NGUYỄN VĂN MÙI
ENZYM HỌC ^m síÊ ^m Ể Ê Ê Ê Ể Ê Ê Ê Ê Ê Ê Iẳ^,..
M
NGUYỄN VĂN MÙI
ENZYM HỌC
NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM
MỤC LỤC • * Mục lục................................................................................................................. 3 Mổ đầu......................................................................................................... 7 Chương 1. GIỚI THIỆU s ơ L ư ợ c VỂ ENZYM 1 .1 . Enzym trong thời kỳ cổ đại............................................................................ 9 1.2. Enzym học trong thế kỷ XVIII - IXX........................................................... 10 1.3. Sự phân bô"của enzym trong tế bào.............................................................. 12 1.4. Sụ phát triển nghiên cứu cơ chế xúc tác của enzym......................................13 1.5. Các nghiên cứu về cấu trúc enzym............................................................... 15 1.6. Hầu hết các enzym là các protein................................................................ 16 1.7. Đặc tính của enzym......................................................................................18 1 .8 . Nghiên cứu enzym hiện nay.........................................................................19 1.9. Enzym và bệnh di truyền............................................................................ 23 Chương 2. CÁC THÀNH PHẦN CẤU TRÚC CỦA PHÂN TỬ ENZYM 2.1. Thành phần cấu tạo.................................................................................... 26 2 .2 . Các axit amin...............................................................................................27 2.2.1. Những đặc tính của chuỗi bên axit amin.............................................. 28 2.2.2. Axit amin là các chất axít và bazơ........................................................ 32 2.2.3. Sự gắn cation và liên kết kim loại......................................................... 34 2.2.4. Gắn anion và polyanion........................................................................35 2.2.5. Sự hình thành liên kết đồng hoá tr ị......................................................35 2.2.6. BỒ' trí trong không gian........................................................................ 37 2.3. Một sô'cofatơ trong enzym........................................................................... 38 2.4. Trung tâm hoạt động của enzym................................................................. 42 2.5. Cấu trúc nhiều chuỗi và cấu trúc dị lập thể của enzym................................44 2.5.1. Câu trúc nhiều chuỗi (Bậc 4).................................................................44 2.5.2. Enzym dị lập thể (Allosteric enzyme)....................................................45 2.5.3. Phức hợp nhiều enzym (multienzyme)..................................................49 2.5.4. Các tiền chất enzym và sự hoạt động của chúng....................................50 Chương 3. CÂN BẰNG LIÊN KET p r o t e i n - PHỐr TỬ 3.1. Hằng số cân bằng phân ly, ......................................................................60 3.2. Động học vổi trạng thái cân băng................................................................ 62 3.3. Các phép đo liên kết ỏ trạng thái cân bằng..................................................64 3.3.1. Nguồn gốc của đưòng đẳng nhiệt Langmuir..........................................64 3.3.2. Các vị trí nhiều liên k ết........................................................................67 3.3.3. Sửa chữa đôì với liên kết không đặc hiệu.............................................. 70 3.4. Phân tích đồ thị của dữ liệu liên kết phối tử ò trạng thái cằn bằng.............. 71 3.4.1, Các đồ thị trực tiếp dạng bán logarit (semilog)..................................... 72 3.4.2. Những biến đổi tuyến tính của dữ liệu liên kết các đồ thị Wolff............74 3.5. Liên kết ở trạng thái cân bằng vổi sự loại bỏ phôi tử (các tương tác liên kết chặt)......................................................................... 77 3 .6 . Sự cạnh tranh của nhiều thụ thể vào một vị trí liên kết chung....................78 Chương 4. ĐỘNG HỌC CỦA PHẨN ỨNG ENZYM 4.1. Thài gian tiến hành của phản ứng enzym....................................................82 4.2. Ảnh hưâng của nồng độ cd chất đến tốc độ phản ứng xúc tác enzym............ 84 4.3. Mô hình tốc độ cân bằng của động học enzym.............................................. 87 4 .4 . Mô hình trạng thái ổn định của động học enzym.........................................89 3
4.5. Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ủng có thê biểu thị định lượng..............................................................................94 4 .6 . Ý nghĩa của VcựcJại và là đơn vị đổi với mỗi enzym................................... 97 4.7. Phép đo thực nghiệm giá trị k xúc tác và Km................................................101 4.7.1. Phép xác định theo biểu đồ dựa trên các dữ liệu không biến thiên.... 101 4.7.2. Đồ thị Lineweaver - Burk của động học enzym................................... 105 4.8. Những tháy đổi tuyến tính khác của số liệu động học enzym..................... 110 4.8.1. Đo thị Eadie - Hoftee........................................................................... 110 4.8.2. Đồ thị Hanes —Wolff............................................................................I l l 4.8.3. Đồ thị môt chiều Eisenthal —Ccornich —Bowden.................................112 4.9. Phép đo tại nồng độ cơ chất thấp.................................................................112 4.10. Độ lệch từ động học hypecbol................................ .................................... 114 4.11. Đọng học trạng thái tien ổn định có thể cung cấp bằng chứng cho các bưốc phản ứng đặc biẹt..................................................................118 4.12. Động học enzym một cơ chất, hai sản phẩm............................................ 119 4.13. Các phan ứng enzym với nhiều cơ chất..,.,..,,........................................... 119 4.13.1. Đặt tên phản ứng............................................................................... 120 4.13.2. Cẩc cơ chế phản ứng bi b i...................................................................121 4.13.5.Sử dung phương pháp King - Altman để xác định các phương trình tốc độ... 7...............................................................126 Chương 5. CÁC Cơ CHẾ x ứ c TÁC HOÁ HỌC CỦA ENZYM 5.1 Các liên kết giữa enzym và cd chất......... ................................................... 130 5 .2 . Sự tạo thành phức hợp enzyra - cơ chất (ES)............................................ 134 5.3. Sự tương đồng của trung tâm hoạt động với cở chất.................................. 135 5.4. Gia tăng tốc độ phản ứng nhờ sự bền vững trạng thái chuyển tiếẹ......... 140 5.5. Những cơ chếhoá học của quá trình làm bền hoá trạng thái chuyên tiếp.... 144 5.5.1. Sự tương đối cua chất phản ứng............................................................144 5.5.2. Xúc tác cộng hoá trị.............................................................................. 147 5.5.3. Xúc tác axit bazơ chung........................................................................154 5.5.4. Nhũng xoắn vặn hình thể................... ................................................. 159 5.5.5. Sự bổ sung trung tâm hoạt động tiền sắp xếp vổi trạng thái chuyển tiếp............................... .....................................166 5.5.6. Tương tác yếu giữa enzym và cơ chất được tối ưu hoá ở trạng thai chuyển tiếp........................................................................169 5.6. Các serin proteaza là một ví dụ minh hoạ.................................................... 172 5.7. Tốc độ phản ứng của enzym........................................................................ 177 5.8. Một vài nguyên lý giải thích khả năng xúc tác và đặc hiệu của enzym..... 180 5.9. Enzym dùng năng lượng liên kết để xúc tác phản ứng và tạo ra tính đặc hiệu phan ứng...............................................................................181 5.10. Vai trò của các nhóm chức năng trong phân tủ enzym.............................. 183 5.10.1. Khóm imidazol của histidưi..... ......................................................... 184 5.10.2. Nhóm Hydroxyl của serin...................................................................187 5.10.3. Nhóm e —amin của lysin.................................................................... 188 5.10.4. Nhóm cacboxy!................................................................................... 192 5.10.5. Nhóm sulfuhydryl.............................................................................. 193 5.10.6. Vai trò của các nhóm -SH trong phân tử enzym................................ 193 5.10.7. Vai trò của các nhóm disulfua trong phân tử enzym................... . 198 Chương 6. THỰC NGHIỆM ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM 6.1. Các phép đó vận tốc ban đầu.......................................................................200 6.1.1. Các phương pháp nghiên cứu trực tiếp,gián tiếp và kết hợp................ 200 6.1.2. Phân tích các đường cong diễn biến băng cách đo tốc độ trong trạng thái cân bằng...................................................................205 4
6.1.3. Phép đo liên tục chông lại điểm cuôì................................................... 210 6.1.4. Bắt đầu, hỗn hợp và kết thúc các phản ứng.........................................211 6.1.5. Sự quan trọng cua chạy kiểm tra........................................................ 214 6 .2 . Các phương pháp nghiên cứu.....................................................................215 6.2.1. Phân tích dựa trên phương pháp quang phổ.......................................216 6.2.2. Đo sự hấp thụ.....................................................................................217 6.2.3. Chọn bước sóng phân tích...................................................................218 6.2.4. Các tế bào quang học............. ............................................................ 218 6.2.5. Sai số’trong phép đo quang phố’hấp thụ............................................. 221 6.2.6. Đo sự phát huỹnh quang....................................................................222 6.2.7. Sự dập tắt nội huỳnh quang và chuyển năng lượng............................224 6.2.8. Sai sô”trong các phép đo huỳnh quang................................................227 6.2.9. Phép đo đồng vị phóng xạ...................................................................230 6.2.10. Sai sô' trong đo độ phóng xạ.............................................................. 233 6.2.11. Các phương pháp phát hiện khác..................................................... 234 6.3. Các phương pháp phân tách trong nghiên cứu enzym............................... 235 6.3.1. Sự phân tách các protein từ nhũng chất tan có khôi lượng phân tử thấp................................................................. 235 6.3.2. Các phương pháp phân tách sắc ký.................................................... 237 6.3.3. Phương pháp điện di trong các thí nghiệm enzym...............................243 6.4. Các yếu tổ’ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng enzym.............................. 250 6.4.1. Nồng độ enzym................................................................................... 251 6.4.2. Ậnh hưởng của pH..................................... ......................... ...............254 6.4.3. Ạnh hưởng của nhiệt độ......................................................................262 6.4.4. Ảnh hưởng của độ nhốt.....................................................................265 6.4.5. Các tác động của đồng vị trong động học enzym....... ..........................267 6.5. Báo cáo do liệu về hoạt động của enzym.................................................... 272 6 .6 . Độ ổn,định của mẫu enzym........................................................................273 6.6.1. Ôn định hoá enzym trong quá trình dự trữ .................. ...................... 273 6.6.2. Sự bất hoạt của enzym trong các thí nghiệm về hoạt tính...................276 Chương 7. CÁC CHẤT ỨC CHẾ 7.1. Các chất ửc chế thuận nghịch.................................................................... 280 7.1.1. Trạng thái cân bằng của quá trình ức chế thuận nghịch.................... 282 7.1.2. Các phương trình ức chế thuận nghịch............................................... 286 7.1.3. Trường hợp nhiều cơ chất................................................................... 291 7.1.4. Biểu đo minh hoạ các loại ức chê........................................................ 293 7.1.6. Quá trình gắn loại trừ nhau của hai chất ức chế................................ 307 7.2. Các chất ức chế liên kết chặt......................................................................310 7.2.1. Nhận biết sự ức chế liên kết chặt........................................................ 310 7.2.2. Phân biệt các loại chất ức chế liên kết chặt.........................................311 7.2.3. Xác định KjCho các chất ức chế liên kết chặt....................................... 315 7.2.4. Sử dụng các chất ức chế liên kêt chặt để xấc định nồng độ enzym hoạt động.................................................318 7.3. Sự ức chế phụ thuộc thòi gian.................................................................... 321 7.3.1. Các đưòng cong tăng dần cho các chất ức chế liên kết chậm............... 325 7.3.2. Phân biệt giữa các sơ đồ liên kết chậm................................................329 7.3.3. Phân biệt mô hình tương tác giữa chất ức chế và enzym.....................333 7.3.4. Xác định sự thuận nghịch................................................................... 334 Chương 8 CAC COENZYM 8.1. Giới thiệu về coenzym................................................................................337 8.2. Các nucleotit triphosphat.......................................................................... 338 5
8.2.1. Adenosin triphosphat (ATP)................................................................. 338 8.2.2. Uridin nucleotit................................................................................... 339 8.2.3. Xytidin nucleotit...................................................................................341 8 .2 .4 . Guanosin và Inosin nucleotit............................................................... 343 8.3. Coenzym HEM............................ ................................................................344 8.3.1. Cấu tạo hoá học và đặc tính của nhóm hem......................................... 344 8.3.2. Xytocrom...... .......... .............................................................................346 8.3.3. Một sốenzym khác có Hem..................................................................348 8.4. Một số vitamin liên quan đến coenzym........................................................350 8.4.1. Thiamin (vitamin Bị) và coenzym thiamin pyrophosphat.................... 351 8.4.2. Riboflavin (vitamin Bj) và coenzym flavin nucleotit............................. 355 8.4.3. Axit nicotinic (niaxin, vitamin pp, vitamin B3) và các pyridin nucỉeotit........................................................................ 358 8.4.4. Axit pantothenic (vitamin B5) và coenzym A....................................... 360 8.4.5. Vitamin Bfl và coenzym pyridoxal phosphat......................................... 362 8.4.6. Vitamin B12 và coenzym cobamit......................................................... 364 8.4.7. Biotin (Vitamin H) và coenzym............................................................ 367 8.4.8. Axit folic............................................................................................... 369 8.4.9. Coenzym quinon.................................................................................. 371 8.4.10. Axit lipoic........................................................................................... 372 8.5. Cốc coenzym khác........................................................................................373 8.5.1. Glutathion........................................................................................... 373 8 .5 .2 . S— adenosyl—metionin...........................................................................374 8.5.3. Coenzym protein sắt............................................................................ 375 Chương 9. ISOZYM 9.1. Đại cương về isozym....................................................................................377 9.2. Isozym lactat dehydrogenaza...................................................................... 379 9.2.1. Sự khử pyruvat thành lactat............................ ...................................379 9.2.2. Sự kiểm soát quá trình đưòng phân bởi isozym lactat dehydrogenaza ...379 9.3. Isozym hexokinaza..................................................................................... 380 9.4. Các isozym trong quá trình biến đổi aspartat............................................. 381 9.5. Isozym sucxinyl —CoA syntetaza................................................................382 9.6. Một sô"ứng dụng của nghiên cứu isozym.....................................................384 9.6.1. Điện di..'............. .7................................................................................384 9.6.2. Hiện màu các băng isozym.................................................................. 385 9.6.3. Phan tích hình ảnh các bảng điện d i............................................ ;......386 9.6.4. Tính trạng di truyền số lượng và các dấu chuẩn isozym lập bản đồ.... 389 9.6.5. Lập bản đồ gen.................................................................................... 393 9.6.6. ứng dụng trong phân loại, tiến hoá và đa dạng sinh học..................... 404 9 .6 .7 ! ĐSÌ VỔ1 Y học...7..............!............................ ................ ........................ 417 Chương 10. PHÂN LOẠI ENZYM 10.1. Giối thiệu về lịch sử phân loại enzym.......................................................419 10.2. Phân loại và các tên gọi của enzym...........................................................422 10.2.1. Ngúyên tắc chung..............................................................................422 1 0 .2 .2 . Các tên hệ thông và tên thưồng.........................................................425 10.2.3. Sơ đồ định loại và đặt số cho enzym.................................................. 426 10.2.4. Khoá đánh sô"và phân loại của các enzym......................................... 431 Tài liệu tham khảo........................................................................................... 439 i 6
MỞ ĐẦU
Trong th ế kỷ XXI đã chứng kiến sự phát triển chưa từng có của sinh học phân tử và công nghệ sinh học, đặc biệt là các ứng dụng của enzym. Các enzym là nền tảng xúc tác trong trao đổi chất, chính VI th ế nó được chú trọng trong nhiều sinh vật y học, trong các phát minh trị liệu công nghệ dược, trong lĩnh vực hoá sinh về tách dòng và biểu hiện các protein bằng các phương pháp sinh học phân tử,... Enzym là chất xúc tác cho các phản ứng sinh học, làm tăng tốc độ phản ứng cao hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Chúng có tính đặc hiệu cơ chất rấ t cao và xúc tác các phản ứng hoá học đặc biệt ỏ nhiệt độ, áp suất và pH bình thường, phần lớn các chất xúc tác khác đều không có đặc tính này. Enzym là chìa khoá quan trọng để hiểu biết cách tồn tại và nhân lên của tế bào. Chúng xúc tác hàng trăm phản ứng của chuỗi trao đổi chất giúp cho các chất dinh dưỡng bị phân giải, năng lượng được bảo toàn và chuyển hoá, các chất sinh học phân tử lớn được tạo thành từ các tiền chất đơn giản. Một số enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất với chức năng là các enzym điều hoà, những enzym này có thể phản ứng với các tín hiệu trao đổi chất khác nhau bằng cách thay đổi hoạt động xúc tác một cách hợp ]ý. Nhờ hoạt động của các enzym điều hoà mà các hệ thông enzym được phối hợp một cách nhịp nhàng để thực hiện các phản ứng trao đổi chất cần thiết cho sự sống. Một số’ dạng bệnh lý, đặc biệt là những bệnh di truyền liên quan đến sự thiếu hoặc m ất hoàn toàn một hay nhiều enzym trong mô. Những điều kiện không bình thưòng này có thể là do hoạt tính dư thừa của một enzym đặc hiệu. Sự đo hoạt độ các enzym đặc hiệu trong huyết tương, hồng cầu hoặc mẫu mô là rấ t quan trọng trong chuẩn đoán bệnh. Enzym đã trở thành một công cụ thực nghiệm quan trọng không chỉ trong y học mà còn trong công nghiệp hoá học, chê biến thực phẩm và nông nghiệp. Enzym đóng vai trò quan trọng, thậm chí trong các hoạt động hàng ngày như nấu ăn và vệ sinh nhà cửa,... Gần đây, ngưòi ta lại quay lại quan tâm đến các đặc tính lý hoá của các protein và tương tác của chúng với các đại phân tủ và các cấu tử có khối lượng thấp (ví dụ như các cơ chất, chất hoạt hoá, chất ức chế,...). 7
Do đó, việc nghiên cứu cấu trúc, động học, cơ chế xúc tác của enzym là những vấn đề cần thiết. Hiện nay cũng đã có một sô sách về enzym học, song tác giả thây cần có một tài liệu có các kiến thức cơ bản về lý thuyết enzym phục vụ cho dào tạo cử nhân, bác sỹ, kỹ sư, thạc sỹ, tiến sỹ có liên quan đến enzym, Đồng thòi tác giả cũng hy vọng cuốn sách này cũng được sử dụng trong các phòng thí nghiệm và trong công nghiệp. Trong ấn phẩm này không thể đề cập toàn diện lĩnh vực enzym học. Nhìn chung, mục đích của cuốn sách là hướng chúng ta có cái nhìn bước đầu trong thí nghiệm và trong suy nghĩ về enzym. Nó cung cấp các phương pháp hộc trong thí nghiệm và xử lý số’ liệu đê cho phép một người mối bắt đầu thiết kế và tiến hành thí nghiệm với enzym, đồng thòi cung cấp một cái nhìn lý thuyết để có thể hiểu được các thí nghiệm. Cuốn sách E n zy m học gồm 10 Chương: C hương 1. Giới thiệu sơ lược về enzym; C hương 2. Các thành phần cấu trúc của phân, tử enzym; C hương 3. Cân bằng liên kết protein - phối tử; C hương 4. Động học của phản ứng enzym; C hương 5. Các cơ chế xúc tác hoá học của enzym; C hương 6. Thực nghiệm đo hoạt độ enzym; C hương 7. Các chất ức chế; C hương 8. Các coenzym; C hương 9. Isozym; C hương 10. Phân loại enzyme, Về th u ật ngữ khoa học trong cuốn sách, tác giả dựa vào các cuôn từ điển hoá học, sinh học và y học, riêng Chương 10 (Phân loại enzyme) tác giả dùng các th u ật ngữ khoa học bằng tiếng Anh để bạn đọc không bị nhầm lẫn. Với trìn h độ có hạn, chắc chắn quyển sách này còn nhiều thiêu sót, chúng tôi mong bạn đọc thông cảm và xin chân thành tiếp thu những ý kiến đóng góp để lần xuất bản sau sách được hoàn thiện hdn. Mọi ý kiên đóng góp xin gửi vể Công ty Sách Đại học - Dạy nghề, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 25 Hàn Thuyên, Hà Nội. Xin trân trọng cảm ơn. Tác giả NGUYỄN VẨN MÙI 8
Chương 1
GIỚI THIỆU Sơ LƯỢC VỂ ENZYM 1.1. ENZYM TRO N G THỜI KỲ c ổ ĐẠI
Tài liệu lâu đời nhât nói đên việc sử dụng enzym trong thương mại là bản mô tả việc sử dụng enzym làm rượu của hãng Cođex ỏ Hammurabi (Babilon cổ đại, vào khoảng năm 2 1 0 0 trước Công nguyên). Việc sử dụng vi sinh vật như các nguồn enzym cho quá trình lên men đã phổ biến trong cuộc sống người cổ đại. Các tài liệu viết về quá trình này có thể được tìm thấy trong các bản viết tay không chỉ ỏ Babilon mà còn từ thòi kỳ đầu nền văn minh của Roma, Hy Lạp, Ai Cập, Trung Quốc, Ân Độ. Các bản viết cổ cũng đã đưa ra các tài liệu tham khảo về quá trình sản xuất giấm, một quá trình dựa trên việc dùng enzym để chuyển hoá rượu thành axit axetic. Giấm là một m ặt hàng thông dụng trong đời sống cổ đại và được dùng không chỉ cho viộc dự trữ và chuẩn bị đồ ăn mà còn được dùng cho các mục đích chữa bệnh. Các sản phẩm làm từ sữa cũng ỉà một nguồn thức ăn quan trọng trong các xã hội cổ đại. Vì trong thời kỳ này, ngưòi ta không thể cất trữ sữa tươi trong bất cứ khoảng thòi gian mong muôn nào, việc chuyển hoá sữa thành phomat trở thành một phần sông còn trong sản xuất thức ăn, nhờ đó người nông dân có thể mang được sản phẩm của mình tổí nhũng khu vực chợ xa và sản phẩm vẫn ở trạng thái chấp nhận được. Người ta làm phomat bằng cách làm đông sữa nhò hoạt động của một số enzym. Trong thòi kỳ cổ đại, những chất thông thường nhất dùng cho mục đích này là fixin, một chất chiết thu được từ cây vả và rennet, một chất từ niêm mạc dạ dày thứ tư của động vật đa dạ dày như bò. Tư liệu này có thể được tìm thây trong tác phẩm kinh điển của Homer, chuyện cổ Iliat: “Nước quả của cây vả làm đông sữa và làm đông đặc toàn bộ sữa lỏng đó trong một khoảnh khắc nhanh đến mức mà người Paeaon ngăn chặn được sao Hỏa hung dữ ngay lập tức”. Tương tự như vậy, nhà triết học Aristot cũng đã nhiều lần viết về quá trình làm đông sữa và đưa ra giả thuyết về hoạt động của chất rennet: “Rennet là một loại giống như sữa, nó được tạo thành trong dạ dày của các động vật non trong khi vẫn đang được cho bú. Vì thế, rennet là sữa có nguồn gốc từ lửa (contains fire) sinh ra từ con vật trong quá trình tiêu hoá sữa”. 9
Một thực phẩm chủ yếu nữa có m ặt qua suốt các thời kỳ là bánh mỳ. Việc làm nở bánh mỳ bằng nấm men (do hoạt động của enzym tạo ra C 02) đã được nhiều người biết đến và được dùng rộng rãi trong thời kỳ cổ dại, và không phải là thái quá nếu nói quá trình này đối với xã hội cổ đại là rấ t quan trọng. Việc làm mềm th ịt là một quá trình nữa trên enzym và quá trình này cũng đã được sử dụng từ thòi kỳ cổ đại. Cư dân sông trên nhiều đảo ở Thái Bình Dương đã biết từ nhiều thê kỷ là nước ép từ quả đu đủ sẽ làm mềm ngay cả các loại thịt dai nhất. Enzym hoạt động chiết ra từ thực vật này là papain, là loại enzym proteaza. Hiện nay papain vẫn được sử dụng là chất làm mềm thịt được bán trên thị trường. Khi hải quân Anh lần đầu tiên thám hiểm các đảo Thái Bình Dương năm 1700, họ đã thấy người ta sử dụng quả đu đủ như là một chất làm mềm thịt và để điều trị bệnh nấm da. Các báo cáo về việc sử dụng quả đu đủ của người địa phương gây ra cho Châu Âu ở th ế kỷ XVIII một sự chú ý lớn và có thể phần nào đã dẫn đến việc các nghiên cứu về enzym tiêu hoá được hệ thống hơn, điều mà ngay sau đó đã xảy ra. 1.2. ENZYM HỌC TRO N G T H Ế K Ỷ XVIII - XIX
Trong khi những ngưòi cổ đại sử dụng hoạt tính của enzym vào việc thực tế thì những áp dụng thòi kỳ đầu này lại dựa hoàn toàn vào các quan sát thực nghiệm và các truyền thông dân gian hơn là bất kỳ các nghiên cứu có hệ thông nào hoặc sự am hiểu vể cơ sở hoá học của các quá trình được sử dụng. Vào thế kỷ XVIII và XIX, các nhà khoa học đã bắt dầu nghiên cứu các hoạt động của enzym một cách có hệ thông hơn. Quá trình tiêu hoá đưòng là một vấn đề được nghiên cứu rộng rãi. Trong khi bán khoăn làm sao mà loài chim săn mồi lại có thể tiêu hoá được th ịt mà không cần có một cái mề, nhà khoa học nổi tiếng Réaum ur người Pháp (1683 —1757) đã thực hiện một số nghiên cứu sớm nhất về sự tiêu hoá của loài chim ó Butêo. Rổaumur đã thiết kế một ông kim loại với một tấm lưới sắt đặt ỏ một đầu để giữ cố định một miếng th ịt nhỏ và tránh được tác động hoá học của mô dạ dày. Ông đã thây được rằng, khi ông chứa th ịt được gắn vào dạ đày của con chim ó Butêo, miếng thịt sẽ bị tiêu hoá trong 24 giờ. Từ đó ông đã đi đến kết luận là: sự tiêu hoá chắc chắn phải là một quá trình hoá học chứ không phải chỉ là những quá trình vật lý, vì miếng thịt trong ông đã được tiêu hoá bởi sự tiếp xúc vói dịch vị (hoặc như ông gọi là “một dung môi”). Ông cũng đã thử nghiệm như thê" với một miếng xương và một mẩu thực vật. Ông thấy 10
rằng, trong khi miếng thịt được tiêu hoá và mảnh xương bị mềm ra nhiều bởi sự hoạt động của dịch vị thì mẩu thực vật vẫn trơ trước “đung môi” này (dịch vị). Đây có thể là thực nghiệm đầu tiên chứng minh về đặc tính của enzym. Công trình của Réaumur đã được Spallanzani (1729 - 1799) mỏ rộng. Spallanzari đã chỉ ra rằng, sự tiêu hoá thịt trong ổng kim loại cũng xảy ra trong dạ dày của nhiều loài động vật khác, kể cả con người. Sử dụng chính dịch vị của mình, Spallanzari đã tiến hành các thí nghiệm về sự tiêu hoá trên các mẫu thịt trong phòng thí nghiệm. Những thí nghiệm này đã chứng minh cho một số nét đặc trưng quan trọng của thành phần hoạt động chứa trong dịch vị: bằng cách sử dụng thí nghiệm đối chứng khi xử lý thịt với một lượng nước tương đương, quá trình tiêu hoá thịt đã không xảy ra, Spallanzari dã chứng minh sự có m ặt của một thành phần hoạt động đặc biệt trong dịch vị. Ông cũng chỉ ra rằng, quá trình tiêu hoá phụ thuộc nhiệt độ và thòi gian cần thiết cho quá trình tiêu hoá đó gắn liền với lượng dịch vị dùng để tiêu hoá thịt. Cuối cùng ông đã chứng minh rằng, thành phần trong dịch vị hoạt động không bền khi ở ngoài cơ thể. Điều đó có ý nghĩa là, khả năng tiêu hoá thịt của dịch vị giảm dần theo thời gian cất giữ. Ngày nay chúng ta biết rằng, tất cả những đặc tính được để cập ở trên là những đặc điểm chung của các phản ứng enzym, nhưng ở thời kỳ của Spallanzari, những điều này là mới lạ và là những khám phá đầy hứng thú. Thồi gian này cũng chứng kiến những khám phá về các hoạt động của enzym trong rất nhiêu hệ sinh vật khác. Ví dụ: enzym peroxidaza từ cây cải ngựa đã được mô tả và hoạt động của enzym a - amilaza trong ngũ cốc cũng được quan sát. Tất cả các kết quả này đều gắn liền vâi các nguyên liệu là chất chiết thô từ thực vật hoặc động vật có hoạt tính enzym. Vào những năm 1850, Louis Pasteur cho rằng, quá trình lên men đường thành rượu bởi nấm men được xúc tác bởi các chất lên men. Pasteur giả định rằng, các chất lên men này (sau này được gọi là enzym) không thể bị phân tách khỏi các tế bào nấm men sông. Nhưng năm 1897, Eduard Buchner đã phát hiện được dịch chiết nấm men có thể lên men đường thành rượu. Chứng tỏ rằng các enzym liên quan đèn quá trình lên men vẫn có thể hoạt động cho dù bị tách khỏi cấu trúc của tế bào sông, Báo cáo của Buchner đưa ra một quan sát thú vị là: hoạt tính của nước cp nấm men giảm xuống trong vòng 5 ngày cất giữ ở nhiệt độ đóng băng. Tuy nhiên, nếu nước quả được bổ sung bằng đường mía thì hoạt tính còn lại nguyên vẹn hơn hai tuần trong ngăn đá. Đây có lẽ là 11
báo cáo đầu tiên về một hiện tượng ngày nay nhiều người biết đến, đó là sự ổn định của enzym nhờ cơ chất. Cũng trong khoảng thời gian này, khi nghiên cứu quá trình xúc tác trong nước chiết men rượu, Kiihme là người đầu tiên đưa ra thuật ngữ “enzym” (từ này bắt nguồn từ “enzymos” trong tiếng Hy Lạp thòi Trung cổ, liên quan đến quá trìn h nở bánh mỳ). Các phát hiện này đã thúc đẩy các nhà hoá sinh cố gắng tách chiết nhiều enzym khác nhau và xác định đặc tính xúc tác của chúng. 1.3. S ự PHÂN B Ố C Ủ A ENZYM TRONG T Ế B À O
Người ta thấy rằng, có những enzym có m ặt ỏ mọi mô tế bào. Mỗi loại mô thường có những hệ thông enzym đặc biệt. Một enzym cũng có thể có trong các mô khác nhau hoặc thậm chí có ở các bộ phận khác nhau của cùng một loại tế bào, cũng có thể khác nhau về lượng và có khi cả vể chất. Tê bào của cơ thể bậc cao thưòng có nhũng cấu trúc dưới tế bào như: nhân, ty thể, lạp thể, hệ thông lưới nội chất, ribosom,... Mỗi loại cấu trúc này đểu có cấu trúc và chức năng riêng vối những hệ enzym đặc hiệu. Những enzym này hoặc hoà tan trong dịch lỏng, hoặc gắn chặt vào các màng của cấu trúc đó. Do cấu trúc đặc hiệu như vậy của tế bào, enzym được phân bô" thành từng ngăn đặc biệt, Sự khu trú và sắp đặt các enzym một cách hợp ]ý trong các cấu trúc của tế bào, làm cho các phản ứng enzym có tính chất định hưóng, có phối hợp tác dụng với nhau và tạo ra nhũng hệ thông phản ứng dây chuyền liên tục, nhịp nhàng ăn khớp với nhau. Ty thể được coi là “nhà máy cung cấp năng lượng”, có chứa hầu hết các hệ enzym có liên quan đến quá trình chuyển hoá năng lượng. Trong các hệ enzym của ty thể phải kể đến hệ enzym của chuỗi hô hấp tế bào và của quá trình phosphoryl hoá tạo ATP. Tuy thấy xytocrom ở ngoài ty thể, nhưng xytocrom oxidaza chỉ thấy có trong ty thể. Ngoài những enzym kể trên, ty thể còn có hệ enzym xyclophoraza bao gồm toàn bộ các enzym của chu trình Krebs. Có thể tìm thấy một số enzym của chu trình này trong tê bào chất như isoxitrat dehydrogenaza, m alat dehydrogenaza,... Nhưng hệ thống enzym hoàn chỉnh của chu trình này thì chỉ tìm thây trong ty thể. Người ta cũng tìm thấy các hệ enzym tổng hợp axit béo, phân giải axit béo và nhiều enzym khác trong ty thể. Cách sắp đật các enzym kể trên trong ty thể có liên quan chặt chẽ với nhau để đảm bảo cho các quá trình chuyển hoá phối hợp nhịp nhàng. Lysozym có chứa nhiều enzym thuỷ phần (hydrolaza) có tác dụng phân giải nhiều loại phần tỏ lớn như axit nucleic, protein, lipit,
12
mucopolysaccarit và nhiều phân tỏ lớn khác thành những phân tử nhỏ, các phân tử nhỏ này lại được chuyển hoá dưới tác dụng của các enzym của ty thể. Thông thường các enzym được bọc kín trong màng lipoprotein của lysosom và do đó không có tác dụng vói các cơ chất trong nguyên sinh chất. Một khi màng lysosom bị phá vỡ, hoặc bị tổn thương, các hệ enzym của nó được giải phóng ra sẽ làm tiêu huỷ cả tế bào. Các hạt ribosom dính trên hệ thống lưới nội chất nguyên sinh chất là ndi tổng hợp protein, do đó có các hệ enzym của quá trình tổng hợp protein. Nguyên sinh chết là phần lỏng của tế bào có chứa nhiều loại enzym, có tấ t cả các enzym phân giải đường (con đường Embden Meyerhof). Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng, con đường này hoạt động chủ yếu ở nguyên sinh chất, nhiều enzym của con đường này có thể dính ở màng ngoài của hệ thông lưới nội chất nguyên sinh chất, có những enzym gắn sâu vào màng của hệ thống này. Sản phẩm pyruvat của con đưòng đường phân được vận chuyển qua màng vào ty thể để tiếp tục cacboxyl oxy hoá khử thành axetyl —CoA rồi vào chu trình Krebs. Cần chú ý rằng, các cấu trúc màng trong tế bào có tính thấm chọn lọc, nhiểu chất chuyển hoá không qua được màng của ty thể. Ví dụ như oxaloaxetat, isoxitrat, NADHg, NADPH2. Chính tính thấm chọn lọc này làm tăng thêm tính đặc hiệu của các ngăn trong tế bào. Một điểu đáng chú ý nữa là trong tế bào sông nguyên vẹn, enzym thường chưa hoạt động tôi mức tối đa và những điều kiện trong cơ thể cũng chưa phải là điểu kiện thích hợp nhát cho sự hoạt động của enzym. Đây chính là những diều kiện quan trọng giúp cho cơ thể điều hoà các quá trình chuyển hoá. 1.4. S ự PH ÁT TRIỂN NGHIÊN c ứ u c ơ C H Ế x ú c TÁ C C Ủ A ENZYM
Khi enzym đã được tinh sạch, hoặc tinh sạch một phần thì sự chú ý của các nhà khoa học lại hướng tới việc đạt được những hiểu biết sâu hơn về cơ chế phản ứng được enzym xúc tác. Khái niệm cho rằng, các enzym tạo thành phức chất với các phân tử cơ chất của chúng lẫn đầu tiên được trình bày rõ ràng vào cuối thế kỷ XIX. Vào thòi gian này, Emil Fischer đã đề xuất mô hình “chìa khoá và ổ khoá” cho mốì quan hệ hoá học theo khuôn giữa các enzym và cơ chất của chúng. Mô hình này đã được xây dựng dựa trên nhiều số' liệu thí nghiệm về đặc tính rập khuôn của enzym. Vào đầu thế kỷ XX, bằng chứng thực nghiệm về sự tạo thành một phức hệ enzym - cơ chất như một chất trung gian của phản ứng đã sớm được công bố. Một trong những nghiên cứu sớm nhất của Brown công bố năm 1902 là nghiên cứu về tốc độ của các phản ứng do enzym xúc tác. Brown đã 13
quan sát thấy rằng, không giông như các phản ứng hoá học có tốc độ bị giói hạn bởi khuếch tán, trong các phản ứng có enzym xúc tác “có thể dễ dàng nhận thấy, thòi gian cho các phân tử chuyển hoá và kết hợp có thể đủ lâu làm ảnh hưởng đến tiến trình chung của phản ứng”. Sau đố Brown tiếp tục tống hợp những dữ liệu sản có để củng cố cho khái niệm về sự hình thành một phức hợp enzym - cơ chất. Có lý do để tin rằng, trong khi chuyển đổi đường mía nhờ enzym nghịch đảo thì đưòng kết hợp với enzym trưốc khi chuyển dổi. c. O’Sullivan và Tompson,... đã cho thấy khi có m ặt đưòng mía, hoạt tính của enzym nghịch đảo vẫn được duy trì, nếu không có đưàng mía thì hoạt tính của enzym sẽ bị m ất hoàn toàn và coi điều này như là dấu hiệu của sự kết hợp của enzym với các phân tử đường. Wurtz (1880) đă cho thấy papain dường như tạo thành hợp chất không tan với fibrin trước khi bị thuỷ phân. Hơn nữa, gần đây hơn, khái niệm của E. Fischer về hình dạng và hoạt tính của enzym cũng hàm ý nói tới dạng liên kết nào đó của enzym với cơ chất phản ứng. Những quan sát tương tự như vậy đã giúp cho việc đưa ra các phương trinh tốc độ enzym, khi sủ dụng toán học để mô hình hoá động học enzym có sự tham gia của phức hợp trung gian enzym - cd chất. Vào năm 1903, Victor Henri đã công bô" mô hình toán học đầu tiên thành công trong việc mô tả động học enzym. Vào năm 1913, trong một tò báo dược phát hành rộng rãi, Michaelis và Menten đã phát triển công trình trước đây của Henri và đưa ra phương trình tốc độ enzym mà ngày nay mang tên họ. Phương trinh Michaelis —Menten, hay nói đúng hơn là phương trình Henri - Michaelis —Menten, là nền tảng cho nhiều nghiên cứu hiện đại về các cơ chế của phản ứng enzym. Câu hỏi về việc, các enzym làm tăng tốc độ các phản ứng hoá học như th ế nào đã làm cho các nhà khoa học bối rối, cho đến khi có sự phát triển của lý thuyết về trạng thái chuyển tiếp vào đầu nửa th ế kỷ XX. Vào năm 1948, nhà lý hoá học nổi tiếng Linus Pauling đã đổ xuâ't rằng, enzym làm tăng tốc dộ được là nhò sự ổn định của trạng thái chuyên tiếp của phản ứng hoá học khi tương tác với vị trí enzym hoạt động. Giả thuyêt này đã được chấp nhận rộng rãi và đã được chứng minh thông qua các quan sất thực nghiệm: Các enzym liên kết rấ t chặt chẽ với các phân tử được thiết kế sao cho cấu trúc của các phân tỏ này giông hệt cấu trúc của trạng thái chuyển tiếp của phản ứng xúc tác. Trong những năm 1950 và 1960, các nhà khoa học đã xem xét lại câu hỏi: làm sao enzym có được cơ chất đặc hiệu để ổn định được trạng thái chuyển tiếp ỏ vị trí hoạt động của enzym. Các giả thuyết mổi, chẳng 14
hạn như mô hình “tạo ra sự khớp hợp” của Koshland đã nổi lên trong thời gian này giúp giải thích cho sự cần thiết cạnh tranh của ái lực liên kêt cơ chât và hoạt động làm tăng tôc độ phản ứng nhờ enzym. Trong suôt khoảng thòi gian này, các nhà khoa học đã cô" gắng để có thổ hiểu được các kêt quả quan sát, trong đó các hoạt động biến đổi chất của enzym có thế được quy định bởi các phân tử nhỏ chứ không phải cd chất, hoặc sản phẩm trực tiêp của enzym. Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng, tương tác gián tiếp giữa các vị trí liên kết nhất định trong một phân tử enzym có thể xảy ra, thậm chí cả khi các vị trí liên kết này cách xa nhau. Năm 1965, Monod, Wyman và Changeux đã phát triển học thuyết về sự chuyển hoạt tính enzym để giải thích các quan sát này. Nhờ vào tài liệu mang tính bước ngoặt này mà ngày nay chúng ta biết rằng, râ't nhiều loại enzym và protein liên kết với phôi tử không có tính chất enzym cũng có khả năng điều chỉnh sự chuyển hoạt tính enzym. 1.5. C Á C NGHIÊN c ứ u VỀ CẤU TRÚC ENZYM
Một trong những nguyên lý của enzym học hiộn đại là sự xúc tác đó có quan hệ m ật thiôt với sự tác động qua lại giữa một phân tử cơ chất và các hợp phần của phân tử enzym, bản chất và trình tự của những tác động qua lại này xác định cơ chế xúc tác. Vì thế, việc áp dụng các phương pháp vật lý để làm sáng tỏ cấu trúc của enzym đã có một bề dày lịch sử và ngày nay nó tiếp tục trở thành vấn để tối quan trọng. Các phương pháp quang phổ, nghiên cứu tinh thể bằng tia X và gần đây hơn, các phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều đã cho phép thu được những hiểu biết phong phú về cấu trúc, và dựa vào đó, các lý thuyết vể cơ chế enzym đã được xây dựng. Trong giai đoạn đầu của th ế kỷ XX, chụp tinh thể bằng tia X đã trở thành phương pháp quan trọng hàng dầu để nghiên cứu các phân tử nhỏ. Nồm 1926, Jam es Sumner đã tách chiết và kết tinh ureaza tạo ra một bước đột phá trong việc nghiên cứu đặc tính các enzym đặc hiệu. Sumner phát hiện ra rằng, tinh thể ureaza bao gồm toàn bộ là protein và từ đó cho rằng, tất cả enzym đều là protein. Vì thiếu các dẫn Jam es Sum ner J.B.S. Haldane liệu khác nên ý kiến này vẫn là 1887-1955 1892-1964 một để tài tranh luận sôi nối. 15
Câu trúc tinh thể enzym của Sumner đã mở rộng cánh cửa và đã nhanh chóng có thêm nhiều báo cáo về nhiều tinh the enzym khác. Trong vòng 20 năm kể từ tài liệu đầu tiên của Sumner, hơn 130 tinh thể enzym đã được công bô'. Tuy nhiên, chỉ đến cuối những năm 1950, các cấu trúc protein đó mới bắt đầu được chứng minh thông qua ảnh chụp tinh thể bằng tia X. Năm 1930, khi John Northrop và dồng sự của ông kết tinh được pepsin, trypsin và phát hiện được chúng cũng là protein. Trong suô't thời gian này, J. B. s. Haldane viết luận án có tên “enzym”. Mặc dù bản chất của phân tử enzym chưa được đánh giá cao, nhưng cuổn sách này vẫn đề cập đến giả thiết là có sự tương tác yếu giũa enzym và cơ chất của nó, có thể được dùng để phân huỷ cơ chất và xúc tác phản ứng. Năm 1957, từ kết quả nhiễu xạ tia X, Kendren là người đầu tiên suy ra toàn bộ cấu trúc ba chiều của myoglobin. Không lâu sau đó, các cấu trúc tinh thể của nhiều protein, bao gồm cả các enzym cũng đã được chứng minh bằng phương pháp này. Vào cuôì th ế kỷ XX, phần lớn là những nghiên cứu về enzym xúc tác cho phản ứng trao đôi chất tế bào, từ đó dẫn đến việc tinh sạch hàng Hình 1.1. Các tinh thể pyruvat kinaza, ngàn enzym (Hình 1.1) đã làm sáng một enzym của con đường đường phân. tỏ cấu trúc và cơ chế hoá học của Tinh thể protein có độ sạch cao và cấu trúc đồng nhất. (Nguồn: Lehninger A.L., hàng trăm enzym và sự nhìn nhận Nelson D.L., Cox M.M., Principles of chung về phương thức hoạt động Biochemistry, 1993) của enzym. Ngày nay, các hiểu biết về cấu trúc thu được từ những nghiên cứu ảnh chụp tinh thể bằng tia X và cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều thường được sử dụng để làm sáng tỏ các chi tiết về cơ chế xúc tác của enzym và đê điều chế các phối tử mới (cơ chất và các phân tử cản trở tác dụng hoá học) để liên kết vào những vị trí nhất định trong phân tử enzym. 1.6. HẦU H ẾT C Á C ENZYM L À C Á C PROTEIN
Việc suy ra cấu trúc ba chiều từ phương pháp nhiễu xạ tia X, hoặc cộng hưởng từ hạt nhân dựa vào hiểu biết vềsự sắp xếp các axit amin 16
dọc theo chuỗi polypeptit của protein, sự sắp xếp này được biết đến như là trình tự axit amin. Để xác định trình tự axit amin của một protein, các axit a min phải được thuỷ phân theo kiểu chuỗi nối tiếp nhau từ chuỗi polypeptit và được nhận dạng bằng phân tích hoá học, hoặc bằng phương pháp phân tích sác ký. Edman và các đồng sự đã xây dựng phương pháp thuỷ phân các axit amin theo trình tự từ đầu N cuối của chuỗi polypeptit. Năm 1957, sử dụng phương pháp của Edman, Sanger lần đầu tiên đã công bô" về trình tự axit amin của một protein hormon insulin. Nãm 1963, lần đầu tiên trình tự axit amin của ribonucleaza cũng đã được công bô". Qua các nghiên cứu cho thấy rằng, tất cả các enzym đều là các protein, trừ một nhỏm nhỏ các phân tỏ ARN cố hoạt tính xúc tác. Hoạt tính xúc tác của enzym phụ thuộc vào sự nguyên vẹn của cấu hình riêng protein nguyên thuỷ của chúng. Nếu một enzym bị thuỷ phân thành các axit amin, thì hoạt tính xúc tác của nó sẽ bị mất hoàn toàn. Do đó cấu trúc bậc 1, 2, 3 và 4 của các protein enzym rất cần thiết cho hoạt tính xúc tác của chúng. Enzym cũng giông các protein khác, chúng có khôi lượng phân tử khoảng từ 12.000 Dal đến 1.000.000 Dai. Một sô' enzym không cần phải có bất cứ một nhóm hoá học nào ngoài axit amin (enzym một thành phần enzym đơn giản). Một sô" khác đòi hỏi phải có một thành phần hoá học thêm gọi là cộng tô" - cofactd (enzym hai thành phần - enzym phức tạp). Cộng tổ’này có thể là một, hoặc nhiều ion vô cơ như Fe2+, Mg2+, Mn?+, hoặc Zn2+ (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Một sô' enzym có, hoặc đửi hỏi các nguyên tô' vô cơ như là cofactd (cộng tố) F e*hoặcFe*
C ác xytocrom , catalaza, peroxidaza, ferredoxin
Cu* (Cu+)
Xytocrom oxidaza, tyrosinaza
Zní+
Cacbonic anhydraza, alcohol dehydrogenaza, cacboxypeptidaza
Mg *♦
Phosphohydrolaza, phosphotransferaza, glucoza-6-phosphataza, pyruvat kinaza
Mn24
Arginaza, phosphotransferaza, ribonucleotit reductaza
K’
Pyruvat phosphokinaza (cũng cần Mg2*)
Na*
ATPaza màng plasma (cũng cần K" và M g2')
N
Ureaza
Mo
Dinitrogenaza
Se
Glutathion peroxidaza
17
Hoặc là một phân tử hữu cơ phức hợp hay chứa kim loại gọi là coenzym (Bảng 1.2). Bảng 1.2. Một số coenzym thực hiện sự chuyển các nguyên tử đặc biệt, hoặc các nhóm chức Coenzym Thiamin pyrophosphat Flavin adenin dinucleotit Flavin mononucleotit
Vi dụ m ột s ố nhóm hoá h ọ c được chuyển Aldehyt Các điện tử
Tiền chất dinh dưdng trong động v ật có vú Thiamin (vitamin B,) Riboflavin (vitamin Bj)
Nicotinamit adenin dinudeotit
lon hydro (:H")
Axit nicotinic (niaxin)
Coenzym A
Nhóm axyl
Axit pantotenic, các phân tử khác
Py ri doxa 1ph QSphat
Nhóm amin
Pyridoxin (vitamin B6)
5-Deoxiadenosyl cobalamin (coenzym B(?)
Nguyên tử H vả nhóm axyl Vitamin B,
Bíoxytin
CO ị
Biotin
Tetrahydrofolat
Các nhóm 1 cacbon
Folat
Axit lípoat
Các điện tử và nhóm axyl
Không đòi hổi trang thút ăn hàng ngày
Rất nhiều vitamin, các chất dinh dưỡng hữu cd cần vói một lượng nhỏ trong bữa ôn là các tiền chất của enzym. Một số enzym bị biến đổi bôi quá trình phoaphoryl hoá, glycosyl hoá và các quá trình khác. Phần nhiều sự biến đổi này là để điểu hoà hoạt tính enzym. 1.7. Đ Ặ C TÍNH C Ủ A ENZYM
Bản chất của enzym là protein có cấu tạo phân tử rấ t phức tạp. Hiện nay, ngưòi ta đã xác định được cấu trúc phân tử của nhiều loại enzym. Enzym là các phân tử protein nên dễ hoà tan trong nước, hoặc trong dung dịch muối loãng. Chúng có kích thước phân tử lớn nên chúng không chui qua được màng thẩm tích, Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như axit đặc, kiểm đặc, muối kim loại nặng, nhiệt độ cao,... đều có thể làm cho enzym bị biến tính và m ất hoạt tính xúc tác. Enzym cũng thưòng bị kêt tủa và biên tính trong các dung môi hữu cơ như rượu,
18
axe ton,... các chất gây kêt tủa thuận nghịch đối với protein như amoni sulphat, natri clorua và các dung môi hữu cơ ỏ nhiệt độ thấp cũng có tác dụng tương tự chế phẩm enzym. Người ta có thể dùng các chất này để kết tủa và phân tách enzym. Một đặc tính quan trọng là khi enzym kết hợp với một sô chất như cơ chất của nó, coenzym ion kim loại, hoặc một sô' chất hữu cơ đặc hiệu thì một số’tính chất hoá lý của phân tủ enzym có thể bị thay đổi. Ví dụ như độ bền nhiệt, tính quang hoạt, khả năng kết hợp vói kháng thể. Enzym là một phân tử protein, nên tuỳ theo pH của môi trường mà phân tử enzym tồn tại ỏ dạng anion, cation, hoặc trung tính. Vì vậy, có thể đùng kỹ th u ật điện dí để phần tách các loại enzym. Enzym có hiệu lực xúc tác rấ t lớn, ỏ điều kiện thích hợp, hầu hết các phản ứng enzym xảy ra với tốc độ nhanh, gấp từ 10® đến 10u lần so với những phản ứng cùng loại không có xúc tác của enzym. Có enzym trong một phút có thể chuyển hoá hàng triệu phân tử cd chất. Hầu hết phản ứng enzym có tính đặc hiệu cao đối vói kiểu phản ứng và cấu trúc của cơ chất. Phạm vi hoạt động của enzym khá rộng. Các phản ứng được enzym xúc tác gồm nhiều loại như phản ứng oxy hoá khử, vận chuyển, thuỷ phân, phân cắt, đồng phân, tổng hợp. Enzym do tế bào sông tổng hợp và hoạt động trong môi trưòng của cơ thể sống, cho nên enzym cũng như hoạt động của nó đều chịu sự kiểm tra điều khiển của tế bào vể nhiều mặt. Đồng thòi cũng cần phải biết rằng, sự tổng hợp của chính enzym và nhũng chất có hoạt tính sinh học quan trọng khác cũng đều do enzym xúc tác. 1.8. NGHIÊN CỨU ENZYM HIỆN NAY
Ngày nay vẫn còn nhiều câu hỏi cơ bản liên quan đến các chi tiết trong cơ chế hoạt động của enzym và mối quan hệ giữa cơ chế và cấu trúc enzym, Hai công cụ m ạnh nhất mà đã được sử dụng để giải đáp những cầu hỏi này trong thời kỳ hiện đại, đó là việc tiếp tục phát triển và sử dụng những thí nghiệm sinh hoá thãm dò câu trúc protein và việc áp dụng các phương pháp sinh học phân tử cho ngành Enzym học. Phương pháp chụp tinh thể bằng tia X vẫn tiếp tục là phương pháp thông thường được sử dụng để phân tích cấu trúc của các enzym và cấu trúc của các phức hợp enzym - phối tử. Thêm vào đó, các phương pháp 19
cộng hưởng từ hạt nhân mới và các phương pháp chuyển từ tính sẽ có thể giúp đánh giá cấu trúc ba chiều của các enzym nhỏ nằm trong dung dịch và cấu trúc của các phôi tử liên kết với enzym. ứ n g dụng của phương pháp nhiễu xạ Laue với các nguồn bức xạ đồng bộ m ang lại nhiểu triển vọng cho phép các nhà khoa học xác định những cấu trúc của các chất trung gian phản ứng trong thời gian enzym chuyển hoá, và từ đó xác đính được chi tiết từng bước của quá trình xúc tác enzym. Các phương pháp vật lý khác, như phương pháp quang học (ví dụ: hiện tượng màu kép tuần hoàn, u v - Vis, hay phương pháp huỳnh quang) và phương pháp phổ dao động (ví dụ: phương pháp phổ hồng ngoại, Raman), cũng đã được ứng đụng để trả lòi câu hỏi về cấu trúc và khả năng phản ứng của enzym trong dung dịch. Tiến bộ kỹ th u ậ t đ ạt được ỏ các phương pháp quang phổ đã làm cho các phương pháp này trỏ thành công cụ rấ t m ạnh và sẵn có cho các nhà enzym học sỏ dụng. Hơn nữa, những công dụng của sinh học phân tử đã cho phép các nhà khoa học tách dòng và đưa enzym và các cd thể vật chủ ngoại lai với hiệu quả râ't cao. Những enzym mà trước đây chưa từng được tách ra cũng được nhận dạng và mô tả đặc tính nhờ phương pháp tách dòng phân tử. Sự phát triển m ạnh của enzym trong vật chủ nhân sơ (prokaryote) đã cho phép thực hiện việc tinh chế và mô tả đặc tính của các enzym chỉ có một lượng rấ t nhỏ trong các nguồn tự nhiên. Đây là sự tiến bộ to lớn của các nhà khoa học nghiên cứu protein nói chung. Các công cụ của sình học phân tử cũng cho phép các nhà nghiền cứu điều khiển trìn h tự axit amin của một enzym theo ý muốh. Việc sử dụng vị trí đột biến điểm trên gen (ở nơi mà một axit amin này bị thay th ế bởi một axit amin khác) và sự cắt bỏ đoạn gen đột biến trên hệ gen (ở nơi mà các đoạn của chuỗi polypeptit của một protein bị cắt bỏ) đã cho phép các nhà enzym học xác định chính xác các nhóm hoá học tham gia vào liên kết phổi trí và vào các phản ứng hoố học cụ thể trong quá trình xúc tác enzym. Nghiên cứu về các enzym vẫn còn m ang ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với khoa học nói riêng và vối toàn xã hội nói chung. Chúng ta tiếp tục sử dụng các enzym trong nhiều ứng đụng công nghiệp. Thêm vào đó, các enzym vẫn đóng vai trò truyền thống của chúng 20
trong việc sản xuất thực phẩm và đồ uống (rượu bia). Trongr thời kỳ hiện nay, vai trò của enzym trong các sản phẩm tiêu dùng và trong việc sản xuất liên quan đến hoá học đã phát triển m ạnh. Ngày nay, các enzym cũng được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau như tổng hợp hoá chất đa tính năng, các chất giặt tẩy và các chất làm sạch kính áp tròng. Có lẽ một trong những lĩnh vực lý thú n h ất của enzym học hiện đại là việc ứng dụng các chất ức chế enzym để làm các loại thuốic cho ngưòi và thuốc th ú y. Nhiều loại thuôc thường được sử dụng hiện nay có tác dụng là do chức nàng ức chế các enzym có liên quan đến quá trình bệnh tật. Chẳng hạn như aspirin, một trong những loại thuốc được sử đụng rộng rãi nhất trên th ế giới, có khả năng chông viêm có hiệu quả là vì aspirin hoạt động như là chất ức chế enzym prostaglandin syntaza. Nhìn vào Bảng 1.4 cỏ thể thấy rằng, các enzym tham gia vào rấ t nhiều quá trình sinh lý bệnh của con ngưòi, và nhiều chất ức chế enzym đặc biệt đã được điều chế để chống lại hoạt động của các enzym này, và vì thê hoạt động như là các tác nhân chữa bệnh. Nhiều chất ức chế liệt kê trong Bảng 1.3 là kết quả của việc kết hợp sử dụng các phương pháp vật lý để xác định cấu trúc của enzym và đánh giá đặc tính dược học, và thưòng được nói đến như là phương pháp điều chế thuốc hợp lý dựa theo cấu trúc. Phương pháp này sử dụng các thông tin về cấu trúc có được từ việc phân tích tinh thể bằng tia X và quang phổ NMR để xác định hình dạng và kích thước của vị trí hoạt động của enzym. Tiếp đó, các mô hình được xây dựng để thiết kế các phân tử sao cho các phân tử này sẽ khớp vào các vị trí hoạt động này. Rồi thì các phân tử được tổng hợp và thử nghiệm tính ức chế của chúng. Việc lặp đi lặp lại quy trìn h này thưòng dẫn đến việc có được các chất ức chế cực kỳ mạnh. Danh sách đưa ra trong Bảng 1.3 sẽ tiếp tục kéo dài khi hiểu biết của chúng ta về sinh lý bệnh học ngày càng tăng. Còn nhiều enzym tham gia vào quá trình sinh lý học của con người vẫn chưa được cô lập và xác định tính chất. Vì càng ngày càng nhiều các enzym gây bệnh được phát hiện, sẽ cần phải điều chế các chất ức chế mới để ngăn ngừa hoạt động của các enzym này nhằm thoả m ãn nhu cầu vể thuốc của con người. 21
Bảng 1.3. Các v í dụ vể các chất ức c h ế enzym có thể là cá c thuốc Chất ức c h è '/ Thuốc
Bệnh / Điểu kiện
Mục tiêu / Enzym Cacbonic anhydra 2a
Axetazolamit
Bệnh tâng nhãn áp (Glaucoma)
Axiclovir
Viêm da do virus có đặc trưng là Vi khuẩn ADN polymeraza tập hợp các bọng nước nhỏ (Herpes)
Alopurinol Argatroban
Gút (gout)
Xantin oxidaza
Sự đông
Trombin
Aspirin, ibuprofen, DuP697 Viêm, bị đau, sốt Các kháng sinh p - Nhiễm vi khuẩn lactam Brequinar Candoxatril
Prostaglandin syntaza D-Ala-D-Ala transpeptidaza
Cấy ghép mô
Dihydrooroiat dehydrogenaza Tăng huyết áp, suy tim không tương Atriopeptidaza chuyển đổi thích
Captopril
Tăng huyết áp
Clavulanat
Kháng vi khuẩn
Angiotensin (một protein trong máu chuyển hoá từ một protein huyết tưđng và phóng thích bởi một enzym (Renin) thận p-lactam aza Xyclophilin/csr.xineurin
Xyclosporin
Cấy ghép mô
DuP450 Enoximon
Proteaza của HIV AIDS Thiếu máu cục bộ, suy tim không AMPVphosphodiesteraza tương thích
Finazterit
Bắt đầu tăng sản tiền liệt
Testosteron-5-a-reductaza
FK-506 Fluorouraxyl
Cấy ghép mô, bệnh tự miễn
FK-506 protein liên kết
Ung thư
3-Fluorovinylglyxin
Nhiễm vi khuẩn
Thymidilat syntaza Alanin raxemaza
(2-Furyl) - acryloyl - Gly Sự thoái hoá sợi mô đàn hồi phổi Elastaza của Pseum onas - Phe - Phe tròng sự xơ hoá nang IC I-2 0 0 , 806 Khí thũng Elastaza trung tính (Neutrophil) Lovastatin Cholesterol cao HMG CoA reductaza Ly - 256548
Viêm
Phosphorylaza A2
Methotrexat
Ung thư
Nitecapon
Bệnh Parkinson
Dihydrofolat reduclaza Catechol - o - metyftransfenaza
Norfloxaxin
Nhiễm đưởng niệu
Omeprazol
Loét tiỗu hoá
PALA P D - 116124
Ung thư Chuyển hoá của các thuốc Purin nucleotit phosphat kháng u tân sinh (antineoplastic)
Phenelzin
Trầm cảm
Monoamin oxidaza não
Ro 42 - 5892
Tăng huyết áp
Ronin
22
ADN gyraza H*. K* - ATPaza Aspartat transcacbamoylaza
Chất ức chê' / Thuốc
Bênh / Điểu kiên
Mục tiêu / Enzym
Sorbinil
Bệnh võng mạc, tiểu đường
SQ - 29072
Táng huyết áp, suy tim không Enkephalinaza tuơng thích
Sulfamethoxazol
Nhiễm vi khuẩn, sốt rét
Aldoza reductaza
Dihydropteorat syntaza
Testolacton Sưng phụ thuộc hormort Threo - 5 - fluoro - L - Ung thư dihychoorotat
Aroma taza
Trimethoprim
Dihydrootataza
WIN 51711
Nhiễm vi khuẩn Cảm lạnh
Dihydrofolat reductaza Protein VỎ Rhinovirus
Zidovudin
AIDS
Zileuton
Dị ứng
Transcriptaza ngược của HIV 5 - Lypoxygenaza
Trong chương này, chúng ta nhận thây rằng, enzym học đã có một bề dày lịch sỏ. Từ các quan sát hiện tượng, ngành Enzym học đã trỏ thành một môn khoa học phân tử có thể đo đếm được. Trong phần còn lại của cuốn sách này, chúng ta sẽ xem xét enzym từ góc độ hoá học và vật lý. Trong khi tầm quan trọng sông còn của enzym trong sinh học là không thể phủ nhận, hiểu được cấu trúc và hoạt động của chúng vẫn còn là một vấn đề khó khãn trong hoố học. 1.9. ENZYM V À BỆNH DI TRUYỀN
Cuộc sống phụ thuộc vào một chuỗi các phản ứng hoá học được tiến hành một cách hoàn hảo. Để đẩy nhanh tốc độ các phản ứng này phải có các chất xúc tác. Ngày nay, chúng ta gọi các chất xúc tác này là các enzym. Enzym có khả năng thúc đẩy nhanh các quá trình sống trong hầu hết các dạng sống, từ virut đến con người. Nhiểu enzym vẫn duy trì được khả năng xúc tác sau khi tách ra từ cơ thể sinh vật sông. Con ngưòi đã phát hiện ra và khai thác tính năng xúc tác của enzym vào mục đích thương mại. Nguồn tài liệu sớm nhất được biết vể enzym là những bài viết có liên quan đến hoạt động sản xuất phomat, bánh mỳ, rượu, bia và làm mểm các loại thịt. Ngày nay enzym tiếp tục đóng vai trò chủ chốt trong nhiều quá trình sản xuất thực phẩm và bia, rượu. Enzym cũng là thành phần có trong các sản phẩm tiêu dùng như các chất giặt tẩy (các enzym proteolytic có thể hoà tan các chất bẩn có chứa protein). Enzym cũng là mối quan tâm cơ bản của ngành khoa học về sức khỏe, vì nhiều quá trình gây bệnh có thể có mối liên hệ với những hoạt động khác thường của một, hoặc vài enzym. Do đó, nhiều nghiên cứu dược phẩm hiện đại nhằm vào việc tìm kiếm các chất ức chế đặc hiệu và hiệu nghiệm của các enzym này (Bảng 1.4). 23
Bảng 1.4. Các bệnh dỉ truyền liên quan đến mất hoặc thiếu enzym hoặc protein Bệnh Cystic fibrosis (Bệnh xơ màng biểu mô phổi do rối loạn cân bằng trao đổi muối trong tế bào, gãy ra sự tạo các tế bào xơ biểu mô chất đống, gây ùn tắc trao đổi chất, bệnh do đội biến gen).
Ảnh hưởng sinh lý
Ảnh hưởng enzym hoặc protein
Sự tiết không thưởng xuyên trong Kinh - clorua. phổi, các tuyến tuy, mồ hòi, bệnh phổi mãn tinh pho biến dẫn đến cải chết của trẻ em hoặc nguời trưởng thành.
Lesch-Nyhan Syndrome Thiểu năng thần kinh, sự tự đột Hypoxantin guanin (Bệnh thiểu năng thẩn kinh do đột biến, sự làm giảm trí tuệ. Phosphoribozyl bien gen, kém trí tuệ và cảm giác). transferaza. Bệnh thiếu hụt miễn dịch.
Mất đi sự đáp ứng miễn dịch Purin nucleosit nghiêm trọng (trẻ em phải sống phospborilaza. trong phòng vô trùng).
Bệnh Gaucher’s (một khuyểt tật Sự ăn mòn xương, các khớp hông, Glucoxerebrosidaza hoá học bẩm sinh gây tích tụ các thỉnh thoảng tổn thất não. (enzym tham gia hợp chất béo trong gan, lách, tổng hợp lipit màng hạch bạch huyết và hệ thần kinh). thần kinh). Bệnh gây chết trong thòi tho ấư (có Sản xuất quá mức axit ưric gây ra Phosphoribosyl dạng ft nghiêm trọng hơn chỉ thấy sự nhức khớp tái diễn. pyrophosphat rõ khi đã truởng thành). Bệnh Gout syntetaza. tiên phát (bệnh do khuyết lật vể chuyển hoá axit uric làm cho axit này và muối của nó tích tụ nhiều trong dòng máu và trong khớp). Bệnh còi xương (Ricket) phụ Tầm cỡ thấp, dộng kinh, bệnh còi 25-Hydroxychole thuộc vitamin D. xương. Một bệnh ở trả em, có các canxiíerol - 1 xương không cứng lại được và bị hydroxylaza. biến dạng do thiếu vitamin D. Tăng colesterol huyết (Hypercolesterolemia) gia đinh (thân thuộc).
Xơ vữa động mạch (Atheroscleosis Chất nhặn lipoprotein
Bệnh ngu và mù gía đình (Tay-Sachs).
Vận động yếu, tâm thần, chết ở 3 Hexosaminidaza -A. tuoi.
Bệnh hổng cầu liềm {Sickle—cell anemia).
Sưng tay và chân đau đớn, có thể Hemoglobin. đột ngột đau đốn trong xương hoặc chỗ nối khớp và chết.
nesuttíng) từ sự tăng mức độ tỷ trọng thap. cholesterol trorìg máu, thỉnh thoảng gây chết đo suy tim.
Những nghiên cứu về enzym và những hoạt động của các enzym không chỉ làm thoả mãn mối quan tâm mang tính chất học thuật của các nhà khoa học, mà còn vi việc sử đụng những hiểu biết vể enzym cho các nhu cầu thực tế của xã hội. Chương này sẽ cung cấp những kiến thức về lịch sử phát triển ngành Enzym học như một ngành khoa học. 24
CÂU HỎI ỐN TẬP
1. Hãy nêu các mốc chính đánh dấu sự phát triển môn enzym học từ thời cổ đại? 2. Các đặc tính quan trọng của enzym? 3. Nghiên cứu vể cấu trúc enzym có ý nghĩa như thế nào trong enzym học hiện đại. 4. Các enzym có liên quan như thế nào với các bệnh di truyền?
25
Chương 2
CÁC THÀNH PHẦN CÂU TRÚC CỦA PHẦN TỬ ENZYM
Nghiên cứu cấu trúc và cơ chế hoạt động của enzym sẽ giúp chúng ta hiểu được mốĩ quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của enzym. Mối quan hệ này rấ t quan trọng trong nghiên cứu vể sinh học phân tử. Enzym có cấu tạo rấ t phớc tạp, có khối lượng phân tử lớn, từ 10.000 đến hàng triệu Dal. Hình dạng phân tử cũng rấ t khác nhau, phần lđn cấu tạo protein có dạng hình cầu. Có loại enzym chỉ cố một chuỗi polypeptit, cũng có loại do nhiều chuỗi polypeptit tạo nên, nghĩa là enzym có các bậc cấu trúc của protein (bậc 1, 2f 3, 4). Cũng giống như protein, cốc enzym đều được cấu tạo từ 20 axit amin cần thiết. Các axit amin liên kết với nhau để tạo thành chuỗi polypeptit, các đại phân tử này tạo thành cấu hình không gian bậc 3 của enzym, cấu hình phù hợp với chức năng xúc tác. Các chuỗi bên axit amin riêng lẻ có khả năng tham gia các kiểu phản ớng hoá học khác nhau của enzym trong nhũng biến đổi hoá học đặc trưng xúc tác. Ngoài axit amin, nhiều enzym còn có các coĩactơ (cộng tổ) không phải protein cũng có khả năng phản ứng hoá học. 2.1. THÀNH PHẦN CẤU TẠO
Có loại enzym khi thuỷ phân chỉ gồm các axit amin (protein đơn giản), ví dụ: enzym thuộc lóp hydrolaza. Có loại enzym có cấu tạo gồm 2 thành phần (protein phức tạp), phần protein được gọi là apoenzym (hay apoprotein) và phần không phải protein, phần này thường là nhũng chất hữu cơ đặc hiệu có nhiệm vụ cofactd với enzym trong quá trìn h xúc tác. Chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặt vào phẫn apoenzym, hoặc chỉ liên kết lỏng lẻo và có thể tách ra khỏi phần apoenzym khi cho thẩm tích qua màng. Chất hữu cơ đặc hiệu gắn chặt vào phần apoenzym và đặc biệt là những trường hợp được gắn bằng liên kết cộng hoá trị, được gọí ỉà nhóm ngoại (prothetic). Còn trường hợp chất hữu cơ đặc hiệu đó có thể tách dễ dàng và xác định được hằng sô' phân ly của chúng thì chất hữu cơ đặc hiệu đó được gọi là coenzym. Một phức hợp hoàn chỉnh gồm cả apoenzym và coenzym được gọi là holoenzym. Tuy nhiên, sự phân biệt coenzym và nhóm ngoại chỉ là tương đốĩ, vì khó có thể có một tiêu chuẩn 26
th ật rõ ràng để phân biệt gắn chặt hay không gắn chặt, hơn nữa gần đây đã thấy rằng, nhiều coenzym cũng kết hợp vái apoenzym bằng liên kết cộng hoá trị. Do đó, ít cố phân biệt coenzym và nhóm ngoại. Một số enzym được coi là protein đơn giản như trypsin, chymotrypsin,... cũng có chứa kim loại. Có ion kim loại lại là thành phần của chất hữu cơ đặc hiệu (coenzym) như sắt (Fe) gắn với nhân porphyrin trong enzym hệ xytocrom, catalaza, peroxidaza,... Có những kim loại tuy là thành phần cấu tạo của phân tử enzym, nhưng có thể dỗ dàng tách khỏi phân tử enzym, ví dụ: polyphenoloxidaza có chứa đồng (Cu), cacbonic anhydraza có chứa kẽm (Zn), một s ố peptidaza có chứa mangan (Mn), sắt (Fe), hoặc magie (Mg),... tất cả các trưòng hợp kể trên nếu mất kim loại, enzym sẽ m ất hoạt tính và hoạt tính enzym có thể được phục hồi nếu trả lại kim loại vốn có cho enzym đó, hoặc cung cấp cho enzym một cation tương tự khác. Vai trò của kim loại trong phân tủ enzym có thể là để liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa apoenzym và coenzym, ví dụ: Mn trong aminopeptidaza là nôi với cơ chất protein, Zn liên kết coenzym NAD* với alcohol dehydrogenaza. Kim loại cũng có thể tham gia trực tiếp vào sự vận chuyển điện tử như sắt (Fe) trong xytocrom và peroxidaaa. Trong nhiều trưòng hợp, kim loại còn có tác dụng bảo đảm cho sự ổn định của phân tử enzym, giữ vững sự kết hợp giữa các đơn vị cấu tạo với nhau để tạo nên phân tử enzym, Như vậy, kim loại có thể là thành phần cấu tạo của phân tử enzym, hoặc phức hợp enzyme —cơ chất, hoặc có thể là châ^t cộng hợp (coíactơ) trong hoạt động xúc tác của enzyme, hoặc cũng có thể vừa là thành phần cấu tạo, vừa là chất cộng hợp. 2.2. C Á C AX1T AMIN
Một axit a min có công thức chung như sau: H3N+- CH{R) - c o o Nguyên tử c trung tâm trong cấu trúc này được gọi là c alpha (Co,), còn gốc R, được biết đến như chuỗi bên axit amin. Dựa vào cấu tạo hoá học, có thể phân loại 20 axit amin tự nhiên như những viên gạch cấu trúc phố' biến n hất cho sự tạo thành protein và peptit. Cấu trúc chuỗi bên của 20 axit amin tự nhiên được minh hoạ trong Hình 2.1, còn một sô' đặc tính vật lý của những phân tủ này được tóm tắ t trong Bảng 2.1. Vì Ca ở trung tâm nên tấ t cả các axit amin, ngoại trừ glyxin, đều tồn tại ở dạng đối hình L và D. Tất cả protein đều chỉ bao gồm axịt amin có đối hình dạng L. 27
Phần lớn các axit amin trong một protein, hoặc peptit đều có nhóm amin (—NHa) và nhóm cacboxyl (-C 02) tích điện được trung hoà bởi sự hình thành liên kết peptit (trong phần này cấu trúc của axit amin vẫn được xem như là một gốc axit amin của protein hay peptit). Do vậy, sự phân biệt hoá học và vật lý axit amin này với axit amin khác trong một protein là đặc tính của chuỗi bên của axit amin. Như đã thấy trong Hình 2.1, những chuỗi bên này khác nhau về cấu trúc hoá học so vđi những nhóm bên đơn giản, giông như một proton trong trường hợp của tryptophan. Những cấu trúc hoá học khác nhau như th ế này của các chuỗi bên tác động rấ t lớn đến khả năng phản ứng hoá học khác nhau đối với axit amin của một protein. Chúng ta hãy xem lại một số đặc tính hoá học của chuỗi bên axit amín, như sự tham gia vào tương tác của các protein vôi những đại phân tử hay phân tử khác. 2.2.1. Những đặc tính của chuỗi bên axit amỉn 2.2.1.1. Tính k ỵ nước
Trong Hình 2.1, chúng ta lưu ý rằng, một số axit am in (valin, lơxin, alanin,...) hoàn toàn đểu bao gồm hydrocacbon. Điều này sẽ cho thấy rằng, sự hoà tan của các axit amin không phân cựo như th ế này trong một dung môi phân cực giống như nước sẽ là vô cùng khó khăn. Nhìn chung, khi các phân tử kỵ nước được hoà tan trong một dung môi phân cực, chúng có xu hướng co cụm lại với nhau để giảm đến mức tốì thiểu tổng sô" điện tích bề m ặt lộ ra vỏi dung môi, hiện tượng này được biết đến như sức kỵ nước. Sự đẩy ra khỏi nước của các axit amin trong một protein tạo ra lực mạnh cho các protein để gẩp nếp thành dạng cấu trúc bậc ba, dạng này sẽ cô lập các axit amin không phân cực với phần bên trong, hoặc lõi kỵ nưốc của protein. Các axit amin kỵ nước cũng góp phần làm ổn định liên kết của nhũng phân tử chất nền không phân cực trong những vùng liên kết của enzym. Khả năng kỵ nưỏc của axit amin được xác định bỏi khuynh hướng của chúng đôi vổi sự phân chia bên trong một dung môi phân cực trong hệ thông dung môi hỗn hợp. Ví dụ: một phần tử có thể được hoà tan theo tỷ lệ 50 : 50 trong hỗn hợp của nưốc và octanol. Sau khi trộn, các dung môi phân cực và không phân cực sẽ phân tách, và nồng độ phân tử kiểm tra trong mỗi pha sẽ được xác định. Hằng số cân bằng cho sự di chuyển của phân tử từ octanol tới nước là như sau:
,
ÍC = x *di chuyển
^nưdc ^ .. l
/ọ
1\
oct J
ơ đó [CnuJ và [CU là nồng độ mol của phân tử lần lượt trong pha 28
nước và octanol. Năng lượng vận chuyển tự do sau đó có thể được tính từ giá trị Krfi chuyển bằng cách sử dụng phương trình (2.1). Những nghiên cứu về nhiệt động học như th ế này được thực hiện cho sự vận chuyển của axit amin tự do từ một sô" đung môi không phân cực tới nước. Để thực hiện sự định lương này, các nhà khoa học đã sử dụng sự tương đồng của các axit amin, mà ở đó amin và cacboxyl tích điện được trung hoà (ví dụ: bằng cách dùng N —axetyl etyl este của axit amin). Sự kết hợp dạng này của thông tin nhiệt động học cho hệ các dung môi khác nhau có thể tạo ra một loại thứ tự khả năng kỵ nước của 20 axit amin. Một thứ tự phổ biến được sử dụng trong vấn đề này là thứ tự được phát triển bởi Kyte và Doolittle (1982): Khả năng kỵ nưóc của axit amin do Kyte và Doolittle chỉ ra được liệt kê trong Bảng 2.1. Nhìn chung, các axit amin kỵ nước thưòng được tìm thấy ở phía trong của những protein gấp nếp, mà ỏ đó chúng được bảo vệ khỏi lực đẩy của đung môi phân cực, còn axit amin phân cực có khuynh hướng được tìm thấy trên bề m ặt lộ ra ngoài dung môi của protein gấp nếp. H»CW CHl No (Aliphatic) Gly AIu Ưa nưúc HC
Va]
Ltỉu
o ° ^ C ^ 0H Ọ II 1 tí X ......... pHa A
CHỵ CHu CH2 :Ợ n 2Ọ H2Ợ
I
Asn
Có chửa lưu huỳnh Uuỳnh
Gln
I
I
Ly 6
Arg
H ^ SH h ^ H2 M et
M et
Thơm
29
Bảng 2.1. Đặc tính hoá lý của các axit amin tự nhiên
Axit amin
Mã ba
ch ữ
Mã một chữ
Khối lượng của gốc trong protein'
Diện tích bể mặt có thể (A )b
Khả năng không ưa nướcc
Alanin
Ala
A
71,08
115
+1,8
Arginin
Arg
R
156,20
225
—4,5
Asparagin
Asn
N
114,11
160
-3 ,5
Aspartic
Asp
D
115,09
150
-3,5
Xystein
Cys
c
103,14
135
Glutamic
Glu
E
128,14
Glutamin
Gln
Q
Glyxin
Gly
Histidín
pKa của chuỗi bên ion hoá
Sự có mặt của protein <%)d
Sự thay đổi tương đối •
Thổ tỉch Van der Waals (A3)
9.0
100
67
4,7
65
148
4,4
134
96
3,9
5,5
106
91
+2,5
8,4
2,8
20
86
180
-3 ,5
4,1
3,9
102
109
129,12
190
-3 ,5
6,2
93
114
G
57,06
75
-0 ,4
7,5
49
48
His
H
137,15
195
-3,2
2,1
66
118
Isolơxin
Iso
I
113,17
175
+4,5
4,6
96
124
Lơxin
Leu
L
113,17
170
+3,8
7,5
40
124
Lysin
Lys
K
128,18
200
-3,9
7,0
56
135
Metionin
Met
M
131,21
185
+1,9
1,7
94
124
Phenilalanin
Phe
F
147,18
210
+2,8
3,5
41
135
Prolin
Pro
p
97,12
145
-1,6
4,6
56
90
Serin
Ser
s
87,08
115
-0 ,8
7,1
120
73
Threonin
Thr
T
101,11
140
-0,7
6,0
97
93
T ryptophan
Trp
w
186,21
255
-0 ,9
1,1
18
163
Tyrosin
Tyr
Y
163,18
230
-1 ,3
3,5
41
141
Valin
Val
V
99,14
155
•*■4,2
6,9
74
105
12,5
6,0
10,8
10,1
a: các giá trị thể hiện khối lượng phân tử axit amin đối với nưâc; b: diện tích bề mặt của gốc như là chuỗi polypeptit. s ố liệu từChothia (1975); c: Khả năng kỵ nước từ (Kyte và Doolittle, 1982); đ: dựa trên tần số xuất hiện của mỗi gốc trong trình tự 207 protein không liên quan, s ố liệu từ Dayolf và cộng sự (1977); e: rất có ỉhể một gốc sẽ đột biến trong thòi gian lý thuyết trong suốt quá trình tiến hoá. Số liệu từ Dayotf và cộng sự (1978).
