo de masa de gas, kg.s-l
:
F.=pe-F I pr= Ptx'M, R.T
17
.111
Donde, F: caudal de gas, m3 s-'; pg: densidad del gas, kg/m3; Por.: presión absoluta, Pa, (Pa : N.m-2):
Puror*^ = Pu.mwlttrc1 * Pul¡pustruct
7.2.1.2 Agitación
Los tipos de fermentadores utilizados con mayor frecuencia en la práctica de la
lngeniería Bioqulmica son los fermentadores de laboratorio, el tanque agitado, la columna de burbujeo y elfermentador de recirculación, (Figuras 5.20 y 5.21).
Los fermentadores de laboratorio generalmente son recipientes con un volumen de operación entre 0,5 y S litros, usualrnente son de vidrio y están provistos
de un sistema de agitación mecánica. Los fermentadores denominados "de banco" son similares a los de laboratorio, sólo que tienen volumenes de trabajo entre 5 y 15litros. Sykita, 1983, dor pequeño:
,r"."nr"
las siguientes caracterfsticas deseables de un fermenta-
413
- Relaciones geométricas (factores de formal similares a las de un ferrnentador industrial.
- Construcción hermética para prevenir la contaminación del medio. - Sistemas confiables de registro y control de temperatura, sistemas de control de pH y ruptura de espuma con el propósito de garantizar condiciones estandarizadas en los diferentes ensayos.
-
Volumen de operación suficientemente grande para permitir la toma de muestras sin alterar apreciablemente el volumen del cultivo o perturbar las condiciones de aeración y mezcla. La columna de burbujeo (Figuras 5.2O v 5.21) es un tanque cilíndrico diseñado generalmente con una relación entre altura y diámetro mayor que 3 y equipado con un distribuidor de aire. Este fermentador de reducido costo y fácít construcción y mantenimiento requiere una distribución homogénea del aire pero t¡ene la desventaja de generar demasiada espuma. Entre las industrias que
utilizan este t¡po de reactor están la de ácido cítrico, ácido láctico, enzimas, esteroides y levadura para panificación. Los fermentadores de recirculación más utilizados son el reactor de circulación
líquida impulsada por aire "airlift" y el fermentador de chorro (Figura 5.21lr. El fermentador airlift es una columna de burbujeo equipada con un tubo concéntri-
co de arrastre "draft tube" con el objeto de distribuir el aire. Este tipo
de
fermentador se utiliza principalmente en los sistemas de tratamiento de agua y para la producción de proteína unicelular. El fermentador de chorro, similar al airlift, está equipado con una bomba para recircular el lfquido.
A nivel industr¡al el fermentador más usado es el tanque agitado. En la Fígura 7.2 se representa esquemáticamente un reactor de mezcla completa agitado por dos impulsores de turbina acoplados al eje de rotación. Generalmenté se instalan entre 2 y 5 impulsores. Eltanque agitado es muy flexible ya que puede manejar fluidos con viscosidades muy diferentes y satisfacer,un.amplio intervalo de requerimientos de tranferencia de calor. Cuando el sistema de camisa no es suficiente para proveer el área requerida de transferencia de calor siempre existe la posibilidad de instalar serpentines, internos o externos, o utilizar un intercambiador externo. Los impulsores son preferencialmente de turbina, tipo Rushton. Estas turbinas fáciles de construir suministran una elevada potencia y se caracterizan por su alta eficiencia para dispersar el gas. Los impulsores del
414
tipo hélice marina son ut¡l¡zados cuando se requiere bajo corte y bajas transferencias de oxígeno. La relación (H/Dr) entre la profundidad del llquido en elreactor y el diámetro del mismo varía entre 2:1 y 3:1 . En la práctica Europea se prefiere una relación 3:1 ,
y en los EE. UU.,2:1.
Algunos fermentadores a escala industrial están construidos según la relación (H/D¡) : 1. En el sistema de eje con 2 impulsores, elimpulsbr inferior se inst¿ila a una altura
sobre el fondo del tanque igual a 1,5 diámetros de impulsor (E : 1,5 Dol y el segundo impulsor se instala a 1,5 Do sobre el primero. Cuando se'instalan'3 impulsores, la distancia (E) a partir del fondo del tanque, y entre impulsores se reduce generalmente a 1 diámetro de impulsor.
Representación esquemática de un reactor agitado por dos impulsores de turbina: Dr: diámetro del tanque; Do: diámetro del impulsor; E: altura del impulsor sobre elfondo del tanque y separación entre impulsores; W: anchura de las aspas; L: longitud de las aspas; J: anchura de las pantallas deflectoras; H: profundidad del líquido.
Figwa
7.2
II k- Do+t ¡-Dt+l
fr
EI
II 415
Fukuda (1968), encontró una proporcionalidad directa entre el número de potencia y el número de impulsores. Así, por ejemplo, se puede suponer gue la
potencia total es la suma de la potencia suministrada por cada ímpulsor. En condiciones aeradas el impulsor inferior consume menos potenc¡a que el resto. El diámetro de un impulsor varía generalmente entre
0,3 y 0,4 veces el diámetro (0,3 Dr < DA < 0,4 Drl. Usualmente elimpulsor se construye según del reactor la relación: 20:5:4 : D¡: W: L, donde W es la anchura y L es la longitud de las aspas del imBulsor. Generalmente se instalan 4 pantallas deflectoras uniformemente espacialas de anchura igual a 1/10 del diámetro del tanque (J : Dr/10) con el propósito de crear turbulencia y evitar la formación de vórtice.
7.2.2 Agitación
de fluidos Newtonianos no gaseados
Según McCabe y Smith (1976), la potencia requerida para agitar un fluido Newtoniano se calcula a partir de: P.g, p.n3.DAs
=
rl\ür,+,
r, ,...,r"]
P=8" p^= iFr=ol'D^ - p.no -Dt" =iRe=n'D^2'P F I
17.121
s,=N,',=l:s,=l
s,=l,tr=*,t"=l Donde, Po : número de potencia; Re: número de Reynolds; Fr: número de Froude; S,, Sr, S., So, S., S.: factores de forma; P: potencia requerida para rotar un impulsor dado a una determinada velocidad, W; g": factor de conversión de la Ley de Newton (1 kg.m.s'2.N-'); p = densidad del fluido, kg,m-3; n 416
velocidad del impulsor, revoluciones s-l; l.r = viscosidad del fluido, kg.m-1.s'1; Do: diámetro del impulsor, m; Dr: diámetro del tanque, m; g : 9,8 m.s-2: aceleración de la gravedad; E: altura del impulsor sobre el fondo del tanque, m; L: longitud de las aspas del impulsor, m; W: anchura de las aspas, m; J: anchura de las pantallas deflectoras, m. La Ecuación f7 .121, válida para agitación de fluídos Newtonianos no gaseados, generalmente se representa en forma gráfica (Figuras 7.3 V 7 .41 para diversos
tipos de impulsores, diferentes configuraciones (factores de forma) y condiciones de operación (McCabe y Smith, 1976; Wang, 1979; Perry y Chilton, 1973t.
Figura
7.3 Función de potencia versus
Reynolds para un impulsor de turbina de
6 paletas planas. McCabe y Smith, 1976.
t00
Funcion de potencio
-l'-i. t'-t
o {--1.1.+
t0
,.\
e1 \l
Éi
-¿l
+i *i 'i rfi
t4
iil \ l-{
?.!.v. t.9:
i l¡
to
1000
700
too00
ts<
+ 1
00000
Reynolds
La representación gráfica de la Figura 7.3 se aplica en'el caso de tanques equipados con un eje verticalcentral y una turbina de 6 paletas planas. Las dos curvas de la Figura 7.3 son válidas para los factores de forma: Sr = Dr/D¡ : 3;Sz = E/DA :1;S. = L/DA = 0,25; Ss = H/Dr = 1. LacurvaAseaplicaen el caso de tanques equipados con 4 deflectores, cada uno de anchura igual a la 417
: .i
décima parte del diámetro del tanque (Su : 6,1), y Q aplica en el caso de tanques sin deflectores.
: P". La curva B se
La fqnción de potencia, {p, representada en las ordenadas de las Figuras 7.4, depende de los números de potencia P" y de Froude, F^:
P'8' : F^=n"'D^ g p.ns.D|¡ 'R
Po='
'Q=Pr.Fi^i
7.3 y
t7:131
Figura 7.4 Functón de potencia, (D, versus Reynolds para hélices de 3 aspas. McCabe y Smith, 1976, .i
to0
a
_a\a_
'.4:::.¿t
.le,tti dr.o16.sri.slFfr
-3i:P-qf¿g,i?:ili
.EL:..il.
dérk
s¡.P.á.§a:12¡I
e
_'
\\ ...t\.
dé;i,t ¡a-te7"'; §i;'i 5,: Pá§óilil: ---!--j---.- l---¡--i,-i-i+i D:iG ddíl tctdresi §Jl r;Pespitil¡
t\\
10
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(Uts9i9
I
i§ §i
\^i.. 'ii
\
\-.--¿.
-*-: iX
A
==+:M
§ it =
0.1
t
t0
100
1000
j::iri:i:i1
+
I
*+ 10000
100000
Reynolds
El efecto del número de Froude aparece cuando hay formación de vórt¡ce, y entonces sólo si el número de Reynolds es mayor que 300. En Ios tanques equipádos con pantallas deflectoras, o p'árá impulsores que entran lateralmente al tanque, o cuando el número'de Reynolds es menor que 300, no se forma vórtice, y el número de Froude no afdCta la Ecuación 17.121 y m : O.
418
El exponente m depende del número de Reynolds:
m= a-looRe '
t7.141
b
Donde:
ab 1 1,7 0 2,3
Curva 40 1g
Figura 7.3 7.4 7.4 7.4
B B
18
C
1g
D
La representac¡ón gráfica de la Figura 7.4 se aplica en el caso de tanques equipados con un eje vertical central y una hélice de tres aspas, Para todas tas curvas 52 = E/Do : 1, y Su : g¡¡, : 1. La curva A se aplica en el caso de tanques equipados con 4 deflectores y Ss : J/D, : 6,1 .
7.2.3 Agitación de fluidos Newtonianos
gaseados
La potencia consumida por un sistema gaseado es considerablemente rnenor que
en un sistema no gaseado. A bajos caudales el gas pasa por el impulsor sin dispersarse y el líquido fluye sin ser prácticamente perturbado por el gas. A medida que aumenta ef caudal, una mayor cantidad de gas es capturada por los vortices formados detrás de las paletas del impulsor, y luego es dispersada. En este momento el consumo de potencia del sistema §aseado comienza a disminuir con respecto al consumo del sistema sin gasear. El sistema de agitación se diseña generalmente para el procedimiento de esterilización donde el medio de fermentación e§tá usualmente en una condición no gaseada. El número de aeración,
Ar, relación entre la velocidad superficial del gas y
la
velocidad en la punta del impulsor define la intensidad de la aeración:
17.15t
419
Donde, Fo: caudal de gas, m3.s-',; Do: diámetro del impulsor, m; n: velocidad del impulsor, revoluciones.s-1; n,Do: velocidad en la punta del impulsor, m.s'1. En los cultivos de microorganismos miceliales se encuentra generalmente que
las células sufren daño cuando la velocidad en la punta del impulsor es mayor que 5 m.s-t, (Lynd, 1989). La relación entre los consumos de potencia en un sistema gaseado y en el mismo sistema sin gasear, Pn/P, varla entre 1,0 y 0,3' wang et al., (1979), presentan la relaciÓn, Po/P, en función del número de deración, A., para el impulsor de turbina de hojas planas: PG
P
0,65
= 0,35 *
t7.16I
1 + (f 6,67)-á,
Nagata, 1975, presenta la siguiente ecuación para evaluar la relación Po/P, en un reactor equipado con una turb¡na de hojas planas:
bsio+ =
Donde:
*,
=
,*(3f'*'*3'"' ';'* ?' 'n"
+
;
&
+,
=
n,
=
17.171
?,j,
Donde, Pu: consumo de potencia en el sistema gaseado, W; P: consumo de potencia en el sistema sin gasear, W; Fo: caudal de airé, m3.s-'; n: velocidad del impulsor, revoluciones.s-'; Do: diámetro del impulsoÍ, mi pi densidad del caldo, kg/m3; p: viscosidad del caldo, kg/(m.s). Michel y Miller (1962) desarrollaron la siguiente P
c
= K.ÍP2
.
n. D
.
^3
ecuación:
,
t7.18t
F
^-o'$]o'§
Donde, K: constante que depende de la geometrfa del sistema y de las Unidades utilizadas. Los intervalos de las variables físicas en los ensayos de Michel y Millerfueron: viscosidad: p - 9.10-4 - 0,:l kg,m-l's'1; densidad del caldo: p :
-
1650 kg.m-3 ; tensiÓn superficial: O,O27 'O,O72 N.m-'; Potencia consumida por el sistema gaseado: Po: 3,73 -74,6 W; Volumen del líquido en el reactor: 3,5 - 10,5 litros, BOO
420
Ejemplo
7.1
Consumo de potencia por agitación
un tanque cillndrico de 0,99 m de diámetro, prov¡sto de cuatro
placas
deflectoras, unifOrmemente espaciadaS. de anChura J = 0,1 .Dr, se agita con un impulsor de turbina de seis hojas planas (DA : Dr/3) que gira a 3 rps. Agua a 25 oC (densidad: p : 997,08 kg/m3, (Perrf,y Chilton, 1973); viscosidad p : 8,9O4.tOo fg/m.s) ltena el tanque hasta un nivel de operación H : Dr' El oC y 5,2 psig a ¡azÓn de 0,4 vvm tanque se alimenta con aire estér¡l a 25 (volumen de aire por volumen de licor cada minuto) por un orificio situado debajo del impulsor. La presión local es 10,8 psi. Calcular la potencia disipada por el impulsor en el líquido sin gasear y en el lfquido gaseado. Solución:
- Volumen de licor: V = !;(O,gq2.(O,gg) = 0,762
mg
- Caudal de aire:
- O,4.LO:762) = S,0g.l0-o ^60
F,
msls
- Nrimero de Reynolds: Rr
3.(0,$)2.(997,0q 8,904.10-4
=
\¿
t
Por consiguiente, Q - Po : 6, (Figura 7.3), y la potencia disipada por el impulsor en el llquido sin gasear, Ecuación [7.13], es:
P = 6.(997,08).(3)0.(0,33): = 6s2,1
W
- Número de Froude: FR =
n2.D,
I ---a
=
9,8
= 0,303
421
- Número de aeración:
A-= F^ ' n.o|
(5,08.10-1 =O.M7 3.(0,$)3
La potencia disipada en el líquido gaSeado, (Ecuación 7.'l-1l., es: ros
."+ = - .'rr.(:#f'o.",n"' .&I'*
.As =
- 0,1471
Pc = (0,7126).(632,1) = 450,4 W La potencia disipada en el llquido gaseado, {Ecuación 7.16}, es:
&=o.gs* P
0,65
1+(16,67)-(O,U7)
=o.T1u
Pc = 6O,V144¡}.(632,f) =.451,6
[
7.2.4 Agitación de fluidos no Newtonianos no gaseados
fluido no Newtoniano no gaseado (o velocidad del impulsorl. Metzner y Otto la velocidad de corte de depende {1 957} definen un número modificado de Reynolds para fluidos pseudoplásticosi El consumo de potencia en ta agitación de un
, )' R¿*=D^".o"-.^.pl rt (0,1).X" \6.n + 2)
t7.1gl
Donde, K": lndice de consistencia de flujo, igual al esfuerzo cortante
7
correspondiente a una velocidad de óorte de 1 s-t; m: fndice de comportamiento
de flujo lm -- 1: fluido Newtoniano; fluido dilatante).
422
r
m < 1: fluido pseudoplásticoi m > 'l:
Taguchi y Miyamoto (19661 relacionaron los números de potencia, po, y de Reynolds, Rerr, para caldos no Newtonianos no aerados en la fermentación de glucoamilas a con Endomyces:
Po=k.(fu¡t)"
(+)'(#)'
17.201
Donde, Dr: diámetro del tanque; Do: diámetro del impulsorr
w:
impulsor.
anchura del
En la Tabla 7.1 se presentan los vatores de k, a, b y c, correspondientes a la Ecuación f7.2ol. Los caldos de fermentación con organismos miceliales (como en el caso de la producción de antib¡ót¡cos con Penicillium o Streptomyces) o
con materiales poliméricos (fermentación de polisacáridos) manifiestan
un
comportamiento pseudoplástico.
Tabla
7
.1
Valores del coeficiente y exponentes de la Ecuación y Miyamoto, 1966).
Rer.:
<10
10 - 50
k
32
-0r
11
a
b c
-7,7
9
0,4
7.2.5 Agitación de fluidos
-o ,4
-L,7 0,5
17
.2oj. (Táguchi
>50 9
-0,0s -1,2 o, 9'
gaseados no Newtonianos
Taguchi y Miyamoto, (1966), investigaron el efecto de ta aeración sobre el consumo de potencia en la agitación de un caldo no Newtoniano y encontraron que una forma modificada de la ecuación de Michel y Miller (Ecuación 7.19l, con Kl en lugar de K, fija adecuadamente los datos experimentates de la fermentación de glucoamilasa en régímen turbulento, Re", ) S0:
423
P
e = Kt -lr2.n.
o^3 -F,{-o's'
]o'45
t7.211
OonO", K,,: constante que depende de la geometría del s¡stema y de las unidades utilizadas. Los mismos autores recomiendan la siguiente ecuación para la zonas laminar y de transición: P
c=
K2.lP2.n. D^s . F;o'ú fo'n
t7.221
Donde, Kr: constante que depende de la geometría del sistema.
7.3
TRANSFERENCIA DE CALOR EN FERMENTACION
En los reactores biológicos hay necesidád de transferir calor en diferentes etapas y circunstancias del proceso de fermentación:
- En el procedimiento de esterilización se suministra calor para calentar el caldo hasta la temperatura requerida para la elimininación de todos los microorgariismos. El caldo se mantiene a esa temperatura durante un tiempo denominado período de sostenimiento. Entonces hay que retirar calor y enfriar el caldo hasta la temperatura de fermentación. - En el tratamiento anaerobio de los lodos de aguas residuales, el calor generado
por la conversión del sustrato es insuficiente para alcanzar lq temperatura requerida por el proceso (55 - 60oC) y, por consiguiente, hay necesidad de suministrar calor al digestor,
- La conversión del sustrato genera un exceso de calor con respecto a las condiciones óptimas del reactor en la mayoría de las fermentaciones microbiales y, por tanto, hay necesidad de retirar este calor, Los procesos de fermentación exotérmicos pueden llegar a generar entre 7,32
y
14,6 Wilitro. La disipación de energía (por agitación y aeración) puede alcanzar un valor entre 0,73 y 4,4 Wlitro. Los coeficientes globales de transferencia de calor para un fermentador industrial estándar alcanzan valores 424
entfe 280 W.m-2.oC-1 con medios de baja viscoSidad y 850 W.m-2.oC-ren el caso de fluidos viscosos y no Newtonianos. La magnitud de la transferencia de calor depende de los llmites del sistema y de las condiciones ambientales. Las variables más importantes en la determinación de la magnitud del calor transferido, qiñr, son: la diferencia de temperatura entre el fermentador y el aire ambiente, la temperatura del agua de refrigeración y el área disponible para transferencia de calor.