30
2.2.1.2. Liê n kết hydro
Liên kêt hydro kết hợp với các dị nguyên tử (heteroatoms) của chuỗi bên của một vài axit amin có thể trao đổi proton, axit amin mà có thể dóng vai trò như chất cho hydro cho liên kết hydro. Những axit amin khác lại thích hợp như chất nhận liên kết hydro nhờ các điộn tử bắt cặp một mình trên các dị nguyên tử của chuỗi bên của chúng. Liên kết hydro của chuỗi bên axit amin và các nhóm khung polypeptit làm bền vững tương đối cấu trúc protein. Thêm vào đó, các liên kết hydro còn có thể được tạo thành giữa chuỗi bên axit amin với nguyên tử phối tử (chất nền, sản phẩm, chất ức chế,...) và có thể góp phần để toàn bộ năng lượng liên kết cho sự tương tác của enzym với những phân tử như thê này. Những chuỗi bên có khả năng hoạt động như chất cho liên kết hydro bao gồm tyrosin (—O-H), serin (-0-H ), treonin (—0 —H), tryptophan (—N—H), histidin (-N -H ) và xystein (-S-H). Tại pH thấp, chuỗi bên của axit glutamic và aspartic cũng có thể hoạt động như chất cho liên kết hydro (—COO-H). Các dị nguyên tử ở chuỗi bên của các axit amin sau đây có vai trò như các chất nhận liên kết hydro: tyrosin (-:0:-H ), axit glutamic và aspartic (-C 0 0 -), serin và threonin (-:0:-H ), histidin (N:), xystein (-:S:-H) và metionin (:S:), Một vài axit amin có thê đóng vai trò cả chất cho và chất nhận liên kết hydro, như minh hoạ ồ Hình 2.2.
(b)
Hinh 2.2. Tyrosin tham gia liên kết hydro (a) như một chất ch o hydro và (b) như m ột ch ất nhận hydro (Nguồn: Copeland, R.A., Enzymes, 2000).
2.2.1.3. S ự hìn h thành cầu m uối
Những tương tác tĩnh điện không cùng hoá trị có thể xảy ra giữa các nhóm tích điện ám và tích điện dương bên trong protein. Hình 2.3 minh hoạ sự hình thành của một tương tác tỉnh điện như th ế giữa chuỗi bên của lysin trên một chuỗi polypeptit và axit glutamic trên chuỗi polypeptit khác. Bởi vì những tương tác này giống với tương tác ion kết hđp với sự hình thành các phân tử muối nhỏ nên chúng thường được gọi là cầu muôi. Các cầu muối này có thể ỗ bên trong phân tử (nội phân tử), giữa một chuỗi bên axit amin tích điện với các nhóm khác bên trong protein; hoặc ngoại phân tử; giữa chuỗi bên axit amin vối các nhóm tích điện 31
trên một phôi tử, hoặc đại phân tử khác. Ví dụ: nhiều protein liên kết với axit nucleic nhận được một phần quan trọng năng lượng liên kết của chúng bằng cách hình thành tương tác tĩnh điện giữa các gốc axit amin tích điện dương trên bề m ặt của chúng (thường là gổc lysin và arginin) với các nhóm phosphat tích điện âm của khung axit nucleic. Ví dụ quan trọng khác của lực tương tác tĩnh điện đến từ tầng vận chuyển điện tủ ty thể. ở đây, các điện tử đi từ protein xytocrom c tới enzym xytocrom oxidaza, ở đó chúng được sử dụng để khử oxy thành nước trong suốt quá trình hô hấp tế bào. ĐÔI với các điện tử nhảy từ một protein này tới một protein khác thì cả hai protein đều phải tạo thành một phức hợp kín (hằng số kết hợp ~ 10-9M). Khi câu trúc tinh thể của xytocrom c được giải thích thì rõ ràng là bề m ặt của phân tử này có chứa một vùng với m ật độ cao không bình thường các gốc lysin tích điện dương. VỊ trí thường gắn xytocrom c trên phân tủ xytocrom oxidaza có mật độ cao của các gốc axit aspartic và glutamic. Do đó, ngưòi ta tin tưởng rằng, phức hợp kín được tạo thành giữa hai phân tử protein này là dễ dàng bằng cách hình thành một số' lượng lón các cầu muôi tại bề m ặt chung này. Ý kiến này đã được ủng hộ bỏi khả năng của phức hợp đã bị phân tách bằng cách thêm nồng độ cao của muôi vào dung dịch. Khi đó lực ion tăng lên, ion muối hoàn toàn chông lại các gốc axit amin, m ặt khác sẽ thích hợp trong sự hình thành cầu muối.
o Lysin
Axit glutamic
Hlnh 2.3. Sự hình thành cầu muối giữa lysin và gốc axit glutamic ã pH trung tính
2.2.2. A x it amỉn ià các chất axit và bazơ
Ở Bảng 2.1, chúng ta có thể thấy rằng, có 7 chuồi bên axit amin, với các proton có thể chuẩn độ được có vai trò như là các bazơ cùng gốc và axit của Bronsteđ Lowry. Những axit amin này gồm tyrosin, histidin, xystein, lysin, arginin, axit aspartic và glutamic. Những chuỗi bên này có khả năng góp phần vào hoá học axit, bazơ, cung cấp cho enzym một cơ chế về vận chuyển proton từ các chất tham gia phản ứng đến các phân 32
tủ tạo thành. Thêm vào đó, để vận chuyển proton, axit và bazơ lewis'”' chuồi bên còn có thể có vai trò trong các phản ứng ái nhân và ái điện tử với các phân tử tham gia phản ứng, qua đó dẫn đến sự hình thành và phân tách các liên kêt, Sự sắp xếp của các nhóm axit và bazơ từ các chuỗi bên axit amin tại các vị trí nghiêm ngặt bên trong trung tâm hoạt động, là một cơ chế phổ biến được biểu hiện bởi các enzym đổi với các phản ứng hoá học ngẫu nhiên của các phân tử gắn ở trung tâm hoạt động. Ví dụ: sự thuỷ phân của các liên kết este và peptit có thể xảy ra qua việc gắn của peptit ái nhân bởi nước. Phản ứng này trải qua giai đoạn biến đổi, mà ở đó cacbonyl oxy của peptit có một phần điện tích âm, và oxy của nưổc có một phần điện tích dương: * * ô" ọ Nếu có thể đặt một nhóm cơ bản ì tại một vị trí chuyển tiếp cố’ định gần phân tử nước, thì nó sẽ có thể ổn định hoá trạng thái này bằng cách chuyển Ca : t ị I một phần một trong số các proton của nưốc tói bazơ. Sự ổn định này của Qỗ+ trạng thái trung gian sẽ cho phép ỵ/ phản ứng diễn ra nhanh chóng. H H ô_ Thêm vào đó, sự chuyển tiếp có thể đạt 9 được sự ổn định giông nhau bằng cách đặt £ Q một nhóm axit amin tại vị trí đã cô" định gần y/ ; y/ kề với cacbonyl oxy, dẫn đến sự vận chuyển Cct ! N một phần cùa proton từ axit tới cacbonyl, í ỉ làm ổn đinh phần tích điện âm của oxy này ! g+H trong trạng thái trung gian. Khi quan sát những trung tầm ’h oạt động của các enzyme, ^ mà tại đó gây xúc tác phản ứng cắt liên kết \ peptit (một họ enzym đã được biết đến là x :B proteaza), người ta nhận thấy rằng, thường có các chuỗi bên axit amin có tính axit, hoặc bazơ (hoặc cả hai) có m ặt tại các vị trí thích hợp cho sự ổn định trạng thái trung gian của dạng này. Chúng ta sẽ trình bày nhiều hơn về sự ổn định trạng th ái trung gian của các phản ứng enzym ỏ Chương 5. Các cơ chế hoá học xúc tác của enzym.
\ / f\ A
<*>A xit
lewis: c h ấ t có th ể n h ậ n m ột cặp electron từ m ột bazơ, như vậy A1C1S, B F 3, và SOâ ]à các axit. Bazơ lewis: ch ất có th ể cho một cặp electron, ví dụ ion hydroxy] 0 H “ và am oniac NH3“.
33
Khi bàn luận về đặc tính axit, bazơ của chuỗi bên axit amin, thì điều quan trọng là phải công nhận giá trị pKa được liệt kê trong Bảng 2.1 cho nhóm bên trong dung dịch nưóc. Tuy nhiên, đối vói protein, giá trị pKa này có thể chịu ảnh hưởng lớn hơn bởi môi trường cục bộ như gốc axit amin. Ví dụ: pKa của axit glutamic trong dung dịch nước là 4,1 nhưng pKa của gốc axit glutamic đặc trưng trong một số protein có thể cao bằng 6,5. Do đó, giá trị pKa liệt kê ở Bảng 2.1 có thể cung cấp một số’ sự hiểu biết sâu sắc vể vai trò có thể của một số’ chuỗi bên nhất định trong các phản ứng hoá học, để tránh tạo ra sự quá đơn giản hoá. 2.2.3. S ự gắn cation và liên kết kím loại
Nhiều enzym kết hợp chặt chẽ với những cation có hoá trị hai (Mg2\ Ca2+, Zn2+) và vận chuyển các ion kim loại (Fe, Cu, Ni,...) bên trong cấu trúc của chúng để ổn định câu hình gấp nếp của protein, hoặc góp phần trực tiếp vào các phản ứng hoá học được xúc tác bỏi enzym. Các kim loại có thể cung cấp khuôn cho protein gấp nếp, như trong vùng “ngón tay” kẽm của axit nucleic gắn protein, ion Ca2+ của calmodulin, và trung tâm cấu trúc Zn của insulin. Ion kim loại cũng có vai trò như trung tâm oxy hoá khử cho sự xúc tác; ví dụ bao gồm: trung tâm sắt hem, các ion đồng và sắt không nhân hem. Các ion kim loại khác có thể có vai trò như các tác nhân ái lực điện tử trong xúc tác, như trong trưòng hợp trung tâm hoạt động ion Zn của metalloproteaza (protein kim loại). Những kim loại thường liên kết với phần protein của enzym bằng cách hình thành liên kết phôi trí với chuỗi bên axit amin nhất định là: histidin, tyrosin, xystein, metionin, axit aspartic và glutamic. Vòng imit chuỗi bên của histidin liên kết phôi trí với kim y = \ /= loại phổ biến đặc trưng. Gốc histidin phần lổn thường được tìm thấy trong sự kết hợp với các vị trí gắn kim loại trung gian trên protein cũng như thường kết hộp vối liên k ết ion kim loại hoố N>N trị hai. Ví dụ: Hình 2.4 cho thấy, cầu phôi trí của Zn ồ trung tâm Hinh 2.4. Hỉnh cẩu phối trí của trung tâm hoạt động của enzym cacbonic hoạt động Zn của cacbonic anhydraza anhydraza. Zn thường tạo thành (Nguồn: Copeland, R.A., Enzymes, 2000). 4 liên kết phối trí trong sự sắp xếp
© S-
34
tứ diện với ion kim loại. Trong cacbonic anhydraza, ba trong bốn liên kết được tạo thành nhờ sự phối hợp với gốc histidin của chuỗi bên của protein, c ả bôn vị trí phối hợp đều bị chiếm giữ bởi phân tử nước, phân tử mà góp phần trực tiếp trong xúc tác. Trong suốt quá trình phản ứng được xúc tác bởi enzym, liên kết H20 - Zn sẽ bị phá vỡ và thay thế tạm thời bởi liên kết giữa kim loại với cơ chất C 02 của phản ứng. 2.2.4. Gắn anion và polyanion
Các axit amin lysin và arginin tích điện dương có thể có vai trò như chất thu nhận ion —gắn kết anion và polyanion. Tác động qua lại của dạng này là quan trọng trong sự liên kết của các cofactơ, chất phản ứng và các chất ức chế với enzym. Ví dụ: các chất phản ứng và đồng yếu tô' được dùng bỏi enzym bao gồm nhóm phosphat, nucìeotit và các chất tương tự chúng, axit nucleic và heparin. 2.2.5. S ự hỉnh thành liên kết đổng hoá trị
Chúng ta chỉ ra rằng, khả năng phản ứng hoá học của các gốc axit amin bên trong protein được xác định bởi cấu trúc chuỗi bên của chúng. Một sô" axit amin có thể trải qua sự cải biến sau dịch mã (ví dụ: sự biến đổi xảy ra sau khi chuỗi polypeptit được tổng hợp ở ribosom), quá trình này thay đổi cấu trúc của chúng, đo đố thay đổi độ phản ứng, có nghĩa bằng cách hình thành liên kết đồng hoá trị. Trong một số trưòng hợp, sự cải biến của chuỗi axit amin có thể thuận nghịch là một bưốc quan trọng trong cơ chế xúc tác của enzym. Các mục 2.2.5.1 2.2.5.3 đưa ra một sô" ví dụ về liên kết đồng hoá trị được hình thành bối chuỗi bên axit amin. 2.2.5.1. Liê n kết disu lfu a
Hai gốc xystein có thể liên kết ngang với nhau, qua quá trình oxy hoá để hình thành liên kết s - s, được gọi là liên kết disulfua. Nhũng liên kết ngang này có thể xảy ra trong nội phân tử, giữa hai xystein bên trong một chuỗi polypeptit đơn; hoặc ngoại phân tử, để nốì hai chuỗi polypeptit với nhau. Liên kết ngang disulfua như th ế này có thể tạo ra năng lượng ổn định đốì vối cấu hình gấp nếp của protein. Có nhiều ví dụ về protein có liên kết disulfua cả nội và ngoại phân tử trong các dạng gấp nếp của chúng. Liên kết disulfua ngoại phân tử cũng có thể xảy ra giữa một gốc xystein trong một protein vâi một nhóm sulthydryl của một phối tử nhỏ, hoặc chất phản ứng sửa đổi. Ví dụ: 4-4’-dithioldipyridin là 35
một tác nhân đã dùng một số lượng xystein tự do (các xystein đó không liên quan đến liên kết disulfua) trong protein. Các chất phản ứng tác động trỏ lại sulthydryl tự do tạo thành liên kết disulfua ngoại phân từ, với sự giải phóng một sản phẩm phụ mang màu. 2.2.5.2. S ự p h o sp h o ry l hoá
Những chuỗi bên axit amin nhất định có thể bị biến đổi hoá trị bằng cách thêm một phosphat của phosphat tích điện âm (Pvc). Trong tự nhiên, sự phosphoryl hoá các gốc đặc hiệu bên trong protein thích hợp vói một lóp enzym đã được biết đến là kinaza. Một lớp enzym khác, phosphataza, sẽ loại bỏ một cách chọn lọc các nhóm phosphat khỏi những axit amin này. Sự thuận nghịch này, phosphoryl hoá/đephosphoryl hoá có thể ảnh hưỏng lón đến hoạt tính sinh học của enzym, chất nhận (receptor) và các protein liên quan trong sự hình thành phức hợp protein - protein và protein - axit nucleic. Vị trí phổ biến nhất cho sự phosphoryl hoá trên protein là các nhóm hydroxyl của gốc treonin và serin; tuy nhiên, các chuỗi bên của tyrosin, histidin và ly sin cũng có thể bị thay đổi theo cách này (Hình 2.5). Tyrosin kinaza, enzym phosphoryl hoá các gốc tyrosin bên trong những protein n h ất định, hiện nay đang được quan tâm đến nhiều trong hoá sinh học và sinh học tế bào. Điều này là bởi vì nó giúp nhận ra sự phosphoryl hoá và dephosphoryl hoá quan trọng trong sự truyển tín hiệu hoá học bên trong tế bào (sự truyền tín hiệu). Enzym cũng có thể tạm thời tạo thành liên kết đồng hoá trị với nhóm phosphat trong suốt quá trình xúc tác. Trong những trưòng hợp này, một chất trung gian phosphoseryl - enzym được tạo thành bằng cách chuyển một phosphat từ phân tử cơ chất, hoặc phosphat vô cơ tối chuỗi bên axit amin đặc trưng bên trong trung tâm hoạt động enzym. Ngày nay đã biết đến một sô" ví dụ vể chất trung gian phosphoryl enzym bao gồm phosphoserin, phosphohistidin và thậm chí cả sự hình thành phosphoaspartat. Ví đụ: ATPaza là enzym xúc tác sự thuỷ phân ATP (ađenosin triphosphat) và Pvc. Trong một phân nhóm của những enzym này, Na+, K+ và Ca2+, ATPaza, Ỵ-phosphat của ATP được vận chuyển tới p - cacboxylat của gốc axit aspartic của enzym trong suốt quá trình phản ứng. Vì rằng, phosphoaspartat là không bền về động học nên nó phân tách r ấ t nhanh để giải phóng phosphat vô cơ. 36
/ P h o s p h o s e r in
P h o s p h o tr e o n in
P h o s p h o ty r o s in
Hlnh 2.5. Cấu trúc dạng phosphoryl hoá của serin, treonin và tyrosin
(Nguồn: Copeland, R.A., Enzymes, 2000).
2.2.5.3. G ly co ry l hoá
Trong các tế bào nhân chuẩn, đưòng có thể gắn với protein bằng cách hình thành liên kết cộng hoá trị tại các nhóm hydroxyl của gốc serin và threonin (glycosyl hoá liên quan đến liên kết -O), hoặc tại nitơ của chuỗi bên asparagin (glycosyl hoá liên kết —N). Phức hdp protein đưòng tạo ra được gọi là một glycoprotein. Những đường được dùng cho mục đích này bao gồm các đường đơn của galactoza, glucoza, manoza, N-axetylglucozamin, N-axetylgalactozamin, axit sialic, fructoza và xyloza. Sự có m ặt của những đường này có thể ảnh hưởng đáng kể đến độ tan, sự gấp nếp và hoạt tính sinh học của protein. 2.2.6. B ố trí trong không gian
Ngoài hoạt tính hoá học đã được bàn luận, hoá học lập thể của chuỗi bên axit amin cũng có vai trò quan trọng trong sự gấp nếp và tương tác nội phần tử của protein. Kích thưóc và hình dạng của chuỗi bên xác định loại tương tác đóng gói có thể xảy ra với các nhóm bên, theo lực Van der Waals. Đây là sự sắp xếp của chuỗi bên bên trong trung tâm hoạt động của phân tỏ enzym, quy định toàn bộ kích thước và hình dạng của vùng gắn, vị trí thích nghi với phân tử cơ chất, do đó sự tương tác đóng gói này giúp xác định tính đặc hiệu cho sự gắn cơ chất và các phân tử ức chế tại những vị trí này. Đây là một khía cạnh quan trọng của sự xúc tác enzym. Trong Chương 5. Các cơ chê xúc tác hoá học của enzym, chúng ta sẽ bàn luận nhiều hơn nữa mốĩ quan hệ giữa kích thưốc và hình dạng của vùng gắn enzym và cấu trúc của các phối tử.
Đối với các axìt amin, diện tích bề m ặt của chuỗi bên cũng ảnh hưởng đến khả năng kỵ nước của các phần còn lại. N hìn chung, khả năng kỵ nước của các phân tử no, cũng liên quan đến diện tích bề mặt được bộc lộ của chúng. Hansch và Coast (1970) đã khái quát rằng, AGvệmchuyển từ một dung môi không phân cực, giông như n-octanol để nước tăng khoảng 0,68kcal/mol đối vói bất kỳ nhóm m etylen nào dược thêm vào Ịnột cấu trúc no (aliphatic). Đây là sự đơn giản hoá, nó có vai trò như một định luật có ích cho sự dự đoán vể tính tương đôi kỵ nước các phân tử liên quan cấu trúc. Sự liên quan này giữa diện tích bề mặt và tính kỵ nước không chỉ đối với axit amin mà còn liên quan đến vùng gắn của enzyme, và cũng liên quan đến phân tử cơ chất và ức chế có thể gắn vào trong vị trí đó. 2.3. MỘT SỐ C O FA C T O TRO N G ENZYM
Như chúng ta đã biết, cấu trúc chuỗi bên của 20 axit amin có thể làm cho enzym có khả nàng phản ứng hoá học. Tuy nhiên, thông thường các phản ứng được xúc tác bồi enzym cần sự tham gia của các nhóm hoá học để hỗ trơ phản ứng xảy ra nhanh chóng, dễ dàng. Do đó để đáp ứng, phản ứng cần thiết không thể được thực hiện với chỉ mỗi axit amin mà nhiều enzym hợp tác với các nhóm hoá học không có bản chất là protein (nonprotein) bên trong cấu trúc của trung tâm hoạt động của chúng. Những nhóm hoá học không protein (nonprotein) này được gọi chung như các cofactơ (cộng tố) hay coenzyme. Hình 2.6 cho thấy cấu trúc một số cofactơ phổ biến. Trong p hần lớn trường hợp, coíactơ và enzym kết hợp với nhau qua các tương tác không đồng hoá trị, như liên kết hydro, tương tác kỵ nước,... Tuy nhiên trong một số trường hợp, các cofactơ được liên kết đồng hoá trị với chuỗi polypeptit của enzym. Ví dụ: nhóm hem của protein xytocrom c vận chuyển điện tử, được liên kết với protein qua cầu tioeste với hai gốc xystein đã biến đổi. Một ví dụ khác của sự tham gia cofactd đồng hoá trị là cofactơ pyrodoxal phosphat của enzym asp artat am onitransferaza. ở đây cofactd được liên kết đồng hoá trị với protein qua sự hình thành của bazơ schiff vói gốc lysin trong trung tâm hoạt động.
38
Flavin
Nicotinamit 0
o.. OH
>(CH2- C H = { C H a) - CH 2)nH
Pyridoxal phosphat K' R"
CH z- H 2C - C O O H
J 1 0 0 C - H 2C - H 2C
Hem Hinh 2.6. Ví dụ về một 50 cofactd thường gặp ở enzym
(Nguồn: Copeland, R.A., Enzymes, 2000).
Enzym cần một coíactơ cho sự hoạt động, phần protein của trung tâm hoạt động được gọi là apoenzym, còn phức hợp hoạt động giữa protein và coíactơ được gọi ỉà holoenzym (enzym hoàn chỉnh apoenzym và coenzym). Trong một số' trường hợp như thế, về phương điện hoá học hay chất đồng vị đã thay dổi kiểu của coíactơ có thể được kết hợp chặt chẽ bên trong apoenzym để nghiên cứu cấu trúc và cơ chế hoá học của enzym một cách dễ dàng. Cofactd thực hiện một loạt các phản ứng trong enzym. Một trong những vai trò phổ biến hơn của coíactơ enzym là để cung cấp vị trí cho quá trình oxy hoá/khủ hoá học tại trung tâm hoạt động. Một ví dụ minh hoạ của hiện tượng này là hoá học cofacto flavin.
Flavin (từ tiếng latin là flavius, có nghĩa là màu vàng —coíactơ màu vàng sáng, XmaM- 450) phổ biến đối với oxidoreductaza, dehydrogenaza và protein vận chuyển điện tử. Đặc điểm cấu trúc chính của cofactd flavin là hệ thông vòng isoalloxazin ghép đôi cao (Hình 2.6). Flavin oxy hoá dễ dàng trải qua sự khử hai điện tử thuận nghịch để thành 1,5dihydroflavin, do đó có thể hoạt động như bể điện tử trong suốt phản ứng khử bên trong trung tâm hoạt động của enzym. Ví dụ: một số dehydrogenaza dùng cofactd flavin để nhận hai điện tử trong suốt sự oxy hoá xúc tác của NADH (một cofactd enzym phổ biến khác; xem nicotinamit trong Hình 2.6). Thêm vào đó, flavin có thể trả i qua sự khử một điện tử riêng biệt để tạo thành gốc semiquinon; chất này có thể tiếp tục bị khử bồi phản ứng khử một điện tử thứ hai để giải phóng cofactd bị khử hoàn toàn. Qua hiện tượng này, cofactd flavin có thể đặc trưng trong sự oxy hoá của một điện tử, quá trình như th ế này được thực hiện trong suốt chuỗi vận chuyển điện tử hồ hấp trong ty thể. Thực tê có hai dạng semiquinon chuyển hoá lẫn nhau phụ thuộc vào pH (Hình 2.7). Semiquinon trung tính màu xanh có pH trung tính và pH axit, trong khi đó semiquinon anion màu đỏ xuất hiện ỏ pH trên 8,4. c ả hai dạng đều bền vững và có thể được quan sát trong các phản ứng enzym nhất định. Tính chất đa dạng hoá học được giải thích bởi cofactd flavin trong khả năng của chúng để tạo thành liên kết đồng hoá trị vổi cơ chất trong suốt phản ứng khỏ. Phản ứng oxy hoá của dithiol thành disulfua bởi trung tâm hoạt động flavin của glutathion reductaza là một ví dụ của trường hđp này. Ớ đây anion thiolat thêm vào cacbon C4a của hệ thống vòng isoalloxazin (Hình 2.8a). Cũng như vậy, trong một số flavoenzym oxidaza, sự oxy hoá lại xúc tác của flavin đã bị khử bởi oxy phân tử thực hiện với sự hình thành của chất trung gian peroxit C4a nhất thời (Hình 2.8b). Bảng 2.2. Một sô' vi dụ về cofacto được tlm thấy trong enzym Coíactơ
s ử dụng enzym Trung tâm oxy hoá khử gắn phối tử Trung tâm hoạt động gắn phosphat Ưa điện tử Zn2Trung tâm hoạt động ưa điện tử Trung tâm oxy hoá khử vận chuyển Flavin proton Trung tâm oxy hoá khử gắn phối tử Hem NAD và Trung tâm oxy boá khử vận chuyển NADP proton pyridoxal Nhóm amino vận chuyển ổn định phosphat carbanion trung gian Trung tâm oxy hoá khửvận chuyển hydro Quinon CoenzymA Vận chuyển nhóm axyl
Cu* Mg2-
40
Ví dụ vồ enzym Xytocrom oxidaza, superoxit Dismutaza phosphodiesteraza, ATP syntaza Phút hợp metalloproteaza, cacboxypeptidaza Giucoza oxidaza, sucxinat dehydrogenaza Xytocrom oxidaza, xytocrom P450S Alcohol dehydrogenaza, omithin xyclaza Aspartat dehydrogenaza, arginin raxemaza Xykxxom b„dtiyckoorotat dehydrogenaza Pyruvat dehydrogenaza
Sự đa dạng của các cofactd khác góp phần trong hoá học xúc tác của trung tâm hoạt động enzym. Một sô" ví dụ khác của hiện tượng này được thông kê trong Bảng 2.2. Tuy nhiên, bảng liệt thống kê này chỉ đưa ra gợi ý của khả năng phản ứng và cấu trúc của enzym bởi các cofactd khác nhau. Các thỏ nghiệm của Dixon và Webb (1979), Walsh (1979); Dugas và Penney (1984) đã đưa ra sự nghiên cứu toàn diện hơn về cofactơ enzym và các phản ứng hoá học mà chúng tham gia. Trong phần này chúng ta đã thấy được sự đa dạng phản ứng hoá học là phô biến đốỉ với enzym nhờ cấu trúc của chuỗi axit amin. Chúng ta đã mô tả các axit a min có thể liên kết như thế nào để tạo thành chuỗi polypeptit và các chuỗi này gấp nếp như thế nào trong mô hình chung của cấu trúc bậc hai và bậc ba. Sự gấp nếp của một enzym trong cấu trúc bậc ba của nó cung cấp phương tiện để tạo thành vị trí gắn cho phôi tử cơ chất và đưa ra những vị trí gắn này, các nhóm phản ứng hoá học cần xúc tác. Trung tâm hoạt động của enzym được xác định bỏi những nhóm phản ứng này và bởi toàn bộ hình học của vị trí gắn. Chúng ta biết rằng, các nhóm phản ứng hoá học thông thường chuyển hoá cơ chất thành phân tử sản phẩm là được bổ sung nhờ enzym, không chỉ từ những axit amin tạo thành protein mà còn từ những cofactd phân tử; những cofactd là thành phần của phân tử enzym hoạt tính sinh học. Trong Chương 5, chúng ta sẽ thấy cấu trúc chi tiết của trung tầm hoạt động enzym thích hợp với cơ chất gắn vào và gia tốc của tốc độ phản ứng. 11
8
R
n3.N 2 - 0 ' Ỷ *
R
le ++ H
/UNH 11 3
0
Flavin bị oxy hoá
0 Semìquinon trung tính màu xanh (570nm)
Flavin
o bị khử
pKa 8,4
o Semiquinon anion m àu đỏ (480nm) Hỉnh 2.7. Cấu trúc của cotactơ flavin trong trạng thái oxy hoá của nó
(Nguổn: Copeland, R.A., Enzymes, 2000)
41
(a)
o2
(b)
Hình 2.8. Sự tạo thành liên kết cộng hoá trị nhờ cofactd trong enzym
(a) Sự oxy hoá của dithio thành disulfua nhờ sự hình thành của phức hợp C4a - dithio, nhữ tròng phản ứng khử của glutathion reductaza với dìthìo; (b) Sự oxy hoá lại của flavin đã bị khử bồi oxy phân lử, với sự hình thành của chất trung gian C4a - peroxidaza (Nguon: Copeland, R.A., Enzymes, 2000).
2.4. TRUN G TÂM HOẠT ĐỘNG CỬ A ENZYM
Cấu trúc không gian của phân tử enzym có vai trò quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzym, Trong phân tử enzym có nhóm chức trực tiếp kết hợp vổi cơ chất để hình thành hay cắt đứt các liên kết, tạo thành sản phẩm phản ứng, gọi là trung tâm hoạt động của enzym, người ta rú t ra một số nhận xét chung như sau: - Trung tâm hoạt động của enzym chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ của phân tử enzym. - Trung tâm hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau của axit amin, phân tử nước liên kết và trong nhiểu trường hợp có cả ion kim loại, các nhóm chức của coenzym (enzym hai thành phần). Các nhóm chức của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động là nhóm sulthydryl (—SH) của xystein; nhóm amin (-NH 2) đầu N hoặc e-amin của lysine; nhóm cacboxyl (-COOH) của axit aspartic và glutamic; nhóm hydroxyl (-0H ) của serin, treonin và tyrosin; vùng indol của tryptophan; vùng imidazol của histidin; nhóm guanilic của arginin. - Trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian xác định. Các nhóm chức của axit amin trong trung tâm hoạt động có thể ở xa nhau trong chuỗi polypeptit, cách nhau vài chục gôc axit amin nhưng lại gần nhau trong không gian (Hình 2.9). Giữa các nhóm chức này (và hoặc í on kim loại, hoặc coenzym) được định hướng xác định trong không gian, cách nhau những khoảng cách nhất định (thường bé hơn 3Ằ). 42
Ví dụ: Trung tâm hoạt động của a —chymotrypsin bao gồm nhóm hydroxyl của Ser195, imidazol của His87 và nhóm cacboxyl của Asp102, các gôc này ở khá xa nhau trong chuỗi polypeptit nhưng giữa các nhóm chức của chúng chỉ cách nhau từ 2,8 - 3,0Ằ (Hình 2.9). Những nghiên cứu gần đây cho thấy, mạng lưới hydro cũng đủ linh động để có thể dễ dàng thay đổi cấu tạo của nó khi tương tác với cơ chất cũng như các chất khác.
(a)
(d)
Hỉnh 2.9. Cấu trúc của chymotrypsin
(а) Mô tả cấu trúc bậc 1, giới thiệu các liên kết disulíưa và sự định vị của các axít amin chìa khoá. Cần nhở rằng, protein gồm 3 chuỗi polypeptit. Các axit amin vị trí hoạt động được tìm thấy cùng nhóm lại với nhau trong cấu trúc 3 chiều; (b) Mô hình chymotrypsin được lắp đầy các khoảng tróng. Các axit amìn thơm chuỗi bên liên kết trong túi đuạc biểu thị (1). Các nitơ amit của Gly193 và S er195 trong khung polypeptit tạo nén hố oxyanion và được biểu thị (2). Các chuỗi bên của các gốc vị trí hoạt động chìa khoá khác gồm S er195, His57 và Asp10ỉ được chỉ ra (3). Khung polypeptit cùa chymotrypsin như một cấu trúc dải xoắn. Các liên kết disulfua được mô tằ bằng đường mờ (4), các chuôi A, B, c được mô tả bằng đưâng đậm (5), (б) và (7); (đ) Sự đóng vị trí hoạt động của chymotrypsin do sự liên kết với cơ chất. Ser193 tấn công nhonrì cacboxyl củà cơ chất (9); sự tăng điện tích âm tren oxy được làm ổn định bởi hố oxyanion (các nitơ amit được biểu thị (8)). Trong cơ chất, axit amin thơm chuỗi bên và nitd amit của liên kết peptit bị phân giải được biểu thị (6) {Nguồn: Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M., Principles of Biochemistry, 1993).
43
Sự tương tác về cấu hình không gian giũa trung tâm hoạt động và cơ chất được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất. Theo quan điểm trước đây của Emil Fishcher (1890), thì trung tâm hoạt động của enzym vốn có cấu trúc không gian tương ứng vỏi cấu trúc phân tử cơ chất (Hình 2.9), cũng giông như sự tương ứng giữa ổ khoá và chìa khoá. Quan niệm này đã nêu được một hình ảnh khá rõ ràng về sự tương ứng hình thể giữa enzym và cơ chất đã được thừa nhận trong một thời gian dài. Tuy nhiên, hiện nay đã có nhiều dẫn liệu thực nghiệm chứng minh cấu trúc không gian của enzym cũng như protein không cứng mà mềm dẻo, linh động. Theo quan điểm hiện nay, khi enzym tương tác vói cơ chất, các nhóm chức ỏ trung tâm hoạt động của phân tử enzym thay đổi vị trí trong không gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất, vì vậy gọi là sự "khớp cảm ứng" (Hình 2.10).
Hỉnh 2.10. (a) Mô hình thuyết ổ khoá và chìa khoá của Emil Fishcher; (b) MÔ hình khớp “cảm ứtig* của Kohland
Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzym và sản phẩm phản ứng, Trung tâm hoạt động của các enzym có cấu trúc bậc 4 có thể nằm trên một phần dưới đơn vị, hoặc bao gồm các nhóm chức thuộc các phần tiểu đdn vị khác nhau. Trong trường hợp thứ hai, khi enzym bị phân ly, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động bị phá huỷ, làm m ất hoạt tính xúc tác của nó. ở enzym điều hoà, ngoài trung tâm hoạt động còn có một vị trí khác có thể tương tác với các chất khác gọi là trung tâm điềú hoà. 2.5. CẤU TR Ú C NHỈỂU CHUỖl V À CẤU TR Ú C DỊ L Ậ P THỂ c ủ a ENZYM 2.5.1. Cấu trúc nhiều chuỗi (Bậc 4)
Rất nhiều enzym có cấu trúc nhiểu chuỗi hay cấu trúc bậc 4 do nhiều tiểu đơn vị cấu tạo nên, mỗi tiểu đơn vị là một chuỗi polỳpeptit. Các tiểu đơn vị trong một phân tử enzym có thể giống nhau, nhưng cũng có thể khác nhau. Những enzym do nhiều tiểu đơn vị câu tạo nên còn 44
được gọi là enzym multime (phân tử protein gồm 2, hoặc nhiều mono me), các tiểu đơn vị còn được gọi là protome. Enzym oỉigome thường có từ 2 - 4 tiểu đơn vị (chuỗi polypeptit), có trường hợp enzym có tới 12 - 20 chuỗi polypeptit, hoặc hơn nữa. Ví dụ; m alat dehydrogenaza của gan chuột cố 2 chuỗi, hexokina của nấm men rượu có 4 chuồi, catalaza có 6 chuỗi, ureaza có 8 chuỗi, ATPaza ty thể tim bò có 10 chuỗi polypeptit,... các enzym oligome, multime thường chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác cao khi phân tử nguyên vẹn, nếu các tiểu đơn vị bị phân ly, tách rời ra thì hoạt tính của chúng bị giảm, hoặc m ất hẳn, hoặc có khi tính đặc hiệu của enzym cũng bị biến đổi. 2.5.2. Enzym dị lập thể (Allosteric enzyme)
Enzym dị lập thể còn gọi là enzym điều hoà hay enzym allosteric, là nhũng enzym điều hoà đặc hiệu trên những vị trí đặc biệt của mạng lưới chuyển hoá, đặc biệt là nhũng quá trình sinh tổng hợp. Trên những phân tử enzym này, ngoài trung tâm hoạt dộng làm chức năng xúc tác, còn có một vị trí khác có thể tương tác vổi các châ't khác gọi là trụng tâm dị lập thể hay trung tâm điểu hoà (trung tốm allosteric). Các chất kết hợp vào trung tâm này được gọi là các chất điều hoà dị lập thể (các chất điểu hoà alỉOBteric). Khi các chất này kết hợp với enzym làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tủ enzym, của trung tâm hoạt động, đo đó làm thay đổi hoạt động xúc tác của enzym. Chất làm tăng hoạt độ của enzym được gọi là chất điều hoà đương. Chất làm giảm hoạt độ của enzym được gọi là chất điều hoà âm, Điểu đáng lưu ý là các chất điều hoà này kết hợp với enzym nhưng không bị chuyển hoá tác dụng của các enzym mà nó kết hợp. Tuy trung tâm điều hoà và trung tâm hoạt động có tác động tương hỗ vói nhau, nhưng là 2 loại cấu trúc khác biệt nhau. Trong nhiểu trưồng hợp, có thể "khoá" trung tâm dị lập thể lại mà vẫn giữ được hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động. Enzym dị lập thể là những enzym có cấu trúc bậc 4, do nhiều tiểu đơn vị cấu tạo nên. Những tiểu đơn vị này thường kết hợp với nhau bằng nhũng liên kết không cộng hoá trị, do đó chúng có thể tách rời ra và kết hợp lại một cách thuận nghịch. Do đặc điểm cấu tạo của phân tử, enzym dị lập thể rấ t mềm dẻo, dễ thay đổi, có thể tồn tại nhiều trạng thái không gian khác biệt nhau (ít nhất là 2 trạng thái) và có thể biến đổi thuận nghịch từ trạng khái này sang trạng thái khác một cách dễ dàng. Vì có cấu trúc bậc 4 nên trong phân tử enzym dị lập thể thường có 2 hay một số trung tâm hoạt động, có thể kết hợp với 2 hay một sô" phân tử cơ chất. Nếu cơ chất thực hiện chức năng của chất điều hoà gọi là điểu hoà đồng thể. Nếu chất điều hoà có cấu trúc khác cơ chất gọi là điều hoà 45
dị thể. Thông thường các enzym dị lập thể được điều hoà theo kiểu hỗn hợp, vừa là đổng thể, vừa là dị thể. Nhiều enzym dị lập thể đã được nghiên cứu kỹ, ví dụ: a) A s p a r ta t tra n sca cb a m o yla za (ATCaza) Là enzym xúc tác phản ứng ngưng tụ cacbamoyl phosphat với aspartat tạo thành cacbamoyl aspartat, là sản phẩm đầu tiên trên con đường sinh tổng hợp pyrimidin và nucleotit của nó, tiêu biểu là xytidin triphosphat (CTP). Aspartat transcacbamoylaza (của E. coli) xúc tác cho phản ứng: phosphat
_o o c nh2
0 = C\
ch2
ỵcu
+
°x
HCV ^ ™ --------- ^ ----- ►
H2N
coo-
cacbamoyl-phosphat
aspartat
~o o c n h 2 ch2 0=c
CH
NH
XCOO-
cacbamoyl-asparlat
Enzym này có cấu trúc bậc 4 gồm 12 tiểu đơn vị được ký hiệu là CcH,;( nghĩa là gồm 6 tiểu đơn vị c có chức nãng xúc tác (catalysis) và 6 tiểu đơn vị R có chức năng điều hoà (regulation). Các đơn vị c và R là do những gen tương úng khác nhau tổng hợp nên. Các tiểu đơn vị xúc tác c có khối lượng phân tử 32.000 Dal, các tiểu đòn vị điểu hoà R có khối lượng phân tử 17.000 Dal, khối lượng phân tử của enzym là 300.000 Dal. Ngưòi ta có thể phân tách phân tử enzym này thành hai đơn vị C3 và ba đơn vị R2. Nhũng tiểu đơn vị xúc tác c có 2 vị trí, một để nhận biết cơ chất asp artat và một để nhận biết phosphat của cacbamoyl phosphat. ở đầu c tận cùng của chuỗi polypeptit của các tiểu đơn vị xúc tác c , có một vị trí gắn ion kẽm (Zn) và ỏ đầu kia của chuỗi polypeptit có một vị trí nhận biết CTP. Các trung tâm hoạt động được tạo thành từ hai đơn vị xúc tác c , một phần ở đơn vị này, một phần ở đơn vị kia (hai vị trí của một tiểu đơn vị này phôi hợp vổi 2 VỊ trí ở 2 tiểu đơn vị kế cận khác), như vậy một đơn vị xúc tác C3 sẽ có 3 trung tâm hoạt động, toàn phân tủ enzym sẽ cỏ 6 trung tâm hoạt động. Người ta có thể dùng thuỷ ngân (Hg) để "khoá" trung tâm điều hoà của ATCaza, làm cho enzym m ất tính "nhạy cảm dị lập thể", đo đó hiện tượng điểu hoà dị lập thể không xảy ra, nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác bình thường của enzym theo phương trình Michaelis. Mô hình cấu trúc của ATCaza dược giới thiệu ở Hình 2.11. 46
■Ca ■1Ỉ2
Ra
Hinh 2.11. Mô hinh phân tửATCaxa
c. Tiểu đơn vị xúc tác;
R. Tiểu đơn vị điều hoà; c3. Đơn vị xúc tác gồm 3 tiểu đơn vị; R2. Đơn vị điểu chỉnh có 2 tiểu đơn vị; Eq. Vùng nhận biết aspartat; P0. Vùng dành cho nhóm phosphat của cacbamoyl phosphate; a, Vùng dị lập thể; z. Vung gắn Zn. (a) Nhìn lừ trên xuống; (b) Nhìn nghiêng (mặt bên).
b) A x e ty l - CoA cacboxylaza Enzym này làm nhiệm vụ điều hoà bưốc phản ứng đầu tiên trong quá trình tổng hợp mối axit béo. Trong gan của chim, enzym này thưòng tồn tại dạng monome (đơn thể) và multime (đa thể), những dạng đơn thể là dạng không có hoạt tính và chỉ có dạng đa thể là có hoạt tính. Enzym này dòi hỏi phải có mặt xitrat hay isoxitrat làm chất điều hoà dương. Khi có m ặt các phân tử xitrat hay isoxitrat, các phân tử đdn thể không có hoạt tính của enzym, khi các đơn thể kết hợp lại thành dạng polyme (polymer - trùng hợp) hay multime (multimer) enzym mới có hoạt tính. Nhiểu monome (không có hoạt tính)
+ xitrat - xitraí
Polyme (có hoạt tính)
Axetyl-CoA cacboxylaza dạng polyme của các mô động vật bao gồm nhiều sợi dài, mỗì sợi trung bình có khoảng 20 đơn vị monome khôi lượng phân tử vào khoảng 8 megađalton và chiểu dài khoảng 400nm. Mỗi monome trong dạng polyme (trùng hợp) đều có gắn một phân tử xitrat. Người ta đã quan sát được các sợi dài dạng trùng hợp tinh bào tương tố bào m3 bằng kính hiển vi điện tử. Mỗi đơn vị đơn thể có 4 đơn vị nhỏ khác nhau tạo thành. Các phản ứng trong quá trình tổng hợp malonyl-CoA đã được suy luận từ việc nghiên cứu bôn đơn vị nhỏ của các monome (monomer). Các đơn vị nhỏ gồm có: hai đơn vị nhỏ làm nhiệm vụ xúc tác là biotin cacboxylaza (BC) và eacboxyl transferaza (CT), một đơn vị nhỏ có gắn biotin làm nhiệm vụ vận chuyển nhóm cacboxyl được gọi ỉà protein mang cacboxyl (CCP) và 47
một đơn vị nhỏ khác là một protein ìàm nhiệm vụ điểu hoà, có trung tâm diểu hoà dương là xitrat. Trung tâm hoạt động của biotin cacboxylaza (BC) có gắn ion cacbonat, trung tâm hoạt động của cacboxyl transferaza (CT) có gắn axetyl - CoA. Biotin được kết hợp vào protein vận chuyển cacboxyl (CCP) bằng liên kết amit giữ nhóm cacboxyl của biotin và nhóm e-NH2 của gốc lysin của protein, tạo nên một "cánh tay di động" có chiểu dài khoảng 14Ắ để vận chuyển nhóm C 02. Sơ đồ mô tả cấu tạo phân tử của axetyl - CoA cacboxylaza được trình bày ỏ Hình 2,12.
Malony(-CaA
Hình 2.12. Phản úng của axetyl — CoA cacboxylaza
Axeiyl — CoA cacboxylaza có ba vùng chíte năng: protein mang biotin; biotin cacboxylaza hoạt hoá C 0 2 bởi tác dụng của nó đến nitơ trong vòng biotin trong phản ứng phụ thuộc ATP; và Iranscacboxylaza’ no chuyển C 0 2 hoạt hoá từ biotin đến axetyl - CoA, lạo thành malonyl - CoA. Cánh tay biotin dải, mểm dổo mang CO5 đã hoạt hoá từ vùng biotin cacboxylaza đến vị trí phản ứng của transcacboxylaza. Trong sơ đổ, mủi tên chỉ phản ứng, Enzym hoạt động trong mỗi trường hđp là màu đen. (Nguồn: Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M., Principles of Biochemistry, 1993).
48
Phản ứng vận chuyển C 02 được thực hiện bằng một quá trình hai bước như sau: Bước 1: phản ứng thứ nhất là phản ứng cacboxyl hoá biotin tác dụng của biotin cacboxylaza _
_____ _________
___ BC
Biotin —CCP + HCOg + H+ + ATP ^ cacboxy - biotin - CCP + ADP + p Bước 2: là phản ứng chuyển nhóm cacboxyl từ cacboxyl transferaza (CT). cr Cacboxyl—biotin - CCP + axetyl - CoA ^ biotin - CCP + manonyl - CoA Trong những phản úng này, gốc biotin của protein mang cacboxyl (CCP) hoạt động như một "cánh tay di động" để chuyển ion bicacbonat (HCO 3 ) từ trung tâm hoạt động của biotin cacboxylaza (BC) đến axetyl - CoA gắn trên trung tâm hoạt động của cacboxyl transferaza (CT). Quá trình vận chuyển cacboxyl có thể hình dung như sơ đồ ghi ỏ Hình 2.12. Cần chú ý rằng, khi yếu tố dị lập thể điều hoà dương (xitrat) gắn vào trung tâm dị lập thể của protein điều hoà sẽ làm tăng Vcực dại đôi vâi quá trình vận chuyển nhóm cacboxyl từ cacboxylbiotin đến axetyl CoA, nhưng không làm thay đổi hay chỉ thay đổi rấ t ít ái lực (Km) của enzym này đôi với axetyl —CoA. 2.5.3. Phức hợp nhiều enzym (multienzyme)
Ngoài những enzym trùng hợp (polymer), trong cơ thể còn gặp những phức hợp nhiều enzym, bao gồm các enzym xúc tác cho dây chuyền phản ứng của một quá trình trao đổi chất xác định, trong đó sản phẩm của một phản ứng do một enzym xúc tậc trưổc là cơ chất của enzym xúc tác cho phản ứng tiếp theo. Ví dụ: hệ thống gồm nhiều enzym xúc tác cho dây chuyền phản ứng sau (Hình 2.13):
( S C
a)
b) Hình 2.13. Phức hdp nhiếu enzym (multienzyme)
(a) Hệ nhiều enzym hoà tan hoặc phân ly; (b) Phức hợp nhiều enzym. Thuờng sản phẩm trung gian của nó không khuếch tán ra khỏi phứt chất; (c) Hệ enzym liên kết màng (Nguồn: Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M., Principles of Biochemistry, 1993).
49
Người ta gặp các phức hợp nhiều enzym trong nhiều quá trình chuyển hoá như quá trình oxy hoá khử cacboxyl của axit pyruvic để tạo thành axetyl-CoA, quá trình tổng hợp axit béo ngoài ty thể ở nấm men, ỏ động vật có vú, ở chim,... quá trình tổng hợp những peptit có hoạt tính kháng sinh như gradimixin, tyroxidin, quá trình tổng hợp tryptophan,... Các enzym trong hệ thông nhiều enzym có thể tồn tại riêng ở dạng hoà tan, không liên kết vối nhau, hoặc có thể kết tụ vối nhau, liên kết vởi nhau khá bền tạo thành phức hệ nhiều enzym. Khi tách riêng khỏi phức hệ enzym, sẽ mất hoạt tính xúc tác. Ngoài ra, một sô' hệ thống enzym có thể liên kết với màng, cơ quan tử của tế bào (màng ty thể, ribosom,...). 2.5.4. Các tiền chất enzym và sự hoạt động của chủng
Phần lớn các enzym được tổng hợp trong cơ thể thành những phân tử enzym có hoạt tính, nhưng có một sô' enzym khi mới tổng hợp không có hoạt tính xúc tác gọi là tiền chất enzyme, hay còn được gọi là proenzym, hoặc zymogen. Trải qua một quá trình biến đổi, sắp xếp lại cấu trúc phân tử mối trở thành enzym hoạt động. Quá trình chuyển hoá zymogen thành enzym gọi là quá trình hoạt hoá zymogen. Quá trình này có thể là tự xúc tác, hoặc do các proteaza tương ứng xúc tác (Bảng 2.3). Bảng 2.3. Một sõ' v( dụ về zymogen vả enzym xúc tác cho quá trinh hoạt hoá zymogen Zymogen
Enzym
Pepsinogen*
Pepsin
Pepsin
Chymotrypsinogen
Chymotrypsin
Trypsin, chymotrypsin
Trypsinogen
Trypsin
Trypsin, enteropeptidaza
Procacboxipeptidaza
Cacboxipeptidaza
Trypsin
Proelastaza
Elastaza
Trypsin
Enzym xúctáccho quá trình hoạt hoá
(* đuợc tổng hợp ở dạ dày, các enzym khác được tổng hợp ỏ tuỵ)
Qua bảng trên ta thấy trypsin rấ t quan trọng. Phải có đủ trypsin mới đảm bảo được quá trình tiêu hoá protein ỏ ruột non. Đầu tiên trypsin đi vào tá tràng, các tế bào tá tràng sản sinh ra enzym enteropeptidaza, enzym này hoạt hoá trypsinogen tạo thành một lượng nhỏ trypsin, trypsin hoạt hoá trypsinogen và các zymogen khác. Do đó, sự hoạt hoá trypsinogen nhò enteropeptidaza là bưổc hoạt hoá có vai trò đặc biệt quan trọng. 50
Ngoài các proteaza kể trên, trypsin cũng hoạt hoá prophospholipaza A2 tạo thành phospholipaza A2. Quá trình này xảy ra ở tá tràng, là nơi có muối của axit m ật được đưa từ túi mật đến. Một số đặc điểm chung của quá trình hoạt hoá: (1) Là quá trìn h thuỷ phân giới hạn protein, cắt dứt một hay một số liên kết peptit ở đầu N của phân tử zymogen. Đoạn peptit .được cắt có thể bị loại ra, do đó mà khôi lượng phân tử của enzym cố hpạt tính thường nhỏ hơn khối lượng phân tử của chính tiền chất tạo ra nó, hoặc đoạn peptit vẫn gắn với phần còn lại của phân tử nhò các cầu disulfua. (2) Khi liên kết peptit bị cắt đứt thưòng làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, tạo thành phân tỏ enzym như làm bộc lộ, hoặc tạo ra trung tâm hoạt động của enzym. y o (3) Hiệu suất hoạt hoá zymogen phụ thuộc vào điểu kiện hoạt hoá, nồng độ zymogen, bản chất và nồng độ của enzym xúc tác cho quá trình hoạt hoá, nhiệt độ, pH và một sô*yếu tô" khác. Hiện tượng tổng hợp ra các zymogen có ý nghĩa sinh học quan trọng, có thể nói rằng, các proteaza trong ống tiêu hoá được tổng hdp qua giai đoạn trung gian như vậy chính là một cơ chế tự bảo vệ của cơ thể, vì nếu không như vậy thí chính các tuyến đã tổng hợp nên các loại enzym này sẽ bị tiêu huỷ bởi chính nhũng enzym do chính tổng hợp nên. Quá trình hoạt hoá các zymogen của tuỵ nói chung vừa phải đảm bảo được nhu cầu, vừa phải đúng lúc. Khi quá trình hoạt hoá xảy ra không đúng lúc (quá sớm), bị bệnh sợi tuỵ (pancreatilith) rấ t nguy hiểm, có thể chết, ở bệnh này, các zymogen được hoạt hoá ngay khi còn ở bên trong tuỵ dẫn đến việc phá huỷ mô tuỵ và các mạch máu. Do đó, các zymogen thường được bao bọc trong màng protein và lipit. Ngoài ra, tuỵ cũng tiết ra chất kìm hăm đặc hiệu cùng vổi các zymogen và được giữ trong các hạt zymogen. 2.5.4.1. H oạt h oá pepsinogen
Pepsinogen của lợn có khôi lượng phân tử khoảng 42.000 Dal và của pepsin lợn vào khoảng 35.000 Dal. Pepsin là một protein có tính axit cao hơn pepsinogen rấ t nhiều và di chuyển trong điện trường dạng những ion âm ỏ môi trường có pH = 1 trỗ lên, trong khi đó pH của pepsinogen là 3,7 - sự hoạt hoá pepsinogen bao gồm sự loại bỏ khoảng 1/5 phân tử, như vậy phần bị loại bỏ phải có tính kiềm trội hơn hẳn phần còn lại. 51
Quá trình tạo thành pepsin của lợn từ pepsinogen có thể biểu diễn như sau: Pepsinogen — pepsin ^ phức hợp pepsin —chết ức chế + 5 peptit _
pH < 5,4
Phức hop pepsin - chất ức chế Chất ức chế
pepsin ^
4
^
—
pH > 5,4
pepsin + chất ức chế
peptit
Trong quá trình hoạt hoá pepsinogen, bằng phương pháp chuẩn độ, thấy rằng, 1 phân tử pepsin được tạo thành kèm theo vói sự bẻ gãy 9 liên kết peptit. 6 peptit đã được sản sinh ra trong quá trình hoạt hoá (gồm 5 peptit nhỏ và 1 peptit lón), peptìt lân nhất là một chất ức chế pepsin. Ớ pH 5,4, chất ức chế này vẫn kết hợp vói phân tử pepsin, do đó với những điểu kiện như vậyf quá trình này không thể thực hiện được cơ chế tự xúc tác. ở pH thấp hơn, chất ức chế có thể phân ly thuận nghịch ra khỏi phân tử enzym. Khôi lượng phân tử của chất ức chê được xác định vào khoảng 3.000 Dal và có 29 gốc axit amin, trong đó có 1 gốc arginin, 1 gốc tyrosin và 4 gốc lysin, 4 gốc axit aspartic và hai gốc axit glutamic, Tác dụng của pepsin, chất ức chế (inhibitor) bị thuỷ phân thành 4 peptit nhỏ. Cùng với chất ức chế này, quá trình hoạt hoá còn giải phóng ra 5 peptit nhỏ khác như đã nói ô trên. Đây là những peptit trung tính, trung binh có khoảng 10 gốc axit amin, khối lượng phân tử của cả 5 peptit vào khoảng 4.000 Dal. Như vậy, cùng với sự thuỷ phân chất ức chế, toàn bộ quá trình hoạt hoá đã được thực hiện vối sự bẻ gãy 9 liên kết peptit. Sơ đồ mô tả sự biến đổi pepsinogen thành pepsin (Hình 2.14). Pepsinogen 42.000 Oal
+ Leu - He... Lẹụ - Gỉu... lie - Gly - Asp - His - Glu... Val - Leu - Ala I
_______ỉ I____ ____ I 1
I
I
__________________
I
.
4.000 Dal
3.000 Dal
35.000 Dal
5 peptỉt
Chất ức chế
Pepsin
X X,
1
Hỉnh 2.14. Sự biên đổi pepsinogen thành pepsin
52
2.S.4.2. H oạt ho á tryp sinogen
Sự nghiên cứu động học của quá trình hoạt hoá trypsinogen thành trypsin đă được Northrop nghiên cứu kỹ. Trypsinogen tinh thể có thể được hoạt hoá bằng chính trypsin. Trypsinogen cũng dược hoạt hoá bằng enterokinaza (enteropeptidaza —một enzym thuỷ phân protein có trong dịch tiết của ruột) và một số enzym tương tự từ nguồn gốc khác, ví dụ như "kinaza" của Peniciỉlinum sp. Tất cả các trường hợp đểu tạo ra cùng một loại trypsin. Trong quá trình tự xúc tác, có thể xảy ra hai phản ứng cạnh tranh nhau: một phản ứng (a) tạo thành trypsin có hoạt tính và một phản ứng (b) tạo thành một protein không có hoạt tính enzym, sự phân phối pepsinogen cho hai phản ứng này phụ thũộc vào pH và sự có m ặt của một số ion Ca làm tăng cường phản ứng (a) và ngăn chặn phản ứng (b). Khi có m ặt CaCl2 0,02 moi và được khởi đầu với sự có m ặt một lượng nhỏ (vết) enterokinaza thì phản ứng sẽ xảy ra như một quá trình tự xúc tác thuần nhất. Ca2+ và pH thấp sẽ làm tăng hiệu suất enzym có hoạt tính, nhưng ở pH thấp thì tốc độ hoạt hoá kém. Hai phản ứng cạnh tranh nhau trong quá trinh hoạt hoá trypsinogen có thể biểu thị như sau: Trypsinogen __trypsin ^ Trypsin + hexapeptit h o ặ c “ k in a z a ”
Trypsinogen
trypsin
Protein không có hoạt tính enzym
Kinaza của nấm mốc có sự khác biệt rõ rệt với các kinaza khác là nó hoạt động trong dung dịch axit (pH thích hợp nhất vào khoảng 3,5), ở pH này thì trypsin không hoạt động được, do đó trong trường hợp này, sự hoạt hoá không phải là hiện tương tự xúc tác. Enteropeptidaza hoạt động tốt nhất trong vùng pH = 6 - 8, nhưng vì chính trypsin cũng hoạt động trong vùng pH này và xúc tác sự biến đổi trypsinogen thành cả trypsin có hoạt tính và protein không có hoạt tính enzym, cho nên khó có thể nói một cách chắc chắn là, sự hoạt hoá do trypsin là bao nhiêu và do enteropeptidaza là bao nhiêu. Có thể ước tính được sự hoạt hoá do một mình enteropeptidaza bằng cách cho bằng một lượng nhỏ trypsinogen phản ứng vối một lượng tương đối lớn enteropeptidaza, đặc biệt là ở pH = 6 (sự hoạt hoá này theo động học bậc một). Ngược lại, ngưòi ta cũng ước tính được sự hoạt hoá của 53
một mình trypsin bằng cách sử dụng một lượng lớn trypsinogen với một vết enteropeptidaza (cùng với trypsin), và như vậy trưòng hợp này có thể coi như hiện tượng tự xúc tác. Trypsinogen của bò có khối lượng phân tử vào khoảng 24.000 Dal và trypsin của bò có khôi lượng phân tử thấp hơn một ít, 2 loại phân tử này có sự khác nhau về hấp thụ quang phổ tử ngoại. Mỗi loại phân tử kể trên chỉ do một chuỗi polypeptit cấu tạo nên và có thể phát hiện được nhóm a - amin tận cùng, nhưng không phát hiện được nhóm tận cùng bằng cách sử dụng cacboxypeptidaza. Điều đó gợi ý một cấu trúc vòng ỏ đầu này nhưng cũng có thể do sự cản trỏ không gian nào đó nên cacboxypeptidaza không tác động được. Nhóm ở đầu N của trypsinogen bò là isolơxin, nhưng nhóm ỏ đầu N của trypsin là valin. Một đoạn 6 axit amin đã tách ra khỏi trypsinogen trong quá trình hoạt hoá và người ta đã phân lập được 1 hexapeptit gồm 6 axit amin này là: Val - Asp - Asp - Asp - Asp - Lys. Sự loại bỏ hexapeptit này đã làm cho phân tử thay đổi hình dạng không gian và có lẽ vì thế đã tạo điều kiện cho sự hình thành trung tâm hoạt động của enzym (Hình 2,15), Ngoài ra, người ta cũng đã nghiên cứu sự hoạt hoá của nhiều trypsinogen từ tuỵ của nhiều động vật khác. Trong khi hoạt hoá trypsinogen tuỵ lợn, ngưòi ta thấy một octapeptit (Phe —Thr - Pro Asp4 - Lys) đã được giải phóng ra. Không giống như trường hợp của bò, axit amin đầu N của trypsinogen tuỵ lợn là Ala-Asp (NH 2), hoặc Ileu Ala - Glu (NH2). Trong quá trình biến đổi trypsinogen thành trypsin, đầu c của chuỗi không bị biến đổi. 2.S.4.3. H oạt hoầ chym otrypsinogen
Thưòng có 2 loại chymotrypsinogen tách chiết từ tuỵ, chymotrypsinogen A và chymotrypsinogen B. Chymotrypsinogen A còn được gọi là a chymotrypsinogen hay chymotrypsinogen a. Hai loại chymotrypsinogen A và B thường tồn tại vối số lượng gần bằng nhau trong dịch tuỵ của bò. Phân tử chymotrypsinogen A là một chuỗi polypeptit đơn, bao gồm 249 axit amin và có 5 liên kết ngang do những cầu nối disulfua tạo nên. Phân tử này có tói 4 gốc arginin, 11 gốc lysin, 29 gốc serin. Một trong sô' những gốc serin này cùng với histidin đóng vai trò quan trọng trong trung tâm hoạt động của chymotrypsinogen (Hình 2.16). 54
Hình 2.15. Sự biến đổi trypsinogen thành trypsỉn của bò
(Neurath, H. và Dixon, G.H., Federation Proe, 1957)
Trên sơ đồ này, liên kết peptit giũa lysin và isolơxin bị bẻ gãy trong quá trình hoạt hoá. Cả hai loại chymotrypsinogen đều được hoạt hoá dưới tác dụng của trypsin. Chymotrypsin chỉ có thể tham gia vào sự xúc tác những biến đổi tiếp sau. Do đó, quá trình hoạt hoá chymotrypsinogen không phải là quá trình tự xúc tác. Từ chymotrypsinogen A, qua quá trình hoạt hoá, có thể tạo ra a, p, 5 và 7t chymotrypsin. a, p và y- chymotrypsin đã được kết tinh ở dạng tinh sạch, còn 5- chymotrypsin được kết tinh dạng hợp chất diisopropyl phosphat. Chymotrypsinogen B được hoạt hoá thành* chymotrypsin B, enzym này cũng đã được kết tinh. Nếu chymotrypsinogen A được hoạt hoá bằng một lượng nhỏ trypsin thì quá trình sẽ xảy ra một cách chậm chạp, tốc độ hoạt hoá sẽ tỷ lệ với sô" lượng trypsin đã được đưa vào phản ứng và tuân theo động học của phản ứng đơn phân tử. Với điều kiện này, a - chymotrypsin được tạo ra là chủ yếu, không chiếm quá 50% tổng hoạt tính của chymotrypsin sản phẩm. Nếu để lắng trong vài ngày thì có thể lấy được nhũng tinh thể của những dạng chymotrypsin khác, đó là những tinh thể hỗn hợp của p và y~ chymotrypsin cùng vỏi một ít protein không có hoạt tính enzym. Nếu kết tinh lại ở một pH khác thì có thể thu được y- enzym ở trạng thái tinh khiết. Với nồng độ muối cao hơn, có thể th u được nhũng tinh 55
thể hỗn hộp của p~ chymotrypsin với protein không có hoạt tính enzym sau khi đã loại bỏ y-chymotrypsin. Khi dung dịch của những tinh thể hỗn hợp này được giữ ở 35°c và ở pH = 8 thì ị3- chymotrypsin phân giải protein bất hoạt và sau đó có thể thu được (3- chymotrypsin ở trạng thái tinh khiết bằng phương pháp tái kết tinh. Hai enzym p và y hầu như chắc chắn được sản sinh ra từ a—chymotrypsin vì nếu để các dung dịch oc—chymotrypsin tái kết tinh những điều kiện n h ất định, thì trong tấ t cả các trường hợp đểu thu được cả hai loại p và y- chymotrypsin. Sự tạo thành Y~ chymotrypsin sẽ thuận lợi hơn nếu được ủ trong một thời gian ngắn ồ những pH và nhiệt độ cao hơn và sự tạo thành (3- chymotrypsin sẽ thuận lợi hơn trong những điều kiện ngược lại với những điểu kiện kể trên. Bằng cách điểu chỉnh đến những điều kiện thích hợp, có thể biến đổi a - chymotrypsin thành {3- chymotrypsin hay y—chymotrypsin theo ý muôn, tuy nhiên khoảng 35% a - chymotrypsin đã bị m ất đi trong quá trình biến đổi này. Sau khi đã thu được |3- và y—chymotrypsin, có thể kết tinh lại những enzym này mà không gây sự biến đổi nào; hai enzym này không biến đổi lẫn nhau và không biến đổi ngược lại thành a chymotrypsin được. Các enzym a -, (3- và Ỵ—chymotrypsin rấ t khó phân biệt về tính đặc hiệu và hoạt tính của chúng đôi vói một số cơ chất rất giông nhau, về phương diện miễn dịch cũng khó phân biệt các enzym này. Tuy nhiên chúng có một số khác biệt về tính chất protein, độ hoà tan, tôc độ bất hoạt và khôi lượng phân tử của chúng. Sự giải thích những khác biệt về khối lượng phân tử khá phức tạp vì a - chymotrypsin tồn tại chủ yếu dạng dime. Nếu sự hoạt hoá chymotrypsinogen A được thực hiện với những lượng lớn trypsin ô 0°c thì động học trỏ nên phức tạp hơn. Jacobsen đã có những nghiên cứu động học khá kỹ và đã suy luận rằng, quá trình này xảy ra khác vối quá trình kể trên, trước hết sinh ra một chymotrypsin rấ t hoạt động và rấ t không bền gọi là n - chymotrypsin, do tác dụng thuỷ phân một liên kết peptit. Hoạt độ của enzym này vào khoảng 2,5 lần hoạt độ của a - chymotrypsin. Tác dụng thuỷ phân một liên kết peptit thứ hai, JC- chymotrypsin nhanh chóng được biến thành ô - chymotrypsin với hoạt độ vào khoảng 1,5 lần hoạt độ của a - chymotrypsin. Mặt khác, 71- chymotrypsin có thể được biến thành a—chymotrypsin do sự thuỷ phân 3 liên kết peptit, nhưng với sự hoạt hoá nhanh, hiệu suất của a—chymotrypsin 56
chỉ vào khoảng 1%. Bettelheim và Neurath đã phân lập được nhưng dẫn xuất với di-isopropylphosphat ở dạng tinh khiết của những enzym này. Để thu được 71— chymotrypsin thì cần phải ức chế tác dụng của chymotrypsin bằng chất ức chế đặc hiệu [3- phenylproprionat; với nhiều bằng chứng, một sô tác giả đã kêt luận rằng, sự biến đổi 7T- chymotrypsin thành 5- chymotrypsin là do chính chymotrypsin. Người ta thấy hoạt độ của 71- chymotrypsin và ô- chymotrypsin gần bằng nhau. 5- chymotrypsin có cả Vcực(!íi vâ ái lực với cơ chất tổng hợp lớn hơn a - chymotrypsin, chứng tỏ rằng sự khác biệt này không chỉ đơn thuần là vấn đề sô' lượng các trung tâm hoạt động. Bản chất của sự biến đổi trong quá trình hoạt hoá chymotrypsinogen được làm sáng tỏ bằng sự xác định những nhóm tận cùng trong những dạng khác nhau của enzym này với những công trình của trường phái Desnuelle và Neurath. Bằng nhũng phưdng pháp thông thưòng, không thể xác định được những nhóm tận cùng của chymotrypsinogen A, do đó lúc đầu người ta giả thuyết rằng, phân tử này là một chuỗi vòng kín. Tuy nhiên, Bettelheim đã chỉ ra rằng, sau khi oxy hoá đã xác định được nhóm đầu N là một gốc xystein. Tương tự như vậy, ngưòi ta cũng không xác định được nhóm đầu c của chymotrypsinogen nguyên thuỷ tác dụng của cacboxypeptidaza. Sau khi khử hoá liên kết disulfua của phân tử này, hoặc làm biến tính bằng ure, người ta có thể xác định được gốc asparagin đầu N (Asp-NH2) của nó. Khi làm đứt liên kết disulfua của chymotrypsinogen A, người ta không thấy có sự thay đôi về khối lượng phân tử, như vậy quá trình trên chỉ là sự mở chuỗi đơn thuần. Chuỗi này bắt đẩu bằng một gốc nửa xystin và kết thúc bằng gốc asparagin, có chứa khoảng 240 gôe axit amin. Có lẽ cấu trúc bậc ba của phân tử này đã làm cho các thuốc thử hoá học, hoặc enzym đặc hiệu không tác dụng được vào các nhóm cuối của nó. Trong quá trình biến đổi n - chymotrypsin thành ỗ- chymotrypsin đã giải phóng ra một dipeptit (Ser - Arg) và khi biến đổi chymotrypsinogen A thành neochymotrypsinogen tác dụng của chính chymotrypsin đã giải phóng ra một dipeptit (Thr - Asp - NHj;). Với những kết quả thí nghiệm đã thu được, ngứòi ta nhận thấy rằng, quá trình hoạt hoá chymotrypsinogen bao gồm sự thuỷ phân 4 liên kết peptit: Tyr - Thr, Asn - Ala, Leu - Ser và Arg - Ileu. Quá trình hoạt hoá chymotrypsinogen thành chymotrypsin có thể tóm tắt theo sơ đồ của Hình 2.16. 57
Các gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động
.24
146 149 a) Sơ đồ của chymotrypsin với các gốc trong trung tâm hoạt động a - chymotrypsin
chymotiypsínogen
Chuỗi A 13 16
13 16
,—
,___
42
5 I
3 1 1
^His
I 1----- 4 57 1 5B s
f1— —i 58
b) Sơ đổ của sự biến đổi chymotrypsinogen thành chymotrypsin
42
(His 57
Ì
Chuôi B
•Asp102 14 15 Ser-Arg
1Jo
147 148 Thr-Asn
I I
122
122
Sự 3 hoạt hoà bải dipeptit
136
146 149 p
168
146 149
'
SI 182 191 < 1Ser 195 201
S Ị S
? 168 IChuôi c
s
s s
182 191
i 1Ser 201
221
221
245
245
195
1 s
I s I
c) Mô hình không gian ba chiều cửa chymotrypsin
Hlnh 2.16. Quá trinh hoạt hoá chymotrypsinogen thành chymotrypsín
(Nguồn: Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M., Principles of Biochemistry, 1993).
58
CÂU HỎI
1.
Thành phần cấu tạo của enzym?
2.
Hãy làm rõ các khái niệm sau a) Nàng lượng hoạt hoá b) Xúc tác c) Hoạt động (trung tâm) d) Coenzym
3.
Hãy nêu một số co-factor được tìm thấy trong enzym và miêu tả ngắn gọn chức năng của chúng.
4.
Thế nào là enzym dị lập thể? Cho ví đụ.
5.
Hãy nêu một sô" con đưòng chuyển hoá các tiền enzym (pro-enzym) thành enzym và cho ví dụ.
59
Chương 3
CẢN BẰNG LIÊN KẾT PROTEIN - PHỚI TỬ
Các enzym xúc tác cho sự chuyển hoá hoá học của một phân tử, cơ chất thành một dạng phân tử khác, đó là sản phẩm. Tuy nhiên, để điều này có thể xảy ra được thì enzym và cơ chất phải gặp nhau và tạo ra một phức hệ thứ cấp nhờ cơ chất liên kết vối một vị trí đặc hiệu trên phân tử enzym, đó là trung tâm hoạt động, ở chương này chúng ta sẽ khảo sát các tương tác liên kết xảy ra giữa các đại phân tử là các protein (ví dụ: enzym) và các phân tử khác, thường là các phân tử khôi lượng thấp. Những ví dụ về các tương tác này bao gồm chất chủ vận và chất đổi kháng Hên kết vối các thụ thể; các phức hệ protein —protein và protein axit nucleic; cơ chất, chất hoạt hoá và chất ức chế liên kết với enzym và ion kim loại với cofactơ (cộng tô) liên kết với các protein. Chúng ta sẽ định nghĩa một cách chung chung các chất kèm theo có khôi lượng phân tử nhỏ hơn ỏ trong tương tác liên kết là các phối tử (Ligand-L) và các chất kèm theo liên kết với các đại phân tử là các thụ thể (Receptor-R). Các biểu thức toán học được đưa ra để diễn tả về mặt số lượng các tương tác trên. Các phương pháp đồ thị biểu diễn sô" liệu thu được cũng được trình bày ỏ đây để ngưòi đọc có thể xác định được hằng sô' cân bằng liên quan đến sự phân ]y phức hệ. Cuôì chương là các phương pháp thí nghiệm được trình bày sơ qua để nghiên cứu các tương tác protein - phôi tủ. 3.1. HẰNG S Ố CÂN B ẰN G PHÂN LY, K d
Chúng ta sẽ bắt đầu chương này bằng cách định nghĩa trạng thái cân bằng giữa hai loại phân tử thụ thể: tự do và liên kết với phối tử. Bây giò chúng ta sẽ thừa nhận là thụ thể có một vị trí liên kết với phôi tỏ nên bất cứ một phân tử thụ thể nào, hoặc là ỏ trạng thái tự do, hoặc là ở trạng thái liên kết đều vói phối tử. Cũng như vậy, bất cứ phân tử phối tử nào cũng phải tự do, hoặc liên kết với một phân tử th ụ thể. Giả định này dẫn đên cặp phương trình bảo toàn khôi lượng dưới đây: [R] = [RL] + [R]f (3.1) [L] = [RL] + [L]f (3.2) Trong đó [R] và [L] lần lượt là tổng nồng độ của thụ thể và phối tử. 60
[R]f và [L]f là các nồng độ của các phân tử tự do. [RL] là nồng độ của phức hệ phôi tử - thụ thể. Sự cân bằng giữa hai dạng thụ thể tự do và liên kết sẽ được thiết lập ở bất kỳ một cặp điều kiện dung dịch đặc hiệu nào. VỊ trí cân bằng thường được định lượng bằng hằng sô" phân ]y, K,ị, đối vói phức hệ ở trạng thái cân bằng: [R]f[L]r K<= p u r (3'3) Ái lực tương đối của các phức hệ thụ thể “ phổi tử tỷ lệ nghịch với giá trị Kd của chúng, phôi tử liên kết càng chặt thì giá trị của hằng số phân ly càng thấp, Do đó các hằng số’phân ly được sử dụng để so sánh ái lực giữa các phối tỏ khác nhau với một thụ thể riêng và cũng để so sánh ái lực của các thụ thể khác nhau với cùng một phối tử. Hằng số phân ly có thể liên quan vỡi năng lượng tự do Gibbs của sự liên kết trong phức hệ thụ thể - phối tử (Bảng 3.1) như sau: A G ^ K é -t-R T ln ÍK d )
(3 .4 )
Bảng 3.1. Mối quan hệ giữa Kdvả AG|lènkit đối với các phức hệ thụ thể - phối tử ỏ 25°c Kd (M)
AG(f4nWt
10“3 (mM) 10"*(mM) lO^ímM) 1CT6 (nM) 10-7(nM) 1 0-^M ) 1CT9 {nM) 10-10 (nM) 10-11 (nM) 1 0 ',s (pM)
- 4 ,0 8 -5 ,4 4 -6 ,8 0 - 8 ,1 6 - 9 52 - 10,87 -1 2 ,2 3 -1 3 ,5 9 -1 4 ,9 5 -1 6 ,5 1
* Tính toán theo phương trình (3.4).
Chúng ta có thể chú ý đến dấu hiệu thay đổi ở dưái đây, liên quan đến cách biểu diễn đặc trưng năng lượng tự do Gibbs. Đó là vì trong các tiền đề hoá học chung, năng lượng tự do thưòng được biểu diễn ỏ phản ứng thuận dưới dạng hằng số kết hợp: A G ^-v = - R T ln ( - [Ry -) LKJfLMf
(3.5)
A G ^ ^ -R T M K .,)
(3.6) 61
Điểm trái ngược giữa công thức (3.4) và (3.6) phản ánh không nhiều mổi quan hệ nghịch đảo giữa hằng sô" phân ly Kd và hằng sô' kết hợp Ka: K d= - L ^■a
(3.7)
Ở đây chúng ta có thể băn khoăn: tại sao các nhà hoá sinh lại chọn cách biểu diễn môi quan hệ kết hợp dưới dạng hằng số phân ly chứ không phải là hằng số kết hợp thông thường hơn, hay gặp ở các sách vật lý và hoá học. Lý do là hằng số phân ly có đơn vị là mol và do đó có thể được tương đương vói một nồng độ phối tử đặc hiệu; điều này sẽ rõ ràng hơn ỏ mục 3.3, phần mà chúng ta sẽ thảo luận về các thí nghiệm gắn vói trạng thái cân bằng. 3.2. ĐỘNG HỌC VỚ! TRẠNG THÁI CÂN BẰN G
Trước tiên chúng ta hãy xem xét một trường hợp đơn giản của hai phân tử liên kết mà không có bất kỳ phản ứng hoá học tiếp theo nào. Giả sử là hai phân tử R và L, liên kết thuận nghịch vối nhau trong dung dịch tạo thành phức hệ đôi RL. Trạng thái cân bằng giữa các thành phần tự do, R và L, và phức hệ đôi RL sẽ bị chi phôi bởi tỷ lệ tạo thành phức hệ đôi RL và tỷ lệ phân chia phức hệ vừa được hình thành, ở đây chúng ta sẽ định nghĩa hằng số' tỷ lệ bậc hai với phức hệ kết hợp là kkỄt hợp và hằng số tỷ ]ệ bậc một với phức hệ phân ly là kphànlr k k ế t hợp
R + L ỈF = ^
RL
(3.8)
kphân ly
Từ đó người ta đưa ra hằng số phân ly cân bằng đôì với phức hệ là ty so
kphSn ly
^ki>l hợp’
Kd =
(3 .9 ) ^ k é ì. hợp
ở hầu hết các điều kiện thí nghiệm, sự hình thành phức hệ đôì sẽ dẫn đến sự thay đổi nhỏ trong nồng độ phối tử tự do; từ đó ta có phương trình: [RL] t - [RL]cânb in , [1 - exp (—
8át dược t)]
(3.10)
Trong đó [RL]t là nồng độ của phức hệ đôi ở thòi gian t, [RL]cénbinKlà nồng độ của phức hệ đôi ở trạng thái cân bằng và kciuan aốt dược là giá trị hằng sô tỷ lệ bậc một giả khi đạt đến trạng thái cân bằng, được xác định 62
bằng thí nghiệm. Hình 3.1 minh hoạ đường cong phát triển động lực học quá trình tiên đên trạng thái liên kết cân bằng của phức hệ thụ thể phối tử. Đường đi qua các điểm số liệu trong hình là một đường bình phương tối thiểu phi tuyến phù hợp với phương trình (3.10). Từ đồ thị này, nhà nghiên cứu có thể ước lượng được kqunn9átưược-
Thời gian (giày)
Hinh 3.1. Đường biểu diễn thời gian đạt đến trạng thái cân bằng sau khi trộn thụ thê’ với phối tử. Dữ liệu dược phù hợp vái phương trinh (3.10), từ dó đánh giá hằn g s ố tỷ lệ bậc một giả (kqoin .itdưạc) thu được.
0
2
4
[Q.ụM
6
8
10
Hỉnh 3.2. Đồ thị của hằng s ố tỷ lệ (kquan .ụ dưọc) khi đạt đến trạng thái cả n bằng dưói dang hàm s ố củ ã nống đọ phối tử. Cac s ố tiẹu được phù hdp vdi một hàm tuyến tính có độ nghiêng bằng kkft hỢf>và giá trị chặn của y bằng kphỂn ly.
63
Để liên kết thuận nghịch, có thể chỉ ra giá trị của k<,Uiin slU(in*, tỷ lệ trực tiếp với nồng độ phối tử như ỏ phương trình dưới đây: k q u a n sát dược -
k p h ỉ n ly ^ ^ k ế t hợp [ L ] f
( 3 .1 1 )
Do đó người ta có thể xác định được giá trị của sát Jược ở một dãy các nồng độ phối tử từ các thí nghiệm minh hoạ ở Hình 3.1 một đồ thị vẽ lại của kqUHn ait dưỢcdưới dạng hàm của nồng độ phôi tử phải đưa ra sự phù hợp tuyến tính với độ nghiêng bằng kkèt hợpvà giá trị chặn của y bằng kphânly (Hình 3.2). Từ các giá trị này, hằng sô" phân ly cân bằng có thể được xác định bằng phương trình (3.9). 3.3. C Á C PH É P ĐO LIÊN KẾT ỏ TRẠN G THÁI CÂN B Ằ N G
Về cờ bản thì hằng số phân ly cố thể được xác định từ các nghiên cứu về động lực học nhưng trong thực tế, các quá trình động lực học này thưòng xảy ra trong một khoảng thời gian ngắn, điều này làm cho chúng trở thành thách thức về mặt thí nghiệm. Vì th ế các nhà nghiên cứu chủ yếu nghiên cứu về các tương tác của thụ thể —phối tử trưôc thời điểm cân bằng. 3.3.1. Nguồn gốc của đường đẳng nhiệt LANGMUIR
Ớ trạng thái cân bằng, nồng độ của phức hệ RL là cô" định. Do đó tỷ lệ kết hợp vàphân ly hệ phải bằng nhau.Xem lại sơ đồ về sự cân bằng ỏ công thức (3.3), chúng ta thấy rằng, tỷ lệ của sựkết hợp và phân ly được đưa ra ỏ các công thức (3.12) và (3.13) lần lượt như sau: ~ ^ = k kèUflp[R]r [L]f
(3.12)
= k phàn)v[RL] (3.13) at Một lần nữa, ở trạng thái cân bằng, các tỷ lệ trên phải bằng nhau, đo đó: kkô'thdp[R]f [L ]f- kphãn lyfRL]
(3.14)
[RL] = ^ a -
(3.15)
hoặc [R]f [L]f
phần ]y
Sử dụng đẳng thức k két hợ/kphẳti ly tương đương vởi hằng sô" kết hợp cân bằng Ka, chúng ta có: [RL] - Ka [R]f [L]f (3.16) 64
Hiện nay, trong hầu hết các thí nghiệm đang thiếu một phương pháp đo đúng nồng độ thực tế của phối tử tự do hay protein. Chính vì vậy chúng ta thường dùng phương trình dưới dạng tổng nồng độ của protein và/hoặc phối tử thêm vào với các lượng được người làm thí nghiệm điều chỉnh sẵn. Nếu chúng ta dùng phương trình bảo toàn khối lượng (3.1), chia cả hai vế cho 1 + ([RL]/[L]ị) và sử dụng một ít kiến thức đại số học, chúng ta sẽ được công thức sau: [R ]f= — I S n
(3.17)
[R]f sử dụng đẳng thức Ka = [RL] / [R]f[L]f và một ít kiến thức đại sô", ta nhận được công thức: [RL] = Ka [L]f---- J2 J----l + K a[L]f
(3.18)
Sắp xếp lại và dùng đẳng thức Kd = 1/Ka sẽ dẫn đến công thức: tRL]= ỹIVJ I r i i
(319)
Một lần nữa chúng ta cho rằng, trong hầu hết các điều kiện, nồng độ của thụ thể ít hơn nhiều so vối nồng độ của phối tử. Do đó việc hình thành phức hệ đôi không làm giảm đáng kể nồng độ của phối tử tự do. Vì vậy chúng ta có thể xem nồng độ của phối tử tự do với tổng nồng độ phối tử đã được thêm vào là gần bằng nhau. [L]r« [L] (3.20) Với sự xấp xỉ trên thì công thức (3.19) có thể được viết lại như sau: [R L )= j m = _ im _ K d + [LJ .
(3.21)
[L] Phương trình này diễn tả một dường hypecbol đặc trưng cho sự liên kết bão hoà ở nhiều trạng thái hoá sinh, vật lý và hoá học. Nó được Langmuir phát hiện lần đầu tiên để miêu tả sự hấp phụ cácphân tử khí lên bề m ặt của chất rắn như là một hàm số về áp suất ởnhiệt độcô' định (ví dụ ở các điểu kiện đẳng nhiệt). Do vậy phương trình trên được gọi là phương trình đẳng nhiệt Langmuir. Vì nhờ có phương trình này mà dữ liệu độ phối tử tổng số, đôi khi được đề cập đến như là đưòng đẳng nhiệt t
65
liên kết. Hình 3.3 thể hiện hai sự tính toán đường đẳng nhiệt liên kết đặc trưng cho trạng thái cân bằng liên kết thụ thể - phôi tử. Đưòng cong vẽ qua các điểm trong mỗi trường hợp thể hiện bình phương tối thiểu phí tuyến phù hợp nhất với dữ liệu ở công thức (3.21); từ đó nhà nghiên cứu có thể nhận được sự xấp xỉ cả giá trị Kd và nồng độ thụ thể tổng số. Các đường đẳng nhiệt liên kết như vậy được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về hoá sinh. Chúng ta sẽ xem xét các ví dụ về việc sử dụng các điểm này trong các tiểu phần của chương khi chúng ta thảo luận về sự tương tác giữa enzym - cơ chất và enzym - chất kìm hãm.
[LịụM
[L],nM
Hình 3.3. (a) Đường đẳng nhiệt Langmuir của sự hình thành phứt hệ RL dưới dạng hàm số của nồng độ phối tử (b). s ố liệu từ (a) biểu diễn dưới dạng phân số của thụ thể, B. Só liệu trong các đổ thị (a) và (b) theo thứ tự phù hợp với phương trình (3.21) và (3.23).
Không cần thiết và cũng không thể biết được nồng độ thụ thể tổng số trong một thí nghiệm cần sử dụng phương trình đường đẳng nhiệt Langmuir. Ngưòi ta có thể xây dựng* một đường đẳng nhiệt liên kết miễn ]à có các điểm được đo bằng thí nghiệm, các điểm mà chỉ liên quan đến phức hệ th ụ thể - phối tử. Hãy cho rằng, chúng ta có một số điểm Y mà chúng ta có thể chấp nhận đó là phép đo [RL]. Vối ký hiệu này, phương trình đẳng nhiệt Langmuir có thể tính lại như sau: Y-
Y
(3.22)
[L] Các giá trị của Y^,. đại và Kd sau đó sẽ được xác định phù hợp với giá trị của Y như là một hàm sô" của nồng độ thụ thể theo công thức (3.22). Chú ý là, vói bất kỳ nồng độ nào của phối tử th ì tỷ số YỈYcưcđại bằng với [RL]/[R]. Tỷ sô" [RL]/[R] được xem là phân số của thụ thể và thường được ký hiệu bằng chữ B. Các công thức (3.21) và (3.22) có thể được tính 66
dưới dạng phân sô bằng cách chia cả hai vế của đẳng thức lần lượt cho R và Y y a Acưcdại*
[RL]TRI
Lk J
V
Y _H_ cucđại
1 1 ,
K"
d
(3 .2 3 )
[L] Dạng phương trình đường đẳng nhiệt Langmuir thường rấ t hữu ích trong việc đơn giản hoá dữ liệu nhận được từ cốc mẫu thụ thể khác nhau, các mẫu mà có thể hơi khác nhau về nồng độ thụ thể tổng số của chúng, cho các mục đích so sánh cốc giá trị Kd và toàn bộ các đường đẳng nhiệt liên quan. 3.3.2. Các vị trí nhiều liên kết 3.3.2.1. Các v ị trí nhiều liên kết đương lượng (QUIVALENT)
Trong các thảo luận ở trên, chúng ta đã xem xét mô hình đơn giản nhất trong đó mỗi một phân tử thụ thể (receptor) chỉ có một vị trí liên kết đặc hiệu đối với phối tử. Do vậy, số mol của phối tử (ligand) liên kết cũng giống như sô" moi của thụ thể. Tuy nhiên, có nhiều ví dụ mà các thụ thể đa hoá trị đổi vối phối tử; nghĩa là mỗi một phân tử thụ thể có chứa nhiều hơn một vị trí liên kết đặc hiệu vối phối tử. Trong trưòng hỢp đơn giản n hất của đa hoá trị, mỗi một vị trí liên kết phối tử phản ứng như nhau và độc lập với nhau đổi với phối tử liên kết. Nghĩa là ái lực của mỗi một vị trí đối với phối tử là giống với tấ t cả các vị trí liên kết khác (các giá trị Kd như nhau) và khả năng liên kết của phôi tử ỏ một vị trí không ảnh hưỏng đến xu hướng kết hợp của phổi tử ở các vị trí liên kết khác trên cùng một phân tỏ thụ thể (liên kết độc lập vói nhau). Trong trưòng hợp này, một đường đẳng nhiệt liên kết dược xây dựng bằng cách lập đồ thị các giá trị nồng độ của thụ thể đã liên kết là hàm sô' của phối tử tổng số đã thêm vào, sẽ không thể phân biệt được với đường đẳng nhiệt ở Hình 3,3b. Phương trình đường đẳng nhiệt Langm uir vẫn diễn tả được tình huống này, nhưng bây giờ sô' moi của các vị trí liên kết đặc hiệu có sẵn cho phôi tủ sẽ là n[R]> trong đó n là Bà' vị trí liên kết đặc hiệu trên một phân tử thụ thể. [RL] =
(3.24) 1+ -4-
[L]
Một lần nữa, một đồ thị của [RL] là hàm số' của nồng độ phối tử tổng 67
sô" sẽ không thể phân biệt về m ặt sô" lượng với Hình 3.3b, ngoại trừ giá trị lớn nhất của B bây giờ là n chứ không phải là 1,0 (Hình 3.4): (3.25)
2,0
--- 1--- r
1,5
0,5 0,0
0
50
100
150
200
250
UịiM Hỉnh 3.4. Đưdng đẳng nhlật Langmuir cho thụ thể có hai vj trí liên kết phối tửtưdng đưdng. s ố liệu thu dược phù hợp nhất với phương trình (3.24).
3.3.2.2. C ác vỊ trí nhiều liên kết không đương lượng (N onequivatentị
Một phân tử thụ thể đơn cũng có thể có nhiều hơn một dạng vị trí liên kết đặc hiệu độc lập đối vdi một phối tử riêng, với mổi vị trí liên kết có một hằng sô" phân ly khác nhau. Trong trường hợp này, đường đẳng nhiệt liên kết của thụ thể sẽ là tổ hợp của các đưòng đẳng nhiệt liên kết riêng đối với mỗi kiểu vị trí liên kết khác nhau (Feldman, 1972; Halfman và Nishida, 1972):
(3 .26)
[L] Trong trưòng hợp đơn giản nhất, có hai kiểu vị trí liên kết khác biệt nhau trên một phân tử thụ thể vói n, và n2 lần lượt của mỗi kiểu vị trí ỉiên kết đối với một phân tử thụ thể. Các hằng số phân ly riêng của mỗi kiểu được ký Kiệu là K.J và
. Đưòng đẳng nhiệt chung được đưa ra
sẽ là (3.27)
68
Nêu K j và K.J rấ t khác nhau (bằng khoảng cách một thừa sô" 100) thì có thể quan sát được sự có mặt của nhiều vị trí liên kết không tương đương trên mô hình của đường đẳng nhiệt liên kết. Điểu này được thể hiện ở Hình 3.5 vói một thụ thể có hai kiểu vị trí liên kết với hai hằng scí phân ly lần lượt là 0,1 và 50^M.
[L],MM Hình 3.5. Đường đẳng nhiệt Langmuir cho thụ thể có nhiều vị trí liên kâ't phối tử không đưdng lượng.
ở đây thụ thể có hai vị tri liên kết với phối tử, Vị trí thứ nhất có Krf = 0,1 |iM và vị trí thứ hai có Kd = 50jiM. Đường đậm đi qua các số liệu thu được phù hợp nhất với phương trình (3.27) và đường đứt quãng phù hợp với phương trinh đường đang nhiệt Langmuir, phương trinh (3.23).
Chú ý ]à sự có mặt của nhiều vị trí liên kết không đương lượng rõ ràng hơn nhiều trong việc miêu tả bằng đồ thị các đường đẳng nhiệt liên kết, như sẽ trình bày ở dưởi đây. 3.3.2.3. Các tuơng tác p h ô i /ipp giữa các v ị trín h iể u ỉiẽn kết
Chúng ta đã xem xét thấy nhiều vị trí liên kết trên cùng một phân tử thụ thể phản ứng độc lập với nhau đối với việc liên kết phối tủ. Tuy nhiên, điều này vẫn chưa phải là một trường hợp. Đôi khi sự liên kết của một phôi tử tại một vị trí trên thụ thể sẽ ảnh hưởng bởi sự chiếm giữ của phôi tỏ ở vị trí này làm tăng ái lực của sự liên kết phối hdp. Nếu sự liên kết của một phối tử ồ một vị trí này làm tãng ái lực của vị trí khác thì hai vị trí được gọi là biểu hiện sự phối hợp đương tính. Mặt khác, nếu sự liên kết của một phôi tử ỏ một vị trí lại làm giảm ái lực của vị trí khác thì hai vị trí được gọi là biểu hiện sự phối hợp âm tính, c ả hai dạng phối hợp âm tính và dương tính đều được quan sát trong tự nhiên, và đây là một cơ chế chung trong các quá trình điều hoà sinh hoá, ví dụ: các con đường trao đổi chất. 69
3.3.3. sử a chữa đối với liên kết không đặc hiệu Trong các vấn đề trình bày ồ trên, phức hệ đôi [RL] có liên quan đến trạng thái phân tử của phôi tử tương tác ở một vị trí đặc hiệu trên phân tử th ụ thể. Chính sự liên kết đặc hiệu này đã dẫn đến những hoạt động sinh học và do đó nó cũng là tiêu điểm của sự nghiên cứu vế các tương tác th ụ thể - phối tử. Tuy nhiên trong thí nghiệm, người ta cũng thường quan sát được những sự liên kết không đặc hiệu của một phối tử đối vói phân tử thụ thể và vái các thành phần khác của hệ thông phản ứng (ví dụ: liên kết vói bề mặt của vật đựng, màng lọc,...). Bản th ân sự liên kết không đặc hiệu của phôi tử với thụ thể cũng xảy ra một cách ngẫu nhiên mà không phụ thuộc vào bất kỳ hoạt động sinh học nào. Các tương tác như vậy là hiện tượng giả và có thể được sửa chữa trong phân tích số liệu nếu ngưòi ta có phép đo đúng các tương tác liên kết đặc hiệu. Trong nhiều thí nghiệm về sự liên kết phối tử, người ta có thể đo các tín hiệu gắn vối phôi tử. Tiêu biểu là gắn các đồng vị phóng xạ, đánh dấu huỳnh quang, hoặc một sô" chất hấp thụ quang học. Với mục đích của thảo luận này, hãy nói đến phối tử sơ cấp được ưa thích đánh dấu phóng xạ (ví dụ 3H, l4C, 36s, 33p, I2BĨ; phối tử đánh dấu như vậy thường được xem là một “phôi tử nóng”). Sau đó chúng ta cố thể đo sự liên kết phối tử nhờ sử dụng một cách nào đó để tách phức hệ thụ thể - phối tử ra khỏi các phôi tử và xác định lượng phóng xạ kết hợp với các phần tự do và liên kết. Trong một thí nghiệm như vậy, tổng lượng phóng xạ kết hợp với thụ thể sẽ là tổng sô" liên kết đặc hiệu và không đặc hiệu. Kết hợp vối một vị trí đặc hiệu trên thụ thể, phôi tử đánh dấu phỏng xạ đặc hiệu có thể được thay th ế bằng cách thêm vào một lượng dư của dạng phối tử tương tự không đánh đấu (ví dụ: phổi tử giống như vậy không đánh dấu phóng xạ, thường được gọi là “phối tử nguội”). Tuy nhiên, các vị trí liên kết không đặc hiệu này sẽ không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của phối tử nguội. Điều này sẽ dẫn đến quyết định về m ặt thí nghiệm phạm vi liên kết không đặc hiệu của phối tử đổi vỗi các phân tử thụ thể như thê nào. Nguyên tắc tốt nhất chính là thay th ế tấ t cả các liên kêt đặc hiệu, nồng độ phổi tử không đánh dấu phải vào khoảng 100 đến 1.000 lần cao hơn K(t đối với phức hệ thụ thể —phối tử (Hulme, 1992; Kiotz, 1997). Tính phỏng xạ còn lại được đo ỏ các điểu kiện này sẽ được coi là liên kết không đặc hiệu.
70
[L].nM Hình 3.6. Các kết quả tiêu biểu từ các thí nghiệm liên kết thụ thể: số liệu cho thấy ảnh hưỏng của các liên kết phôi tử không đặc hiệu trong việc chuẩn độ phối tử. Các chấm tam giác Ihể hiện số liệu của sự liên kết phối tử tổng số (tổng các liẻn kết đặc hiệu và không đặc hiệu). Các chấm tròn thể hiện sự liên kết không đặc hiệu, được các định bằng
cách đo sự có măt của các phối tử không đánh dấu thừa ra. Các chấm vuông thể hiện sự lién kết đặc hiệu, đƯỌc xác định bằng trừ hai giá trị trên cho nhau lại mỗi nồng độ thụ thể đánh dấu.
Không giống như liên kết đặc hiệu, liên kết không đặc hiệu không thể bão hoà, gia tăng tuyến tính nồng độ tổng sô' của phối tử đánh dấu. Trong một thí nghiệm liên kết, nếu người ta thay đổi nồng độ phối tử tổng số đánh dấu theo một dãy xếp chung cùng vởi Kd của thụ thể, thì có thể nhận được số liệu tưdng tự với đưòng cong thể hiện ba giá trị như ở Hình 3.6. Nếu thí nghiệm này được lặp lại với một lượng phối tử nguội thừa không đổi ỏ tất cả các điểm thì sự liên kết không đặc hiệu có thê đo được (các đường cong trong Hình 3.6). Từ những dữ liệu này, liên kết đặc hiệu tại mỗi nồng độ phôi tử có thể được xác định bằng cách lấy tổng liên kết đo được trừ đi liên kết không đặc hiệu: [ ĩ? .I ỉ I (lặc hiệu
' Ị R I JỊ tốngâấ"
Ị
í '] không đặc hiệu
( 3 .2 8 )
Liên kết đặc hiệu từ những thí nghiệm như vậy (các đường cong trong Hình 3.6) thể hiện bản chất có thể bão hoà, được mong đợi từ phương trình đường đẳng nhiệt Langmuir. 3.4. PHÂN TÍCH Đ ồ THỊ C Ù A DỮ LIỆU LIÊN KẾT PHỐI TỬ ỏ TRẠN G THÁI CÂN B Ằ N G
Các đồ thị trực tiếp của dữ liệu liên kết thụ thể - phôi tử cung cấp phương pháp đo tốt nhất các thông số liên kết và n (tổng số các vị trí liên kết trên một phân tử thụ thể). Tuy nhiên qua nhiều năm, một số các phương pháp biểu đồ khác cũng được tận dụng để phân tích dữ liệu trong các thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử. Ở đây chúng ta sẽ xem xét ngắn gọn một số phương pháp. 71
3.4.1. Các đồ thị trực tiếp dạng bán logarỉt (SEMILOG)
Trong phương pháp bán logarit, người ta vẽ đồ thị số liệu trực tiếp thu được từ thí nghiệm liên-kết phôi tử, như ở Hình 3.3, nhưng vối trục X ở dạng log10 chứ không phải là dạng tuyến tính. Các kết quả của việc vẽ đồ thị như thế này được thể hiện ỏ Hình 3.7, trong đó số liệu một lần nữa lại phù hợp với phương trình đường đẳng nhiệt Langmuir. Những lợi thế của phương phập này gần đây được Klotz xem xét lại (1997), là rất rõ ràng ở Hình 3.7. Đưòng đẳng nhiệt xuất hiện dưối dạng hình chữ s vâi nồng độ phôi tử tương ứng với Kd ở điểm trung tâm của phần đưòng đang nhiệt gần như tuyến tính.
U\M Hình 3.7. Đồ thị dường đẳng nhiệt Langmuir dưới dạng bán logarit, minh hoạ mối quan hệ giữa nồng độ phối tử và phẩn trăm các phân tử thụ thể đã liên kết
Tại điểm [L] = Ka, 50% vị trí trên thụ thể liên Kết với phối tử. Tại một khoảng mười vạch dưới giá tri Kd chỉ có 9% vị trí được lièn kết trong khi tại một khoảng mưòi vạch trẽn giấ trị K
Các đồ thị bán logarit cho phép ước lượng bằng m ắt giá trị Kd từ điểm chính giữa của đồ thị; thể hiện ở Hình 3.7, giá trị Kt[ dễ dàng được xác định bằng cách chấm một đường đứt quãng từ đường cong xuông trục X tương xứng với giá trị B = n/2, Đồ thị này cũng đưa ra một cái nhìn rõ nét về sự bão hoà vị trí liên kết nhận được trong một thí nghiệm chuẩn độ phôi tử. Ớ Hình 3.7, nồng độ phối tử cao nhất vào khoảng 95% sự bão hoà các vị trí liên kết có sẵn trên thụ thể. Tuy nhiên, đồ thị trực tiếp cũng thể hiện một số phần ngang bằng, phần mà có thể dễ bị nhầm lẫn với trạng thái bão hoà hoằn toàn. Trong đồ thị bán logarit, mức giới hạn của sự bão hoà thể hiện rõ hơn nhiều. Tất nhiên ngày nay thì giá trị của Kj và n được xác định bỏi đường cong bình phương tối thiểu không tuyến tính phù hợp vối cả hai dạng đồ thị trực tiếp (tuyến tính và bán logarit), không phải nhờ xem bằng mát. Tuy vậy, sự thấy rõ bằng mắt thưòng mà đồ thị bán logarit cung cấp vẫn còn giá trị. Vì những lý do này, Klotz (1997) đã đề 72
nghị sử dụng đồ thị bán logarit là một phương pháp được ưa thích nhất trong việc vẽ đồ thị sô liệu thí nghiệm liên kết phối tủ. Hình 3.7 thể hiện một mong muôn rõ nhất về các đưòng đẳng nhiệt liên kêt phôi tử đã lý tưởng hoá: sự phụ thuộc của trạng thái bão hoà vị trí liên kết với nồng độ phối tử. Chú ý từ Hình 3.7 là, khi nồng độ phốỉ tử là một khoảng mười vạch trên giá trị K*] chúng ta có độ bão hoà của vị trí liên kết là 91%. Trong một trường hợp khác, người ta có thể thấy rằng, để giá trị [L] (phối tử —Ligand) thay đổi 81 lần thì tỷ sô' của các nồng độ phối tử cần phải đạt được 90% và 10% độ bão hoà các vị trí liên kết; (3.29) Ví dụ: để bao phủ chỉ trong khoảng 20% —80% sự chiếm giữ thụ thể, người ta cần thay đổi nồng độ phối tử từ 0,25k ,) đến 5,0Kd. Do vậy, để che phủ một đoạn vừa phải đường đẳng nhiệt liên kết, các thí nghiệm phải được bố trí sao cho có thể phủ một khoảng nồng độ phối tử thay đổi 100 ỉần trên dưói giá trị Kj. Vì Kd thường không được biết trước khi thí nghiệm (thực tế cần có toàn bộ các điểm của thí nghiệm đê xác định Kj) nên tốt nhất là bố" trí thí nghiệm che phủ một khoảng nồng độ phôi tử càng rộng thì càng khả thi. Một lợi thế khác của đồ thị bán logarit là dễ dàng nhận thấy sự đa hoá trị không tương đương của các vị trí liên kết thụ thể. Ví dụ là: so sánh dữ liệu được vẽ trong các Hình 3.5 và 3.8. Trong khi xem xét kỹ Hình 3.5, sẽ bộc lộ ra một độ lệch của đường đẳng nhiệt liên kết cò bản, thì đặc tính hai pha của các khả năng liên kết là bằng chứng rõ ràng nhất trong đồ thị bán logarit. 2,0 1,5
0,5 0.0 0,001
0,01
10
0.1
100
1000
[L].pM Hình 3.8. Đổ thị bán logarit của đường đẳng nhiệt Langmuir đối với một thụ thể có nhiều vị trí liên kết không tương đương, s ố liệu phù hợp với phương trình (3.27) và tưdng tự như Hình 3.5.
3.4.2. Những biến đổi tuyến tính của dữ liệu liên kêt các đổ thị W olff
Trước khi máy tính được sử đụng rộng rãi thì phương pháp vẽ các đường cong phi tuyến tính thường không được áp đụng trong việc xử lý số liệu thí nghiệm. Vì thế các nhà khoa học ở tất cả các ngành đã tập trung rấ t nhiều vào việc tìm kiếm những phép biến đổi toán học các số liệu thu được để dẫn đến các đồ thị được tuyến tính hoá, nhò đó các sô" liệu có thể được phân tích và vẽ đồ thị một cách dễ dàng. Trong suôt những năm 1920, B. Wolff đã phát triển ba phương pháp biến đổi tuyến tính để biểu diễn các dạng đồ thị và dữ liệu liên kết phôi tử (Wolff, 1930, 1932). Chúng ta sẽ gặp lại cả ba phương pháp biến đổi và vẽ đồ thị này ở Chương 4 (Động học của phản ứng enzym), khi chúng ta sử dụng để nghiên cứu động lực học của enzym ở trạng thái bền vũng. Như đã được Klotz thảo luận, mặc dù những giới thiệu ban đầu về các biểu đồ của Wolff nhưng mỗi một kiểu đồ thị đều được mang tên các nhà khoa học khác nhau, những ngưồi mà đã giới thiệu lại từng phương pháp riêng biệt trong các bài xuất bản rộng rãi hơn, ứ n g dụng của ba phương pháp biến đổi tuyến tính được dùng trong thời gian không dài, vì ngày nay phương pháp phi tuyến thích hợp cho xử lý dữ liệu được thực hiện dưới dạng sô" rấ t dễ dàng. Các phương pháp này có m ặt ỏ đây chủ yếu là nhắc lại quá trình lịch sử. — Một phương pháp tuyến tính hoá dũ liệu liên kết phôi tử là sắp xếp lại phương trình (3.25) dưới dạng nghịch đảo: (3.30) So sánh phương trình (3.30) với phưdng trình chuẩn cho đồ thị dạng đưòng thẳng ta có: (3.31) y = (mx) + b Trong đó m là độ dốc và b là giá trị chặn của y (khi X = 0). Do đó chúng ta thấy phương trình (3.30) dự đoán rằng đồ thị của 1/B là hàm số’ của 1/ [L] sẽ cho ta một đồ thị tuyến tính với độ dốc bằng Kd/n và giá trị của y bằng 1/n (Hình 3.9). Các đồ thị của kiểu này có liên quan đến các đồ thị nghịch đảo hai lần hay đồ thị Langmuir. Chúng ta sẽ thấy ở Chương 4 (Động học của phản ứng enzym), các đồ thị tương tự được sử dụng, và trong trường hợp này, các đồ thị trên thưòng được gọi là các đồ thị Lineweaver —Burk. 74
[L],mM Hlnh 3.9. Đồ thị nghịch đảo hai lẩn với số liệu từ Hinh 3.3
Số liệu ở dạng đồ thị này phù hợp với một hàm tuyến tính trong đó ước lượng của 1/n và K^n đ ể có thể nhận được theo thứ tự từ giá trị chặn của y và độ đốc.
Một phương trình phốp tuyến tính hoá thứ hai là nhân cả hai vế của phương trìn h (3.25) với (1 + Kjj/fL] để nhận được phương trình. (3.32) Có thể sắp xếp lại như sau: ( BN +n
B = -K .. —
(3.33)
Từ phương trình (3.33), chúng ta thấy rằng, đồ thị của B là hàm số của B/[L] sẽ cho ta một đường tuyến tính vói độ nghiêng bằng -K d và giá trị chặn bằng n (Hình 3.10). Các đồ thị kiểu này được thể hiện ở Hình 3.10, được gọi là các đồ thị Scatchard, là kiểu biến đổi phổ biến nhất được sử dụng để phân tích các dữ liệu liên kết phối tủ. Chúng ta sẽ thấy các đồ thị tương tự được sử dụng ở Chương 4 (Động học của phản ứng enzym) trong việc phân tích động lực học của enzym ở trạng thái bền vững và trong trường hợp này, các đổ thị trên thường được gọi là các đồ thị Eadie - Hofstee. Chú ý là, khi thụ thể chứa nhiều vị trí liên kết đương lượng (nenequivalant) thì đồ thị Scatchard vẫn ở dạng tuyến tính, nhưng giá trị chặn n > 1. Tuy nhiên, nếu thụ thể có nhiều vị trí liên kết không đương lượng thì đồ thị Scatchard sẽ không còn tuyến tính nữa. Hình 3.10 thể hiện trường hợp hai vị trí liên kết đương lượng trên một thụ thể: đồ thị tuyến tính cong xuất hiện l à nhờ ghép hai đường thẳng riêng biệt. Nhiều nhà nghiên cứu đã thử kết hdp các dữ liệu như vậy thành hai đưòng thẳng riêng để xác định giá trị của và n cho mỗi kiểu vị trí liên kết. Tuy nhiên đây có thể là một cách đơn giản việc phần tích dữ liệu mà không tính toán độ cong ỏ các đồ thị này (Klotz, 1997). 75
Hình 3.10 (a) Đồ thị Scatchard của số liệu liên kết phối tử từ Hình 3.3. ở dạng đổ (hị này, số liệu phù hợp với một hàm tuyến tính trong đó ước luọng của n và - Kđ có thể nhận được theo thứ tự từ giá trị chặn của y và độ dốc; (b) Đổ thị Scatchard dối với một thụ thể có nhiều vị trí liên kết không đương lượng; số liệu từ Hỉnh 3.3: Đuỡng đút quảng minh hoạ cho việc phù hợp số liệu của hai hám tuyến tính khác nhau. Kiểu phân tích các đổ thị phi tuyến Scatchard này không thích hợp và còn có thể dẫn đến các lỗi nghiêm trọng khi xác định các giá trj Kd khác nhau.
Phương pháp tuyến tính hoá thứ ba, phương pháp mà được sử dụng rộng rãi, nhận được nhờ nhân cả hai vế của phưdng trình (3.30) với [L]. G J=1[L ] + ! | i
(3.34)
Từ phương trình này chúng ta thấy rằng, đồ thị của [L]/B là hàm số của [L] cũng cho ta một đường tuyến tính với độ dôc bằng 1/n và giá trị chặn bằng Ka/n (Hình 3.11). Các đồ thị kiểu này được sử dụng để phân tích các dữ liệu liên kết phối tử và dữ ỉiệu động lực học của enzym ỏ trạng thái bền vũng. Chúng ta sẽ thấy các đồ thị tương tự được sử dụng ở Chương 4 (Động học của phản ứng enzym). Trong cả hai trưòng hợp trên, các đồ thị được gọi là các đồ thị Hanes —Wolff.
Hình 3.11. Đổ thị Hanes - Wolff của sấ liệu liên kồt phối tử từ Hinh 3.3
Ở dạng đồ thị này, số liệu phù hdp vởi mội hàm tuyến tính, trong đó ước lượng của 1/n và Kj/n có thể nhận được theo thứ tự từ độ nghiêng và giá trị chặn của y.
76
Nên cẩn thận khi quan tâm đến các phép biến đổi tuyến tính này. Bất kỳ một phép biến đổi toán học, các dữ liệu đều có thể có các lỗi do chính cách biến đổi ấy (ví dụ các lỗi trong tính toán). Ngoài ra, một sô' phương pháp biên đổi có thể cho các phần dư lẻ đôì với những điểm sô" liệu thí nghiệm. Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu đều có các phần mềm đồ hoạ máy tính có khả năng tạo sự điều chỉnh đường cong phi tuyến. Vì th ế việc sử dụng các phương pháp biến đổi tuyến tính này không còn phù hợp nữa, 3.5. LIÊN K ẾT ở TRẠNG THÁI CÂN BẰNG VỚI s ự LOẠI B ỏ PHOI TỬ (CÁC TƯƠNG T Á C LIÊN KẾT CHẶT)
Trong tấ t cả các phương trình nhận được cho đến giờ, chúng ta thấy rằng, nồng độ th ụ thể được Bỏ dụng trong việc xác định giá trị K,( bằng thí nghiệm thì thấp hơn rấ t nhiều so với K(1. Điều này cho phép chúng ta sử dụng phép xấp xỉ đơn giản nồng độ phôi tỏ tự do [L]tụdo bằng với nồng độ phối tử tổng sô”thêm vào hỗn hợp liên kết, [L]. Tuy nhiên, nếu ái lực của phôi tỏ với thụ thể Tất mạnh thì để Kti tương tự như độ phóng đại nồng độ của thụ thể. Giả định trên lại không hợp lý. Trong trường hợp này, sự liên kết của phôi tử để hình thành phức hệ RL sẽ làm giảm đáng kể nồng độ phôi tử tự do. sử dụng phương trình đường đẳng nhiệt Langmuir đơn giản để phù hdp số liệu thí nghiệm sẽ đẫn đến các lỗi khi xác định K,|. Thay vào đó chúng ta phải phát triển một phương trình mà tính toán rõ sự giảm nồng độ phối tử và thụ thể tự do do sự hình thành phức hệ đôi RL. Một lần nữa chúng ta lại bắt đầu hai phương trình bảo toàn khối lượng (3.1) và (3.2), sử dụng các phương trình này, chúng ta sẽ tính lại phương trình (3.3) dưổi dạng nồng độ phối tử và thụ thể tự do như sau: ^ ([RM RLjKjLM RLj) (3 36) [RL] Nêu chúng ta nhân cả hai vế của phương trình (3.35) vói [RL] và chuyển K(1[RL] sang vế bên kia chúng ta được: 0 = ([R] - [RL])([LÌ - [RL]) 1 K(1[RL] (3.36) Có thể viết lại như sau: 0 = [RL]2 - ([RJ + [L] + Kd)[RL] + [R] [L] (3.37) Phương trình (3.37) là phương trình bậc hai của [RL]. Từ kiến thức đại số cơ bản, chúng ta biết rằng, một phương trình như vậy có hai 77
nghiệm; tuy nhiên, trong trưòng hợp của chúng ta chỉ có một nghiệm là có ý nghĩa về m ặt vật lý: [RL] = (M + M + M - ^ r o + M + K ^ - t Ị Ì Ĩ Ĩ L Ĩ (3 38) Phương trìn h bậc hai ở trên luôn được sửa chính xác cho bất kỳ sự liên kết th ụ thể - phôi tử nào. Khi việc giảm thụ thể, hoặc phôi tử không quan trọng, thì phương trình đường đẳng nhiệt Langm uir đơn giản hơn nhiều, sẽ được sử dụng tiện lợi nhưng người đọc phải xem xét kỹ càng những giả định ở trên, các giả định mà đi sâu vào sử dụng phương trìn h này trong bất kỳ mục đích thí nghiệm riêng biệt nào. Như chúng ta sẽ thấy ở Chương 7 (Các chất ức chê), các chất ức chế có thế’ liên kết khá chặt với các phân tử enzym. Trong các trường hợp như vậy, hằng sô" phân ly đổi vối phức hệ enzym - chất ức chế chỉ có thể được xác định chính xác bằng cách sủ dụng phương trìn h bậc hai tương tự như phương trìn h (3.38). 3.6. S ự CẠN H TRANH C Ủ A NHIỀU THỤ THỂ V À O MỘT VỊ TRÍ LIÊN KẾT CH UN G
Trong nhiều trường hợp thí nghiệm, người ta mong ước có thể so sánh ái lực của nhiều phôi tử khác nhau với cùng một thụ thể. Ví dụ: khi đưa ra một phôi tử tự nhiên cho một thụ thể (ví dụ: cơ chất cho enzym), ngưòi ta có thể mong muôn tạo ra các phối tử không tự nhiên (ví dụ: các chất ức chế enzym) dể cạnh tranh vào vị trí liên kết của thụ thể với phôi tủ tự nhiên. Như đã thảo luận ỗ Chương 1 (Giới thiệu sơ lược vể enzym), đây là một chiến lược chung để tạo ra các tác nhân dược lý có khả năng khoá hoạt động của enzym chủ chốt của một quá trình gây bệnh riêng biệt. Nếu một trong những phối tủ (ví dụ: phối tử tự nhiên) có một số đặc tính hoá lý mà phải kể đến sự nhận biết của chúng và sự nhận biết phức hệ RL, thì các thí nghiệm cạnh tranh có thể được sử dụng để xác định ái lực đổi với một dãy các phối tủ khác nhau. Phối tử thứ nhất có thể được đánh dấu phóng xạ bằng cách gắn chất đồng vị phóng xạ vào cấu trúc của nó. Một khả năng khác nó thể gắn vói một tính hiệu quang học, hoặc chất huỳnh quang, hoặc nó có thể kích thích các hoạt động sinh học của th ụ thể theo hướng dễ dàng kiểm soát được (ví dụ: hoạt động của enzym ức chế bởi cơ chất). Với mục đích m inh hoạ, thụ thể này được đánh dấu phóng xạ và chúng ta có thể kiểm tra sự hình 78
thành phức hệ RL bằng cách đo độ phóng xạ gắn với protein sau khi protein tách ra khỏi phôi tử tự do bằng một phương pháp (xem mục 3.7). Trong một trường hợp như vậy, chúng ta có thể dễ dàng xác định giá trị của K(i đôi với thụ thể bằng sự chuẩn độ phối tử đánh dấu phóng xạ, như đã miêu tả ở trên. Xác minh được giá trị của KJ,, chúng ta có thể cố' định nồng độ của các thụ thể và của phối tử đánh đấu phóng xạ để đưa đến một nồng độ phức hệ thụ thể —phối tủ nhất định. Thêm vào đó, phôi tử không đánh dấu (A) mà liên kết với cùng một vị trí như phôi tử đánh dấu sẽ tạo ra một sự cạnh tranh cho cùng một vị trí liên kết trên th ụ thể giữa hai phối tử. Do vậy, khi nồng độ của phối tử A tăng lên thì càng ít phối tử đánh dấu cố thể cạnh tran h hữu hiệu với phôi tử A cho các vị trí liên kết và nồng độ của [RL] được tạo thành sẽ bị giảm đi. Đồ thị [RL] hay B là hàm số của [A] sẽ xuất hiện dưới dạng nghịch đảo của đưòng đẳng nhiệt Langmuir (Hình 3.12), từ đố hằng sô" phân ]y đối vối phôi tử không đánh dấu Kj có thể được xác định phù hợp với sô" liệu thí nghiệm của phương trình dưới đây. [R]
----------- n-----------
(3,39)
11 + ^Kd 1 + IẠỊ Kí [L]
Chúng ta sẽ thấy một dạng của phương trình này ở phần các chất ức chế thuận nghịch khi chúng ta thảo luận về sự ức chế cạnh tranh của các enzym. 0,5 0,4
m °'3 0,2 0,1
0,0
0.1
1
10
100
1.000
[L],k M Hình 3.12. Đường đẳng nhiệt đối vâi sự liên kết phối tử cạnh tranh
B được đo bằng hàm số của nồng độ phối tử không đánh dấu [A]. ở đây [L] =
= 25 |iM.
Đường thảng qua các điểm phù hợp nhất với phương trinh (3.36).
79
Sự phù hợp của số' liệu ở Hình 3.12 với phương trìn h (3.39) cho ta một ước lượng tôt giá trị thừa nhận việc nhà nghiên cứu xác định giá trị của [L] và K j trước tiên. Tuy nhiên, cần chú ý là, giá trị của điểm trung tâm của [A] trong Hình 3.12 không tương đương với hằng sô" phân ly . Sự có m ặt của thụ thể cạnh tran h dẫn đến sự chuyển chỗ của điểm trung tâm trên đồ thị một đoạn so với giá trị thực của hằng sô" phân ly. Trong trường hợp mà điểm trung tâm không phải là giá trị đo chính xác của ái lực như trên thì giá trị của điểm trung tâm thưòng được gọi là ECso hay IC5Ũ. Thuật ngữ này, và cách sử dụng của nó trong việc phân tích dữ liệu sẽ được thảo luận đầy đủ hơn ở phần các chất ức chế thuận nghịch.
CÂ U HỎI ỒN TẬP
1. 2. 3. 4.
5. 6.
80
Thế nào là trạng thái cân bằng giữa 2 loại phân tử thụ thể: tự do và liên kết với phổỉ tỏ? Kd là gì? Tại sao lại cần thiết phải xác định động học trạng thái cân bằng khi nghiên cứu cơ chế xúc tác của 1 enzym? Thế nào là phương trình đăng nhiệt Langmuir? Ý nghĩa của đưòng đẳng nhiệt? Phép đo liên kết ỏ trạng thái cân bằng của các vị trí nhiều liên kết đương lượng giông và khác gì với các vị trí nhiều liên kết không đương lượng? Hãy vẽ và nêu ý nghĩa của đồ thị trực tiếp dạng bán logarit (semilog). Thế nào là liên kết trạng thái cân bằng với sự loại bỏ cấu tủ? Thê nào là cạnh tranh của nhiều thụ thể vào một vị trí liên kết chung?
Chương 4
ĐỘNG HỌC CỦA PHẢN ỨNG ENZYM
Nghiên cứu động lực học enzym là đến gần sự hiểu biết về cơ chế xúc tác của enzym. Rất nhiều phương pháp được sử dụng để nghiên cứu cơ chế hoạt động của enzym tinh sạch, đặc biệt cấu trúc không gian ba chiều của protein đã đưa ra nhũng thồng tin quan trọng. Ngoài ra còn có phương pháp hoá học protein cổ điển và phương pháp đột biến điểm (thay đổi trình tự của axit amin của protein) cho phép xác định chức năng của từng axit amin trong cấu trúc và hoạt động enzym. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng cũng nối lên phần nào về enzym. Sự nghiên cứu tốc độ phản ứng và sự thay đổi của nó ở các tham sô" thí nghiệm khác nhau được gọi là động học. Đây là phương pháp phổ biến nhâ't để nghiên cứu cơ chế hoạt động của enzym và vẫn còn rấ t quan trọng cho đến nay. Hầu như các phản ứng hoá sinh đểu có sự xúc tác của enzym. Enzym là yếu tô" chi phối tốc độ của phản ứng quan trọng nhất, khi phản ứng tiến hành thì nồng độ cơ chất giảm dần và nồng độ sản phẩm tăng dần, nhưng nồng độ toàn phần của enzym thì hầu như không thay đổi. Chính vì vậy mà các nghiên cứu về biến thiên tốc độ hay động học của phản ứng enzym sẽ giúp ta phân tích các phản ứng, đồng thòi xác định được những đặc tính và cách thức hoạt động của enzym. Kết hợp sự nghiên cứu động học với nghiên cứu cấu trúc phân tử enzym, chúng ta sẽ có những hiểu biết về cơ chế hoạt động của enzym. Đó là vấn đề quan trọng nhất của enzym học. Trong cơ thể sông, phản ứng hoá sinh thưòng xảy ra nhanh chóng để cung cấp những sản phẩm cần thiết, đổng thòi loại bỏ những chất độc hại. Tuy nhiên, các quá trình hoá sinh xảy ra quá nhanh hay quá chậm so vối tốc độ sinh lý bình thường đều có thể dẫn đến sự rối loạn chuyển hoá, hoặc quá trình bệnh lý, các tế bào sốhg rấ t nhạy cảm với những biến thiên của nhiệt độ, của pH và nhiều yếu tô" khác. Các yếu tố này đều ảnh hưỏng đến đặc tính của enzym trong các quá trình hoá sinh ỏ tế bào. Do đó nghiên cứu tốc độ của các quá trình phản ứng enzym sẽ không chỉ giúp ta hiểu được những quá trình chuyển hoá bình thường và không bình thường mà còn giúp ta tìm hiểu bản chất của chính các quá trình enzym và nhiều hiện tượng sinh học khác. 81
Trong chương này, chúng ta sẽ tìm hiểu về việc sử dụng trạng thái ổn định và nhất thòi của động học enzym làm phương pháp xác định hiệu quả xúc tác và ái lực với các cơ chất của các enzym đơn giản. Như chúng ta đã biết, thuật ngữ “trạng thái ổn định” dùng để chỉ các điều kiện nghiên cứu mà tại đó có thể thấy rõ phữc hệ enzym - cơ chất tạo thành đạt đến mức độ “trạng thái ổn định”. Những điểu kiện này đạt được dễ dàng trong phòng thí nghiệm, và giúp chúng ta ước lượng được khoảng thòi gian hợp lý cho một phản ứng enzym diễn ra. Tất cả các số liệu phân tích đưa ra trong chương này đều dựa trên khả năng đo tốc độ ban đầu của phản ứng xúc tác enzym trong một loạt các điều kiện khác nhau. Để hiểu sâu sắc hơn, chúng ta sẽ tổng kết một vài phương pháp phù hợp xác định tốc độ ban đầu của các phản ứng. Trong Chương 6. (Thực nghiệm đo hoạt độ enzym), chúng ta tập trung tìm hiểu xem tốc độ ban đầu được đo như th ế nào, đồng thời miêu tả các phương pháp thực nghiệm khác nhau để tiến hành công việc đo này. 4.1. THỜI GIAN TIỂN HÀNH CỦ A PHẢN ỨNG ENZYM
Dựa trên việc trộn enzym với cơ chất tương ứng của chúng, sau đó sử dụng một sô" phương pháp phù hợp để xác định lượng cd chất còn lại cũng như lượng sản phẩm tạo thành sau một khoảng thòi gian nhất định, một cơ chất sẽ được quan sát trên đường cong tiến trình cũng như cơ chất còn lại được chỉ ra trên Hình 4.1.
Thài gian (gièy) Hình 4.1. Đường cong tiến trình phản ứng của quá trinh giẳm nồng độ cơ chất [S] và tạo (hành sản phẩm [P] trong một phản ứng xúc tác enzym
Cần chú ý rằng, đưòng cong giảm dần của nồng độ cơ chất là hình ảnh ngược của đường cong tạo thành sản phẩm. Trong thời gian đầu, cơ chất m ất dần đi đồng thòi với sản phẩm tạo thành gây ra sự thay đổi đột 82
ngột với thời gian, tuy nhiên khi thòi gian tăng dần thì tỷ lệ này giảm đi, đạt tới không khi tất cả lượng cơ chất được chuyển thành sản phẩm dưởi tác dụng của enzym. Khoảng thời gian này được mô hình hoá khá rõ ràng qua động học bậc một, dã được để cập ỏ Chương 2: [S] = [S0] e (4.1) ỏ đây [S] là nồng độ cơ chất còn lại ở thòiđiểm t, [S0] là nồng độ cơ chất ban đầu và k là hằng sô" tỷ lệ giả bậc mộtđôì với phản ứng. Vận tốc V của phản ứng trên được xác định bằng: v = ^ = f f l k [ S 0]e-kt (4.2) at at Chúng ta cùng tìm hiểu chi tiết hơn về thời điểm xuất hiện sản phẩm trong phản ứng xúc tác enzym (Hình 4.2).
Thài gian (giây)
Hinh 4.2. Đưdng cong tiến trình phản ứng trong quá trinh tạo thành sản phẩm của một phản ứng xúc tác enzym
Trong vùng màu đậm, các điểm thời gian ban đáu, tại đó vận tốc ban đầu, có thể được xác định từ đường dốc của đồ thị tuyến tính IP] ngược với thời gian.
Nếu chúng ta tập trung chú ý vào phần xuất hiện rấ t sổm ở biểu đồ này (phần tối màu), sẽ thấy rằng, sự tăng sản phẩm tạo thành (cũng như khi cơ chất bị phân giải) di chuyển tuyến tính vởi thòi gian. Trong khoảng giới hạn này, vận tốc ban đầu v0 có thể gần bằng với đường dốc (thay đổi trên trục tung nhiều hơn thay đổi trên trục hoành) của đồ thị tuyến tính đôì vói [S] và [P] cũng như vái vai trò của thời gian: AỊS] = ẠẸP] At
At
Theo thực nghiệm ngưòi ta nhận thấy rằng, khoảng thời gian sản phẩm xuất hiện và cơ chất bị phân giải được mô hình hoá nhờ hàm số' tuyến tính tối thòi điểm khi 10% của nồng độ cơ chất ban đầu bị chuyển 83
hoá thành sản phẩm. Ở phần thực nghiệm đo hoạt độ enzym chúng ta sẽ thấy rằng, dưới sự thay đổi điều kiện dung dịch thì khoảng thời gian qua đó một phản ứng xúc tác enzym đóng vai trò là động học tuyến tính. Trong phần còn lại của chương này, chúng ta đặt giả thiết rằng, tôc độ phản ững được đo trong suốt pha ban đầu của phản ứng, điều đó có nghĩa là, ở đây V - v0, vận tốc ban đầu của phản ứng. 4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ c ơ CHẤT ĐẾN T ố c ĐỘ PHẢN ỨNG XÚC TÁC ENZYM
Một trong những yếu tố" chính ảnh hưởng tới tôc độ phản ứng xúc tác bôi enzym tinh sạch in vitro là lượng cơ chất có m ặt [S]. Nhưng sự nghiên cứu về ảnh hưỏng của nồng độ cơ chất phức tạp ỏ chỗ [S] thay đổi trong quá trình phản ứng, vì cơ chất chuyển thành sản phẩm. Một cách đơn giản là đo tốc độ ban đầu (hay vận tốc ban đầu) gọi là V , khi [S] lớn hơn nhiều so với nồng độ enzym. Sau đó, nếu sử dụng một thòi gian ngắn sau khi bắt đầu phản ứng thì sự thay đổi [S] là không đáng kể và [S] có thể được coi là không đổi. Sự ảnh hưởng của các [S] khác nhau lên V khi nồng độ enzym được giữ không đổi được miêu tả Hình 4.3. Ở nồng độ cơ chất tương đối thấp, V tăng theo đưòng thẳng khi [S] tăng.
Hình 4.3. Ảnh huỏng của nồng độ cơ chất hoặc vận tốc ban đầu của phản ứng xủc tác enzyffl
Vcụcđ*0*1' 00 th®tính xấp x' nhưở sơ đồ vì V sẽ không bao giò đạt đến Vạ*, à,,. Nổng độ cơ chất mà ỏ đó V bằng một nửa là Km, hằng số Michaelis-Merrten. Nồng độ của enzym trong thi nghiệm này thuởng rất thấp [S] » {E], thậm chí khi [S} đuợc mô tả ở mức độ thấp hoặc rất thấp. Các đơn vị giới thiệu là đăe trưtig cho các phản ứng xúc tác enzym và được sử dụng để giúp cho sự chứng minh ý nghía V và [S]. (Cần chú ý rằng, đưởng cong trên hinh mô tả là một phần của đường hyperbol vuông gốc vôi đường tiệm cận à Vcụe d9. Nếu đường cong tiếp tục hạ xuống thấp [S] = 0, nó sẽ đi đến gần đường tiệm cận thẳng đứng ỏ [S] = -K ra).
84
ơ nồng độ cơ chất cao hdn, V tăng chậm hơn và tăng chậm hơn so với sự tăng [S]. Cuối cùng tới một điểm mà V chỉ tăng chút ít khi [S] tăng nhiều (Hình 4.1) và được gọi là vận tốc cực đại Vcựcdại.
Phần động học ở Hình 4.4 mà năm 1903, Victor Henri đưa ra giả thiết là một enzym kết hợp vối phân tử cơ chất của nó để tạo thành phức hợp ES cần thiết cho sự xúc tác. Ý tưởng này phát triển thành một thuyết chung về hoạt động của enzym, đặc biệt bởi Leonor Michaelis và Mand Menten năm 1913. Họ cho rằng, đầu tiên enzym kết hợp thuận nghịch với cơ chất của nó để tạo thành phức hợp enzym - cơ chất: kj E+s —-. — ES (4.4) K-1 Sau đó phức hợp ES phân huỷ thành enzym tự do và sản phẩm phản ứng P: kg ES ’ k 2 E+p (4.5) Theo mô hình này, phản ứng thứ hai (phương trình 4.5) chậm hơn và do đó làm giảm tốc độ của toàn phản ứng. Vì vậy mà tốc độ chung của phản ứng xúc tác bỏi enzym phải tỷ lệ vói nồng độ của chất phản ứng, ở bước thứ hai chính là ES. Enzym thưòng tồn tại ở hai dạng: dạng E tự do và dạng ES kết hợp. Ở nồng độ [S]thấp, phẩn lớn enzym ò dạng E không kết hợp. ở đây, tốc độ phản ứng sẽ tỷ lệ thuận với [S] bởi vì sự cân bằng của phương trình (4.4) sẽ bị đẩy sang hướng hình thành nhiều ES do [S] tăng lên. Tốc độ ban đầu cực đại (Vcựcdại) quan sát được khi gần như tấ t cả enzym ò dạng phức hợp ES và nồng độ của E là rấ t nhỏ. ở điều kiện này, enzym đã “bão hoà” vối cơ chất của nó cho nên sự tăng [S] không có ảnh hưởng gì đến tốc độ phản ứng. Sau khi phức hợp ES phân huỷ thành sản phẩm p, enzym được giải phóng để xúc tác phản ứng khác. Hiệu ứng bão hoà chính là một đặc điểm phân biệt chất xúc tác enzym. Khi enzym được trộn lẫn với một lượng cơ chất thừa sẽ có một giai đoạn đầu gọi là trạng thái tìển ổn định, trong suốt thòi gian này, phức hợp ES được tạo thành. Trạng thái tiển ổn định rấ t ngẩn, do đó rấ t khó quan sát. Phản ứng nhanh chóng dạt đến trạng thái ổn định mà tại đó [ESỊ (và nồng độ của bất cứ chất trung gian nào khác) duy trì không đổi theo thời gian. v0 đo được thường phản ảnh trạng thái ổĩi định mặc.dừ v0 bị giới hạn ổ giai đoạn đầu của phản ứng. Michaelis —Menten. nghiên cứu tốc độ của trạng thái ổn định, kiểu phân tích này được gọi 1&4ộng học trạng thái ôn định. '-I 85
Từ phương trình (4.2), người ta cho là vận tốc phản ứng giả bậc một phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất ban đầu. Ở những nghiên cứu trước đây đã trình bày về các phản ớng xúc tác enzym, tuy vậy, các nhà khoa học thấy rằng, thay vào đó là các phản ứng có sự phụ thuộc về cơ chất, được thể hiện trên Hình 4.4. Hình 4.4a minh hoạ khoảng thòi gian của các phản ứng xúc tác ẹnzym được xem xét ở nồng độ cđ chất ban đầu khác nhau, tốc độ của mỗi phản ứng được xác định dựa trên độ dốc của biểu đồ [P] nghịch đảo vói thời gian. Hình 4.4b biểu thị lại những dữ liệu này dưới dạng vận tốc ban đầu v0 với vai trò là hàm số của [S], nồng độ ban đầu của cơ chất. Ngược lại, bằng việc quan sát mối quan hệ tuyến tính dành cho động học enzym bậc một, chúng ta thấy rằng, vận tốc có vẽ là Ổn định (không tăng thêm nữa) khi nồng độ cơ chất cao. Điều này đã sổm đặt ra nhiều khó khăn cho các nhà enzym học. Đã xác định được ba vùng khác biệt trong đưòng cong này: tại vùng có nồng độ cơ chất thấp, vận tốc xuất hiện đóng vai trò vận hành bậc một, di chuyển tuyến tính với nồng độ cơ chất; tại vùng có nồng độ cơ chất rấ t cao, vận tốc biến đổi thành không, do đó sẽ biểu hiện một sự phụ thuộc theo đưòng con tuyến tính với nồng độ cơ chất. Làm sao người ta có thể hợp ]ý hoá các thí nghiệm quan sát này được?
2
4
6
ISị, nM
Thòi gian (giây)
Hình 4.4. (a) Đường cong tiến trinh cho tập hợp phản ứng xúc tác enzym với nồng độ cơ chất ban đau khác nhau; (b) Đổ thị về vận tốc phản ứng, xac định độ doc của đường thẳng từ (a), vối hàm số [S].
Brown (1902) đã đề ra một 8ự giải thích hợp lý về sự phụ thuộc cơ chất của vận tốc phản ứng xúc tác enzym. Đồng thời các đặc điểm động học của phản ứng cũng được tìm ra, bằng chứng cho hoạt động kết hợp giữa enzym và cơ chất được tích lũy dần. Brown cho rằng, các phản ứng xúc tác enzym phải được mô tả đúng nhất bỏi hệ thống phương trình phản ứng sau: E +S^ 86
k-1
■E S— ->E + P
Hệ thông phản ứng cho thây tốc độ phản ứng sẽ tỷ lệ với nồng độ phức hệ ES như sau: V = k2[ES]. Có thể là chúng ta tạo ra một nồng độ enzym tổng sô' luôn ổn định ở mức thấp và thay đổi nồng độ cơ chất. Tại nồng độ cơ chất thấp, nồng độ ES sẽ tỷ lệ trực tiếp với [S], ngược lại tốíc độ phản ứng phụ thuộc vào [S] trong một kiểu bậc một biểu hiện. Tuy nhiên, tại nồng độ cơ chất rất cao thì thực tế là tất cả enzym sẽ dược biểu hiện dưới dạng phức hệ ES. Trong các trường hợp này, tốc độ phụ thuộc vào sự chuyển hoá hoá học để biến ES thành EP, đồng thời giải phóng sản phẩm là các enzym tự do. Bằng cách thêm nhiều cơ chất hơn dưỏi các điều kiện này có thể không gây ảnh hưỏng đến vận tôc phản ứng. Vì vậy đường dóc của đồ thị vận tốc nghịch đảo [S] sẽ bằng không (Hình 4.4b). [S] hoàn toàn không phụ thuộc vào tốc độ phản ứng (Hình 4.4b) được dự đoán dựa trên mô hình của Brown tương tự như kết quả thu được từ phương trình đẳng nhiệt của Langmuir khi trạng thái cân bằng với sự liên kết giữa cấu tử với chất nhận. Điều này không mấy ngạc nhiên, từ mô hình của Brown, sự xúc tác phụ thuộc chặt chẽ và sự hình thành liên kết giữa E - s tạo thành phức hệ ES nhờ sự gắn cân bằng. 4.3. MÔ HÌNH TỐ C ĐỘ CÂN BẰNG CỬ A ĐỘNG HỌC ENZYM
Dù rằng mô hình của Brown đưa ra một nhận xét thật hữu ích của phản ứng enzym và được các nhà khoa học thực nghiệm áp dụng rất nhiểu thì nó vẫn cần đặt trong một hệ thống tiêu chuẩn toán học cụ thể. Hệ thống này đã được Henri thiết lập lần đầu tiên vào năm 1903 và sau đó là Michaelis và Menten. Không thể ngò rằng, Michelis và Menten đã có sự nhận biết sâu sắc về vấn để này, cho dù chính bần thân họ cũng chấp nhận kết quả trước đó của Henri. Phương trình cơ bản trong phần này được tham khảo từ phương trình của Henri-Michaelis-Menten, một sự cố gắng dể khắc phục các công trình nghiên cứu bị bỏ dở của Henri. Phương pháp của Henri-Michaelis-Menten giả thiết rằng, tốc độ cân bằng được thiết lập giữa các chất tham gia phản ứng (E + S) và phức hệ ES, tiếp theo là, sự chuyển hoá từ từ của phức hệ ES để giải phóng enzym tự đo và tạo ra sản phẩm; điều đó có nghĩa là giả thiết rằng k2 « k_; trong dãy phương trình ở mục 4.2. Trong mô hình này, enzym tự do Ef trưóc tiên liên kết vổi cơ chất s để tạo nên dạng phức hệ liên kết ES. Kê từ khi lượng cơ chất tự do xấp xĩ bằng nồng độ cơ chất tổng sô" thêm vào 87
phản ứng [S]. Ngược lại, nồng độ phân tách cân bằng của phức hệ này được tính như sau: K s -
s
f
( 4 .6 )
[ES]
Tương tự như phương pháp nghiên cứu về liên kết giữa chất nhận cấu tử trong Chương 3, ở đây nồng độ enzym tự do được tính bằng sự chênh lệch giữa nồng độ enzym tổng sô" [E] và nồng độ của phức hệ liên kết [ES] . [E]r = [E] - [ES] (4.7) Và từ đó:
Ks = M d g g m [ES]
(4.8)
Kết hợp cốc phương trình này lại, chúng ta được phương trình tính của [ES] như sau: [ES] = - M Í® L
(4.9)
Ks + [S]
Tiếp đó phức hệ ES bị chuyển hoá qua một loạt các bưđc hoá học khác nhau tạo sản phẩm phản ứngvà tiếp tục giảiphóng enzym tự do. Trong trường hợp đơn giản nhất, một bưỗc phản ứng hoá học đơn, được xác định nhò hằng sô' tỷ lệ bậc một ks, kết quả là tạo thành sản phẩm. Tuy nhiên, sẽ có một loạt các sự kiện hoá học diễn ra m ạnh mẽ theo sau sự hình thành phức hệ ES. Một cách đơn giản, tỷ lệ chung cho các bước hoá học hợp lại được biểu hiện qua hằng số tỷ lệ bậc một đơn kxúctác Ngược lại:
E+ s ==±
ES —kĩfe-‘fe. > E + p
Và tỷ lệ tạo thành sản phẩm được đưa ra bỏi phương trìn h bậc một: v^kricuctES] (4.10) Kết hợp phương trình (4.9) và (4.10) chúng ta có được: _
k>uctáJEjỉS]
^
K a +[S]
Phương trình (4.11) tương tự như phương trìn h đẳng nhiệt Langmuir ở Chương 3. Sau đó, phương trình này dùng để mô tả cho vận tốc phản ứng giống như hàm hypecbon của [S], cùng vói giả trị cực đại của kX(lctác[S] tại điểm vô hạn cơ chất, chúng ta xem xét giá trị này như là vận tốc phản ứng cực đại, Vcụed?i. 88
Vcụcdại = k xúctác [E S ]
( 4 .1 2 )
Kết hợp vói phương trình (4.9) ta thu được: „ _
V C1ÍCđại ■1ÍS1J
Ks + [S]
V
_
cục (tại
Kị
tÁ
!