7 -3.1 Area de transferenc¡a de calor
La transferencia de calor se ¡ealtza entre el fluido procesado, caldo
de
fermentación, y el fluido refrigerante, generalmente agua, mediante sistemas de Camisas externas, Serpentines internos o externos, flujo a través de un intercambiador, o mediante la condensación o la evaporación del agua y otros compoñentes volátiles delfluido que contiene las células y demás productos de la ferirrentación. El área efectiva de transferencia de calor de un sistema de camisa externa (Figura 7.5.a), según Humphrey (1989), es eJ área láteral del tanque:
A" = n'DrH
f7.23t
Donde, A¿: área de,transferencia de calor de la camisa, m2; D.: diámetro del reactor, m; H: altura alcanzada por el caldo de fermentación dentro del reactor, m. Con el propósito de controlar la temperatura del caldo durante la fermentación, usualmenterentre 25 oC y 35 oC. es necesario remo\rer el calor generado' Con este propósito se requieren áreas de transferencia que generalmente no son
posibles de satisfacer con el área disponible de la camisa. Por e.sta razÓn prácticamente todos los fermentadores de capacidad superior a 1000 litros requieren un serpentín interno, Los serpentines helicoidales tienen la ventaja de proveer una gran cant¡dad de área de transferencia en un volumen dado de fluido pero son relativamente
425
costosos y difíciles de mantener. El área de transferencia de calor de un sistema de serpentfn interno (Figura 7.5.b1, es:
Ar=n.d.Ls=t2.d.Dr.n,
17.241
.Donde, A": área de transferencia de calor del serpentín interno, mr; d: diámetro externo del tubo del serpentín, m; Ls: longitud del serpentfn, mi Ls : n. D..n.; D.: diámetro del serpentín, m. Generalmente: Ds : 0,9.Dr, para serpentines sencillos de una sola hilera; Dr: diámetro del reactor; n. : (H./e) + 1 : número de espiras del serpentín; H": altura del serpentín, m. Usualmente: Hs =- 0,8.H; H: attura ocupada por el caldo de fermentación dentro del reactor; e: separación entre espiras adyacentes, m. Frecuentemente e varía entre 2d y 4d. En la Figura.7.5.c, se muestra esquemát¡camente-el intercambiador fle doble tubo, el flujo puede ser en paralelo o en contracorriente y cualquiera de los dos fluidos puede ocuparelespacio anularo el tubo interior. El equipo mostraflo;en la Figura 7 .5.d, es un intercambiador de un paso por Ia coraza y dos, puatro, o cualquier múlt¡plo de pasos por los tubos. Elequipo mostrado en la Figura.7,5"e, es un intercambiador con dos pasos por la coraza y cuatro, ocho, o cualquier múltiplo de pasos por los tubos. En la Figura 7.6 sq,representa esquemátieámente la variación de la temperatura de los fluidos cal¡ente y frío con Ia distancia, medida a partir de la entrada de fluido frío, en un intercambiador de doble tubo. En figura 7.6.b, se observa que la temperatura de salida del fluido frío es necesariamente menor que la temperatura de'salida del fluido caliente. El calor transferido es menor que el posible con flujo en contracorriente en el mismo equipo, y por esta razón el flujo en paralelo se utiliza raramente en un intercambiador de un sólo paso.
El fluio en paralelo se emplea en situaciones especiales donde es necesario limitar la máxima temperatura delfluido más frlo o donde es importante camb¡ar rápidamente la temperatura de uno de los fluidos. Otros intercambiadores ampliamente utilizados en la industria son los de co(aza y tubos. Un fluido fluye dentro de los tubos, mientras el otro fluido es forzado por la coraza a través de los tubos, mediante placas deflectoras.
426
Figura
7.5
Representación esquemática de algunos equipos de transferencia de ñ' calor.
H
:l-Dt A
x-Dt +
-¡
c
B
Reocton con conlso extenno
Reoctor
con
senpentln hterno
Intencqhb¡odon de tub€r¡o doble
fco Tfe
TFe
.Tfo
D
lntercqrrblodor de corozo y ttdoos un pqso por lo corqzo y ?, 4.,.. posos por los tubos
Tce,
fntereonk¡lodar Ce corqzo y tubgs dos pqsos por lo corozq y 4, 8-'-.poso:s por los tubos
427
Figura 7.6 Variación de la temperatura de los fluidos caliente frío en un intercambiador de doble tubo. T"o, T.r: Temperaturas afluente y efluente, respectivamente del fluido caliente, oC; Tro, Trr: Temperaturas afluente y efluente del fluido frío.
Tco
ftu¡do coltente T
Fluido col¡ente
AT2
ftu¡do Pro Tce
T
I
A:
Tf
Tf
ATI
t
fq
Tfo
D¡stoncio
D¡stonc¡o
b- flujo en paralelo
a-flujo en contracorriente
7.3.2
[are
ftu¡do
Balance de energía
En los intercambiadores de calor no'hay traba¡o de eje, y las energías cinética y potencial son pequeñas comparadas con los otros términos de la ecuación de balancg de energfa. Además, los intercambiadores de calor operan generalmente en,condiciones estables, excepto durante los cortos perlodos de arranque y finalización. Por consiguiente, la ecuación de balance de energfa aplicada a cada una de las corrientes que fluyen por el intercambiador se convierte enl
ewr = Fxr-(Hr"
428
-
Ho) = Fn.(Ho
-
Hu)
t7.251
Donde, q,,ur: velocidad de transferencia de caior, kW; Frr, Fr.: velocidad de flujo
de masa de fluido frío y de fluido caliente, respectivamente, kg.s-'; H.r, Hro: 1; entalplas del fluido frlo, efluente y afluente, respectivamente, kJ. (kg) H"o, H..: entalpías del fluido caliente afluente y efluente, respectivamente. La Ecuación 17 .251expresa un balance global de entalpía, el calor perdido por el fluido caliente es ganado por el fluido frío. Si se suponen constantes los calores específicos de ambos fluidos, el balance global de entalpía del intercambiador se convierte en:
Q¡iy=F¡ap-crr.(fo
-
Tr )=Fo"'c"r'(To
- Tu\
17
'261
Donde, T6¡, T6E: Temperaturas del fluido caliente, afluente y efluente, respectioC, En vamente, oC; Tr¡, Tr.: Temperaturas afluente y efluente del fluido frío, la Ecuación t7.2d los calores específicos se evalúan a la temperatura media aritmét¡ca entre las temperaturas de entrada y de salida def fluido: crr: calor espectfico del fluido frío, kJ (kg.oC)-1; Cr": calor específico del fluido calÍente. La velocidad de transferencia de calor por unidad de área se denomina fluio de calor y se expresa en unidades de potencia por unidad de área (W.m-'z) de la
superficie por la cual fluye el calor. La mayoría de los equipos de transferencia de calor están construídos con tubos. El flujo de calor puede expresarse con respecto al área exter¡or, o con respecto al área interior, y aunque la selecciÓn del área es arbitraria, ésta debe quedar clarameñte establecida.
7.3.3 Coeficiente de transferencia de calor
La ecuación general utilizada en el diseño de equipo de transferencia de calor es:
ftnn
= U'A'LTu = Uo'Ao'LTu = Ui'Ai'LTM
17.271
Donde, q,^r: velocidad de transferencia de calor (Ecuaciones 7.25 y 1.26l., kW; U: coeficiente global de transferencia de calor, kW.m-2.oC-l' Uo: coeficiente global referido al área exterior; U,: coeficiente global referido al área interior; A: área de la superficie de transferencia de calor, m2; ATr: diferencia media de temperatura en el intercambiador, oC.
429
7
El coeficiente global de transferencia de calor de un intercambiador de doble tubo (Figura 7.5.c} se expresa rnediante las siguientes ecuaciones: U¿= 1
hi
*
A,.ln (r.lr,)
Z.r.L.k
*
L
Ao
t
v.2at
ho
Donde, U,: coeficiente global referido al coeficiente global referido al área exterior. uo
Aol Ai
-t_
Donde, Ao
hi
+
,l".ln (r" lr,l 2.¡.L.k
1
Í7.291
ho
:
2.n.ro.L: área exter¡or del tubo interior, m2; ro: radio exterior del tubo interior; L: longitud total de la tubería doble, m; A, : 2.n.r,.L: área interior del tubo interior; r,: radio interior del tubo interior; k; conductividad térmica de la pared deltubo interior, kw.(m.oC) 1 ; ho: coeficiente de transferencia de calor por convecciÓn, o coeficiente de película, por el lado exterior del tubo interior, kW,(m2 oC)-1; hi: coeficiente de película por el lado interior del tubo interior, Las ecuaciones disponibles en la literatura para la evaluación de coeficientes de transferencia de calor dependen de las condiciones del flujo, de la geometría y
configuración del sistema, de las propiedades reológicas del fluido
y
del
mecanismo de transferencia,
Eltema de transferencia de calor es un área especializada de lngeníería Ouímica e lngenierfa Mecánica. En la literatura se encuentran numerosas ecuaciones de transferencia de calor, aplicables bajo diversas condiciones experimentales: Welty (1976), Foust (1980), McCabe y Smith (1976), Perry y Chitton (19731, Holman (1976). En la Figura 7,6 se muestra esquemát¡camente la variación de la temperatura de los fluidos caliente frío en un intercambiador de doble tubo (F¡gura 7.5.c). una inspección de la Figura 7.6 muestra que la diferencia de temperatura, entre los fluidós caliente y frk., varía entre la entrada y la salída del ¡ntercambiador. S¡ se suponen constantes los calores específicos y los coeficientes de pelfcula, el valor promedio de la diferencia de temperatura es:
\
430
LTM
-
LT2 LT. ln' LTz
LT1 =
17.301
Donde, ATr: diferencia media logarltmica de temperatura, oC. Enunciada en palabras, AT, es la diferencia de temperatura en un extremo del intercambiador menos la diferencia de temperatura en el otro extremo, dividida por el logaritmo natural de la relación entre estas diferencias de temperatura. En el caso de los intercambiadores de. tubo y coraza (Figura 7.5.d y 7.5.e), sg aplica un factor de corrección a la diferencia media logarltmica, ATr, calculada para un intercambiador de doble tubo con las mismas diferencias de temperatura en los extremos frío y caliente. La ecuación global de transferencia de calor,
Ecuación f7.271, se convjerte en:
enn J (I.A.Ft.^Ty
17.311
Donde, F': factor de corrección de la diferencia media logarítmica de temperatura, Holman (1976), Kern (195O). Los fluidos microbiales forman ocasionalmente
incrustaciones sobre la superficie de transferencia de calor que reducen gradualmente el valor del coeficiente de película por el lado del fluido.
7.3.4
Reactores equ¡pados con cam¡sa
El sistema de camisa tiene algunas ventajas de costo y economía de operación con respecto a los sistemas de serpentfn, pero el área de transferencia de calor
es prácticamente inmodificable una vez construido el tanque.
Brooks y Su, (1959), recomiendan la siguiente ecuación para calcular el coeficiente de película entre el líquido en el reactor y la superficie interior del recip¡ente encamisado) válida para un amplio intervalo de viscosidadeS y aplicable en un tanque agitado, equipado con pantallas deflectoras y una turbina de aspas planas, y documentada por otros investigadores en sistemas equipados con paletas y turb¡nas de flujo axial, (Strek, 1963): 431
ho'D,
= 0.74.(R,l)*.
trrl'r. ( -r
)''''
t7.32)
pr=n'Dtz'P i pr=F"-cp pk Donde, h": coeficiente de película entre el lfquido en et reactor y la superficie ínterior del iecipiente encamisado, W.m-2. oCi ; Re número de Reynolds; pr: número de Prandtl; Do: diámetro del impulsor, m; D.: diámetro del tanque; p: viscosidad del lfquido a la temperatura media aritmética, kg.m-'.s-'; lpi viscosidad del líquido a la temperatura de la pared; k: conductividad térmica del líquido, W.m-''.oC-t; cr: calor específico del líquido, J.kg''.oC''i p: densidad del líquido, kg.m-3;
La siguiente ecuación se aplica a la transferencia de calor hacia o desde
la
camisa de un tanque provisto de pantallas deflectoras y agitado por una turbina
de aspas inclinadas, Cummings y West, (1950):
ho'Dr
=
0,44.;y
rJ, (ü)"'
t7.33I
Donde, h": coeficiente de película entre el líquido en el reactor y la superficie interior del recipiente encamisado, W.m-2.oC-1. El coeficiente de la ecuación anterior es 0,76 para turbinas de aspas planas.
Ackley, 1960, analiza los resultados obtenidos por diferentes investigadores y recomienda la siguiente ecuación para evaluar los coeficientes de pellcula correspondientes a la superficie interior del reactor y a la superficie exterior de las superficies contenidas dentro del tanque:
ho'D,
= a.R"N.P,1F.
17.341
Donde, h.: coeficiente de película entre el llquido en el reactor y la superficie interior del reactor encamisado o entre el líquido en el reactor y la superficie exterior del serpentín, W.rn-2.oC-1; Dr: diámetro interior del tanque.
432
Los valores promedio del coeficiente'a"dependen del tipo de agitador y de la superficie de transferencia de calor:
tgiüador
Superflcle
Turbina Turbina
Camisa
PaIeLa P.aleta AncJa
Camisa' Serpent,f n Camisa Camisa Serpent ín
Hé1 Hé1
Coeficiente ,62 1,50 0, 35 0 ,87 0 ,46 0 ,54 0,83 0
Serpentfn
ice ice
a
Cuando los llquidos son muy viscosos se utiliza un agitador de tipo ancla, Uhl y Gray (1966):
ho'Dr
= K.R,o.P,o*
(ü)''"
t7.3sI
K : 1, o = 1l2para1.0 < Pe < 300; K = 0,36, a = 0,67 para 3O0< r9e <40000; ho; coeficiente de pelfcula entre el lfquido en el reactor y la superDonde,
ficie interior del recipiente encamisddo, W.m'2.oC'r.
7.3.5
Reactores equ¡pados con serpentín
Oldshue y Gretton, (1954), recomiendan la siguiente ecuación para el calentamiento o enfriamiento de líquidos en un reactor equipado con pantallas deflectoras, un serpentln helicoidal y un impulsor de turbina: hr'do
= (0,14.R:'Ül
'=P*l'{*l'(-1)'
17.361
Donde:
433
Rc= ".D1.p
i pr =tP
Donde, ho: coeficiente de película entre la superficie del serpentín y el líquido, ; do: diámetro exter¡or de la tubería del serpentín, m; a: exponente dependiente db propiedades del fluido tales como viscosidad, capacidad calorÉ fica y conductividad térmica. Para una evaluación preliminar, el valor de a, consistente con otras ecuaciones similares es: a : O,24. La Ecuación [7.36] se aplica a un arrollamiento simple. La eficiencia térmica de un segundo arrollamiento con un área equivalente a la del primero, se estima entre 70 y 90% de la eficiencia del serpentín simple. W.m-2.oC-1
7.3.6 Reactores equ¡pados con tubos
vert¡cales
Los reactores equipados con haces de tubos vert¡cales aprovechan el efecto deflector de los haces para generar una acción de mezclado adicional a la transferencia de calor. Los tubos originan áréas de alta turbulencia, Dun[ap'y Rushton, (1953): ho'D^
=
o,(x) ne*
.P:"
(+i'"
(i)" (ü)'" t7 sr/t
v.cp k Donde, no: número de haces de tubos; ho: coeficiente de pelfcula entre la superficie de los tubos y el llquido en W.m-2.oC-1. El trabajo de Dunlap y Rushton dernuestra que en el caso de seis haces de tubos, formado cada uno por tres tubos de tamaño do/D1 = 0,031, (do: diámetro exterior de los tubos; Dr: diámetro del tanque), los tubos verticales originan una pérdida equivalente al 75 o/o
de la potencia consumida por un impulsor en un tanque equipado con pantallas deflectoras estándar, Cuatro haces de tubos originan una pérdida equivalente al 50 - 60 % de la potencia consumida en un tanque equipado con deflectores estándar.
434
de placa veftical 7.3.7 Reactores con serpent¡nes
Y Small' (1978):
R. > 4.103
:
t7.38I
+ =to,mrzl.n3'*."r".(ül 4
+
< 1,4.103
:
=(o,rzaa).n:'* r:*
Dor.dc: Re =
+,
t7.391
[tl
n -' u?
Llanchuradelaplaca;ho:coeficientedepelfculaentrelasuperficiedelaplaca viscosidad del llquido a p: densidad a"rr¡"ár, *é m't. /,: m.2oc.l; w líquido, v el ''s de pelfcula' kg'm
Li"rp"t.,ura
7
media
raspada .S.Slntercambiadores de superficie
eje rotatorio'
435
La superficie exterior del tubo central está en contacto con vapor de agua o con
el líquido refrigerante. Las porciones de llquido viscoso en contacto con la superficie de transferencia de calor están esencialmente en reposo, excepto cuando son perturbadas por el paso de la hoja raspadora. La transferencia de calor hacia el lfquido viscoso ocurre en condiciones inestables.
De acuerdo con la siguiente ecuación, (Skelland, 1958), el coéficienté de transferencia de calor sobre una superficie raspada depende de las propiedades térmicas del lfquido, de su velocidad en la dirección longitudinal, y del diámetro y longitud del intercambiador:
b? = (4,e).R:'n ,:,'(:?)''" (?)" Rc=
Dr.v'P
a7.401
;Pr=+
Donde, l-: longitud del intercambiador, m; h,: coeficiente de transferencia de
calor entre la superficie interior del tubo central y el llquido, W.m-',oC-'; v: velocidad promedio del fluido en la dirección longitudinal, m.s-1; D^: diámetro interior del tubo central, m; n: velocidad de rotación del agitador, (revolucioñes).s't.
7.3.9
Transferenc¡a de calor en cond¡ciones inestables en rec¡p¡entes ag¡tados
La ecuación básica para el calentamiento
o
enfriamiento de un caldo de
fermentación, en un tanque agitado, es:
dQ = U.A.(Tc - TF\.dI = tn-c".dT
f7.411
'Eonde, O: calor transferido, J: Ur coeficiente global de transferencia de calor entre la superficie de transferencia y el líquido, W.m'.o¿-t; Ai área de transfeoC; Tr: temperatura del rencia de calor, m2; T.: Temperatura del fluido caliente,
436
fluido frfo; /n: masa del caldo en el reactor, kg; co: calor específico a presión constante, J.kg''.oC-l; f: tiempo, s. Si el fluido caliente es un medio de temperatura constante, como en el caso de
vapor de agua a la temperatura de condensación, y el coeficiente global U se supone constante, la ecuación anteriof se puede integrar entre los llmites: t : 0, T, = T.o Y t : tr, T : Tra, Para obtener:
,
l-m-
T" T"
- To
- Tru
m.cD,tT
17.42t
u.A
Donde, Tc: temperatura del fluido caliente; Tr: temperatura del fluido frío'
Si el fluido que transfiere calor al caldo no es un med¡o de temperatura constante, como en el caso de agua de refrigeraóión que entra a la temperatura Tro y sále a Trr, mientras el caldo se enfría desde T"^ hasta T6s, s€ obtiene:
,
- Trrt To - To Tc^
Fw.crp
R't-1
ñc.cpc
K1
(u.¡\
K.=eXDl I --'' \Fn''o
tr
Í7.431
|
)
Donde, cp¡, cp6l calores específicos a presión constante del fluido frío y del fluido o6-t ' Frr: velocidad de flujo de masa de caliente (caldo), respectivamente, J kg-t
fluido frlo, kg.s-'; mc: masa de fluido caliente (caldo), kg'
Ejemplo
7.2
Transferenc¡a de calor en un reactor aerób¡Go
Un reactor cilfndrico de 4 m de diámetró provisto de cuatro placas deflectoras uniformemente espaciadas (J : 0,1'Dr : o,4 m), sé agita con tres impulsores
de turb¡na de seis hojas planas, (Do : Dr/3 : 1,33 m), montados sobre el mismo eie que gira a 0,8 rps. El tanque de 12,8 m de altura se alimenta con 437
medio de crecimiento a 25 oC (densidad, p : 112O kglm3; viscosidad, p : O,216 kg/(m.s); calor específico, c, : 2836 J/(kg.oCl; conductividad térmica, k : O,44 W.m-1.oC-l1, hasta un nivel de operación H : 8,g6 m. La velocidad máxima de consumo de, oxígeno del cultivo es: r(Or) : 0,03 mol Orl(litro.hora). Se dispone de agua de refrigeración cuya temperatura varía entre 15 y 18 oC. El tanque se alimenta qon aire estér¡la 25 oC y 2O,2 psig a razón de 0,4 vvm (volumen de aire por volumen de licor cada minuto) por un orificio situado debajo del impulsor. La presión tocal es 10,8 psi.
calcular: 1- Area de transferencia de calor disponible por el sistema de camisa;
2- Area de transferencia de calor disponible por el sistema de serpentín interno sencillo; 3- calor generado por el cultivo; 4- calor generado por la agitación del
licor; 5- Calor entregado al licor por la dispersión del aire; 6- Calor total generado en el reactor; 7- Coeficiente de transferencia de calor entre el líquido en el reactor y la superficie interior del recipiente encamisado; B- Coeficiente de transferencia de calgr erltre el líquido en el reactor y la superficie exterior del serpentín; 9- Area de transferencia de calor requerida por el sistema de camisa; 10- Area de transferencia de calor requerida por el sistema de serpentín Solución: 1- Area de transferencia de calor disponible por el sistema de camisa, Ecuación f7.231:
A, = n.Dr.H = ¡.4.(8,96) = 112,6 m2 2- Area de transferencia de calor disponible por el sistema de serpentín: Diámetro exterior del tubo del serpentín:
d
:
Separación entre dos espiras adyacentes
e
: 2.d:
0,0508
:
7,17 m
- Altura del serpentln:
Hs': 0,8.H -
1 pulgada
(O,8).(8,96 m)
:
- Número de espiras:
,ro=fl, " e +l=
438
7,17 +1=142
0,0508
esoi¡as
0,0254 m m
v
- Diámetro interior del serpentln: Ds = 0,8.Dr = (O8).@
nl
= 3,2 m
- Area del serpentfn (Ecuación 17.24ll:
á,
.,
= Í,2.d.Ds.ns = Í2.(0,0?#1.@,2».(1421
i,
=
115,9 m2
- Volumen de licor: 'ns
v,
=
=lfd2,6 X,(4)2.(s,go)
'
3- Calor generado por el cultivo, qrrr, Ecuación [3.71]:
a!,2+ a-o,@mol oz ! -tu o
s- = ,*t
o,
-ffi
36oo
4 = Q1,1
kW
4- Calor generado poÉ la agitación del-licor,
:r
Iirros -"i s\"-'-*' '12.6@)
qoorr:
- Caudal de aire: .l
'.r
D =- 0,4.(112,6)= u'lo o,¡ -8r^aE m-F
--bó-
- Número de Reynolds: n_ =
"
0,8.(1,«¡)2.1120 0,216
=7§7.ú
: P" : 6, (Figura 7.31, y la potencia, P, disipada por el impulsor en el líquido sin gasear, Ecuación [7.13], es:
- Por consiguiente, O
P = 6.(1120).(0,8)3.(1,33)s = 14í118,5 w
439
- Número de Froude:
Fn=
o2,Q*
g
= 0,087
9,8
- Número de aeración:
F^
0,75
' ,.ol =,. 0,8.(1,q0)"
A-=
=o.gga
- Potencia disipada en el líquido gaseado, (Ecuación 7.17t':
+
-É2.