(4-13)
[S]
Phương trình (4.13) là phương trình cuối cùng xuất hiện độc lập với Henri và Michaelís cùng với Menten để biểu hiện các dữ liệu động học enzym. Chú ý rằng, cố sự tương đồng nổi bật giũa phương trình này và các dạng phương trình đưòng đẳng nhiệt Langmuir được giới thiệu ở Chương 3 (phương trình 3.21 và 3.22). Vì vậy, nhiều trong sô" các động học enzym có thể được giải thích theo phương diện mô hình cân bằng đơn giản liên quan đến cân bằng nhanh chóng giữa enzym tự do và cơ chất để tạo nên dạng phức hệ ES kết hợp, tiếp theo bởi các bước chuyển hoá hoá học để tạo sản phẩm và giải phóng sản phẩm. 4.4. MÔ HÌNH TR ẠN G THÁI Ổ n ĐỊNH CỦ A ĐỘNG HỌC ENZYM
Sự xuất phát điểm ban đầu của Henri, Michaelis và Menten phụ thuộc vào phương pháp cân bằng nhanh chóng của phản ứng enzym. Phương pháp này th ật sự có hiệu quả trong các phép đo lường động học nhanh chóng, ví dụ như các phản ứng thay thế đơn, sẽ được mô tả sau trong chương này. Tuy vậy, đa sô' các phép đo lường thực nghiệm của phản ứng enzym lại diễn ra khi phức hệ ES có m ặt là không thay đổi, nồng độ được duy trì ổn định (đựợc xác định dưới đây). Briggs và Haldane nhận thấy rằng, phương pháp liên kết cân bằng của Henri, Michaelis và Menten có thể được mô tả tổng quát hơn nhờ một phương pháp trạng thái ổn định mà không cần đòi hỏi k2« k _ 1. Vấn đề sau đây dựa trên sự mô tả của Briggs và Haldane. Như chúng ta đã thấy, phương trình cuối cùng với kết quả đã để cập cũng tương tự như phương trình (4.13), dù rằng có sự khác biệt giữa trạng thái cân bằng nhanh chóng và phương pháp trạng thái ổn định thì phương trình trạng thái ổn định khá giông như phương trình Henri - Michaelis - Menten. Trạng thái ổn định có nghĩa là chỉ một khoảng thời gian của phản ứng enzym mà trong suốt khoảng thời gian này tỷ lệ tạo thành phức hệ ES có quan hệ chính xác với tỷ lệ phân giải thành enzym tự do và sản phẩm. Pha động học này có thể được đạt đến khi nồng độ của các phân tử cơ chất vượt quá nhiều so vỏi nồng độ enzym tự do. Để đạt đến trạng thái ổn định, điều kiện xác định phải được thiết lập và những điều kiộn này 89
cho phép chúng ta để ra một vài giả thiết hợp lý, giúp đơn giản hoá phần lón các phương pháp toán học của động học. Các giả thiết này bao gồm: (1) Trong suốt pha đầu tiên của đưòng cong tiến trình phản ứng (ví dụ: dưới điều kiện chúng ta xác định vận tốc tuyến tính ban đầu), sẽ không thể thấy rõ sự tạo ra bất kỳ dạng trung gian nào nhiều hơn phức hệ ES. Ngược lại, tất cả các phân tử enzym có thể được xác định dựa trên enzym tự do, hoặc dựa trên phức hệ ES. Nồng độ enzym tổng sô' [E] được xác định như sau: [E] = [E]f+ [ES] (4.14) (2) Giếng như trong phương pháp trạng thái cân bằng nhanh chóng, chúng ta giả thiết rằng, enzym đóng vai trò xúc tác, dù nếu nó có mặt ở nồng độ rấ t thấp so vối cơ chất, tức là [S] » [E]. Ngược lại, sự tạo thành phức hệ ES không làm giảm một cách đáng kể nồng độ của cơ chất tự do. Từ đây, chúng ta có thể tạo ra một sự xấp xỉ [S]f ~ [S], tại đây [S]f là nồng độ cd chất tự do và [S] là nồng độ cơ chất tổng số. (3) Trong suốt pha ban đầu của đường cong tiến trình, rất ít sản phẩm được tạo thành so vối nồng độ cơ chất tổng số’. Ngược lại, trong pha ban đầu này [P] - 0 và vì vậy sự giảm [S] là rấ t nhỏ. Tại thời điểm ban đều của phản ứng sẽ có sự phá vỡ nhanh chóng đối với việc tạo thành phức hệ ES, tiếp theo nhò một pha động học mà tại đó tỷ lệ tạo thành phức hệ ES mới là cân bằng với tỷ lệ phân giải để giải phóng trở lại enzym tự do và sản phẩm. Nói cách khác, trong suốt pha này, nồng độ của ES là không đổi. Chúng ta đặt tên cho pha động học là trạng thái ổn định, được xốc định bằng: =0 (4.15) dt Hình 4.5 tểng kết quá trình phát triển và kéo dài trạng thái ổn định của enzym oxidaza xytocrom c đổi vối cơ chất là xytocrom c và oxy phân tử của nó. Ngay khi cơ chất của enzym kết hợp được vối nhau, chúng ta sẽ thấy sự tạo thành trạng thái tiền ổn định nhanh chóng của phức hệ ES, tiếp theo đó là một ô cửa sổ thời gian dài mà ỏ đó nồng độ ES không thay đổi (pha trạng thái ổn định), và cuối cùng pha trạng thái ổn định được xác định nhờ sự phá võ đáng kể đôì vỡi nồng độ cơ chất ban đầu. Khi những giả thiết này được đặt ra, chúng ta có thể thấy một biểu thức của vận tôc enzym dưới những điểu kiện trạng thái ổn định. Theo như trưỏc đây, đôì vôi hệ thông phản ứng đơn giản nhất, đưòng cong tiên trình giả bậc một cho một phản ứng enzym có thể được xác định: V - k2[ES] (4.16) 90
0,50 0,45 T rạng thái ổ n định
0,40
j
0,35 0,30 0,25 0,20
-20
0
20
40
60
80
100
Thài gian {giây)
Hình 4.5. Sự tiến triển của trạng thái ổn đinh trong phẳn ứng oxy hoá xytocrom c vói cơ chất của nó, xytocrom c và oxy phin tử.
Sự hấp thụ ỏ bước sóng 444nm thể hiện trạng thải liên kết của trung tâm hoạt động cotactơ hem của enzym. Trước khi thêm cơ chat vảo (t < 0) nhóm Hem nằm trong trạng thái oxy hoá Fe3* và được liên kết với nhóm hístídin của enzym. Khi thêm cơ chất, trung tâm hoạt động kim loại khử thành Fe2+ và nhanh chóng đạt đến trạng thái ổn định của việc sử dụng CO chat mà tại đó kim loai được liên kết bởi một số oxy phân tử. Pha trạng thải ổn định kết thúc khi một tỷ lệ đáng kể oxy phân tử trong cking dịch được sử dụng mất. Tại thdi điểm này, ion Hem duy trì thế khử (Fe2+) nhutig không lảu sau một cấu tử ở vị trí kết hợp thứ 6, những loại nhản Hem này cũng cỏ một hệ số dập tắt lân hơn nhiều ă 444nm. Ngược lại, sự tâng đột ngột sự hấp thụ ồ bước sóng này sẽ được tiếp tục ở pha trạng thái ổn đinh.
Bây giờ, [ES] phụ thuộc vào tỷ lệ tạo thành của phức hệ (được chi phôi bởi k, và tỷ lệ biến mất của phức hệ (bị ảnh hưởng bởi k ( và k2). Phương trình tỷ lệ cho hai quá trình này được thể hiện sau đây.
4 § 3 = k ,[E ]f [S]f và z® 51=(k., + k,)[ES)
(4.17) dt dt Dưới nhũng điều kiện trạng thái ổn định thì hai tỷ lệ này phải cân bằng với nhau, nghĩa là: (4.18) k 1[E]f[S]r-(k _ 1+ k2)[ESl Nếu sắp xếp lại ta sẽ thu được biểu thức cho [ES]:
(4.19)
Tại thời điểm này chúng ta xác định được hệ số Km như một sự rút gọn cho hằng sô' động học của v ế phải phương trình (4.19): K l +k2
(4.20) .
kl
91
Chúng ta sỏ dụng Kra để viết tắt giúp cho các biểu thức toán học bớt đi sự cồng kểnh, phức tạp. Sau đó, chúng ta sẽ thấy rằng, Kmcó ý nghĩa đáng kể lón hơn nhiều. Thay phương trình (4.20) vào phương trình (4.19) chúng ta nhận được: [BSJ = ^ L Km
(4.21)
Khi cơ chất giảm đi một cách không đáng kể trong pha trạng thái ổn định, chúng ta có thể thay [S]f bằng nồng độ cơ chất tổng sô' (tại đây có nhiều cách xác định dễ dàng cho các trường hợp thực nghiệm). Chúng ta cũng có thể sử dụng cân bằng của phương trình (4.14) để thay [E]f bỏi [E] - [ES]. Với sự thay th ế này, phương trình (4.21) có thể được viết lại như sau: (4.22) Nếu chúng ta kết hợp biểu thức này cho [ES] vói biểu thức vận tốc của phương trình (4.16), chúng ta có được: (4.23) Hoặc, chúng ta có thể khái quát hoá, phương trình (4.24) để dùng cho các dãy phản ứng phức tạp bằng sự thay thế k^tâc cho k2: (4.24) Theo như mô tả trước đây, khi nồng độ cơ chất đạt đến vô cùng, vận tốc sẽ đạt đến giá trị cực đại, từ đó chúng ta xác định được Trong các điểu kiện này, hệ sô" Km là một phẫn rấ t nhỏ đổi với phương trình (4.24). Bởi vậy: (4.25) Và do đó chúng ta quay trỏ lại phương trình (4.12): dạí = k*úc tác [£]• Kêt hợp phương trình này với phương trình (4.25), cuối cùng chúng ta sẽ tìm được một biểu thức rấ t giông với phương trình đầu tiên mà Michaelis và Menten tả: « (4.26)
92
Đây là biểu thức trung tâm cho các động học enzym trạng thái ổn định. Trong khi nó khác với biểu thức cân bằng của Henri và của Michaelis cùng Menten, tuy nhiên nó lại có tính phổ biến hơn so vãi phương trìn h của Michaelis - Menten, hoặc của Henri - Michaelis Menten. Theo cách định nghĩa Km(phương trình 4.20), ta kết hợp hằng số tốc độ bậc một (k_i và k2, các hằng sô" có các đơn vị thòi gian tương hỗ) và một hằng sô" tốc độ bậc hai (k, là hằng sô" có các đơn vị mol tương hỗ, thài gian tương hỗ) trong cách này kết quả Km có các đơn vị mol, cũng như [S]. Nếu chúng ta thiết lập được hệ thông thí nghiệm mà nồng độ cơ chất có quan hệ chính xác với Km, phương trình (4.26) sẽ là: V
=
V
^
rsi
ãgì l
[S ] + [S ]
=
~
V
njti
2
2 7 )
■
Phương trình này giúp cho việc định nghĩa giá trị Km: “Km là nồng độ cơ chất m à tại đó vận tốc phản ứng bằng một nửa vận tổc phản ứng cực đại thu được dưổi điều kiện cơ chất bão hoà”. Giá trị Km thường được tham khảo từ hằng số Michaelis. Khi so sánh phương trình (4.26) của động học trạng thái ổn định với phương trình (4.13) của phương pháp cân bằng nhanh chông, chúng ta sẽ thấy rằng, phương trình sẽ được chấp nhận nếu thay thế Km cho K, trong phương pháp trạng thái ôn định. Đó là bởi vì dễ dàng dùng chung hai sô'hạng này và để xử lý giá trị Km nếu có một hằng sô' phân tách nhiệt động học cho phức hệ ES. Tuy vậy, hai hằng sô' không phải lúc nào cũng bằng nhau, thậm chí để đổi cho hằng sô" đơn giản nhất của hệ phản ứng. Quay trở lại, K„ có thể được xác định nhờ vào tỷ lệ của hằng sô" tốc độ nghịch đảo: K8= ^ -
(4.28)
Giá trị này không đồng nhất với giá trị Kffl của phương trình (4.20), Chỉ trong điều kiện đặc biệt khi mà k2« k _ i thì Kmvà Ks mới bằng nhau. Trong hệ phản ứng phức tạp hdn có thể thay thế k2 trong phương trình (4.20) bằng Kúctic- kx,.ct&cphản ánh sự tổng hợp các bước hoá học đa dạng trong phản ứng xúc tác. Vì thế, phụ thuộc vào những chi tiết trong cơ chế phản ứng và giá trị của hằng số tốc độ riêng lẻ, tuỳ trường hợp mà có thể tăng lên khi giá trị Kmnhỏ hơn, lớn hơn hoặc bằng vổí Ks. Vi vậy, Kro có thể được coi là hằng số động học. 93
4.5. MỐI QUAN HỆ GIỮA NỒNG ĐỘ cơ CHẤT V À Tốc ĐỘ PH ẢN ỨNG CÓ THỂ BIỂU THỊ ĐỊNH LƯỢNG
■ Hình 4.2 chỉ sự quan hệ giữa [S] và V đối với phản ứng enzym. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ này cố hình dạng giống nhau của hầu hết các enzym khác nhau, nó có dạng đường hypecbol vuông góc. Dạng đường hypecbol của đồ thị này có thể biểu diễn đại số qua phương trình Michaelis - Menten, Những tham số quan trọng là [S], V , Vcực đại và hằng sổ Km (gọi là hằng số Michaelis - Menten). Tất cả những tham sô' này đã được đo bằng thí nghiệm. Ở đây chúng ta sẽ phát triển logic cơ bản và những bưóc đại sô" thành phương trình Michaelis - Menten. Bắt đầu với 2 phản ứng cơ bản liên quan đến sự hình thành và phân huỷ ES (phương trình 4.4 và 4,5). Ở thời gian đầu của phản ứng, nồng độ của sản phẩm (P) không đáng kể và giả thiết đơn giản là k _2 có thể bỏ qua. Phản ứng chung được viết thành: y, E+S ES
Leonor Michael is
Mund Menten
L875-1949
1879-1960
(4.29)
được xác định bằng sự phân huỷ ES thành sản phẩm và do đó được tính bằng [ES]: V - k 2 [ES] (4.30) Vì [ES] trong phương trình (4.30) không dễ gi đo bằng thực nghiệm, nên chúng ta phải tìm một thông sốkhác cho [ES]. Đầu tiên chúng ta đưa ra [EJ biểu thị nồng độ enzym (tổng lượng enzym tự do và enzym liên kết cơ chất). Enzym tự do hoặc liên kết cò chất được biểu thị bởi [EJ - [EJ. Cũng như vậy, do [S] lớn hơn [EJ rất nhiều, lượng cd chất liên kết bởi enzym tại một thòi điểm nào đó là không đáng kể so với tổng [S]. Do đó các bưóc sau sẽ dẫn chúng ta đến sự biểu diễn V theo các tham số dễ đo. Bước 1. TỐC độ của sự hình th àn h và phân huỷ ES được xác định bởi V
94
các bưóc có hằng số tốc độ kj (tạo thành) và k.j + k2 (phân huỷ) theo phương trình sau:
Tốc độ của sự tạo thành: ES = kj ([Et] - [ES])[S] (4.31) Tốc độ của sự phân huỷ: ES = k_! [ES] + k2[ES] (4.32) Bước 2. Một giả định quan trọng là tốc độ ban đầu phản ánh một trạng thái ổn định mà ở đó [ES] không đổi, có nghĩa là tốc độ hình thành ES bằng với tốc độ phân huỷ nó. Đây được gọi là giả định trạng thái ổn định. Tại trạng thái ổn định, phương trình (4.31) và (4.32) được xác định chung lại như sau: k, ([EJ - [ES]) [S] = k_, [ES] + k2[ES] (4.33) Bước 3. Các bước đại số thứ 2 được dùng để giải phương trình (4.33) k L[EJ [S] - k, [ES] [S] = (k + ka) [ES] (4.34) Thêm k,[ES] [S] vào cả hai vế của phương trình ta được: k. [EJ [S] = (ki [S] + k_! + k j [ES] (4.35) Giải phương trình cho [ES] được: [ES] = ---- ---------------(4.36) 1 J k ^ S l+ k ^ + k s Đơn giản hoá tiếp theo bằng cách kết hợp các hằng số tốc độ vào với nhau: [ES] — ---- [E‘][S]
(4.37)
k. + kfj. đươc đinh nghĩa là hằng sỐMichaelis - Menten, Km. K Thay vào phương trình (4.37) ta có: [E S ]= i^ M j
(4.38)
Bước 4. V được biẩu diễn theo [ES]. Phương trình (4.38) được dùng dể thay cho [ES] trong phương trình (4.30).
k-,[EJ[S] K m+[S] Bỏivi vận tốc cực đại chỉ xảy ra khi enzym bão hoà và [ES] = [EJ. v cựcứại đượcđịnh nghĩa lá k2 [EJ. Thay vào príươngtrình (4.39) ta được: V ^ IS ] (4.40) V = ■ K,n +[S] Đây là phương trình Michaelis - Menten, phương trình tốc độ cho 95
phản ứng một cơ chất xúc tác bởi enzym. Đây cũng là môi quan hệ định lượng giữa vận tốc ban đầu V , vận tốc cực đại VC1JCdại và nồng độ cơ chất ban đầu [S] qua hằng sô" Michaelis - Men ten. Trong trường hợp đặc biệt, khi V chính xấc bằng 1/2 Vcljcđại (Hình 4.6) ta có: cực đại
2
its]
cực dại
Km +[S]
(4.41)
Chia cho Vcựt.(tại, chúng ta tính được: 1, [S] 2 Km+[S]
(4.42)
Giải Km tạ có Km+ [S] = 2 [S] (4.43) hay Km= n a y — [S], 1 . 0 | , khi A lii V V -= Ìl/2.Vcựcđại . I Í , . y cự c đ ạ i Đây là định nghĩa rấ t hữu ích của Km: Kmtương đương với nồng độ cơ chất tại thời điểm V =l/2.VCtìCdại. c ầ n chú ý rằng Kn, cũng có đdn vị là moi. Phương trình Michaelis —Menten (4.40) có thể được biến đổi đại sô thành dạng dùng để xác định thực nghiệm Kmvà Vcực
Hinh 4.6. Sự phụ thuộc của tốc độ ban đẩu vão nồng độ Cd chất, qua đó chỉ ra các thông sấ động học xác định các giãi hạn của đưòng cong tại [S] cao và thấp
ở [S] t h ấ p , Km » [S] và giới hạn [S] trong mẫu số trỏ thành không quan trọng của phương trình Machaelis - Menten (phương trình 4.40); phưong trình đơn giản hoá thành V = Vạt 3, [S]/Km và V phụ thuộc tuyến tinh vào [S] như mô tà trên hình vẽ. ỏ nồng độ [S] cao, khi [S] » Km, giới hạn Km trong mẫu số của phương trình Michaelis - Menten trỏ thanh không quan trọng, và phương t r ìn h đơn giãn hoá thành V = sự ổn định này thấy ồ trên hình vẽ â [S] lớn. Do đó phương trình Michaelis - Menten ổn định với sự phụ thuộc của V vào [S], dạng đường được xac định bỏi quan hệ dạ, /Kmỏ [S] thầp và ^ ở’ ỊS] lãn.
96
C hú ý 4,1: Sự biến đổi phương trình Michaelis - Menton: đồ thị nghịch đảo kép
Phường trình Michaelis-Menten:
. y*d.j[s] v
K m +[S]
C6 thể đuợc biến đổi đại số thành dạng hữu ích khi vẽ kết quẳ thí nghiệm. Một cách biến đổi thông thưởng là lấy nghịch đảo cả 2 vế của phưang trình Michaelis - Menten: Tách lử số ỏ vế phải ta được
Đơn giản hoá thành
1 V
Km+[S] Vcục(lại[Sj
1
1
— --------sS— ^
<■!]( đụi
L J
1
+ —------cực đại
Phương trinh này là sự chuyển đổi của phương trình Michaelis - Menten và được gọi là phương trinh Linew eaver- Burk. Đối với enzym tuân thđo mối quan hệ Michaelis - Menten, đổ thị của 1/v đối với 1/[S) (đồ thị “nghịch đảo kép” lá một đường thẳng) {Hình trên). Đường thảng này có độ dốc là đại. cắt trục 1/v ở 1/V ^ dại và cắt trục 1/[S] ở -1/Km. Đồ thị nghịch đâo kép còn được gọi là đổ thị Lineweaver - Burk, đồ thị này có ưu điểm là cho phép xác định d„ chính xác hơn đồ thị đơn của V đối với [S] (Hình 4.2). Sự biến đổi khác của phương trinh Michaelis - Menten củng đã được sử đụng. Mỗi một phương trình có số chi tiết có lợi bằng số liệu phân tích động học enzym. Đổ thị nghịch đảũ - kép của tốc độ phàn ứng enzym rất có ích phân biệt giữa các loại cơ chế phản ứng enzym (Hình 4.4) và trong sự phân tích sự ức chế enzym.
4.6. Ý NGHĨA C Ủ A V cựcđạj V À K mL À ĐƠN VỊ Đ ố l VỚI M ỗ l ENZYM
Một điều quan trọng là phải phân biệt được phương trình Michaelis Menten và cơ chế động học đặc hiệu. Phương trình mô tả tác động động học của rấ t nhiều enzym và tất cả enzym có sự phụ thuộc theo đường hypecboỉ c ủ a V v à o [S] t h ì được gọi l à động học Michaelis - Menten. Một 97
quy luật thực tế là Km = [S] khi V = l/2.Vcựcđại (phương trình 4.41) đúng với tấ t cả enzym tuân theo động học Michaelis - Menten (trừ enzym điều hoà). Tuy nhiên, phương trình này không phụ thuộc vào cơ chế phản ứng hai bước đưa ra bởi Michaelis —Menten (phương trình 4.3). Rất nhiều enzym tuân theo động học Michaelis —Menten lại có cơ chế phản ứng hoàn toàn khác nhau và enzym xúc tác phản ứng với (4.30) đến (4.32) bước riêng biệt thường có cùng tác động động học trạng thái ổn định. Mặc dù phương trình (4.41) đúng với nhiều enzym, ý nghĩa thực sự của Vcực đại và K™ có thể thay đổi từ enzym này đến enzym khác. Vcực ct(uvà Kmlà các tham sô" có thể thu được từ thực nghiệm, nhưng chính chúng lại không nói nhiều đến sô" lượng, tốc độ hoặc bản chất hoá học của các bước riêng rẽ trong phản ứng. Tuy nhiên, động học trạng thái ổn định biểu thị ngôn ngữ chuẩn để đánh giá và so sánh hiệu quả xúc tác của enzym. Bảng 4.1. Kmđối với một sấ enzym Enzym
Cd chất
Catalaza
h 20
Hexokinaza (não)
ATP D - glucoza D - fructoza
Cacbortic anhydraza
hco;
Chymotrypsin
Glyxyltyrosyl glyxin N—benzoyl tyrosinamit
108 2,5
D - lactoza
4,5
L—treonin
5,0
p - galactosidaza Treonin dehydrataza
2
K„ (mM) 25 0,4 0,05 1,5 9
Một phương pháp đồ hoạ đơn giản để xác định tương đối giá trị dược mô tả ở Hình 4.4. Một cách kháe thuận tiện hơn là dùng đồ thị nghịch đảo - kép (Chú ý 4.1). K,,, có thể thay đổi lớn từ enzym này đến enzym khác (Bảng 4.1). Kmcũng thĩnh thoảng được dùng để chỉ ái lực của một enzym với cơ chất của nó. Ý nghĩa thực sự của Kmphụ thuộc vào từng điểu kiện cụ thể của cơ chế phản ứng như sô lượng và tốic độ cùa các bước riêng của phản ứng. ở đẫy chúng ta sẽ xem xét phản ứng có 2 bưốc: lc + K --■--21 (4.44) kị
98
Đối với phản ứng Michaelis —Menten, k2 là hằng số giới hạn tốc độ, do đó k 2 « k_i và Kmgiảm đến k_j/ k, được gọi là hằng sô" phân ly K, của phức hợp ES. Khi điều kiện này được giữ nguyên, Kmđược biểu thị phép đo ái lực của enzym với cơ chất trong phức hợp ES. Tuy nhiên, điều kiện này không áp dụng được cho tất cả enzym. Thỉnh thoảng k2 » k_i và do đ ó K ^ krj/kj. Trong các trường hợp khác, k2 và k^! khá bằng nhau và Km vẫn được tính bằng phương trình phức tạp có cả 3 hằng số tốc độ (phương trình 4.42). Những điểu đó đă được Haldane và George E. Briggs phân tích đầu tiên năm 1924. Phương trình Michaelis —Menten và tính chất tác động bão hoà của enzym được ứng đụng, nhưng Kn, không được khảo sát đo riêng của ái lực cơ chất. Thậm chí nhiều cái chung có trong phản ứng đi qua nhiều bước sau khi tạo thành phức chất ES; Kmcó thể sau đó trỗ thành hàm số nhiều phức chất của nhíểu hằng sô" tốc độ. v cực đ ạ i cũng thay đổi lớn từ enzym này đến enzym khác. Nếu một enzym phản ứng với cơ chê Michaelis —Menten 2 bưâc, Vcục đfi tương đương với k2[EJ (k2 là bước giới hạn tốc độ). Tuy nhiên, số bước phản ứng và sự nhận dạng bước giới hạn tốc độ có thể thay đổi ỏ mỗi enzym. Ví dụ: khi sản phẩm giải phóng, EP —►E + Pf là bước giới hạn tốc độ: E+s
k_t
ES ====±. EP —^2—» E + p k-a
(4.45)
Trong trưòng hợp này, phần lớn các enzym ở dạng EP khi bão hoà và = k3 ỊEJ. Để thuận lợi, người ta dùng một hằng số tốc độ chung, kxúc táo để diễn tả tốc độ giới hạn của bất cứ một phản ứng xúc tác enzym nào ồ trạng thái bão hoà. Nếu cố một vài bước trong phản ứng và một bước rõ ràng là bước giới hạn tôc độ thì kxúc tic tương đương vói hằng số tốc độ của bước giới hạn tốc độ đó. Đối với phương trình (4.42), kxúctie = k3. Khi một vài bước là giới hạn tốc độ, kxtlc tác có thể là một phưdng trình phức tạp của một vài hằng sô' tốc độ. ở phương trình Michaelis Menten, Kúot&o - Vcựcàại [EJ và phương trình (4.37) trở thành: V = ÌL á £ ts s íẼ J I§ ì
( 4 .4 6 )
K»+[S1 kxủc tée là hằng số’tốc độ bậc 1 vái đơn vị là S_1 và được gọi là số' vòng quay. Nó tương đương với sô' phân tử cơ chất bị chuyển hoá thành aản phẩm trong một đdn vị thời gian với một phân tử enzym đơn khi enzym bão hoà với cơ chất. Sốvòng quay một s ố enzym được ghi ỏ Bảng 4,2.
99
Bảng 4.2. s ố vòng quay * (kxaetíc) của một s ố enzym Cơ chất
Enzym
^xúctác
)
Catalaza
H2O z
40.000.000
Cacbonic anbydraza
HCO-
400.000
Axetylcholin esteraza
Axetylcholin
140.000
p - lactamaza
Benzylpenixilin
2.000
Fumaraza
Fumarat
800
RecA protein (ATPaza)
ATP
0,4
* SỐ vân chuyển phân tử cơ chất / giây / phân tử enzym
Các tham số động học kIÚCtác và Km thường có ích khi nghiên cứu và sd sánh các enzym khác nhau dù cho có phản ứng đơn giản hay phức tạp. Mỗi enzym có các giá trị kxúetác và Kmtốì ưu. Khi 80 sánh hiệu quả xúc tác của các enzym khác nhau thì cần phải có sự chọn lọc m ột tham số phức hợp. kxúc tàc không hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu. Hai enzym xúc tặc hai phản ứng khác nhau có thể có cùng kmic tic (số vòng quay), nhưng tốc độ của các phản ứng không xúc tác có thể khác nhau rấ t nhiều. Cũng như vậy, kxúc tảc biểu thị các đặc tính của một enzym khi nó băo hoà vôi cơ chất. Km không đổi cũng không đáp ứng được yêu cầu. N hư đã chỉ ra ở phương trình (4.41), Kmphải có quan hệ vỡi [S] trong tế bào. Một enzym hoạt động trên cơ chất có nồng độ rất thấp trong tế bào sẽ có xu hưóng cố Km thấp hơn enzym hoạt động trên cơ chất thừa thãi. Tham số thích hợp nh ất để đánh giá hiệu quả xúc tác là tham số bao gồm cả kxlíc t4e vằ Km. Khi [S] « Km, phương trình (4.46) được biến đổi thành: v = % ^ [E J[S ]f
(4.47)
Trong trường hợp này, V phụ thuộc vào nồng độ của 2 cơ chất phản ứng, Et và S; do đó đây là quy luật bậc 2 và hằng số kxlictá(;/Kmlà hằng số tốc độ bậc 2. tác/Kmthường là tham sô' động học tốt nh ất dùng để so sánh hiệu quả xúc tác. Có một giói hạn trên cho kxúc láJK m; đó chính là tốc độ mà tại đó E và s có thể khuếch tán vào trong dung dịch. Giới hạn khuếch tán này là 10® đến ÌO^M^S-1 và nhiều enzym có giá trị kxut Uc/ Km gần vùng giới hạn này (Bảng 4.3). 100
Bảng 4.3. Các enzym vói KúttiJKm gần đến giới hạn khuếch tán Enzym Axelylcholin esteraza
Cơ chất Axetylcholin CO?
Cacbonic anhydraza Catalaza
hco;
KxúcUe (s-1) 1,4
4
Crotonaza
Crotonyl-CoA
5,7
Fumaraza
Fumarat Malat
[5 - Lactamaza
Glyxeraldehyt3-phosphat
Benzyl penixilin
10*
1 X 10s 4 X 105
h 2o 2
Trioza phosphat isomeraza
X
K ro
(M) 9
X
lO"5
1,2 X 10"2 2 ,6 X 10-=
107
^*úc tảc^m ( M 'V ) 1,6
X
10B
8,3 X 107 1 5 x 107
1 ,1
4
2 X 10-5
2,8
X
10s
8 X 102 9 x 10s
5 x 10-® 2,5 X 10-6
1,6 36
X
10B 107
4,3 x 1 0 3
4 ,7 x 1 0 ^
2,4 x 1 0 s
X X
103
2 X 103
2
X
1Q-6
107
X
X
1 X 108
4.7. PH ÉP ĐO THỰC NGHIỆM GIÁ TRỊ K Kúciic V À K m 4.7.1. Phép xác định theo biểu đổ dựa trên các dữ liệu không biến thiên
Hằng sô' động học Vcự0dại và Km được xác định bằng đồ thị vái phép do vận tốc ban đầu thu được từ nồng độ cơ chất khác nhau. Các giá trị của đồ thị được minh hoạ rõ nhất bằng quá trình thực hiện qua các ví dụ và dữ liệu bằng số. Số lượng ưóc chừng của V cực dai và Kmphụ thuộc vào sự chc phủ của khoảng nồng độ cd chất mà trải qua một tỷ lệ quan trọng của liên kết đẳng nhiệt. Theo thực nghiệm, một phương pháp th u ận lợi đổ lựa chọn nồng độ cơ chất là tạo ra một thể tích dung dịch cơ chất gốc tại một nồng độ khá cao sao cho từ dung dịch gốc này có thể pha ra một loạt các dung dịch cơ chất có nồng độ thấp hơn trong một chừng mực thí nghiệm. Sau đó, làm loãng dần dung dịch đi một nửa. Ví dụ như: có một nồng độ cơ chất cao nhất trong phản ứng enzym là 250^M. Chúng ta có thổ pha một dung dịch gốc của các cơ chất 2,5mM sau đó được pha loãng 10 lần để cuối cùng có được hỗn hợp phản ứng dùng cho nghiên cứu (ở đây nồng độ cuối cùng là 250jiM ). Sau đó chúng ta có thể lấy một phần dung dịch nồng độ l,25mM, đây là dung dịch pha loãng có trong những phản ứng nghiên cứu để rồi cuối cùng nồng độ cơ chất đạt được là 125nM. Một phần dung dịch này được pha loãng với đệm, cứ tiếp tục qua một loạt các dung dịch có sự giảm dần nồng độ cơ chất. Nồng độ cơ chất cuối cùng đượe trình bày trên Bảng 4.4, thê hiện việc sử dụng hệ thông giảm một nửa liên tục từng lần một. 101
Bảng 4.4. Vận tốc ban đẩu (có thêm sal sấ ngẫu nhiên) là hàm số của nồng độ cơ chất trong một mô hình phản ứng enzym
V (iiM sả n phẩm tạo thành 5 1)
1/v(ixM-1s)
1/[S](nM-’)
0,98
10
0,100
1,024
1,95
12
0,083
0,512
3,91
28
0,256
7,81
40
15,63
55
31,25
75
0,036 0,025 0,018 0,013
62,50
85
0,012
0,016
125,00
90
0,011
0,008
250,00
97
0,010
0,004
0,128 0,064 0,032
aNóng dô cơ chất phản ánh một loạt sự pha loãng hai lần từ dung dịch gốc tương ứng với 250mM cơ chất cho tôi tạo thành hỗn hợp phản ứng cuối cùng.
Tại Bảng 4.4, kết quả nghiên cứu đưa ra một danh sách các giá trị thí nghiệm của vận tốc b an đầu V tạ i mỗi nồng độ cơ chất sử dụng. Chung cho cả bảng, một vài sai số ngẫu nhiên được thêm vào mỗi giá trị vận tốc để kích hoạt tốt hơn điều kiện thí nghiệm thực tế. Các sai sô chiếm phần trăm lân nhất trong bảng này xẳy ra tại các nồng độ cơ chất thấp nhất, tại các thí nghiệm thực tế sẽ gặp phải khó khăn lổn nhất là việc có được phương pháp đo vận tốc chính xác. Phương cách trước tiên và cũng là đơn giản của việc lập đồ thị dũ liệu nhờ một biểu đồ trực tiếp cho vận tốc cũng như hàm số của nồng độ s, chúng ta tham khảo một biểu đồ như biểu đồ của Michaelis —Menten. Hình 4.6 là biểu đồ của Michaelis—Menten phản ánh dữ liệu trong Bảng 4.4, đưòng cong nối giữa các dữ liệu được tạo ra nhờ một vùng tôì thiểu phi tuyến tính tương ứng vồi dữ liệu trong phương trình (4.24). Với một phương trình lập biểu đồ vi tính hiện đại, người đọc có một loạt sự chọn lọc về những quan sát đối với sự tạo thành tiến trìn h tương ứng như vậy. Các đồ thị trong cuốn sách này, ví dụ, đã được vẽ ra nhò vào chương trình Kaìeiđagraph, có mang phương pháp thiết lập cho việc tạo thành tiên trình tuyến tính phù hợp cho các phương trình được người sử dụng tạo ra. Đối với dữ liệu trong Hình 4.7. c ả Vcựcđại và Kmđểu được thiết lập là các ẩn số được tìm ra đồng thòi nhò sự tuần tự thích ứng tiến trình. Sự ước lượng Vcực đ?i và Km được xác định nhờ cách này có giá trị là 102
100,36 |oM/s và 11,63 |xM, theo tương ứng, sự hoà hợp tuyệt vời vói các giá trị thực của hằng số này. Các thành phần rõ ràng như th ế này của dữ liệu không bị biến thiên giúp đưa ra những ước lượng đáng tin cậy nhất cho cả hai hằng sô" động học. Với sự ứng dụng phổ biến của các chương trình thích ứng tiến trình thì đâu là giới hạn cho phép trong khả năng của chúng ta để ưóc lượng Vcực dại và Km từ dữ liệu thực nghiệm? Như đã đề cập ỏ phần trên, sự chính xác của nhũng phép ưốc lượng như vậy sẽ phụ thuộc vào khoảng nồng độ cơ chất mà vận tốc ban đầu được xác định. Nếu như phép đo đó được xác định tại nồng độ cd chất thấp, dữ liệu sẽ xuất hiện dưới dạng bậc một (ví dụ: V sẽ xuất hiện dưới dạng hàm số tuyến tính đôì với [S]). Điều này được trình bày trên Hình 4.8a đổì với dữ liệu ỏ Bảng 4.4 giữa nồng độ cơ chất từ 0,98 và 3,91^iM (< 0.33KJ. Trong khoảng nồng độ này, trung tâm hoạt động của enzym không thể đạt tới sự bão hoà, và theo đồ thị, cả VC1ỊCđại và Kra xuất hiện ở tại vô cùng. Nói cách khác, Hình 4.8b thể hiện những gì xảy ra khi phép đo được tiến hành chỉ tại các nồng độ cơ chất rấ t cao, tại đây dữ liệu đô'i với nồng độ cơ chất khoảng trên 60fiM (ví dụ [S] > õKn,). Tại nồng độ cd chất bão hoà này, vận tốc xuất hiện một cách độc lập đối với nồng độ cơ chất. Trong khi sự ước lượng tạm thòi giá trị Vcực đụi có thể thu được từ những dữ liệu này (dù rằng ngưòi đọc nên chú ý v,ưc dại thực không chỉ đạt đến tại nồng độ cơ chất vô hạn; vì vậy bất kỳ phép đo thực nghiệm vận tốc tại [S] cao có thể đạt đến, nhưng không bao giờ đạt hoàn toàn đến V cụcdsj), lúc này không có cách nào để xác định giá trị Km.
[S], pM Hình 4.7. Đồ thị Mechaelis - Menten đối với các dữ liệu vể vận tốc có trong Bảng 4.4. Đwng nối giữa các điểm thể hiện vùng tối thiểu phi tuyến tính phù hợp với phương trinh (4.24).
103
Cách bố cục n h ư trên Hình 4.8 nhấn mạnh vào việc cần thiết để tìm ra một khoảng rộng nồng độ cơ chất để xác định chính hằng sô" động học đổi với enzym đang quan tâm. Một lần nữa, có thể có nhũng giới hạn thực tế đối vói khoảng nồng độ cơ chất tại đó phép đo có thể được thực hiện. Trong Chương 3, chúng tôi đã gợi mở rằng, để mô tả đặc điểm một cách tốt nhất đường đẳng nhiệt liên kết phốỉ tử, việc cần thiết là bao phủ một khoảng nồng độ phối tử và đem lại kết quả từ 20 —80% chất nhận bão hoà. Tương tự như vậy, trong việc xác định hằng sô' động học trạng thái ổn định với một hệ thông enzym, cách tốt nhất để phủ nồng độ cơ chất thấp nhất mà vận tốc đạt được từ 20 - 80% Vcực đại, điều này tương ứng vói [S] từ 0,25 - 5,0Km.
[$], ụM
[s], nM
(a)
Hinh 4.8. Đổ thị Michaelis Menten đối vái những dữ liệu giới hạn trong Bảng 4.4
(a) Khoảng giá trị IS] thấp không thích hđp (< 0.33K J, vì vậy Kmvà xuất hiện vô hạn; (b) Khoảng giá trị [S] cao không thích hợp, làm cho tất cả các điểm the hiện gần với điểu kiện bão hoà, một trong số đó có thể xấp xỉ Vcụcaại nhưng Kmkhông thể xác định được.
Từ khi các hằng sô" động học còn là ẩn số thì cách chung nhất để tiến hành thí nghiệm ban đầu với một số' lượng có hạn các điểm dữ liệu nôi giữa một khoảng rộng nồng độ cơ chất (ít nhất là gấp 100 lần khoảng nồng độ cơ chất) để thu được một ước lượng ban đầu giá trị Vcực(jại và Km. Những ước lượng tiếp theo (cao hơn) có thể thu được bằng cách thu hẹp khoảng nồng độ cơ chất từ 0,25 và 5,0Kmvà sẽ thu được một lượng lớn các điểm dữ liệu nằm trong khoảng này. Bảng 4.4 thể hiện một trưòng hợp cụ thể để xác định Vcựe dại và Km. Dữ liệu trải qua một khoảng gấp 250 lần nồng độ cơ chất mà trùm lên khoảng từ 0,08 đến 20,8Km. Vì vậy, sử dụng một hệ thống giảm liên tục hai lần như vậy, bằng cách khối đầu với một nồng độ cơ chất cao nhất là có thể tin được, và được giói thiệu nhiều nhất. 104
Thay phiên nhau, một ngưòi có thể thực hiện một lượng có hạn các thí nghiệm nhờ vào viộc sử dụng một quá trình giảm liên tục 5 lần mà băt đầu tại nồng độ cơ chất cực đại là 250/iM . Chỉ với 5 thí nghiệm chúng ta có thể tiên hành bao gồm các nồng độ cơ chất 250; 50; 10; 2 và 0,4fiM, Dữ liệu từ một thí nghiệm giả thuyết như vậy được chỉ ra trên Hình 4.8a và có thể đem lại một sự ước lượng giá trị Kmlà khoảng 10|xM. Với sự ước lượng ban đầu này, một mặt một giá trị có thể được chọn để mở rộng sô" lượng điểm dữ liệu nằm trong khoảng hẹp hơn 0,25 - Õ.OK^ đổ có được sự ưóc lượng chính xác hơn cho hằng sô' động học. Hình 4.8b là một ví dụ, thể hiện dạng của dữ liộu, một giá trị thu được từ các phép đo vận tốc cực đại [S] là 2,5; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45 và 50|iM. Từ cách thiết lập phương pháp đo thứ hai này, giá trị 102M/s và 12}iM đối với VtụC()cii và Km, một cách tương ứng, đã được thu nhận. 4.7.2. Đồ thị Lineweaver - Burk của động học enzym
ứng dụng phổ biến nhất của chương trình phù hợp đường cong phi tuyến tính là rấ t dễ sử dụng cho những người không chuyên môn đã tương đối phát triển trong thòi gian gần đây. Trước kia, việc xác định hằng sô' động học cho một enzym từ những dữ liệu bất biến không tuân theo nguyên tắc thông thường, Để giúp cho công việc được diễn ra thuận tiện, các nhà khoa học đã nghiên cứu những ý nghĩa của sự biến đổi dữ liệu để xây dựng các dồ thị tuyến tính, từ đó các hằng số động học có thể được xác định một cách đơn giản nhờ giấy đồ thị và thưốc thẳng. Trong khi đó, ngày nay, tuỳ theo mục đích sử dụng mà rấ t nhiều người trong số’ chúng ta có những chương trình phù hdp đường cong phi tuyến tính (và dây là giá trị thích hợp để xác định Vt.ựcd(li và K J , nó mang ý nghĩa to lớn trong những đồ thị tuyên tính của dữ liệu dộng học enzym. Như chúng ta sẽ thấy trong các chương sau, những đồ thị này th ật sự có ích để đoán trước những cơ chế chi tiết của những enzym nhiều cơ chất và để xác định mô hình tác dộng giữa enzym và chất kìm hãm. Một phương pháp được dùng phổ biến nhất đối vổi dữ liệu động học enzym tuyến tính là phương phốp của Lineweaver và Burk (1934). Chúng ta sẽ bắt đầu với giả định về trạng thái ổn định tương tự đã được mô tả trước đây. ứ n g dụng một sô' đại số' học đơn giản, chúng ta có thê viết lại phương trình (4.26) thành dạng sau đây: V= V
. . — — ---------
(4 .4 8 )
“^ l + K /[S] 105
Tiếp theo, chúng ta tiến hành nghịch đảo phương trình và sắp xếp lại thành như sau: - = — ^ — + — -— V V c ự c d rtiJS1 V cự c d ạ i L J
(4.49)
So sánh phương trình (4.49) với phương trình chuẩn ỏ dạng một đường thẳng, chúng ta có: y = mx + b (4.50) Tại đây mlà độ dốc và b là m ặt phẳng của y. Chúng ta thấy rằng, phương trình (4.49) là một phương trình đường thẳng với độ dốc là KJVcue^i, và m ặt phẳng y là 1/VcụcJíU.
[S], t*M
[S], n M
Hình 4.9. C ác bước thiết lập thí nghiệm đ ể ưốc lưỡng v cựcđ?i và Km (a) Tập hợp giá trị giới hạn A được đặt trong mội khoảng biến thiên rộng của nồng độ [S] từ đo nhận đứọc một sự ước lượng gần đúng các hằng số động học; (b) Một sự ước lượng gẩn đúng giá trị Kmđược thiết lập, một tập hợp thứ hai của thí nghiệm được tạo thành với nhiều dữ liệu hơn trong sự biến thiên của 0,25 - 5,0Km nhằm thu được những ước lượng chính xác hơn những hằng số động học.
Do đó, nếu như nghịch đảo nồng độ ban đầu được đồ thị hoá giông như nghịch đảo [S], chúng ta hy vọng từ phương trình (4,49) sẽ thu được một đồ thị tuyến tính. Đốì với những lý do tương tự được mô tả sớm hơn vể các dữ liệu bất biến, những đồ thị này cố dạng đẹp nhãt khi nồng độ cơ chất biến thiên trong khoảng 0,25 - 5,0Km. Trong khoảng biến thiên này, chúng ta sẽ quan sát đượe một sự tuyến tính thật tuyệt vời, như dược tổng kết trong Hình 4.8 đốỉ với dữ liệu trong khoảng [S] = 3,91 và [S] = 62,5|iM có trong Bảng 4.4. Một đồ thị giống như vậy trong Hình 4.8 được biết đến như là đồ thị Lineweaver—Burk.
106
Hlnh 4.10. ĐỔ thi nghỊch đ ảo kép Lineweaver-Burk cho những giá trị dược chọn lọc ỏ Bảng 4.4 trong khoảng biến thiên của [S] = 0,25 - 5,0 k m.
Hằng số' động học Vcụcaẹi và Kmcó thể được xác định dựa trên giá trị độ dốc và m ặt phang từ những dữ liệu phù hợp tuyến tính trong đồ thị Lineweaver-Burk. Từ đó ẩn số X là nghịch đảo của nồng độ cơ chất, khi giá trị X = 0 (ví dụ như 1/[S] = 0) tương đương với [S] = 00. Vì vậy, giá trị ngoại suy của m ặt phẳng y tương đương với nghịch đảo của Vcực đại. Giá trị Km có thể được xác định từ một đồ thị Lineweaver-Burk bằng hai cách. Trước tiên chúng ta nhận thấy rằng, từ phương trình (4.49) có độ dốc bằng với Km được phân biệt bỏi Vcựcđại. Nếu n h ư từ đó, chúng ta đem chia hết độ dốc của đường thẳng phù hợp n h ất cho giá trị m ặt phang y (ví dụ như 1/Vcựcdại), kết quả thu được sẽ tương đưdng với Km. Cuổì cùng, chúng ta có th ể ngoại suy thành sự phù hợp tuyến tính đối với những điểm giao nhau của trục X . Mặt phang X này tương đương với 1/Km; do đó chúng ta có th ể xác định giá trị nghịch đảo của m ặt phẳng X trong đồ thị của chúng ta. Trong một số lẳn, cách xác định thích hợp hơn giá trị Vcục ((ại và Km là từ những dữ liệu bất biến phù hợp tuyến tính đối với phưdng trình M ichaelis-M enten. Hình 4.10 nhấn m ạnh rằng, cần phải chú ý tới điểm này. Trong những dữ liệu thí nghiệm thực tế, các lỗi nhỏ trong giá trị đo được của V đã được tăng lên do sự biến đổi về m ặt toán học khi tiến hành một nồng độ cơ chất thấp. Nhưng th ậ t đáng tiếc, trong đồ thị nghịch đảo, các giá trị thấp nhất của [S] tưdng đưdng với giá trị cao nhất của 1/[S]. Do đó những sai số' th í nghiệm được phóng đại hơn và làm lượng không đầy đỏ những hằng số' động học, thậm chí khi mà sai số thí nghiệm tương đối nhỏ. Để làm rõ hơn về vấn đề này, chúng ta sẽ so sánh giá trị ưóc lượng được của Vcực dại và Km đã thu được dữ liệu trong Bảng 4.4 qua nhiều phương pháp đồ thị khác nhau, tấ t cả đểu 107
được tổng kết trong Bảng 4.5. Các giá trị thực của VCVcdại và Kmđôi vói những dữ liệu mang tính giả thuyết trong Bảng 4.4 là 100^M/s và 12|uM, theo tương ứng. Bảng 4.5. Ưãc lượng các hằng s ố động học Veựcd,| và từ những xử lý bằng đồ thị các dữ liệu trong Bảng 4.4 Độ lệch của giá tri thưc K j% ) ‘
Phương pháp đổ thị Các giá trị thực Michaelis-Menten Lineweaver-Burk {dãy số liệu đấy đủ) Lineweaver-Burk ([S] = chỉ từ ũ ,2 5 -5 ,0K J Eadie - Hofstee Hanes - Wolff Eisenthal-Cornish-Bowden
^cực đũ {ịM Ís)
Độ lệch từ giá tri thưic v cực
12,00 11,63 7,57
3,08 36,92
100,00 100,36 79,28
0,36 20,72
9,17
23,58
91,84
8,16
9,66 11,84 11,53
19,50 1,33 3,92
94,45 100,97 100,64
5,55 0,97 0,64
Sự phù hợp của những dữ liệu không bất biến tái phương trình Michaelis-Menten giúp đưa ra cách ước lượng về 100,36 và 11,63 đổi với hai hằng số động học, vói độ lệch so với giá trị thực là 0,36 và 3,08% tương ứng. Sự điều chỉnh tuyến tính nhũng dữ liệu trong Hình 4.10, mặt khác với giá trị ưỏc lượng của Vcực dại và Kmlà 91,84 và 9,17, với độ lệch so với giá trị thực là 8,16 và 23,58% tương ứng. Các sai số’thậm chí là nhiều hơn khi đồ thị nghịch đảo bình phương được dùng cho tập hợp các dữ liệu có trong Bảng 4.4, theo như ước tính trong Hình 4.10 và Bảng 4.5. Ở đây gồm cả những giá trị dữ liệu nồng độ thấp (<[S] = 3,91jjM) được làm lớn hơn rấ t nhiều trong sự hồi quy tuyến tính và giới hạn rõ hơn độ tin cậy của các hằng sô' động học ước lượng. Các giá trị Vcực dại và Km bắt nguồn từ việc lắp sô" liệu là 79,28 và 7,57, với độ lệch chuẩn là 20,72 và 36,92% tương ứng. Ví dụ được để cập đến có thể giúp cho bạn đọc vể những giới hạn của việc sử dụng các phép biến đổi tuyến tính của các dữ liệu ban đầu nhằm xác định giá trị các hằng sô động học. Tuy vậy, đồ thị Lineweaver—Burk vẫn được các nhà nghiên cứu sử dụng rất phổ biến, như chúng ta sẽ thấy ở chương sau, chúng là các phưđng tiện, công cụ rấ t hữu ích sử dụng cho các mục đích nhất định. Nhừng trường hợp này, được miêu tả chi tiết trong Chương 7. (Các chất ức chế), Hơn cả việc sử đụng phép hồi quy tuyến tính để khớp các dữ liệu nghịch đảo trong đồ thị Lineweaver-Burk, ta có thể xác định giá trị VCụCđẹi và Km bằng phép phân tích hồi quy phi 108
tuyên tính của những dữ liệu không bất biến để khớp với phương trình Michaelis-Menten. Những giá trị này sau đó được chèn vào hằng sô trong phương trình (4.49) để tạo ra một đường thẳng đi qua dữ liệu nghịch đảo trên đồ thị Lineweaver-Burk.
1/IS] Hình 4.11. Đồ thị nghịch đảo bình phướng Linew eaveráp dụng cho tập hợp các s ố liệu trong Bảng 4.4 Chú ý rằng, sự ảnh hưởng mạnh mẽ của các điểm tại [S] thấp (giá trị) 1/[S] cao) nẳm trén đường thẳng khớp nhất từ sự hổi quy tuyến tính.
Bảng 4.6. Thiết lập quy đjnh thực nghiệm về động học enzym bằng cách sử dụng đổ thị Lineweaver-Burk Dịch g ố c [S] (nM)
Nống độ cuối [S] trong hỗn hơp phản ứng (nM)
1/[S1 (JIM-1)
600 300 200 150 120 100 86 75 67 60 55 50
60,0 30,0 20,0 150 12,0 10,0 8.6 7,5 6,7 6,0 5,5 5,0
0,017 0 033 0,050 0,067 0083 0,100 0,116 0,133 0,149 0,167 0,182 0 200
Cuốỉ cùng, nếu như có được số liệu thực nghiệm ở dạng đồ thị nghịch đảo bình phương thì điều mong muôn tiếp theo là chọn được nồng độ cơ chất sao cho chúng nằm cách những khoảng bằng nhau trên trục X nghịch đảo (ví dụ, 1/[S]). Điểu này dề dàng đạt được trong thực nghiệm sau đó. Một ai đó đem chọn ra giá trị cực đại của [S] ([Scijcíl
thí nghiệm và tạo ra được dung địch gốc nồng độ cơ chất từ đó pha loãng sẽ thu được nồng độ cuối cùng để có được hỗn hợp phản ứng. Phép đo vận tốc ban đầu thêm vào sau đó được xác định bằng cách thêm cùng một thể tích cuôl vào hỗn hợp phản ứng enzym từ dung dịch cơ chất gốc, nhờ quá trình pha loãng dung dịch gốc theo t ỷ l ệ l : 2 ; l : 3 ; l : 4 ; l : 5 ; tiếp tục như vậy, Nhờ cách này, các điểm số’liệu sẽ nằm trên trục 1/[S] tại những khoảng 1, 2, 3, 4, 5,... đơn vị. Ví dụ: khi ta tiến hành thí nghiệm với nồng độ cơ chất cao nhất là 60|jJVI cho các điểm sô" liệu thì ta có thể pha loãng nó theo tỷ lệ 1: 10, t r o n g h ỗ n h ợ p p h ả n ứ n g p h â n t í c h đ ể t h u được n ồ n g đ ộ c ơ c h ấ t m o n g muốn cuối cùng. Chẳng hạn, thể tích tổng sô' là l,0m l ta có thể bắt đầu phản ứng bằng cách trộn IOOjiM của cơ chất gốc với 9 0 0 nhũng thành phần khác trong hệ thống phản ứng (enzym, đệm, cofactơ,...). Bảng 4.6 tổng kết quá trình thêm dung dịch gốc là rấ t cần thiết để có được nồng độ cơ chất cuối cùng nằm trên các khoảng đều nhau tại trục 1/[S]. 4.8. NHỮNG THAY Đ ổl TUYẾN TÍNH KHÁC CỦA s ố UỆU ĐỘNG HỌC ENZYM
Mặc dù có những sai sô" liên quan với phương pháp này, nhưng đổ thị nghịch đảo bình phương Lineweaver - Burk đã trở thành phương tiện phổ biến nhất của đồ thị để miêu tả các sô'liệu động học enzym. Tuy nhiên, đó là một tập hợp khác nhau của các thay đổi tuyến tính. Hơn nữa, việc sử dụng các phương pháp biến đổi là không cần thiết nữa vì hầu hết các nhà nghiên cứu đều truy cập máy tính dựa trên phương pháp gắn khớp đường cong phi tuyến tính, và sự phù hợp trực tiếp của những dữ liệu bất biến nhờ các phương pháp này có độ tin cậy cao. Tuy nhiên, chúng ta sẽ miêu tả ba phương pháp đồ thị phổ biến khác để biểu thị các sô' liệu động học enzym: đồ thị một chiều của Eadie - Hofstee, Hanes - Wolff, và Eisenthal —Cornish —Bowden. Nhũng phương pháp thay đổi tuyến tín h này đã được áp dụng cho số liệu học enzym, giống như sự thay đổi Wolff đưdc mô tả trong Chương 3 đối với dữ liệu liên kết chất nhận —cấu tử. 4.8.1. ĐỔ thị Eadie - Hoftee
Nếu như chúng ta nhân thêm cả hai vế của phương trình (4.26) với Km+ [S], chúng ta có được: v(Km+[S]) = Vcựcđại [S] (4.51) Nếu như chúng ta chia cả hai vế cho [S] và sắp xếp lại, chứng ta thu được: (4.52) 110
Vì vậy, nêu ta biểu diễn đồ thị V là hàm sô" của v/[S], phương trình (4.52) được dự đoán là một đưòng thẳng có môi liên quan với độ dốc của Kmvà m ặt phẳng y của Vcực đại. Một đồ thị như vậy được xem là đồ thị Eađie - Hoftee, minh hoạ trên Hình 4.12.
Hinh 4.12. Đổ thị Eadie - Hofstee của động học enzym. s ố liệu dược lấy từ Bảng 4.4
4.8.2. Đồ thị Hanes - W olff
Nếu như ta nhân cả hai vế của phương trình Lineweaver-Burk với [S], sẽ thu được: I§! = [S1— -— + Km V VCựcđại Vcựcđội
(4.53)
Cách này cũng tạo ra một đồ thị tuyến tính khi là [S]/v được biểu diễn là hàm số' của [S]. Hình 4.13 minh hoạ một đồ thị, được biết đến là đồ thị Hanes - Wolff. Ở đồ thị này, độ đốc là 1/Vcự<;d?i và m ặt phẳng y là Km/Vcực và m ặt phẳng X là Km.
[S], nM Hỉnh 4.13. Oố thị Hanes - Wolff của số liệu động học enzym. s ố liệu lấy từ Bảng 4.4
111
4.8.3. Đồ thị m ộỉ chiểu Eisenthal - Cornish - Bowden
Ở phương pháp cuối cùng, cùng vói số liệu V , [S] (như trong Bảng 4.4) được m inh hoạ trên đồ thị như sau: các giá trị của V nằm dọc theo trục y và những giá trị âm của [S] nằm dọc theo trục X (Eisenthal và Cornish - Bowden, 1974). Trong mỗi cặp, ta vẽ một đường thẳng nối giữa các điểm nằm trên hai trục và ngoại suy những đưòng này qua các điểm của phần kéo dài (Hình 4.14). Khi một đưòng nằm ngang được kẻ từ những điểm giao nhau của các đường thẳng này tới trục y, thì giá trị tại đó đường nằm ngang đi qua trục y bằng Vcựcdílì.
-IS], mM Hình 4.14. Đổ thị một chiểu Eisenthal - Cornish - Bowden của sấ liệu động học của enzym. Sô' liệu đuạc tập hợp từ Bảng 4.4
Cũng tương tự như vậy, khi một đường thẳng đứng rơi từ điểm giao nhau với trục X , th ì giá trị tại nơi đưòng thẳng đứng đi qua trục X xốc định Km. Đồ thị như Hình 4.13, được gọi là đồ thị một chiổu Eisenthal Cornish —Bowden và được xem như là ưôc lượng tốt nhất giá trị Km và Vcực đẠÌ hơn bất kỳ phương pháp thay đổi tuyến tính nào. Vĩ thế, chúng thật sự khả quan khi ta muốn xác định những tham số động học nhưng sự phù hợp đường cong phi tuyến tính vâi phương trình (4.26) lại không thực hiện được. 4.9. PH ÉP ĐO TẠI NỒNG ĐỘ c ơ CHẤT THẤP
Trong một sô' trưòng hợp, dãy nồng độ cơ chất thích hợp cho phép đo thực nghiệm thường bị giới hạn do khả nàng hoà tan kém hoặc do đặc điểm hoá lý của cd chất gây trở ngại cho phép đo trên một nồng độ 112
giối hạn. Nếu một yếu tổ’là giới hạn của phép đo tại đó nồng độ cơ chất ít hơn nhiều so với Km, phản ứng sẽ đi theo con đưồng động học giả bậc nhất, và sẽ là khó khăn để tìm ra ô cửa thời gian, qua đó vận tốc phản ứng đạt xáp xi như một hàm sô" tuyến tính. Thậm chí nếu như được một dường cong tiến trình gần tuyến tính, thì đồ thị của vận tốc ban đầu vói vai trò là hàm sô" của [S] cũng không được dùng để xác định hằng sô" động học riêng biệt Wc và Km, khi đó nồng độ cơ chất biến dổi có thổ đạt tói thực nghiệm th ật sự rấ t xa so vối nồng độ bão hoà (như trong Hình 4.8a). Trong những trường hợp như vậy, một giá trị có thể bắt nguồn từ sự thiết lập kxú(. tác/Kmbằng việc gắn khớp đường cong tiến trình phản ứng với phương trình bậc một tại một sô' nồng độ cơ chất nhất định. Giả thiết rằng, chúng ta coi sự giảm xuống của nồng độ cơ chất là hàm số của thời gian đưối điều kiện bậc một (ví dụ: [S] « Km). Khi ấy đường cong tiến trình có thể khớp với phương trình sau đây: [S] = [S0]e“kt (4.54) Tại đây, [S] là nồng độ cơ chất còn lại sau thòi gian t, [So] là nồng độ cơ châ't ban đầu, và k ]à hằng số tỷ lệ bậc một. Khi [S] « Km, thì [S] có thể bị bỏ qua trong mẫu số' của phương trình (4.26). Kết hợp với việc xác định Vcựcipi từ phương trình (4.12), chúng ta có: ^d[S] ^ _kx dt Kra Sắp xếp lại phương trình (4.40) thu được phương trình sau: [S] = [S0] e x p ( ^ á Ễ-[E]t )
(4.56)
m
(với: exp = e k..
So sánh phương trình (4.41) vói phương trình (4.39), nhận thấy: k = - xúe ^ -[E]
(4.57)
Do đó, nếu chúng ta biết được nồng độ của enzym trong một phản ứng, việc ước lượng kX(Sctác/Kmcó thể nhận được dựa trên phép đo hằng số tỷ lệ bậc một của đưồng cong tiến trình phản ứng khi [S] « K™(Chapman và cộng sự, 1993; Wahl, 1994). 113
4.10. ĐỘ LỆCH TỪ ĐỘNG HỌC H YPEC B O L
Trong hầu hết các trưòng hợp, phép xác định động học enzym phù hợp hoàn toàn với quan điểm Henri —Michaelis - Menten trong chương này. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, người ta quan sát thấy có một sự lệch từ sự phụ thuộc theo hàm hypecbol của vận tốc lên cơ chất. Những sự bất thường xảy ra là do một số nguyên nhân. Có thể là các phương pháp vật lý để xác định vận tốc, như phép đo quang phổ nhìn thấy, và chúng ta sẽ đi vào bàn chi tiết ồ chương “Thực nghiệm đo hoạt độ protein”. Dạng không theo hàm hypecbol cũng được gây ra do sự có m ặt của các loại chất ức chế nhất định. Trong một sô' trường hợp gặp, chất cạnh ức chế cơ chất là một phân tử cơ chất thứ hai có thể liên kết vào phức hệ ES để tạo thành một phức hệ tam phân không hoạt động, SES. Do sự hình thành phức hệ ES xảy ra trước khi có sự hình thành phức hệ tam phân ức chế nên chất ức chế cơ chất thưòng chỉ được phát hiện ra khi nồng độ cơ chất cao, và nó được xác định là thấp hơn so với giá trị mong muôn dùng để đo vận tốc tại nhũng nồng độ cd chất cao này. Hình 4.15 phản ánh một dạng hoạt động tại đó một enzym bộc lộ sự ức chế cd châ't. Tại nồng độ cơ chất thấp, động học enzym tuân theo những quan điểm đơn giẳn Michaelis - Menten. Vượt qua nồng độ cơ chất giới hạn, tuy nhiên thì sô" liệu có một độ lệch đáng kể so với mong muôn. Liên kết ở vị trí thứ hai, với hai chất ức chế, phân tử cơ chất có thể được xác định theo phương trình sau: V — . V- W s l K„+[S](1 + ^ )
(4 58)
Hoặc là đem chia tử sô' và mẫu số của vế phải phưdng trình (4.58) cho [S], thu được: v = —
1+
( 4- 59)
+i sỉ [S] k
[
Tại đây, K, trong phương trình (4.58) và (4.59) là hằng sô" liên kết của phức hệ ức chế tam phân SES. Ảnh hưồng ức chế tại cáo nồng độ cơ chất rấ t cao, có thể được xác định một cách dễ dàng là phi tuyến tính trong đồ thị Lineweaver —Burk. Tại đây ta có thể thấy một đường cong đi lên một cách đột ngột và mạnh mẽ của các dữ liệu nằm ở m ặt phăng trục y. 114
100 -
T— >— I— >— I— >— I— >— I— .— r
80
I
60
J
40
&.
20
=L
>
0,
0
_
_ ...............................
200 400 600 800 10001200*1400
-IS]. mM Hình 4.15. Đổ thị Michaelis - Menten cho phản ứng một enzym hiển thị sự ứe chế cơ chất tại một nồng độ cơ chất cao; đuỡng nét rời, tương thích nhất của số liệu ở nổng độ cơ chất thấp đối với phương trình (4.26); đường nét liền, tuơng ứng vâi tất cả số liệu đối với phương trinh
(4.59). Hằng số Kị (phương trình 4.59 sẽ đứạc mô tả ky hơn ố chương sau).
Một lý do khác nữa của động họe không theo hàm hypecbol là sự có mặt nhiều hơn một enzym hoạt động đối với cùng một cơ chất. Nhiều nghiên cứu về enzym cũng chỉ được tiến hành với một phần enzym tinh sạch và nhiều chẩn đoán đơn giản phát hiện rằng, dựa vào việc xác định enzym hoạt động được tiến hành trên mẫu enzym thô (máu, mô đồng chất). Khi mà cơ chất đối vói phản ứng lại là duy nhất cho enzym đang quan tâm thì những enzym thô được sử dụng cũng đem lại kết quả tốt. Tuy nhiên, nếu mẫu chứa nhiểu hơn một loại enzym có tác động lên cơ chất, thì độ lệch xuất hiện từ nhũng kết quả động học. Giả sử rằng, mẫu của chúng ta có chứa hai loại enzym, cả hai cùng chuyển hoá cơ chất thành sản phẩm, nhưng chúng lại có hằng sô' động học khác nhau. Giả thiết xa hơn cho một enzym là Vcực đại = Yi và Km= Kj và enzym còn lại V«ỊCdại = v 2 và Km= K2. Vận tốc của hỗn hợp tổng sô' được chia ra như sau: v =, i s L +_ S H . K,+[S] Kj + [S]
(4.60)
Ta có thể sắp xếp lại để thu được biểu thức sau (Schulz, 1994); i. _ (VìK ^ V 2K l)ỈS]^(Vt ^ V 2)[S]2 K,K2 + (K2 + K2)[S] + [Sf Phương trình (4.61) là một đa thức, đem lại nhũng dạng đồ thị rất khác so với dạng đồ thị hypecbol vuông góc như mong muốn, điều này được minh hoạ trên Hình 4.16. 115
-[S], nM Hình 4.16. Ảnh hưỏng rất nhiều enzym lên cùng một cơ chất.
Đưởng nét rời thể hiện sự gắn khớp của dữ liệu ở phương trình (4.26) trong một enzym đơn, trong khi đường nét liền thể hiện sự gắn khớp với phương trình (4.46) đối với hai enzym hoạt động trên cùng một cơ chất với V, = 120nM/s, v2 = 75ụM/s, K, = 65|aM/s và K2 = 3ụM/s.
Một ví dụ cuối cùng vể độ lệch của động học dạng hypecbol đó là các enzym thể hiện sự cộng tác với liên kết cơ chất. Trong độ lệch của phương trình (4.26), chúng ta cho rằng, trung tâm hoạt động của phân tử enzym thể hiện hoạt động một cách độc lập với các phân tử enzym khác. Như chúng ta đã thấy trong Chương 3 và 4, đôi khi các phàn tử protein xuất hiện dưới dạng một nhóm các đa phân tử dưới đơn vị. Một số' enzym xuất hiện là các chuỗi đồng dạng, trong đó mỗi tiểu đơn vị có chứa một trung tâm hoạt động riêng biệt. Có thể là sự liên kết với một phân tử cơ chất tại một sô" các trung tâm hoạt động đó gây ra ảnh hưởng áp lực đối VỚỊ các trung tâm hoạt động khác trong nhóm các đa phân tử dưới đơn vị. Sự ảnh hưỏng này được gọi là sự cộng tác. Nó có tác dụng dương tính nếu như liên kết của một phân tử cđ chất với một trung tâm hoạt động làm tăng áp lực cho một phân tử cơ chất của một trung tâm của phân tử enzym và mức độ cộng tác giữa chúng có thể được xác định nhồ hệ số Hill, h. Ảnh hưồng của sự cộng tác lên các giá trị vận tốc đo được có thể dễ dàng tính toán được khi ta biến đổi phương trình (4.26) thành phương trình sau: cụcdại [Sr V = ■ (4.62) K’+ [S] Ở đó K’ có liên quan tói K nhưng cũng chứa khái niệm liên quan tới ảnh hưỏng chiếm giữ cơ chất của một trung tâm hoạt động lên áp lực cơ chất của một trung tâm hoạt động khác. Hình 4,17 minh hoạ sự cộng tác dương tính cố thể gây ảnh hưởng lên đồ thị Michaelis - Menten và Lineweaver - Burk của một phản ứng enzym như thế nào. 116
10'
20 30 -[S], »M
0,5
1
1,5
2,5
1/IS]
Hình 4.17. Ảnh hưỏng của sự cộng tác dương tính lên động học của một phản ứng
xúc tác enzym (a) Dữ liệu được đổ thị hoá dưới dạng biểu đổ của Michaelis - Menten, và (b) Dữ liệu từ (a) được tái đổ thị hoá dưới dạng biểu đồ dạng nghịch đảo Linew eaver- Burk.
Số liệu vận tốc đối vối enzym cộng tác có thể được biểu hiện trên dạng tuyến tính nhờ áp dụng phương trình (4.63): log(-
v„Cực ,dọi; - V
) = hlog[S] - logỊK’]
(4.63)
Do đó, một đồ thị hàm log (v/Vcục đ?i - v) là hàm số của log[S] được thể hiện qua một đường thẳng với độ dốc là h và mặt phẳng y của -log(K’), được minh hoạ trên Hình 4.18.
logisi Hỉnh 4.18. Đố thị Hili cho dữ liệu tấy từ Hình 4.17
log[v/(Vcựcaạ1 - v)] được biểu diễn trên đổ thị là hàm số của Ịog[S]. Độ đốc của đường khôp nhat giúp cho việc ước lượng hệ số Hill, h, và mặt phẳng y ước lượng - 1og{K').
Tính hữu ích của những đồ thị như vậy là bị giói bạn nhưng lại cần thiết dể biết được v cực dại và vì mốì quan hệ tuyến tính mô tả trong phương trình (4.63) chỉ được giữ trong một khoảng giới hạn cửa nồng độ 117
cơ chất (trong vùng [S] = K’). Vì vậy, bất kỳ khi nào có thể, cách tốt nhất để xác minh Vcựcđ?i, h, và Kmcho các enzym cộng tác là từ đường cong phì tuyến tính ứng với phương trình (4.62), Các ví dụ này minh hoạ cho độ lệch gặp phải một cách phổ biến từ động học dạng hypecbol. Các nguyên nhân của sự lệch này cũng được biết đến, nhưng chúng lại ít phổ biến hơn. Một sự bàn luận toàn diện hơn về độ lệch như vậy đã được trình bày bởi Segel (1975) và Bell (1 9 8 8 ).
4.11. ĐỘNG HỌC TRẠNG THÁI TIỀN Ổ n ĐỊNH CÓ THỂ CUNG C Ấ P BẰNG CHỨNG CHO C Á C BƯỚC PHÀN ỨNG ĐẶC BIỆT
Hai tham số thí nghiệm quan trọng nhất của động học trạng thái tiền Ổn đính là kxúc aJ K^. Sự thay đổi các tham sô' này cùng với sự thay đểi pH hoặc nhiệt độ sẽ đưa thêm thông tin vê' các bước trong một phản ứng. Trong trường hợp phản ứng 2 cơ chất, động học trạng thái ổn định có thể xác định xem một phức hợp hình thành 3 cấu tử có được hình thành hay không trong quá trình phản ứng (Hình 4,19).
Hinh 4.19. Sự phân tích động học trạng thái cân bằng của phản úng 2 cd chất
Trong các đồ thị cân bằng - kép này (xem ghi chú 4.1), nồng độ của cơ chất 1 thay đổi trong khi nổng độ cơ chất 2 đuỢc giữ ổn định. Điểu này được lặp lại đối với một vài giá tri của [SJ, tạo ra một vài'đuờng ttìầng tách biệt. Các đường này cắt nhaủ nếu một phức chất 3 cấu tử được tạo thành trong phản ứhg (a), nhưhg sẽ song song VỚI nhau nếu phản úng hay con đuớng thế kép (b).
Để hiểu cặn kẽ một phản ứng xúc tác bỏi enzym thì cần phải đo được tổc độ của từng bước phản ứng riêng rẽ, ví dụ như đo tốc độ phản ứng kết hợp enzym và cơ chất thành phức hợp ES. Điều này có thể thực hiện được khi phản ứng ỏ trạng thái tiền ổn định. Các điều kiện phản úng được điều chỉnh để dễ xác định các sự kiện của một số chất đơn xảy ra trong suốt 118
quá trình phản ứng. Do pha trạng thái tiền ổn định của một phản ớng thường rấ t ngắn nên đòi hỏi phải có những kỹ thuật chuyên hoá để trộn và lấy mẫu nhanh. Như đã được đề cập ở trên, tốc độ phản ứng và cân bằng phản ứng liên hệ với sự thay đổi năng lượng tự do của phản ứng. Việc đo tốc độ của các bước riêng rẽ có thể xác định năng lượng dã được enzym sử dụng như thế nào. Trong một số trường hợp, có thể đo được tốc độ của các bước riêng rẽ của một phản ứng enzym nhiều bước. 4.12. ĐỘNG HỌC ENZYM MỘT c ơ CHẤT, HAI SÀN PHAM
Các enzym xúc tác giải phóng hai sản phẩm trong một kết quả xấc định cần một mô hình phức tạp hơn cho cách xử lý động học của chúng. Những enzym này trải qua hai giai đoạn trung gian trong quá trình xúc tác, ES và ES’, và hình thành các sản phẩm gồm hai bậc với các hằng số vận tốc liên kết k2 và k3:
E+s -
ES —
ES’ + p,
E + pa+(4.64)
Bước xác định vận tốc bao gồm cả 8ự giải phóng sản phẩm bậc một p, và sự chuyển hoá ES thành ES’, Việc áp dụng phép tính xấp xỉ trạng thái Ổn định vào cả hai giá trị [ES] và [ES1] (chẳng hạn, bằng cách cho rằng, và )* tạo ra phương trình (4.65) của vận tốc phản ứng.