(f}*.*3'"'.
(+
)',*.
Pc = (0,45).(14f!18,5) = W2
W
bsrc
=
.1P^
,og,oÉ = -
t,
q*7
;t
- Potencia disipada en el lfquido gaseado, (Ecuación 7'16):
?=0,*.
+ (16,67).(0,398)
= 0,4.35 .i -.
P6 = (0,435).(1.¡818,5) =.622Í1.5 W - Potencia disipada por los tres impulsores: 3.(6440,2) = 19.320,6
r
- Potencia disipada por'unitiád de volumeñ,pe licor:
. ,:
4rto
,
*
=.
1?:1?
-0,172
kw-,
=.
5- Calor entregado al licor por la dispersión del aire:
- Velocidad del aire en la tuberla: se supone que el aire llega al dispersor'a 25 oC y 2O,2 psig por una tuberfa de 4 pulgadas de diámetro:
n, = &-L = ü2,51 L 1+.o,ozil n¡z 4'
mls
- Velocidad del aire en el reactor:
v^
= o'76
i
t+
msls
*t'
=
o,o6 nls
- Densidad del aire en el fondo de reactor:
(N,2 * 10,8\ 101,325 ft,¡f Z§kg
'
'b''I P.M t t4z |--,z R.T (8,g14lu.hnot-r.tr-t.(25 + 273)K p = 2,5 kg-^-"
- Velocidad de fluio de masa del aire:
m. = o.r5 É.25 '--as'¿t9s
k
= 1,075
&
- La pérdida de presión de tas burbujas en el feactor equivale a la profundidad del licor, (Hr = 8,96 m):
ur=
*
= B,e6
P.-
,, = ,,#frO
g"
¡r = ge.i,go
L*, = 14,fi ?rie
441
- Presión en la cima del reactor:
-
po = 2O,2
- 14/8 -- 5p4 psig
- Potencia entregada al licor por la dispersión del aire:
,1+i.ff,.*)^^
lEcu. 7.10I
, = ((ge,sl,'t (o,oet').r,rru .
("#_:-'.
ffi]fÉ)'r'ezs
= 1ú'728'7 w
Donde, v*: velocidad dél gas.en el reactor; g": factor de conversión de la ley de Newton (1 kg.m.s2.N-1); p¡: presión en el punto de salida de aire por ta tobera en el fondo del reactor; po: presión en la cima del reactor ; R: constante de los gases, 8314 J.kmol-1.K-1; Mr: peso molecular del gas (M¡,n¡: 29 kg.kmoi'tl; T: temperatura absoluta delgas, K;'m^: velocidad de flujo de masa de gas, kg.s''.
6- Calor total generado en el reactor El calor total generado en el reactor es la suma de la potencias entregadas al fluido por metabolismo, agitación mecánica y por la dispersión del aire:
q = 421.1ü) + 19;320,6 +'16.728,7 = 547.1ñ
W
7- Coeficiente de transferencia de calor entre el líquido en el reactor y la superficie interior del recipiente encamisado:
- Número de Prandtl: P_ 'f
442
_ (o'216).(2E36) = 1392,2 0,4
- Coeficiente de transferencia de calor, sistema de camisa, Ecuación 17.321:
¡"" -
(0,74).-(o'441
4
.n?.p)F
=
!t3,21
w
m2."c
En este problema no se conoce la viscosidad del licor a la tennperatura de la pared, pr. Sjn embargo, como la diferencia de temperatura entre la pared de la camisa y la temperatura del licor es pequeña, la relación de viscosidades plp" es aproximadamente igual a 1. B- Coeficiente de transferencia de calor entre el llquido en el reactor y la super-
ficie exterior del serpentín, Ecuación [7.36]:
u. =
W^:, ho
r?*(+)o'i(0,%2s4[s
= '1156,2
k
9- Area de transferencia de calor requerida por el sistema de camisa:
q = 547.150 W = ho.A.¡7 = (W,21).á-(25
A = 227,8 m2 >
-
18)
112,6 m2
generado. Además de la camisa se requiere un área adicional de serpentín.. 10- Area de transferencia requerida por el sistema de serpentín: 4:
= 547.150 W = ho.A.AT =
A = 67,6 m2 <
(1
.1#,2)-A.(25
113,9
-
18)
r¿2
Por consiguiente el área exterior de un sistema de serpentln sencillo
es
suficiente para remover el calor génerado.
443
7.4
TRANSFERENC¡A DE MASA
7.4.1 lntroducción
En una fermentación aeróbica por lotes la masa celular y por consiguiente la demanda de oxígeno aumentan exponencialmente. En e§tas condiciones generalmente no es posible mantenel constante la concentración, C., de oxlgeno disuelto, por la necesidad de equilibrar la velocidad de demanda de oxígeno IOURI con la velocidad de transferencia de oxlgeno (OIR) mediante la manipulación de las variables de operación.
Et oxlgeno suministrado usualmente mediante burbujeo de aire al caldo es transferÍdo desde una burbuja hacia el llquido y luego hacia la pared celular y a través de la pared. La mayor resistencia a la transferencia de oxlgeno se presenta en la superficie de separación gas-líquido entre la burbuja y el volumen del líquido. Este fenómeno se manifiesta mediante una diferencia de concentraciones que limita la velocidad de transferencia de oxígeno: OTR
dc" =
dt
=
Kfi.(C.- C)
f7.41
Donde, OTR: velocidad de transferencia de oxlgeno g/(litro'sl; Kra: coeficiente volumétrico de transferencia de masa, s-I ; C-: concentración de oxígeno en la superficie de separación gas-lfquido, g/litro; C,.: concentración de oxígeno en el caldo, g/litro. La velocidad de transferencia de oxígeno (OIF) puede equilibrarse con la veloci-
dad de demanda de oxígeno lOURl, para una diferencia dada de concentraciones, (C- - C.), mediante la modificación de algunas condiciones delproceso tales como la velocidad del impulsor, o el caüdal de gas. Una alimentación de aire rico en oxígeno aumenta el válor de C-.
Uno de los factores mas importantes en el diseño de un fermentador es la provisión de una mezcla adecuada de su contenido. El propósito del mezclador en fermentación es dispersar las burbujas de aire hacia los microorganismos, o células de tejidos animales y vegetales, y favorecer la transferencia de masa y
444
de calor hacia el medio, Armenante y Kirwan,
1989. La mayorla de los
nutr¡entes, excepto eloxfgeno, son altamente solubles en agua, y prácticamente no requieren una acción previa de mezclado para ser consumidos por los microorganismos.
En la práctica normal de la lngenierla Bioqufmica se utiliza aire estéril para satisfacer la demanda de oxígeno durante una fermentación aerobia, pero mientras la demanda de oxlgeno para crecimiento aerobico es alta, la solubilidad del oxígeno en el medio es muy baia. En la Tabla 7 .2 se presentan los valores de la solubilidad del oxfgeno, a 1 atmósfeta, en agua, a diversas temperaturas. El valor de la concentración de oxfgeno en agua, en equilibrio con aire, C*,, a presión atmosférica, se calcula segrfn la ley de Henry:
ci=
P(o)
f7,451
H(O2,7\)
Donde, O(O2): presión parcial de oxfgeno; H(Or,T): constante de la ley de Henry para O, a la temperatura T.
Tabla 7.2 Solubilidad del.oxfgeno en agua a 1 atmósfera.. El valor de la solubilidad es el correspondiente a la máxima concentración de oxígeno en agua, en equilibrio con oxfgeno puro. Solubilidad
Temperatura
oc 0
mmol,Orllitro 2,!8
10 15 20
1,70 1_ ,54 1,38
25
1-,26
30 35
7,76 1,09 1,03
40
mg Orllitro 69 ,8 54 ,5 49 ,3
44,2 40, 3 37 34
,9 ,9
33,
0
.
lnternational Critical Tables, Vol lll, p.271 , McGraw-Hill Book Co', New York, 1928. 445
El valor de la constante de la ley de Henry se obtiene de la Tabla 7.2. por ejemplo, a 30oC, C-,_ : 1,16 mrnol Orllitro y P(Or) : 1 atmósfera, si se tiene en cuenta que el gas es oxígeno puro. Después de sustituir estos valores en la
Ecuación Í7 .451 se obtiene el valor de la constante de Henry para O, a ,la temperatura T : 30 oc:1|fi,16) : 0,862, La concentración de equilibrio det oxígeno en el sistema aire-agua a 30oC es:
0,242 mmol O, litro
c.
= 0,242
O" añ mg Oz litro . mmol 02
mmol
eL--
= 7,75
mg Oz ütro
La demanda de oxígeno de los microorganismos en una fermentación aerobia varía ampliamente, según el tipo de microórganismos; pero es del orden de l g/(litro'hora). Por consiguiente, si no se suministra oxfgeno coRtinuamente, el oxígeno presente en un caldo saturado de oxígeno sería consumido por los microorganismos en un tiempo muy corto (Ejemplo 7.41; una falla de este suministro puede afectar irreversiblemente las células. El metabol¡smo de un cultivo es afectado por la concentración de oxfgeno'disuelto en el caldo. La velocidad específica de la dernanda de oxlgeno sigue generalrnente una cinética del tipo Michaelis-Menten tal como se muestra esquemáticamente en la Figurá
7.7. Los valores dé saturacióh de oxígeno disuelto en agua expuesta a aire saturado con agua a presiones diferentes de 760 mm Hg., son calculados a partir de los
valores anotados en la Tabla 7,3, mediante la ecuación:
c = P-'p C* 760-p
t7.46t
Donde, C*: concentración de oxígeno en agua, en equilibrio con aire, a presión atmosférica (valores anotados en la Tabla 7.3), mg Orllitro; C: concentración de oxígeno en agua, en equilibrio con aire, a una presión P diferente de la atmosférica, mg Orllitro; P: presión absoluta, mm Hg.; p: presión del vapor saturado de agua a la temperatura del agua, mm Hg.
446
Tábla 7.3 Valores de saturación de oxígeno disueho en agua expuesta a aire saturado con agua''. El aire a760 mm Hg contiene 20,9 o/o de oxfgeno.
Temperatura Concentración de cloruros oC en agua, mg/litto ., 0
5000
Presión de vapor mm Hg
10000
Oxígeno disuetto, mg/litro o 2 3
14,6 14,2 13,8 13,5
4
13,"1
5 6
12,8 12,5 12,2 1,9 1,6 1,3
1
7
I I
10 11
1,1
12 13
10,8 10,6 10,4 10,2
14 15
16' 17 18
10,o 9,7 9,5 9,4 9,2 9,0
13,0 12,6 12,3
5
12,7
12,O
12,4
11 ,7 11 ,4 11 ,1
6 6
13,8
13,4 13,1
12,1
1,8 1 1,5 11,2 1 1,0 10,7 10,5 10,3 1
10,1
9,9 9,7 9,5 9,3 9,1
''
10,9 'l 0,6 10,4 10,1
5 5
7 7
8 8
9
I
9,9
10
s,7
11 11
9,5 9,3 9,1
12 13
s,0
14
8,8 8,6 8,5 8,3
15 16 17
8,1
19
8,8 8,7
8,9 8,7 8,6 8,4 8,3
I,O
20
8,5
8,1
7,7
22
25 26 27
8,4
8,0
7,6
24
8,2
7,4
28
7,9 7,8 7,6
7,8 7,7 1,5
19
20 21
22 23 24
29
30
8,1
18
7,9
7,1
25 27 28
7,4
7,O
30
7,3
6,9
32
7,3
*
Hammer, M.J.,'Water and waste-watertechnology". Sl Version. John Wiley & Sons, lnc., New York, 1977.
447
oC, con Asl, por ejemplo, la concentración de oxígeno disuelto en agua a 15 'úna concentración de cloruros de 2000 mg/litro, en un tanque a una presión manom&trica de 8 psig, en un sitio donde la presión barométrica es 11 psi. se calcula. en los siguientes pasos: - La concentráciOn de oxígeno disuelto en agua a 15 oC, con una concentración
de cloruros de 2000 mg/litro, segrfn la Tabla 7.3, es:
C- =
1O.2
-
(10,2
- 9'4'2000 5000
- La concentración de oxígeno disuelto, corregida para una presión manométrica de 8 psig, y una presión barométrica de 11 .psi, según la Ecuación [7.46], es:
(8 + 111 psia .760 nm HS 14,7 psi
c = ro . fe82'3 -
13)
[760-13)
= 992,3 mm Hg
= re.gz
mg Oz
üto
Fjgura 7.7' Representación esquemática del efecto de la concentrac¡ón de oxígeno disuelto sobre la velocidad especlfica de demanda de oxfgeno, plOl, (mmol de O, consumido)/(g de células secas. hora).
Weloc¡do.d espectFtco. de consLrr,¡o cle oxlgeno
Concentro.clon crltlco. Concentro.c¡on
448
de
o><¡geno disLlelto
Tabla
7.4
Solubilidad del oxfgeno en una solución de sal o de ácido a 25oC, (Todt, F,, 19581
Concentración
SolubiIidad, mmol O"/litro H2SO4 NaCl HCl
0,0 0,s 1r0 2,0
7-,25
mo1/Iitro
Tabla
,27
l,2L
)-
,1-6
L
L,L2
7.5
L,26
7-
1,26 1- ,07 0,89
,12
I ,02
0 ,71-
Nivel crftico de oxígeno disuelto para la viabilidad de algunos microorganismos, Riviere, J., 11977l .
Organismos
Temperatura oc
Azotobacter sp. Escherichia coli Saccharomyces sp.
Penici l- I ium chrysogenum
30 37 30 24
Concent,ración crÍtica de O, disuelto en mmol Or/1iEro 0, 018 0, 008 0, 004 0 ,022
El valor de la solubilidad del oxfgeno disminuye con la presencia de ácídos o sales tal como se muestra en las Tablas 7.3 v 7.4. La Tabla 7.5 pregenta algunos ejemplos de los niveles crfticos de oxlgeno para viabilidad de algunos microorganismos.
La velocidad específica aumenta al incrementar el nivel de oxfgeno disuelt(i hasta un cierto punto, denominado concentración crítica, por enóima del cual no hay un aumento apreciable de la velocidad de demanda de oxígeno. En términos de dimensionamiento la situación más frecuente es permitír a las células respirar a su máxima velocidad, aspecto que significa mantener una concentración de oxfgeno disuelto en el medio por encima del valor crftico.
449
7
.4.2 Determinación experimental
del coeficiente de transferencia
.de oxígeno
7.4.2.1 Método
de oxidación de una solución de sulfito de sodio
El método de oxidación de una solución de sulfito de sodio, descrito por Cooper et al., (1944), se fundamenta en la oxidación de una solución 0,S M de sulfito de sodio hasta sulfato de sodio en presencia de un catal¡zador, (Cu * * o Co + * ):
NarSO, + 0,5 02 -----> NarSOo La velocidad de esta reacción es tal que todo el oxígeno que entra en solución
es inmediatamente consumido en la oxidacíón del sulfito, de manera que la velocidad de oxidación del sulfito es equivalente a la velocidad de transferencia de oxígeno, En la práctica, la concentración de oxígeno disuelto, C., es igual a cero, y la Ecuación Í7.441se convierte en: oTR
dC" =
dt
=
Kra.C'
17.471
Con el propósito de medir la velocidad de transferencia de oxígeno se alimenta el reactor con una solución 1 N de sulfito de sodio y iones Cq** en concentra-
ción de O,OOS N4. Se inicia la alimentación de aire i se pulsa el cronómetro cuando las primeras burbujas de aire emergen del dispersor. Después de un perfodo de oxidación, entre 4 y 20 minutos, se realizan las siguientes acciones simultáneamente: se suspende la agitación y la alimentación de aire, se toma una muestra y se anota el tiempo marcado por el cronómetro. Cada muestra se mezcla con un exceso de reactivo estándar de yoQuro, recién preparado. La titulación se realiza con solución de tiosulfato (NarSrO.) hasta el punto final con un indicador de almidón. El método de oxidación del sulfito d'á sodio es sensible a la contaminación por agentes de superficie activa tales como aminoácidos, proteínas, ácidos grasos, ésteres y lípidos. Además, la reología de una solución de sulfito de sodio es
450
completamente diferente a la de un caldo de fermentación. El costo del süifito de sodio y el tiempo requerido para cada determinación, usualmente de varias horas de acuerdo con las velocidades de aeración y de agitación, dificultan su aplicación a escala industrial. Sin embargo, el método es útil para confrontar
resultados obtenidos con diferentes fermentadores y estudiar los efectos del cambio de escala y de las condiciones de operación sobre la transferencia de masa.
7.4.2.2 Método
de! balance de oxígenó
El método del balance de oxígeno se fundamenta en la determinación directa de la cantidad de oxígeno transferida a la solución en un determinado intervalo de
tiempo. El procedimiento incluye la medición de tos siguientes
parámetios: volumen del caldo en el fermentador, Vr, litros; caudal de aire afluente, O¡, litros/s; caudal de gases efluentes, Or; presión absoluta de los gases efluentes, PE; temperatura del afluente, To, K; temperatura de los gases efluentes, T.; fracción molar del oxfgeno en el aire afluente, Yo, mol Orlmol aire; fracción molar del oxígeno en los gases efluentes, Yr. La demanda de oxígeno se calcula a part¡r de las siguientes ecuaciones:
n=-P.V R.T
t7.481
Donde, n: gramos molde Or; R: constante de los gases, R : 0,08206 (atmósfera.litro)i(gmol.K); P: presión absoluta, atmósferas; V: volumen, litros; T: temperatura absoluta, K.
n I Ie^.P^.Y^- eE.PE.YE]
1=l'la Donde,
Or = V¡/U
Oe
=
orR. =
Ve/t;
dc"
dt
n/t
=
r,
17.49t
)
(gmol Or)/s.
t lQ^'p^'v^ RL TA -
QE'PE'YEI.
1
TE )V,
17.50]
451
Dondg, OTR: velscidad de transferencia de oxlgeno: (gmol de Or)/(litro de caldo.s); C.: concentración de oxígeno en el caldo, gmol/litro; Vr: volumen del caldo en el fermentador, litros. Estas determinaciones requieren la utiiización de medidores precisos de flujo, temperatura y presión y un analizador de oxígeno gaseoso, El analizador paramagnético de oxígeno es lo suficientemente exacto como para detectar cambios de la concentración de oxígeno entre 1 y 2 o/o. Una vez establec¡da la demanda de oxígeno, OTR, se calcula el coeficiente Kra a part¡r de la Ecuación 17 .441, donde C. es la concentrac¡ón de o¡ígeno en el caldo y C- la concentra-
ción de oxlgeno en equilibrio con la corr¡ente de gas. La concentración de oxígeno en el caldo se mide usualmente mediante un sensor en línea. La variación de (C- - C,_) es pequeña si el volumen del fermentador es menor que 50 litros. En el caso de fermentadores de mayor volumen se recomienda la utilización de la diferencia media de logarftmica de las concentraciones C- y C. entre la entrada y la salida de gas:
C'-C,
(c'-c"l^-(c. -cr), t7.51I
7.4.2.3 Método estát¡co
Los métodos de evaluación delcoeficiente de transferencia de oxlgeno mediante técnicas de desgasificación requieren una reducción previa de la concentración de oxígeno disuelto hasta un valor ligeramente superior al crítico con el propósito de medir el incremento de la concentración de oxígeno disuelto en el caldo durante un período adecuado de aeración y agitación. En el método estático descrito por Wise, (1951), se reduce la concentración de oxígeno mediante la gasificación del líquido con nitrógeno gaseoso, de manera que la solución es despojada de oxlgeno. Entonces el líquido desoxigenado es aerado y agitado con el objeto de medir el incremento de la concentración de oxígeno disuelto durante un tiempo t.