* A l [E][S] V =
k2[ESJ
= -—
-------------------------------------------------------------- \ <4 ' 6 5 )
k-1 j- K + [S] K l k 2+ k 3
Mặc dù phương trình (4.65) trông có vẻ rắc rối, nhưng nó có dạng giống phương trình (4.26). Thực tế nêu thay thê Vcựcdại kjiuc tàc [E0] = và Km= thì phương trình (4.26) vẫn được sử đụng và đối với enzym loại này vẫn theo động học Michaelis —Menten. *: Chúng ta thừa nhận rằng hầu như ngay lập tức sau Khi phẳn ứng bắt đầu, vận tốc thay đổi nồng độ của phức ES là bằng không, đó là khi giá trị [ES] ỏ trạng thái ổn định được xác lập. Tốc độ thay đổi của [ES] theo thời gian, —^ dt - jp
có thể được biểu thị ồ phương trình:
= k,[E][S] - k _ , [ES] - k2 [ES] = 0
4.13. C Á C PH ÀN ỨNG ENZYM VỚI NHIỀU c ơ CHẤT
Cho đến bây giò, chúng ta đã để cập đến các phản ớng enzym đơn giản nhất liên quan đến một cơ chất bị biến đổi thành một sản phẩm. 119
Tuy nhiên, phần lớn các phản ứng enzym lại liên quan đên hai cơ chất và dẫn đến sự tạo thành nhiều hơn một sản phẩm. Chúng ta đã từng lấy rất nhiểu ví dụ, hầu hết chúng là các phản ứng đa cơ chất và đa sản phẩm, ví dụ như phản ứng proteaza —serin ở đầu chương trước có hai cơ chất và tạo hai sản phẩm, hay VI dụ peptit được hydro hoá để tạo sản phẩm hai peptit, hoặc một phân tử ĩiước bị thuý phân trực tiếp thành proton và nhóm OH. Khi chúng ta đề cập đến sự phosphoryl hoá các protein bằng kinaza, cần một nguồn phosphat cho phản ứng và chính nguồn phosphat này là cơ chất của enzym. Ví dụ: một kinaza phụ thuộc ATP, cần protein và ATP là hai cơ chất và phosphoprotein và ADP là hai sản phẩm. Trong chương này, chúng ta sẽ đề cập đến động học trạng thái cân bàng để nghiên cứu các phản ứng kiểu này. 4.13.1. Đặt tên phản ứng
Một phương pháp đặt tên phản ứng đã được đưa ra để mô tả số lượng cơ chất và sản phẩm trong một phản ứng, sử dụng các tiền tô" latin như uni, bi, ter,... ví dụ: một phản ứng có hai cơ chất tạo thành hai sản phẩm được viết là phản ứng bi bi, ba cơ chất tạo thành hai sản phẩm là ter bi,... (Bảng 4.7). Bảng 4.7. Danh pháp chung cho các phản ứfig P hản ứng
Tốn
A —►p
Unf uni
A + B -» p
Bi uni
A+B
Bí bi
p, + P2
A + B + C —»P.| + P2
Ter bi
Phương trinh cho phần ứng bi bi: E +A X + B ; = ± E + A + B X Tuy nhiên, phương trình phản ứng này còn để lại nhiều câu hỏi chưa có câu trả lòi. Có phải cơ chất gắn và tách trước khi có chất thứ hai có thể gắn? Có thứ tự trong gắn cơ chất hay ngẫu nhiên? Có phải nhóm X chuyển trực tiếp từ A đến B khi cả hai cùng gắn vào vị trí hoạt động của enzym, hay là vận chuyển từ phần tử cho A tới vị trí trên enzym, sau đó vận 120
chuyển nhóm lần thứ hai từ vị trí enzym đến phân tử B chất nhận (ví dụ: phản ứng trải qua sự hình thành phân tử trung gian E - X)? Những thắc mắc này dẫn tới ít nhất 3 cơ chê tồn tại cho phương trình chung, đó là các cơ chê theo thứ tự ngẫu nhiên, thứ tự chặt chẽ và thử tự xen kẽ - “Ping —Pong” thông thường, mục đích chính của động học trạng thái cân bằng phản ứng là để phân biệt các cơ chế phản ứng khác nhau. Và chúng ta sẽ đưa ra mô tả cho từng loại, đi kèm với các phương pháp đổ thị để phân biệt chúng. Vì thế, chúng ta sẽ sử dụng các phưởng trình tốc độ trạng thái cân bằng chung của Alber (1953), là một phản ứng đa cơ chất, trong đó hằng số cân bằng cũng giống với những gì chúng ta đã thoả luận về phương trình Henri - Michaelis - Menten. Điều này rấ t phù hợp với các enzym phân giải một hoặc hai cơ chất và tạo ra một đến hai sản phẩm. Với mô hình phản ứng phức tạp hơn thì thông thường sẽ có thêm thông tin được đưa ra chứ không chỉ là hằng sô" tốc độ cho từng bước (Dalziel, 1975). Đến cuôì chương, giới thiệu sd lược phương pháp của King và Altman (1956), theo đó các hằng s<3 tốc độ cho các mô hình phản ứng phức tạp có thể được xác định bằng đồ thị. 4.13.2. Các cơ ch ế phản ứng bi bi 4.13.2.1. Các phản ủng thứ tự ngẫu nhiên
Trong cơ chế này, cơ chất cố thể gắn vói enzym trước hay sản phẩm có thể tách trước cho dù các cơ chất gắn vào trưác thì phản ứng xảy ra qua một phức hệ trung gian (E'AX-B) như: E+ A X ^ = ^ E
E-BX
E+BX
ở đây, sự gắn AX dể giải phóng enzym (E) được mô tả bằng hằng số phân ly K,vx, và việc gắn B với E tương tự được mô tả bởi K '\ Chú ý rằng, sự gắn của một ed chất có thể ảnh hưởng lớn tới ái lực của enzym với cò chất thứ hai. Do đó, chúng ta có thể tính được sự gán AX để tạo phức hệ E-B là một hằng số aK1®. Tương tự, vì sự cân bàng enzym giũa EA X B và E phải độc lập, sự gắn B đến phức hdp E-AX sơ bộ được cho là bởi 121
aK B. Khi B đã bão hoà, giá trị của aK '^ bằng với hằng số Michaelis cho AX (ví dụ ). Tương tự, khi AX đã bão hoà, aKB = K® . Tốc độ phản ứng enzym như th ế này cho phương trình (4.66): v = kV M C1,e[E -A X-B ]J = -I vúctácL [E] + [E ■AX] + [E • B] + [E • AX ■B]
<4'66)
Nếu chúng ta biểu diễn nồng độ của các nhóm khác nhau bằng nồng độ của enzym tự do [E], chúng ta có: V ^JA X H B ] (4 67) V = ----- ----------- cựcdạ‘ —— J ------- ----ciK^K® + ccKB[AX] + ccK^ [B] + [AX] [B] Nếu chúng ta cố định nồng độ của một trong các cơ chất, chúng ta có thể sắp xếp và đơn giản phương trình (4.67). Ví dụ: khi [B] cố định và [AX] thay đổi, chúng ta có: VW AX]
B\ a K ^ I 1 + Ỉ L + [AX] 1 + K_ [B] [B]
(4.68)
Hình 4.20. Đồ thị kép thuận nghịch đối vdi phản ứng enzym b í b i th ứ tự ngẫu nhiốn
Ở trên, nồng độ B cố’định, điều kiện Kb/[B] và aK B/[B] đi đến zero. Vì vậy, ỏ nồng độ B bão hoà, chúng ta thấy: vS T Ị Ạ X Ị V—J£AX, biểuhiộn
Và tương tự, khi [AX] bão hoà: 122
(4.69)
T f b ie u h iệ n r r j l cực ctn; l- ^ J
(4.70)
V = --------- ----------------------J ^ A X , biéu h iệ n
+ [3 ]
Nêu chúng ta tính tôc độ phản ứng trong khoảng ở một nồng độ AX, B cô định, đồ thị biểu diễn là các đường giao nhau tại một điểm bên trái y, giới thiệu ở Hình 4.20. Các kết quả ở Hình 4.20 có thể được biểu thị lại độ dôc của các đường thẳng như là hàm số của 1/[B] và phần chắn y (ví dụ 1/Vcbj ^ iện ) như là hàm số của 1/[B] (Hình 4.21). Phần chắn y của đồ thị 1/[B] chống lại độ dốc cho phép ưốc tính aK^/Vcục (tíli và phần chắn X của đồ th ị này cho phép ước tính -1/KB. Phần chắn y và X của độ dốc của 1/ V^jf^iận cho phép ước tính 1/Vcựcđụi và -l/otKBtương ứng. Do đó, từ những sổ liệu có được trong hai đồ thị vẽ lại, một có thể tính được các giá trị của K**, KBvà Vtựcdíl, đồng thòi.
Hỉnh 4.21. Đồ thj vỗ lại (a) độ dốc và (b) phẩn chắn y của sô' liệu Hinh 4.20 biểu diẫn s ự xác định đổ thị của K** và Vcụeđt, cho phản ứng enzym bí bi th ứ tự ngẫu nhiên
4.13.2.2. Các phân útig b i b i có th ứ tự b á t buộc
Trong nhũng phản ứng này, một cơ chất là AX, phải được gắn vói enzym trước khi cơ chất còn lại [B] gắn vào. Như phản ứng ngẫu nhiên, cơ chế này diễn ra bằng cách hình thành một phức hệ trung gian. Sơ đồ là: E + A X ^=t E. AX
E. AX. B ^
E. A. BX ^
E. A
E+A
Nếu sự chuyển E-AX-B thành E'A’BX là bưổc có tốc độ tới hạn trong phản ứng xúc tốc, sau đó E, AX, B và K-AX-B vổ trạng thái cân bảng và tốc độ phản ứng là: V =
k
axk
h
+
k
b
[A X] + [A X ][B I
(4.71)
123
Tuy nhiên, nếu sự biến đổi EAXB thành E-A'BX diễn ra nhanh như các bước khác trong xúc tác, giả thuyết về trạng thái cân bằng phải được sử dụng trong phép đạo hàm của phương trình vận tốc, do đó, ta có phương trình (4.72): V.
................. K " K ' + K” (AX] + K“ [B] + [AX][B]
(4.72)
Như chúng ta đã mô tả trước đó, K** trong phương trình (4.72) là một hằng sô" phân ly cho phức hệ E.AX và là nồng độ của AX khi vận tốc được cố định ỏ 1/2 Vcực(líli, còn [B] bão hoà. Đồ thị cho các giá trị [AXJ khác nhau tại các giá trị [B] cô' định được mô tả như trên Hình 4.21 biểu diễn phản ứng bi bi ngẫu nhiên (giống như phương trình 4,67 và 4.72). Do đó, khi chúng ta không thể phân biệt được cơ chế phản ứng bi bi ngẫu nhiên hay có thứ tự chặt chẽ, chúng ta cần sử dụng đến các nghiên cứu sủ dụng đồng vị hoặc các chất ức chê sản phẩm. 4.13.2.3. Các phản úng th ế kép hay phản úng b i b i p in g - pong
Trong trưòng hợp này, cơ chế phản ứng có liên quan đến sự liên kết AX vối enzym và chuyển nhóm X đến vị trí trên enzym. Sản phẩm A, sau đó có thể được giải phóng ra và cơ chất thứ 2, B gắn với dạng E-X của enzym (trong cơ chế này, B không thể gắn với enzym dạng tự do). Nhóm X, sau đó được chuyển tới (ví dụ, sự phản ứng đổi chỗ thứ hai) để liên kết với cơ chất B, trước khi giải phóng từ enzym của sản phẩm cuối cùng, BX. Sơ đồ cơ chế của phản ứng như sau: -A K + AX E-AX EX-AX EX J^ E X -B E-BX ? = i E + A Sử dụng giả thuyêt trạng thái cân bằng đối với phản ứng th ế kép có phương trình: [AX][Bj ___ K“ [AX] + K f[B ] + [AX][B] Nếu chúng ta cố định giá trị [B], thì phương trình (4.73) có giá trị [AX] trở thành: V
, ( [AXJ
K*x +[AX](l+ - “ ) [B] 124
(4.74)
Tăng [B]
Hình 4.22. Đồ thị kép thuận nghịch đối với phản ứng enzym b i b i (Ping - Pong) thè’ kép
Đồ thị thuận nghịch của phản ứng là phù hợp với cơ chế th ế kép cho các nồng độ khác nhau của [AXỊ ỏ một vài nồng độ cô" định của [B] tạo thành những đường thẳng song song như ở Hình 4.22. Đối vói mỗi nồng độ của cơ chất B, giá trị l / V * Ị f “ và - 1 /v b'ể^hiện có thể được xác định từ phần chắn y và X tương ứng của đồ thị thuận nghịch kép. Số’ liệu trong
Hình 4.22 có thể được vẽ lại trong điều kiện l / v “f j “ện như là hằng số’ của 1/(13] và
hiện được giới thiệu ở Hình 4.23. Giá trị của -1 /K “
có thể được xác định từ phần chắn X của đồ thị vẽ lại tạo ra sự ước tính
của 1/v ,ự, []r„ (đối với 1/
ngược vối đồ thị vẽ lại 1/[B]) và 1/Knw
(đối với 1/Kbiểl’h'ện ngược với đồ thị vẽ lại 1/[B]) đối với phản ứng, giới thiệu ỏ Hình 4.23.
Hinh 4.23. Đổ thị từ số liệu Hinh 4.22
(a) 1/ v biểtihiện ngược với 1/ÍB1 và (b) 1/ K^x-biổuhi?n ngược với 1/[B], biểu hiện sự xác định cực dại
m
đổ thi của KM . KB và v„,rr1ai cho phản ứng enzym bi b i (Ping - Pong) thế kép.
m
m
^ *
125
4.13.4. s ử dụng phương pháp King - Altman để xác định các phương trình tô'c độ
Các phương trình tốc độ cho các phản ứng bi bi có thể liên quan dễ dàng tới phương trình Henri —Michaelis - Menten đã được mô tả ở Chưdng 4 (Động học các phản ứng enzym). Tuy nhiên, vâi những mô hình phản ứng phức tạp hơn, ví dụ như có liên quan đến các đa chất trung gian vì nó rấ t khố để có được phương trình tôc độ từ những dữ liệu đơn giản. Một phương pháp khác, theo King và Altman (1956), cho phép tính được đạo hàm của một phương trình tốc độ cho cơ chế phản ứng enzym bất kỳ với các hằng số’ tốc độ đơn giản của các bước khác nhau, trong quá trình xúc tác. Dựa vào phương pháp đại số ma trận, King và Altman đã đưa ra các dạng hàm của các mốĩ liên hệ hằng sô" tốc độ này. Chúng ta sẽ có 2 ví dụ. Để bắt đầu, chúng ta sẽ có một phản ứng đơn giản uni - uni như đã nói ở trên. E + S = > E S —*E + P Theo King và Altman, chúng tôi cho rằng, phản ứng có thể là một sự quay vòng và được thể hiện:
Vối mỗi bước trong phản ứng, ta có thể coi K (kappa) là hằng số’tốc độ cho bưỏc đó và nồng độ của cơ chất tự do trong bước đó. Tiếp theo, để xác định vói mỗi con đưòng mà ở đó, một enzym riêng biệt có thể được hình thành trong sơ đồ phản ứng. Dạng enzym
Các con đưòng hlnh thảnh
£ của các kappa sản phẩm
E
E «- K,
K, + K2
E <- k 2 ES
Với bất kỳ enzym riêng biệt, ta có: 126
* i [S]
[dạng enzym] _ X K ddạạ n g
ỵK
[E]
0
enzy m
(4.75)
đây, [dạng enzym] là nồng độ các enzym hình th àn h dưới điều
kiện đó, ^ th àn h và
K d ạ n g en z y m
là tổng các kappa sản phẩm của các enzym hình
K là tổng tấ t cả các kappa sản phẩm. Áp dụng vối phản ứng
uni uni, chúng ta có:
[E] [EJ Và
K-. + KS K^+Kg + KjIS]
P
- -
[E ,]
K _| +
/4 76)
K f ]-r , + K |[S ]
(4.77) '
’
Do đó phương trình tốc độ tổng quát có thể được viết như sau: V = k 2[ E S ]
(4 .7 8 )
Thay th ế giá trị trong phương trình (4.76) và (4.77) thành phương trình (4.78), chúng ta có: V =
k
K_!
2 K .[S Ĩ[E ,]
+ K,
+ K ,[S ]
K a[ E J [ S ]
=
(4
7 -9 )
(
*•-[ ' 2 ^+ [S] \ K'"1 )
Dựa vào phương trình (4.79) ta có thể thấy ngay rằng K2= K
XÚC t á c )
và (K_! + K2)/K jbằng hằng sô'M ichaelis, Km. Nếu chúng ta cho rằng,
v cực d?1 = Kxủc Ucl ta có thể thấy rằng, kết quả theo King - Altman dẫn đến phương trình tốc độ như phương trình (4.26). Bây giờ hãy chuyển sang trưồng hợp phức tạp hơn của phản ứng bi bi thế kép sử dụng sự tiếp cận King - Altman. Cần chú ý rằng ở đây, các nồng độ ban đầu của 2 sản phẩm A và BX là 0 và sự giải phóng các sản phẩm này từ enzym là-không thuận nghịch. Do đó, ta có sơ đồ phản ứng dạng vòng.
127
Cho rằng phản ứng này diễn ra trong các tham sô như ở Bảng 4.10. Phương trình tổng quát cho phản ứng thế kép là: v
= k2[EAX] = kJEBX1
(4.80)
Từ những tham sô" trôn, ta thấy rằng:
_
J
[FAX] ___ ____ k,1k3 „[AX][B] dk-'II---JL (4.81) [EJ ” KjX:.s[AX][B](kz + ki1) k3k 1[B](k_j + k2) + K!K2[AX](k_3 + K„) Kết hợp phương trình (4.80) và (4.81) và sắp xếp lại, ta có phương trình (4,82).
v = -— 7------- 4 K2 — -r ( -------------------------------------------X-(4-82) K.J + K2\ [B] + [AX] [B] [AX] + — K, Vối những kết quả trên, phương trình (4.79) có thể được viết lại, sử dụng phương pháp của Alberty để có thể thu được dạng biểu diễn ban đầu ỏ phương trình (4.82). Tương tự, các phương trình tốc độ cho phản ứng có thứ tự ngẫu nhiên và bắt buộc cũng sẽ dược tính toán. Xem thêm phản ứng của King và Altman trong bản Segel (1975) và bản gốc của King và Altman (1956). Trong chương này dã giới thiệu ngắn gọn khái niệm các phản ứng enzym đa cơ chất và đưa ra các phương trình trạng thái cân bằng để mô tả tốc độ cho các phản ứng này. Chúng ta đã thấy rằng, các phản ứng enzym có liên quan đến 2 cơ chất và 2 sản phẩm có thể diễn ra theo ít nhâ't 3 eơ chế phản ứng riêng biệt là thứ tự ngẫu nhiên, thứ tự bắt buộc và thay thế kép. Các phương pháp thực tế đã được đưa ra để phân biệt các cơ chế phản ứng này dựa trên sự tính toán độn^ học, các nghiên cứu ức chế và trao đổi đồng vị. Sách cũng đã giới thiệu ngắn gọn phương pháp của King và Altman để tính hàm tốc độ cho các phản ứng enzym phức tạp. Sự quan trọng của các phản ứng enzym trong tự nhiôn diễn ra qua sự biến đổi của nhiều hơn một cơ chất để tạo ra nhiều hơn một sản phẩm.
128
Bảng 4.8. Quan hệ King - Altman cho một phản ứng bi bi thay ỉhế không bển
CÂ U HỎI ÔN T Ậ P
1. 2.
Ý nghĩa của vroBXvà Kmđôì với một số enzym cơ bản. Khi nồng độ cơ chất thấp thì phép đo sẽ được tính như thế nào?
3.
Phản ứng ping-pìng là gì? Thế nào là động học enzym 1 cơ chất, 2 sản phẩm? Các phản ứng enzym với nhiều cơ chất.
4.
129
Chương 5
CÁC C ơ CHẾ XÚC TÁC HOÁ HỌC CỦA ENZYM
Vai trò thiết yếu của một enzym trong hầu hết các quá trình sinh lý xuất phát từ hai đặc tính cơ bản của nó: (1) các enzym làm tăng tốc độ các phản ứng hoá học; (2) cốc enzym hoạt động trên nhũng phân tử đặc hiệu có liên quan như các cơ chất để tạo ra các sản phẩm phản ứng đặc hiệu. Các tính chất của sự tăng tốc độ phản ứng này cùng với tính đặc hiệu cơ chất tạo cho các enzym có khẳ năng tiến hành các biến đổi hoá học trong quá trìn h trao đổi chất với hiệu su ất và độ chính xác cần thiết, Trong chương này, chúng ta sẽ thấy cả tính đặc hiệu cơ chất và sự tăng tốc độ phản ứng xuất phát từ cấu trúc ba chiều rấ t chuẩn xác của vị trí gắn cơ chất trong phân tử enzym, được biết như trung tâm hoạt động. Hầu hết các enzym là protein, vì thế các nhóm chức phản ứng hoá học tác dụng lên cđ chất được b ắ t nguồn chính từ các axit amin tự nhiên. Việc xác định và sắp xếp các axit amin này ở bên trong trung tâm hoạt động của enzym sẽ quy định cấu hình của trung tâm hoạt động, Hên quan đến đặc điểm, tính chất hoá học lập thểf tính kỵ nước và độ tích điện. Đồng thời, các tính chất này cũng quyết định các phân tử có thể bám vào trung tâm hoạt động và được xúc tác ra sao. Cấu trúc của trung tâm hoạt động enzym đã tiến hoá để có thể gắn với phân tử cơ chất theo cách gây những thay đổi để chuyển hoá cơ chất thành cấu trúc trạng thái chuyển tiếp của chính nó. Trạng thái chuyển tiếp này được giữ ôn định hoàn toàn nhò việc gắn vói enzym. Tính bền vững của nó dưối các điểu kiện dung dịch bình thường thì thấp hơn nhiều. Việc đạt tới một cấu trúc của trạng thối chuyển tiếp là rào cản năng ìưdng chính cho mọi diễn biến của một phản ứng hoá học, chúng ta sẽ thấy rằng, sự bển vững của một trạng thái chuyển tiếp bồi các enzym tạo ra sự gia tăng đáng kế tốc độ phản ứng. 5.1. C Á C LIÊN KẾT GIỬA ENZYM V À c ơ CHẤT
Cơ chế xúc tác của enzym là vấn đề rấ t quan trong trong việc nghiên cứu vai trò của enzym trong tấ t cả quá trình hoá học trong cơ thể sông. Sự kêt hợp của cơ chất (S) vào trung tâm. hoạt động của enzym (E) tạo thành phức chất enzym - cơ chất (ES) là giai đoạn đầu tiên của phản ứng do enzym xúc tác, Điều này đã được xác nhận qua n h i ề u dẫn liệu thực nghiệm nhận được khi đùng các phương pháp hoá lý khác nhau. Trong một số trưòng hợp, đà quan sát được những phức chất ES 130
dưói kính hiển vi điện tủ hoặc tách được phức ES. Phức chất ES rấ t kém bền vững, nhanh chóng chuyển hoá giải phóng sản phẩm được tạo thành và enzym tự do, enzym lại quay vòng xúc tác. Sự xúc tác enzym của các phản ứng là bản chất của sự sống. Dưới các điều kiện sinh học thích hợp, các phản ứng không được xúc tác, nó thường chậm. Hầu hết các phần tử sinh học khá bền trong pH trưng tính, nhiệt độ bình thường, môi trường nước ở trong tế bào. Nhiều phản ứng thông thưồng trong hoá sinh, thậm chí bao gồm cả hoá học là không thuận lợi hoặc xảy ra trong môi trường tế bào như sự tạo thành tạm thòi các sản phẩm trung gian không bền, hoặc sự va chạm của hai hay nhiểu phân tử trong sự đòi hỏi định hướng chính xác đốỉ với phản úng. Các phản ứng cần thiết đối với phân giải thực phẩm, dẫn truyền các tín hiệu thần kinh, hoặc sự co cơ không xảy ra khi không có sự xúc tác. Sỏ dĩ enzym có khả nãng xúc tác trong điểu kiện bình thường vì nó đã tạo được môi trưòng đặc hiệu bên trong có lợi nhất về m ặt năng lượng để thực hiện phản ứng. Sự phân biệt đặc điểm đặc trưng của phản ứng xúc tác enzym là nó xảy ra bên trong một cái túi của enzym, được gọi là trung tâm hoạt động (Hình 5.1 và 5.2). Phân tử được liên kết với trung tâm hoạt động của enzym và chịu tác động bởi enzym được gọi là phức chất enzym - cơ chất, đó là đặc điểm cơ bản của hoạt động enzym và nó là điểm khdi đầu cho việc áp dụng toán học xác định động học của các phản ứng xúc tác enzym và lý thuyết của các cđ chế xúc tác enzym.
Hình 5.1. Sự liên kết của cơ chất vâi trung tâm hoạt động của enzym Enzym chymotrypsin liên kểt với cơ chất (1); Một số axit amin của trung tâm hoạt động (2); (Nguồn: Lenhninger, Nelson, Cox, 1993)
Các liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và s trong phức chất ES là tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác Van der Waals. Mỗi loại 131
liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước. (1) Tương tác tĩnh điện còn gọi là liên kết ion, liên kết muôi hoặc cặp ion. Liên kết này được tạo thành giữa nhóm tích điện của cơ chất với nhóm tích điện trái dấu trong phân tử enzym. Ví dụ: trong phản ứng thuỷ phân dipeptit glyxyl tyrosỉn do cacboxy peptidaza A xúc tác, nhóm cacboxyl tích điện âm của cơ chất tương tác với nhóm guanidin tích điện dương của gốc arginin trong phân tử enzym. Đối vối cơ chất có chứa các nhóm tích điện dương, các nhóm này sẽ kết hợp với các nhóm tích điện âm (nhóm cacboxyl ồ mạch bên của Asp, Glu hoặc ở đầu C) trong trung tâm liên kết của phân tủ enzym. (2) Liên kết hydro được tạo thành theo kiểu A - H... B, trong đó hydro kết hợp vối A bằng liên kết cộng hoá trị, đồng thời tạo th àn h liên kết yếu với B. Liên kết hydro được tạo thành khi khoảng cách giữa A và B vào khoảng 3Ẩ. Ví dụ: - o - H ..........N - N - H .......... O <------2,88Ẳ------ >
<------3,04Ằ-------*
Vai trò của liên kết hydro trong tương tác giữa enzym và cơ chất được minh hoạ rõ ràng trong tương tác giữa ribonucleaza tuỵ với phần uridin trong cơ chất của nó. 3 liên kết hydro được tạo thành như sau (Hình 5.2, Bảng 5.1).
phán tích Hlnh 5.2. Trung tâm hoạt động của chymotrypsin có ba axit amin, một phẩn của chuỗi cơ bản có liên kết hydro, nhóm bồn của serin có các phản ứng hoá học với liên kết peptit thuỷ phân protein đfch
+ Giữa nhóm —NH - trong liên kết peptit của enzym với nhóm cacboxyl của uridin. + Giữa nhóm - NH - của uridin vối nhóm OH của treonin trong phân tử enzym. + Giữa nhóm OH trong gốc serin của enzym với nhóm cacboxyl của uridin. 132
I
Vòng uridin
I
V
s
°ỉhấtơ MC^N
I
HC.
T 0
H — N\
'I N
/
" " H• / ‘, v Mc£ hin„.„ ạch bèn của goc
H —C H j
threonin trong phân tử enzym
Mạch bên của gốc serin trong phân tử enzym
Hỉnh 5.3. Liên kết hydro tương tác giữa ribonucleaza và cơ chất
Hình 5.4. Sơ đó minh hoạ tương tác ky. nư ãc trong môi trường nưác
Bảng 5.1. Khả năng chuyển đổi trạng thái đối với một số phản ứng xúc tác enzym Enzym
Phản ứng
Ribonucleaza
Thuỷ phân phosphat 2’, 3’ xytidin
lsoxitrat iyaza
Cắt ìsoxitrat thành sucxinat và glyoxylat
Cacboxyl peptidaza
Trạng thái chuyển
u t il
Thuỷ phân liên kết peptit
m Alcohol dehydrogenaza
m
m
im
w
Oxy hoá ethanol thành axétaldehyt
t
ó
i 133
(3) Tương tác Van der Waals yếu và ít đặc hiệu hơn tương tác tĩnh điện và liên kết hydro. Vai trò tương tác này thể hiện rõ khi nhiều nguyên tử của cơ chất có th ể đồng thời tiếp cận với nhiều nguyên tử của enzym. Điều ĩiày chỉ có thể xảy ra khi có sự ăn khớp về hình dạng giữa cơ chất và enzym. Vì vậy, một tương tác Van der VVaals không có tính đặc hiệu, nhưng tính đặc hiệu tăng lên khi có điều kiện để đồng thòi tạo thành lượng lớn tương tác Van der Waals. Ngoài ba loại tương tác kể trên còn có tương tác kỵ nước giữa các nhóm không phân cực cũng có vai trò quan trọng. Các nhóm, các phần không phân cực của các gốc trong phân tử cơ chất và enzym có khuynh hướng kết lại với nhau, do đố có vai trò quan trọng trong quá trình cuộn lại của các chất phân tử lớn cũng như trong tương tác giữa cơ chất và enzym. Phản ứng enzym thường xảy ra trong môi trường nước, các phân tử nước có tính chất phân cực, do đó làm yếu tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, nhưng lại làm tăng cường tương tác kỵ nước (Hình 5.4). Khi cơ chất kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzym, nước bị đẩy ra khỏi vùng này, kết quả hồi phục lại độ bển của tướng tác tĩnh điện và liên kết hydro. 5.2. S ự TẠO THÀNH PHỨC HỢP ENZYM - c ơ CHẤT (ES)
Nghiên cứu về cơ chê xúc tác của enzym, Brown và Henri đề ra thuyết “phức hợp trung gian” và sau đó được Michaelis và Menten bo sung và phát triển thêm. Theo Michaelis và Menten thì trước hết enzym (E) k ết hợp với cơ chất (S) tạo nên một phức hợp trung gian giữa enzym và cơ chất (ES). Trong phức hợp này, do tác dụng của enzym, phân tử cơ chất biến đổi thành sản 'phẩm (P) của phản ứng. Sau khi sản phẩm được tạo thành, thì enzym được giải phóng và quá trình phản ứng hoàn thành, có thể trình bày sơ đồ của phản ứng theo Michaelis và Menten như sau: E + S —»■ES —►E + p Sự hình thành phức hợp ES thitờng xảy ra rấ t nhanh chóng vằ hơn nữa phức hợp này là chất không bền vững, cho nên sự chứng minh cho sự tạo thành phức hợp này trong một thời gian dài gặp nhiều khó khăn. Tuy nhiên, bằng nhiều phương pháp khác nhau, người ta đã chứng minh được sự tạo thành phức hợp của enzym với cơ chất là có thật. Đo quang phổ hấp thụ của enzym peroxidaza riêng biệt và quang phổ hấp thụ của
134
peroxidaza với sự có m ặt của cờ chất của nó là hydroperoxit, ngưòi ta đã thấy quang phổ của phức hợp enzym với cd chất (ES) và enzym hoàn toàn khác nhau.
Bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tự động đã ghi được phức hợp enzym — cơ chất (ES) của nhiều loại enzym khác nhau. Phương pháp ly tâm cũng đã theo dõi được sự hình thành phức hợp ES. Khi cho siêu ly tâm một dung dịch có chứa cả enzym và cơ chất trong những điều kiện thích hợp, thì với một tốc độ nhất định nào đó, phức hợp ES vì có khối lượng phân tử cao hơn nên sẽ lắng xuống đáy ống ]y tâm. Gần đây, một số tác giả đã kết tinh được phức hợp ES của enzym D-alanin oxidaza với cơ chất của nó là D-alanin (enzym này xúc tác quá trình oxy hoá khử amin của D-alanin). Về bản chất của sự kết hợp enzym và cơ chất, nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự kết hộp này xảy ra theo nhiều kiểu rất khác nhau và tuỳ thuộc trước hết vào bản chất hoá học của cd chất. A - B + X ------» A - X + B - H -*g- >A + X + B Với tính đặc hiệu không gian của enzym, ngưòi ta thừa nhận rằng, sự kết hợp được thực hiện qua nhiều điểm tiếp xúc giữa enzym và cơ chất. Hơn nữa, người ta đã biết, vể nhiệt động học, thì năng lượng liên kết của phức hợp Michaelis chỉ vào khoảng lOcal.mol-1. Điểu đó đã chỉ ra rằng, sự kết hợp enzym vào cơ chất là do nhiều liên kết có nàng lương thấp chứ không phải do một liên kết có nống lượng cao. Liên kết cộng hoá trị như ta đã biết, có năng lượng liên kết khá cao (vào khoảng 30 - lSOcal.mol-1), hẳn là không tham gia vào sự hình thành phức hợp ES lúc đầu. Nhưng theo nhiều tài liệu thực nghiệm thì loại liên kết này lại là một yếu tô' quan trọng trong cơ chế xúc tác của enzym. Ngưòi ta đã chứng minh rằng, có 5 loại liên kết có khả năng kết hợp enzym - cơ chất. Các liên kết này có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau, bao gồm liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ nước (lực Van der Waals), và liên kết do chuyển điện tích. 5.3. S ự TƯƠNG ĐỒNG CỦ A TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG VỚI c ơ CHẤT
Khi một protein và một cd chất kết hợp lại tạo thành một phức chất đôi, phức chất này có sự bền vững thực sự, nếu không thì việc gắn sẽ không có lợi về mặt nhiệt động học. Những lực chính có liên quan trong việc làm ổn định các mối tương tác cơ chất protein như: liên kêt hydro, 135
các lực kỵ nước, các tương tác Van der Waals, các tương tác tĩnh điện,... Tất cả chúng góp phần vào toàn bộ nàng lượng liên kết chung của phức hệ và bắt buộc phải lổn hơn để bù vào entropy quay vòng và entropy tịnh tiến kèm theo sự hình thành phức chất đôi. Cũng chính những lực này được các enzym sử dụng trong việc liên kết các phân tử cơ chất của chúng. Ngày nay, sự hình thành của phức hệ đôi cơ chất —enzym đã rõ ràng, nhưng chỉ trừ bước đầu tiên trong quá trình xúc tác. Sự hình thành của phức hệ bắt gặp đầu tiên (gọi là cơ chất - enzym, ES, hoặc phức hệ Michaelis) tiếp theo đó bỏi các bước diễn ra tuần tự tới một phức hệ enzym và trạng thái chuyển tiếp bền vững (ES*), một phức hệ sản phẩm enzym (EP) và cuối cùng phân ly để tái tạo enzym tự do và các phân tử sản phẩm. Sự hình thành phữc hệ ES ban đầu được quyết định bởi hằng sô' phân ly Rs, đó là thương số của các hằng số tốc độ Kding và Kmỏ. Tốc độ các phản ứng hoá học tiếp theo sự hình thành phức hệ ES thưòng được mô tả một cách chung chung cho dễ hiểu là hằng số động học riêng, kíúc tic. Như chúng ta biết, ,ác thường bị giới hạn bởi tốc độ đạt được của các dạng trạng thái chuyển tiếp ES*. Tuy nhiên, sơ đồ xúc tác đơn giản nhất của enzym được minh hoạ trong Hình 5.5.
E+ E+s
ES —
-> E + p
ES‘
Hình 5.5. Sơ đồ chung c h o m ột phản ứng xúc tác bằng enzym th ể hiện các d ạn g nâng lượng tự do mả nó đ i bổ su n g vào toàn bộ năng lưdng hoạt hoá của phản ứng
Để hiểu cd chế tăng tốc độ và tính đặc hiệu của các phản ứng enzym, chúng ta phải xem xét cấu trúc trung tâm hoạt động của các phân tử này, trung tâm hoạt động và môi liên quan vói cấu trúc phân tử cơ chất ở trạng thái ban đầu của nó và trạng thái chuyển tiếp trong quá trình hình thành các dạng ES và phức hệ đôi ES*. Mặc dù trung tâm hoạt động của mỗi enzym là duy nhất, nhưng một số đặc điểm tổng quát có thể được rú t ra: (1) Trung tâm hoạt động của enzym rất nhỏ so vối toàn bộ enzym. (2) Trung tâm hoạt động có cấu trúc ba chiều, các axit amin và coỉactơ trong trung tâm hoạt động được gắn kết theo một sự sắp xếp chính xác so vỏi các vị trí khác về m ặt cấu trúc phân tử cơ chất. Cấu trúc ba chiểu của trung tâm hoạt động này được hình thành là kết quả toàn bộ cấu trúc bậc ba của protein. 136
(3) Trong hầu hết các trường hợp, các tương tác ban đầu giữa enzym và phân tử cơ chất (ví dụ sự liên kết) là không cộng hoá trị, chỉ bằng cách tạo các liên kết hydro, các tương tác tĩnh điện, các tương tác kỵ nước và các lực Van der Waals để liên kết một cách hiệu quả. (4) Trung tâm hoạt động của các enzym thường ỏ trong các rãnh, kẽ nứt bên trong của protein. Cấu trúc như thế có tác đụng đẩy phần lớn dung môi ra ngoài, nếu không, khả năng xúc tác của enzym sẽ giảm. Nói cách khác, phân tử cơ chết bị loại dung môi sau khi gắn enzym và được bảo vệ không có dung môi trong trung tâm hoạt động enzym. (5) Tính đặc hiệu của việc sử dụng cơ chất phụ thuộc vào sự sắp xếp đặc biệt của các phân tử trong trung tâm hoạt động của enzym mà trong một số’trường hợp bổ sung với các phân tử cơ chất. Các bằng chứng thực nghiệm của sự tồn tại nhị phức hệ ES nhanh chống được tích luỹ ố cuôì thế kỷ XIX - đầu thế kỷ XX. Bằng chứng này một phần được đề cập đến, chủ yếu dựa trên các nghiên cứu về sự bền vững của enzym, sự ức chế và động học trạng thái bền vững. Cũng trong giai đoạn đó, các nhà khoa học quan tâm đến việc sử dụng có chọn lọc các phân tử cơ chất đặc hiệu, đặc trưng cho các phản ứng xúc tác bởi enzym. Những thông tin tổng hợp này dẫn tới một quan điểm chung rằng, tính đặc hiệu là kết quả của việc gắn kết có chọn lọc các phân tử cd chất với enzym tại trung tâm xúc tác. Sự chọn lọc của các cơ chất đặc hiệu phản ánh sự tương đồng giữa cơ chất và trung tâm hoạt động enzym. Cuối th ế kỷ XIX, Emil Fisher đã tổng kết tất cả các kết quả này trong mô hình ổ khoá và chìa kho á, được mô tả ở Hình 5.6. Trong mô hình này, trung tâm hoạt động của enzym và phân tử cơ chất được thể hiện dưới dạng cấu trúc tĩnh và bổ sung với nhau về m ặt hoá lập thể. Sự gắn cơ chất vào trung tâm hoạt động tĩnh của enzym thì tương tự như một chiếc chìa khoá khớp vối ổ khoá, hoặc là một miếng ghép hình khđp với phần còn lại: trung tâm hoạt động enzym sẽ khớp nhất với cơ chất khi chúng bổ sung với nhau; do đó các phân tử này bám chặt nhất. Sự tương đồng giữa trung tâm hoạt động và cơ chất không chỉ tạo ra sự vừa khớp về m ặt hoá lập thể của cơ chất vào trung tâm hoạt động mà cả hai câu trúc này đều phải tương đồng về mặt tĩnh điện để đảm bảo các điện tích trung hoà, tránh hiệu ứng loại bỏ. Cũng tương tự như vậy, hai cầu trúc cũng phải bổ sung cho nhau trong việc sáp xếp các tương tác kỵ nước và các tương tác liên kết hydro để có thể đạt được tương tác gắn cao nhất. 137
E
s
ES
Hình 5.6. Sơ đổ minh hoạ mô hỉnh ổ khoá và chìa khoá của các tương tác cđ ch ất - enzym
Quá trình xúc tác của enzym thường chọn lọc về hình dạng lập thổ, theo vòng hoặc đổi xứng lẫn nhau. Do sự nhận biết cơ chất phải có ít nhất ba điểm nối kết giữa enzym và phân tử cơ chất. Lấy ví dụ là: enzym alcohol dehydrogenaza (Walsh, 1979) xúc tác cho sự chuyển hydro trong gốc metyl của etanol tới cacbon ỏ vị trí số bốn của NAD+ (cofactd) tạo thành NADH và aldehyt, Trong các nghiên cứu sử dụng phương pháp thay thế các nguyên tử hydro gốc metyl của etanol bởi đơterin, các nhà khoa học chỉ ra rằng: enzym alcohol dehydrogenaza chuyển toàn, bộ hydro từ pro - R đến NAD+ (Loewus và cộng sự, 1953; Fersht, 1985). Tính đặc hiệu về mặt lập thể này chỉ ra rằng, alcohol bám vào trung tâm hoạt động enzym nhờ các tưdng tác đặc hiệu của nhóm CH;t, OH và các nhóm hydro pro - R để tạo thành sự kết nối ba điểm vối cốc nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động. Quan điểm này được minh hoạ ở Hình 5.7. Sau khi cố định nhóm hydroxyl và nhóm etyl như dược mô tả ỏ Hình 5.7 thì enzym đã được chuẩn bị sẵn sàng cho việc chuyển nguyên tử H của nhóm pro —R dặc hiệu, bồi vì khi nó đã ở tương đôi gần nhóm coíactđ NAD+. Giả thuyết vể sự kết nối ba điểm thường được đặt ra để giải thích tính đặc hiệu lập thể được thể hiộn qua các phản ứng enzym. Các q u a n điểm về mô hình ổ khoá - chìa khoá và sự kết nôi ba điổm giúp chúng ta giải thích sự chọn lọc cơ chất trong quá trình xúc tác nhờ enzym bằng cách lộ ra sự bổ sung hoặc tương đồng về cấu trúc giữa enzym và cơ chất. Tuy nhiên, trong cuốn sách này không đề cập đến dạng phân tử có cấu trúc bổ sung với trung tâm hoạt động enzym. Những công thức đầu tiên của giả thuyết này trưóc khi thuyết về trạng thái chuyển tiếp được phát triển (pauling, 1984), do đó nó thể hiện trạng thái ban đầu của cơ chât như một câu trúc thích hợp. Tuy vậy, ngày nay đã có bằng chứng rõ ràng 138
rằng, trung tâm hoạt động của enzym đ ã tiến hoá để khớp với cấu trúc của Cd chất ở trạng thái chuyển tiếp hơn là trạng thái ban đầu.
Hlnh 5.7. Minh hoạ của s ự kết nấi 3 điểm trong các tường tá c enzym và cđ chất (Nguổn: Copeland, R.A., Enzymes, 2000)
Một ví dụ điển hình là các phân tử ức chế có cấu trúc được thiết kế bắt chưóc với trạng thái chuyển tiếp của phản ứng thì bám chặt với enzym hơn là cơ chất hay sản phẩm. Trên thực tế, một sôi”nhà khoa học lại tranh luận rằng: “nguồn động lực xúc tác duy nhất là sự bền vững của trạng thái chuyển tiếp; các tương tác của trạng thái phản ứng là do sự ức chế tự nhiên và chỉ là nguồn dư thừa” (Schowen, 1978). Một số khác lại cho rằng, có một chút ái lực ở trạng thái ban đầu của cơ chất cần thiết cho sự hình thành của phức hệ ban đầu, sử dụng nàng lượng kèm theo đó để kiểm tra sự hình thành trạng thái trung gian (Menger, 1992). Thực ra có một sô' bằng chứng từ các nghiên cứu đột biến điểm theo ý muôn gdi ý rằng, những yếu tô" cấu trúc của tính đặc hiệu cơ chất có thể phần nào được phân biệt với cơ chế của sự bền vững trạng thối chuyển tiếp (Murphy và Benkovic, 1989; Wilson và Agard, 1991). Hơn nữa, phần lớn các bằng chứng thực nghiệm ủng hộ m ạnh mể thuyết về sự tương đồng giữa trung tâm hoạt động và trạng thái chuyển tiếp như là nền tảng cơ bản cho tính đặc hiệu cơ chất và động lực xúc tác trong hầu hết các hệ thông enzym. Chẳng hạn, có rất nhiều nghiên cứu vể tính đặc hiệu trong các hệ thống enzym sử dụng động họe của trạng thái bền vững đã đo được tính đặc hiệu thông qua mối liên quan của giá trị K ú c tí,c/Km đôi với các cơ chát khác nhau. Có thể thấy, trong các nghiên cứu đó, giá trị Kmthay đổi rấ t ít đối với các cơ chất khác nhau, chỉ là gấp mười lần hoặc ít hơn. Một cd chất tốt được phân biệt khỏi các cơ chất còn lại theo mức năng lượng chủ yếu bởi tác dụng của k^ictác- Do vậy, phần 139
lớn tính đặc hiệu cơ chất lại nằm trong các tương tác ỏ trạng thái chuyển tiếp với trung tâm hoạt động enzym. Chúng ta sẽ bàn đến điều này nhiều hơn trong các phần sau của chương này. 5.4. GIA TĂNG T ố c ĐỘ PHÀN ỨNG NHÒ s ự BỂN VỮ NG TR Ạ N G THÁI CHUYỂN TIẾP
Các phản ứng hoá học, ví dụ như từ phân tử s (viết tắ t của cơ chất) biến thành phân tử p (sản phẩm) được thực hiện qua sự hình thành của một trạng thái năng lượng cao, tạm thời (thường có thòi gian bán huỷ là 10-’3 giây) được gọi là trạng thái chuyển tiếp (S*). Sau đây chúng ta sẽ nhắc lại một sô" bưóc liên quan tới quá trình xúc tác như đã minh hoạ ở Hình 5.5. Sự kiện đầu tiên (thường là sự va chạm phân tử trong dung dịch) giữa enzym và cơ chất dẫn tới sự tái tạo của phức hệ Michaelis, ES. Dưối các điều kiện thí nghiệm tiêu chuẩn, trạng thái cân bằng này sẽ nghiêng về phía tạo thành phức chất, với AG của phản ứng liên kết đôi với một cặp ES điển hình xấp xỉ từ -3 đến -12kcal/mol. Sự tạo thành phức chất ES dẫn tới sự tạo thành của trạng thái chuyển tiếp liên kết ES*. Đốì với phản ứng không được xúc tác thì sự hình thành trạng thái chuyển tiếp này là rào cản năng lượng chính cho sự tạo thành sản phẩm. Một khi rào cản năng lượng này được vượt qua, phản ứng sẽ nhanh chóng tiếp tục theo chiều hướng đi xuống để tạo thành sản phẩm. Trong trưòng hợp một phản ứng được xúc tác bỏi enzym, quá trình này sẽ liên quan đến sự hình thành của phức hệ EP liên kết, và cuối cùng là aự phân ly của phức hệ EP để giải phóng sản phẩm p và enzym tự do (E). Vì enzym có m ặt ở cả bên phản ứng và cả bên sản phẩm của phương trình phản ứng, do đó không thay đổi về m ặt động học của một phản ứng hoàn chỉnh, nên nó có thể được bỏ qua. Vì vậy, năng lượng tự do của phản ứng chĩ phụ thuộc vào tương quan nồng độ giữa s và P: AG = - RT ln — [S]
(5.1)
Đây cũng chính là phương trình AG của phản ứng không có enzym xúc tác từ cơ chất thành sản phẩm, và nó phản ánh sự độc lập của hàm AG. Nói cách khác, ÀG chỉ phụ thuộc vào trạng thái đầu tiên và trạng thái CUỐI cùng của phản ứng chứ không phụ thuộc vào các bước trung gian (ví dụ ES, ES*, EP) được tạo thành trong quá trinh phản ứng (vì thế AG được gọi là hàm trạng thái). Điều này dẫn tối một kết luận quan trọng của enzym không làm thay đổi sự cân bằng giữa cơ chất và sản phẩm. 140
Vậy giá trị của việc sử dụng một enzym xúc tác cho một phản ứng hoá học là gì? Câu trả lòi của enzym và trên thực tế tấ t cả các chất xúc tác làm tăng độ thiết lập trạng thái cân bằng trong một hệ thống hoá học: enzym làm tăng tôc độ phản ứng hoá học. Do đó, nếu như cơ chất được liên tục cung cấp (dư) thì ta có thể thu được một lượng sản phẩm lớn hơn nhiều trên cùng một đơn vị thòi gian với sự có m ặt của enzym so với không có m ặt enzym. Sự tăng tốc độ này là một đặc tính quan trọng của việc sử dụng enzym trong các quá trình trao đổi chất. Nếu không có enzym xúc tác, tốc độ của nhiều phản ứng trao đổi chất sẽ rấ t chậm, không đủ để duy trì sự sống. Tương tự, việc sử dụng enzym ngoài cơ thể trong các quá trình hoá học cũng phụ thuộc vào sự gia tăng tốc độ này cũng như tính đặc hiệu cơ chất của phản ứng mà enzym xúc táo. Do vậy, giá trị to lốn của enzym cho các hệ thông sinh học và mục đích thương mại ỉà chúng đã cung cấp phương tiện để tạo nhiểu sản phẩm với tôc độ nhanh hơn so vối không có sự xúc tác. Tốc độ chuyển hoá cơ chất, V, có liên quan tới năng lượng hoạt hoá của phản ứng như sau: (5.2) Bây giờ để đơn giản, chúng ta quy ưóc nhiệt độ phản ứng là 25°c và nồng độ cơ chất tại một giá trị của một trong các đơn vị tuỳ chọn. Tại 25°c, RT = 0,59 và k BT/h = 6.2.10’V 1. Giả thiết rằng, năng lượng hoạt hoá của một phản ứng hoá học tại 25°c là 10kcal/mol, tốc độ phản ứng sẽ là: V = e.&lO’V 1.! đơn vị e"1(V0’59 = 2.7.105 đơn vị.s"1 (5.3) Nếu chúng ta giảm năng lương hoạt hoá xuống õkcaưmol thì tốíc độ phản ứng là: V = 6.2.10'V M đơn vị e~6/asB = 1.3.109 đơn vị.s"1 (5.4) Như vậy, bằng cách giảm năng lượng hoạt hoá 5 kcal/mol, chúng đạt được tốc độ phản ứng tăng gấp khoảng 2.000 lần! Thông thường, sự giảm tuyến tính trong năng lượng hoạt hoá dẫn tái sự tăng theo cấp số’ mũ tốc độ phản ứng. Điều này cho thấy rõ chức năng của các enzym. Chúng làm tăng tốc độ phản ứng hoá học nhò việc làm bển hoá trạng thái chuyển tiếp, vi th ế rào cản năng lượng thấp được vượt qua. Chúng ta hãy xem mức độ phản ứng khi có m ặt và không có mặt enzym. Đối với phẫn ứng có enzym xúc tác, cố thể tính toán được các năng lượng tự do và các trạng thái khác từ sự kết hỢp của trạng thái cân bằng và các phép đo động học. 141
Nếu coi năng lượng tự do của enzym và cơ chất với điểm xuất phát ban đầu bằng không thì chúng ta có thể tính được sự thay đổi năng lượng tự do cùng với phức hệ ES* (dưối điểu kiện dư cơ chất) như sau: Ea - AGest = - RT In
( k xúc tác ^
K
+ RT In I
I
(5.5)
Sự thay đổi nàng lượng tự do và sự hình thành phức hệ ES, trong vài trường hợp, có thể được xác định nhờ giá trị Ks từ các phương pháp cân bằng, hoặc từ các phép đo động học. '
1
'
(5.6) K -/ Từ các phép đo ỏ trạng thái cân bằng, người ta có thể tính được sự thay đổi năng lượng tự do với kIÚCtác từ phương trình Eyring: AGes = - RT ln
AGk
= RT l n f M Ì - l n ( k xúctóc)
(5.7)
Nếu lây phương trình (5.5) trừ phương trình (5.7), sự chênh lệch này bằng àG es. Do đó, chúng ta thấy nàng lượng hoạt hoá toàn bộ Ea được thể hiện ở hai dạng AGes và AGk . Dạng AGk là năng lượng được dùng hết để đạt được trạng thái trung gian (các bước tạo liên kết và phá vô liên kốt), trong khi AGES là nàng lượng thu được từ năng lượng gắn cơ chất - enzym (Fersht, 1974; So và cộng sự, 1998). Sự thay đổi năng lượng tự do cùng với phức hệ EP cũng có thể được xác định từ các phép đo cân bằng, hoặc từ sự ức chế ảnh hưởng của aản phẩm lên các giá trị động lực trạng thái bền vững của phản ứng. Trong phản ứng có xúc tác lẫn phản ứng không có xúc tác, nâng lượng hoạt hoá cũng được xác định từ sự phụ thuộc nhiệt độ của tốc độ phản ứng, theo phương trình Arrhenius: ( E_ ' '■xúc lác
=a H
m exp. e
J
( 5
' 8 )
obe: quan sát duợc
Lưu ý rằng, đối với phản ứng không xúc tác thì kxllc tác trong phương trình (5.8) được thay bỏì hằng sô* tốc độ phản ứng bậc một. Từ những phép đo khác nhau, người ta đã vẽ được các sơ đồ minh hoạ ở Hình 5.8. Trong phản ứng không có enzym xúc tác thì quá trình từ cơ chất đến sản phẩm bằng việc vượt qua rào cản năng lương cần thiết để đạt được trạng thái chuyển tiếp s*. Còn trong phản ứng có enzym xúc 142
tác thì những bước đầu tiên của phản ứng để hình thành phức hộ ES. Sự có m ặt của phức hệ ES ngay lập tức làm thay đổi con đường phản ứng, nó khốc hoàn toàn với phản ứng không có enzym xúc tác, nàng lượng gắn cùng với phức hệ ES có thể được sử dụng một phần để thúc đẩy sự hình thành trạng thái chuyển tiếp. Một khi sự gắn kết xảy ra, lực liên kết trong các phân tỏ đang tương tác có ảnh hưỏng cùng lúc làm giảm dộ bển trạng thái cấu hình cơ bản của các phân tử cd chất đã tương tác, đồng thời làm thuận lợi về mặt năng lượng cho sự hình thành trạng thái chuyển tiếp. Do vậy, phức hệ ES có mức năng lượng thấp hơn trạng thái s* tự do, điều này được biểu thị ở Hình 5.8. Những bước tiếp theo của phản ứng là sự hình thành các trạng thái trung gian khác, như phức hệ sản phẩm - enzym, EP, trước khi sản phẩm cuối cùng được giải phóng để tạo ra sản phẩm cuối cùng và enzym tự do. Trạng thái cuối cùng và các trạng thái trung gian một lần nữa được xác định về m ặt năng lượng trong các phản ứng được xúc tác và không được xúc tác. Tuy nhiên, rào cản năng lượng giảm đáng kể trong phản ứng có enzym xúc tác. Sự giảm này làm tăng đáng kể tốc độ phản ứng, như chúng ta đã thấy ỏ phương trình (5.2) - (5.4). Điều đó cho thấy phương pháp thông thường để tăng tốc độ phản ứng là sử dụng enzym.
Hinh 5.8. So đ ổ mức năng lượng của phản úmg enzym xúc tá c và phản ứng không đưdc enzym xúc tác Ký hiệu E s s* ESf, EP và p biểu điên cho enzym tự do, cơ chất bạn đầu, trạng thái chuyển tiếp tự do, phức hệ cơ chất - enzym, phức hệ trạng thái chuyển tiếp enzym, phức hệ sản phẩm —enzym và sản phẩm tự do. Năng lượng hoạt hoá, AGgs* và các thành phàn của nó, AGes và AGk đưạc mô tà như trên hình. Những mức nâng lượng thể hiện mối quan hệ trạng thái mà ỏ đó cơ chất được biểu thị ở nồng độ lớn hơn hằng số phân ly của phức hẹ ES. Khi nồng độ cơ chất lớn hơn Ka thì thế năng cùa trạng thái ES lập tức lớn hơn Irạng thái trung gian E + s (Fersht, 1985).
143
Enzym làm tăng tổc độ phản ứng hoá học bằng cách làm bền hoá trạng thái chuyển tiếp của phản ứng, từ đó làm giảm rào cản năng lượng hoạt hoá cho quá trình hình thành sản phẩm. 5.5. NHỮNG C ơ C H Ế H O Á HỌC C Ủ A Q U Á TRÌNH LÀ M B ỂN HOÁ TR Ạ N G THÁI C H U Y ỂN t i ế p
Sự bền hoá trạng thái chuyển tiếp bỏi xúc tác enzym bắt nguồn từ cấu trúc của chức nồng phản ứng của trung tâm hoạt động enzym và các đặc trưng vể cấu trúc này tương tác với phân tử cơ chất đă liên kết thế nào. Các enzym sử dụng rấ t nhiều cơ chế hoá học khá tỉ mỉ để đạt tới trạng thái chuyển tiếp bền vững và làm tăng tóc độ phản ứng. Những enzym này được xếp vào 5 nhóm chính (Jenck, 1969; Canon và Benkovi, 1998): (1) Sự tương đối của chất phản ứng; (2) Xúc tác cộng hoá trị; (3) Xúc tác axit - bazơ chung; (4) Sự thay đổi hình dạng; (5) Tiền tổ chức của trung tâm hoạt động cho sự bổ sung trạng thái chuyển tiếp. Chúng ta sẽ xem xét từng vấn đề này, song bạn đọc nên nhận thấy rằng, trong bất kỳ một hệ xúc tác, thì một phần, hoặc tấ t cả các yếu tô" này có thể được dùng để đạt tốc độ phản ứng tối ưu. Vì vậy, chúng có ảnh hưỏng lẫn nhau, điểu này có nghĩa là, ranh giới giữa các cơ chế thường không rõ ràng. 5.5.1. S ự tương đối của chất phản ứng
Một sô" yếu tô' kết hợp với phân tử cơ chất tương tác với trung tâm hoạt động enzym làm tăng tốc độ phản ứng. Điều hiển nhiên là sự kết hợp xảy ra khi phân tử cơ chất, nhóm phản ứng lưỡng phân tử giũa hai phân tủ A và B. Chúng tương tác với nhau tạo nhóm cộng hoá trị A - B. Đê cho hai phân tử có khả năng phản ứng với nhau trong dung dịch thì chúng phải va chạm với nhau thông qua sự tương tác khuếch tán theo một hưởng không gian phù hợp cho phản ứng (1); những biến đổi xảy ra trong quá trình tương tác giữa dung môi và chất phản ứng cho phép các obitan phân tử tương tác với nhau (2); lực Van der Waals m ạnh hdn lực đẩy (3) và những sự thay đổi trong các quỹ đạo điện tử để đạt cấu hình của trạng thái chuyển tiếp (4). Trong dung dịch, tốc độ phản ứng được xác định thông qua tốc độ 144
tương tác giưa hai cơ chất. Sự thay đổi nhiệt độ hay sự tăng nồng độ hai chất phản ứng làm thay đổi không đáng kể tốc độ tương tác giữa các phân tử. Trong phản ứng có enzym xúc tác, hai phân tử cơ chất gắn vào trung tâm hoạt động enzym ở dạng tiền phản ứng. Khi cơ chất đã gắn vối trung tâm hoạt động enzym thì hoạt độ của chúng tâng lên một cách đáng kể trong dung dịch. Khía cạnh thứ hai của các ảnh hưởng tương đối là cấu trúc trung tâm hoạt động enzym phù hợp để gắn với cơ chất theo chiều hướng thuận lợi cho phản ứng. Trong hầu hết các phản ứng lưỡng phân tử, hai phân tử cơ chất phải sắp xếp một cách tương đối phù hợp để hình thành trạng thái chuyển tiếp. Trong dung dịch, có sự đóng góp của m ật độ quay đôì với mỗi cơ chất mà nó ảnh hưởng làm giảm tốc độ phản ứng. Bằng việc khoá hai phân tử cơ chất với định hướng phù hợp trong trung tâm hoạt động, enzym trải qua những trở ngại này để đạt được trạng thái chuyển tiếp. Tất nhiên những giới hạn về định hướng và không gian này kết hợp với một số giá trị entropy làm m ất phản ứng. Song sự sắp xếp như vậy cũng xảy ra vói phản ứng trong dung dịch và trong phản ứng có enzym xúc tác. Đây là lợi thế entropy thực sự đáng kể với tác nhân phản ứng tương đối. Việc hai phân tử cơ chất tương tác vói trung tâm hoạt động enzym trong dung dịch phản ứng làm giảm mạnh giá trị entropy; trong phản ứng có enzym xúc tác thì năng lượng này sẽ được bù lại dưới dạng năng lượng liên kết khi hình thành phức hệ ES. Đồng thời, nổng độ và các ảnh hưỗng định hướng cùng với việc gắn cơ chất sẽ quyết định tói hiệu ứng trạng thái gần hay hiệu ứng giổng nhau. Ý nghĩa của những ảnh hưởng tương đối với tốc độ phản ứng được biết tới qua các nghiên cứu so sánh về tốc độ phản ủng của các phản ứng nội phân tử và phản ứng liên phân tử (giữa các phân tử với nhau) (xem Kirby (1980) để hiểu sâu hơn về nội dung này). Ví dụ: Fersht và Kirby (1967) đă so sánh tốc độ phản ủng của sự thuỷ phân aspirin được xúc tác bởi nhóm cacboxylat nội phân tử với phản ứng tương tự nhưng được xúc tác bởi các ion axetat trong dung dịch (Hình 5.9). Phản ứng nội phân tử bắt đầu với hằng số' tốc độ phản ứng bậc một là 1,10 X 1 0 V l. Phản ứng tương tự được xúc tác bởi các ion axetat có hằng số tốc độ phản ứng bậc hai là 1,27 X 10-6. Khi so sánh hai phản ứng này, chúng ta đặt câu hỏi rằng, điều gì đã ảnh hưởng tới nồng độ phân tử gam của các ion axetat gây ra phản ứng nội phân tử kháng lại tốc độ phản ứng như trong phản ứng liên phân tử. Điều này được cân nhắc 145
bằng tỷ lệ của hằng sô" tốc độ phản ứng bậc một và bậc hai (kj/ko). Tỷ lệ này có đơn vị của nồng độ phân tử gam và giá trị của nó đốì với phân tử tạm thời là 8,7M. Tuy nhiên, vi axetat là cơ bản hơn (pka 4,76) so với nhóm cacboxyl của aspirin (pka 3,69) nên người ta phải điểu chỉnh giá trị k2 để tính được sự khác biệt này. Khi điều này xảy ra thì nồng độ phân tử gam là 13M. Do vậy, vói sự điều chỉnh pka một cách hợp lý thì tốc độ của phản ứng nội phân tử lởn hơn nhiều so với phản ứng liên phân tử. Ngoài ra, các ảnh hưồng này cũng đă được Tencks (1969) và Kirby (1980) đề cập. Một quan điểm có liên quan tới những ảnh hưởng tương đối chính là hưỏng quỹ đạo. Giả thuyết hướng quỹ đạo cho rằng, vị trí kề nhau của các nhóm phản ứng giữa phân tử cơ chất và phần còn lại của trung tâm hoạt động không có khả năng xúc tác. Đồng thời vói vị trí này, enzym cần hướng chính xác vào các quỹ đạo phân tử cơ chất tạo nên một định hướng phù hợp. Theo giả thuyết này, các nhóm tại trung tâm hoạt động khác có liên quan tối hưống quỹ đạo nhờ sự gắn cơ chất. Trong khi đó một vài bậc của hưóng quỹ đạo chắc chắn xảy ra trong quá trình xúc tác bởi enzym, hai ý kiến tranh cãi vê' vai trò chủ yếu đổi với ảnh hưởng này trong sự bển vững của trạng thái chuyển tiếp. (1) Sự dao động nhiệt của các phân tử cơ chất làm thay đổi lớn vể định hướng của các nguyên tử tham gia phản ứng bên trong trung tâm hoạt động. Độ lớn của sự dao động này ở nhiệt độ sinh lý mâu thưẫn với ý kiến cho rằng các quỹ đạo phân tử định hưống b ắt buộo. (2) Các tính toán quỹ đạo phân tử gần đây chỉ ra sự thẳng hàng của các quỹ đạo dẫn tới tổng năng lượng đạt giá trị nhỏ nhất (giống như đường cong th ế năng Morse), giả thuyết định hưâng quỹ đạo cần năng lượng tối thiểu nhỏ hơn nữa để duy trì định hướng này. Nội p h â n tử
G ian phân tử
ÓH £*H
Ị. ÒH
ÓH
ồ> 0 Hình S.9. Phản ứng nội phân tử và gian phân tử
146
Một thảo luận sâu hơn về định hướng quỹ đạo và những tranh luận vể giả thuyêt này đã được Bender và các cộng sự đề cập năm 1984. Những thay đổi trong quá trình tương tác giữa dung môi và chất tan cũng cần thiết đối với phản ứng giữa hai phân tử cơ chất. Trong dung dịch, năng lượng sulphat hoá là một rào cản lớn trong quá trình phản ứng. Trong phản ứng có enzym xúc tác, sự cản solvat hoá các tác nhân phản ứng xảy ra đồng thời với quá trình gắn cơ chất vào các trung tâm phản ứng kỵ nước của enzym, nơi mà tạo ra hiệu ứng chắn làm giảm tương tác với các phân tử đung môi. Do đó, năng lượng sự cản solvat hoá được bù lại bằng nãng lượng liên kết của phức chất và không tham gia vào hàng rào năng lượng trong phản ứng enzym (Canon và Benkovic, 1998). Cuối cùng, vượt qua lực tương tác Van der Waals và sự thay đổi nhò sự xen phủ điện tích là các yếu tố quan trọng của phản ứng nội phân tử và xúc tác enzym. Những kết quả này phần nào đã chứng minh được hiệu ứng định hưổng đã được thảo luận ở trên và qua phương pháp quy nạp sẽ được để cập ở phần sau của chương này. Cùng với những tính chất khác nhau này dẫn tới hiệu ứng tổng quát, cái mà được sinh ra bởi Hên kết cơ chất và trung tấm hoạt động của enzym. Các hiệu ứng tương đôi làm tăng tốc độ phản ứng có enzym xúc tác, với các lực liên kết giữa enzym và cơ chất, từ đó sinh ra lực định hướng cho các hiệu ứng này. 5.5.2. X ú c tác cộng hoá trị
Có rấ t nhiều ví dụ về các phản ứng được enzym xúc tác mà những phản ứng này đều trải qụa sự hình thành một chất trung gian cộng hoá trị giữa enzym và phân tử cơ chất. Bằng chứng thực nghiệm về các chất trung gian như vậy được thấy từ các phép đo động lực học, từ việc tách và xác định đặc điểm các sản phẩm cộng hoá trị ổn định, và gần đây hdn là từ các cấu trúc tinh thể của các hợp chất trung gian bằng tia X. Một sô" họ enzym cho thấy, có sự hình thành các chất trung gian liên kết cộng hoá trị, gồm các serin proteaza (các chất trung gian của serin và axyl), các xystein proteaza (các chất trung gian của xystein và axyl), các protein kinaza và phosphataza (các chất trung gian của axit amin và phospho) và các enzym sử dụng pyridoxal phosphat (các bazơ Schiff pyridoxal axit amin). Đôì với những enzym thực hiện cơ chế này thì sự hình thành sản 147
phẩm cộng hoá trị là một bước cần thiết cho sự xúc tác, Sự tạo thành các hợp chất trung gian cộng hoá trị làm cho hệ thống cũng như phản ứng hưởng về trạng thái chuyển tiếp, qua đó giúp vượt qua rào cản năng lượng hoạt hoá. Những enzym mà sủ dụng các hợp chất trung gian cộng hoá trị đã tiến hoá để phân chia phản ứng khó khăn này thành hai bước: hình th àn h và phân giải hợp chất tru ng gian cộng hoá trị nhiều hơn sự xúc tác của các phản ứng đơn lẻ trực tiếp. Bước giối hạn tốc độ trong các phản ứng của các enzym này thường là sự hình thành hoặc phân giải của các hợp chất trung gian cộng hoá trị. Điều này có thể được mồ tả ví dụ trong Hình 5.10, minh hoạ các động lực trạng thái bền vững của sự thuỷ phân p-nìtrophenyletyl cacbonat bỏi chymotrypsin (Hartley và Kilby, 1954). 35 30 5
25
=5
20
ì
C
Is ễ
Ổ. “
,5 10
5 0 0
2
4 6 8 10 12 14 Thời gian (phút) Hình 5.10. Sự minh hoạ các động lực giai doạn bừng p h át Dữ liệu thể hiện sự hình thành p-nitrophenylethyl cacbonat nhà sự xúc tác của chymotrypsin. Các nồng độ chymotrypsin thông thường duạc sử dụng fà 8 (các tam giác), 16 (các hình tròn), 24 (các hình thoi), và 32 (cảc hình vuông) pM. Từ các giá trị bị chặn, các phần enzym hoạt động trong các mau này được uớc luọng là 0,63. Lưu ý rằng, độ coiig rõ ràng trong các mứt thời gian ban đầu ỉại nồng độ enzym cao, qua đó thể hiện một giai đoạn trạng thái tiền bển vững (như sự bùng phát) trong các phản ứng này, (Dữ liệu tính gần đung từ Hartley và Kilby, 1954).
Hình 5.10 thể hiện trạng thái bền vũng tiến tới các đường cong đối với sự thuỷ phân ỏ các nồng độ enzym khác nhau. Từ một thí nghiệm của loại này, người ta mong đợi tốc độ trạng thái bền vũng sẽ tăng với nồng độ enzym (ví dụ độ dốíc của các đường sẽ tăng nồng độ enzym), nhưng tấ t cả các đường cong có nồng độ sản phẩm bằng không tại thời gian bằng không. Thay vào đó, trong Hình 5.10 phần bị chặn y với nồng độ của các trung tâm hoạt động có m ặt trong dung dịch. Sự bột phát đầu tiên trong sự tạo thành sản phẩm là kết quả của một số lượng riêng lẻ
148
của enzym với cơ chất và sự hình thành của một lượng hợp chất trung gian axyl - enzym và sản phẩm. Sự hình thành hợp chất trung gian axyl trong trường hợp này rấ t nhanh chóng, nhưng sự phân giải chúng thì lại bị giới hạn về tốc độ. Hơn nữa, sự hình thành sản phẩm sau đó không thể xảy ra nếu thiếu sự phân giải hợp chất axyl, sự bột phát các động lực nhanh được quan sát, k ế tiếp bởi một tôc độ trạng thái bền vũng chậm hơn nhiều của sự xúc tác. Xúc tác cộng hoá trị trong các enzym phần lớn là dễ dàng hơn nhò xúc tác ái nhân và xúc tác ái điện tử, và trong các trường hợp đặc biệt hơn thì nhò xúc tác oxy hoá khử. Chúng ta sẽ chuyển sang thảo luận kỹ hơn về xúc tác ái nhân và ái điện tử. Một giải pháp chi tiết hdn của các phản ứng oxy ho á khử nhờ xúc tác enzym có thể được tìm thấy trong tài liệu của Walsh (1979). 5.5.2.1. X ú c tác á i nhân
Các phản ứng ái nhân đòi hỏi sự tham gia của các điện tử từ enzym ái nhân đến một cơ chất vói sự tạo thành một phần của liên kết cộng hoá trị giữa các nhóm trong trạng thái chuyển tiếp của phản ứng: Ái nhân + cơ chất V
Ái nhân ....... cơ chất
Tốc độ của phản ứng trong xúc tác ái nhân phụ thuộc cả vào độ bền của sự tấn công ái nhân và sự nhạy cảm của nhóm cơ chất (ái điện tử) bị tấn công (ví dụ: một nhóm chuyển đi thi tốt như thế nào với các loại cơ chất bị tấn công). Khả năng cho điện tử hay tính ái nhân của một nhóm được quyết định bởi nhiều yếu tố, một trong các yếu tô quan trọng nhất này là tính bazơ của nhóm. Tính bazơ là thưốc đo xu hướng của một chất cho một cặp điện tử tới một proton, như đã được trình bày ỏ Chương 2 và được đi sâu hơn ở mục 5.5.3. Nhìn chung, hằng số tốc độ phản ứng trong xúc tác ái nhân có tương quan với pKa của ái nhân. Một đồ thị hàm logarit của hằng số tốc độ phản ứng bậc hai (ka) của phản ứng ái nhân như là một chức năng của một ái nhân pK« mang lại một đường thẳng trong một họ của các ái nhân liên quan tới cấu trúc (Hình 5.11). Đồ thị Hình 5.11 được xem như là đồ thị Bronted vì nó được dùng đầu tiên để chỉ tương quan giữa tốc độ phản ứng với xúc tác pKj, trong xúc tác axit —bazơ chung. Chú ý rằng, trong Hình 5.11, các họ cấu trúc khác nhau của ái nhân tất cả đều th u được đồ thị Bronted tuyến tính, nhưng với các độ đốc khác nhau tuỳ thuộc vào bản chất hoá học của ái nhân. Các yêu tô khác có ảnh hưỏng đến độ bền của một ái nhân bao gồm khả năng oxy hoá, độ phân cực, khả năng ion hoá, độ âm điện. 149
pKs Hinh 5.11, Đổ thị Bronted đối với sự tấn công ái nhân của p-nitrophenyl axetat bởi imidazol (Hinh vuông) và phenoat {hình tròn). Không giổng như xúc lác bazơ chung, trong minh hoạ này, các ái nhân chứa N - và O - có tính bazơ tương tự nhau (pK„) thể hiện các đuờng Brónted khác nhau. Lưu ý rằng, các dữ liệu đối vãi ỉon axetat và các ai nhân phenolat giảm trên đồ thị Bronted [Dữ liệu từBruice và Lapinski (1958)].