452
La velocidad de transferencia de oxfgeno es igual a la pendiente de la tangente a la curva de valores de concentración de oxfgeno disuelto'én función deltiempo de aeración tal como se muestra en !a Figura 7.8, de acuerdo con la Ecuación
t7.441:
AÍR
=
dC, dt
=
Rú.(c'- c)
ÍEcu- 7-Utl
La integración de la Ecuación 17.441conduce a la siguiente expresión:
ln(c' - cr\ = - kra.t
f7.52t
Por consiguiente, la representación gráfica de ln (C' - C.) versus tiempo corresponde a una lfnea recta cuya pendiente es (- K.a) como se muestra en la Figura 7.9. Figura 7.8 Representación esquemática de la concentración de oxfgeno disuelto en una solución durante el perfodo de aeración. La velocidad de transferencia de oxfgeno, dCL/dt, lmmol de O, consumido)/(litro.hora), en elt¡empo t = t es igual
a la pendiente de la tangente a la curva en ese momento.
C d d
ton
t=t Tiempo ----+
453
Figura 7.9 Representación esquemática de de la determinación de K,_a por el método estát¡co de desgasificación. La pendiente de, la curva es igual a (- Kra)
ln (cx
1
c) pendien t e, Kl.o
f
iernpo ---------+
La determinación de Kra por el método estático también se reali4,a en el caldo
de fermentación, agregandole células muertas o micelio para simular la concentración del medio real. El detector del cambio de la concentración de oxlgeno disuelto normalmente es del tipo recubierto por membrana, a causa de la naturaleza compleja de los caldos de fermentación. Además el punto donde se realiza la determinación debe ser representativo de todo el volumen del caldo. El tiempo de respuesta del detector, definido como el t¡empo necesario para registrar un 63 7o de un cambio repent¡no, debe ser mucho menor que el tiempo
de respuesta a la transferencia de masa del sistema
(1
/K.a). Taguchi y
Humphrey, (1966), analizaron la utilización de factores de corrección deltiempo de respuesta. Según Van't Riet, (1979), elempleo de electrodos comerciales con tiempos de respuesta entre 2 y 3 segundos permite la determinación precisa de valores de K.a hasta 360 (horas)-r, mayores valores de Kra requieren un factor de corrección de la respuesta. La principal desventaja de este método es su dependencia de las mediciones realizadas en un sólo punto del fermentador el cual puede no ser representativo de todo el volumen del medio.
454
7.4.2.4 Método
dinámico
En el método dinámico descrito por Bandyopadhyay, Humphrey y Taguchi, (1967), se utiliza la actividad respiratoria de un cultivo en crecimiento para disminuir el contenido de oxígeno del caldo antes de reiniciar la aeración. La Figura 7.1O ilustra esquemát¡camente este procedimiento. La concentración de oxígeno en el fermentador antes del punto A es estable. El suministro de aire se suspende repentinamente en el punto A, entonces el valor de K.a es igual a cero y la pendiente de la línea AB es una medida de la velocidad de respiración del cultivo:
dc.
=
-
lt(Oz)x
t7.531
" La aeración se reinicia en el punto B (Figura 7.1O!. y la concentración de oxígeno disuelto aumenta hasta alcanzar el valor inicial, El incremento observado de la
concentración de oxígeno disuelto en el perfodo BC es la diferenc¡a entre Ia transferencia de oxígeno hacia la solución y la demanda de oxfgeno por la respíración del cultivo: t7.541
:-.
Donde, UlO2l: velocidad específica de respirac¡ón, (g O2ll{.g células.hora); x: concentración de células: gramos de células secas/litro; C,: concentración de oxígeno disuelto en el fermentador. Esta ecuación también se puede expresar como:
c,=ci-+(+
-n«o,).r)
t7.551
La representación gráfica de la Ecuación [7.55], (Figura 7.'11l., con C,- en las ordenadas v (dC./dt + p(Oz).x)en las abcisas, es una línea recta cuya pendiente es (- 1/K.a). La recta se construye con los valores de las tangentes a la curva BC, Figura 7.10, corrrespondientes a diferentes valores de Cr.
455
Figura 7.10 Representación esquemát¡ca de la determinación de K¡a por el método de desgasificación dinámica. La aeración se suspende en el punto A y se reinicia en elpunto B; r(Or) : plOrl.x: velocidad de respiraci6¡, (g Or)/(litro. hora).
c
ian
,d
d
pendienter
Tienpo
..-
fJgúra 7.11 Representación esquemát¡ca de ta determinación det coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, K.a, por el inétodo dinámico de desqasificación; r(Oz) = plQrl.x: velocidad de r.espifación, (g Or)/(litro.hora).
pendiEnte
dC/ 456
dt, + rtr?
7.4.3 Coeficiente de transferencia de masa
El método dinámico permite la determinación de Kra en diferentes etapas del proceso. La principal limitación de este método radica en la necesidad de mantener la concentración de oxlgeno disuelto por encima del valor crltico. Además, el método se basa en mediciones realizadas en un punto del fermentador, las cuales sólo son representativas si el contenido del reactor está adecuadamente mezclado. El coeficiente de transferencia de masa es afectado por la configuración del fermentador y por las propiedades ffsicas del sistema gas-lfquido. Usualmente las ecuaciones de transferencia de masa son expresadas mediante grupos adimensionales obtenidos por el método de Buckingham Pi a partir de una lista de las variables que influyen sobre el proceso. Los coeficientes y exponentes de las ecuaciones obtenidas son deducidos mediante el ajuste de datos experimentales. La evidencia experimental indica que estas ecuaciones son útiles para predecir el valor del coeficiente de transferencia de masa, Kr, y del coeficiente volumétrico de transferencia de masa, K,_a, inclusive si los aspectos fundamentales de la mecánica de fluidos no aparecen expllcitamente, La relación entre la potencia entregada alfluido y el volumen del caldo, Pfy', probablemente incluye todos los efectos del número de Reynolds y de la viscosidad si se tiene en cuenta que el consumo de potencia depende de cada fluido. La evaluación del coeficiente de transferencia de masa mediante ecuaciones emplricas depende de las condiciones de operación y de la configuración del tanque elegido. Desafortunadamente muchas de las ecuaciones empíricas disponibles no informan sobre la constante de proporcionalidad o sobre las condiciones de
operación empleadas en los ensayos realizados para su deducción, aspecto que limita su empleo. Calderbank y Moo-Young, 1961, presentan las siguientes ecuaciones, confirmadas por Calderbank y Jones, 1961, para evaluar el coeficiente de transferencia de masa en dippersiones gas-líquido con partículas sólidas de baia densidad en r€actores agitados. Las partículas simulan la transferencia de masa entre
burbujas de diámetro menor que 2,5 mm
y los microorganismos en los
fermentadores:
457
t7.56I
shs = 2 + 0,31 .(Sch)1B.(era¡1o
Dorrde: Sherwood
=
Graslnf
*you,
Schniá
DAB
Dil.p".s-t =
=
[tc
P"'Dt¡
p
2
l¡c
Para burbujas de diámetro mayor que
2,5 mm:
Slrc = 0,42.(Sch)lP.
(era¡tts
17.571
Donde, K.-: coeficiente de transferencia de masa, m/s; Dsz: diámetro medio de Sauter, m; Dor: difusividad del componente A en el componente B, rn2ls;-¡t.: viscosidad de la fase continua, kg/(m.s); p": densidad de la fase continua, kg/m3; g: aceleración de la gravedad, 9,8 m/s2; Ap: diferencia de densidades entre líquido y gas.
Van't Riet (19791, presenta la siguiente ecuación para evaluar la transferencia de oxígeno en agua en reactores agitados mecán¡camente cuyo volumen varía
entre2y2600
litros:
K,a
=
0,026(l)"'.,:,'
t7.58I
Donde, K.a: coeficiente de transferencia de masa por unidad'de volumen,'s-l, calculado con una aproximación entre 20 y 4Oo/o; P: potencia éntregada al fluido, W; V: volumen del caldo delfermentador, m3; v": velocidád superficial del aire, m/s; v" : O/A; O: caudalde gas, m3/s; A: área transversal: A : lnl4l.D2¡; Dr: diámetro del fermentador, m.
Van't iliet, (1979) recomiendala siguiente ecuacióri para evaluar K,-a, con una aproximabión entre 20 y 40 o/o, én el caso de transferencia de'oxígeno en soluóiones de electrólitos fuertes, no coalescentes, en fermentadores agitados mecánicamente cuyo volumen varía entre 2 y 4400 litros:
458
K,a = o¡o02.(l)"
.r:,
t7.591
Las ecuaciones [7.58] y t7.591 son aplicables en reactores provistos con diversos tipos de agitadores, diferentes valores de la relación entre el diámetro del
impulsor
y gl diámetro del tanque, D./Dr, y una
relación entre la potencia 500 < P_/V <
disipada por impulsor y el volumen del caldo en el intervalo, 10.0OO W/m3.
Humphrey fi977l, recomienda laS siguientes ecuaciones para evaluar K.a, en tanques agitados mecánicamente según el volumen del fermentador;
*," = * (+)''*',*'
.""=.-(+)
t7.601
: ptanra pitoto
t7.61I
.v!'5 : ptantas fu prodtpción
Donde, K: constante dependiente de la configuración del s¡stema
y de las
unidades empleadas. La Ecuación t7.601 se conoce como ecuación de Cooper et al., (1944), quienes evaluaron el coeficiente de transferencia de masa por el método de oxidacíón del
sulfito en reactores hasta de 67 l¡tros de capacidad, aerados y agitados por un impulsor. Bartholomeu, (1960), después de evaluar el coeficiente de transferencia de masa en reactores aerados y agitados provistos de dos o más impulsores, recomienda los siguientes exponentes para el término PnlV de la ecuación de Cooper: reactores a escala de laboratorio: 0,95; reactores a escala de planta piloto: 0,67; reactores a escala de planta de producción: 0,5. Akita y Yoshida, (1 973), presentan la siguiente ecuación para calcular el coeficiente de transferencia de oxígeno en diferentes soluciones acuosas en columnas de burbujeo:
K,a = (0,6) . Dfil . v t"".
(*
.
oo'tt
.,
o'ett.
ú
1'r
17.621
)''62
459
Donde, Dor: difusividad del componente A en el componente B, m'ls; vr: viscosidad cinemática del caldo, m'lsi o: tensión superficial, m2lst pci densidad del caldo, kg/m3; Dr: diámetro deltanque, m; g: aceleración de la gravedad, 9,8 mls2; tlt: fracción volumétrica del gas en la fase dispersa, adimensional; Kra: coeficiente volumétrico de transferencia de masa, s-t. Botton et al., (1980), presentan la siguiente ecuación aplicable a columnas de burbujeo, donde la velocidad superficial del gas varía en el intervalo: 0 < v" < 0,15 m/s, y la relación entre la potencia disipada porel gas dispersado, Pn, Y el volumen del qaldo. V, varía entre: 100 < PslV < 1 I00 Wm3:
H=(#i" , 7.4.4
(+)
='*(#)"
t7.63I
Evaluación del óoeficiente de transferencia de masa
El coeficiente volumétrico de transferencia de masa es la combinación de dos parámetros experimentales, coeficiente de transferencia de masa y el área de la superficie de separación gas-llquido lárea interfaciall:
K,A
Kt=L
17.641
a
Donde, K,-: coeficiente de,transferencia de oxígeno, cm/s; K.a: coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno en s-'; a: área de la superficie de separación gas-llquido por unidad de volumen de dispersión cm'/cm3:
a=¿ 6.ú De
t7.651
Donde, rp: fracción volumétrica del gas en la fase dispersa lholdupl; Drr: diámetro medio de Sauter:
460
rl,
i
=
Dg¿=
» n.dl » n.dl
t7.661
Donde, d,: diámetro de las burbujas; Ho: altura ocupada por el líquido aerado:
Ho:
attura del líquido sin aeraf; n: número de burbujas' La Figura 7.12 es una representación esquemát¡ca de! sistema de medición del
diámetro medio de las burbujas empleado por Ho et al.,(1987). Las burbujas son retiradas de la dispersión a través de un tubo capilar de vidrio calibrado de acuerdo con el método descrito por Topiwala y Hamer, {'1974!.' El volumen de cada burbuja se mide directamente en eltubo capilar. Las burbujas de diámetro inferior al del tubo son consideradas esféricas, en tanto que aquellas burbuias de diámetro mayor son tratadas como cilindros con extremos hemisféricos. La fracción volumétrica del gas en la fase dispersa se obt¡ene a part¡r del cambio de nivel del llquido en el reactor ocasionado por la aeración del líquido agitado.
Figura
7.12 Representación esquemát¡ca del sistema de medición del diámetro de las burbujas.
S¡stemq de ned¡c¡on
del votu¡T en de los burbu¡os Re
Bo¡lbo
de Ftu3o
/' Lineo de succ¡on
Detector
rogeno
det nivel de tlquido
de hurbu¡os
Pontqtlq
deftectorq
CSTR
461
7.4.5
Fracción volumétrica del gas en la fase dispersa
La fracción volumétrica del gas en la fase dispersa, conocida también como retención de ga§, lholdupl, depende principatmente de la velocidad superficial del gas y del consumo de potencia. En algunos casos et gas provee pbr sí mismo suficiente agitación del líquido, pero con mayor frecuencia se utiliza un impulsor, preferencialmente tipo turb¡na, para dispersar el gas y hacer ciictrlar ladispersión líquido-gas a través del'reactor. La reterición de gas es uno de los parámetros más sehs¡bles a las propiedades físicas del líquido.
7.4.5.1
Dispersión de aire en s¡stemas sin agitación mecánica
Normalmente el aire se alimenta al reactor a través de un orificio en una tubería sumergida, de un dispersor tipo regadera, o a través de una placa porosa o de
material cerámico. Akita y Yoshida (1973), investigaron la distribución de tamaño de las burbujas en columnas de burbujeo, mediaete técnicas fotográficas, y recomiendan la siguiente ecuación:
. r-r o,"[4,=)'^[f)'^'[É) =
t7.671
Donde, r¿: retención de gas; D": diámetro de la columna de burbujeo; g: 9,8 mls2; p": densidad de la fase continua, kg/m3; o: tensión superficial, kglm2; v.: viscosidad cinemática de la fase continua, m2ls; v": veiocidad superficial,.m/s; vs : O/A; O: caudal de gas, m3/s; A: área transversal.de la columna, m2. Ak¡ta y Kawasaki (1983), analizaron la retención de gas en reactores de circulación líquida impulsada por aire "airlift" y Sridhar y Potter, (1980), relacionaron la retención de gas, qt, con la velocidad de ascenso de las burbujas, vo, y la velocidad superficial, vr: v§
u= vs+vl
462
t7.681
7.4.5.2
Dispersión de aire en sistemas con agitación mecánica
Calderbank, (19671, presenta las siguientes ecuac¡ones, válidas para una retención de gas, W < Q,15. El tamaño medio de las burbujas de aire en una disolución db electrólitos, generalmente es menor que en agua pura con el consiguiente aumento del área de la superficie de separación gas-lfquido (área interfaciall y la retención de gas, ry:
* = l"'Ú )oo + 2,16.,0 . (+)".01,1,__..(ü \ur
0,5
t7.69t
)
Donde, v.: velocidad superficial, m/s; v. : FolA; Fo: caudal de gas, m3/s; A: área transversat de la'columna, m2; u.: velocidad de flotación de las burbujas, mlsi o: tensión superficial, kg/s?; PrAy': potencia entregada por impulsor y por unidad de volumen en la dispersión gas-lfquido, Wm3; p": densidad del líquido, kg/m3. El diámetro medio de Sauter, Drr, de las burbujas de aire en la ecuación anterior
según Caldórbank, (1967), es:
De. =
O,U,''(?)
.p;02. ú0,5 * g.1O-1
17.70t
Donde todos los términos tienen el mismo significado y las mismas unidades que en la Ecuación t7.691.
El área de la superficie de separación gas-llquido por unidad de volumen de dispersión lárea interfaciall, e¡ la Ecuación [7.69], es:
'
(t
=',*'(+)o'o
'02'"'"
"'(;n¡*
17.711
Donde todos los términos tienen el mismo significado y las mismas unidades que en la Ecuación t7,691,
463
Sise aumenta progresivamente la alimentación de aire a un reactor agitado por un impulsor se observa que a bajas velocidades del impulsor el gas pasa por el impulsor prácticamente sin dispersarse. Por consiguiente la potencia entregada la fluido gasificado, Po, es igual a la entregada alfluido sin gasear, P. A medida que se aumenta la velocidad del impulsor el gas es capturado por los vórtices formados detrás de las paletas del impulsor y luego es dispersado. En este momento la potencia entregada al fluido, Po, comienza a disminuir. Si la velocidad del impulsor se incrementa, hasta un valor crítico, n"^, cambia la configuración de las cavidades, formándose las denominadas cavidades vórtice, la relación PolP,álcanza un valor mínimo, Nienow et al., 1978: Dcn =
¡.ú'u.o9,"
17.721
D1
Donde, n".: velocidad de agitación a la cual se alcanza la dispersión completa del gas, s-1; Dr: diámetro del tanque; Do: diámetro del impulsor: B = 4: dispersores de tubo; B = 3: dispersores de anillo. Finalmente, si la velocidad del impulsor es mayor eu€ ns¡, el valor de la relación Po/P aumenta. Por otra parte, baio ciertas condiciones de agitación, si se incrementa el flujo de aire se alcanza eventualmente un punto donde el agitador queda rodeado de aire, fenómeno conocido como inundación, en este momento el impulsor no puede dispersar el gas. Si se reduce entonces parcialmente el flujo de gas, el impulsor comienza nuevamente a recircular el lfquido y a dispersar el gas; este punto se conoce como punto de redispersión, Zlokarnik y Judat, 1967:
*-=+=o'194'Fl'75 i Válida para números de
Fa=
n2.D^
Froude: 0,5 <
FR
f7.731
<
2,0
Donde, N^: número de redispersión; F^: caudal de gas, m3/s; n:velocidad del impulsor, s-1; Do: diámetro del impulsor, m; g: aceleración de la gravedad, 9,8 m/s2. Zlokarnik y Judat, 1967, encontraron también la siguiente relación válida para números de Froude entre 0,5 y 1:
Po'!" ,s.D1.p, 464
= 1,36.F,0'ffi
17.741
Donde, Po: potencia entregada alfluido gaseado en el punto de redispersión, W;
del lfquido en el punto de redispersión, kg.m't; g": factor de conversión de unidades, 1 kg.m.s-2.N-1.
p,_: densidad
Ejemplo
7.3
Transferenc¡a de masa en un reactor aeróbico
Un tanque cilíndrico de 0,99 m de diámetro, provisto de cuatro placas J : 0,1.Dr, se agita cori qn : (D¡ planas impulsor de turbina de seis hojas Dr/3) que gira a 3 rps. El tanque se llena con agua a 25 oC hasta un nivel de operaciórl H : Dr. El tanque se alimenta con aire estér¡l a 25 oC y 5,2 psig a razón de O,4 vvm (volumen de aire por volumen de licor cada minuto) por un orificio situado deflectoras, uniformemente espaciadas, de anchura
debaio del impulsor. La presión local es 10,8 psi.
Calcular: 1- La retención de gas, g; 2- El diámetro medio de Sauter, D.r; 3- El áreade la superficie de separación gas-llquido; 4-El coeficiente de transferencia, K,-; 5- El coeficiente de volumétrico de transferencía de masa, Kra. Propiedades ffsicas del agua a 25 oC: Tensión superficial en la superficie de separación aire-agua, o : O,O7197 kgls2; Viscosidad I = 8,9O4.10-a kg/(m.s); Densidad: I = 997,O8 kg/m3; Difusividad del oxfgeno en agua, Dor: 2,5.10-e m2ls, (Kaye y Laby, 1973; Per¡y y Chilton, 19731. Datos del Ejemplo [7.1]: Volumen de licor, V = O,762 m3; Caudal de gas, Fo : 5,08.10-3 m3/s; Potencia disipada en llquido gaseado, Pc = 450,4 W. Número de Froude, Fa = O,3O3. 1- Velocidad superficial del gas, v":
v, = 5'08'10-s
= G,6.io-o
].to,ssf
4 s
465
2- Retención de gas, ry, (Ecuación
7.69);
¿
*)o'' * z.rs..,o . f(#)''',rrr,o.,n'1[e,o.ro-.1n, ,' = (e,e.ro.. \ 0,265 ) 0,265
|
Il
lO,OzrSz¡0,6
)
a'
ü uz Donde, u1
= 0,1578.ü0,5
* 8,47.10-3 i u2 = ü
- ojs78 .u - B,Ml.'lo.-s'. u = o,Z
;
U = o,o4
:
0,265 m/s: velocid"á d" flot."ión de burbujas de diámetro entre 2 y 5 mm, McCabe y Smith (1976). 3- Diámetro medio de Sauter, D32, (Ecuación 7.7Ol: Dgz=
4,1s
.|, .-J9,.oJr"')n'
l.(o,o¿)0,, * e.to-a = 4,zs.1o-s
t(#)o'n{so''oe)"1 4- A¡ea de la superficie de separaeión gas-líquido, a, (Ecüación 7.65):
o = t=.v = D§
49'.r} 4,25.10'
= 56,48 m-1
Número de Schmidt, Sch, (Ecuación 7.56); §cá
='
;8,904.10-1
(997,08).(2,5.10-e)
=357.2
Densidad del aire:
=l,N+
466
m
Número de Grashof; Gra, (Ecuación 7.56):
t1 -"r"
(n,zs.to-3)3.(997,0E).(9,8).(997,08
-
1,29)
= 941.48s,7
5- Coeficiente de transferencia, K., (Ecuación 7.571:
x.L.(4'25.10-3) 2,5.10-e
= 0,42. (§7,2)
0'5.