Tiềm năng năng lượng của quỹ đạo bị bắt giữ cao n h ất (HOMO); độ bền liên kết cộng hoá trị và kích thước chung của nhóm. Do tốc độ phản ứng đối vối xúc tác ái nhân phụ thuộc vào không chỉ trên pK„ của ái nhân mà còn phụ thuộc vào bản chât của nhóm (một phương pháp xử lý toàn diện hơn đổi với các yếu tô*này có thể được tìm thây, Jenck, 1969 và Walsh, 1979). Đây chính là một đặc điểm để phân biệt giữa xúc tác ái nhân với xúc tác bazơ chung. Trong xúc tác ái nhân thì độ dốc đồ thị Bronted phụ thuộc vàp bản chất của các loại ái nhân, còn trong xúc tác bazơ chung thì độ dốc phụ thuộc duy trì vào pK,. Tuy nhiên, đặc điểm dễ phân biệt nhất của xúc tác ái nhân là sự tạo thành một liên kết cộng hoá trị bền vững giữa n ái nhân và cơ chất trong suốt con đường dẫn tỡi trạng thái chuyển tiếp. Thường thì các hợp chất trung gian cộng hoá trị giống vói các loại phản ứng izo hoá, phổ biến trong hoá hữu cơ phân tử nhỏ. Những khác biệt này và những khác biệt khác nữa giữa xúc tác ái nhân và xúc tác bazơ chung sẽ được trình bày trong mục 5.5.3. Độ nhạy cảm của ái điện tử cũng bị ảnh hưống bỏi một sô" yếu tố. Một lần nữa pKa của nhóm chuyển đi, do trạng thái cho proton của nó, dường như là một yếu tố quyết định. Các nghiên cứu về tốc độ xúc tác bởi một ái nhân thông thưòng lên một dãy các nhóm chuyển đi cho thấy một sự liên hệ rõ ràng giữa tốc độ tân công và pK„ của nhóm chuyển đi, thông thường bazơ càng yếu thì nhóm chuyển đi càng tốt. Như với bản thân ái nhân, bản chất hoá học của nhóm chuyển đi cũng ảnh hưỏng đến tốc độ phản ứng chứ không phải chỉ riêng pKa. Các yếu tố khác ảnh 150
hưởng đến khả năng chuyển đi của một nhóm có thể tìm thấy trong các trích dẫn của Fersht (1985) và Jencks (1969) và trong hầu hết các trích dẫn hoá học hữu cơ vật chất. Trong xúc tác ái nhân có enzym tham gia, ái nhân thưòng gặp nhất là chuỗi bên axit amin trong tru n g tâm hoạt động enzym. Từ những thảo luận trưổc đó, người ta hy vọng rằng, các axit amin cơ bản nhất có thê chính là ái nhân tổt nhất trong các enzym. Tuy nhiên, các enzym chỉ hoạt động trong một giới hạn pH sinh lý hẹp (khoảng pH 7,4). Điều này giới hạn mối liên quan giữa pKa và tính ái nhân đã được mô tả ở trên. Tuy nhiên, khi xem xét phương trình Henderson - Hasselbalch đã cho thấy, ở pH sinh lý (khoảng 7,4) nhóm này sẽ tồn tại hầu như hoàn toàn ỏ dạng axit được thêm proton. Do đó các chuỗi bên arginin khổng thực hiện chức năng như các ái nhân trong xúc tác enzym. Các axit amin có khả năng hoạt động như các ái nhân bao gồm serin, treonin, xystein, aspartat, glutamat, lysin, histidin và tyrosin. Các ví dụ vể các ái nhân và các hợp chất trung gian cộng hoá trị được trình bày trong Bảng 5.2. Một bảng mô tả kỷ hơn về xúc tác ái nhân và các ví dụ về vai trò của nó trong cơ chế enzym có thể tìm thấy trong các trích dẫn của Walsh (1979). 5.S.2.2. X ú c tác á i điện tử
Trong xúc tác ái điện tử, các hợp chất trung gian cộng hoá trị cũng được tạo nên giữa ái điện tử cation của enzym và một phần giàu điện tử của phân tử cơ chất, Các chuỗi bên axit amin không tạo ra các ái điện tử có hiệu quả. Do đó ái điện tử - enzym thường đòi hỏi các coíactơ chất cộng hợp thiếu điện tử hoặc các ion kim loại. Bảng 5.2. Một sô ' ví dụ về các ái nhân enzym và các hợp chất trung gian cộng hoá trị được tạo thành trong các phản ứng của chúng với cơ chất Nhóm ái nhân
Vi dụ enzym
Hợp chất trung gian cộng hoá trị
Serin (-OH)
Serin proteaza
Axyl enzym
Xystein (-SH)
Tiol proteaza
Axyl enzym
Aspartat (-COO)
Phosphoryl enzym
Histidin
ATPaza Các enzym chứa pyridoxal Phosphoglyxerat mutaza
Tyrosin ( -OH )
Glutamin syntaza
Adenyl enzym
Lysin (-NH2)
Các bazơ Schiff Phosphoryl enzym
(Nguồn: theo Hammes, 1982)
Nhiểu ví dụ về các phản ứng enzym xúc tác liên quan đến các ion kim loại tại trung tâm hoạt động trong xúc tác ái điện tử. Kim loại có 151
một sô" vai trò trong các phản ứng này, chúng có thể bảo vệ các phân tử tích điện âm trên các nhóm cơ chất, đồng thời chống lại sự tấn công của một cặp điện tử từ một ái nhân; nó có thể hoạt động làm tăng tính phản ứng của một nhóm bởi sự m ất điện tử; và nó cũng hoạt động để nôi một cơ chất với nhóm ái nhân; chúng có thể thay đổi pKa và tính phản ứng của các ái nhân gần đó. Các ion kim loại cũng được dùng trong xúc tác enzym như là các trung tâm liên kết cho bác phân tử cơ chất. Ví dụ trong một sô’ xytocrom Hem sắt gắn với phân tử cò chất tại một trong sáu vị trí phối hợp với nhau và tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển điện tử tói cơ chất. Các ion kim loại gắn vói các cơ chất có thể tác động đến câ'u trúc cơ chất để làm tăng hoạt tính xúc tác, có nghĩa là chúng có thể thay đổi cấu trúc hình học của phân tử cơ chất theo chiều làm tăng tính phản ứng. Trong protein kinaza phụ thuộc ATP (các enzym chuyển một nhóm y-phosphat từ ATP tới một cơ chất protein). Ví dụ cơ chất của enzym không là ATP mà là một phức hợp liên kết ATP-Mg2*. Các liên kết Mg2* ỏ các phosphat đầu tận cùng, qua đó định vị các nhóm này để tạo thuận lợi rấ t lớn cho sự tấn công ái nhân lên nhóm Ỵ-phosphat. Trong phòng thí nghiệm, cơ chế phổ biến nhất của xúc tác ái điện tử trong các phản ứng enzym xúc tác là cơ chế mà ở đó cơ chất và nhóm xúc tác kết hợp để tạo thành một ái điện tử chứa một nguyên tử nitơ tích điện đương. Bản thân nitơ không phải là một ái điện tủ mạnh, nhưng nó có thể hoạt động như một bể điện tử hiệu quả trong các phản ứng như thế, do bản chất dễ cho proton và vì nó có thể tạo thành các sản phẩm cộng chưa bão hoà điện tích dương một cách dễ dàng. Một ví dụ điển hình cho điều này là họ các phản ứng ái điện tử có liên quan tới (cofactcl) pyridoxal phosphat, Pyridoxal phosphat là một đồng yếu tố cần thiết cho phần lớn các enzym xúc tác cho các phản ứng hoá học ò cacbon vị trí a, p, Ỵ của các a - axit amin. X +
co cr Y Bước đầu tiên trong các phản ứng giữa các axit amin và cofactd là sự tạo thành một amin tích điện dương (bazơ Schiff), nó đóng vai trò chìa khoá trong việc làm giảm năng lượng hoạt hoá. 152
R
+
h 2n
-
r
Pyridoxalphosphat Amin Bazơ Schiff Vai trò của pyridoxalphosphat ỏ đây chính là bể điện tử, từ đó làm bền vững các hợp chất trung gian cacbanion tạo thành trong xúc tác. Việc mất electron từ cacbon vị trí a của axit amin bị tấn công kéo theo nguyên tử nitơ tích điện dương hoạt hoá toàn bộ ba phần tử thay thế đối với phản ứng; do vậy bất cứ một trong ba phần tử này có thể bị thay thế để tạo thành một trung tàm điện tích âm. Bỏi vì amin tích điện dương được liên kết với pyridin dị vòng, sự tấn công chuyển vị quan trọng được tạo ra, từ đó làm cho nhóm pyridoxalphosphat là chất xúc tác hiệu quả đối với các phản ứng ái điện tử. Br'
j:o ơ NH}
jxxy
(b) BH
®N HC-" k
tưr
04p
0 4p " " '
Ă o
R
coo
Hĩnh 5.12. Những ví dụ vế các phản ứng của các axii amin được làm cho thuận tiện nhà xúc tác ái điện tử bối pyridoxalphosphat
{a) Sự loại bỏ a hydro và
153
Tất cả các enzym chứa pyridoxal đều phải trải qua ba bước cơ bản: hình thành amin tích điện dương, những thay đổi hoá học hình thành các hợp chất trung gian cacbanion, và sự thuỷ phân sản phẩm amin, Một phản ứng thông thường của pyridoxal phosphat vói các axit amin là sự loại bỏ a hydro (Hình 5,12) để mang lại một hợp chất trung gian quan trọng nhất trong vô vàn các phản ứng axit amin, bao gồm sự chuyển amin, sự triệt quang hoá, để cacbon hoá và sự chuyển hoá lẫn nhau của chuỗi bên (Fersht, 1986). Ví dụ trong chuyển hoá amin (Hình 5.12), việc loại bỏ a hydro được kế tiếp bởi việc cho proton vào cacbon cacbonyl của pyridoxal phosphat, dẫn tới hình thành một bazd Schiff, axit a —keto tự do và nhóm pyridoxamin. Sự thuỷ phân tiếp theo của loại này mang lại axit a - keto tự do và nhóm pyridoxamin. Sau đó một amin được hình thành giữa axit keto và pyridoxamin, và sự vận chuyển proton dự trữ xảy ra để tạo ra một axit amin mỏi và tái sinh pyridoxal, do đó hoàn chỉnh chu trình xúc tác. Những ví dụ về một sô" phản ứng có enzym xúc tác liên quan tới xúc tác ối điện tử được cung cếp trong Bảng 5.3. Một phương pháp xử lý toàn diện hơn về những phản ứng này có thể được tìm thấy trong các trích dẫn bởi Jeneks (1969), Bender cùng công sự (1984) và Walsh (1979). 5.5.3. X ú c tác axỉt bazơ chung
Hầu như tất cả các phản ứng enzym đểu liên quan đến một hình thức chuyển proton nào đó mà cần có sự tham gia của một số nhóm axit và hoặc bazơ. Trong xúc tác phân tử nhỏ và trong một số mẫu enzym, các proton (từ ion hydro H+30) và ion hydroxìt (OH ) trực tiếp làm các nhóm axit và bazơ được gọi là xúc tác axit, bazơ riêng. Tuy nhiên, thường gặp nhất trong các phản ứng có en 2ym tham gia là các chất hữu cơ, các coíactơ hay các chuỗi bên axit amin của enzym sẽ hoàn thành nhiệm vụ này bằng cách hoạt động làm các axit bazơ theo định nghĩa của Bronsted Lowry gọi là xúc tác bazơ chung hay xúc tác axit chung. Bảng 5.3. Một sô' vf dụ vể xúc tác ái điện tử trong phản ứng có enzym xúc tác Enzym
Chất có ái lực VỚI điện tử
Axetoaxetat decacboxylaza Aldolaza
Bazd Schiff cơ chất - Lysin Bazơ Schiff cơ chất - Lysin
Aspartat aminotransferaza
pyridoxal phosphat Zn2*
Cacbonic anhydra 2a L-malic enzym pyruvat decacbonxylaza
154
Mn** Thiamin pyrophosphat
Trong phản ứng xúc tác bởi các phân tử nhỏ (các phản ứng không có enzym tham gia xúc tác), xúc tác axit/bazơ chung có thể được phân biệt với xúc tác vể tốc độ phản ứng. Trong xúc tác axit/bazơ chung, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ của chất xúc tác axit/bazơ chung. Ngược lại, xúc tác axit/bazơ riêng không phụ thuộc vào nồng độ của các loại này (Hình 5.13). Mặc dù hầu hết các phản ứng enzym đều phụ thuộc vào xúc tác axit/bazơ chung nhưng việc xác định rõ mức độ phụ thuộc này bằng cách thay đổi hàm lượng nhóm axit/bazơ như trong Hình 5.13 là rấ t khó, bởi các nhóm axit/bazơ này nằm trong chính phân tử enzym của nó. Người ta đã dần xác định được các nhóm tham gia xúc tác axit/bazơ chung trong các enzym nhò những nghiên cứu về các khía cạnh pH ảnh hưỏng đến tốc độ phản ứng, từ sự cải biến hoá học đặc hiệu nhóm axit amin, từ sự phát sinh đột biến điểm có định hướng và các cấu trúc tinh thể chiếu bằng tia X.
Nồng độ axit/bazơ Hình 5.13. Hiệu quả của cảc nồng độ axit hay bazơ chung lên tố c độ phản úng đối với các phản ứng xúc tá c chung và phản ứng xúc tác axit hoặc bazơ riêng
Các axit và bazơ chung chỉ thực hiện chức nãng khi pH ỏ dưới hay trên giá trị pKa tương ứng. Do vậy, một đồ thị tốc độ phản ứng về chức năng của pH sẽ ở dạng đưòng cong xích ma, đường cong mà chúng ta quen gặp trong chuẩn độ (Hình 5.14). Nếu chúng ta vẽ đồ thị ở dạng logarit với cùng dữ liệu đó (tốc độ phản ứng là hằng sô) như một chức năng của pH trong một giới hạn pH hẹp (pH từ 5 —7 như Hình 5.14) thì chúng ta thấy có một mối liên hệ tuyến tính giữa log(k) và pH. Mối liên hệ theo kinh nghiệm này được định nghĩa theo phương trình Bronsted cho các axit và bazd chung (phương trình 5.9, 5.10 tương ứng). 155
(a)
(b)
Hlnh 5.14. Hiệu quả củ a pH lên tốc độ phản ứng đối vớỉ (a) m ột phản ứng xúc tá c bazơ chung và (b) một phản ứng xúc tá c axit chung
Log(k) = A - 0CpKa (5.9) Log(k) = A + apKa Trong đó A là một hằng số liên quan đến một phản ứng xác định, a và p - đơn vị đo sự nhạy cảm của phản ứng đối với axit hay bazd liên hợp, một cách tương ứng. Phương trình Bronsted cho xúc tác bazơ chung khá giống phương trĩnh Bronsted cho xúc tác ái nhân (nucleophile). Tuy nhiên, ngược với xúc tác ái nhân, xúc tác bazơ chung phụ thuộc vào pKa của chất xúc tác và độc lập một cách cơ bản với bản chất của nhóm xúc tác. Thông thường, phưdng trình Bronsted này cho thấy các axit càng mạnh thì xúc tác axit chung càng mạnh và tương tự như vậy, bazơ càng m ạnh thì chất xúc tác bazơ chung càng mạnh. Tuy nhiên, điều quan trọng cần nhấn mạnh lại là hiệu quả của xúc tác axit hay bazơ chung phụ thuộc vào nồng độ có ảnh hưỏng của các loại axit hay bazơ có mặt. Nồng độ của những loại này tuỳ thuộc vào pKa của chất xúc tác trong mối liên hệ với pH dung dịch mà ở đó phản ứng xảy ra. Ví dụ: khi xem lại phương trình Bronsted ỏ trên ta có thể cho rằng, một axit có pKa = 5 sẽ tốt hđn axit thông thường có pKa = 7, tuy nhiên nếu phương trình phản ứng xảy ra ở gần pH = 7 thì chỉ có 1% axit m ạnh tồn tại ồ dạng axit của nó trong khi có tối 99% còn lại tồn tại ở dạng bazơ liên kết. Trái lại, cùng giá trị pH đó, 50% axit yếu (pKa = 7) tồn tại â dạng axit. Khi đó, do nồng độ có hiệu quả của dạng thích hợp cho xúc tác của hai axit trên, xúc tác yếu hơn lại hiệu quả hơn ỏ pH = 7. Vi lý do này, người ta cũng thấy rằng, tốc độ phản ứng đối với xúc tác axit, bazơ chung sẽ lổn n hất khi giá trị pH dung dịch gần giá trị pKa của nhóm xúc tác. Vì vậy, các loại axit/bazơ được sử dụng trong phản ứng có enzym xúc tác là những loại có giá trị pKa gần giá trị pH sinh lý (pH = 7,4). Thông thưòng, điều này có nghĩa là, các enzym bị giới hạn trong việc sử dụng chuỗi bên axit amin có giá trị pH khoảng từ 4—10 như các 156
axit/bazơ chung. Khi khảo sát các giá trị pKa của các chuỗi bên axit amin, người ta cũng thấy rằng, các chuỗi bên của aspartat, glutam at, histidin, xystein, tyrosin, và lysin cùng với đầu N và đầu c tự do của các protein dưòng như là các ứng cử viên cho chất xúc tác axìưbazơ chung. Tuy nhiên, điều quan trọng phải nhận thấy rằng, giá trị pKa của một chuỗi bên axit amin có thể bị xáo trộn rấ t lớn bởi môi trường cục bộ mà nố nằm trong đó. Hai ví dụ điển hình cho điều này là histidin 158 của papain, enzym có một chuỗi bên có pKa = 3,4; và glutamic của lysozym, có giá trị chuỗi bên pKa = 6,5. Đặc điểm cơ bản của chất xúc tác bazơ là nhóm xúc tác tham gia vào vận chuyển proton làm bền hoá trạng thái trung gian của phản ứng hoá học. Một ví dụ minh hoạ cho điều này là sự thuỷ phân liên kết este trong nước, một phản ứng thực hiện bởi nhiều enzym thuỷ phân. Cơ chế của sự thuỷ phân este đòi hỏi sự tạo thành một trạng thái chuyển tiếp có liên quan đến việc chuyển một phần điện tích giữa cốc este và phân tử nước (như ỏ Hình 5,15). Trạng thái trung gian này có thể được làm bền nhò một nhóm cơ bản hoạt động như là thụ thể nhận một phần proton từ phân tử nước, do đó tăng cưòng tính ổn định của phần tích điện dương trên phân tử nưốc (Hình 5.15b). Tương tự, trạng thái trung gian này có thể được ổn định nhò một nhóm có tính axit hoạt động như một chất cho một phần proton đôi với nhóm cacbonyl ở oxy của este (Hình 5. lõa). Kiểu làm bền trạng thái trung gian nhóm axit bazơ này rấ t phổ biến trong xúc tác enzym. Ví dụ: gôc histidin ở trung tâm hoạt động của các serin proteaza hoạt động theo cách này để làm bền trạng thái trung gian trong suốt quá trình thuỷ phân peptit, như mô tả ỏ phần sau. A— H ll r
Ọ II li C R
!ô+
R OR'
H
I B
(a)
(b)
Hình 5.15. Sự bển hoá trạng thái chuyển tiếp bởi m ột axit ch u n g (a) hay bazd chung (b) trong sự th u ỷ phân liên kết hydro bởi nưãc.
Như trên đã trình bày, xúc tác axit/bazơ chung là một cơ chế chung của sự bền hoá trạng thái trung gian trong xúc tác enzym. Điều này cũng đúng với xúc tác ái nhân, đã được mô tả trong mục 5.5.2. Sự hiêu 157
nhầm có thể xuất hiện khi phân biệt xúc tác ái nhân với xúc tác axit/bazơ chung vi 2 cơ chế này có một sô' đặc điểm chung về động lực học. Bender và cộng sự (1984) đã gợi ý một số tiêu chuẩn để phân biệt những cơ chế này như sau: (1) Nếu nhóm phân cắt của một phản ứng có thể tự nó xúc tác cho một cùng phản ứng thì đây là bằng chứng cho phản ứng bazơ chung hơn là xúc tác ái nhân. Hãy xem phản ứng sau: °
°
+
HB
OH Nếu phản ứng này đi kèm vối sự tác dụng ái nhân của B lên nhóm cacbony] thì sản phẩm phản ứng sẽ tương tự như nguyên liệu ban đầu. Do đó xúc tác bởi B chỉ là loại này phải hoạt động chức năng như các bazơ chung. (2) Xúc tác bởi một đương lượng thứ 2 của một loại tác dụng là bằng chứng cho thấy xúc tác bazơ chung đang xảy ra. Chất trung gian cộng hoá trị của xúc tác ái nhân hình thành một hệ số tỷ lượng vđi cơ chất. Do vậy, xúc tác bởi một đương lượng thứ 2 của loại tấn công không thể xảy ra theo xúc tác ái nhân. (3) Như đã trình bày ở trên, việc quan sát một chất trung gian tạm thòi có thể được xác định như là sản phẩm cộng hoá trị tạo thành bằng chứng cho xúc tác ái nhân, hơn là xúc tác bãzơ chung. (4) Như đã trình bày ở trên, đồ thị Bronsted cho xúc tác bazơ chung phù hợp với một đường thẳng đơn đôi vói các bazơ có độ bazơ xác định, không quan tâm đến dạng cấu trúc của chúng. Trái lại, xúc tác áí nhân được xác định- bởi đồ thị Bronsted với nhũng khác biệt lân về tâc độ mà ta quan tâm đến. Ví dụ: các cặp nitơ và oxy của các chất xúc tác có cùng độ bazơ. (5) Liên hệ ý (4), trở ngại lập thể không phải là yếu tố xác định quan trọng trong xúc tác axit thông thường nhưng có những tác dụng quan trọng trong xúc tác ái nhân. Điều này xảy ra do xúc tác bazđ chung liên quan đến việc tách proton; trong khi xúc tác ái nhân lại liên quan đến tấn công vào trung tâm cacbon, đòi hỏi không gian cho phản ứng sau sẽ lớn hơn phản ứng trưỏc. (6) Sự giảm tốc độ phản ứng bằng cách thêm vào một ion chung là một chỉ thị cho một cơ chế phản ứng có liên quan đến chất trung gian thuận nghịch và do đó liên quan đến xúc tác ái nhân. Ví dụ: sự thuỷ phán axetic alhydrit thành ion axetic được xúc tác bôi pyridin. 158
Khi thêm ion axetic vào sẽ làm giảm đáng kể tổc độ phản ứng, qua đó ta thấy đây là xúc tác ái nhân của pyridin. °
°
0
N
H 3C
'O
'C H 3
m cr
h
3c
°
(ion axetat)
o
h
3c '
Õ H
5.5.4. Những xoắn vặn hỉnh thể
Hai quan sát thực nghiệm dẫn đến giả thiết những điều chỉnh về hình thể của enzym, cơ chất hay cả 2 đều là những lĩnh vực quan trọng trong xúc tác enzym. E
i 'l l
ẾàM-ị .í'
4
5
Hlnh 5.16. Mô hình giá đ ã của tưđng tác enzym - cơ chất và quá trinh xúc tác 1. Enzym tự do và cơ chất tự do trong dung dịch; 2. Liên kết mỏ đẩu cho sự hình thành phức hệ enzym cơ chất mà chưa gây ra sự xoắn vãn cấu trúc cơ chất; 3. Enzym trải qua sự thay đổi về mặt hình thể để tạo ra mối liên kết tốt hơn với cơ chất (khớp cảm ứng); 4. Enzym trải qua nhữrig điều chỉnh về mặt hinh thể lân hơn mà làm căng phân tử cơ chất bằng cách đó bẻ cong cơ chất từ dạng cấu trúc nền về cấu trúc ở trạng thái chuyển tiếp; 5. Sức càng cảm ứng trong 4 dẫn tới sự bẻ gãy liên kết và giái phóng 2 sản phẩm A và B. (Nguổn: Copeland R.A., Enzym es, 2000).
Đầu tiên, các nghiên cứu định lượng của cốc phản ứng enzym thưòng dẫn đến kết luận rằng, việc tăng tốc độ quan sát được không thể giải 159
thích đầy đủ bằng cách quan tâm đến sự xấp xỉ, xúc tác cộng hoá trị và xúc tác axit/bazơ riêng rẽ. Do vậy, một giả thiết nảy sinh là những điều chinh về mặt hình thể được sử dụng để xoắn vặn cơ chất, enzym hay cả cơ chất và enzym để đưa hệ thông về trạng thái cấu trúc chuyển tiếp. Hình 5.16 minh hoạ khái niệm này ở dạng sơ đồ đối với một phân tử liên kết. Trong hình này, trung tâm hoạt động của enzym trải qua một loạt điều chỉnh về hình thể mà xoắn vặn cơ chất về cấu trúc ở trạng thái chuyển tiếp, bằng cách đó tạo thuận lợi cho việc cắt đứt liên kết gây ra xúc tác, Trong minh hoạ này, sự vặn xoắn cơ chất bởi trung tâm hoạt động của enzym hơi giống sự tra tấn thời trung cổ mà ỏ đó một người tù bị kéo căng trên một dụng cụ gọi là giá treo. Do lý do này, thuật ngữ cơ chế giá treo được sử dụng để mô tả giả thiết sức căng cảm ứng (Segel, 1975). Quan sát thực nghiệm thứ 2 gợi ý rằng, cần phải có sự vặn xoắn câu trúc là sự biểu hiện nhiều nét đặc trưng của cơ chất ỏ giá trị kjric Uc chứ không phải ở giá trị Km. Chúng ta thấy đơn vị đo tốt n h ất cho tính đặc trưng của cơ chất là hằng số tốc độ thứ cấp thu được bằng cách chia hết kxlk tác cho Km. Nếu như nét đặc trưng của cơ chất đơn thuần chỉ có liên quan đến việc nhận biết đúng liên kết của các cơ chất ở trạng thái nền của chúng thì bất kỳ ai cũng nghĩ rằng, sự khác biệt về Km là nhân tố chính trong việc phân biệt cđ chất tốt và kém. Tuy nhiên, bằng phương pháp thực nghiệm, ngưòi ta thưòng quan sát thây tính đặc trưng cơ chất được biểu hiện -ỏ nồng độ cơ chất cao, bão hoà hòn là ở nồng độ cơ chất thấp. Hay nói cách khác, tính đặc trưng phụ thuộc rấ t lớn vào những khác biệt về giá trị kxlk tác (ví dụ: Vcục dại) hơn là những khác biệt về Km. Những nghiên cứu về sự thuỷ phân của các peptit mới được tổng hợp bởi enzym pepsin (Blender, nghiên cứu này được tổng kết ở Bảng 5.4) cho thấy, đối vổi một loại cơ chất peptit, hiệu quả xúc tác (đo bằng kX)i<;tèc/Km) của pepsin đã chênh nhau tói một nghìn lần. Khi xem các hệ số động lực riêng lẻ, ta thấy giá trị kxúctá(. chênh nhau tới 1.000 lần. Ngược lại, các giá trị Km tương đối giông nhau, chỉ chênh nhau tôi đa khoảng 4 lần. Thực tế giá trị Kmđôi vối cơ chất kém nhất chỉ kém giá trị Km của cơ chât tôt nhất 4 lần, qua đó cho ta thấy, liên kết cò chất ở trạng thái nền không phải là thành tố chính xác định tính đặc trứng cơ chất cùa enzym này. Thực sự, các dữ liệu thực nghiệm đôì với pepsin và đôi với một sô' lượng lón các enzym khác gợi ý rằng, tính đặc trưng cơ chất được xác định chủ yếu bỏi trạng thái chuyển tiếp hơn là bỏi cấu trúc ỏ trạng thái nền.
160
I ' I
I
Ị
Bảng 5.4. Các động lực ở trạng thái bền vững của quá trinh thuỷ phân peptit tổng hợp bòì pepsin Peptit
Km(mM)
^*ùc tie
Cbz-G -H—F -F -O et C bz-H -F-W -O et
0,8 0,2
2,4300 0,5100
C bz-H -F -F -O et C bz-H -F-Y -O et
0,2 0,2
Cbz-H -Y-F~Oet Cbz-H -Y-Y -Oet C bz-H -F-L-O m e
0,2 0,6
0,3100 0,1600 0,0130 0,0094 0,0025
0,7
k,ùet4c/Km (m M 1. s 1) 3,04000 2,55000 1 ,5 5 0 0 0
0,80000 0,01860 0,04700 0,00417
Cbz-cacbonbenzyloxy; Oet-etyl este của đầu cacboxyl; OMe-metyl este của đầu cacboxyl.
Một kết luận thường được suy ra nhờ nghiên cứu về các ảnh hưởng của những đột biến điểm trong các trung tâm hoạt động của enzym. Ví dụ: Leatherborrow và cộng sự (1985) nghiên cứu enzym tyrosyl-ARNt syntetaza, enzym liên kết cộng hoá trị axit amin tyrosin vào vị trí ARNt của nó. Enzym này*cần ATP cho quá trình xúc tác và đẩy nhanh sự tạo thành trạng thái chuyển tiếp tyrosyl —ATP gắn enzym. Ta đã biêt cấu trúc tinh thể của enzym vói liên kết tyrosyl - AMP trung gian cộng hoá trị và Leatherborrow cùng cộng sự có khả năng ứng dụng điều này để xây dựng mô hình phức hợp trạng thái chuyển tiếp. Tyr + ATP Enz-Tyr-AM P + ARNt1^
>Enz-Tyr-AMP + PPVC ------> Tyr-ARNt7^ + AMP + Enz
(Enz: Tyrosin - ARNt1^ - Syntetaza) Từ mô hình này, các nhà nghiên cứu xác định được 2 gôc axit amin trong trung tâm hoạt động của enzym có vai trò quan trọng trong xúc tác là Thr 40 và His 45. Sau đó, họ bắt đầu tạo 3 enzym đột biến, một đột biến ỏ Thr 40-Ala/His 45 - Gly. Khi so sánh thông scTđộng học của 3 enzym đột biến với thông số' động học của enzym gốc, họ thây rằng, các giá trị K* gấp 4 lần K„ của dạng gốc. Tuy nhiên, ngược lại, giá trị kXlk tác thay đổi một cách kịch tính. Giá trị Kúctíc tính từ 38s'1của enzym góc tới 0,16s'1vối đột biến His 45-Gly, tới 0,0055s'1vối đột biến Thr 40 -- AIa và 0,00012s-1 với đột biến kép. Do đó, Leatherborrow và cộng sự kết ỉuận rằng, chức năng chung của các gôc này là tạo ra cáo tương tác liên kết thích hợp vói cầu trúc ở trạng thái chuyển tiếp của tyrosyl - ATP và ngược lại, không cung cấp vị trí gắn vổi cơ chất ỏ trạng thái nền. 161
Jenck (1969) tranh luận rằng, đổỉ với phản ứng enzym thuận nghịch, sự xoắn vặn của phức hợp ES là một thành tô quan trọng trong xúc tác. Hãy xem xét một phản ứng enzym thuận nghịch, phản ứng thúc đẩy tấn công ái nhân của một nhóm lên phân tử cơ chất. Chúng ta có thể tưởng tượng rằng, trung tâm hoạt động của enzym và trạng thái nền của cơ chất đều cứng nhắc về m ặt hình thể. Cơ chất gắn với trung tâm hoạt động do trạng thái ban đầu của nó khớp hoàn chỉnh với khe này. Trong trường hợp này, khoảng cách tương tác phân tử giữa nhân enzym và phân tử cơ chất bị tác dụng có thể được tính bằng bán kính Van der Waals của các nguyên tử tương tác. Nếu sự th ật như thế thì phân tử sản phẩm cứng nhắc sẽ không thể khớp vói cùng cấu trúc trung tâm hoạt động cứng nhắc được. Do vậy, phức hợp enzym —sản phẩm bị mất tính bền liên quan đến phức hợp enzym, cơ chất do kết quả của những cản trở không gian (do đó m ất năng lượng liên kết). Enzym có thể vượt qua chướng ngại nảy bằng cách xoắn vặn sản phẩm liên kết theo một cách khá giống nếu trung tâm hoạt động là cứng nhắc và hoàn toàn khớp vối sản phẩm thì sự khớp không hoàn toàn của phân tủ cò chất bây giờ ngăn cản phản ứng theo chiều xuôi. Nhu cầu đẩy nhanh tốc độ phản ứng enzym theo cả chiều thuận và chiều nghịch đạt được một cách hiệu quả nhất nhò cấu trúc trung tâm hoạt động khớp hợp nhất với câu trúc trung gian giữa trạng thái cơ chất và sản phẩm, điều này có nghĩa là, nhờ có trung tâm hoạt động được thiết kế để khớp hợp nhất vối cấu trúc trạng thái chuyển tiếp. Tuy nhiên, nhũng tranh luận ở trên và các dữ liệu thí nghiệm đã không được giải thích một cách đầy đủ bằng các mô hình mà ở đó cd chất ở trạng thái nền và trung tâm hoạt động của enzym là cứng nhắc vể mặt cấu trúc, giống như mô hình chia khoá và ổ khoá ban đầu của Fisher. Do vậy, ngưòi ta cần các mô hình giải thích tính cần thiết có tính linh động vể hình thể và tốĩ ưu hoá sự bổ sung trạng thái chuyển tiếp của trưng tâm hoạt động. Ba mô hình chính được đưa ra để thoả m ãn nhu cầu này: (1) mô hình khớp cảm ứng; (2) mô hình gắn không tạo sản phẩm và (3) mô hình căng cảm ứng. Mô hình khớp cảm ứng do Koshland (1958) đưa ra đầu tiên cho rằng, trung tâm hoạt động của enzym là dễ thay đổi vể m ặt hình thể. Khi vắng m ặt cơ chất, trung tâm hoạt động của enzym ở dạng không hỗ trợ cho xúc tác. Khi một cơ chất tốt gắn vào trung tâm hoạt động, các lực liên kêt giữa enzym và cd chất được dùng để chuyển ervzym về dạng cấu 162
trúc thích hỢp với năng lứỢng ít hơn nhưng lại có hoạt tính enzym hơn (mô hình giá đỡ minh hoạ ở hình 5.16 giải thích mô hình khớp cảm ứng). Trong mô hình này, một cơ chất “tồi” thiếu các đặc điểm cấu trúc cần thiết để gây ra thay đổi hình thái cần thiết cho hoạt tính xúc tác, và do dó không thể xảy ra phản ứng. Các kết quả mong đợi từ mô hình kháp cảm ứng là giá trị Vcực dại tối đa cho các cơ chất đặc hiệu mà có thể sử dụng tốt nhất các tương tác liên kết nhằm gây ra các hoạt hoá hình thái cần thiết cho phân tử enzym. Trong mô hình gắn không tạo sản phẩm, trung tâm hoạt động của enzym được cho là cứng nhắc, và một cơ chất tốt sẽ là cơ chất có một vài đặc điểm cấu trúc mà mỗi đặc điểm lại bổ sung với một tiểu trung tâm đặc trưng trong cấu trúc trung tâm hoạt động. Do sự có m ặt của rất nhiều tương tác giữa các tiểu trung tâm bổ sung nên chỉ có một hình thái và một định hưởng cơ chất trong trung tâm hoạt động của enzym; các cấu trúc khác hay các định hưóng khác dẫn tới liên kết với một số loại cơ chất bất hoạt mà không có ích về m ặt xúc tác. Một cơ chất “tồi” trong mô hình này sẽ có thể thiếụ một hay nhiều nhóm chức năng chủ chốt cho việc liên kết chính xác. Hay nói cách khác, nhóm chức năng chủ chốt có thể có m ặt trong một cd chất tồi nhưng được sắp xếp theo một kiểu không phù hợp cho liên kết chính xác vổi trung tâm hoạt động của enzym; những quan điểm này được minh hoạ ỏ Hình 5.17. Kêt quả mong đợi từ mô hình này là giá trị theo một mô hình tạo sản phẩm cổ hoạt tính xúc tác. Mô hình liên kết không tạo sản phẩm này thường được dùng làm dẫn chứng để giải thích hiện tượng ức chế cơ chất ở nồng độ cơ chất cao. Mô hình chính thứ ba đôì với vấn đế xoắn vặn cd chất gọi là mô hình căng cảm ứng. Trong mô hình này, các lực liên kết giữa enzym và cơ chất được dùng trực tiếp gây ra sức căng trên phân tử cơ chất, qua đó xoắn cơ chất về cấu trúc ở trạng thái chuyển tiếp tạo thuận lợi cho phản ứng xảy ra. Trong mô hình này, trung tâm hoạt động của enzym được coi là linh động. Hình thái bền nhất (ví dụ: năng lượng thấp nhất) của trung tâm hoạt động của enzym là cấu trúc không phù hợp một cách tôì ưu với cấu trúc cơ chất ở trạng thái nền, nhưng thay vào đó lại bổ sung với trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Đối với cơ chất ở trạng thái nền, để liên kết, enzym phải trải qua một loạt biến đổi về hình thái mà không có lợi về m ặt nãng lượng. Do đó trong phức hợp ES sẽ có một lực đẩy phân tử enzym quay trâ lại trạng V c ụ c
d „j
-
163
thái năng lượng thấp hơn ban đầu và điều này đạt được kèm theo sự xoắn vặn phân tử cơ chất để đưa nó về cấu trúc ở trạng thái chuyển tiếp mà bổ sung đối với hình thể nàng lượng thấp nhất (Hình 5.18). Nhìn lần đầu, mô hình này dường như giống mô hình khôp cảm ứng, trong đó, năng lượng gắn được sử dụng để đưa các nhóm phản ứng trong trung tâm hoạt động về đúng dạng sắp xếp như cơ chất tốt nhằm tạo ra tính đặc trưng cơ chất. Ngược lại, mô hình căng cảm ứng sử dụng năng lượng liên kết để trực tiếp làm giảm năng lượng tự do hoạt hoá cho phản ứng bằng cách cặp đôi xoắn vặn cơ chất và giãn hình thái có triển vọng về mặt năng lượng của phân tử enzym. OH
Liên kết sản phẩm
Cơ chất "tồi"
Không tạo sản phẩm Hlnh 5.17. Sỡ đổ minh hoạ cho mô hinh gắrt khòng tạo sả n phẩm Trong mô hình này, một cơ chất “lốt” có những nhóm đặc hiệu mà ăn khớp với các tiểu trung tâm của trung tâm hoạt động của en2ym, qua đó thu được duy nhất một chiều liên kết tạo sàn phẩm thuận lợi cho xúc tác. Một cơ chất “tồi’ là cơ chất thiếu một chức năng giữ giúp định hướng cơ chất đúng vào vị trí trung tâm hoạt động. Khi đó cơ chất “tồi" có thể gắn theo rất nhiều hướng khốc nhau mà chỉ có một chiều tạo ra xúc tác cò hiệu quả. Các hướng khác, không tạo sản phẩm, làm ngăn cản xúc tác (Nguổn: Copeland, R.A.’ Enzymes, 2000).
164
Hình 5.18. Sd đồ minh hoạ mô hỉnh căng cảm ứng
Enzym tự do 1 đang ở trạng thái nâng lượng thấp nhất bổ sung tốt nhất với cấu trúc ỏ trạng thái chuỳển tiếp cua cơ chất. Dựa trên liên kết cơ chất này 2, enzym trải qua quá trình chuyển tiếp về hình thể để ăn khớp với cơ chất. Sức câng hình thể cảm úttg trong 2 là nhờ sự lạo thành trạng thái chuyển tiểp gẳn trong 3. Khi đó, quá trinh xúc tác dẫn tỏi sự tạo thành một phức hợp enzym - sản phim 4 truớc khi sản phẩm giải phóng để tái tạo lại enzym tự do ban đầu (Nguồn: Copeland, R.A„ Enzymes, 2000).
Các hiệu quả không gian không chỉ là cơ chế gây ra sức căng trong một phân tử cơ chất liên kết. Các ảnh hưởng tĩnh điện có thể gây ra sức căng trong cơ chất ở trạng thái nền, cái mà sau đó phân tử được giải phóng ở cấu trúc trạng thái chuyển tiếp, Ví dụ: một chuỗi bên axit amin tích điện âm trong trung tâm hoạt động của enzym kỵ nước có một hiệu quả phân cực hoá mạnh, có thể không thuận lợi cho việc gắn một cơ chất ở trạng thái nền không tích điện. Tuy nhiên, nếu trạng thái chuyển tiếp có liên quan đến sự tạo thành một trung tâm cation, thì một kháng ion (counterion) âm bây giò sẽ cung cấp một tương tác thích hợp. Sự trỢ giúp này của quá trình khử tính bền của trạng thái nền có thể được sử dụng một cách hiệu quả như một lực thúc đẩy quá trình tạo thành trạng thái chuyển tiếp. Tương tự, liên kết hydro, tương tác kỵ nưóc và các lực không cộng hoá trị khác có thể gây ra các tương tác không thích hợp cho cơ chất ở trạng thái nền mà thúc đẩy sự xoắn tới cấu trúc trạng thái chuyển tiếp, nơi mà những tương tác này là thuận lợi về m ặt năng lượng.
5.5.5. S ự bổ sung trung tâm hoạt động tíển sắp xếp với trạng thái chuyển tiếp
Một trong hai khả năng dẫn tới các cơ chế xoắn vặn về m ặt hình thể là một khả năng mà ỏ đó trung tâm hoạt động của enzym, nói một cách tương đối, là cứng nhắc về m ặt hình thể và được tiền sắp xếp một cách thích hợp tôì đa với cơ chất ỏ cấu hình trạng thái chuyển tiếp. Chỗ này hơi có xu hướng giống mô hình chìa khoá và ổ khoố của Fisher, nhưng ỏ đây, sự bổ sung với trạng thái chuyển tiếp của cd chát chứ không phải với trạng thái nền. Trong một xem xét gần đây về cơ chế này, Cannon và Benkovic (1998) sử dụng chu trình nhiệt động học sau đây để định rõ hằng số phân tích cân bằng cho phức hợp đôi ES*, KTS, tương đương với t-ỷ lệ (kxac tfa/KJ, kkhânelà hằng số tốc độ cho sự tạo thành cơ chất ở trạng thối chuyển tiếp trong khi không có xúc tác enzym. E+S
Ạ
K=1
E + S -4-----------
Es
--------------- ► E s * kjnictác
Từ những thảo luận trước đó, mà chúng ta hiểu rằng, các enzym liên kêt với cơ chất ỏ trạng thái chuyển tiếp tốt hơn là â trạng thái nền, điều rõ ràng là KTS đặc trưng nhỏ hơn nhiều so với Kg. Do vậy, thường thường có một năng lượng liên kết tự do lớn và thích hợp đối với phức hợp ES*. Cannon và Benkovic gợi ý rằng, 2 phương thức có khả năng để giải thích sự khác biệt về năng lượng tự do cho việc gắn giữa s* và s. Đầu tiên, có thể có những tương tác liền kết mạnh hơn một cách đáng kể giữa enzym và hình thái ở trạng thái chuyển tiếp của cơ chất. Điểu này đã được thảo luận ở trên và, ít nhất đối với một số enzym, có những bằng chứng thực nghiệm cho thây những tương tác m ạnh hơn giữa enzym và các chất tương tự trạng thái chuyển tiếp, chứ không phải giữa các enzym và cơ chất ỏ trạng thái nền, Khả năng thứ 2 là năng lượng tự đo của các tương tác giữa dung môi và trạng thái chuyển tiếp thì kém thuận lợi hdn nhiều so với năng lượng đó giữa dung môi và trạng thái nền. Do vậy, trong dung dịch, sự đạt tổi trạng thái chuyển tiếp phải trải qua những thay dổi năng lượng tự do quan trọng nhò các hiệu quả 166
solvat hoá. Hay nói cách khác, trong trường hợp này, các tương tác tốt hơn một cách, đáng kể giữa enzym và s* liên quan đến s không phải là các lực đẩy chính đối với sự bển trạng thái chuyển tiếp. Thay vào dó, bằng cách loại s khỏi dung môi, enzym tránh khỏi phần lớn rào cản liên quan đến sự solvat hoá đối với sự tạo thành của s*. Trong mô hình này, enzym không làm bền quá mớc trạng thái chuyển tiếp và tránh làm mất ổn định hiệu quả của dung môi bằng cách cô lập cơ chất. Cannon và Benkovic gợi ý rằng, cả 2 khả năng này xuất hiện trong xúc tác enzym nhưng khả năng sau có một ảnh hưởng ưu th ế hơn. Để chứng minh cho cơ chế này, Cannon và Benkovic đã lập đồ thị Kts ngược với kxủc tác/Kmđốì với một chuỗi trật tự đầu và trật tự đầu giả, các phản ứng enzym và các phản ứng mô hình thích hợp trong dung dịch. Nếu chức năng chính của các enzym là để gắn s* chặt hơn nhiều so với s, thì ta có thể trông đợi rằng enzym xúc tác m ạnh nhất (ví dụ những loại có giá trị KTS thấp nhất) sẽ có tốc độ quay vòng nhanh nhất (kxúc tác). Ngược lại, nếu sự tấng nhanh tốc độ phản ứng của các enzym chỉ phụ thuộc rấ t lớn vào sự giúp đâ của quá trình làm chậm các phản ứng trong dung dịch do hiệu ớng solvat hoá, thì những enzym thể hiện các giá trị Kts nhỏ có thể là nhũng enzym xúc tác các phản ứng xảy ra râ't chậm trong dung dịch (ví dụ: với các giá trị kkhang nhỏ). Đổ thị dữ liệu do các tác gia đưa ra cho thấy điều quan trọng: sự không liên quan giữa các giá trị Kts và kxúc tác. Cannon và Benkovic kết luận dựa trên đồ thị này rằng, dộng học của các phản ứng trong dung dịch là yếu tố quyết định chính của KTS. Sự giải thích vật lý cho những quan sát này là ảnh hưởng của dung môi lên các phản ứng trong dung dịch là phản tác dụng. Sự cải biến dung môi quan trọng là cần thiết đối với phản ứng trong dung dịch để tạo thành trạng thái chuyển tiếp, và sự tái sắp xếp này có tác dụng làm chậm tốc độ phản ứng. Khi đó enzym hoạt động như một cơ chế đối với sự thay thế dung môi đối với chất phản ứng. Cannon và Benkovic chỉ ra rằng, hiệu quả của dung môi lên phản ứng sẽ phụ thuộc vào cả phản ứng điện môi và sự phân cực của môi trường. Do các trung tâm hoạt động của enzym là kỵ nưốc rấ t lân, chúng thưòng có hằng số điện mồi cao hơn nhưng cũng lại phân cực rấ t lớn (như là kết quả của ảnh hưởng thay th ế một điện tích trong môi trưòng điện môi thấp), qua đó tạo ra các trường điện từ. Nhờ những sắp đặt đúng đắn của các nhóm tích điện 167
trong trung tâm hoạt động, enzym có thể đạt được trạng thái bổ sung tĩnh điện vối cấu trúc cơ chất ở trạng thái chuyển tiếp, qua đó loại bỏ được những hiệu ứng cản trở của dung dịch. Những tranh luận trước đó cho rằng, trung tâm hoạt động của enzym được tiền sắp xếp trở thành trạng thái bổ sung với trạng thái chuyển tiếp của cơ chất, qua đó làm giảm tôì thiểu trị giá năng lượng tái sắp xếp như đã xuất hiện trong dung dịch. Cơ chế này không thuận lợi cho các xoắn vặn theo sự kích thích của cơ chất, cơ chất chỉ thêm vào giá trị tái sắp xếp tói xúc tác. Cannon và Benkovic chỉ ra sâu hdn rằng, khoảng thòi gian của những thay đổi về hình thể cỏa hầu hết protein là mâu thuẫn với tốc độ xúc tác của các enzym, Tuy nhiên, ta cần phải nhớ rằng, các chuyển động liên kết xung động trong một khoảng thòi gian (10-14 tới 10-I3S_1) là phù hợp với xúc tác của enzym. Do vậy, những điều chỉnh về xung động nhỏ của phức hợp enzym cơ chất không thể bị loại bỏ bỏi các tranh luận trưóc đó. Do đó, cơ chế do Cannon và Benkovic đề ra dựa trên sự tiền sắp xếp của trung tâm hoạt động của enzym theo một hình thái bổ sung với trạng thái chuyển tiếp của cơ chất (nhưng không cần thiết phải gắn chặt quá mức với trạng thái chuyển tiếp). Các đặc điểm của trung tâm hoạt động tiền sắp xếp này đã định vị một cách chiến lược các nhóm phản ứng (các axit/bazơ chung; các ái nhân ở trung tâm hoạt động; các thành pl^ần liên kết hydro,..,) trong môi trường điện môi thấp trợ giúp quá trình khử tính bền trạng thái chuyển tiếp rấ t nhiểu kết hợp với phản ứng trong dung dịch. Do đó, trong cơ chế này, các enzym trưốc hết đẩy nhanh tốc độ phản ứng không phải bằng cách làm bển trạng thái chuyển tiếp thông qua các tương tác liên kết chặt chẽ trong chúng, mà thực sự bằng cách tránh các bất lợi về mặt năng lượng có liên quan đến quá trình tạo thành trạng thái chuyển tiếp trong đung dịch lán. Các tác giả cũng chỉ ra rằng, cơ chế này gợi ý ta có thể thu được phần lớn hiệu quả xúc tác của các enzym bằng cách tạo ra một trạng thái chuyển tiếp tiền sắp xếp chính xác liên kết vói túi (pocket) phản ứng trong một enzym tái tổ hợp. Ví dụ: hệ thống miễn dịch thường tạo ra các kháng thể mà có thể nhận ra và liên kết chặt chẽ với các protein và các peptit từ các sinh vật xâm nhiễm. Các kháng thể cũng có thể được sinh ra để nhận biết và Hên kêt với các phân tử nhỏ, còn gọi là các hapten. Do đó, ngưòi ta có thể hy vọng các kháng thể tàng lên chống lại các chất giống trạng thái chuyển tiếp của các phản ứng đặc biệt nhằm thể hiện khả năng n h ất định trong hoạt động xúc tác phản ứng. Phương thức này đã được xác minh về mặt 168
thực nghiệm (Lener và cộng sự, 1991), mặc dầu các khổng thể xúc tác thu dược chỉ cho thây rõ hơn hoạt tính xúc tác vừa phải có liên quan đến các enzym tự nhiên. Trong chương này chúng ta đã thảo luận một chuỗi các phương thức mà nhờ đó các enzym có thể ảnh hưởng đến quá trình làm bền trạng thái chuyển tiếp. Phương thức nào trong những phương thức này đống vai trò quan trọng trong xúc tác enzym? Câu trả lời khả thi nhất là mỗi phương thức trong những phương thức này đă quan tâm đến sự biến đổi các mức độ bởi các enzym khác nhau nhằm đạt được sự làm bền trạng thái chuyển tiếp. Điểm quan trọng nhất để tránh thảo luận này là các trung tâm hoạt động của enzym đã tiến hoá để liên kết một cách ưu tiên với trạng thái chuyển tiếp, enzym cung cấp một phương thức phản ứng thích hỢp về m ặt năng lượng hơn nhiều so với bất cứ phương thức phản ứng nào không có m ặt enzym. 5.5.6. Tương tác yếu giữa enzym và cơ chất được tôi ưu hoá ở trạng thái chuyển tiếp
Năm 1894, Emil Fisher đã đưa ra giả thuyết là enzym có cấu trúc bổ sung vối cơ chất, do đó chúng khớp với nhau như “ ổ khoá và chìa khoái (Hình 5.19).
2
a)
b)
Hlnh 5.19. Hỉnh dạng bổ sung của cơ chất và vị trí liên kết của nó trên enzym
Enzym dihydrofolat reductaza dUỢc giới thiệu với cơ chất của nó, NADP* (1) tách rời (a) và liên kết (b). Phẩn phân tử tetrahydroíolat (2) cũng được thấy rõ liên kểt với enzym. NADP* đuợc liên kết vào túi là hình dạng bổ sung của nó và các lính chất ion. Emil Fishcher giả thiết rằng, các enzym và các cơ chất của chúng hình thành nên phức chất chặt cíia moi loại giống như Ổ khoá và chìa khoá. Khái niệm này được mà rộng đến sự tương tác của các loại protein khác VỐI phối tử hoặc các protein khác. Trong hình dạng bổ sung rất hiếm và sự tương tác của protein và phối tử thường bao gồm sự thay đổi bổ sung của 1 hay 2 phân tử, sự bổ sung lỷ tưởng này không có giữa enzym và c ơ chất của nó (không có bằng chứng trong hình này) rất quan trọng đốt với sự xúc tác enzym (Nguổn: Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M., Principles of Biochemistry, 1993).
169
Ý kiến này đã ảnh hưởng đến sự phát triển của ngành Hoá sinh và là trung tâm của các quá trình sinh hoá. Tuy nhiên, giả thuyết “ổ khoá chìa khoá” có thể không đúng vào sự xúc tác enzym. Một enzym hoàn toàn khớp với cơ chất của nó cũng có thể chỉ là một enzym yếu. Bây giờ hãy xem xét một phản ứng tưỏng tượng, phản ứng bẻ gãy một thanh kim loại. Phản ứng không xúc tác được miêu tả ở Hình 5.20a, chúng ta xem xét 2 enzym tưởng tượng xúc tác phản ứng này, cả 2 đều có lực từ (thay cho năng lượng liên kết sử dụng bơi enzym thật). Đầu tiên chúng ta thiết kê một enzym khớp thật hoàn hảo với cơ chất (Hình 5.20b). Tâm hoạt động của enzym “strick” này dược biểu diễn ở Hình 5.20b. Để bẻ gãy thanh kim loại, phải đưa được thanh kim loại đến trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Thanh kim loại khớp chặt vào tâm hoạt động nên nó không thể cong, bởi vì khi nó cong nó sẽ làm giảm tương tác từ giữa thanh kim loại và enzym. Enzym như thế này ngăn cản phản ứng xảy ra và làm ổn định cơ chất. Khi biểu diễn trên sơ đồ phản ứng (Hình 5.20b), phức hợp ES này tương đương vói một giếng năng lượng mà rấ t khó để cơ chất có thể thoát ra được. Enzym thế này là vô ích. Mô hình hoạt động xúc tác của enzym được Haldane đưa ra đầu tiên vào năm 1930, sau đó được phát triển bởi Linus Pauling năm 1946. Đổ xúc tác phản ứng, enzym phải bổ sung vói trạng thái chuyển tiếp của phản ứng, có nghĩa rằng, sự tương tác tôi ưu (dù chỉ là tương tác yếu) giữa cơ chất và enzym có thể chỉ xảy ra ỏ trạng thái chuyển tiếp. Hình 5.20c chỉ ra môi trưòng hoạt động của enzym. Thanh kim loại liên kết nhưng chỉ có một vài tương tác từ được dùng để tạo phức hợp ES. Cơ chất liên kết vẫn phải tăng năng lượng tự do cần thiết để đạt tới trạng thái chuyển tiếp. Tuy nhiên, sự tăng năng lượng để làm cong thanh kim loại và một phần bẻ cấu hình được bù đắp bằng tướng tác giũa enzym và cơ chất ồ trạng thái chuyển tiếp. Đa số các tương tác này có liên quan đến phần thanh kim loại xa điểm gãy. Do đó tương tác giữa stickaza và các phần không phản ứng của thanh kim loại đã cung cấp năng lưdng cần thiết để xúc tác bẻ gãy thanh kim loại. Enzym thực sự cũng hoạt động theo nguyên lý tương tự như vậy. Một số tương tác yếu được hình thành trong phức hợp ES nhưng phần lớn tương tác này thiêt lập giữa cơ chất enzym khi cơ chất đạt tói trạng thái chuyển tiếp. Năng lượng tự do (năng lượng liên kết) giải phóng từ 170
những tương tác này dã một phần bù lại năng lượng cần thiết để đạt tới đỉnh năng lượng. Tổng sô AG* (giá trị dương) và năng lượng liên kết (AGp) (giá trị âm) sẽ làm giảm năng lượng hoạt hoá tổng số (Hình 5.21). Một phản ứng xúc tác bởi enzym xảy ra nhanh hơn nhiều, So với phản ứng không xúc tác, độ dốc có xúc tác nhỏ hơn. Nguyên lý quan trọng ở đây là tương tác yếu giữa enzym và cơ chất tạo ra lực đẩy chính để xúc tác phản ứng. Các nhóm trên cơ chất tham gia vào tương tác yếu này thường nằm trên vị trí cách xa liên kết bị phá vỡ hoặc thay đổi. Những tương tác yếu hình thành ở trạng thái chuyển tiếp đống góp chính vào hoạt động xúc tác. o o
Không enzym
■6
*Sít Cachất
Trạng thái chuyển tiếp sản phẩm (bẻ cong thanh kim loại) (thanh kim loại bỊ bẻ gãy}
(thanh kim loại)
Sự bổ sung enzym ổêncơchất
Sự bổ sung enzym dến trạng thài chuyển tiỂp
5
7
»- o +
(c)
Hỉnh 5.20. Enzym tuỏng tuụng (stickaza) được phác hoạ sự xúc tác bỏ gãy thanh kim loại
(a). Sự bẻ gãy thanh kim loại trước hết phải uốn cong (trạng thái chuyển tiếp). Trong stickaza có s ự tuóng tá c nơi liên kết yể u giữa e n zy m và cơ chất; (b). E n zy m với túi liên kết từ s ự bổ sung
tròng câu trúc với thanh kim loại (cơ chat) sẽ làm bền cơ chất này. s ự uốn cong bị cản trở bởi sức hút giữia th anh kim loại v à sticka za;
sẽ giúp cho sự loại độ bển của thanh kim loại, kết quả lả xúc tác phản úng. Sự tuơng tác từ cung
cấp năng luợrig bù cho sự tâng năng lượng tự do đòi hòi đối vối sư uốn cong thanh kim loại. Biểu đồ sự phoi hợp phản úng giới thiệu hiệu quâ hoạt động của sự bo sung đến cơ chất chống lại sự bổ sùng đối với t r ạ n g thái chuyển tiếp. Thuật ngữ AGMđặc trưng cho năng luạng đóng góp bởi sự tutfng tóc giữa th à n h kim loại v à sticka za. k h i bổ sung e n zy m đ ến cơ ch ất (b), ph ứ c chất E S rất bền và có năng luọng tự do ò trạng th á i nên nhò hơn ồ cơ chất riêng lẻ. Kết quả là làm tăng năng lượng hoạt h o á P h ú t ch ất - E P không đ u ợc giới thiệu với cá c h đơn giẳn (Nguồn: Lehn in ge r, A .L.,
Nelson, D.L., Cox, M.M., Principles of Biochemistry, 1993).
171
Hlnh 5.21. Vai trồ của nâng lượng liên kết trong xúc tác Làm giảm năng lượng hoạt hoá để phản ứng, hệ thống phải nhận được số năng lượng tương đương tổng số do AG* giảm. Nãng lượng này trờ thảnh mức độ lớn từ năng lưạng liên kết (AGB) được góp phần bỏi sự tương tác không hoá trị yếu giữa cơ chất và enzym ở trạng thái chuyển tiếp. Vai trò của AGe tUttng tự như AGMở Hình 5.20.
5.6. C Á C SERIN PR O T EA ZA L À MỘT v í DỤ MINH HOẠ
Các serin proteaza là một họ enzym xúc tác cho sự phân cắt các liên kết peptit đặc hiệu trong các protein và các peptit. Các serin proteaza có một cơ chế xúc tác chung, cần có bộ ba axit amin ở trung tâm hoạt động của chúng, một gốc serin (do đó mà enzym có họ tên là serin proteaza) dóng vai trò nhân tố ái nhân cơ bản cho liên kết peptit tác dụng, và ái nhân của nhóm này được tăng cưòng bỏi các tương tác đặc hiệu với histidin một chuỗi bên (một chất xúc tác axit/bazơ chung), chuỗi mà sau đó lại tương tác với aspartat một chuỗi bên. Tầm quan trọng về m ặt xúc tác của các gốc histidin và aspartat trong trung tâm hoạt động đã được chứng minh gần đây nhờ các nghiên cứu vể đột biến định hướng điểm, ở đó sự thay thế hoặc serìn, hoặc histìdin hoặc cả 2 đều làm giảm tốc độ phản ứng có enzym tham gia là 10e lần (Carter và Wells, 1988). Do đặc tính dễ phân lập và có sẵn với một lượng lớn trong dịch dạ dày của các dộng vật lón, các serin proteaza nằm trong sô' các enzym được nghiên cứu đầu tiên. Mặc dù các thành viên được nghiên cứu đầu tiên trong họ này đều là các enzym tiêu hoá, nhưng bây giò chúng ta hiểu rằng, các serin proteaza thực hiện các chức năng xúc tác rấ t rộng trong hầu hết các sinh vật từ vi khuẩn tói các động vật có vú. Ví dụ ở người, các serin proteaza không chỉ tham gia trong các quá trình tiêu hoá mà còn trong tạo các cục máu đông, trong viêm, vết thương đang lành, trong đáp ứng miễn dịch thông thường, và trong các sự kiện sinh lý quan trọng khác của cơ thể. Những enzym này nằm trong sô" các protein được nghiên cứu kỹ nhất trong hoá sinh. Một lượng lón thông tin vê cấu trúc và cơ chê của lớp enzym này có rấ t nhiều trong các nghiên 172
cứu về tinh thể học, hoá sinh cổ điển, thuyết cơ học và sự phát sinh đột biên. Nhờ có nhiều thông tin này, các serin proteaza đã cung cấp một mô hình cho việc thảo luận các thuật ngữ cấu trúc và hoá học cụ thể một sô khái niệm vể đặc trưng liên kết cơ chất và sự làm bên trạng thái chuyển tiếp sẽ được thảo luận sâu hơn trong chương này. Để phân cắt một liên kêt peptit trong một polypeptit hay protein, một proteaza phải nhận biết và liên kết vổi một vùng trong chuỗi polypeptit được tạo bởi liên kết peptit có thể phân cắt được (ví dụ các liên kết dễ dàng bị cắt), Các proteaza khác nhau về độ dài chuỗi polypeptit, tạo thành các trật tự nhận biết tương ứng của chúng, nhưng hầu hết các trình tự này lại liên kết với một sô' gốc axit amin trong các trung tâm hoạt động. Một hệ thông danh pháp do Schechter và Berger (1967) đưa ra lầ giá đỡ của các gốc axit amin cơ chất có liên quan đến gắn và xúc tác, và cốc vị trí tương ứng trong trung tâm hoạt động của enzym, nơi mà các gốc này liên kết. Trong hệ thống này, liên kết sẽ bị thuỷ phân giữa gốc P l và P l’ của cơ chất: P l là gốc ở đầu N của liên kết dễ bị phân cắt, P l’ là gốc bị thuỷ phân đầu c (chữ “P ’ đại diện cho từ peptit để chỉ rõ các gốc này thuộc về cơ chất của phản ứng). Gốc gần kề gôc P l ỏ phía đầu N của liên kết dễ phân cắt được gọi là P2 và gốc gần kề gốc P l ’ trên đầu c là P2\ Một trung tâm nhỏ trong trung tâm hoạt động của enzym ăn khớp vối gốc P l được gọi là S l, một trung tâm nhỏ khớp với gốc P l ’ được gọi là S i’. Việc đánh sô' tiếp tục theo phương thức này, như được minh hoạ trong Hình 5,22 đốĩ vối cơ chất peptit gồm 6 gôc axit amin. Chúng ta sẽ sử dụng hệ thông danh pháp này từ bây giờ trở đi khi thảo luận về enzym phân giải protein. Cơ chất peptit
Hình 5.22. Danh pháp trung tâm nhỏ trong proteaza của S chechter và B erger {1967) Các gốc trên cơ chất peptit được ghi từ P1 tới Pn trên phần bên đầu N của lìèn kểt này; liên kết co thể phàn giải được khi đó sê nẳm giữa gốc p, và P ’. Các tiểu trung tâm có líện quan mà ỏ đó nhũtig gốc này phù hợp với trung lâm hoạt động của enzym được đảnh dấu từ S1 đến Sn và SV đển Sn1. (Nguồn: Copeland, R.A., En2ymes, 2000).
173
Dựa trên cơ sở các đặc điểm cấu trúc của chúng, các serin proteaza được chia thành 3 lớp gọi là loại chymotrypsin, loại subtitzin và các họ loại serin cacboxylaza II. Các cấu trúc bậc 2 và bậc 3 của protein thay đổi tương đối từ họ này tới họ khác nhưng trong tất cả 3 họ, serin, histidin và aspartat, ở trung tâm hoạt động được bảo toàn và có chung một cơ chết xúc tốc. Tất cả những enzym này xúc tác thuỷ phân các liên kết este và peptit qua cùng cơ chế vận chuyển nhóm axyl (Hình 5.23), với một tốc độ gấp khoảng 109 lần hay hơn so với phản ứng không được xúc tác. Sau khi tạo thành phức hdp ES, cacbon trong nhóm cacbonyl của liên kết peptit dễ bị phân cắt (ví dụ: trên vị trí P l) bỏi serin ở trưng tâm hoạt động, qua đó tạo thành một chất trung gian tứ diện (tetrahedral) với một trung tâm oxyanion trên cacbon cacbonyl làm nhớ lại trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Trạng thái chuyển tiếp này được làm bền bởi các tương tốc liên kết hydro đặc hiệu giữa các gốc trong túi trung tâm hoạt động và trung tâm oxyanion của cơ chất. Trong subtilizin, liên kết hydro này được tạo thành từ nitơ của serin 195 trong bộ khung (ái nhân trung tâm hoạt động) và của Asn 155 chuỗi bên. Trong các enzym loại chymotrypsin, các liên kết H này được tạo thành từ nìtđ của gốc serin ải nhân và một glyxin ỏ trung tâm hoạt động, trong khi đó, các serin cacboxypeptidaza, những liên kết này được tạo bởi nitơ của tyrosin và glyxin ở trung tâm hoạt động trong bộ khung. Các tài liệu tinh thể học từ các nghiên cứu phân tủ subtilizin chỉ ra rằng, một liên kết H yếu tồn tại giữa Asn 155 và cơ chất trong phức hợp ES và liên kết H này được làm mạnh lên đáng kể â trạng thái chuyển tiếp (một ví dụ vê' những thay đổi hình thể trong trung tâm hoạt động của enzym tạo thuận lợi cho sự làm bền trạng thái chuyển tiếp). Đột biến Asn 155 thành bất kỳ axit amin không có liên kết H nào cũng làm giảm đáng kể tốc độ phản ứng enzym như dã được dự đoán trong những thảo luận về việc tăng cường tốc độ phản ứng enzym bởi sự làm bền trạng thái chuyển tiếp. 0 trạng thái chuyển tiếp, do phân giải histidin ỏ trung tâm hoạt động cho một proton tới nhóm amin của P l\ theo sau bởi sự phân tách các sản phẩm đầu tiên của phản ứng, peptit bắt đầu ỏ P l, và tạo thành đồng thời một chất trung gian cộng hoá trị với một nhóm axyl (từ Pl) gắn vào serin ỏ trung tâm hoạt động. Khi đó enzym bị khỏ axyl do sự tác dụng ái nhân của phân tử rníác đi vào trung tâm hoạt động của enzym từ một khoang do đích đến của sản phẩm peptit đầu tiên. Phản ứng khử axyl xảy ra cùng với sự tạo thành trong quá trình axyl hoá và 174
găn liền với sự làm bền liên kết H với enzym. Trạng thái chuyển tiếp này phân huỷ cùng với sự vận chuyển proton tới histidin ở trung tâm hoạt động và giải phóng sản phẩm peptit thứ 2 có nhóm P l ’ ỏ đầu amin tận cùng.
Asp32 Ser 2 Ũ His 64
His 64
His 64
Hinh 5.23. Thể hiện theo sơ đồ cơ ch ế chuyển nhóm axyl chung của cá c serin proteaza (Nguồn: Nature, Carter và Wells, 1988. 332,564).
Gốc aspartat ở trung tâm hoạt động là một đặc điểm chung của các serin proteaza và đã được chỉ rõ thông qua các nghiên cứu đột biến, là rấ t quan trọng cho quá trình xúc tác. Các nghiên cứu ban đầu cho rằng, cùng với các gốc serin và histidin, aspartat đặc trưng như vậy đòi hỏi phải có một mối quan hệ hình học chính xác giữa các chuỗi bên của gốc aspartat và gốc histidin nhằm đảm bảo liên kết H mạnh. Tuy nhiên, quá trình dinh hưống chuỗi bên aspartat có liên quan đến cắc gốc Ser-His ở trung tâm hoạt động thay đổi tương đối giữa ba lớp serin proteaza, do đó làm cho ta không chắc chắn rằng có sự vận chuyển proton trực tiếp giữa các chuỗi bên histìdin và các chuỗi bên aspartat trong tấ t cả các enzym. Thực tế, một sô' nhà thực nghiệm thấy rằng, cơ chế xúc tác của các serin proteaza hầu hết được cho là hai bộ đôi xúc tác khác biệt - một được tạo bỏi gốc serin và histiđin, một dược tạo bởi gốc histidin và aspartat - chứ không phải là bộ ba xúc tác riêng lẻ (Liao và cộng sự, 1992). Các chi tiết phân tử, các dữ liệu thí nghiệm cho thấy sự có mặt của anion cacboxylat của aspartat ảnh hưỏng đến tính phản ứng của các gốc histidin theo một cách thức rấ t quan trọng đổi vói xúc tác. Những tranh luận trước đó cung cấp một ví dụ điển hình cho các tác động lẫn nhau giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzym, là chúng phải kết hợp vổi sự làm bển trạng thái chuyển tiếp và tăng cường tốc độ phản ứng. Tuy nhiên, quá trình gắn cơ chất phải xảy ra trưổc các bước 175
xúc tốc này và sự tạo thành phức hợp enzym cơ chất cũng bị ảnh hưởng bởi các môì quan hệ hoá học lập thể giữa các nhóm trên cơ chất và các tiểu phần tương tự trong trung tâm hoạt động của enzym. Ví dụ: những khác biệt vê' tính đặc trưng của cơ chất trong các serin proteaza loại chymotrypsin và serin proteaza loại subtilizin có thể được lý giải dựa trên cơ sỏ cấu trúc trung tâm hoạt động từng loại. Trong tất cả các enzym này, liên kết H cơ chất tạo thuận lợi cho việc gắn cơ chất tạo thành cấu trúc gấp nếp p giữa các gốc trong trung tâm hoạt động enzym và các gốc P I - P4 của cơ chất (Hình 5.24), Nhũng tương tác này cung cấp ái lực gắn đôì với các cơ chất nhưng không phân biệt đáng kể peptit này với peptit khác. Cốc tương tác vị trí P1 - S I dường như đóng vai trò quan trọng trong xác định tính đặc trưng cơ chất trong các enzym này. Các subtilizin thưòng biểu hiện một tính đặc trưng cơ chất rộng, với một ưu tiên với các nhóm lớn, kỵ nước ỏ vị trí P1 của cơ chất. T rật tự ưu tiên một cách tương đổi như sau: Tyr, Phe > His, Met, Lys > His, Ala, Gin, Ser » Glu, Gly (Perona và Crain, 1995). VỊ trí S i của subtilizin tồn tại ở dạng một khe nông, rộng được tạo thành bởi hai sợi có cấu trúc gấp p và một vùng loop có kích thưỏc đa dạng (Hình 5.24b). Trong một phân lớp của các enzym này, mà ỏ đó enzym gốc Lys P l được điểu chỉnh cho phù hợp, vòng chứa một gốc gỉutam at được định vị để tạo thành một cầu muối vối gốc lysin cơ chất nhằm làm trung hoà điện tích trên việc gắn cơ chất. Trong các enzym loại chymotrypsin, túi SI bao gồm một rãnh sâu, ở đó gốc P1 cơ chất phải khớp hợp (Hình 5.24a). Tính đồng nhất của các gổc axit amin trong rãnh này sẽ ảnh hưồng đến các loại gốc cơ chất bị tác dộng ở vị trí này (tolerated). Các enzym loại chymotrypsin này có thể được phân chia sâu hơn thành 3 phân lớp dựa trên cơ sở này. Các enzym trong phân lớp loại trypsin có một gốc aspartat được bảo toàn ỏ vị trí 189, nằm ở đáy của giêng Sl; điều này giải thích tính ưu tiên cao của enzym này đôì với cơ chất có các gốc arginin hay lysin ồ P l. Aspartat này bị thay thế bởi một gốc serin hay một gốc kỵ nước nhỏ trong phân lóp loại chymotrysin và clastaza; do vậy cả 2 phân lớp này cho thây tính đặc trưng đôi với các gôc P l không phân cực. Các gốc axit amin khác nằm trong túi S l ảnh hưởng ỉớn hơn đến tính đặc trưng cơ chất. Phân lóp elastaza chứa trong túi này các nhóm không phân cực lớn có xu hướng ngăn chặn các gốc cơ chất kềnh càng. Do đó, các phân lớp elastaza thích hợp với các cơ chất có các gôc kỵ nước nhỏ ở vị trí P l. Ngược lại, phân lớp chymotrypsin có các gôc nhỏ trong các vị trí này (ví dụ glyxin) và những enzym này khi đó ưa 176
thích các nhóm kỵ nước lởn hơn, như các tyrosin và phenylalanin ở vị trí P l của các cơ chất của chúng.
(a)
X
(b)
A spias
Hình 5.24. Các tương tác trung tâm hoạt động - cơ chất trong các serin proteaza
(a) Các tương tác bên Irong lớp serin proteinaza; (b) Tương tác bên trong íớp serin proteinaza giống subtilizin. (Theo Perona và Craik,1995).
Trong phần tổng quan này về serin proteaza, chúng ta đã quan sát được các ví dụ đặc trưng là làm th ế nào cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym có thể: (1), thu hút cơ chất và liên kết với nó theo một định hướng thích hợp cho xúc tác (ví dụ: mạng lưới liên kết H được phát triển giữa các gốc P i - P4 của cơ chất và các gốc ổ trung tâm hoạt động); (2) làm bền trạng thái chuyển tiếp nhằm đẩy nhanh tốc độ phản ứng (ví dụ: sự làm bền chất trung gian oxyanionic tớ diện nhờ các tương tác liên kết H) và (3) phân biệt các cơ chất có khả năng dựa trên cơ sở các mối quan hệ hoá học lập thể giữa cơ chất và các tiểu trung tâm hoạt động của enzym. Do các cấu trúc phân tử khác nhau giữa enzym này vói các enzym khác, nên các dạng chung của tương tác được minh hoạ bởi các proteaza cũng điều khiển liên kết cơ chất và các chuyển dạng hoá học trong tấ t cả các enzym tự nhiên đã được khám phá ra. 5.7. TỐC Đ ộ PHẢN ỨNG CỦ A ENZYM
Một phản ứng enzym đơn giản có thể viết như sau: E+s
ES
EP
p+ E
(5.10)
Ở đây E là enzym, s là cơ chất, p là sản phẩm phản ứng, ES và EP là phức chất của enzym với cơ chất và sản phẩm phản ứng. 177
Để hiểu được bản chất của sự xúc tác, cần phân biệt sự khác nhau giữa khái niệm cân bằng phản ứng và tổc độ phản ứng. Chức năng của một châ't xúc tác là để tồng tốc độ của một phản ứng. Các chất xúc tác không gây ảnh hưởng gì đến sự cân bằng phản ứng. Bất kỳ phản ứng nào từ s —* p có thể được mô tả bỏi một sơ đồ phản ứng (Hình 5.25). Đây là sơ đồ mô tả các phần năng lượng của phản ứng. Năng lượng trong hệ thống sinh học được biểu thị bằng năng lượng tự do G. Trong sơ đồ phản ứng, năng lượng trong hệ thống sinh học được biểu hiện trên trục tung và quá trình phản ứng được biểu hiện trên trục hoành. Ở trạng thái ổn định bình thưòng hay trạng thái nền (ground/state) bất kỳ một phân tử nào (như s hoặc P) đểu có một năng lượng tự do đặc trưng. Để miêu tả sự thay đổi năng lượng tự do của phản ứng, các nhà hoá học đã đưa ra một loạt các điểu kiện chuẩn (nhiệt độ 298K; áp suất từng phần của khí mỗi atm hoặc 11,3 kPa; nồng độ của cha't tan IM), và biểu diễn sự thay đổi năng lượng tự do của hệ thông phản ứng này là AG, sự thay đổi năng lượng tự do chuẩn.
Hlnh 5.25. Biểu đồ phối hợp phản ứtìg đối vâi phản ứng hoá học. Nâng lượng tự do của hệ thống vẽ trèn biểu đổ ngưạc với liến trình phản ứng. Bieu đổ của loại này miêu tả tiến trinh năng lượng của phản úhg và trục hoành (ví dụ sự cắt đứt hoặc sự tạo thành liên kết) như s tạo thành p. Các ký hiệu s và p chỉ năng lượng tự do của trạng thái nền cơ chất và sản phẩm. Trạng thái chuyển được biểu thị bằng ký hiệu khác. Năng lượng hoạt hoá cho phản ứng s —►p và p —» s được biểu thị AG*. AG° là sự thay đổi toàn bộ năng lượng tự do chuẩn đì từ s đến p.