(941 .485,7)
1r3
Kt = 4'58'10-4 Y § - Coeficiente volumétrico de transferenciá,
Ku
K,-a, (Ecuación
7.64l:
= 4,58.10-4.56,¿18 = 0,0258 s-1
- Coeficiente volumétrico de transferencia, K.a, (Ecuación 7.581:
.../
7.4.6 Evaluación de los gases produc¡dos durante la fermentación en reactores a escala de laboratorio
El propósito de esta Sección es describir la aplicación del método de la burbuja para la medición de los pequeños caudales de gas producidos durante una fermentación a escala de laboratorio.
467
Ejemplo 7.4 Toma de muestras líquidas y gaseosas y evaluación del caudal de gases produc¡dos durante la, fefmentación acetobutílica
En la Tabla 7.6 se presenta un resumen de las condiciones de la fermentación y de los resultados obtenidos en cuatro ensayos de fermentación aceto-butílica por lotes, en un reactor de mezcla completa de l2litros de volumen de opera-
ción, diseñado para cultivo contínuo y por lotes, y equipado con sistemas de controt de pH, temperatura y velocidad de agitación, Duarte, A., Alarcón, J.F, Piñeros, E.R. (19931. Los ensayos fueron realizados en la fase de producciÓn de ácidos (fase acidogénica) y no en la fase de producción de solventes (fase solventogénica), correspondiente a la fase estacionaria del crecimiento, con el propósito de evaluar los gases producidos durante la fermentación. El lnst¡tuto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia, inició en
1987 un programa de desarrollo de la fermentación acetobutílica a partir de melazas de caña. De acuerdo con el estudio de prefactibilidad económica para la producción de butanol y acetona por fermentación, realizado por Serrano y Pinzón, (1987), los gases constituyen un 83 % de los ingresos totales recibidos por ventas, rnientras tos solventes, etanol, butanol y acetona, sólo un 16 o/o.
Tabla
7.6
Condiciones de la fermentación, Alarcón, J.F, Piñeros, E.R.,'(1989)'
Vo.fumen deI medi-o de fermentación
1-2
Volumen preinócuIo: volumen de medio Temperatura Velocidad de agitación *, ** Flujo de N, (para anaerobiosis) Tiempo de burbujeo de N, Volumen de cada muegtsra Iíquida
1:9
*:
0C. 37 2OO rpm. 2,1 litros/minuto minutos l-5 40 m1 . I
Doremus, M., Linden, J., y Moreira,A. (1985) "": Yerushalmi, L., Volesky, B. (19851
468
litros
¿r'
1. Descripción de la fermentación acetobutfica:
- 1.1 Preparación del
medio:
Las fermentaciones se realizan con medio fermentativo (Tabla 7,71, preparado mediante el siguiente procedimiento: La melaza se disuelve en agua destilada y luego se centrafuga a 2000 rpm. durante 20 minutos para removerle los sólidos suspendidos. Simultáneamente se disuelve K2HPO4 en agua destilada. Entonces
se adicionan al sobrenadante, extracto de levadura, ácido p-aminobenzoico y minerales. Los recipientes con el medio son sellados con papel de aluminio y esterilizados en el autoclave a 103,388 kPa (15 psig) durante 20 minutos. Finalmente se mezclan los fosfatos con la miel y los nutrientes en condiciones estér¡les a paft¡r de un preinóculo preparado con medio similar.
- Activación de la cepa:
La activación de la cepa se realiza mediante el siguiente procedimiento: Se esterilizan en el autoclave diez tubos de ensayo, preferiblemente roscados, con sus tapas a medio ajustar. Posteriormente, en un área estéril se adiciona a los tubos medio vegetat¡vo hasta la mitad de su volumen. La composicfon de este medio es similar a la delmedio fermentativo (Tabla 7.7!., pero con 80 g de miel de caña, en lugar de 130 g. Entonces, se agrega a cada tubo medio de cultivo perfectamente agitado con esporas de Clostridium acetobutylicum DSM 1732 silvestre, en una proporción de una parte de esporas y nueve de medio puro. Con el propósito de garantizar condiciones anaeróbicas, antes de tapar los tubos se vierte parafina fundida en cada uno. Al solidificar, la parafina forma un tapón sobre la superficie, que ímpide el paso del oxlgeno (airel. Finalmente los tubos son sellados. Los tubos perfectamente cerrados, después de ser introducidos durante 2,5 minutos en un recipiente con agua en ebullición y luego en otro recipiente con agua frfa, son llevados a una incubadora a 37 oC. Veinticuatro horas más tarde aproximadamente, y como consecuencia de la producción de gases, la parafina se levanta de la superficie del medio, indicando la activación de la cepa. En este caso puede apreciarse un cambio de color del medio, desde café hacia amarillo. Por el contrario, si después de 30 horas no se observa producción de gases, la cepa se somete a un nuevo choque térmlco.
469
Tabla7.7 Composición del medio empleado en la fermentación, Silva¡
E.,
(1989).
litiel de
130
caña
K2HPO4
(ácido p-aminobenzoico) Extracto dd levadura' Fuente de minerales Agua, en cantidad suficiente para. -. FueEte de ninerales: PABA
NaMo4 -2H2O
CuSOn.5HrO CoCl-, .6H2O MgSOr.HrO
CaCI, .2H2O HrSO, concentrado FeC13.5HzO
Agiua, cantidad suficie4t,e Para.
.
s
1,8 g 3mg 5g 4mI 90q m1
2,4 a,7 0,24 1g 1,5 28 .,. 2'7 l-000
s g g S
mI
g mI
Una vez act¡vada la cepa, Se mant¡ene en estas cond¡c¡Ones m'ediante repiques cada 24 horas. Los repiques cons¡sten en un cambio de medio con esporas a los tubos, en la proporción de 1 parté de esporas y 9 de med¡o puro. Antes de camb¡ar el medio, los tubos son ag¡tados hasta lograr la homogeneidad de su contenido. Entonces, después de retirarles una buena cant¡dad de medio fresco
y ad¡cionarles parafina fundida, son tapados y transportados a la incubadora. LoS repiques Se hacen cada 24 horas, tiempo requerido para alcahzár la fase exponencia! de crecimiento det microorganismo, caracter¡zada pÓr uná gran producción de gases.
- 1.2 Prcparac¡ón del preinóculo:
El
volumen disponible del fermentador es 12 litros, distiibuidos en 10,8 Iitros de
med¡o puro y 1,2 litros de medio con células activas (preinóculo). Estás cant¡dades corresponden a una relación vo¡úmenes de 9:1'
470
lnicialmente se preparan en un matraz 120 ml de medio vegetat¡vo; la composicíon de este medio es siniilar a la del medio fermentativo (Tabla 7.7), pero con 80 g de miel de caña en lugar de 130 g. Posteriormente el matraz con medio vegetat¡vo es inoculado con la cepa activa contenida en uno de los tubos. Entonces, en un matraz de 2litros se preparan 1 ,1 litros de medio fermentativo (Tabla 7 .71 y se procede a inocularlo con 1 20 ml del matfaz con células en su fase exponencial de crecimiento. Dumar y Granados, (1987), establecieron un tiempo de 20 horas para lograr la densidad adecuada para inocular el medio de fermentación. El medio se calienta en el fermentador hasta la temperatura óptima de crecimiento celular (37oC), antes ¡nocularlo'
Las condiciones anaeróbicas son alcanzadas mediante la alimentación de nitrógeno gaseoso a través de un filtro empacado con lana de vidrio; un filtro simitar se utiliza para evacuar los gases producidos por la fermentaciÓn, La agitación es producida por un impulsor de paletas planas y cuatro pantallas deflectoras. El control de la temperatura se realiza mediante la adición de agua fria o caliente, según el caso. El agua entra por una de las pantallas (huecas) y sale por la pantalla opuesta, Los gases producidos en la fermentación pasan por
un condensador ubicado en la tapa del fermentador.
- 2. Toma de muestras.
- 2.1 Muestras líquidas,
Para la toma de la muestra llquida se usa un tubo de vidrio (Figura 7.1 3) de 1 50 ml de capacidad, provisto de tres entradas. Después de conectar la línea B del
tubo con el fermentador, se hace vacío con una jeringa de 50 ml a través de la línea de gas. La tapa del tubo es un filtro empacado con lana de vidrio. Una vez tomada la muestra, se sella con una pinza la lfnea B conectada con el
fermentador. El tubo descrito también se ut¡liza para inocular el fermentador a través de lá línea A. Las muestras líquidas fueron analizadas por Alarcón y Piñeros (1989) para determinarles concentración de células, concentración de glucosa, pH y solventes, Mclaughlin, 1., Meyer, C', y Papoutsakis, E' (1985)'
471
Figura
7.13
Botella para la toma de muestras líquidas, Alarcón, J,F, Piñeros, E.R., (1989). Jnocutoc on
Tomq de
r¡uestros
-
B
de gos
Line o
de
liquido
-
2.2 Muestras
gaseosas.
Las muestras gaseosas se usan para analizar la composición de los gases producidos durante la fermentación. Antes de tomar la muestra se determ¡na el caudal de gas. Para tomar la muestra se cierra la salida de gas hacia los medidores de caudal mediante la válvula de dos vías (Figura 7.14l-. Entonces, mediante la válvula de dos canales, se conecta la botella tomamuestra con la atmósfera y se abren las dos válvulas de la botella. Después de llenar la botella a través del embudo con agua acidulada (2O o/o ptv de NaCl V O,5 % p/v de ácido cítrico) con el propósito de minimizar la cantidad
de gas carbónico disuelto en el líquido, según el procedimie¡to sugerido por Castillo, Contreras y Magariño (1980). Se .eambia la posición de la válvula de dos
la lfnea de gas. Entonces, se desplaza
y
s,e
conecta la botella con
el ".nal"" embudo hacia abajo para llenar la
botella med¡ante desplazamiento de líquido (esta operación se realiza a la misma velocidad de producción de gases en el fermentadorl.
472
\
Figura
7.14
Sistema de medición de flujo ytoma de muestras gaseosas Alarcón, J.F, Piñeros, E.R., (1989)'
Vqtvut
Medidon
de
dos vlqs
VolvuIo de dos conqtes
d¡sco
Bureto Botet(o
tomo -
nluestnos
Topon
inyectobte (
Enbudo
de vidrlo
Penlt(q
etostico
So(ucion
de jobon Monguero f tex¡bte
Tan pronto como el gas desaloia el líquido de la botella, deben equilibrarse los niveles del improvisado manómetro formado por la manguera flexible que conecta la botella con el embudo mediante una adecuada manipulación del embudo, Cuando se logra e! equilibrio se c¡erran la válvulas de la botella, se cambia la posición de la válvula de dos niveles, se desaloja el líquido presente en el embudo y se reemplaza la botella tomamuestra. El análisis de las muestras se realiza mediante cromatogratla de gases, Stambuk, J., (1970),
473
-
5-
3.
Determinación del caudal de gas
De acuerdo con Beloshitskii, Lanina y simulik, {1983), el método de la burbuja es uno de los más precisos para la determinación de pequeños caudales de gas
entre 2 y 2OO ml/minuto. Es un sistema sencillo (Figura 7"14), si se considera que sólo requiere una bureta calibrada, un cronómetro, solución jabonosa y una conexión en T para alimentar el gas a medir. Como el volumen y la concentración de los gases dependen de la temperatura y la presión, estas dos cantidades se mantienen constantes durante la fermentación. Además, en el análisis de una mezcla de gases se tiene en cuenta que cada uno de los componentes de la mezcla ocupa el volumen total y que la suma de las presiones ejercidas por los componentes es igual a la presión total de la mezcla gaseosa. Para medir el caudal se humedece la bureta y se presiona la perílla hasta el punto en el cual la solución jabonosa alcanza la entrada de gas. En este momento una de las burbujas formadas inicia su ascenso y es necesario accionar el cronómetro cuando la burbuja cruza la marca inferior de la bureta y detenerlo cuando la burbuja alcanza la marca superior. Et caudal de gas es igual al volumen entre las marcas de la bureta dividido por el tiempo requerido para recorrerlas. Además, de acuerdo con la magnitud del caudal a medir, la capacidad de la bureta se puede escoger entre 10 ml y 100 ml. El medidor de disco utilizado en la determinación de caudales superiores a 100 ml/minuto, total¡za el volumen de gas producido durante Ia fermentación y mantiene constante el nivel de presión en el fermentador, dado que permanentemente evacúa el gas producido. La línea de salida de gas solo se cierra cuando se evalúa el flujo con el medidor de burbuja o cuando se recogen
muestras gaseosas (Figura 7.141.
-
-
4.
Resultados
7.15 se representa la curva de crecimiento celular obtenida en un ensayo típico; Alarcón, J.F, Piñeros, E.R. (1989). En la Figura
-
En la Figura 7.16 se representa el consumo'de sustrato durante un ensayo tlpico. Este consumo representa entre el75 y el 80 % de la glucosa inicíalmente presente en el medio. Por consiguiente, en este caso el sustrato no fue un
474
factor limitativo de la fermentación. si se considera que tos ensayos fueron realizados en la fase de producción de ácidos (fase acidogénica) y no en ra fase de producción de solventes (fase solventogénical, correspondiente a la fase estacionaria del crecimiento, los rendimientos de sustrato en solventes (Tabla 7.8 y Figuras 7.1 7, l.1B V 7,l g) son relativamente bajos.
Tabla
7.8 Rendimiento
del sustrato en solventes y gases. Datos obtenidos en cuatro ensayos, Alarcón, J.F, piñeros, E.R. (1gggt.
Pementací6n y"l"
p
CO,
E2
yn/,
EnaayoABCDE 1 2 3 4
0,094 0,095 0, 064 0, 100
0,77 ,2o 0, 14 0,18 0
0,59 0, 54 0 ,72
o,42 ,46 0,29 0,30 0
o,7o
0,1808 0
, L772
0,2653 0 ,2960
Observaciones:
A; Y.,": Rendimiento de sustrato en solventes, expresado como gramos/litro de solventes por cada gilitro de glucosa consumida. B: P: Productividad, expresada como la concentración de solventes producidos en gramo/litro por cada hora de fermentación, r
I
,.
C: Fracción molar de COr, D: Fracción molar de Hr,
E: Yn,r: Rendimiento de sustrato en gases, expresado como gramos de gas producido por gramo de glucosa consumida, - En la Figura 7.20 se representa la variación del caudal de la mezcla de gases H, y CO, con el tiempo de fermentación.
475
- En la Figura 7 .21 se representa la variación de la composición de la mezcla de gases con el tiempo.
-
En la composición de los gases (Figura 7.21l. se alcanzan valores de la relación (moles COrli(moles Hr) menores que 1. Estos valores coinciden con los resultados de Yerushalmi y Volesky, (19851. Además, se observa que esta relación es siempre mayor que 1 en la etapa final de la fase exponencial de crecimiento.
- La fracción molar de CO, (Tabla 7.8) varla ent¡eO,72 y O,54 y Ia correspon-
0,28. (1982). y Walton Martin, diente a H, entre O,46 y
-
Estos valores concuerdan con los informados por
7.81varía entre 18 y 29,6 gramos g glucosa producido por gas consumida. Estos resultados cada 100 de de confirman la importancia de los gases en el estudio de factibilidad técnicoeconómica de la fermentación acetobutílica, Ef rendimiento de glucosa en gases (Tabla
Figura
7.15
Cinética de la fermentación acetobutflica. Crecimiento de biomasa Alarcón, J.F, Piñeros, E.R, (1989).
Concentracion de celulas, g/litro
81216 Tiempo de fermehtacion, horas
476
| ,t
.1
Figura
7.16
Cinética de la fermentacióñ acetobutflica. Consumo de sustrato, Alarcón, J.F, Piñeros, E.R.(1 9891.
Concentraclon de glucosa, g,4ltro
70
60
50 40 30
20
to o
o4aP162024 Tiempo de fermentaclon, horas
Figura
3,5
7.17
Cinética de la fermentación acetobutflioa. Producción d6 butffiol, Alarcón, J.F, Piñeros, E.R. 11989).
Concentraclon de butanol, g/lltro
3 2,5
2 1,5
I
o,5
o
o4812
162024 Tiempo de fermentaclon, horas
47V
;,
Figura
1,2
7.18
Cinética @ la fprrnpntación acetqhutflica. Producción Alarcón, J.F, Piñeros, E.R. (1989).
(e
acetona,
Concentracion de acetona, g/lltro
F-1
o,g o,6 o,4
:
tr
o,2
a
o4a262024 Tiernpo de fermentAcion, horas
Fi$gq 7.X9 cinética'de -ta"ferm€nt@¡ón efetobutfica. produccién de etanol,., ,Alarcón, J.F, piñen¡s, E.R. fl9B9). ,:
_ Concentraclon de etanol, g,/lltro
o,4
.------.---.+----.-.-.
o,O
o,2
-""'.'-.'^i------:---------
o,7
.-.-i-.---l------..---
O---
o4a2162024 Tiempo da fermentecion, horas
f,78
;
Figura
7.2O Ctnética de la fermentación acetobutllica. Producción H. y
COr,
Alarcón, J.F, Piñeros, E.R. (1989).
250
Caudal, (ml de gas)/mlnuto
200 150
too 50 o
8t216 Tlempó de,farmentaoion, horas
7.21
Figuta
20 t8
Composición de los gases producidos en la fermentación acetobutllica. Alarcón, J.F, Piñeros, E.R. (19891.
Composlclon de loe gases, mol Coz/mol H2
16
t4
- . ' {-
12
.-..t......-..'..-.... ----...+...--
.
---
-
.---.....
.
.....-..} .. '
-
{
/
10 ..i..-...-.......-............i......-............-......i..-............-,.....
a 6 4
2 o
....t
-.....-l
ll-/:: t¡--::
----...".--.-.-.i..----.--...--.-.---.--...¿.--.-¿...--...,...i..-.-.-........-..--i-
o
44P62024 Tiempo de fermentacion, horas
479
:'
7.4.7 Transporte de oxígeno
en biorreactores para el cultivo
de
te¡¡dos animates
-r 7.4.7.1 Condiciones ambientales típicas Una de las principales tendencías de la lngenierfa .Bioquímica es la creciente utilización de tejidos vegetales y de tejidos animales de humanos, monos, bovinos, ratones e insectos. El motivo fundamental es la investigación de las respuestas de un cultivo puro, sometido a condiciones cuidadosamente controladas, a la acción de hormonas, factores de crecimiento y drogas.
Tabla
7.9 Condiciones
ambientales típ¡cas requeridas por las células de mamfferos, Cherry, R.S, (1989).
Condiciones de1 bi-orreactor
:
i3";"Í,l.3.e:z
pH Elsfuerzos cortantes por agitacj-ón Osmolalidad deI medio de creeimiento
oc.)
7 - 7,s < 20 dinas/cm' 21O - 350 mosm.
Nutrientes: Concentración de oxlgeno disuelto
30 - 80 t saturación de ai-re O,l - 4 g/l-ítro 0,5 - 2 mM
Coneentración de glucosa Gfutamina Residuos: Concentración de ion amonio Relación ácido láctico/J-actato
< 4 mM no es crítica control-a pH
Crecimiento: vel-ocidad específica
*
de crecímiento,
Ár
si se
o,001 - o,07 (hora) I
Los intervalos de valores anotados corresporiden a células de mamfferos en general. Una célula particular sólo crecerá dentro de un intervalo más estrecho tal como temperatura 37 t 0,5 oC o pH: 7,1 + 0,1 unidad.
480
;
En otros casos las células se cultivan para obtener algún producto como células
de eBidermis para atender victimas de quemaduras, o células de tejido del páncreas para la producción de insulina. También se cultivan células para la pro-
ducción de vacunas (polio, aftosal, y para obtener proteínas complejas como enzimas, factores de crecimiento, hormonas y ant¡cuerpos. Las células animales sólo crecen en un ambiente fisicoquímico prácticamente similar al del organismo vivo, Miller et al., 1991. Los nutrientes deben estar disponibles en niveles estables y los subproductos deben retirarse continuamente. En la Tabla 7.9 se presenta un resumen de las condiciones ambientales tfpicas requeridas por las células de mamíferos, Cherry, R.S, (1989), Desde el punto de vista del diseño del biorreactor las células se pueden clasificar
como células en suspensión y células dependientes de anclaje, Las células en suspensión crecen y funcionan normalmente cuando están suspendidas en el medio de crecimiento. Las células adherentes requieren una superficie para adherirse y crecer hasta un tamaño de aproximadamente 40 - 50 micrómetros y un espesor de sólo varios micrómetros. Estas células se multiplican hasta cubrir completamente la superficie con una monocapa, estado conocido como confluencia, en el cual la mayorfa de las células adherentes normales detienen su crecimiento. Las células normales sólo se mult¡pl¡can entre 20 y 100 veces antes de alcanzar la senescencia. Por otra parte las llneas de células transformadas genéticamente y las células de tumores cancerosos generalmente no alcanzan el estado de confluencia ni tampoco la senescencia.
7.4.7.2 Sistemas de cultivo
Generalmente se utilizan diferentes sistemas para el cultivo de tej¡dos animales, algunos son simples modificaciones de los reactores convencionales, otros están
fundamentados en las caracterfsticas de las células animales, anotadas en la sección anterior. A escala de laboratorio se utilizan cajas cilíndricas (diámetro = 4 veces la altura; volumen de medío: 0,5 - 10 ml) de material plástico tratado con poliestireno para facilitar la adherencia de las células. Las cajas están provistas de una 481
t
*
cubierta transparente para prevenir la contaminación del cultivo, Otros sistemas comerciales de cultivo de tejidos son los frascos T, los reactores de cartuchos de fibras huecas, los reactores con células microencapsuladas, los reaetores de lecho empacado y los reactores de cultivo en suspensión.
# 7.4.7.2.1 Reactores ag¡tados
El cultivo.de células suspendidas se realiza en reactores agitados, columnas de burbujeo y reactores de circulación líquida impulsada por aire. tipo "airlift". Los reactores agitados mécánicamente tienen algunas modificaciones con respecto a los sistemas empleados en las fermentaciones microbianas, papoutsakis, 1991; Cherry y Papoutsakis, 1990; Gardner et al., 1990, por ejemplo, tas turbinas "Rushton" son reemplazadas por impulsores de hélice, y de paletas, con el objeto de prevenir los esfuezos cortantes excesivos. La aeración se realiza con sistemas que minimizan la formación de espuma y el contacto perjudicial entre células y burbujas. Entre estos sistemas se destacan los aeradores superficiales, la tubería semipermeable, y la aeración a través de mallas de acero inoxidable (Prokop y Rosemberg, 1989; Su et al., 1gg2).
una desventaja de estos reactores eg la baja concentración del caldo (5.105 6.106 células/ml; 10 - 500 mg de anticuerpos monoclonates/litro). En el cultivo por perfusión estas concentrac¡ones pueden aumentarse en un orden de magnitud mediante la retención de las células en el reactor por métodos mecánicos tales como mallas cillndricas de acero inoxidable acopladas al impulsor y en algunos casos med¡ante sedimentadores y equipos externos de ultrafiltración.
7.4.7.2.2 Difusión de oxísbno en frascos T
El frasco T representado esquemáticamente en la Figura 7 .22 es un recipiente
de vidrib o de plástico transparente provisto de un cuello inclinado ligeramente hacia arriba y de un tapon poroso por donde se difunden el CO, y el Or.
482
Figura
7.22
Representac¡ón esquemática de un frasco T
topon
Fro.sco
T
Normalmente se encuentran frascos T de 25, 50, 75 v 150 cm2 de área para el crecimiento de las células. El volumen de medio se calcula con el propósito de obtener una capa cuyo espesor varfa generalmente entre 1,5 y 3,5 mm, Esta delgada capa de medio garantiza una adecuada difusión del oxígeno. El control de las condiciones ambientales en el frasco T es indirecto, generalmente el frasco se coloca en una incubadora para controlar la temperatura. El oxígeno se suministra por difusión desde la atmosfera y el pH del medio se
controla mediante "buffers" en el medio y con una concentración de 5 7o de CO, en la atmosfera de la incubadora. El CO, gaseoso en el ambiente, el CO, en el medio, el ácido carbónico, los iones
carbonato y bicarbonato, forman un sistema "buffer" que equilibra el pH en un valor de aproximadamente 7,3. Los nutrientes y los residuos son controlados periódicamente mediante el reemplazo de medio fresco, usualmente una vez cada2 a 5 dfas. Balance de oxlgeno en un elemento de área unitaria delfrasco T, en condiciones estables: Oz eue entra =
,
^(:*),=
O, que salc + 02 cottswtido
17.751
- o.n.(#),.,, + rOr.A.6y
17.76t
Donde, D: coeficiente de difus¡ón deloxlgeno en agua, cm2/s; A: área superficial del frasco T, cm2.
483
ffi
: .i
El valor de la derivada en y + 6y, en la ecuación anterior, se expresa con los dos primeros términos de la expansión de la serie de Taylor:
(+) =(+\ . 914).u, d! )r*q \dv ), dv \¿v \
if
17.77t
)
Por consiguiente:
40)=, (#) t-a
17.781
sqlució¡ general de esta ecuación, es:
17'791
c=.a.12*b.!+e Donde, d, b ¡ ai constantes. Por consiguiente:
.' -,i
'
&" =2'.o =2.a-v+b , -''', " = dy Or, -'' d'c
De acuerdo con las condiciones de frontera:
(dc/áyl
': 0. Por tanto:
,:
r-.7.8dl
c : 0, en y : h, (Figura 7.22l.; .:
a_¡(g) : b=_2.a.y"= 2.D'D rlozl
,2.DD .¡z _
r(oz)
.h2
,*¿! t7.ell
* e=O
Después de reemplazar a, b y e, en la Ecuación Í7.791, se obtiene:
'i 1
, = '!o:) -ft - v)2 2'D
t7 '82t
Las otras condiciones de frontera son: c : c- en y : 0. Donde: c-: concentración de o¡fgeno en la sqperficie de separación entre medio y aire, mmol Orlml.
484
-
Por consiguiente la profundidad, h, correspondiente
a
una concentración de
oxlgeno igual a cero es:
n
Ejemplo
7.5
=(+*+)'.
t7.83t
Difusión de oxlgeno en frascos T
Se desea estudiar el crecimiento de células adherentes (velocidad especffica de crecimiento, ! = O,O4 hora-r) en un frasco T - 150 alimentado con 45 ml de medio {concentración inicial, x" = 80.000 células/ml). Las células crecen hasta alcanzar el punto de confluencia de 460.00o células/cm2. Suponer que todas las células son viables, y todas sedimentan y empiezan a crecer inmediatamente. Suponer que el medio saturado de aire contiene una concentración de oxígeno de 0,23 mM, pero su contenido de sales reduce el nivel de oxlgeno hasta 0,2 mM. Además la concentración de oxlgeno disuelto se mantiene en un 9E % del valorde saturación con elobjeto de mantenerS o/ode Coren la atmosfera para control de pH, El coeficiente de difusión de oxfgeno en el medio es D : 2, b.,l O-s cm2/s. La velocidad especffica de consumo de O, es /(O2) = 2,4.1O-13 mol Orl(célula.hora).
1- Comparar las velocidades de difusión de oxfgeno y de crecimiento de células; 2- Suponer crecimiento exponencial y calcular eltiempo requerido para alcanzar
el punto de confluencia; 3- Determinar si en el punto de confluencia hay límitación de oxlgeno en el fondo delfrasco; 4- Suponer que una vez alcanzado el punto de confluencia se cierra herméticamente el frasco y calcular el t¡empo en el cual se agota completamente el oxlgeno disponible en el medio.
Solución: 1- Velocidad de difusión de oxfgeno: D
(ar)2
3600
§
hora
485
(¿y')
)-
y del medio en et frasco: 150 crn2.y = 45 cm3.
Donde la prófundidad
Por
consiguientei Y = 0,3 cm.
ño = §mr.Bo.ooo No
:
# #^,
= 24.w
#
Número inicial de células.
2- Punto de confluencía
-,
",
;,;: ; JV - 460.(X)0 = Jv;:exp (p.4
= 24,O00.erg(0¡@4.t) horas. t = .73,83 'r
Por consiguiente:
:.,,
3- Concentración final de células: Abol&ü
céry:rñ
:
-Y2 = 1.530. ,rocélqt/rt
,6 nl
cm2 '
l
t'
:
4- Velocidad de conqgmo de oxfgqno: ;i
r(or)
=
g,U.fi'#
ml
.
=
.,
.
1,0D,.1O-'^!n,?
5- Concentraciórt de O, la,superfieie do contacto entre medio,y.aire: '=
c'
O,95.0
,Z)u=
0,19
o"'" ^!lil¡o r,!.Pr' .' 1000 m, i'
c*=r,9.10o4-o"
486
l
-.
6- Profundidad, h, correspondiente a una concentrac¡ón de oxígeno iguala cero, (Ecuación 7.831:
Por consiguibnte no hay limitación por oxlgeno'
7- Tiempo requerido para consumir el oxígeno disponible si el frasco se cierra herméticamente:
'
c' -- .9. 10 -1 1 minuto r(ozl 1.022.10-7 60s 1
7.4.7.2.3 Difusión de oxígeno
=
31
miutos
a través de capilares
La similitud entre los cartuchos de fibras huecas empleadas en microfiltración
y los capilares del sistema circulatorio de los animales indujo a Knazek et al',
1972, a cultivar células animales en reactores de fibras huecas. Estas fibras (de tr¡acetato de celulosa, poliamidas aromáticas, copolímero acrílico, polisulfona o por de carbonato de silicón) son estructuras cilfndricas anisotrópicas compuestas una pequeña capa activa interna lO,1 '2 pmde espesor) y una capa esponjosa gruesa (50 - 85 pm de espesor) que actÚa como soporte' Las fibras (diámetro que interno: 40 - 2oo l/ml tienen poros con diámetros del orden de nanómetros permiten la retención de especies con pesos moleculares entre 300 y 300'O00'
Los reactores convencionales de fibras huecas (longitud entre 5 y 30 cm; volumen entre 2 y 30 cm3) están constituidos por haces paralelos de fibras, y dispuestas en una configuración similar a la de un intercambiador de coraza las pared de externa la tubos. Las células generalmente Son inmovilizadas sobre fibras. El flujo del medio por los canales entre las fibras y sobre las fibras sum¡nistra los nutrientes y retira los desechos tóx¡cos del metabolismo' La velocidad de flujo del medio está limitada por los esfuerzos cortantes impuestos 487
ajas,células. Los valores,de esfuerzo cortante superiores a 3 dinasicm2 afectan la morfología de las células. En los reactores de fibras huecas se logran concentrac¡ones de celulares hasta de 108 célulasicmt, comparables con las del sistema vivo (10e célulasicm3). Sin embargo, a estas elevadas concentraciones celulares los gradientes de concentración, especialmente de oxígeno disuelto, en las direcciones axial y radial, pueden conducir a la formación de zonas necróticas. Una de las principales desventajas de estos reactores es su costo, ($ 150 - 500 dólares/cartuchol. Además, estos reactores no son reutilizables ni permiten la toma de muestras.
Figura
7.23
Representación esquemática de la sección transversal de una fibra hueca
Eh-la Figura 7.23 se representa esquemát¡camente el área transversal de una tüia'nueca. Elbalance de oxlgeno en un elemeirto de área unitaria, en condicio-
riés estables, es:
'
Oz quc enfia = 02 4ue sab + O" conmmido
'(#)-'=
- o'(#L.o* * r(o)'A'6R
Dotde:A=2.¡.r-L
488
f7.841
t7.851
:,
i-
Por consiguiente:
| *\ ^( ¿\ D.lr. - =*)'= o'V';)'
|
* '
"
''' (c.2)'6r
17'861
Donde, D: coeficiente de difusión del oxígeno en agua, cm2/s; A: área lateraldel capilar, cm2; L: longitud de! capilar; c: toncentración de oxfgeno, mmol Orlml; r(O)r: velocidad de consumo de oxlgeno, (OURI, (mmol Or)/(cm3.s).
,_
P+ dosprmero""^'&*;",.:ffi;.;t:il: El valor de la derivada en
6R, en la ecuación anterior, se expresa con los
r7B't Por consiguiente:
!q) ¡(o) \s = r-(-q"-. 1RdR) [¿n'
t7.881
Esta ecuación también se puede expresar como:
r(o)'R !h.L\ dr[ dR) D
t7.891
y después de integrar se obtiene:
dc -¡(Or).R *c,
dr
2.D
n
t7.90I
tas ccjrtd¡ciones de frontera (Fígura 7.231, son:
c=o
en
R=xo
y. (#t=*o=o
t7.ett
Por consiguiente, el valor de la constante de integración c,,, es:
t7.921
489
Después de integrar la ecuación [7.90], se obtiene:
r tO^\.R2
t7.931
'=il-'+ct'lnR+c2
Las otras condiciones de frontera son: c : e* en Fl : R", Donde: c*: concentración de oxlgeno en la superficie interior de la fibra, mmol Orlml. Por consiguien-
te el valor de lá constante de integración c, es: cq =
'
c*
¡(oz).R?
- 4.D - '(oz)'Rl 2.D
,o
*
c
[7 §41
Después de reemplazar lqp cénstantes c1 y c2 en la Ecuación t7.g3l se obtiene la variación de la concentración de oxígeno dentro de la fibra:
c
7
=
c,
*'(o") .(n, - n1' -z.n?.t ) " Á 4.D I R,)
t7.951
.4.7 .2.4 Microencapsulac¡ón
Las células pueden ser atrapadas en esferas de alginato (diámetro entré'O,,S y 2 mm) recubiertas con una membrana polimérica semipermeable con el propósito de protegerlas de los excesivos esfuerzos de corte y facilitar su posterior recuperación. La difusión del medio a través de la membrana abastece los nutrientes y simultáneamente remueve los desechos tóxic9s, Chen, Dale y Okos, (1990); Tyler, (19901; Pu y Yang, (1988); Gossmann y Rehn, (1986).
El procedimiento de encapsulación somete las célutas a osmolaridades muy altas, además, después de varios dlas de operación las capsulas pueden erosionarse, aspecto que impide Su aBlicación-en los cultivss prolongados, Casson et al., (1987). Las concentraciones celulares alcanzadas por este sistema son similares a las logradas con fibras huecas. Un segundo sistema de microencapsulación emplea microesferas porosas (diámetro entre 500 y 600¡lm) de colágeno y de otros materiales como vidrio, cerámica y acero inoxidable con el propósito de alcanzar elevadas concentraciones celulares y simultáneamente
490
sum¡nistrar grandes cantidades de oxlgeno. Estas microesferas porosas también
son utilizadas en los lechos fluidizados densos, en este caso, provistas de diminutas esferas metálacas en su centro para aumentar su densidad relativa y mantenerlas en el lecho.
7.5
CAMBIO DE ESCALA
El cambio de escala de una fermentación exitosa a nivel de laboratorio origina cambios imprevisibles en las variables no controladas a medida que aumenta el volumen del sistema. La metodologfa del cambio de escala se fundamenta en la selección de una estratég¡a con el propósito de predecir el comportamiento de
las variables no controladas y su consecuencia sobre el diseño global del
proceso.
Algunas condiciones requeridas para e! crecimiento de los microorganismos y la formación de productos en un proceso bioqufmico son: temperatura, presión, velocidad de corte, concentración de nutrientes, pH, Damkóhler, (1988); King y Hossain, (19821. Generalmente elpropósito delcambio de escala es manténer constantes estas condiciones independientemente del volumen del reactor y obtener resultados similares-en términos de rendimientos y productividades. Usualmente las condiciones crfticas en el cambio de escala son la temperatura y la concentración de oxígeno. El pH puede controlarse separadamente, y todos los nutrientes, excepto el oxfgeno en las fermentaciones aerobias, pueden ser añadidos en exceso. El control de la temperatura se dificulta por la necesidad de suministrar o retirar calor a través de una superficie de contacto. Generalmente el diseño de un reactor está l¡m¡tado por la capacidad del sistema
para transferir masa
y
calor. La transferencia de calor se realiza en las
superficies que limitan el sistema y por consiguiente es proporcional al cuadrado del diámetro del reactor. La transferencia de masa ocurre en todo el volumen del caldo y es proporcional al cubo del diámetro. De acuerdo con estas considera-
ciones, Cooney, 1983, recomienda una estrategia de cambio de escala fundamentada en la transferencia de masa mientras la capacidad de transferencia de calor es provista separadamente.
491
Algunos autores como Finn, 1967; Aiba et al., 1 973; Oldshue, 1 983 y Charles, 1985; consideran que los métodos de transferencia de calor generalmente son diferentes a nivel de laboratorio y a nivel de planta de producción y analizan una
estrategia de cambio de escala fundamentada en el mantenimiento de una C,_, de oxígeno disuelto, por encima de un valor crítico.
concentrac¡ón constante,
Entre los criterios de cambio de escala utilizados con mayor éxito están potencia por unidad de volumen, tiempo de mezcla, coeficiente volumétrico de transferencia de masa y velocidad de la punta del impulsor. La aplicación de estos criterios requiere un profundo conocimiento del proceso y part¡cularmente del paso
limitante en la obtención del producto.
7.5,1 Agitación
Generalrnente las ecuaciones disponibles en la literatura para la agitación y mezcla de líquidos y la dispersión de gases en llquidos han sido deducidas para 'reactores relativamente pequeños dentro de un estrecho intervalo de factores geométricos. Einsele, 1976, establec¡ó que la potencia disipada por unidad de volumen es proporcional al volumen del fermentador: P V ?
g,
V-o,sl
t7.961
r.
Esta ecuación significa que a nível de laboratorio,Y = 0,1 m3, las potencias tfp¡cas son de 10 - 15 W/litro. A nivel de planta piloto, Y = 1- 5 m3, las potencias son de 6 - 8 W/litro, y nivel industrial se aplican potencias de 1 - 2,5 Wlitro. Einsele también estableció los siguientes criterios:
- El número de Reynolds aumenta con la escala. - Los tiempos de mezcla y homogenización típicos a nivel industr¡al varían entre
80 y 100 segundos.
492
- La velocidad de la punta del impulsor (n.Drl eS prácticamente independiente del volumen del reactor y varía entre 5 y 6 m.s-1. - El coeficiente de transferencia de masa Kra varía normalmente entre 0,O02 y O,28 s'1, donde los valores más pequeños son tfpicos de los fermentadores más grandes. Charles M., (19851, presenta dos ejemplos sobre los problemas y posibilidades del cambio de escala en fermentación. En el primer ejemplo analiza el consumo
de potencia en un reactor de 100 m3 de volumen útil (Dr: 4 m; Do: 1 ,6 m; rt: 2 revoluciones/s; Caudal de aire: F = 20 m3/minuto, en condiciones estándar; viscosidad delcaldo: ! = 1kg m-'s-11, Elconsumo de potencia en elcaldo sin aerar, calculado según la Ecuación 17 .121, es 527 ,2 kW. El consumo de potencia en elcaldo aerado, calculado por el método de Oyama y Endoh, (1955), es 408,7 kW. El consumo de potencia en el caldo aerado, calculado según el método de Michel-Miller, Ecuación 17.1 81, es 667,4 kW. Hay una discrepancia de 63o/o en los dos rfltimos resultados, pero debe tenerse en cuenta que Michel y Millerutilizaron reactores con una capacidad entre 3,5 y 10,5 litros. En ei segundo ejemplo, Charles M., (1985), analiza el mismo reactor con la
misma capacidad e idénticos factores geométricos, pero el caldo es pseudoplástico con un índice de comportamiento de flujo, m = O,5, y un índice de consistencia, K : 2 N.m-2.s-o'5. El consumo de potencia en la agitación del caldo aerado (O : 20 m3/minuto), calculado según las Ecuaciones 7.21 v 7.22 es 83,5 kW. Este último valor es inferior al observado bajo condiciones similares. En la práctica hay necesidad de realizar ensayos con caldos reales de fermentación a escala de laboratorio, de banco y de planta piloto, con el propósito de obtener los criterios de cambio de escala en cada caso especffico y aplicar racionalmente las ecuaciones disponibles.
7.5.2
Transferenc¡a de calor
Generalmente la ecuaciones de transferencia de calor disponibles en la literatura han sido deducidas para reactores relativamente pequeños. Muy pocos estudios han utilizado caldos reales de fermentación y sus propiedades reológicas no han
493
.
sido incorporadas explícitamente en las ecuaciones. Por óonsiguiente, ecuaciones deducidas emplricamente usualmente no son aplicables
las en
situaciones apreciablemente d¡ferentes de las condiciones para las cuales fueron deducidEs. Una inspección de las Ecuaciones [7.23] y 17.241indica algunos problemas de diseño asociados con la transferencia de calor en biorreactores. En el cambio de escala desde el reactor de laboratorio o de planta piloto hacia el reactor industrial, o viceversa, puede suponerse que las velocidades 'de reacción microbial y la potencia suministrada por unidad de volumen permanecen constantes.