Do các hệ thống hoá sinh thưòng liên quan đến nồng độ H* thấp hơn IM rấ t nhiều nên các nhà hoá sinh học thiết lập AGd, sự thay đổi năng lượng tự do chuẩn ỏ pH = 7. Sự cân bằng giữa s và p phản ánh sự khác nhau về năng lượng tự 178
do giũa các trạng thái nền của chúng, ở ví dụ Hình 5.25, năng lượng tự do của trạng thái nền của sản phẩm thấp hơn so vối cơ chất, vì vậy AG05 của phản ứng có giá trị âm và sự cân bằng nghiêng về phía sản phẩm. Sự cân bằng này không bị ảnh hưởng bởi bất kỳ phản ứng xúc tác nào. Tuy nhiên, sự cân bằng phản ứng không có nghĩa là sự chuyển hoá s —►p xảy ra nhanh. Tốc độ của một phản ứng phụ thuộc vào một tham sô" hoàn toàn khác. Có một rào cản năng lượng giữa s và p biểu thị năng lượng cần thiết để xếp hàng các nhóm phản ứng, hình thành các điện tích không bền, sự sắp xếp lại các liên kết và các chuyển đổi khác cần thiết cho phản ứng xảy ra theo cả hai chiều. Điều này được minh hoạ bởi độ dốc năng lượng ở Hình 5.25 và 5.26. Để tham gia phản ứng, các phân tử phải vượt rào cản này và do đó phải tăng tới mức năng lượng cao hơn. Tại đỉnh năng lượng có một điểm mà tại đó trạng thái s hoặc p đều có khả năng xảy ra như nhau và được gọi là trạng thái chuyển (transition State). Trạng thái này đơn giản chỉ là một sự chuyển động phân tử. Sự khác nhau giữa các mức năng lượng ở trạng thái nền và trạng thái chuyển được gọi là năng lượng hoạt hoá (AG*). Tốc độ phản ứng phản ảnh nàng lượng hoạt hoá này. Một năng lượng hoạt hoá cao hơn tưdng đương vối một phản ứng chậm hơn. Có thể tăng tốc độ phản ứng bằng cách tăng nhiệt độ, từ đó táng số phân tử vối năng lượng đủ để vượt qua được rào cản năng lượng này. Có thể giảm năng lượng hoạt hoá bằng cách thêm một chất xúc tác (Hình 5.26). Chất xúc tác tăng tốc độ phản ứng qua việc giảm năng lượng hoạt hoấ.
Hình 5.26. So sánh biểu đồ phối hợp phản ửng của các phản ứng được xúc tác enzym và không xúc tác
ES và EP biểu thị sự chiếm giữ nhỏ nhất trong đường cong tiến trình năng luợng của phản ứng xúc tác enzym. Các thuật ngữ AG* khanglúclàc và liên quan đến nâng lượng hoạt hoá đối với phản ứng không xủc tảc và xúc tac tương ứng. Năng lượng hoạt hoá đối với toàn bộ tiến trình là thấp khi enzym xức tác phản ứng.
179
Enzym cũng không ngoại lệ của quy tắc là các chất xúc tác không ảnh hưởng đến sự cân bằng phản ứng. Mũi tên 2 chiều ở phương trình (5.11) chỉ ra rằng: bất cứ enzym nào xúc tác cho phản ứng s —►p cũng xúc tác phản ứng p —►s. Chức năng duy nhất của nó là tăng sự chuyển hoá qua lại giữa s và p. Enzym không bị m ất đi trong quá trình xúc tác và điểm cân bằng không bị ảnh hưỏng. Tuy nhiên, phản ứng đạt đến cân bằng nhanh hơn nhiều khi có mặt enzym thích hợp bởi vì tốc độ phản ứng đã tăng lên. Nguyên lý chung này có thể được minh hoạ khi xem xét phản ứng của glucoza và 0 2 thành C 02 và H20. Phản ứng này có AG°’ âm và khá lớn và tại điểm cân bằng lượng glucoza cố m ặt không đáng kể. Tuy nhiên, glucoza là một chất bền. Sự bền này biểu th ị việc cần có một nông lượng hoạt hoá cao để phản ứng xảy ra. ở trong tế bào, khi có m ặt 0 2, glucoza bị thuỷ phân thành C 02 và HaO với sự xúc tác của enzym. Enzym này khồng chỉ làm tăng tốc độ phản ứng mà còn tổ chức và điều khiển chúng sao cho phần lổn năng lượng giải phóng trong quá trình này được phục hồi dưới tác dụng khác và thực hiện các chức năng khác nhau. Trên thực tế, bất cứ phản ứng nào cũng có thể có vài bước liên quan đến sự hình thành và phân huỷ một vài chẩt hoá học, được gọi là các chất trưng gian của phản ứng. Khi phản ứng s —» p được xúc tác bởi một enzym, phức hợp ES và EP là các chất trung gian (phưdng trình 5.11). Khi một vài bưốc xảy ra trong một phản ứng, tốc độ chung được xác định bằng bưốc (hoặc các bước) có mức năng lượng hoạt hoá cao nhất, được gọi là bưổc giới hạn tốc độ phản ứng. Trong trường hợp đơn giản, bước giói hạn tốc độ phản ứng là điểm năng lượng cao nhất trong sơ đồ chuyển hoá qua lại s và p (Hình 5.26). Trong thực tế, bước giổi hạn tốc độ phản ứng có thể thay đổi khi điều kiện phản ứng thay đổi và đối vói nhiều enzym, các bước có thể có năng lượng hoạt hoá như nhau. 5.8. MỘT VÀI NGUYÊN LÝ GIẢI THÍCH KH Ả NĂNG x ú c TÁ C VÀ Đ ẶC HIỆU C Ủ A ENZYM
Enzym là chất xúc tác tốt nhất có khả năng gia tăng tốc độ phản ứng tới 107- 10H lần (Bảng 5.5). Enzym cũng rấ t đặc hiệu, dễ dàng phân biệt cơ chất với cốc câu trúc hoàn toàn giống nhau. Vậy nguyên nhân nào cho phép nó có những đặc tính trên,,.. Một phần câu trả lời nằm trong các phản ứng hoá họe đã được hiểu rõ khi xảy ra giũa cơ chất và nhóm chức enzym (axit amin đặc hiệu chuỗi bên, ion kim loại và coenzym). Các nhóm chức năng xúc tác trong enzym có thể tương tác vôi cơ chất và hoạt hoá nó để phản ứng xảy ra. Trong nhiều trường hợp, các nhóm 180
này làm giảm năng lượng hoạt hoá (và do đó thúc đẩy phản ứng) bằng cách tạo ra một phản ứng năng lượng thấp. Tuy nhiên, các nhóm này không phải là duy nhất tham gia vào quá trình xúc tác enzym, năng lượng cần thiết để làm giảm năng lượng hoạt hoá được cung cấp từ các tương tác yếu không cộng hoá trị, giữa cơ chất và enzym. Yếu tố mà thực sự phân biệt enzym khỏi các chất xúc tác không enzym là sự hình thành phức hợp ES đặc biệt. Sự tương tác giữa cd chất và enzym trong phức hỢp này được điều khiển bởi cùng một lực vớì sự ổn định cấu trúc protein (liên kết hydro, tương tốc kỵ nước, tương tác ion và tương tác Van der Waals). Sự hình thành liên kết yếu trong phức hợp ES được thực hiện nhờ một lượng nhỏ năng lượng tự do làm ổn định tương tác. Năng lượng từ sự tương tác enzym —cơ chất được gọi là năng lượng liên kết. Năng lượng liên kết là nguồn năng lượng tự do chính được sử dụng bởi enzym dể làm giảm năng lượng hoạt hoá của phản ứng. Bảng 5.5. Một số tốc độ phản úng gia tăng bởi enzym (lẩn) Cacbonic anhydraza
107
Phosphoglucomutaza
101ỉ
Sucxinyl - CoA transferaza
10'2
Ureaza
1014
Hai nguyên lý cơ bản và liên hệ với nhau giải thích phương thức hoạt động của enzym. Thứ nhất, khả nống xúc tác của enzym là do năng lượng tự do giải phóng khi hình thành các liên kết yếu và sự tương tác xảy ra giũa enzym và cơ chất của nó. Nống lượng liên kết này tạo ra tính đặc hiệu cũng như tính xúc tác của enzym. Thứ hai, các tương tác yếu được tôi ưu hoá trong trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Các trung tầm hoạt động của enzym không chỉ khớp với cơ chất mà còn với trạng thái chuyển tiếp của phản ứng nổ xúc tác. 5.9. ENZYM DỪNG NẢNG LƯỢNG LIÊN KÊT ĐỂ x ú c t á c p h à n ứ n g V À TẠO R A TÍNH Đ Ặ C Hiệu PHẢN ỨNG
Năng lượng liên kết làm cho enzym có tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu chính là khả năng một enzym phân biệt hai cơ chất cạnh tranh nhau, về thuật ngữ, tính đặc hiệu khác xa với tính xúc tác, nhưng trên các thí nghiệm thì không đơn giản như vậy, bởi vì chúng cùng có các hiện tượng 181
như nhau. Nếu trung tâm hoạt động của enzym có những nhóm chức được sắp xếp tối ưu để tạo ra hàng loạt các tương tác yếu với một cơ chết nào đó ở trạng thái chuyển tiếp thì nó không thể tương tác tốt với bất kỳ cơ chất nào khác. Ví dụ: nếu cơ chất bình thưòng có nhóm hydroxyl tạo thành liên kết hydro đặc hiệu với gốc Glu của enzym th ì b ất kỳ phân tử nào thiếu nhóm hydroxyl đặc hiệu đó sẽ là cơ chất tồi đôì với enzym. Hơn nữa, nếu phân tử nào có thêm nhóm chức mà enzym lại không có vị trí liên kết với nhóm chức này thì phân tử này cố thể bị loại bỏ khỏi enzym. Nhìn chung, tính đặc hiệu khởi nguồn từ sự hình thành các tương tác yếu giữa enzym và một phần hoặc toàn bộ phân tử cơ chất đặc hiệu của nó, Năng lượng liên kết là lực đẩy quan trọng nhất trong một vài cơ chế xúc tác nhưng cũng chỉ là trợ thủ trong một sô" trường hợp. Điều này được minh hoạ bằng cách xem xét những điều cần thiết để một phản ứng xảy ra. Các rào chắn lý học và nhiệt động học nổi trội là: (1) Entropy, sự chuyển động tương quan của hai phân tử trong dung dịch. (2) Lóp vỏ solvat của nưóc bao quanh và giúp ổn định phần lớn các phân tử sinh học trong dung dịch, (3) Sự phá v5 điện tử hoặc cấu trúc của cơ chất xảy ra ở rấ t nhiểu phản ứng. (4) Sự cần thiết để sắp xếp chính xác các nhóm chức xúc tác trên enzym. Năng lượng tự do có thể được dùng để vượt qua các rào cản này. Sự giảm entropy là một trong những lợi ích rõ ràng cùa việc liên kết của hai cơ chết với một enzym. Năng lượng liên kết giữa các cơ chất ỏ vị trí đúng để phản ứng. Một đặc tính quan trọng cho sự xúc tác vì sự va chạm giữa hai phân tử enzym trong dung dịch rất hiếm. Các cơ chất được định vị chính xác trên enzym nhờ rất nhiều tương tác yếu giữa mỗi cơ chất và các nhóm định vị trên enzym. Các nghiên cứu cho thấy rằng, khi giảm sự chuyển động của hai chất phản ứng thì có thể làm tăng tốc độ lên đến 108M (một tốc độ tương đương vâi tốc độ phản ứng khi các chất phản ứng có nồng độ cao đến mức không thể có được, 100.000.000 M). Sự hình thành các liên kết yếu giữa cơ chất và enzym cũng dẫn đến sự loại solvat khỏi cơ chất. Sự tương tác enzym —cơ chất thay th ế phần lốn hoặc tấ t cả các liên kết hydro giữa cơ chất và nưóc trong dung dịch. 182
Năng lượng liên kết liên quan đến tương tác yếu hình thành ở trạng thái chuyển tiếp bù lại những đứt gãy của cơ chất trong quá trình phản ứng. Sự đứt gãy của cơ chất ỏ trạng thái chuyển tiếp có thể là đứt gày về cấu trúc hoặc tĩnh điện học. Enzym có thể tự thay đổi cấu hình khi cơ chất liên kết với nó, tạo ra nhiều tương tác yếu với cơ chất. Hiện tượng này được gọi là khớp hợp cảm ứng, một cơ chê được Daniel Koshland đưa ra năm 1958. Khớp hdp cảm ứng sắp xếp các nhóm chức đặc hiệu của enzym vào VỊ trí đúng để xúc tác phản ứng. Sự thay đổi cấu hình cũng cho phép hình thành thêm các tương tác yếu ở trạng thối chuyển tiếp. 5.10. VAI TRÒ CỦ A C Á C NHÓM CHỨC NĂNG TRONG PHÂN TỬ ENZYM
Bản chất enzym là protein, phân tử của chúng gồm hàng tràm hoặc hàng ngàn gốc axit amin, Hầu hết các axit amin đều có mạch nhánh. Các mạch nhánh này thưòng ở trạng thái tự do, có thể tham gia vào những phản ứng hoá học nhất định. Các nhóm này tạo nên các nhóm chức nông của trung tâm hoạt động; có những nhóm trực tiếp tham gia vào hoạt động xúc tác; có những nhóm khác làm nhiệm vụ kết hdp và định hướng cho cơ chất và coenzym và tạo nên bộ phận tiếp xúc của enzym. Tuy nhiên, ta không thể xác định đước một ranh giói rõ rệt giữa các nhóm “xúc tác" và các nhóm “tiếp xúc” vì những nhóm tiếp xúc cũng thưòng tham gia vào sự xúc tác. Các nhóm chức năng thưòng nằm ỏ những bộ phận khác nhau trong các chuỗi polypeptit của phân tử enzym, nhưng do sự cuộn khúc của các mạch peptit làm cho các nhóm dó kể lại gần nhau về không gian và định hướng theo một cách nhất định. Sự phá huỷ hoặc khoá một nhóm chức năng nào đó thường gây ra sự kìm hãm, hoặc làm chậm phản ứng xúc tác. Khi cấu trúc bậc ba hay bậc bôn của phân tử enzym bị thay đổi vì lý do vật lý hay hoá học nào đó, cũng thường gầy tổn hại đến cấu trúc đặc biệt của trung tâm hoạt động, làm rối loạn sự định hướng tương hỗ của các nhóm chức năng. Các nhóm chức năng thứờng có trong phân tử enzym bao gồm: (1) Các nhóm cacboxyl của axit aspartic và axit glutamic. (2) Nhóm a-am in của lysin. (3) Nhóm guanidin của arginin. (4) Nhóm indol của tryptophan. (5) Nhóm imidazol của histidin. 183
(6) Nhóm hydroxyl c ủ a serin và treonin. (7) Nhóm phenol của tyosin. (8) Nhóm sulfuhydryl của xystein. (9) Nhóm thioete của metionin. (10) Những mạch béo của những axit amin khác và vòng thdm của phenylalanin. Các nhóm chức năng tham gia vào hoạt động xúc tác của enzym bằng nhiều cơ chế. Nhò khả năng nhường hoặc nhận proton, chúng có thể hoạt động như những chất xúc tác. Chúng cũng có thể liên kết bằng liên kết cộng hoá trị với cơ chất tạo thành phức hợp enzym —cơ chất có hoạt tính cao, để thực hiện cơ chế xúc tác cộng hoá trị. Trong những enzym có chứa kim loại, nhiểu trưòng hợp chính ion kim loại đóng vai trò trung gian giữa những nhóm chức nâng của enzym và cơ chất, lon kim loại là những chất mang điện tích dương, có thể đóng vai trò chất hút điện tử rất mạnh và do đó tham gia vào cơ chế phản ứng rấ t có hiệu lực. Trong một số enzym loại thuỷ phân, nhất là loại thuỷ phân liên kết peptit, thường có chứa những ion kim loại như Mg2*, Mn2+, Zn2+... Những ion này có thể đóng vai trò chất hú t điện tử trong cơ chế phản ứng enzym và có thể gây tác dụng phân cực. Những enzym cần coenzym thì chính nhóm chức năng của coenzym được coi như nhóm hoạt động của enzym. 5.10.1. Nhóm im idazol của hỉstidin
Nhân imidazol là một hệ thống mạch vòng thơm với những liên kết đôi liên hợp. Nhân imidazol có hai nguyên tử nitò, hai nguyên tử này khác nhau và khác với các nguyên tử cacbon về khả năng phản ứng. Trong dị vòng imidazol, những cặp điện tử tham gia vào sự tạo thành liên kết đôi (những điện tử pi). Nhân imidazol là một hệ thống vòng liên hợp cho nên đốm mây điện tử p i trong đó một giới hạn nh ất định thành những tính chất ngược lại, và do đó gây ra sự chuyển proton. Khả năng của imidazol có những biến đổi hỗ biến (tautome) được thể hiện do sự tấn công của proton, hoặc của nhóm mang điện tích dương (R+) vào nitơ (N3). Quá trình này có thể minh hoạ trong sơ đồ trong Hình 5.27.
NV
N rV -
. r v A
n\
r —
V À
_ / = \. —
-^ -J T \ n A
Hình 5.27. Sự biến đổi hỗ biến của imldazol
184
4-H* r
Theo sơ đồ trên, sự kết hỢp của nhóm mang điện tích dương R+ vào nguyên tử N3 đã làm cho các điện tử được phân bố lại, dẫn đến sự xuất hiện điện tích dương ở nguyên tử N ị và sự tách proton ra khỏi nguyên tử đó. So sánh cấu trúc ban đầu với cấu trúc cuối cùng thì nguyên tử Nj (giông nitơ bậc hai của pyrol) và N3 (giông nitơ bậc ba của pyridin) đã biến đổi hỗ biến và thay đổi vai trò. Do sự biến đổi hỗ biến thuận nghịch mà cả hai nguyên tủ nitơ của imi.dazol đều thể hiện được tính châ't hai m ặt khác hẳn nhau (ái điện tử và ái nhân), do đó có khả năng hoạt động như một chất xúc tác axit-bazơ và như chất vận chuyển các nhóm mang điện tích dương và điện tích âm. Khả năng biến đổi hỗ biến nội phân tử và tính không bền vững của imidazol đă tạo ra khả năng xúc tác cho imidazol, làm cho nó có thể hoạt động như một chất trung gian các gổc axit. Imidazol tự do cũng như imidazol ỏ trung tâm hoạt động của enzym, khi tác dụng với nhũng axyl tương đối bền vũng, có thể đóng vai trò của chất vận chuyển trung gian các gôc axit (axyỉ, phosphoryl) sang cho nước (đó là sự thuỷ phân dẫn xuất chất axyl), hoặc sang nhóm ái nhân của nhừng chất nhận khác (trong phản ứng chuyển axyl), tính chất của imidazol tác dụng với các gốc axyl và phosphoryl mang điện tích dương đáng được chú ý. Ngưòi ta nhận thấy tác dụng xúc tác của một số’ esteraza, proteaza và ribonucleaza có liên quan m ật thiết vâi vai trò của nhóm imidazol của histidin (Hình 5.28) và một sô'nhóm chức năng khác. Với những kết quả thực nghiệm thu được bằng những phương pháp khác nhau, người ta đã có cơ sở để đưa ra giả thiết rằng, trong tác dụng xúc tác của một số’enzym thuỷ phân liên kết este và liên kết peptit có sự tham gia phối hợp hoạt động của gốc imidazol (His) và nhóm hydroxyl (Ser). Chức năng xức tác của nhóm imidazol trong quá trình xúc tác của enzym gồm nhiều mặt, hoàn toàn không phải chỉ giới hạn vào' chức năng của một chất nhận nhóm axit và chất xúc tác axit —bazơ. Nguyên tử nitd (Ng) của imidazol ngoài khả năng kết hợp những nhóm mang điện tích dương, còn có khuynh hưổng tạo thành những liên kết hydro và những phức chất vỏi kim loại. Ái lực của imidazol đối vối một sô' kim loại cũng cao như ở những hợp chất thiolic hoặc cao hơn. Histidin dễ tác dụng qua lại vồi saccarit, những phức chất của nó với hexoza và pentoza khá vững bền. Sự kết hợp được thực hiện qua liên kết hydro giũa nguyên tử nitơ của imidazol và nhóm hydroxyl của oza > N—axyl—imidazol... H-O—R. Ngưòi ta cho răng, phức hợp của maitoza và oligo l,6-glycosidaza cũng do những liên kết tương tự tạo nên và trong những enzym này, imidazol vừa có chức năng của nhóm tiếp xúc, vừa cố chức năng của nhỏm xúc tác. Khi nghiên cứu các nhóm chức năng của creatin kinaza, 185
người ta thu được những kết quả chứng tỏ rằng, imidazol có m ặt trong trung tâm hoạt động của enzym và kết hợp với nhóm thiolic bằng liên kết hydro > N... HS - R. Sự chuyển proton trong nhóm > N... HS - R và những biến đổi có liên quan của những chất cho và nhận điện tử của lưu huỳnh và của các nguyên tử nitơ của imidazol đã tạo điều kiện cho các hiệu ứng m ạnh mẽ của cơ chế xúc tác axit - bazơ hợp đồng trong trung tâm hoạt động của enzym. Nhóm imidazol có ái lực khá cao đổi với kim loại, gốc histidin tham gia vào sự hình thành các phức hợp phối trí với nguyên tử sắt của hem trong các enzym chứa sắt (như enzym porphyrinic). Trong một đoạn của chuỗi polypeptit của xytocrom có nhóm hem gắn vào đó, có một gốc histidin ò vào một vị trí rấ t thuận lợi cho tác dụng của nhóm imidazol với nguyên tử sắt của hem. Sự tham gia của nhóm imidazol trong sự tạo thành phức chất của hem ở những phân tử myoglobin và hemoglobin đã được nói đến từ lâu, dựa theo sự suy đoán qua các trị số của hằng số phân ly (pK) của nhóm có liên quan với sự kết hợp 0 2 của những chất sắc tô" đó.
n ộr.*
ỹI
,R,rt/^X R R1
ỏ
Axyl hoá
ĩ
r v
rQ
^ X >>
°c_ ẹ—R 1
< Ml " o Q=R ^OR2 Hs 'Ọ
Deaxyl hoá
Hinh 5.28. Cơ chê giả thiết của các phàn ứng chuyền axyl đước xúc tác bải chymotrypsin Việc gắn nhóm hydroxyl của serin vào nguyên tử cacbon của cacbonyl của cơ chất xảy ra khi đưạc trợ giúp bỏi sự xúc tác axit chung và bazơ chung của gốc histidin. Một phân tử nuớc đóng vại trò là tác nhân chuyển proton cho phần xức tác axit chung của phản ứng. Trong kiểu đối xứng, sự phân ly của chất trung gian tứ diện cũng được thực hiện thông qua con đưòng xúc lác axít bazơ chung, một phàn tử nước đóng vai trò lả tác nhân chuyển proton cho xúc tác bazơ chung. Phẩn deaxyl hoá cùa phản ứng được coi như là ngược với phần axyl hoá (Nguồn: Mahler H.R., Cordes E.H., Biological Chemistry, 1968)”
186
5.10.2. Nhóm hydroxyl của serin
Người ta phát hiện được vai trò quan trọng của gốc serin trong trung tâm hoạt động của một sô" esteraza, proteinaza và phosphoglucomutaza. Vai trò của serin đã được xác định khi dùng các chất phospho hữu cơ như diisopropylfluorophosphat hay tetraetylpyrophosphat làm chất ức chê các enzym axetylcholinesteraza và những hydrolaza khác. Người ta thấy gôc phosphat của các chất ức chế này đã kết hợp với nhóm hydroxyl của gốc serin hoạt động của cholinesteraza, chymotrypsin và một sô' enzym khác cùng loại, tạo nên những dẫn chất O-phosphoryl bền vững. Các liên kết này chỉ bị phân giải trong những điểu kiện nhất định bởi nhũng chất ái nhân, ví dụ như các chất dẫn hyđroxylamin,... Sau khi liên kết vối chất ức chế bị phân giải thì hoạt tính của enzym được phục hồi. Nhóm hydroxyl (OH) của serin tự do, giông như những nhóm alcol bậc nhất khác, rất trơ vê' m ặt hoá học, nhưng khi có những điều kiện gây ra sự phân cực của nhóm đó thì khả năng phản ứng của nó tăng lên rất nhiều. Trong phân tủ có nhân thơm đã làm cho mật độ điện tử nguyên tử oxy của nhóm OH bị giảm đi rõ rệt, do đó nguyên tử hydro của nó dễ bị phân huỷ và thay thế bằng những nhóm tích điện dương (Hình 5,29).
H ò
R2—NH3
Hình 5.29. Bước phàn ứng xúc tác dầu tiên của chymotrypsin được gọi là bưâc axyl hoá Nhóm hydroxyl của Ser125 là ái nhân trong phân ứng đuợc trợ giứp bởi xúc tác bazơ chung (bazơ la His57 của chuỗi) (Nguồn: Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M., Principles of Biochemistry, 1993).
Ngày nav, vối nhũng kết quả thực nghiệm thu được, ý kiến của nhiều tác giả cho rằng, trong các enzym chớa serin, chính nhóm imidazol của histidin, tu y ở cách xa gốc serin hoạt động về phương diện cấu trúc bậc một nhưng lại gần kề gốc serin này trong cấu trúc bậc ba của enzym nguyên thuỷ, do đó có khả năng tác dụng của nhóm hydroxyl của serin (có thể bằng cách tạo thành liên kết hydro) và đã làm tăng khả nảng phản ứng của nhổm này lên rấ t nhiều. 187
Nhiều enzym loại thuỷ phân như esteraza (cholinesteraza) và peptidaza (chymotrypsin và trypsin) đã được chứng minh rằng, nhóm hoạt động của chúng là serin và cơ chế hoạt động của những enzym này dựa trên đặc tính ái nhân của nhóm (—CH20 -) của serin. Khi nhóm hoạt động này phản ứng este hoá với phosphat của DFP thì chất này khoá nhóm CH20 - lại và do đó enzym mất hoạt tính. Trong chymotrypsin và trypsin, ngoài nhóm serin hoạt động, histidin cũng có vai trò quan trọng trong trung tâm hoạt động, người ta đã tạo ra được những dẫn chất của histidin hoạt động gắn vối hoạt động cơ chất của những enzym này. 5.10.3. Nhóm s - amin của lysỉn
Những phân tử lysin tham gia vào thành phần protein thưồng có nhóm e- amin tự đo, trị sô" pK của nhóm này (10 —10,5) rấ t khác với các nhóm chức năng khác của enzym. Nhóm E-amin có những tính chất khác nhau về căn bản so với nhóm a-am in của các nhóm axit amin. Vì ỏ cách xa nhóm cacboxyl, cho n ê n nhóm E -am in giống nhóm a m in của các amin bậc nhất, trong đó nhóm a-am in của axit amin tự do ô bên cạnh nhóm cacboxyl cho nên nó được trung hoà với mức độ đáng kể và được bảo vệ khỏi bị nhiều tác dụng hoá học khác. Những sự khác biệt kể trên giữa nhóm E-amin và ot-amin được thể hiện rõ rệt trong phản ứng của lysin với benzaldehyt ồ dung dịch nước trong môi trường kiềm. Trong những điều kiện đó, chỉ có e-amin của lysin phản ứng với benzaldehyt mà thôi. Nhóm 8-amin của lysin trong các phân tử protein là tự do, không tham gia vào sự tạo thành peptit thông thường. Thông thường hàm lượng của lysin và arginin trong phân tử protein quyết định số điện tích đương của nó những protein có hàm lượng lysin và arginin cao như protamin, histon lysozym,... thường là những protein kiềm. Trong một sô" trưòng hợp, những axit amin kiềm tập trung vào những đoạn nhất định của phân tử protein. Ví dụ: Trong phân tử ribonucleaza, chỉ một đoạn peptit gồm 11 axit amìn đã có tối 3 gốc lysin và hai gốc arginin. Sự tập trung các nhóm cation như vậy đã tạo nên điện tích dương ở những vị trí nhất định của những phân tỏ. Có tác giả cho rằng, chính bộ phận polycation này là bộ phận của phân tử enzym tiếp xúc vối cơ chất, tức là axit ribonucleic, mà axit này là polyanion. Thật vậy, khi khoá một trong oác n h ó m E -a m in c ủ a ly sin c ủ a bộ p h ậ n đó b ằ n g các h cho p h ả n ứ n g với
dinitrophenyl thì enzym hoàn toàn m ất hoạt tính. Người ta cho rằng, các nhóm e—amin của lysin hoàn toàn có khả năng tạo nên những liên kết ion với nhóm phosphat của coenzym flavin và các coenzym nucleotic khác, do đó mà có thể cô" định được vị trí của 188
coenzym này trên những bộ phận tiếp xúc tương ứng trên bề mặt apoenzym. Tuy nhiên, cần chú ý rằng, cả các nhóm a —amin của các axit amin đầu N của các chuỗi polypeptit củng có thể tham gia vào tác dụng này. Ngoài ra, các nhóm E-amin của các gôc lysin của một số phân tử enzym còn có khả năng tạo ra những liên kết cộng hoá trị với coenzym hoặc cơ chất. Người ta đã biết rõ nhiều trường hợp như vậy, chẳng hạn khi thuỷ phân các enzym chứa biotin (ví dụ axyl - CoA cacboxylaza) bằng papain, người ta có thể tách ra được một đoạn peptit có chứa biotin (peptit - biotinyl) trong dó nhóm cacboxy của biotin kết hợp bằng liên kết đồng hoá trị khá bển vững vối nhóm E —NH2 của lysin (e N—biotinyl - lysin). Tương tự như vậy, axit lipoic trong các hệ thống pyruvat và ketoglutarat dehydrogenaza cũng liên kết với nhũng apoenzym đặc hiệu thông qua liên kết E —am in với lysin khá bền vững. Một loại liên kết cộng hoá trị khác của nhóm s - NHg của lysin với coenzym cũng đã được phát hiện, đó là liên kết của nhóm này với pyridoxalphosphat trong phosphorylaza A của cơ. Phân tử enzym này chứa 4 đương lượng pyridoxalphosphat và được kết hợp một cách chặt chẽ. Với những tính chất hoá, lý của nó, đặc biệt là quang phổ hấp thụ tối đa đặc hiệu của nó, ngưòi ta giả thuyết rằng, trong phân tử enzym, pyridoxalphosphat kết hợp với apoenzym kiểu aldimin thế, trong môi trường axit yếu liên kết đó chuyển sang liên kết aldìmin không bền (Hình 5.30).
Hlnh 5.30. Liồn kết kiểu aldimin giữa pyridoxal phosphat với apoenzym (a) Aldimin thay thế; (b) Aldimin ịbazơ Shiff).
Ngưòi ta đã chứng minh sự tồn tại của liên kết aldimin đó bằng cách dùng tính chất bị khử của nó bởi borhydrit natri (trong điều kiện nhẹ nhàng) thành liên kết amin bậc hai. Với sự khử tương tự trong môi trưòng axit yếu, phosphorylaza chuyển thành dạng hydro hoá vững bền và hoàn toàn hoạt động. Từ nhũng sản phẩm thuỷ phân của phosphorylaza bị khử, ngưòi ta đã chiết xuất thành công e —N - pyridoxyllysin: )H H2—NH—CH2(CH2)3—CH—COOH CH2OH
nh2
189
Từ nhưng sản phẩm thuỷ phân của phosphorylaza bị khỏ, người ta đã chiết xuất thành công £ - N - pyridoxyllysin. Như vậy rõ ràng đây là sản phẩm của phức hợp enzym pyridoxalphosphat đã được hydro hoá. Hai thành phần này kết hợp với nhau thông qua liên kết giữa e-NH2 của lysin của apoenzym và nhóm aldehyt của pyridoxalphosphat. Nhóm phosphat của enzym đã bị tách ra trong quá trình thuỷ phân bằng axit. Trong một sô" enzym khác cần pyridoxalphosphat, ngưòi ta cũng thấy rằng, apoenzym kết hợp với coenzym bằng liên kết aldimin. Người ta cũng đã chiết xuất được e-N pyriđoxyllysin sau khi đã được oxy hoá,... Từ những kết quả thực nghiệm đã thu được, ngưòi ta giả thuyết rằng, ở rấ t nhiều enzym có chứa pyridoxal, nhóm e—amin của một trong các gôc lysin của apoenzym đã tham gia vào việc kết hợp coenzym này. Cần chú ý rằng, việc gắn nhóm aldehyt của coenzym vào nhóm hoạt động của enzym không phải đơn thuần là để gắn coenzym vào apoenzym vì sự gắn coenzym vào apoenzym được thực hiện chủ yếu qua một vị trí khác của coenzym vào enzym. Sự vận chuyển aldimin thường nhanh và nhạy hơn nhiều so vối tạo thành aỉdimin (bazơ Shiff).Vai trò của nhóm e-NH2 (lys) trong bước mở đầu của quá trình vận chuyển amin, có thể mô tả như trong Hình 5.31.
Hlnh 5.31. Vai trò của nhóm 8 - NH, mỏ đầu cơ c h ế vận chuyến nhóm amin
190
Trên đây là sơ đỗ mô tả tác dụng của nhóm e—NH2của aminotransferaza và chất phôi hợp là pyridoxal phosphat trong cơ chế vận chuyển amin. Ngoài ra, người ta củng xác nhận rằng, nhóm e-am in của lysin trong các phân tử enzym không chỉ tham gia vào tác dụng với pyridoxalphosphat mà còn tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm CO, dặc biệt là những cơ chất chứa nhóm cacbonyl, ví dụ như trường hợp của transaldolaza. Hoạt động xúc tác của enzym này là vận chuyển những gôc dihydro axeton từ những phân tử phosphoxetoza này sang phosphoxetoza khác. Với nhóm hoạt động là e—NHZ (lys), tất cả các loại aldolaza đều có khả năng xúc tác thuận nghịch quá trình sau đây: Fructoza-l,6-di-® — ± Glyxeraldehyt -3-©+Dihyđroxyaxeton -® Trong quá trình này, thế cân bằng thưòng lệch nhiều về phản ứng ngược chiểu, nghĩa là quá trình ngưng tụ glyxeralđehyt — 3 — © và dihydroxyaxeton - ® thành fructoza - 1,6 - di —®. Đối với quá trình này, aldolaza thưòng thể hiện tính đặc hiệu tuyệt đôì với dihydroxyaxeton phosphat. Khi cho ủ enzym này với dihydroxyaxeton phosphat và không có mặt aldehyt thì sẽ xảy ra phản ứng sau đây: CH ị—O—0
o=c
CH;—o—(p)
H CH2- O - 0
H— c —OH H
Nhờ tác dụng của enzym, một trong hai Rì R2 nguyên tử hydro trên cacbon bên cạnh \ Q/ Cơ chất cacbon không bị este hoá bằng liên kêt N phosphat đã trỏ nên linh hoạt, có thể trao dổi với các proton trong môi trường. Do đó ch2 cacbon này trỏ nên có hoạt tính cao, sẵn ( C H 2)3 En2ym sàng phản ứng với cacbon aldehyt của cơ chất thứ hai để thực hiện phản ứng ngưng -H N -C H -C O tụ (ngược chiều). Đối vối decacboxylaza của axetoaxetat, người ta cũng thu được những kết quả tưdng tự như trên. Có lẽ những enzym này đã tạo nên các xetimin (bazơ Schiff) với nhóm xeton của cd chất. 191
Với những kết quả thí nghiệm đã thu được, người ta cho rằng, sự tạo thành các hợp chất trưng gian dưôi dạng bazd Schiff (qua nhóm E-NH2 của lysin) là cơ chế phổ biến của sự phân cắt các liên kết cacbon cacbon trong các chất đưòng xetonic và axit betaxetonic. Từ lâu người ta đã biết rằng, những amin bậc nhất trong những hệ thống mẫu, có khả năng xúc tốc các phản ứng khử cacboxyl của axit p—xetonic và các biến đổi aldol c ủ a ly s in tro n g tr u n g tâ m h o ạ t đ ộ n g c ủ a e n z y m v ừ a cố v ai trò
liên kết cơ chất, vừa có vai trò hoạt động xúc tác. 5.10.4. Nhóm caboxyl
Rất nhiều protein có một số' khá lớn cacboxyl tự do, đó là những nhóm a-cacboxyl của axit aspartic và glutamic cũng như những nhóm a-cacboxyl tận cùng của chuỗi peptit. Các nhóm cacboxyl thưòng đóng vai trò nào đó trong trung tâm hoạt động của enzym, hoặc tham gia vào việc bảo vệ và duy trì cấu hình nguyên thuỷ của phân tử enzym. Những nhóm cacboxyl (dưới dạng ion hoá và không ion hoá) ở trung tâm hoạt động của enzym cỏ thể thực hiện cơ chế xúc tác axit - bazơ hoặc bằng cách gây ra tác dụng cảm ứng đôi với tính phân cực của những liên kết ở cạnh chúng và của những nhóm của phức hợp enzym cơ chất, hoặc bằng cách gây ra những sự di chuyển điện tử thông qua sự tạo thành liên kết hydro. Trong trung tâm hoạt động của enzym pgalactosidaza, ion cacboxylat đã gây ra sự cảm ứng tĩnh điện và nhóm imidazol này có trị sô' pK rấ t cao do tác dụng của nhóm cacboxyl ồ gần nó đã làm tăng tính chất bazơ của nó lên. Những hiện tượng xảy ra trong trung tâm hoạt động của enzym p - galactosidaza có thể giả thuyết như trong Hình 5.32.
Hình 5.32. Trung tâm hoạt động của 0 -galactosidaza
192
5.10.5. Nhóm sulfuhydryl
Trong cơ thê sông, nhiều chức phận sinh lý khác nhau có liên quan với những hợp chất thiolic, đặc biệt là nhóm —SH của protein và enzym. Chúng tham gia vào sự co cơ, hoạt động thần kinh, hô hấp tế bào, điều hoà tính thấm của màng ty thể,... Người ta cũng nói đến sự liên quan của nhóm -SH vói cơ chế tổn thương do bức xạ. Ngưòi ta đã thấy rằng, hoạt tính của hàng loạt enzym bị ức chế, khi nhóm - SH chức năng của chúng bị khoá. Các enzym này được gọi là enzym etholic (hay - SH enzym) bao gồm những enzym thuộc nhiều loại khác nhau. Đa sô' những enzym nội bào bao gồm những enzym dehydrogenaza (như enzym nicotinamit, flavinic), enzym pyridoxalic bị ức chế bởi những thuốc thử tác dụng lên nhóm - SH. v ề nguyên nhân của sự thay đổi tính phản ứng của các nhóm - SH trong phân tử protein và enzym, người ta cho rằng, nhóm sulfuhydryl cũng như những nhóm chức năng khác bị giảm đi tính phản ứng là tuỳ thuộc vào vị trí sắp đặt của chúng trong phân tử protein, những nhóm càng bị che lấp nhiều, càng bị giấu kín thì tính phản ứng của chúng càng bị giảm bởi những tác nhân hoá học bị cản trỏ về mặt không gian. Ngoài ra, tính phản ứng của một số nhóm - SH còn có thê bị giảm đi do tác dụng hoá học của các mạch nhánh của cốc gốc axit amin ở gần kề. Tính phản ứng của nhóm - SH có thể bị thay đổi do ảnh hưởng tĩnh điện của các nhóm chức năng lân cận trong phân tử cũng như sự tạo thành các liên kết hydro. Tuy nhiên cũng cần lưu ý rằng, những nhóm có cực khác nhau của phân tử protein gần kề nhóm - SH, tuỳ theo điện tích của chúng, đều có khả năng tạo điều kiện thuận lợi, hoặc trái lại, ngăn cản các thuốc thử ion hoá không cho chúng đến gần nhũng nhóm —SH. 5.10.6. Vai trò của các nhóm -S H trong phân tửenzym
a) Đối vởi sự tạo th à n h hợp chất trung gian E S Nhiều tác giả cho rằng, nhóm - SH của phân tủ enzym tham gia vào sự hoạt hoá cơ chất thông qua việc tạo thành những liên kêt cộng hoá trị vối các nhóm hoạt động của cơ chất. Điều này đã được chứng minh khi nghiên cứu phosphoglyxeraldehyt dehydrogenaza (PGAD). Enzym này kết hợp vói NAD* và tạo thành hợp chất trung gian với gôc axyl của cơ châ't. Hợp châ't trung gian này sẽ được phân giải bằng cách phosphoryl, tạo ra sản phẩm là 1,3 - diphosphoglyxerat và phục hồi lại dạng ban đầu của phân tử enzym. Quá trình phản ứng gồm nhiều bước như sau: 193
(I)
R “ C—H
+ HS —Enzym
NAD+
o
OH
H (2)
R —c ~ S—Enz—NADH +H
R - i :-S - -E n z -N A D f
I] o
I
OH (3)
(4)
R - c ~ S -E n z NADH + NADf
R - C ~ S—Enz —NAD4 + NADH
li o
R -C -S -E n z -N A D
o + HO PCh ^
0
R-C-O-POj
+ H S -E n z-N A D
o
Một sô" tác giả đã phân lập được phức hợp axyl - enzym dưới dạng kết tinh sau khi cho enzym PGAĐ phản ứng vói 1,3 - diphosphoglyxerat hoặc axetylphosphat. Người ta đã chứng minh rằng, những phức hợp axyl - enzym này có những tính chất tương tự như những axylthioeste, có khả nãng phản ứng với hydroxylamin và tạo thành axit hydroxamic và cũng nhanh chóng bị khử bởi NADH2 để tạo thành aldehyt. Sau khi xử lý axyl - enzym bằng trypsin, người ta đã chiết xuất được axyl thioeste phân tử thấp, tính chất gần giống như S - axylgluthation. Một số tác giả đã xác nhận rằng, khi phospho glyxeraldehyt dehydrogenaza (PGAD) phản ứng vói axetylphosphat để tạo thành phức hợp axyl enzym đã làm cho sô' lượng các nhóm - SH tự do có thể phản ứng với paracloromercuribenzoat (pCMB) bị giảm đi, Phân tử PGAD có 11 đến 14 nhóm - SH, nhưng chỉ có 3 nhóm là thực hiện chức năng xúc tác, các nhóm —SH khác có lẽ tham gia vào sự duy trì hình dạng không gian hoạt động xúc tác của phân tủ enzym. Một sô tác giả đã chứng minh rằng, nhóm SH chức năng này là thuộc về glutathion trong thành phần cấu tạo của trung tâm hoạt động của enzym. Ngoài ra nhóm - SH có thể đổng vai trò của một nhóm tiếp nhận trong những phản ứng vận chuyển các gốc axyl, phosphat, aldehyt,... Trong glutathion reductaza, cơ chế tác dụng của nhóm - SH có thể thực hiện như sau: Enz - S H + G - S - S - G Enz - s - s - G + NADPH2
■» Enz —S —S —G + G - SH
» Enz - SH + G - SH + NADP Qua các phương trình ở trên ta thấy giai đoạn đầu của phản ứng đã tạo ra một disulfua hỗn hợp giữa enzym và cơ chất, sau đó disulfua này bị khử dưới tác dụng của NADPH2. 194
Trong trường hợp của papain và fixin là nhũng enzym thuỷ phân, nhóm - SH đã tạo nên liên kết thioeste - c o - của liên kết peptit bị bẻ gẫy: I c
C T .
Ò
R —
O
I
R _
(
I
Enz—SH + I— ►Enz—S—c = 0 + R —NH2 — ►Enz—SH + c = 0
N-H
I
I
R'
OH
s
Điều này đã được chứng minh với loại cơ chết R—C—NH—R'. Chất này tạo nên hợp chất trung gian dithioaxyl với enzym: R I R c=s _ ỉ Enz—SH + I— —► Enz—s —c = s + ĩt — NH, ỷ —H R' Chất trung gian này có quang phổ hấp thụ khác hẳn với quang phổ hấp thụ của enzym tự do. Tốc độ hình thành và phân huỷ của hợp chất đithiol cũng phù hợp với tốc độ xúc tác của sự hình thành sản phẩm. Trong điều kiện enzym oxy hoá, người ta nghĩ rằng, nhóm “-SH hoạt động” tham gia vào sự vận chuyển điện tử, như trưòng hợp lipoat axetyltransferaza. b) Đối với sự kết hợp cơ chất và cáe chất cộng tác của enzym Những nhóm - SH trong trung tâm hoạt động của enzym ngoài sự tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác, còn có thể tham gia vào sự kết hợp các cơ chất và các chất cộng tác của enzym. Tuy nhiên củng cần chú ý rằng, việc phân chia thành các nhóm hoạt động xúc tác và các nhóm kết hợp cơ chất và chất cộng tác chỉ là quy ước, cũng giông như việc phân chia trung tâm hoạt động của enzym thành những bộ phận phản ứng và bộ phận tiếp nhận. Vấn đề đáng chú ý là, sự tạo thành liên kết giữa các nhóm —SH và các nhóm chức năng khác của enzym vói một sô nhóm của phân tủ cơ chất và coenzym thường dẫn đến nhũng sự thay đổi này đã tạo điều kiện thuận lợi cho những phản ứng xúc tác của enzym. Ngày nay, ngưòi ta đã có bằng chứng để thừa nhận rằng, các nhóm - SH của enzym tham gia vào sự ỉiên kêt hợp cơ chất hoặc coenzym. Khi cho enzym kết hợp với cơ chất hoặc coenzym, có thể tránh cho enzym khỏi bị mất hoạt tính vì những chất độc thiolic trong khi nghiên cứu hệ thông sucxinat dehydrogenaza và phosphoglyxeraldehyt dehydrogenaza, Người ta đã chứng minh rằng, sucxinat và cả chất tương tự nó (malonat) đều có 195
khả năng bảo vệ nhóm —SH của sucxinat—dehydrogenaza khỏi bị tác dụng của các chất oxy hoá, các tác nhân alkyl hoá và cả những hợp chất asen hoá trị 3. Nhóm -SH chức năng của hàng chục enzym khác nhau được bảo vệ khỏi bị tác dụng của các thuốc thử, nhờ có cơ chất hoặc chầt tương tự cơ chất của chúng, ví dụ: sucxinat dehydrogenaza, malat dehydrogenaza, lactat dehydrogenaza, glutamat dehydrogenaza, alcohol dehydrogenaza, aldehyt dehydrogenaza, 3-phosphoglyxeric aldehyt dehydrogenaza, xytocrom oxidaza của D-axit amin, adenosin syntetaza, adenosin triphosphataza, reductaza của semi aldehyt glutaminic, glutamin synthetaza, ATP-creatin phosphotransferaza, homogenti sicaza. Cần chú ý rằng, tác dụng bảo vệ của cơ chất và coenzym đôi với hoạt tính của enzym trong một sô" trường hợp, có lẽ không hẳn là do sự bảo vệ nhóm -SH, mà là do tác dụng làm ổn định cấu trúc phân tử của enzym, hoặc cấu trúc của phức hợp enzym —cơ chất. Trong một sô" enzym, các nhóm -SH liên kết với cd chất hoặc coenzym gián tiếp qua một nguyên tử kim loại. Nghiên cứu những chế phẩm tinh khiết của prolín amino peptidaza (là một enzym thuỷ phân liên kết peptit được tạo nên do nhóm imin của prolin hoặc oxyprolin), người ta nhận thấy rằng, enzym này hầu như hoàn toàn m ất hoạt tính khi thiếu các ion Mn2+. Hoạt tính của enzym này bị ức chế rõ rệt bỏi pCMB và có thể được phục hồi khi cho thêm xystein hoặc glutathion. Enzym này cũng bị ức chế khi ủ với iodo axetamit và không có m ặt ion Mn2+, nhưng khi có m ặt các ion này, iodo axetamit hầu như không có ảnh hưõng đến hoạt tính.của prolin amino peptidaza. Với những kết quả nghiên cứu thu được, ngưòi ta đã giả thuyết rằng, ion Mn2+ kết hợp với nhóm —SH chức năng của trung tâm hoạt động của enzym và bảo vệ nó khỏi tác dụng của iodo axetamit, nhưng không ngăn ngừa được tác dụng của pCMB. Một số tác giả để nghị sơ đồ phức hợp enzym —cơ chất của enzym này với cơ chất là glyxin —L prolin như trong Hình 5.33. p R 0 T H2C ' ' c " N — Mn2+— s E H2C — C H b \ / 1 CO N Hỉnh 5.33. Phức hợp glyxin-L-prolin
196
Theo sơ đồ trên đây, ta thấy nhóm —SH của prolin amino peptidaza (enzym cần Mn2+) có chức năng tạo nên những cầu nối mercapsit để kết hợp vói cơ chất và đặc biệt để hoạt hoá cơ chất. Người ta cũng đã chứng minh về vai trò của nhóm -SH trong việc kết hợp với Zn2+ trong trường hợp của cacboxypeptidaza và có thể cả trong trường hợp của phosphataza kiềm. Ion kim loại được kết hợp qua hên kết mercaptit vói lưu huỳnh, có khả năng tạo thành những liên kết phối trí bổ sung vái nhóm chức năng khác của phân tử protein như nitơ, cacboxyl,... Trong trường hợp cacboxypeptidaza, ion Zn2+ kết hợp với nhóm -SH của xystein và nhóm alpha amin của gốc asparagin N - tận cùng. Do đó, ion này có thể vừa thực hiện chức nãng xúc tác, vừa tham gia vào việc tạo ra những liên kết giữa nhũng bộ phận, hoặc giữa các đdn vị cấu tạo của phân tử protein, bảo đảm cho việc duy trì cấu trúc không gian hoạt động của enzym. c) Vai trò của nhóm -S H với 8ự duy trì cấu trúc không g ia n hoat đông của enzym Khi khoá các nhóm -SH bằng những thuốc thử tạo mercaptit sẽ gây ra những biến đổi cấu trúc bậc ba và bậc bốn của một số protein và enzym, Khi khoá các nhóm -SH trong phân tử dehydrogenaza của 3 phosphoglyxeric aldehyt và phân tử aldolaza bằng pCMB đã làm tăng độ nhớt và làm thay đổi tính quang hoạt của những dung dịch các enzym này, đồng thời cũng làm tăng tính nhạy cảm của các enzym này đối với tác dụng của các proteinaza. Như vậy, ta thấy rằng, khi khoá các nhóm -SH của enzym đã gây ra những biến đổi về cấu trúc phân tỏ của chúng giông như những biến đổi xảy ra trong quá trình làm biến tính protein. Người ta cũng đã nghiên cứu tác dụng của pCMB đối với phosphorylaza và thấy rằng, chất này không chỉ ức chế hoàn toàn hoạt tính của enzym mà còn ngăn cản sự phân ly thuận nghịch của phân tử enzym này thành những đơn vị nhỏ. Hiện nay, nhiều tác giả thừa nhận rằng, nhóm -SH tham gia vào việc tạo thành một loại liên kết cộng hoá trị nội phân tủ, gián tiếp qua ion kim loại, nghĩa là những liên kết mercaptit đối vối việc duy trì cấu trúc phân tử của một sô' enzym cần kim loại như glutam at dehydrogenaza, alcohol dehydrogenaza,... Trong trường hợp của alcohol dehydrogenaza, ngưòi ta đã chứng minh rằng, các ion Zn2+đã tạo thành những liên kết mercaptit kết hợp với các đơn vị câu tạo nhỏ thành phân tử enzym lán có hoạt tính xúc tác. Tuy nhiên, một số’ tác giả lưu ý rằng, sự biến đổi cấu trúc của các 197
phân tử enzym xảy ra khi khoá các nhóm —SH chức năng của chúng nói chung không thể coi là những bằng chứng của sự tham gia trực tiếp của các nhóm -SH trong sự tạo thành cấu trúc đặc hiệu của phân tủ enzym, bởi vì những biến đổi lớn trong cấu trúc phân tử protein thường chỉ xảy ra khi khoá những nhóm -SH “khó phản ứng”, hoặc “khó đạt tới”, hơn nữa, những sự biến đổi này không xảy ra tức thì ngay khi tiến hành khoá các nhóm -SH, mà chỉ xảy ra sau một thời gian thích hợp nào đó. Đe giải thích vấn đề này, một số tác giả giả thuyết rằng, sự khoá các nhóm -SH “khó phản ứng” thường xảy ra chậm là do các trở ngại vể không gian. Những sự trở ngại này có thể thay đổi và dược khắc phục dần theo nhũng sự thay đổi nhỏ về cấu trúc không gian của phân tử enzym, sau một thài gian nhất định phản ứng mới đủ điều kiện để xảy ra. Việc khoá các nhóm -SH này sẽ ngản cản phân tử enzym trở lại trạng thái cấu trúc không gian ban đầu, làm m ất tính chất ổn định của phân tỏ enzym mà dẫn đến sự biến tính. Như vậy, người ta thấy rằng, có rấ t nhiều cách giải thích khác nhau về những biến đổi cấu trúc không gian của các phân tử protein và enzym khi khoá các nhóm -SH của chúng. 5.10.7. Vai trò của các nhóm disulfua trong phân tử enzym
Tính phản ứng của các nhóm - s - s trong phân tử protein cũng như những nhóm —SH sẽ tuỳ thuộc vào những yếu tố lập thể và ảnh hưởng tĩnh điện của các nhóm phân cực ở gần kề và thưòng thay đổi trong một giối hạn khá rộng. Nhũng biến đổi thuận nghịch về cấu trúc không gian của phân tử protein xảy ra khi thay đổi pH của dung dịch, cũng có ảnh hưỗng rõ rệt tới tính phản ánh của nhóm s - s. Khi làm biến tính protein, tính phản ứng của nhũng nhóm s - s của chúng cũng thườiig tăng lên đáng kể. Một sô" tác giả chứng minh rằng, khi xử lý pepsin nguyên thuỷ vốn có 3 liên kết —s - s - bằng mercaptoetanol ở môi trường pH - 5,0 - 6,0 thì thấy xảy ra hiện tượng khử 2 liên kết - s - s. Liên kết disulfua thứ ba chỉ bị khỏ khi có mặt ure với nồng độ 8 mol, hoặc guanidin với nồng độ 3 —4 mol. Khi phân ly các liên kết —s —s trong phân tỏ pepsin cũng như một sô' enzym khác như trypsin, chymotrypsin, ribonucleaza,... đã làm cho các enzym này m ất hoạt tính. Điểu đó được coi là một dấu hiệu về vai trò của các liên kết —s —s trong việc duy trì cấu trúc bậc ba của phân tử enzym để bảo đảm hoạt tính xúc tác của chúng. So với các nhóm - SH, khả năng phản ứng của các nhóm - s —s —kém hơn rõ rệt, vì thế vai trò của các nhóm này trong phân tử protein của enzym chủ yếu là chức năng tĩnh, tham gia vào việc 198
duy trì cấu trúc không gian của chúng. Các liên kết - s - s - là những liên kết đồng hoá trị duy nhất làm ổn định cấu trúc bậc ba của một số protein và enzym (ngoài nhũng liên kết càng cua với sự tham gia của các ion kim loại). Tuy nhiên, người ta cũng chứng minh rằng, các nhóm - s - s - trong một số enzym oxy hoá, ngoài chức năng bảo đảm cấu trúc phân tử của enzym, còn đồng thòi có thể thực hiện chức nàng trực tiếp tham gia vào các hoạt động xúc tác. Người ta nhận thấy nhóm - s - s — trong trung tâm hoạt động của enzỵm lipoamit dehydrogenaza tham gia vào việc duy trì cấu trúc không gian của phân tử enzym, đồng thời có khả năng bị khử thuận nghịch, thành hai nhóm -SH khi cho enzym này tác dụng với cơ chất dihydrolipoat (dihydrolipoamit) hoặc với coenzym NADHg. Sự khử này là giai đoạn trung gian của quá trình chuyển điện tử và proton từ cơ chế đến chấp nhận. Cơ chế tác dụng của lipoamit dehydrogenaza có thể hình dung theo sơ đồ trong Hình 5.34: Lip(SH);
LipSj
s
s FADH+
Hình 5.34. Cơ chế tác dụng của lipoamit dehydrogenaza
Lip {SH)j và Lip s 2: Những dạng khử và dạng oxy hoá của cơ chất lipoat hoặc lipoamit. Những chữ số La Mã chỉ thứ tự của phân tử.
CÂU HỎI ÔN TẬP
1. Sự tạo thành phức hợp giũa enzym và cơ chất là như thê nào? 2. Những cơ chất hoá học của quá trình làm bền hoá trạng thái chuyển tiếp. 3. Năng lượng nào xúc tác phản ứng và tạo tính đặc hiệu phản ứng. 4. Vai trò của các nhóm chức năng trong các phản ứng enzym. 199
Ị
Chương 6
THỰC NGHIỆM ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM í
6.1. C Á C PH ÉP ĐO VẬN TỐC BAN ĐẦU 6.1.1. Các phướng pháp nghiên cứu trực tiếp, gián tiếp và Kết hợp
!
Để đo được tốc độ của một phản ứng, cần phải theo dõi tín hiệu sự hình thành sản phẩm hoặc sự mất cơ chất trong phản ứng đổ. Tín hiệu để theo dõi thưòng khốc nhau tuỳ từng phương pháp nhưng thông thưòng dựa vào một sô" đặc điểm hoá lý của cơ chất hoặc sản phẩm, và/hoặc khả năng phân tách của cơ chất ra khỏi sản phẩm. Nhìn chung, hầu hết các phương pháp enzym dựa vào một hoặc một sô' phương thức phát hiện và phân tách các chất, phụ thuộc vào phản ứng: Phổ quang học; Phương pháp ảnh phân cực; Phổ phóng xạ hoạt động; Phân tách điện di; Phân tách sắc ký; Phản ứng miễn dịch. Các phương pháp này có thể được sử dụng trong phép đo trực tiếp: đo trực tiếp nồng độ cơ chất, hoặc sản phẩm như một hàm số theo thời gian. Ví dụ: enzym xytocrom c oxidaza xúc tác cho phản ứng oxy hoá protein xytocrom c chứa nhóm hem ở dạng khử (ion sắt), xytocrom c hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 550nm và bị giảm cường độ đáng kể khi bị oxy hoá bối oxidaza, Ta có thể đo sự thay đổi hấp thụ ánh sáng tại 550nm của dung dịch xytocrom c như là một hàm sô* theo thòi gian sau khi cho thêm xytocrom c oxidaza; sự giảm cường độ hấp thụ ánh sáng tại 550nm quan sát được là phép đo trực tiếp cho sự giảm nồng độ cơ chất.
^J
Bước sóng (nm)
(bj
Thài gian (giây)
Hỉnh 6.1. (a) Độ hấp thụ của ferroxytocrom c là một hàm theo số thời gian sau khi thêm enzym xytocrom c oxidaza. Khi sắt của xytocrom c bị oxy hoá bỏi enzym, sự hấp thụ ánh sáng tại 550nm glẳm; (b) đổ thị sự hấp thụ ánh sáng tại 550nm là hàm số theo thời gian. Chú ý rằng, lúc mới phần ứng (<10% cơ chất được biến đổi), đổ thị là một đường thẳng. Do đó, tốc độ phản ứng có thể được tính theo độ dốc của một hàm tuyến tinh.
200
Tuy nhiên, trong một sô trường hđp, cơ chất và sản phẩm của một phản ứng enzym không cho ta một tín hiệu rõ ràng để đo nồng độ của chúng. Thông thường, sự hình thành sản phẩm thường đi đôi với một sản phẩm khác, không phải enzym, ta sẽ phải sử dụng các phương pháp gián tiếp. Dihydroorotat dehydrogenaza (DHODaza) là một ví dụ về phương pháp đo gián tiếp. Enzym này xúc tác cho phản ứng biến đổi dihydroorotat thành axit orotic với sự có mặt của coíactơ ubiquinon. Trong quá trình phản ứng, các electron tạo ra bởi sự biến đổi dihydroorotat thành axit orotic được chuyển cho cofactơ ubiquinon để tạo thành ubiquinol. Rất khó để đo trực tiếp phản ứng này, nhưng sự khử ubiquinon cô thể đi đôi với các phản ứng khử không có enzym. Một số chất nhuộm có hoạt tính oxy hoá khử dược biết đến do có thể đổi màu khi bị oxy hoá hoặc khử. Trong số đó, 2,6 diclorophenolindophenol (DCIP) là một chất nhận có hoạt tính trong phản ứng DHODaza. ở dạng oxy hoá, DCIP bị khỏ bởi ubiquinol, chất được hình thành trong suốt quá trình xúc tác của DHODaza. Do đó, có thể xác định được sự biến đổi bằng cách xác định lượng DCIP có trong dung dịch cơ chất (dihydroorotat) và cofacta (ubiquinon), sau đó dựa theo sự giảm nồng độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 610nm theo thời gian sau khi thêm enzym cho đến khi phản ứng bắt đầu. Một cách thứ ba dựa theo diễn biến của một phản ứng xúc tác enzym lồ một phương pháp nghiên cứu kết hợp, những phản ứng enzym này thường đi kèm vối một phản ứng enzym thứ cấp có thể đo được dễ dàng. Trong một nghiên cứu kết hợp thông thường, sản phẩm của phản ứng enzym lại là cơ chất của phản ứng kết hợp. Một ví dụ cho phép tính này là xốc định hoạt tính của hexokinaza, enzym xúc tác đổ hình thành glucoza—6-phosphat và ADP từ glucoza và ATP. c ả cơ chất lẫn sản phẩm của phản ứng này đều không thể cung cấp dữ liệu để xác định được hoạt tính của enzym này. Mặc dù thế, sản phẩm glucoza-£phosphat lại là cơ chất của glucoza-6-phosphat dehydrogenaza với sự có mặt của NADP\ chuyển phân tử này thành 6-phosphogluconolacton. Trong phản ứng thứ hai, NADP+ bị khử thành NADPH và sự khử cofaetơ này có thể được đo đạc tính toán dễ dàng tại bước sóng 340nm. Có thể biểu diễn ví dụ này theo sơ đồ: A — S- » B —
c
Ở đây, A là cơ chất của phản ứng cần tính toán, Vị là tốc độ phản ứng, B là sản phẩm của phản ứng cần tính toán và lại là cơ chất cho 201
phản ứng kết hợp; v2 là tốc độ của phản ứng sau. c là sản phẩm của phản ứng kết hợp, có thể đo được dễ đàng. Mặc dù ta đo c nhưng kết quả CUỐI cùng lại là Vj. Để tính được phép tính này, ta phải có điều kiện giới hạn cho tốc độ Vj (ví dụ Vj « V g ) và B đ ạ t tối nồng độ ở trạ n g thái cân bằng. Trong điều kiện này, lượng B chuyển thành c là không đổi và tốc độ sản xuất c thể hiện tốc độ V j . Tuy nhiên, tốc độ đo được sẽ nhỏ hơn tốc độ Vi tại trạng th ái cân bằng, cho đến khi nồng độ [B] đ ạt tói nồng độ trạng thối cân bàng.
Thời gian (phút) Hình 6.2. Số liệu thông thường cho một phản ứng enzym Kết hợp
Do đó, trong một nghiên cứu kết hdp, sẽ có một pha chậm trước khi đạt trạng thái cân bằng tạo ra c (Hình 6.2); điểu này có thể làm sai kết quả tính vận tốc ban đầu. Do dó, để xác định được tốc độ ban đầu thực của phản ứng quan tâm, điều kiện đưa ra là phải tôi thiểu hoá tối đa pha chậm và phải đảm bảo rằng, tốc độ đo được phải là tốc độ của pha cân bằng. Tốc dộ phản ứng kết hợp v2, theo dạng đơn giản của động học Micheaỉis - Menten là: V - V;[BJ 2 K*[B]
(6.1)
Trong đó K2m là hằng số Michealis - Menten cho enzym E2. Đoạn đầu của phản ứng, V , là không đổi với nồng độ E] nhất định. Do đó, tốc độ tạo ra B là: dt
= V l- V 2 = Vl--
1 -»
V2[B]
1 K*[B]
(6.2)
Phương trình (6.2) được tính bối Stoner và Cornish Bowden (1974), 202
tác giả đă cho rằng, thời gian để [B] đạt tới một lượng tại nồng độ trạng thái cân bằng [B]ss có thể tính theo phương trình: (bKĨ, ^99%— m ,
(6.3)
Bảng 6.1. Giá trị 0, đối với [BJ = 99%[B]„ có ích trong thiết kê' nghiên cứu kết hợp
v,/V2 0,1 0,2
0,54 1,31
0,3 0,4
2,42 4,12
0,5
6,86
0
0,6
11,70
0,7
21,40
0,8
45,50
0,9
141,00
Nguồn: Được chuyển thể tử storer và Cornish-Bowden (1974)
Trong đó, t99%là thời gian để [B] đạt tới 99%[B]88và 0 là một giá trị không đdn vị, phụ thuộc vào tỷ lệ v,/V2 và Va/Vj. Trong Chương 5 đã để cập, vận tôc tối đa V2 là kết quả của kxlk tảc và nồng độ enzym kết hợp [E2]. Các giá trị kxúc tác và Km cho phản úng kết hợp là không đổi, và không thể xác định được nếu có sự thay đổi các điều kiện phản ứng. Tuy nhiên, tốc độ tối đa V2 có thể được điểu chỉnh bỏi các nhà nghiên cứu bằng cách thay đổi [E2]. Do đó, vỗi các giá trị [E2] khác nhau, ta có thể thay đổi v 2, tỷ lệ V|/v2 cũng có thể thay đổi, do đó có thể điều chỉnh được thòi gian pha chậm của phản ứng kết hợp. Có thể nói rằng, chúng ta có thể đo tốc độ Vj ở trạng thái cân bằng thực sau khi [B] đạt tới 99%[B]as. Nhưng cần bao lâu để đạt tói nồng độ ỊB]sa này? Có thể tính toán thời gian này từ phương trinh (6.3) nếu biết các giá trị Vj và 0 . Storer và Cornish - Bowden đã đưa ra tỷ số' v,/V2 cho các giá trị 0 khác nhau. Bảng 6.1 đưa ra một sô' giá trị 0 khác nhau để [B] đạt tới 99%[B]3S. Tỷ lệ này thường được coi là tối ưu để tính V! trong một nghiên cứu kết hdp. Trong một sô' trường hợp, yêu cầu này là không cần thiết. Ví dụ: [B] - 90%[B]Mcó thể đủ để sử dụng tính cho một nghiên cứu kết hợp trong các phân đoạn cột với sự có mặt của enzym cần quan tâm. Trong những trưòng hợp này, chúng ta không dùng các tham số động học thông thường để tính toán nồng độ enzym sơ cấp. Có thể tìm 203
hiểu kỹ hơn trong bảng gốc của Storer và Cordish —Bowden (1974) để tham khảo thêm các bảng giá trị 0 vói tỷ lệ [B]Mkhác nhau. Chúng ta sẽ lấy một ví dụ minh hoạ làm th ế nào mà các giá trị trong Bảng 6.1 có thể được sử dụng trong nghiên cứu kết hợp. Giả sử rằng, chúng ta coi nồng độ enzym quan tâm ở trạng thái cân bằng vôi tốc độ Vj là 0,lmM /phút và giá trị Km của enzym kết hợp là 0,2mM. Chúng ta sẽ tíĩih tốc độ sau mỗi 5 phút. Pha chậm sẽ là một phần nhỏ của thời gian đo, « 0,5 phút. Vậy giá trị v 2 chúng ta cần để đạt tới điều kiện phép tính này là bao nhiêu? Từ phương trình (6.3) ta có: (6 .4 )
Sắp xếp lại chúng ta thấy là 0 = 0,25. Từ Bảng 6.1 giá trị của 0 yêu cầu là V}/V2 < 0,1 vi chúng ta biết V! = O.lmM/phút, V2 phải » lmM/phút. Nếu chúng ta có thời gian để đo kjnie tóc và Kmcho phản ứng kết hợp, từ đó tính được [E2] cần để đạt tới V2. Easterby (1973) và Clelanđ (1979) đã đưa ra một phương pháp hơi khác một chút để tính trong khoảng thòi gian pha chậm trong một phản ứng kết hợp. Từ những xử lý của họ, chúng ta thấy rằng, vái các điều kiện ban đầu (ví dụ như [B]^ « K ^ ) , chúng ta có thể viết: (6.5) và
(6.6)
Ỏ đây Xthời gia pha chậm,
Thời gian để [B] đạt tới [B]M là phụ thuộc lũy thừa vổi c, vì thế ỊB] = 92%[B]m tại 2,5x; 95%[B]B9 tại 3x và 99%[B]B8 tại 4 , 6 t (Easterby, 1972). Sự hình thành sản phẩm c là một hàm của thòi gian, phụ thuộc vào vận tốc ban đầu V] và thòi gian chậm X như sau: [ỢỊ = V y ( t + xe“ƯT- t) (6 .7 ) Để minh hoạ cho ứng dụng của phương trình (6.6), hây xem xét ví dụ sau đây: giả sử ràng enzym kết hợp có Kffl cho cơ chất B là lOmM và kxúctác = lOOs-1. Chúng ta muôn tạo ra một phép tính để đạt tới 99%[B]M trong 20s đầu tiên của thòi gian phản ứng. Để đạt được 99%[B]ae cần 204
4,6t, do đó, T - 20s/4,6 - 4,3s. Gắn vào phương trình (6.6), chúng ta có thể tính được v z để có thời gian chậm có thể là 2,3mM/s, Chia cho kKÚCtác (100s'1), ta có được nồng độ enzym kết hợp cần là 0,023mM hay 23nM. Nếu có nhiều hơn một enzym được sử dụng trong các bước kết hợp, tổng thời gian chậm cố thể tính S(K^,/Vị). Ví dụ: nếu 1 người sử dụng 2 enzym kết hợp A và B trong phản ứng quan tâm thứ nhất, tổng thòi gian chậm là: KA T =
V
Kb +
A
V
(6 -8 ) B
Bởi vì các phản ứng kết hợp thường có nhiều enzym, các phép tính này ẩn nhiều vấn đề không giông như các phép tính trực tiếp hay gián tiếp. Ví dụ: để có được số liệu có ích cho một enzym quan tâm trong các nghiên cứu kết hợp, cần phải có điểu kiện giối hạn tốc độ phản ứng trong các điểu kiện phản ứng. Hơn nữa, bất kỳ sự thay đổi tốc độ có thể làm thay đổi các điều kiện phản ứng và có thể không phản ánh đúng giá trị enzym đích. Ví dụ: để sử dụng một sơ đồ phản ứng kết hdp để tính tác và K„ cho một phản ứng sd cấp quan tâm, cần phải chắc chắn rằng Vj được giới hạn trong giá trị [A] cao nhất (cơ chất của enzym quan tâm). ứ n g dụng của phép kết hợp để nghiên cứu sự ức chế enzym sơ cấp có thể cũng gây rắc rối. Sự có mặt của nhiều enzym có thể dẫn đến sai số. Ví dụ: enzym nào thực sự bị ức chế? Tuy nhiên, Easterby nhấn mạnh nghiên cớu kết hợp có thể để phân biệt dễ dàng sự có các chất ức chế và enzym sơ cấp và enzym kết hợp. Các chất ức chế enzym sơ cấp có thể ảnh hưỏng tới tốc độ trạng thái cân bằng Vi (Hình 6.3a), trong khi đó các chất ức chế enzym kết hợp lại có thể kéo dài pha chậm mà không ảnh hưỏng Vj (Hình 6.3b). Trong thực nghiệm, những khác biệt này là rõ rệt chỉ khi chúng ta tiến hành đo sự hình thành sản phẩm qua thời gian của cả pha chậm và pha cân bằng trong đường cong diễn biến (Hình 6.3). Rudolph và cộng sự (1979), Cleland (1979) và Tipton (1992) thảo luận khá chi tiết về enzym kết hợp, 6.1.2. Phân tích các đường cong diễn biến bằng cách đo tốc độ trong trạng thái cân bằng
Ở Chương 4, chúng ta đã giối thiệu các đường cong diễn biến sự giảm cd chất và hình thành sản phẩm trong suốt quá trình xúc tác enzym (Hình 4.1, 4.2). Chúng ta đã cho rằng, cả sự m ất cơ chất và hình thành sản phẩm tuân theo động học. Đường cong diễn biến đầy đủ của 205
một phản ứng enzym có nhiều thông tin động học. Qua đường cong diễn biến, tốc độ chính là sự thay đổi nồng độ cơ chất. Do đó, qua đường cong diễn biến, tốc độ tức thời được tính theo tốc độ ban đầu và nồng độ cơ chất tức thòi tại thòi điểm đó. Các chương trình máy tính thường cung cấp các phương pháp tính đạo hàm của các điểm số’ liệu từ đồ thị y theo X . Từ đó ta có thể tính dược vận tốc tức thời: (v = d[P]/dt = d[SJ/dt) khi lấy đạo hàm từ đưòng cong diễn biến enzym tại mỗi thời điểm vận tốc tức thời được xác định. Giá trị [S] tức thòi có thể được xác định và vì thế vận tốc tức thòi có thể đưa về là hàm sô" của [S]. Đồ thị này có hình hypecbol và có thể tương ứng vói phương trình Michealìs —Menten để tính kjoic lAc và Km từ đường cong đơn giản. Những phưdng pháp này và những hạn chê của nó được mô tả bởi khá nhiều tác giả (Cornish Bowden, 1972; Duggleby và Morrison, 1977; Waley, 1982; Kellershohn và Laurent, 1985; Duggleby, 1985, 1994). ứng dụng của phép phân tích đưòng cong diễn biến đầy đủ đã không phổ biến bỏi vì đạo hàm của đường cong là không đơn giản cho đến khi máy tính được sử dụng rộng rãi và bởi vì một vài vấn đề liên quan, phương pháp chúng ta vừa nói trên chỉ được tham khảo trong tài liệu.
Hình 6.3. Ảnh hưỏng của các chất ức c h ế lên phản ứng enzym kết hợp Các chấm tròn là các điểm số liệu đối với enzym khi không có chất ức chế; các chấm hình vuông là các điểm số liệu khi có chất ứd chế ở nồng độ xác định; (a) Ảnh hưởng của chất ức chế của enzym sơ cấp quan tâm: pha chậm không bị anh hưởng nhưng tốc độ trạng thái ổn định (độ dốc) được giảm; (b) Ảnh hưởng của chất ức chê' của enzym kết hợp: pha chậm được kéo dài, nhưng tốc độ trạng thái ổn định không bị ảnh hưởng.