La generación de calor
y las necesidades de refrigeración
varían con (Dr)3
mientras el área de transferencia de calor varía de acuerdo ctin (Dr)2. Por consiguiente un sistema de camisa, suficiente para mantener un reactor de laboratorio en condiciones isotérmicas, debe, reemplazarse, por ejemplo, por un sistema de serpentín interno o externo, para calentar un digestor de lodos de,aguas residuales, o refrigerar un reactor industr¡al para la producción de proteína unicelular.
La presencia de un serpentín interno altera los patrones de mezcla, las velocidades de flujo, y quizás las velocidades de coalescencia de burbujas, (Bailey y Ollis, 1986). El valor del coeficiente de transferencia de calor á, (kW.m-2.oC-'), también depende de la configuración del sistema.
Generalmente
el
serpentln interno proporc¡ona un. mayor coeficiente de
transferencia de calor que la camisa, pero ocupa un considerable volumen, interfiere los patrones de flujo y origina problemas de limpieza y esterilización. Además los escapes por pequeños agujeros frecuentemente constituyen un serio problema de contaminación. También, en muchos casos se ha observado la disminución del coeficiente de transferencia de calor por la formación de zonas donde se acumulan los microorganismos.
y un serpentín
depende de la fermentación específica, del comportamiento reológico del caldo y de los detalles de diseño del tanque y del sistema de agitación, A escala industrial la liberación de grandes cargas calorfficas, como en el proceso de producción de proteína unicelular (SCP) desarrollado por la compañía lCl(El reactor es una columnade 7 m de diámetro y 60 m de altura con un volumen efectivo de 1560 m3, Bailey y Ollis, 1986) los serpentines internos no alcanzan a remover el calor producido y deben ser reemplazados por un intercambiador externo,
La decisión entre una camisa
494
Los circuitos externos de refrigeración evitan las restricciones impuestas por el diseño del reactor e independizan la transferencia de masa de la transferencia de calor. Usualmente en un intercambiador externo se logran mayOrés coefic¡entes de transferencia de calor que en los sistemas de camísa o de serpentín.
Las principales desventajas de un intercambiador externo son el costo de bombeo y la dificultad para encontrar bombas que puedan manejar, de una manera eficiente y económica, caldos saturados de aire a los flujoS y presiones requeridas por el circuito externo. Un sistema de bombeo bien diseñado evita, en algunos casos, la necesidad de utilizar un sistema de agitación con impulsores. Ocasionalmente los fermentadores son enfriados con aire o refrigerados mediante la evaporación de una película lfquida externa. Otra posibilidad de minimizar el problema transferencia de calor, sin disminuir apreciablemente las velocidades de producción, es la utilización de un sistema de refrigeración mecánica.
Aunque el refrigerante reduce el área de transferencia requerida, su costo es elevado. Por ejemplo, la carga calorffica de un fermentador de 200 m3 puede alcánzar un valor de 1758 kW, con un costo de refrigeración de S 60 dólares por hora, (Charles M., 1985).
La utilización de organismos termofílicos disminuye los requerimientos
de las termofílicas cepas la mayorfa de Desafortunadamente calor. de transferencia son menos productivaS que sus correspondientes mesofílicas, pero este no es
el único factor que se debe considerar. En la medida que aumenta la tendencia hacia el empleo de organismos más eficientes y mayores concentraciones celulares en los caldos de fermentación, aumenta la importancia de la transferencia de calor como factor limitativo del tamaño y de la productividad de un biorreactor.
Otros aspectos que deben recordarse al evaluar la transferencia de calor en el diseño de un reactor agitado son:
-
El agitador únicamente afecta el coeficiente de transferencia de calor por el
lado del mezclador.
-
Generalmente los tanques equipados con pantallas deflectoras, usualmente cuatro pantaltas uniformemente espaciadas de anchura igual a la décima parte del diámetro del tanque, conducen al diseño más económico.
495
- La selección de un agitador para asegurar la operación del sistema en una zona de convección forzada, normalmente resulta en el diseño rnás económico y, por consiguiente, ño es una buena prácticá diseñar un agitador para obtener un
coeficiente especffico de transferencia de calor,
7.5.3
Transferenc¡a de masa
Generalmente las ecuaciones disponibles en la literatura para la determinación del coeficiente vblumétrico de transferencia de oxígeno, K.a, son ecuaciones empfricas, válidas para fluidos Newtonianos (fundamentalmente agua con o sin ior¡es) y no-Newtonianos, usualmente soluciones de carboximetilcelulosa , CMC. Belmar, 1 984, ¡ealizó un estudio donde se comparan diferentes ecuaciones para evaluar Kra en el caso de agua. La forma general de este tipo de ecuaciones corresponde a la expresión:
K,a u,
(+)" v!
f7.97'l
tjonde, Kra: coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, s-l m/s; vs :
;
vr:
velocidad superficial, O/A; O: caudal de gas, m3/s; A: área transversal de fa columna, m2: PnlV: potencia entregada por impulsor y por unidad de volumen en la dispersión gas-líquido, W/m3. Estas ecuaciones deducidas empír¡camente usualmente no son aplicables en situaciones apreciablemente diferentes de las condiciones para las cuafes fueron deducidas Herbst et al., 1992, y Solomon, 1980, recopitaron ecuaciones y datos de la literatura relacionados con la evaluación delcoeficiente KLa en el caso de fluidos
'viscosos no-Newtonianos. En términos generales puede observarse un incremento en el valor de K,-a conforme aumenta la velocidad de agitación, de acuerdo con la siguiente expresión general:
KIn u
lL-^
t7.98I
Donde. K,-a: coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, s't'; lt: viscosidad del fluido, kg.m-t,s-1; El valor del exponente m varía entre 0,4 y 0,6. 496
En el Ejemplo 7.6 adaptado de Oldshue, 1983, se muestra una estrategia de camb¡o de escala donde se mantiene constante un parámetro específico en un
reactor de 100 litros y en otro de 10.000 litros. En este caso los demás parámetros no pueden controlarse y toman valores diferentes de los originales (Tabla 7.10) a medida que cambia el volumen del sistema.
Eiemplo
7.6
Estudio del comportam¡ento de algunas var¡ables en el procedim¡ento de cambio de escala
Suponer que las propiedades de un caldo de fermentación tales como composi-
ción del medio, temperatura, pH y concentración de oxígeno disuelto, son similares en un reactor de 100 litros y en otro de 10.000 litros. Suponer que los fermentadores, geométricamente similares, están equipados con un impulsor
de turbina y cuatro pantallas deflectoras, y que el patrón de flujo en ambos reactores es de flujo turbulento plenamente desarrollado. Determ¡nar el comportamiento de los siguientes parámetros con el cambio de escala: P, potencia en W; P/V, potencia por unidad de volumen de licor, Wi(m3);
n velocidad del impulsor; revoluciones/s; Do, diámetro del impulsor, m;
Oo:
caudal de aire alimentado al reactor, m3/s; Oo/V: relación entre el caudal de aire alimentado y el volumen de licor, s-t, o en v.v.m, (volumen de aire por volumen de licor por minuto); n.Do: velocidad de la punta del impulsor, m/s; Rr, número
de Reynolds. Utilizar los siguientes criterios de cambio de escala: 1- Potencia por unidad de volumen constante en ambos reactores; 2- Velocidad del impulsor igual en ambos reactores; 3- Velocidad de la punta del impulsor igual en ambos reactores; 4- Número de Reynolds igual en ambos reactores; y evaluar el efecto de cada criterio sobre los demás parámetros del sistema. Solución.
En la Tabla 7.10 se presenta un resumen de los valores relativos de los diferentes parámetros del sistema de acuerdo con las diferentes estrategias de cambio de escala.
498
ambos reactores, columnas A y B (Tabla 7.1O): La relación de los volúmenes de caldo en ambos reactores esl
+=4$=1oo; 100 ,vP
ad¿,,tás:
v a ol a »),
Donde los subíndices G y P se refieren al reactor de 10.000 litros y al de 1O0 litros respectivamente.
- Diámetro del impulsor del reactor de 10.000 litros:
Drn=(1ü))1F=4,A4 El diámetro del impulsor del reactor de 10 m3 es 4,64 veces mayor que el diámetro correspondiente del reactor de 0,1 m3,
- Velocidad del impulsor del reactor de 10.000 litros:
+ d nl .oln=nf,. ol,n (1) . (1) = o3.
G,ilF
ns = 0,36 La velocidad de giro del impulsor del reactor
de 10 m3 es O,36 veces menor que la velocidad correspondiente en el reactor de 0,1 m3.
- Caudal de aire en el reactor de 10.000 litros:
Qrc ú nn.Dlo= 0,36.(4,O4)o
= 36
El reactor de 10 m3 requiere un caudal de aire 36 veces mayor que el correspondiente al reactor de 0,1 m3.
- Volumen de aire por volumen de licor por minuto (v.v.ml en e! reactor
de
10.000 litros: 499
El caudal de aire, por unidad de volumen de
licor, suministrado al reactor de 10
m3 es O,36 veces menor que el correspondiente án el reactor de
0,1
m3.
- Velocidad de la punta del impulsor en el reactor de 10.000 litros:
ne-Dte= 0,36. (4,il) = 1,57 La velocidad de la punta del impulsor del reactor de 10 m3 es 1,67 veces mayor que la correspondiente en el reactor de 0,1 m3.
- Número de Reynolds en el reactor de 10.O00 litros:
R,
o.
nn.Dl,6= 0,36. (4,6412 = 7,75
El número de Reynolds en el reactor
de 10 m3 es 7,75 veces mayor que e¡
el
reactor de 0,1 m3.
Tabla
7.10 Comportamiento
de algunas variables en el procedimiento de cambio
de escala.
Reactor de 100 litroa
R6acEor de 10.000 litroe
ED
A 1
P/v
7
100
2t5t
I
2t,5
0,27-5
2L,5
0,21
0,0021
n1
0,36
L
0,2L
0,0464
DA1
4,64
4,64
4,64
4,64
36
Qo1
100
Q"/Y
1
o
n.Do
1
)-,67
RE1 500
,36
7,15
2t,s
4,54
1
0; 215
O
4,64
1
0,215
2L,5
4,63
.1
,0464
ne = O'215
- Los demás
parámetros se calculan mediante un proced¡miento similar al desarrollado en los puntos anteriores.
4. criterio de cambio de escala:.Númelo de Reynolds igual en ambos reactores, columnas A y E (Tabla7.1Ol: - Velocidad del,impulsor del reactor de 10.000 litros: R, u n.Dl, ='l
=
no.Dl, = nc.(4,64)2
nn =
Q'Q$!
La velocidad de giro del impulsor del reactor de 10 m3 es 0,0464 veces menor que la velocidad correspondiente en el reactor de O, 1 m3.
- Los demás
parámetros se calculan mediante un procedimiento similar al desarrollado en los puntos anteriores.
PROBLEMAS
7.1
Con el propósito de evaluar el coeficiente de transferencia de oxígeno se alimenta un fermentador con 1,2litros de una solución 0,5 M de sulfito de sodio y 0,003 M de iones cut*. se inicia la alimentación de aire y se pulsa elcronómetro cuando las primeras burbujas de aire emergen del dispersor, (tiempo cerél. Después de un perfodo de oxídacíón de 624 segundos, se susBende la agitación y la alimentación de aire, se.toma una muestra de 10 ml y se anota la temperatura del caldo, (3O oC a 1 atmósfera).
La muestra se mezcla con un exceso de reactivo estándar de yoduro recién preparado. La concentración de sulfito de sodio en la muestra, obtenida a partir de la titulación con solución de tiosulfato (Narsror) hasta el punto final con un indicador de almidón, es de 0,16 mol/litro.
502
Calcular: 1- La cantidad de sulfito de sodio, mol/litro, que reacciona en 624 s; 2- Eloxígeno que reacciona con el sulfíto de sodio, mol/litro; 3- La demanda de oxígeno, en (g Or)/(litro.s); 4- La solubilidad del oxfgeno en equilibrio con el aire, c-r, g/litro. 5- El valor de K,_a, {coeficiente volumétrico de transferencia de masa, s-1).
7.2Un reactór de mezcla completa (D, : 1,2 m) se llena con agua hasta una altura H = 0,8 m. El tanque está equipado con 4 pantallas deflectoras de
anchura J : 0,12 m y un impulsor de turbina de 6 hojas planas que gira a 260 rpm (diámetro del impulsor: D¡ : 0,4 m). Aire a 25 oC (Presión local : '10,8 psi; Presión manométricd = 5 psi) entra al reactor por un orificio situado debajo del impulsor a raz6n de 2S litros/s. Calcular: 1- La potencia entregada al fluido sin aerar; 2- La potencia entregada al liquido gaseado; 3- La fracción volumétrica de gas; 4- El diámetro medio de las burbujas; 5- El área de la superficie de separación entre burbujas y líquido; 6- El coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, Kra; 7- El coeficiente de transferencia de oxígeno, K..
7.3
Una industria bioquímica utiliza un reactor de mezcla completa equipado con camisa y serpentín interno para el control de la temperatura, tres impulsores tipo turbina Rushton acoplados al mismo eje y cuatro pantallas deflectoras
uniformemente espaciadas (diámetro del tangue, Dr = 5 m; diámetro del impulsor, D¡ : 1,33 m; altura del tanque, Hr : 1 5 m; anchura de las pantallas deflectoras, J : 0,5 m; potencia delmotor:745 kW; velocidad de rotación:48 rpm. Los requerimientos de oxfgeno del proceso son sat¡sfechos con alre estéril (Presión local: 10,8 psi; temperatura: 28 oC) suministrado a razón de 0,6 volúmenes de aire por volumen de licor por minuto. Volumen de caldo en el reactor: Y = 22O m3; rendimiento de oxfgeno en células: 0,86 (g células)/(g Oz); velocidad máxima de crecimiento de células: 0,78 (g célulasl/(litro.horal; densidad del caldo: 1280 kg/m3; viscosidad del caldo: 0,36 kg/(m.s); Temperatura: 2B oC). Calor especlfico: 2836 kJ/(kg.'C). Calcular: 1- La presión manométrica del aire a la salida del dispersor localizado entre el fondo del tanque y el primer impulsor si la presión en la cima del reactor es 6 psig; 2- El oxígeno suministrado al cultivo en (g Or)i(litro de medio.hora); 3- La velocidad de demanda de oxfgeno del cultivo en (g Or)/(litro de medio.horal; 4- El coeficiente volumétrico de transferencia de oxfgeno, K.a, s-1; 5- La potencia por unidad de volumen entregada al fluido sin aeración, Wlitro; 6- La potencia por unidad de volumen entregada al fluido gaseado, W/litro; 7- La
s03
velocidad superficial del aire, m/s; B- La velocidad superficial del aire correspondiente al punto de redispersión, m/s; 9- La velocidad en la punta del impulsor;
10- El calor generado por metabolismo, por la agitación mecánica y por la dispersión del aire, W/(litro); 1 1- El coeficiente de transferencia de calor entre la camisa y el licor; 12- El coeficiente de transferencia de calor entre el serpentín interno y el licor; 13- El área de transferencia de calor requerida para mantener
el caldo a 28 oC. Suponer que el fluido de enfriamiento es agua
cuya
temperatura varla desde 12 hasta 16 oC.
7.4 Difusión de oxígeno en capilares: Calcular la máxima concentración de células sobre la superficie exterior de una fibra cilfndrica (radio interior: 50 pm; radio exterior: 25O pml. Coeficiente de difusión de oxígeno a través de la masa celular: D = 2,2.10-5 cm2ls; velocidad específica de consumo de Oz, p(O2l : 3,6.10-13 mol Orl(célula.horal; concentración de oxígeno en la superficie de separación gas-llquido, c- : 2,4,10-a mmol O./ml 7.5
Difusión de oxígeno en soportes esféricos: Realizar un balance de oxígeno para células retenidas dentro de un soporte esférico poroso (Area superficial: 4.n.R2l somet¡do a las siguientes condicrones:
c=c'
en
n=& , #=O
en R=O
Dbnde, Rr: radio de la superfície de la esfera; c: concentración de oxfgeno, (mmol Oz)/ml; c*: concentración de oxfgeno en la superficie de separación gasllquido. .Demostran
'(o")
=
o.(1"- . ? L\ [¿n' R dR)
También:
c=c* -'=(':).(^:-*') 6.D
Donde, c: concentración de oxígeno, (mmol Or)/ml; r(O)r: velocidad de consumo de oxígeno, lOURl, (mmol Or)/(cm3.s); D: coeficiente de difusión del oxígeno en agua, cm2/s.
504
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514
INDICE DE MATERIAS
Aceites vegetales
101
Acetil colina, hidrólisis en presenqa y en ausencla de un inhibidor
258
Agitación de fluidos Newtonianos no gaseados Newtonianos gaseados . . . . no Newtonianos no gaseados gaseados no Newtoníanos
Agua
tonicidad ......... actividad actividad y
277 275
influencia sobre la
velocidad relativa de
.
410
diversos bioprocesos
279
422 419 422
diseño de
medios
97
423
Agitación, aeración cambio de escala
410 492
evaluación de la potencia entregada al fluido
421
y dispersión
Almidón, hidrólisis
conq-amilasa...r . con maltosa con c-dextrina
2O7
228 229
Aminoácidos en el licor de maceración de
mafz
103
Análisis en la evaluación de parámetros cinéticos
Aire calentamiento directo calentamiento indirecto compresión politrópica
388 388 386
condiciones del aire requerido por la industria
385
dispersión en sistemas
sin agitación mecánica . . . .
.
462
con agitación mecánica . . . .
.
463 384 386 388
esterilizac¡ón
por calor por filtración
diferencial
integral
.....
3O2
termodinámico del metabolismo microbial
126
Antibióticos producidos por bacterias y hongos . . . . .
.
25
Aplicaciones de la lngenierfa Bioqufmica . .
.
22
de los lenguajes de simulación en ingeniería Azúcar de caña, simulacíón
Aire, pérdida de presión filtros de fibra
3O5
delahidrólisis
....
43
.:
235
de vidrio Bacterias
lecho empacado con lana mineral en una vela de "Celloton" . .
390 .
productos ¡ndustr¡ales producción de antibioticos, .
.
23 25
392 período de reproducción de varias especies tipos de nutrición
273 91
515
Biomasa
valores de pH para el desarrollo Balance de
281
energía
decrecimiento...
288
164
del proceso aerobio de producción de levadura . . .
Calor área de
.. .
transferencia
425
171 Calor. coeficiente
¡
del proceso anaerobio de producción de etanol ....... Balance de
influencia de la concentración sobre la velocidad específica
114
materiales
52
de la biomasa, determinación
consideraciones sobre
cinética y simulación
reactores de'elementos qulmicos de
detransferencia... Calor de combustión de las células
429 142
152 1
50,1 52
322
145
Calor de reacción 54
Calor específico en fermentación 170
en una fermentación
anaerobia
56 Calor generado
de carbono durante el crecimiento de S. cereu
iae
de oxígeno durante el crecimiento de S. cerevisiae . .
83 . 84
....... disponibles
decarbono yoxígeno de electrones
en catálisis enzimática en fase heterogénea
57 245 q0
cinéticas
capítulo 1 . ... . capÍtu|o2....
46 116
capftulo 3
181
capítu|o5.... capftulo6.... capítu|o1....
351 4O2 505 30
Biocatalizador
Biomasa modelos cinéticos no estructurados para crecimiento
516
.
por metabol¡smo aerobic en un reactor por lotes
169 150 166 167
55
formulación de ecuaciones Bibliografía
por metabol¡smo por mol de 02 . por actividad metabólicr .
: 282
Calor, producción bajo represión por
glucosa . .
1
53
1
55
durante el crecimiento
microbial
C br transferido
enfermentación... en un reactor aeróbico en cambio de escala
encond¡cionesinestables...
agitación comportamientodevarlables. transferenciadecalor transferencia de masa
424 437 493 436 491
492 498 493 496
Capacidad calorífica
enfermentación...
17O
Característ¡cas de la lana mineral 390
7
Carbono balance
55 balance durante el crecimiento 83 de S. cerevisiae 89 fuentes 9 Catabolismo y anabolismo Catálisis enzimática en fase heterogénea balance de
materia sustrato
consumo de
239 245 246,249
químicos físicos Células cultivo
24O 242 2
representación esquemát¡ca . . . .
31
.
3
de mamfferos condiciones ambientales . . .
é'
. 480 filtración a través de membranas 41 información genética 3 productos intracelulares 39 productos e)Gracelulares . . . . . 40 representación esquemática . . . . 3 ruptura ...... 40 separación 39 tipos básicos 2 Ciclos del ácido tricarboxflico 15 de esterilización, díseño 37O energét¡co de las células . . . 134 Cinética de las reacciones catalizadas por enzimas . . . . . 185 modelos cinéticos 2OO de la destrucción de microorganismos mediante calor htlmedo 357
Cinética evaluación de parámetros a partir de datos experimentales . , ' . modelos cinéticos
noestructurados ....
y productos
consumo de sustrato
formación de
263
282
para. la inhibición del
crecimiento modelos cinéticos para la formación de producto
292 297
Clasificación de microorganismos del reino protista
4
t
de mantenimiento, determinación gráfica
86
Arrhenius Cofactores y coenzimas Columnas de burbujeo
359
de
186
343
Composición melazas de remolacha y caña 99 105 extracto de levadura extracto de malta en polvo 100
extfactodesalvadoyaceitede
semillas
104
licor de macerac¡ón de mafz . licor de papa .
. 103 103 67
coli Compresión politrópica elemental del E.
386
Concentración de nutrimento y concentración de
células
de sustrato y velocidad de una reacción enzimática . . . Conservación de
del crecimiento de biomasa,
301
energla
Consumo de potencia por agitación
92
.
203 121 421
517
D
Control ambiental, medios de cultivo
Diseño de un bioproceso
i : .. . . . .
107
.
Cultivo de tejidos animales composición elemental de diversos microorganismos
de antibióticos
207 229 228
.
348
Datos experimentales de la velocidad inicial de la reacción de hidrólisis de acetil colina
141
39
,,O,
,
42
40
Diseño de medios de crecimiento y producción
88
consideraciones técn¡co económicas
94 97
17O
264
.
69
Difusión de oxígeno
fuentes de carbono aceites vegetales alcoholes sintéticos licor de sulfito . melazas, cebada y extracto de malta hidrocarburos
enfrascosT...... ejemplo ..:,:.::
482
a través de capilares Diseño de ciclos de esterilizac¡ón
518
células
41
productos ¡ntracelulares 39 productos extracelulares . . . . 40 purificación final del producto -
ruptura de células
. Densidad de la biomasa . . .
equrpo
.. ..
258
Datos tlpicos de calor especlfico y capacidad calorífica en fermerttación. . .
esterilización
atravésdemembranas
recuperación de antibióticos y proteínas med¡ante intercambio iónico
Datos termodinámicos de algunos compuestos representat¡vos
Determinación de la fórmula de un microorganismo típ¡co .
42
filtración de células separación de
Datos del crecimiento de Escherichia coli en un cultivo por lotes
.
38
extracción llquido-lÍquido
con o-amilasa
el biocatalizador . el biorreactor
separación y purificaoión de productos de la ingenierla bioquímica. 68
Datos de la hidrólisis del almidón
Diseño de un bioproceso considerac¡ones generales . . . cultivos de células y teiidos . .
36 37
480
Datos
en presencia de o-dextrina . . en presencia de maltosa
medios
de aire
98 101
'
100 1O0
98 r01
485
fuentes de nitrógeno
487
inorgánicas y sintéticas
101
370
extracto fermentado de salvado y aceite de semillas
1O4
.
29
.
31
30 33 35 35
extracto de levadura licor de maceración de maíz licor de papa torta de soya
105
102
102 102
requerimientos
nutrimentales
88
I
Elementos quimicos, balance por el método de electrones
Diseño de medios de crecimiento y producción requerimiento de: elementos mfnimos específicos de energía ambientales medios de cultivo definidos . control ambiental
89
90 92 93
94 106 107
.
Diseño preliminar de un medio de cultivo Disipación de energÍa y eficiencia termodinámica . . .
110 146
.
Disipación de calor y de entalpfa libre
148
disponibles 57 Embden-Meyerhof-Parnas 8 Energta
balance
general
164
balance del proceso aerobio de producción de levadura
171
balance del proceso anaerobio de obtención de etanol
"¡74
disipación
146
Energfa libre
124
estándar
130
Dispersión
412
de gases
Energfa libre estántar de hidrólisis de algunos
compuestos de aire en sistemas sin agitación mecánica
462
fosforilados
Energía libre estándar de algunas reacciones
biológicamente importantes .
de aire en sistemas
.
133
463
con agitación mecánica
de hidrólisis del ATP Ecuación de crecimiento . . . . . en un proceso aerobio en un proceso anaerobio
.
59 62
Entalpía
137
123
64 Entner-Doudoroff
Ecuaciones c¡néticas, formulación a part¡r del balance de materiales de un cultivo cont¡nuo
Entropía 80
"t2
124
Enzimas
actividad de la enzima Eficiencia de la célula en el proceso de captura de energfa en la reducción del piruvato hasta lactato . ,
132
... actividad enzimática Sglucosidasa
192 291
139
.
catálisis enzimática en fase Eficiencia energética del crecim¡ento microbial Elementos quimicos, balance' . en una fermentación anaerobia
heterogénea
239
cinética de las reaociones catalizadas por enzimas
185
149 .
54 56
clasificación
cofactores y coenzimas
187 186
519
' !.
Enzimas
-
Enzimas
¿áteiminación del t¡po de reacción enzimát¡ca
226
energfas de activac¡ón e inactivación.
198
evaluación gráfica de los parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten.
2O4
influencia de los factores
ambientales pH .. . temperatura importancia industrial rsoenzrmas y enzrmas
alostéricas
modelos cinéticos'de las reacciones catalizadas por enzrmas
Michaelis-Menten : Briggs-Haldan€ .
. ...
Michaelis-Menten para 'una reacción enzirnática reversible
196 -196
196 188 187
200 . ': 200 208 215
Enzimas, modelos de inhibición
competit¡va no competitiva. por sustrato.
223 225 231 número de recambio , . . . 193,194 reactores enzimáticos 233 pór lotes 234 continuo de flujo tapón . . . . . 234 relación entre el caudal
empacado.
simulación de la hidrólisis del azúcar de caña por acción de la enzima inverfasa 235 simulación del modelo de Michaelis Menten.
212
velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima
191
Esterilización
lotes continua diseño de ciclos por
energía de activación y coeficiente de Arrhenius. .
.
359
Esterilización
mediante calentamiento directo por inyección de vapor.
376
reducción fraccional de la población de
l
microorganismos
362
selección del microorganismo de
370
diseño. Ester¡l¡zación de aire calor . compresión politrópica calentamiento rlirecto calentamiento indirecto con gases combustibles
384 386 396
388 388
217
filtros fibrosos
393
eficiencia de fibra espesor de un lecho empacado con fibras
393
devidrio 524
369 375 370
eficiencia de los
y el grado de conversión, en la isomerización de 'glucosa, en un reactor
relación entre la concentración de sustrato y el t¡empo de reacción, en un reactor por lotes, empacado con enzima
....396
Factor de rendimiento
Esterilización de aire
'
388 389
filtración filtros empacados filtros de vela filtros de membrana
391
.
43
Evaluación
de entalpía y calor de combustión
410
aeración
por catabol¡smo .
158
.
energla tctal disponible en el medio
156
equlvalencia de los factores de rendimiento
72
evaluación en la producción de ácido cltrico
77
Evaluación de rendimientos basados en energía
159
generación de ATP máximo de ATP en céluias 467
.
Evaluación
de rendimientos basados en energía
159
del rendimiento máximo en la producción de ácido 77
.
Extracción lfquido-lfquido de ant¡biót¡cos
42
Extracto fer mentado de salvado y aceite de semillas
104
Extracto de levadura
105
Factores de rendimiento de de de de de en
78 79
140
de la potencia entregada al fluido por agitación y
cftrico
en medios mfnimos en medios complejos energla liberada
498
Etapas en el planteamiento y la solución de un modelo . .
Evaluación de los gases producidos durante la fermentación en reactores a escala de laboratorio . . . .
74
392
Estudio del comportamiento de algunas variables en el procedimiento de cambio de escala
-
en el crecimiento aerobio de S- cerevisiae
electrones en biomasa energía en biomasa oxígeno en biomasa . .,¿ . sustrato en biomasa sustrato en producto el crccimiento aerobio
70
161
163
máximo de sustrato en producto rendimiento verdadero verdadero del oxlgeno
76 163 79
Fenómenos de transporte en bioprocesos reología del caldo agitación, aeración y dispersión
406 406
410 424
transferenc¡a de calor transferencia de masa Fermentación aceto-butn¡ca composición de los gases consumo de sustrato crecimiento de biomasa producción de acetona producción de butanol producción de etanol producción de gases, CO2 e
444 479 477
476 478 477
H,
478 479
71
154 .
70 70 75
Fermentación aerobia 171 balance de energfa ecuación de crecimiento . . . . . 71 factores de rendimiento 71.74
7'.|
521
Fermentación aerobia formulación de ecuaciones
' -
Formación de producto, modelos asociados al
Fermentación anaerobia balance de elementos químicos 56 balance de energía 174 ecuación de crecimiento . . . . . 64 Fermentadoresen set¡e . . . . . . 343 Filtración
deaire
..........
388
de células a través de
300
parcialmente asociados al crecimiento: rñodelo de Luedeking y Piret .. . . .. ,
vela
fibrosos
...:..
301
Formulacióndeécuaciones células de S. cerevisiae . .
eficiencia de los
i.
cinéticas para el control
Filtros
de
no asociados al crecimiento microbial
filtros
391
Formulación de medios
I 393
Fuentes
.... . 80
decarbono
gg
de nitrógeno
empacados
.. i :,.......:..
pérdida de presión en filtros de fibra de vidrio . . . r
389
.
Generación de ATP, factores de rendimiento
161
398 Glucólisis
Fluidos
Newtonianos
4Oi
agitación de fluidos no
gaseados
416
agitación de fluidos gaseados
419
Fluidos no Newtonianos
agitación de fluidos no gaseados
422
agitación de fluidos
gaseados
plásticos Bingham . . .,.,. : . comportamiento pseudoplástico
deCasson
Glucosa
balance de energla del :proceso de producción de levadura
171
balance de energÍa del proceso de obtención de etanol
174
producción de calor bajo' represión por glucosa
153
isomerización en un reactor
empacado
Grado de reducción
58
Hidrocarburos
101
¿109
Hidrólisis de acetil colina . . . . .
.
258
Hidrólisis del almidón
con glucoamilasa en un reactor por
522
217
423
409 .. :..... 410 Formación de producto, moderos '' 297 c¡nét¡cos ,cuerpo
8
lotes
,.
r.
256
f'
Hidrólisis del almirlón evaluación de parámetros .
cono-amilasa....
Melazas de remolacha
.,
204
2O7,2Og
y caña,
composición Metabol¡srno, microbial
análisis termodinámico . . . . .
con o-am¡lasa en presencia de
maltosa.
228
con o-amilasa en presencia de
a-dextrina
procesos de producción de energía glucólisis
.
5
12A
7
8
23O rutas metabólicas:
Hidrólisis del azúcar de caña por acción de la enzima
Embden-Meyerhof -Parnas
del fosfato-pentosa
¡nvertasa.
,
99
235
Entner-Doudoroff .
I 11
respiración
12 13
ciclo del ácido tricarboxllico
13
.
pro9rama:
C:\|SIM\|NVTSA1.S|M.
progfama:
C:\GWBASIC\INVTSAI.BAS-
.
236 237
259
lntermediario qufmico
del
138
alostéricas
187
Lenguajes de simulación, aplicación en ingenierfa
43
lenguajes de simulación cont¡nua
102
102 100
Materias primas en la industria de procesos bioquímicos.
95 .
106 108
cebada. monosacáridos y
oligosacaridos ,; .
.
reducción
16
Medios de crecimiento
diseño
Microorganismos composición elemental
88 66
determinación de la
composición
69
45
Licor
de maceración de malz de papa de sulfito
16
reacciones de oxidación
y producción,
lsoenzimas y enzimas
Medios de cultivo definidos . . formulación
y fosforilación
oxidativa
Hidrólisis de sacarosa con invertasa, velocidad inicial de la reacción
común, principio
transporte electrón¡co
99
Modelos cinéticos de las reacciones catalizadas por enzimas de Michaelis-Menten . .. . de Briggs-Haldarie
200 2OO,2O4
208
Michaelis-Menten reacción enzimática
reversible
215
de inhibición competitlva . . . . 223 de inhibición no competitiva. 225 de lnhibición por sustrato . . . 23'l
extracto de malta,
composición
100
523
- .,
Monosacáridos y oligosacáridos en la cebada
Modelos cinéticos no
estructurados
Para
crecimiento de biomasa, consumo de sustrato
-
yformacióndeproducto. 282 283 de Monod 285 de Moser 286 € de Contois y Fujimoto 286 de Teissier 286 " de Konak 287 de Kargi y Shuler ... 288 deMeyrath .....' ... 288 deHinshelwood .. 289 de La Motta 289 de muerte microbial. 289 de Chiu 290 de Moser y Steiner de metabolisrno endógeno . . . 29O Modelos cinéticos para la inhibición del crecimiento
292 294 295 de inhibición por producto . . . 295 de Holzberg 295 296 de Ghose y Tyagi deJerusalimsky.. 296 296 de Bazua y Wilkie de represión cataból¡ca 297 de Andrews de Tseng y Waymann
Modelos c¡néticos para la formación de producto
Nitrógeno, fuentes
inorgánicasysintéticas.....
101
Nivel crítico de oxígeno disuelto para la viabilidad de algunos microorganismos 449 Número de
recambio
193,194
Parámetroscinéticos,
evaluaciónapartirde datos
experimentales
de la ecuación de Monod. . .
.
301
308
Parámetros de la ecuación
de Michaelis-Menten evaluación gráfica.
2O4
evaluación en la hidrólisis del almidón.
206
Pérdida de presión
del aire en los filtros de fibra de vidrio
.
398,309
en un lecho empacado con lana mineral en una vela de
297
99
390
"Celloton" . . 392
Período
de adaptación asociado al crecimiento
microbial.
no asociado al crecimiento microbial' parcialmente asoc¡ado al crecimiento: modelo de Luedeking y Piret
299 3O0 301
de calentamiento
y período de sostenimiento .
Modelo de Miehaelis-Menten, simulación. Programa:
C:\GWBASIC\MENTEN.BAS
524
213
271
de replicación de los
organismosfilamentosos....
Modelo de Michaelis-Menten,
Programa: C:\ISIM\MENTEN.SIM 2'12
374
de replicación de bacterias
y levaduras
de replicación de E. simulación.
-
de sostenimiento en una fermentación por lotes. de sostenimiento, influencia del volumen del caldo
pH . .
271
coli . .. ....
7
371
375 191,218
pH
efecto sobre la velocidad de crecimiento de algunas bacterias.
280
efecto sobre la velocidad de un bioproceso .
281
efecto sobre la actividad enzimática
197
pH de algunos fluidos
280
valores de pH para el desarrollo de bacterias
281
38,41
40
formación, modelos cinét¡cos no
estructurados
297 295
inhibición Productos industriales derivados de bacterias. . . . . .
.
23
derivados de los hongos. intracelulares
24 39
metabólicos de bacterias
Potencial de reducción estándar de algunas reacciones bioqulmicas.
y hongos tltiles como 20
antibióticos.
25
Programa:
Problemas
Capltulo Capltulo Capftulo Capítulo Capftulo
Productos de la ingenierfa bioqulmica, purificación extracelulares
2
114
3
178 255
4 6
347 400
Capltulo 7
502
5
Proceso aerobio ecuación de crecimiento . . . . de producción de levadura a partir de glucosa Proceso anaerobio ecuación de crecimiento . . . .
.
62 171
.
obtención de etanol a partir de
glucosa
64 '174
Productividad y grado de conversión
330
máxima, en un reactor continuo de mezcla
completa
C:\GWBASIC\HERBERTl.BAS 324 C:\GWBASIC\HERBERT2.BAS 336 C:\ISIM\MENTEN.SIM 212
. 213 C:\lSlM\lNVTSAl.SlM 236 C;\GWBASIC\INVTSA1.BAS. . 237 C:\OUATTRO\MONOD.WOI . 308 C:\GWBASIC\MONOD.BAS . . 312 C:\GWBASIC\LEDUYZAJ.BAS 317 C:\GWBASIC\SPLINE.BAS. . . 32O C:\lSlM\THlELEl.StM 25o C:\GWBASIC\MENTEN.BAS .
Prólogo Reactor
......
33
a escala de laboratorio, evaluación de los gases producidos durante la fermentación
467
aeróbico, transferencia
de calor
(CSTRI
437
328 aeróbico, transferencia
demasa
Productos clasif icación
......465
298 agitado
de la fermentación, composición qufmica . . . . . .
xvu
.
90
415,482
con circulación lfquida inducida
346
525
Reactor
continuo, calor generado por metabolismo aerobio . . . continuo de flujo
.
tapón
.
cont¡nuo de mézcla completa
168
327
328
empacado, relación entre ceudal y grado de conversión . .t 217
evaluación de los gases producidos durante la fermentación en reactores a escala de laboratorio . .
467
transporte de oxfgeno en biorreactores para el cultivo de tejidos animales
480
Fleducción fraccional de la población 'de microorganismos
relación entre concentración de sustrato y tiempo de
...
.
342,343
sustrato en biomasá . . .
.
enzimáticos
233
de electrones en biomasa en el crecimiento aerobio
lotes
234,322
reacción en serie
Rendimiento
Reactores
pof
'
334
contrnua.
continuo de flujo tapón . .
.
234,321 .'.... 328
(CSTR)
'
cont¡nuo de mezcla completa con récirculác¡ón 338 en serie 342
con circulación líquida inducida por aire "airlift' . . .
.
343
Reactores equipados con:
con camrsa con serpentín con tubos verticales con serpentines de
placavertical
....
431
433
434 ':
435
transferencia de calor en un reactor aeróbico transferencia de masa en un reactor aeróbico
526
435 437
465
,..;..
en el crecimiento aerobio de S. cerevisiae . . . . . .
70 71 71
.
72
.
74
de sustrato en producto máximo de sustrato en producto
75 76
evaluación del rendimiento t' máximo en la producción de ácido cítrico
77
coeficiente verdadero en medios mínimos verdadero en medios complejos verdadero del oxígeno
78 19 79
'
Rendimiento de energía en biomasa
'
,154
basado en el calor producido en la energía totat disponible
enelmedio intercambiadores de superficie raspada
70
., 70
oxlgenoenbiomasa....
equivalencias
por lotes con alimentación
cont¡nuo
362
221
............. '
basado en la energla liberada por catabolismo ,.
156
,,'
. .
evaluación de rendimientos basados en energfa en la generación de"ATP . . .
158
1
.
59
161
Termodinámica, energía libre estándar
130
de hidrólisis de algunos compuestos fosforilados . . .
Transferencia de calor en fermentación en un reactor
.
132
aeróbico
437
reactores equipados con:
de algunas reacciones biológicamente importantes
133
Termodinámica de los procesos bioquímicos
431
..,433
434
serpentines de placa
vertical
ciclo energético
435
raspada Transferencia de masa superficie
delascélulas....
134
hidrólisis del ATP
137
evaluación de entalpía y calor de combustión
140
datos termodinámicos de algunos compuestos representativos
43 5
444
coefic¡ente de transferencia de oxígeno, determinación
450
oxidación de una solución de sulfito de sodio
450
141 145
balance de oxfgeno método estático método dinámico
455
coeficiente de transferencia de
457
142
calor de combustión calor de reacc¡ón disipación de energía eficiencia termodinámica .
.
146
eficiencia energética del crecimiento microbiat'. . .
.
149
.y
camisa serpentín tubosverticales...
451
452
masa
evaluación
460
fracción volumétrica determinación del calor de combustión de las células y otros compuestos
del gas en la fase 151
Thiele, modulo
249 2
Transferencia de calor eir fermentación
424
área de transferencia balance de energía
425
428
coeficiente de transferencia de calor
528
429 .
436
462
difusión de oxígeno
enfrascosT...
482,485
difusión de oxígeflo
Tipos básicos de células
en condiciones inestables en recipientes agitados . . . .
dispersa
a través de
capilares :., . . ,
.
dispersión de aire eri sistemas sin agitación mecánica
con agitación mecánica . . . en un reactor aeróbico evaluación de los gases producidos du!.ante la fermentación en reactores a escala de laboratorio . . . .
487
462
.
463 465
.
467
\ t.-,ú
I
Velocidad especffica
Transferencia de masa
de consumo de sustrato, crecimiento de biomasa y formación de
toma de muestfas lfquidas
y gaseosas y evaluación
del caudal de los gases producidos durante la fermentac¡ón aceto-butflica .
producto
. 468
transporte de oxígeno en biorreactores para el cultivo de tejidos
animales
4
\r,
Velocidad inicial de una reacción catalizada por una
enzima
480
de crecimiento de biomasa . de crecimiento: influencia de la concentración de biomasa, Modelo de
Meyrath
54
.
266
288
191
-.§
u
529