Như chúng ta đã mô tả ở Chương 4, đạo hàm của đường cong diễn biến, sự tạo thành sản phẩm và m ất đi cơ chất là tuyến tính theo thòi gian, vì thế tốc độ có thể được tính từ độ dốc của đồ thị. Phần còn lại của chương này, phần thảo luận của chúng ta chỉ giới hạn để đo tại các thời điểm sớm này, vì thế chúng ta gọi vận tốc ban đầu. 206
Mặc dù rấ t cần thiết để xốc định đưòng cong diễn biến đầy đủ cho một phản ứng enzym, ít nhất tại một vài sự kết hợp của enzym và các nông độ cơ chất, đê chăc chắn rằng, hệ thông được tiến hành tốt, phản ứng diễn ra tôt (nghĩa là [P]„ = [S]o) và phép đo là chuẩn trong suốt pha cân bằng của phản ứng. Đường cong diễn biến cho phản ứng enzym hiệu quả có thể được biểu diện như Hình 5.1. Có thể chia thành một số' khoảng thài gian, đoạn đầu phản ứng, khi sự giảm cơ chất và tạo thành sản phẩm tuyến tính với thời gian. Khi phản ứng diễn ra, ta có thể thấy đường cong xuất hiện. Trong một số trưòng hợp, một pha chậm có thể xuất hiện trước pha tôé độ ban đầu tuyến tính của đường cong diễn biến. Điều này xảy ra trong nghiên cứu enzym kết hợp, đã đề cập ở trên. Pha chậm có thể xuất hiện bâi nhiều nguyên nhân khác. Nêu enzym được bảo quản cùng với sự có mặt của một chất ức chế thuận nghịch, đôi khi có thể đòi hỏi sự hoà tan hoàn toàn chất ức chế sau khi pha vào hỗn hợp phản ứng. Do đó, pha chậm có thể xuất hiện trưốc trạng thái cân bằng (xem Chương 6, mục 6.3). Ngược lại, nếu enzym được bảo quản ở một nỗng độ dẫn tới sự oligo hoá, mà chỉ có dạng enzym mono mới hoạt động, một pha chậm cũng có thể xuất hiện, phản ánh tốc độ hoà tan enzym oligomer thành enzym monome. Pha chậm cũng có thể xuất hiện khi nhiệt độ hoá chất không được kiểm soát tốt (mục 6.4.3). Pha trạng thái cân bằng tuyến tính của một phản ứng nhanh, như được đề cập trong Chương 5, vâi phản ứng chymotrypsin xúc tác thuỷ phân nitrophenyletyí cacbonat (Hình 5.5). Động học pha bùng iiổ đột ngột được quan sát ở một vải enzym bởi nhiều nguyên nhân. Đầu tiên sự ức chế một số' sản phẩm có thể xảy ra, do đó sau một vài biến đổi hình thành một phức hợp EPS bậc ba sẽ làm cho phản ứng thuỷ phân có tốc dộ chậm hơn khi ở dạng phức hợp đôi. Vì thế, tại thời điểm rất sớm, tốc độ tạo thành sản plìẩm tương ứng với tốc độ không ức chế của phản ứng enzym, nhưng sau một khoảng thời gian ngán, tốc độ thay đổi theo phức hỢp ESP. Mội nguyên nhân thứ hai của động học bùng nổ, sự thay đổi cấu tạo phụ thuộc thời gian của cấu trúc enzym khi có cơ chất bám vào. 0 đây enzym có mặt ở dạng hoạt tính cao nhưng lại chuyển thành dạng ít hoạt tính hơn khi ESP hình thành. Nguyên nhân thứ ba, tốc độ phản ứng tổng thể có thể bị giới hạn bởi sự giải phóng chậm sản phẩm từ phức hợp EP. Cuối cùng, có thể là chung nhất, nguyên nhân của động học bùng nổ là phản ứng nhanh của enzym và cơ chất để tạo thành dạng trung gian, làm chậm sự phân ly thành sản phẩm. Enzym như serin proteaza có cơ chê phản ứng trải qua sự hình 207
thành một dạng trung gian, thường xảy ra động học bùng nổ bôi vi phản ứng tổng thể có tốc độ bị giới hạn bởi sự phân ly dạng trung gian. Khi nó xảy ra, dạng trung gian tập trung hình thành nhanh chóng (nghĩa là trước khi tốc độ trạng thối cân bằng được xác định) tới một nồng độ bằng với phân tử enzym hoạt động trong mẫu. Với các enzym có pha bùng nổ do hình thành dạng trung gian, nồng độ enzym hoạt động trong một mẫu có thể được xác định theo giá trị bị chắn của đường thẳng theo số liệu phần trạng thái cân bằng trong đường cong diễn biên. Ví dụ; quay lại Hình 5.5, chúng ta thấy rằng, phản ứng diễn ra tại nồng độ chymotrypsin là 8, 16, 24, và 32^M. Đường thẳng đồ thị tương ứng với sô" liệu trạng thái cân bằng có giả trị đoạn chắn y tương ứng là 5, 10, 15, và 20^M. Do đó, tỷ lệ của giá trị đoạn chắn y vói nồng độ enzym cho vào là không đổi: 0,63, nghĩa là 63% phân tử enzym trong m ẫu ở trạng thái xúc tác. Phương pháp này gọi là chuẩn độ vị trí hoạt động, có thể là công cụ hữu ích để xác định nồng độ enzym hoạt động. Tuy nhiên có nhiều vấn đề còn thắc mắc trong khi sử dụng phưdng pháp chuẩn độ vị trí enzym hoạt động. Thứ nhất, chúng ta phải chắc chắn rằng, pha bùng nổ là do nguyên nhân hình thành dạng trung gian. Thứ hai, đoạn chắn y phải lớn hơn 0 để tính được. Nghĩa là nồng độ của enzym yêu cầu cho các phương pháp này là cao hơn nhiều so với các phương pháp enzym thông thưòng. Phương pháp 80 màu hoặc huỳnh quang thường lượng Ịimol của enzym để quan sát một pha bùng nổ đáng kể lượng enzym cần để thêm vào có thể giảm khi sử dụng phương pháp phát hiện bức xạ. Thậm chí, ta chỉ cần yêu cầu nồng độ enzym ở mức cao nmol hoặc mức thấp Ịamol. Cuôì cùng, biên độ của bùng nổ không đem lại phép đo chuẩn xác nồng độ enzym hoạt động nếu các tốc độ bùng nổ và tốc độ pha cân bằng khác nhau không đáng kể. Sơ đồ đơn giản nhất có thể được biểu diễn như sau: E +
NE S ^ p - >
E - I
e
+ P2
P1 Fersht (1985) đã chỉ ra rằng, biên độ bùng nổ (nghĩa là giá trị đoạn chắn y ứng vói sô' liệu trạng thái cân bằng Hình 6.4) có thể được mô tả như sau: * = [E]
2
k 2 + k3,
(6.9)
Trong đó 71 là biên độ bùng nổ. Từ phương trình (6.9) ta có thể thấy rằng, nêu k3« k2, hằng số tốc độ sẽ giảm về 1, vì thế 71 = [E]. Tuy nhiên, nếu k3 là không đáng kể so với k2, chúng ta sẽ tính 7t theo [E]. Do dó, các 208
nồng độ enzym hoạt động xác định từ chuẩn độ vị trí hoạt động trong một số trường hợp có giới hạn thấp hơn nồng độ enzym hoạt động thực. Sự phức tạp này có thể tránh khi sử dụng các cơ chất có thể tạo thành dạng thuận nghịch so với enzym (nghĩa là các cơ chất có k3 = 0). ứng dụng của các cơ chất cho chuẩn độ vị trí enzym hoạt động đã được Schobaum và cộng sự đề cập (1961) và nhiều tài liệu khác như của Silverman (1988) cũng rấ t quan trọng để chắc chắn rằng, phản ứng diễn ra tới khí [P] = [Sjo, nồng độ sản phẩm đạt tới nồng độ cơ chất ban đầu. Enzym, cơ chất hoặc cả hai có thể không bền trong các điều kiện của phản ứng, có thể dẫn tới sự kết thúc sớm phản ứng (xem mục 6.6). Sự có mặt của một chất bất hoạt enzym hoặc một chất ức chế liên kết chậm, có thể làm cho phản ứng có điểm cong hoặc dừng trước khi biến đổi hoàn toàn cơ chất (xem Chương 9). Trong một số trường hợp, sản phẩm được tạo thành bởi phản ứng enzym có thể tự liên kết với enzym để tạo nên sự ức chế. Khi sự ức chế sản phẩm đáng kể như thế, thì sự tạo thành sản phẩm trong suốt đưòng cong diễn biến có thể dẫn tới sự kết thúc sớm phản ứng. Cưôì cùng, các hạn chế trong phương pháp phát hiện được sử dụng trong một phép đo có thể hạn chế khoảng nồng độ mà ô đó có thể đo được sản phẩm tạo thành. Một ví dụ đặc biệt được thảo luận ở phần sau trong chương này. Nhìn chung, trước khi phân tích chi tiết bằng cách đo tốc độ ban đầu, điều quan trọng là phải thiết lập đường cong diễn biến đầy đủ của phản ứng enzym trong điểu kiện tốt nhất.
Hình 6.4. Ví dụ vò' đường cong quá trình đối với sự giải thích động học pha bủng nổ enzym
Đuỡng thảng ngắn miêu tả sự thích hợp đường thẳng của số liêu pha trạng thái ổn định của phản ứng; đường chặn y là thích hợp cho sự đánh giá 71 được xác định ở đây và trong các tài liệu tham khảo. Đường cong liền miêu tâ sự thích hợp tốt nhất của đuởng cong thài gian toàn bộ phương trình đối với quá trình động học hai bước [P] = 7t[1 - exp(-k„t)l + vMt
209
Nếu thí nghiệm đã bắt đầu, trong đoạn đầu của đường cong diễn biến, nồng độ cơ chất và sản phẩm là tuyến tính theo thời gian và qua đây ta sẽ xác định được tốc độ ban đầu. Tất nhiên, thời gian của pha tuyến tính này phải xác định một cách kinh nghiệm và nó khác nhau trong các điều kiện thí nghiệm khác nhau. Sẽ là phiến diện nếu cho rằng, tổng thời gian để tốc độ phản ứng được xác định thể hiện sự tuyến tính rõ ràng trong các điều kiện thí nghiệm tiến hành. Các thay đổi trong nồng độ enzym hay cơ chất, nhiệt độ, pH và các điều kiện dung dịch khác có thể làm thay đổi pha tuyến tính đáng kể. Chúng ta không thể cho rằng, một phản ứng là tuyến tính trong một khoảng thòi gian thì sẽ tuyến tính trong khoảng thời gian đó khi điều kiện thí nghiệm khác. 6.1.3. Phép đo liên tục chống lại điểm cuối
Khi một khoảng thòi gian tuyến tính nhất định được thiết lập, các nhà nghiên cứu có 2 lựa chọn để đo được tốc độ phản ứng. Thứ nhất, tín hiệu có thể được đo tại các điểm riêng biệt trong khoảng tuyến tính hoặc một phần thích hợp. Phương pháp này được gọi là phép đo liên tục, cung cấp các công cụ an toàn nhất để xác định tốc độ phản ứng từ độ dôc của đồ thị tín hiệu theo thòi gian. Tuy nhiên, phép đo này không luôn luôn thích hợp, đặc biệt là khi sử dụng các kỹ thuật phân tách như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay các phưdng pháp điện di. Trong những trường hợp này, phương pháp thứ hai được gọi là phép đo điểm cuối hay phép đo không liên tục thường được áp dụng. Khi đã thiết lập khoảng tuyến tính, ta sẽ đo được tín hiệu tại các thời điểm riêng biệt trong khoảng đó (thường là khoảng thòi gian gần vói điểm giữa pha tuyến tính). Tốc độ phản ứng sẽ được xác định từ những khác nhau trong tín hiệu tại thòi điểm đó là thòi điểm bắt đầu phản ứng, chia cho thòi gian ỂL = At tdọe
(6.10)
Trong đó cưòng độ tín hiệu đo tại thời gian t và thời gian 0 là It và I0; tdọc là thòi gian từ lúc bắt đầu đến lúc đọc. Trong nhiều trường hợp, dễ hơn nhiều khi đọc các điểm riêng biệt hơn là đo nhiều điểm trong suốt một phản ứng. Tụy nhiên, nếu sử dụng phép đo tại điểm CUỐI, thì đó là nguy hiểm để giả th iế t rằng, tín hiệu sẽ 210
tuyến tính trong khoảng thời gian đã chọn, trong điểu kiện phản ứng đưa ra. Những thay đổi ở nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, enzym cũng như sự có mặt của một sô' loại chất ức chế (Chương 7) có thể làm thay đổi đáng kể sự tuyên tính của tín hiệu trong khoảng thời gian đã được chọn. Do đó phép đo điểm cuối có thể có sai sót. Nhưng bất cứ khi nào có điều kiện thỏ nghiệm, chúng ta càng nên thử sỏ dụng phép đo liên tục để xác định sự giảm cơ chất hay tạo thành sản phẩm. Khi sử dụng phép đo này, các phép đo điểm cuối sẽ được áp dụng, nhưng nên cẩn thận để cho kết quả th ật chính xác. 6.1.4. Bắt đầu, hỗn hợp và kết thúc các phản úìig
Trong một thí nghiệm enzym thông thưòng, tất cả chứ không phải một thành phần của hỗn hợp phản ứng được cho vào một bình phản ứng, và phản ứng được bắt đầu tại thòi điểm 0. Khi cho thêm chất cuôì cùng vào, có thể là enzym hoặc cơ chất, sự lựa chọn thành phần bắt đầu sẽ phụ thuộc vào từng phép đo cụ thể và sự ổn định của enzym trong điều kiện phản ứng. Trong những trưòng hợp đó, các thành phần khác có thể được trộn kỹ và làm cân bằng trong pH, nhiệt độ và cưàng độ ion. Sau đó, phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm vào một lượng nhỏ nồng độ dung dịch gốc. Một lượng nhỏ thành phần dung dịch bắt đầu được sử dụng để không làm xáo trộn đột ngột hỗn hợp phản ứng và dung dịch bắt đầu này được trộn đều trong thành phần đệm, pH, nhiệt độ và các nhân tô' khác, dung dịch bắt dầu không nên lón hơn 5 - 10% tổng thể tích hỗn hợp phản ứng. Các mẫu nên được trộn nhanh sau khi thêm dung dịch bắt đầu, nhưng lắc m ạnh hoặc dùng máy lắc trộn có thể làm biến tính enzym nên tránh động tác này. Tuy nhiên, cần phải trốn đều hoàn toàn, hơn nữa sẽ có sự lệch ra khỏi tốc độ ban đầu tuyến tính nếu vẫn tiếp tục trộn lúc đo khi phản ứng, Một cách để nhanh chóng trộn đều dung dịch bắt đầu là dốc ngược bình, như giới thiệu ở Hình 6.5. Với thể tích nhỏ (<50ụl) 8ức căng bề m ặt sẽ giữ giọt dung dịch phản ớng ỏ trên. Tại thòi điểm 0, phản ứng được bắt đầu khi trộn đều nhẹ bình thí nghiệm 2 đến 3 lần đảo. Hình 6.5 biểu diễn kỹ thuật để lắc trong một ôhg ly tâm. Nó cũng thích hợp khi cho đung dịch bắt đầu vào nắp ông, sau đó dóng nắp và đảo ngược. Vối phép đo phổ quang học (mục 6.2.1), các phản ứng có thể được bắt đầu trực tiếp trong cuvet đo phổ bằng kỹ th u ật như trên, sử dụng một miếng giây parafin đậy lên cuvet và đảo ngược. 211
Enzym
Hỗn hợp phản ứhg
Kinh 6.5. Nguyên tắ c chung cho bắt dầu phản ứng enzym trong ống ly tâm
Bất chấp làm thế nào để dung dịch phản ứng và bắt đầu được trộn, hỗn hợp phải đạt được trong khoảng thời gian ngắn liên quan tới thời gian ngừng giữa các lần đo. Chỉ cần thực tập một chút, ta có thế sử dụng phương pháp trộn như mô tả ỏ trên trong 10s hay ít hơn. Thường thì nó phải đủ nhanh để phép đo được dừng khoảng 1 phút hoặc ìâu hơn. Hàng loạt tham số khác, như nhiệt độ, nồng độ enzym (xem 6.4) có thể được điều chỉnh chắc chắn rằng tôc độ phản ứng là đủ chậm để cho phép trộn hỗn hợp dung dịch và tiến hành đo trong khoảng thòi gian phù hợp. Trong một số ít trường hợp, tốc độ phản ứng enzym là quá nhanh để đo theo cách này. Vì thế, ta cần dùng phương pháp đặc biệt, trộn nhanh và phương pháp phát hiện đặc biệt, ví dụ như kỹ th u ậ t ngừng chảy (Rough ton và Chance, 1963; Kyte, 1995); các phương pháp này cũng được sử dụng để đo động học enzym trước trạng thái cân bằng như đã mô tả trong Chương 4 (Kyte, 1995). Với các phép đo mà ỏ đó mẫu được lấy ra khỏi bình phản ứng tại mỗi thời điểm đặc trưng để đo, ta có thể bắt đầu thòi gian tại điểm trộn và đo tại điểm đừng đã biết sau khi bắt đầu. Tuy nhiên, trong nhiểu phép đo quang phổ, ta có thể đo sự thay đổi độ hấp phụ hay huỳnh quang theo thòi gian vói các máy đo phổ gần đây, sự phát hiện được bắt đầu bằng cách nhấn nút trên bảng công cụ hay nhấn phím trên máy tính. Vì 212
thế, để bắt đầu một phép đo, ta phải trộn dung dịch, cho vào cuvet hoặc ống đo trong máy quang phổ và bắt đầu bằng việc nhấn nút thích hdp. Khoảng thời gian từ lúc trộn đến lúc đo thường là khoảng 20s. Do đó, thòi điểm đo bằng quang phổ là 0 sẽ không phải là thòi điểm không thực sự (nghĩa là điểm trộn) của phản ứng. Hơn nữa, ta có thể thực hành để giảm thiểu thời gian chậm này. Trong hầu hết các trường hợp, phép đo phải thiết lập để cân bằng sai số này. Như chúng ta thấy, sẽ luôn có 2 phép đo đối chứng; một là đo lúc không có enzym và một là phép đo lúc không có cd chất (trong những điều kiện đốĩ chứng này). Đệm được thay thế vào đúng bằng thể tích dung dịch enzym hay cơ chất. Với 2 phép đo đôì chứng, ta có thể tính toán được độ hấp phụ hay huỳnh quang cho hồn hợp phản ứng tại thời điểm 0 thực sự. Nếu phép đo quang phổ đầu tiên (nghĩa là thòi điểm đo là thời gian 0 của quang phổ) là khác nhiều so với giá trị tính toán này, thì cần điều chỉnh thời điểm đo sau khi trộn và bắt đầu phản ứng của thiết bị đo. Một cái đồng hồ tính ngược trong phòng thí nghiệm là rất cẫn thiết cho quá trình đo. Nhiều phép đo không phải là quang phổ yêu cầu thòi gian đo lâu hơn so với tốc độ phản ứng enzym trong máy đo. Ví dụ, giả sử rằng, ta muốn đo lượng sản phẩm tạo thành sau mỗi 5 phút trong một phản ứng hơn 30 phút và phép đo sản phẩm bằng HPLC. Một phép đo HPLC bản thân nó đã kéo dài 20 - 30 phút. Nêu phản ứng enzym vẫn tiếp tục lúc đo, lượng sản phẩm tạo ra suốt thòi gian dừng không thể xác định được chính xác. Trong những trường hợp nảy, rấ t cần thiết làm lạnh hay kết thúc phản ứng tại một thòi điểm xác định để tránh sự tạo thành các sản phẩm hay enzym m ất thêm. Các phương pháp kết thúc phản ứng enzym thường liên quan đến sự biến tính enzym bằng một số công cụ hoặc làm đông lạnh nhanh dung dịch phản ứng. Ví dụ: các phương pháp làm lạnh bao gồm nhúng trong cồn khô lạnh để làm lạnh nhanh dung dịch và biến tính enzym bằng cách thêm axit hay bazơ mạnh, thêm đệm điện di, hoặc ngâm trong chậu nước sôi. Ngoài ra, các hoá chất có thể được thêm vào theo một cách đặc hiệu vối một số’enzym đặc biệt. Ví dụ: hoạt tính của nhiều metalloenzym có thể dừng khi thêm nhiều tác nhân càng cua kim loại như etylen diamin tetraaxetic (EDTA). Có 3 điểm cần lưu ý khi chọn phương pháp dừng phản ứng. Thứ nhất 213
là kỹ thuật sử dụng để dừng không cản trở sự phát hiện sản phẩm hay cơ chất. Thứ hai, cần thiết lập để kỹ thuật được chọn làm kết thúc hoàn toàn phản ớng. Cuối cùng, sự thay đổi thể tích khi thêm hoá chất vào phải được tính toán. Tương tự, phép đo nồng độ sản phẩm hay cơ chất phải được điều chỉnh để bù vào bởi sự pha loãng lúc thêm chất vào. 6.1.5. S ự quan trọng của chạy kiểm tra
Không quan tâm đến phương pháp dò sử dụng tiếp một phản ứng enzym, nó thường quyết định để thực hiện các cách đo kiểm tra enzym và cơ chất được tách nhau ra trong hỗn hợp phản ứng. Các thí nghiệm đối chứng đó cho phép phân tích để hiệu chỉnh sô' liệu thí nghiệm đối với bất kỳ sự thay đổi phụ thuộc vào thời gian xảy ra độc lập của hoạt động enzym nghiên cứu, và hiệu chỉnh cho bất kỳ tín hiệu không thay đổi nào nhờ các thành phần trong hỗn hợp phản ứng. Để minh hoạ cho điều này, ví dụ: dựa trên thuyết phản ứng enzym bỏi sự theo dõi giảm sự hấp thụ ánh sáng ở một số bưốc sóng, do cơ chất biến đổi thành sản phẩm. Dựa vào điều này có một tỷ lệ nhỏ tự tạo thành sản phẩm trong khi thiếu enzym, đó là chính tự enzym va chạm nhỏ, nhưng đo được sự hấp thụ ở bước sóng phân tích. Chúng ta có thể thiết k ế thí nghiệm có toàn bộ các thành phần phản ứng ô trong một cuvet, và phản ứng được bắt đầu khi cho thêm vào một lượng nhỏ dung dịch gốc enzym. Để minh hoạ cho điều này, dựa vào hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị bởi cho thêm một lượng dung dịch gôc được tính ở Bảng 6.2. Cách chuẩn bị hỗn hợp phản ứng ở Bảng 6.2 là được sử dụng phổ biến cho thí nghiệm. Hình 6.6a minh hoạ diễn biến mà chúng ta có thể biết đối với các dung dịch giả thuyết từ Bảng 6.2. Để tiến hành thí nghiệm đó, đọc sự hấp thụ khoảng 0,1 đơn vị, đó là kết quả sự hấp thụ của chính enzym (“Không cơ chất” trong Hình 6.6a). Để hiệu chỉnh cho kết quả, chúng ta bỏ giá trị không thay đổi của toàn bộ các điểm số”liệu thí nghiệm. Nếu chúng ta xác định độ dốc mới của sự hiệu chỉnh thí nghiệm sẽ được vẽ lại, tuy nhiên, chúng ta có thể đánh giá vận tốc của một phản ứng bởi vì độ dốc có thể cho thấy cả sự chuyển đổi xúc tác của cơ chất thành sản phẩm và thay đổi sự hấp thụ xảy ra trong dấu hiệu kiểm tra “Không enzym”. Để hiệu chỉnh kết quả, chúng ta bỏ các điểm số”liệu kiểm tra này từ điểm thí nghiệm ở mỗi lần đo cho đồ thị khác nhau trong Hình 6.6b. Số đo độ dốíc của đồ thị có sự khác nhau này là kết quả vận tốc phản ứng thực. 214
Bảng 6.2. Thể tích các dung dịch gốc cho thỉ nghiệm và các mẫu kiểm tra đối với gìả thuyết phản úhg xúc tác enzym Thể tích cho thdm (nl) Các dung dịch nguồn Thí nghiêm 10 X Cơ chất
Kiểm tra không cơ chất
Kiểm tra Không enzym
0
100
100
10 X Đệm
100
100
100
Nưõc cất
790
890
800
10
10
0
1,0 ml
1 ,0 m l
1,0 ml
Enzym Tổng thể tích
Giông như minh hoạ trong Hình 6.6a, sự hiệu chỉnh đối vói sự thay đổi hấp thụ xảy ra có thể xuất hiện thoạt nhìn không quan trọng. Tuy nhiên, vận tổc đo được đối với số liệu không hiệu chỉnh sẽ khác nhau với vận tốc hiệu chỉnh lớn hơn 10% trong ví dụ này. Trong một vài trưòng hợp, sự thay đổi tín hiệu cơ bản thậm chí trực tiếp rấ t nhiều. Từ đó, các loại đo kiểm tra này được thảo luận là cần thiết để thu được sự đo vận tốc có nghĩa đổỉ với nghiên cứu phản ứng xúc tác.
(a)
Thời gian (phút)
(b)
T hài gian (phút)
Hình 6.6. Sự quan trọng của chạy kiểm tra trông (a) Quá trình thời gian hấp thụ đối với phản ứng enzym giả thiết (vết thí nghiệm), cùng với 2 mẫu kiểm tra: một với tất cả các thành phần hỗn hợp phản ứng trừ enzym; và cái khác vái các thành phần hỗn hợp phản ứng trừ cơ chất. Trong thí nghiệm này, enzym hấp thụ nhỏ nhất ở bước sóng phân tích, nhưng đủ để thay thế đo thòi gian zero bởi khoảng 0,1 đơn vị hấp thụ; (b) Hai kiểm tra đọc ở mỗi điểm thời gian có cd chất từ đo thí nghiệm đến hiệu suất quá trinh thời gian phản úrig thụt của phản ứng.
6.2. CÁC PHƯƠNG PH ÁP NGHIÊN cứu
Các ứng dụng rộng rãi của các phương pháp hoá lý được sử dụng để nghiên cứu các phản ứng enzym. Một số' kỹ thuật phổ biến được mô tả và thảo luận dưới đây là sâu sắc và toàn diện hơn. Các chất hoặc các sản phẩm của hỗn hợp phản ứng đều có các tín hiệu khác nhau, đây là nguyên lý cơ bản của phương pháp phân tích enzym; giói hạn chỉ là sự sáng tạo của các nhà nghiên cứu. 215
6.2.1. Phân tích dựa trên phương pháp quang phổ
Có hai phương pháp phổ biến để nghiên cứu một phản ứng enzym là phương pháp p h ổ hấp thụ và phương pháp quang p h ổ huỳnh quang, c ả hai phưđng pháp đều dựa vào sự thay đổi cấu hình electron của các phân tử khi chúng hấp thụ năng lượng ánh sáng ở các bước sóng đặc biệt. Các nguyên tử có thể hấp thụ cốc bức xạ điện từ, như ánh sáng, sự hấp thụ gây ra sự chuyển tiếp các trạng thái năng lượng khác nhau. Ví dụ; năng lượng ỏ vùng hồng ngoại có thể gây ra sự chuyển tiếp giữa các mức độ giao động của một phân tử. Năng lượng của các bước sóng ngắn có thể gây ra sự chuyển tiếp trạng thái thay đổi giữa các mức năng lượng quay của cấc phân tử, trong khi năng lượng của bước sóng radio lại gây ra sự thay đổi sự quay của nhân (momen xung lượng riêng của hạt cơ bản hoặc hạt nhân vốn tồn tại khi hạt ở trạng thái nghỉ, khác với momen xung lượng quỹ đạo), đó cũng là cơ sở của phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Mức năng lượng khác nhau giữa các cấp điện tử của các phân tử là rấ t lốn, năng lượng ánh sáng của vùng tia cực tím (UV) và vùng khả kiến của quang phổ điện từ được yêu cầu để tạo ra sự chuyển tiếp của các trạng thái. Nếu một phân tử được chiếu sáng với ánh sáng ở các bước sóng khác nhau (cùng cường độ chiếu sáng), chỉ ánh sáng của bước sóng đặc biệt mẫu sẽ hấp thụ mạnh nhất. Ố bước sóng đó, năng lượng của ánh sáng phù hợp với khoảng cách giữa hai trạng thái electron của phân tử, và ánh sáng được hấp thụ để gây ra sự chuyển đổi trạng thái. Hình 6.7 là một giả định về phổ hấp thụ ánh sáng của một phân tỏ, ở bước sóng ?Lcục d(li gây ra sự sắp xếp lại electron để biến đổi phân tử từ trạ n g th ái 71 cơ bản sang trạng th ái kích thích 7C*. Q uá trình này được minh hoạ ỏ giản đồ năng lưdng ở Hình 6.8a.
Bước s ó n g (nm)
Hình 6.7. Quang phổ hấp thụ của một phân tử và s ự h ấp thụ cực đại ỏ bước só n g 375nm
216
K hoảng c á c h giữa c á c nguyên
tử
K hoảng c á c h giữa c á c n g uyên tử
(a) Hỉnh 6.8. Biểu đổ mức độ năng lượng
(a) Ảnh sáng gày ra sự chuyển trạng thái điện tử từ trạng thái cơ bản 71 sang trạng thái hoạt động 71* của phân tử và (b) quá trình chuyển điện tử từ trạng thái kích thích sang trạng thái cơ bản bởi sự phát xạ photon (huỳnh quang),
6.2.2. Đo sự hấp thụ
Giá trị của quang phổ hấp thụ là một công cụ phân tích bởi vì sự hấp thụ của một phân tử tại một bước sóng nhất định có liên hệ vâi nồng độ của phân tử trong dung dịch, nó được mô tả bởi định luật Beer: (6.11)
A là hệ sô" hấp thụ của một mẫu tại một bước sóng rìhất định; c là nồng độ của phân tử trong mẫu, dơn vị là mol (M); 1 là độ dài của ánh sáng đi qua mẫu (tính theo cm); E là đại lương không đổi phụ thuộc vào bản chất của phân tử, nó được gọi là hệ số tắ t hoặc hấp thụ phân tử gam (mol). Hệ số hấp thụ là đại lượng không đơn vị, s phải có các đơn vị của nồng độ phân tử gam (moi) tương ứng chiểu dài đi qua (biểu thị điển hình như cm-1 hoặc Bởi vậy, nếu chúng ta biết được giá trị e của các phân tử và chiểu dày cuvet, chúng ta có thể tính được nồng độ của phân tỏ trong dung dịch bằng phương pháp đo sự hấp thụ của dung dịch. Trong ví dụ ỏ Hình 6.1 và 6.6, chúng ta có thể sử dụng đơn vị hấp thụ đặc trưng của cơ chất hoặc sản phẩm của một phản ứng enzym đê nghiên cứu một phản ứng. Để sử dụng định luật Beer, phải đo giá trị AA ở các thòi điểm khác nhau đối với các nồng độ của phân tử tiếp theo, và vì vậy tốc độ của phản ứng, trong một giói hạn thay đổi nồng độ của một phân tử là một hàm sô cua thời gian. 217
Ví dụ: cơ chất của một phản ứng được minh hoạ ỏ Hình 6.6 có hệ số tắt 2,5mM‘1,cm"1 và được đo bằng cuvet có chiểu dày là lem. Hình 6.6b cho thấy quang phổ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng thay đổi 0,89 trong 10 phút hay là 0,089/phút, Tốc độ phản ứng như sau: V=
=
dt
elAt
---------------------= - 0 ,0356mM /phút 2,5 X 1 X 10
(6.12)
Chú ý rằng các đơn vị ồ đây, nồng độ mol đơn vị thòi gian (mol/1 cho mỗi đơn vị thòi gian) được sử dụng phổ biến trong các báo cáo vận tốc enzym. Một vài ngưòi thao tác thay vì báo cáo vận tốc các đơn vị mol trên đơn vị thời gian. Hai đơn vị chuyển đổi qua lại dễ dàng bỏi sự lưu ý tới tổng thể tích của hỗn hợp phản ứng mà vận tốc đang được đo. 6.2.3. Chọn bước sóng phân tích
Độ dài bưóc sóng được dùng sau khi các enzym hoạt hoá nên sự khác biệt lớn n hất là việc hấp thụ giữa cơ chất và các phân tử sản phẩm của phản ứng. Trong nhiều trưòng hợp thì điều này tương ứng với độ dài bước sóng lớn n hất của cd chất hoặc phân tử sản phẩm. Tuy nhiên, khi có sự chồng chéo giữa các dải hấp thụ của cơ chất và sản phẩm, sự nhạy cảm phân tích bưốc sóng có thể không giống vói bước sóng lớn nhất. Khái niệm nàỹ được minh hoạ ỏ Hình 6.9. Trong kiểm tra quang phổ cho cd chất và sản phẩm của giả thuyết phản ứng enzym ỏ Hình 6.9a, cần chú ý rằng, ở bước sóng lớn nhất cho mỗi phân tủ, các phân tử khác hiển thị sự hấp thụ đáng kể. Các bước sóng mà ỏ đó sự khác biệt lớn nhất là quan sát tín hiệu có thể xác định được bởi tính phổ khác nhau giữa 2 quang phổ, như minh hoạ trong Hình 6.9b. Do đó, trong giả thuyết ví dụ của chúng ta, bước sóng lớn nhất cho cơ chết và sản phẩm là 374 và 385nm, không nhạy nhất cho bước sóng làm m ất cơ chất và hình thành sản phẩm là 362 và 402nm. 6.2.4. Các tế bào quang học
Phép đo sự hấp thụ phổ biến là thực hiện với một máy đo quang phổ chuẩn, và mấu được chứa trong các ống cóng đo chuyên biệt được gọi là cuvet. Các ông đo chuyên biệt này trong một phạm vi độ dài đường dẫn và được cấu tạo bằng các vật liệu quang học khác nhau. Các cuvet nhựa chứa được 1 hoặc 3ml mẫu. Các cóng thể tích có sẵn này rấ t tiện lợi và giảm bớt sự nhiễm chéo mẫu, chúng chỉ sử dụng được ở bước sóng nhìn thấy (350 - 800nm). 218
(a)
Bước sóng (nm)
(b)
Bước sóng (nm)
Hình 6.9. Ví dụ vể sử dụng các quang phổ khác nhau (a) Hấp thụ quang^phổ của cơ chất và sản phẩm của một số phản ứng enzym. Bởi vi mật độ cao của quang pho chồng chéo giữa hai phân tử sẽ rắt khó để định lượng thay đổi trong một thành phẩn của một hỗn hợp của hai loài; (b) Các quang phổ khác biệt toán học (sàn phẩm trừ cơ chất) cho 2 quang phổ trong (a). Phổ khác nhau nổi bật giữa 2 phổ tạo nén sự thay đổi không phức tạp của lượng hoà.
Đối với các phép đo ỏ bước sóng nhỏ hơn 350nm, phải sử dụng cuvet thạch anh chất lượng cao, cóng nhựa và thuỷ tinh hấp thụ quá nhiều ánh sáng trong tia tử ngoại. Cuvet thạch anh có sẵn từ nhiều nhà sản xuất với nhiều kích cò và hình dạng bất kể loại cuvet phải được chọn đúng để ứng dụng phép đo lưòng của định luật Beer. Thông thường, nhà sản xuất cung cấp thông tin này tại thời điểm mua hàng. Nếu VI lý do nào, chiểu dài đường dẫn của 1 cuvet đặc biệt là không được biết, nó có thể được xác định thử nghiệm bằng cách đo sự hấp thụ của bất kỳ dưng dịch màu ổn định trong một cuvet chiểu dài đi qua lcm chuẩn và sau đó đo sự hấp thụ của chất mẫu trong cuvet chưa biết chiều dài đi qua. Tỷ lệ của 2 lần đọc hấp thụ (Achưa bìa/At CJ sẽ cho biết độ dài đi qua của cuvet chưa biết tính bằng xentimet. Dung dịch chuẩn của phương pháp được chuẩn bị như sau (theo Haupt, 1952): cân 0,04g kali cromat và 3,2g kali hydroxit (KOH). Hoà tan chúng trong 700ml nưốc cất. Chuyển dung dịch vào bình tam giác 1 lít, thêm nước cất đến 1 lít rồi trộn đểu. Dung dịch thu được sẽ có độ hâ'p thụ 0,991 tại bước sóng 375nm trong cuvet lcm. Nhiều nhà khoa học thực hiện các phép đo hấp thụ bằng cách sử dụng máy đọc đĩa siêu chuẩn tấm 96 giếng. Các thiết bị này có độ nhạy dặc biệt cao (nhiều máy cố thể đo được những thay đổi sự hấp thụ rấ t nhỏ tới 0,001) và có thể năng suất tăng rất nhiều vì phân tích đồng thòi cả 96 mẫu cùng một lúc. Phần lón các đĩa đọc nói trồn dựa trên các bộ 219
lọc quang học hơn là sử dụng quang kế đơn sắc, do đó chỉ cố thể thực hiện phép đo ở một vài bưóc sóng giới hạn. Tuy nhiên, thường không khó để mua một bộ lọc quang học cho một bước sóng cụ thể và cài đặt nó vào máy đọc đĩa nhỏ. Do phần lớn đĩa siêu chuẩn có cấu tạo bằng nhựa nên khả năng truyền giảm, phép đo trên tấm đọc thường bị giói hạn trong vùng khả kiến của quang phổ. Tuy nhiên, hiện nay các máy đọc sử dụng ánh sáng đơn sắc đã được bán trên thị trưòng cho phép các phép đo có thể thực hiện được ỏ bất kỳ bước sóng nào, từ 250nm đến 750nm. Các nhà sản xuất cũng đã đưa ra các đĩa đọc bằng thạch anh, cho phép đo trong phổ ánh sáng tia tử ngoại (UV). Cũng như đối với các cuvet khác không tiêu chuẩn, rấ t cần thiết phải xác định độ dài đưòng truyền sáng của cuvet. Độ dài đường truyền sáng trong điều kiện này sẽ phụ thuộc vào thể tích của hỗn hợp phản ứng có trong giếng. Ví dụ: 200jil dung dịch trong một giếng có độ dài đường truyền sáng xấp xỉ 0,7cm. Độ dài đường truyền sáng chính xác trong điều kiện thí nghiệm cần được xác định dựa theo kinh nghiệm như dã mô tả ở trên. Các máy đo sử dụng tấm lọc c ản cố thể hiển thị hệ sô”tắt của một phân tử, khác vối các phép đo tương ứng được tiến hành trên một máy quang phổ bình thưòng. Sự khác nhau này một phần là do các bộ lọc quang học được sử dụng trong các máy đo sử dụng tấm lọc có băng quang phổ rộng hơn, Như vậy có thể khảo sát vùng bưóc sóng rộng hơn so với các phép do quang phổ thông thường. Bỏi vậy, cần tiến hành các phép đo thử nghiệm trong các điều kiện tương tự để xác định một đưòng cong chuẩn cùa sự hấp thụ nhò vào nồng độ cùa chất màu. Khi sử dụng tấm 96 giếng, việc trộn đều mẫu là khá khó khăn (Hình 6.5) vì cách trộn không thể áp dụng được một cách thuận tiện. Thay vào đó, rấ t nhiều máy đọc trên thị trưòng đã có thêm bộ phận lắc tự động để trộn mẫu. Một cách khác để đảm bảo trộn đều mẫu được mô tả như sau: trộn đều các thành phần của hỗn hợp phản ứng ồ thể tích đủ cho tất cả các giếng, ngoại trừ thuốc thử ban dầu. Dung dịch ban đầu được cho vào các giếng của tấm, và phần dung dịch còn lại sẽ được cho vào giếng bằng pipet nhiều kênh. Dùng pipet nhiều kênh hút đi hút lại trong từng giêng để trộn đều các dung dịch. Mỗi dãy gồm 12 giếng có thể được trộn trong vòng dưới 10 giây. 220
6.2.5. Sai s ố trong phép đo quang phổ hâ'p thụ
Một sai sô thông thường trong phép đo quang phổ hấp thụ là sự lệch khỏi định luật Beer. Theo định luật Beer, độ hấp thụ của một mẫu phân tích sẽ tăng tuyến tính với nồng độ của mẫu ấy, và thực tế đó là cơ sở để ứng dụng quang phổ hấp thụ như một công cụ trong phân tích định lượng. Tuy nhiên, trong thực nghiệm, người ta thấy rằng, mối quan hệ tuyến tính này chỉ xảy ra trong một phạm vi hữu hạn các g^á trị hấp thụ. Điều này được minh hoạ trong Hình 6.10, khi giá trị hấp thụ lớn hơn 1, mối quan hệ tuyến tính này không còn, kết quả đọc không còn phản ánh chính xốc nồng độ của đung dịch phân tích. Vì vậy, các thí nghiệm cần được thiết kế sao cho độ hấp thụ cực đại phải nhỏ hơn 1,0.
Nồng độ ch ất phàn tích
Hình 6.10. S ự lệch khỏi định luật Beer ở vùng nồng độ thấp, độ hấp thụ ỏ một vài bước sóng phân tích tỷ lệ tuyến tính với nồng độ chất phân tích tuân thủ theo định luật Beer (phương trinh 6.11). Khi nổng độ chất phân tích tăng đến điểm A = 1,0 thi sự lệch kliỏi quan hệ tuyến tính bắt đầu xảy ra.
Với một vài thử nghiệm sơ bộ, có thể hiệu chỉnh điểu kiện để phép đo rơi vào vùng giới hạn tuyến tính. Thêm nữa, sự không Ưa thích dụng cụ đo trong một phép đo bị ảnh hưởng bởi sự hấp thụ tổng thể của mẫu. Vì lý đo này càng khó đo sự thay đổi hấp thụ nhỏ của một mẫu có độ hấp thụ cao. Kinh nghiệm chỉ ra rằng, cách tôt nhất để dung hoà giữa giảm thiểu sự không ưa thích và có một tín hiệu hợp lý đê tiến hành tiêp theo khi sự hấp thụ mẫu trong vùng 0,5. Điều này giúp ích sự hấp thụ tôt đôi vối sự thay đổi sự hấp thụ nhỏ tiêp theo. 221
Các loại đèn sỏ dụng để tạo ra các tia ư v và ánh sáng nhìn thấy trong các quang phổ kế hấp thụ phải có nhiều thòi gian để “làm nóng”. Cưòng độ ánh sáng thay đổi đáng kể sau một thời gian ngắn bật đèn và ổn định sau khoảng 30 - 90 phút. Vì thòi gian khởi động cần thiết để làm Ổn định cường độ chiếu sáng của đèn khác nhau giữa các dụng cụ, các đèn khốc nhau trong cùng một hệ thông, nên cách tốt nhất là phải xác định thòi gian khởi động từng thiết bị. Đây là một phương pháp dễ dàng thực hiện bằng cách đo tín hiệu từ 1 mẫu hấp thụ thấp (~0,05 - 0,1) sau 1 thời gian bật đèn và ghi nhận thòi gian cho tín hiệu đạt được là một hằng sô". Trong đo hấp thụ, độ đục của mẫu cũng được coi là một nguyên nhân gây ra lỗi. Hạt vật chất sẽ hâp thụ ánh sáng và làm tăng độ hấp thụ mẫu. Do vậy, người ta phải sử dụng bộ lọc 0,2|im hoặc ly tâm tất cả các hạt trong mẫu (Copeland, 1994). 6.2.6. Đo sự phát huỳnh quang
Ánh sáng của một bưóc sóng thích hợp có thể được hấp thụ bởi một phân tử để gầy ra một chuyển động trực tiếp của điện tử từ trạng thái bình thưòng lên trạng thái kích thích cao hơn như đã thảo luận. Do tính chất năng lượng cao của nó, trạng thái kích thích rấ t ngắn (< 50 giây) và thông thường chúng phải giải phóng năng lượng để trở về cấu hình bình thường. Hầu hết năng lượng này đều bị biến thành nhiệt toả ra môi trưòng xung quanh. Một vài phân tử, trỏ lại trạng thái cơ bản bằng cách phát ra năng ỉượng ở dạng ánh sáng. Ánh sáng huỳnh quang là dạng cơ bản nhất, bao gồm trạng thái mức đơn và trạng thái cd bản. Các quá trình miêu tả trong Hình 6,8 là tính chất của huỳnh quang phân tử. Trước tiên, ánh sáng của một bưổc sóng thích hợp được háp thụ bởi các phân tỏ bằng cách chuyển nó đến trạng thái năng lượng cao hơn (Hình 6.8a). Sau đó, các phân tử phân rã qua nhiều mức năng lượng khác nhau, kích thích sự toả nhiệt, cuôi cùng chuyển về trang thái cơ bản kèm theo sự giải phóng một photon (Hình 6.8b). Do sự khác nhau trong trạng thái cân bằng giữa các nguyên tử và bởi vì năng lượng bị mất khi phân rã, các photon được tạo ra có mức năng lượng thấp hơn so với năng lượng ánh sáng tưdng ứng vói năng lượng kích thích ỏ trạng thái đầu tiên. Do đó, sự phát huỳnh quang cực đại của phân tử thường ỏ bưâc sóng dài hơn (năng lượng nhỏ) hấp thu cực đại, sự khác biệt này trong 222
bước sóng giữa hấp thụ và sự phát huỳnh quang cực đại của một phân tử liên quan đến bản chất Stokes, Ví dụ: axit amin tryptophan hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng khoảng 280nm và phát huỳnh quang giữa khoảng 325 và 350nm (Copeland, 1994). Để tận dụng điều này, máy phát huỳnh quang được thiết kế để kích thích một mẫu trong cuvet với ánh sáng ở bước sóng hấp thụ cực đại và xác định ánh sáng phát giói hạn ở bưốc sóng (dài hơn) khác nhau. Tốt nhất xác định ánh sáng giới hạn với sự giao thoa nhỏ nhất từ chùm tia sáng kích thích, phần lớn các huỳnh quang kế thương mại được thiết kế chọn lọc ánh sáng giới hạn ở góc nghiêng 90° từ phần chùm tia giới hạn. Vì vậy, không giống các cuvet của quang phổ hấp thụ, các cuvet đo huỳnh quang phải có ít nhất 2 cửa sổ định lượng quang học ở góc phải đến một chỗ khác. Tất cả 4 mặt của cuvet đều được làm bóng. Phương pháp xác định động học enzym bằng phép đo huỳnh quang cũng tương tự như đo phổ hấp thụ. Tuy nhiên có 2 lợi thế. Thứ nhất, dụng cụ huỳnh quang nhạy cảm cho phép phát hiện thay đổi nồng độ rấ t thấp cơ chất - sản phẩm. Thứ hai, vì nhiều chất huỳnh quang có độ dịch chuyển Stokes rộng nên tín hiệu huỳnh quang thường bị tách ra khỏi phổ, nơi nhiều từ tín hiệu là do hỗn hợp phản ứng là tối thiểu. Tín hiệu huỳnh quang tuyến tính với nồng độ chất phát huỳnh quang trong phạm vi nồng độ hữu hạn cho phép, vể nguyên tắc, tín hiệu huỳnh quang thay đổi với nồng độ fluoropho bởi mối quan hệ được mô tả như định luật Beer, hệ số phát quang được thay thế bằng sản lượng mol lượng tử. Trong thực tế, rất khó để tính toán nồng độ của mẫu bằng cách áp dụng giá trị 0 để xác định tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm. Hạn chế này một phần do các thiết bị và các số đo (Lackowicz, 1983). Vì vậy, để chuyển đổi giá trị cường độ phát huỳnh quang đo được sang đdn vị nồng độ, cần thiết phải xây dựng một đường cong chuẩn tín hiệu huỳnh quang như một phương trình của nồng độ chất phát quang. Đưòng cong tiêu chuẩn phải dược thu nhập cùng một lúc như là các phép đo thử nghiệm. Tuy nhiên, có rấ t nhiều các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo huỳnh quang. Đôi khi chất phát huỳnh quang được tạo ra chỉ là kết quả của phản ứng enzym và rấ t khó để có được mẫu tiêu chuẩn của các phân tử này để cho xây dựng một đưòng chuẩn. Trong trưòng hợp như vậy, kết quả về đơn vị nồng độ phải được thay bằng kết quả đơn vị nồng độ/thời gian phải được sử dụng thay vào đó. Việc định lượng sự phát huỳnh quang này là 223
rất quan trọng và nó liên quan tồi một số phân tử huỳnh quang chuẩn, để có thể so sánh các phương thức phát huỳnh quang từ ngày này sang ngày khác và giữa các phòng thí nghiệm vái nhau. Một chất điển hình được dùng cho mục đích này là quinin sulphat. Một dung dịch quinin sulphat pha loãng trong H2S 0 4 có thể bị kích thích ở bước sóng từ 240 đến 400nm, tôi đa là 453nm có thể gây ra tín hiệu huỳnh quang mạnh (Fletcher, 1969). Russo (1969) đã đưa ra quy trình sau để chuẩn bị dung dịch quinin sulphat chuẩn dùng cho quang phổ học huỳnh quang: - Cân 5mg quinin sulphat dihydrat và hoà tan trong 100ml HzS 040, IM. - Đo sự hấp thụ của mẫu ở 366nm, và điều chỉnh nồng độ bởi H2S 04 0,1M đến khi thu được dung dịch có mớc hấp thụ là 0,40 ở cùng bưóc sóng này trong cuvet lcm. - Pha loãng một mẫu của dung dịch này tỷ lệ 1/10 với H2S 0 4 0,1M và sử dụng dung dịch để ghi lại phổ huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang của một mẫu sau đó có thể đưdc coi như là cường độ phát huỳnh quang của mẫu quinin sulphat ở bước sóng 453nm, cùng lúc đó huỳnh quang k ế được dùng để kích thích cả mẫu thí nghiệm và mẫu chuẩn ồ cùng một bưổc sóng. Tất nhiên, phép đo cả mẫu thí nghiệm và mẫu chuẩn đều được tiến hành ở cùng điều kiện thí nghiệm (bể rộng giữa các đơn phổ, đèn cao áp, thòi gian sóng,...), sau đó có thê được tiến hành đo. 6.2.7. S ự dập tắt nội huỳnh quang và chuyển năng lượng
Nếu một phân tử hấp thụ ánh sáng tại cùng một bước sóng mà tại đó một phân tử khốc phát quang thì sự phát huỳnh quang từ phân tà thứ hai đó có thể bị hấp thụ bởi phân tử thứ nhất, điểu đó đẫn đến sự suy yếu hay là sự dập tắt cưòng độ huỳnh quang nhìn thây xuất phát từ phân tủ thứ hai. (Chú ý rằng đây chỉ là một trong so”rấ t nhiều cách thức dập tắ t huỳnh quang; tham khảo Lackowicz, 1983, để hiểu toàn diện về hiện tượng dập tắ t huỳnh quang). Sau đó phân tử thứ nhất có thể phân huỷ lại trạng thái bình thưồng do sự phân huỷ không bức xạ (ví dụ sự tiêu tan nhiệt), hoặc tự nó có thể phát quang, chúng ta có thể nghiêng về giải thích đầu tiên, bởi vì kết quả này là sự m ất cường độ huỳnh quang. Trường hợp thứ hai được xem giông như “sự chuyển năng lượng cộng hưông”, vì tại đốy sự kích thích ở mức hấp thụ tối đa của một phân tử dẫn tới sự phát huỳnh quang của một phân tử khác (Hình 6.11). 224
1.2
r-’
1
* A ehál cho
1
I
' c to
I— '— 1— '— I— '— r A c h * nMn
nhận
1.0
p
0,8
.£>■
0,2 0,0
Hình 6.11. Sự chuyển năng lượng cộng hưỏng
Trong thí nghiệm chuyển nâng lượng, mẫu bị kích thích bằng ánh sáng tạì bước sóng của
một bãng hap thụ chất cho (chất cho A) để tạo ra hiện tượng huỳnh quăng của phân tử thể cho lại bứức sóng được chỉ ra bởi chất cho F, Bâng hấp thụ của phân tử nhận (chất nhận A) diễn ra trong vùng bứớc sóng mà nó chống lên băng huỳnh quang của chất cho; vùng bị
chồng giữa hai đặc tính.được chi ra bỏi vùng mò rộng. Vì sự chổng quang phổ này (và một số yếu tố khác nưa), ánh sáng được giải phóng ra bởi thể cho F bị hấp thụ lại bải chất nhận A. Sự kích thích gián tiếp của phãn tử thể cho này có ỉhể dẫn tới sự phát huỳnh quang gãy ra bỏi chất nhận tại bưốc sóng gây kích thích thể cho F. v ể thí nghiệm, một phân tử kích thích ở m ột b ư ớ c s o n g đ ư ợ c c h ỉ rã b ằ n g m ũi tốn c h ỉ lên, v à s ự phát h u ỳ n h q u a n g đ ư ợ c đo ở b ư ớ c sóng ch ỉ
ở m ũi
tê n đ i x u ố n g .
Cả hai quá trình đểu phụ thuộc vào nhiều nhân tổ', bao gồm cả khoảng cách không gian của 2 phân tử. Đặc tính này được khai thác nhằm phát triển các thí nghiệm vể sự phát huỳnh quang đôì vối các enzym thuỷ phân protein dựa trên cơ sở tổng hợp cd chất peptit. Chiên lược cơ bản là tạo ra sự liên kết chặt chẽ trong nhóm phát huỳnh quang (chất cho) thành một chuỗi peptit tổng hợp ỏ cả đầu N và đầu c trong liên kết peptit dễ phân cắt được nhận ra bởi enzym đích. Sự dập tắt huỳnh quang hay phân tỏ nhận năng lượng (cả hai liên quan tới tiếp theo gọi là phân tử nhận) được liên kết chặt chẽ trong chuỗi peptit ở phía còn lại của liên kết dễ phân cắt. Khi chuỗi peptit không bị ảnh hưởng đến, cả phân tử chất cho và chất nhận đềư liên kết cộng hoá trị và vẫn tách nhau một khoảng cách cố định tương đối, có thể tương Lác năng lượng với nhau. Tuy bị thuỷ phân bâi enzym, nhưng 2 nửa của chuỗi peptit vẫn sẽ khuếch tán vào nhau, vì thế loại bỏ đưực khả nảng xảy ra của bất cứ tương tác nào giữa chất cho và chất nhận. Kêt quả quan sát của sự thuỷ phân sẽ làm tăng sự phát huỳnh quang từ phần tử chất cho, và trong trưòng hợp chuyển nãng lượng, có sự giảm dồng thời 225
trong sự phát huỳnh quang của phân tử hấp thụ với sự kích thích do sự hấp thụ tối đa của chất nhận. Những cách này được sử dụng để thuỷ phân, peptit nhđ vào rất nhiều proteaza (xem Matayoshi, 1990, Knight, 1992, 1995 và Packard, 1997). Bảng 6.3 tóm tắt một sô”cặp chất cho —chất nhận được dùng phổ biến trong tổng hợp cơ chất cho các proteaza. Có thể th u thập các thông tin về các cặp chất cho - chất nhận tại địa chỉ internet của công ty Molecular Probes, một công ty sản xuất các công cụ phát huỳnh quang cho nghiên cứu hoá sinh và sinh học. Bảng 6.3. Cặp chất cho - chất nhận cho sự dập tắt bỏi sự chuyển năng lượng cộng hưỏng trong các cơ chất peptit của các enzym phân giải protein Bước só n g (nm) Chất dập tắl
Nhóm huỳnh quang
Sự kích thích
Sự phát xạ
Dabxyl
Edans
336
490
Danxyl
Trp
336
350
DNP
Trp
328
350
DNP
MCA
328
393
DNP
Abz
328
420
Tyr (N02)
Abz
320
420
Dabxyl: axit 4-(4-dimetylaminophenylazo) benzoic; Edans: axit 5-[{2-aminoetyl)amino]naphtalen-1-sulfonic; Danxyl: (5-dimetylaminonaphtalen-1-sulfonyl); DNP: 2,4dinitrophenyl; MCA: axit 7-metoxycoumarin-4-axetic; Abz: o~aminobenzy1; Tyr(N02), 3nitrotyrosin.
Một ví dụ đủ để minh hoạ cho hướng tiếp cận cđ bản được dùng trong những thí nghiệm này. Knight và cộng sự (1992) đã mô tả sự kết hợp của phân tử chất huỳnh quang 7-metoxycoumarin-4-yi axetyl (MCA) với đầu N của một peptit được thiết kế làm cơ chất cho khuôn enzym stromelysin metalloproteaza; ngay sau khi liên kết peptit giữa Gly- Leu được tách rài bằng enzym thuỷ phân, một chất dập tắ t N —3 (2,4-dìnitrophenyl) - L —2,3 - diaminopropionyl (DPA) đã được liên kết rất tốt. Trình tự đầy đủ của peptit này là: MCA —Pro —Leu —Gly —Leu - DPA - Ala - Arg - NH2. Phân tử MCA hấp thụ cực đại tại bước sóng 328nm và phát huỳnh quang cực đại ỏ bước sóng 393nm. Nhóm DPA có một vạch hấp thụ mạnh ỏ bước sóng 363nm với một vai nhô lên ỏ bưốc sóng 410nm. Vai này chồng lên băng phát huỳnh quang của MCA và dẫn tới sự dập tắ t sự phát huỳnh quang trực tiếp; dung địch MCA - Pro - Leu nồng độ lụM 226
(sản phẩm của enzym thuỷ phân được xác định có tính phát huỳnh quang lớn hơn 130 lần so vói dung dịch MCA - Pro - Leu - Gly - Leu DPA - Ala —Arg —NH2 với sự kích thích và phát xạ ở bước sóng 328nm và 393nm tương ứng (Knight và cộng sự, 1992). Sự thuỷ phân bởi enzym của peptit này gây ra sự tách hai nhóm MCA và DTA, do đó làm tăng đáng kể chất phát huỳnh quang MCA. Sự tăng phát huỳnh quang này có thê xảy ra sau một thời gian như một phép đo vận tốc phản ứng, cho phép các nhà nghiên cứu có thể xây dựng giá trị kxllc U
Hầu hết các cuvet miêu tả cho quang phổ hấp thụ đều tương tự cho phép đo tốt sự phát huỳnh quang. Các mẫu phải có các hạt vật chất tự do, do đó tán xạ ánh sáng là một vấn đề quan trọng phát huỳnh quang. Nhiều chất phát huỳnh quang thông thường được sử dụng để phát ra ánh sáng trong vùng nhìn thây được, nhưng phải được kích thích ở gần bước sóng cực tím, vân đề quan trọng là cần sử dụng cuvet thạch anh cho các phép đo. Ngoài ra, bất kỹ phép đo huỳnh quang bị ảnh hưởng bởi các thành phần đệm phải được đo và hiệu chỉnh để bảo đảm rằng kết quả thu được có ý nghĩa. Ngoài các lưu ý thông thường này, cũng có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn tới một sô lỗi khác thường cho các phép đo huỳnh quang. Thứ nhất, nhiều phân tử huynh quang dễ bị quang phân sau khi tiếp xúc lâu với ánh sáng. D n iâốchất huỳnh quang và thuốc thử phải được cất trong ống (buồng) ..tìí uy tinh hoặc nhựa, và các vật chứa nên được gói trong giấy để giảm thiểu tiếp xúc với ánh sáng. Thứ hai, khả năng phát huỷỉứi quang của bất kỳ. phân tử phát huỳnh quang nào cũng đểu phụ 227
thuộc nhiều vào nhiệt độ mầu. Chúng ta sẽ nhìn thấy ngay nhiệt độ ảnh hưỏng trực tiếp đến động học enzym, nhưng điểu này khác vói các ảnh hưởng chung của nhiệt độ lên cưòng độ phát huỳnh quang. Nói chung các tín hiệu phát huỳnh quang tăng khi nhiệt độ giảm. Vì vậy, cần kiểm soát duy trì nhiệt độ phù hợp cho mẫu. Cuối cùng một nguỗn lỗi chính trong phép đo phát huỳnh quang là sự hẩp thụ ánh sáng của mẫu ở các nồng độ cao. Các phân tủ riêng rẽ trong mẫu có thể bị kích thích bởi chùm sáng kích thích và gây ra sự phát huỳnh quang, Để có thể xác định được, các photon phát xạ này phải được đi qua mẫu tĩnh và thoát ra khỏi cuvet để đi va đập lên bể mặt của thiết bị nhận biết (điển hình là một ông khuếch đại ánh sáng hoặc chùm tia diot), Tuy nhiên, người ta sẽ không quan sát được bất cứ photon nào như thế nếu trưóc khi đi ra khỏi mẫu nó chạm phải một phân tử khác có khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng đó. Khi nồng độ mẫu tăng, khả năng xảy ra những va chạm và sự tái hấp thụ ánh sáng này tâng lên theo hàm sô" mũ. Đẩu dò
Đầu
o o
Nguồn sáng
o
o
°
Nguồn sáng
dò
o o 0 o o ọ o o io CL° 0 o o o
0 o °
n o
Hinh 6.12. Sd đổ sd lược minh hoạ hiệu quả lọc bên trong Khi một mẫu pha loãng (bên trái) của phân tử phát huỳnh quang tjị kích thích tại bước sóng thích hợp, một máy dò đật tại 90°c có liên quan đến nguồn kídi thích sê phái hiện ánh sáng phản xạ xuất hiện từ hộp chứa mẫu. Tuy nhiên, nếu mau đậm đặc, ánh sang phần xạ từ một phân tử trong mẫu có thể va kẹt và bị hấp tlìụ lại bởi các phân lử khác trưỚÈ kj-|j xuất hiện từ ngăn mẫu {bên phải), Tất nhiên, photon bị hấp thụ lại sẽ không bị phát hiện. Khả.năng của sự hấp thụ này hoặc hiệu quả lọc bên trong tăng khi nỗrvj độ của mau tăng. '
Ảnh hưởng của fil lọc (Hình 6.12), có thể giảm đột ngột tín hiệu phát huỳnh quang quan sát được từ mẫu. Xét Hình 6.13 biểu thị sơ đồ lượng sản phẩm phát huỳnh quang một cách rõ ràng sau khi một lượng cố đinh của thòi gian phản ứng như môt hàm số của nồng độ cơ ckất đối với peptit MCA/DPA phát huỳnh quang được miêu tả ở mục 6.2.7 trồng một 228
^
phân tích về sự hoạt động của stromelysin. Thay thế cho sự phù hợp hypecbol vuông nhận được từ phương trình Henri - Michealis - Menten, chúng ta quan sát lượng phát huỳnh quang tăng ban đầu cùng vớì việc tăng cơ chất, theo đó một sự giảm nhanh tín hiệu vì giảm nồng độ cơ chất được tãng lên. Thoạt đầu, cách hoạt động này có thể đưa đến kết quả là sự ức chế cơ chất, hoặc sản phẩm tạo thành. Tuy nhiên, trong trường hợp này, việc không phát huỳnh quang tại các nồng độ cơ chất cao ]à một điểu khác lạ của hiệu ứng lọc bên trong. Nó có thể được kiểm tra lại bằng việc tái đo sự phát huỳnh quang của các mẫu cơ chất đặc hơn sau khi pha loãng mẫu nhiều lần với đệm. Ví dụ: mẫu được pha loãng 20 lần so với đệm, sự phát huỳnh quang quan sát được sẽ không ít hơn 20 lần so với mẫu không pha loãng, đúng hơn nó sẽ cho thấy, sự phát huỳnh quang nhiều hơn mong đợi dựa trên hệ số pha loãng. Hiệu ứng lọc bên trong có thể được sửa chữa nếu sự hấp thụ của mẫu được biết ở các bước sóng kích thích và phát xạ được sử dụng trong sự đo phát huỳnh quang. Thực sự, sự phát huỳnh quang đã được hiệu chỉnh, Fhiệu chính có thể được tính toán từ sự quan sát sự phát huỳnh quang Fql)0n dl)ựcnhư sau (Lackowiez): 1 fi(A k íc h th íc h X A p h ủ t x ạ)/2 Fhiệu chỉnh _— rT71qunn sát được * - ,AU
/£ •
1 q \
KV. J.O /
ỊCƠ chất], iiM
Hinh 6.13. Những sai số trong sự đo động học enzym nhò có sự phát huỳnh quang hiệu úng lọc bên' trong: tốc đô của sự phát huynh quang từ cd chat peptit phát huỳnh quang trômelysin được vẽ đồ thị như mọt hàm số của nồng độ cd chất. Thay cho cách hoạt động hypecbol vuông nhận đứợc từ phương trình Henri - Michealis - Menten (đường cong a), chúng ta nhin thấy sự giảm tín hiệu nhận đuợc tại các nổng độ cơ chất cao {đường cong b). Có thể giải thích kết quả này như sự ức che co chất. Tuy nhiên trong trường hợp này, sự chênh lệch do hiệu ứng lọc bên trong trở nên quan trọng tại các nồng độ cơ chất cao. Sự giầi thích hiểu chỉnh có the hoàn thành bỏi sự đo phát huỳnh quang của mẫu cơ chất cao hơn ở vài điều kiện pha loãng.
229
Ở đây Ak(chth(ch và Aphát Xạ là sự hấp thụ mẫu ở bưóc sóng kích thích và phát xạ tương ứng. Công việc hiệu chỉnh này chỉ qua dạng hấp thụ mẫu giới hạn. Nếu sự hấp thụ mẫu lớn hơn khoảng 0,1; sự hiệu chỉnh sẽ không thích hợp. Vì lý do này, theo kinh nghiệm là nên bắt đầu với các mẫu có các giá trị hấp thụ vào khoảng 0,05 ở bước sóng kích thích. Nồng độ mẫu có thể được điều chỉnh từ đầu đến tỷ lệ tín hiệu không thích hợp, tiến hành một cách cẩn thận để không gây ra hiệu ứng lọc bên trong. 6.2.9. Phép đo dồng vị phóng xạ
Quy trình cơ bản để sử dụng dạng đồng vị phóng xạ trong phép đo động học enzym bao gồm cấu trúc của các loại cơ chất có tính phóng xạ, chúng sẽ được tách trong phân tỏ sản phẩm sau xúc tác. Sử dụng kỹ thuật thích hợp để phân tách cơ chất từ sản phẩm (xem mục 6.3. Các phương pháp tách trong nghiên cứu enzym), sau đó có thể đo lượng đồng vị phóng xạ trong cơ chất và các phần sản phẩm, và theo đó xác định sô lượng cơ chất m ất và sản phẩm tạo thành. Hầu hết các đồng vị được dùng phổ biến trong phép đo động học enzym phân huỷ qua sự phát xạ của các hạt (Bảng 6.4). Bảng 6.4. Các tính chất của các đổng vị phóng xạ thông thường được sử dụng trong nghiên cứu động học enzym Đổng vị
Quá trinh phân huỷ
Bán huỷ
Cacbon -14
6*c - ^ . 1p° + 714N
5.7000 nàm
Phospho-32
1532p - _ ,P ° + 1b3ĩs
14,3 ngày
Sulfua-35
^S ^po+ ^C I
87,1 ngày
Triti
1
3H - * . 1p° + 23He
12,3 nàm
Theo quá trình phân huỷ kiểu động học thứ nhất và sự mất (hay sự phân huỷ) của vật chất liên quan tối một chu kỳ bán huỷ từ nguồn chất đồng vị. Đơn vị tiêu chuẩn của độ phóng xạ được gọi là đơn vị phóng xạ Curi (Ci), được định nghĩa là tốc độ 1 gam Radi 226 phân huỷ hoàn toàn. Môí quan hệ này liên quan đến các chất đồng vị khác, rấ t hữu ích để xác định độ phân huỷ của bất kỳ vật chất nào ở tốc độ 2,22 X 10í2/phút (dpm). Các dung dịch của p—terphenyl hay stiben, trong xylen hay toluen, sẽ phát ra ánh sáng khi tiếp xúc với chất phóng xạ. Sự phát sáng này được biêt đến như là tia ánh lên. Ánh sáng phát ra nhấp nháy đểu đặn nhịp nhàng với máy đếm nhấp nháy, dụng cụ được thiết kế xung quanh một ông quang tử hoặc máy dò ánh sáng. Phóng xạ trên m ặt phẳng, như 230
sắc ký lớp mỏng (TLC) và các tấm ge] có thể được đo đếm bằng cách nhấp nháy sau khi phần của bề mặt có chứa mẫu dược cạo hoặc cắt ra và ngập trong chất nhấp nháy. Một phương tiện thông thường để phát hiện phóng xạ trên bề mặt như vậy đòi hỏi được đặt trên bề mặt tiếp xúc với một tờ phim chụp ảnh. Phóng xạ làm đen hình ảnh trên phim ảnh, làm cô' định vị trí vật mẫu lên bề mặt phim ảnh. Kỹ thuật này gọi là phóng xạ tự ghi. Đây là một trong những phương pháp cũ nhất để phát hiện phóng xạ. Ngày nay, phospho kỹ thuật số, một thiết bị chụp ảnh được sử dụng phổ biến để định vị và định lượng phóng xạ trên bề mặt hai chiểu (các gel khô, các tấm TLC,...). Phóng xạ trong một mẫu được định lượng bằng cách đo dpm của mẫu đó bằng một trong các phương pháp đã được mô tả ở trên. Tuy nhiên, vi không phải đầu dò nào cũng đạt hiệu quả 100%, mỗi dụng cụ sẽ cho kết quả khác nhau một ít so với giá trị dpm thực của mẫu. Các kết quả thí nghiệm về độ phóng xạ được coi là số' lần đêm/phút (crap’s: sự kiện phát hiện ra hoặc tính bằng thiết bị đo theo phút). Ví dụ: 1 }iCi mẫu sẽ hiển thị 2,22 X 106dpm. Nếu đầu dò được sử dụng để đo mẫu này có một hiệu quả là 50%, giá trị thử nghiệm thu được sẽ là 1,11 X 106cpm. Để biến đổi kết quả này thành giá trị dpm thực thì cần thiết phải đo một mẫu chuẩn của các đồng vị quan tâm. Thông tin này sẽ cho phép hiệu chuẩn của hiệu quả của các dụng cụ và sẵn sàng chuyển đổi giá trị cpm của các mẫu thành các đơn vị dpm. Khi các chất đánh dấu phóng xạ được sử dụng trong các nghiên cứu động học enzym, các mẫu cơ chất đánh dấu thường được trộn với cơ chất lạnh (tức cơ chất không đánh dấu) để có một cơ chất cuối cùng mà không cần phải sỏ dụng năng lượng cao của phóng xạ. Tuy nhiên, điểu quan trọng ỏ đây là phải xác định được tỷ lệ định lương phân tử đánh dấu phóng xạ cụ thể của mẫu (hoạt độ đặc trưng trong trường hợp này là độ phóng xạ, không nên nhầm lẫn với hoạt độ enzym). Độ phóng xạ đặc trưng có đơn vị là: độ phóng xạ/khôì lượng hoặc khối lượng lĩiol của mẫu. Các đơn vị thưòng gặp của các phóng xạ bao gồm: dpmẠiM và |iCi/mg. Với độ phóng xạ đặc trưng của một mẫu cơ chất xác định, ta có thể dễ dàng biến đổi thành các đơn vị đo độ phóng xạ trải qua một phản ứng enzym. Một ví dụ minh hoạ cho khái niệm nói trên: Giả sử rằng chúng ta muổn nghiên cứu sự biến đổi dihydroorotat của axit orotic bởi enzym dihydroorotat dehydrogenaza. Chúng ta đã có chất đánh dấu phóng xạ 231
!l,c trong cơ chất dihydroorotat đánh dấu 14c trộn với dung dịch dihydroorotat lạnh có nồng độ phóng xạ đặc trưng cuối cùng là 1.000 cpm/nM. Nồng độ cuối cùng là lmM co chất trong phản ứng một hỗn hợp có tổng khối lượng lOOjil. Chúng ta bắt đầu phản ứng vỡi enzym ủ hỗn hợp phản ứng ỏ 37°c. Mỗi 10 phút chúng ta loại bỏ 10|il của hỗn hợp phản ứng và thêm nó vào lOjil HC1 6N để biến tính các enzym và dừng phản ứng. 20^1 tổng 3ố cho lên một tấm TLC và sản phẩm được tách ra khỏi cơ chất. Cạo sản phẩm từ các tấm TLC và đo phóng xạ bằng đếm nhấp nháy (trong khảo nghiệm giả thuyết này, một điều khiển mẫu của lnmol của chất nền trong bộ đệm hỗn hợp phản ứng được phát hiện trên tấm TLC, tại chỗ cơ chất cạo ra, tính và đọc được l.OOOcpm). Bảng 6.5 và Hình 6.14 lần lượt hiển thị các kết quả này. Từ Hình 6.14 chúng ta thấy rằng, độ dốc của cpm so với thòi gian là lOOcpm/phút. Vì cơ chát đã có một phóng xạ cụ thể (SRA) là 1.000 cpm/nmol, giá trị độ dốc này có thể được trực tiếp biến đổi thành một giá trị vận tốc của 0,lnmol sản phẩm/phút. Vì khôi lượng hỗn hợp phản ứng phát hiện trên tấm TLC đo được là 10(il (tức là lx ic r5!), vận tốc trong đơn vị mol thu được bằng cách chia vận tốc trong nmol sản phẩm theo phút bởi lx ic r6! đến hiệu suất vận tốc của lO^M/phút. Những tính toán này tóm tắt như sau: độ dốc _ cpm / phút _ khối lượng sản phẩm _ nmol SRA cpm / nmol đơn vị thòi gian phút nmol / p hút _ khổì lượng sản phẩm / đơn vị thời gian
L
Bảng
232
6 .5 . K ế t
thể tích phản ứng mol -, , , , ---------— --------= p.M / phút đơn vị thòi gian
quả phản ứng giả t h iế t của dihydroorotat d e h y d r o g e n a z a với cơ chất [14CJ dihydroorotat
Thòi gian ủ (phút)
Độ phóng xạ (cpm)
10
980
20
2.010
30
3.050
40
3.900
50
5.103
60
5.952
Như ví dụ minh hoạ, việc tính toán cẩn thận là cần thiết trong thí nghiệm này. Sô lượng cơ chất tổng sô đã sử dụng sẽ được điều khiển bởi mục đích của thí nghiệm và hệ số Kn, của enzym. Độ phóng xạ riêng, trong một hướng khác, nên được điều chỉnh để đảm bảo rằng số lượng phóng xạ được sử dụng là tốì thiểu nhưng sẽ cung cấp tốt sô" đọc nền qua tín hiệu. Những hướng dẫn đối với sự chuẩn bị mẫu bằng cách sử dụng các đồng vị phóng xạ khác nhau có thể được tìm thấy trong bài báo của Oldham (1968, 1992). Điểm khác trong ví dụ minh hoạ ở đây là: việc tách tốt sau phản ứng giữa cơ chất đã đánh dấu và phân tử sản phẩm có tính chất quyết định đến việc sử dụng đánh dấu phóng xạ đối với động học enzym tiếp theo. Các cơ chất đánh đấu phóng xạ thưòng được sỏ dụng kết hợp với các phương pháp tách sắc ký và điện di. Khi cơ chất và/hoặc sản phẩm là một protein, như trong một vài thí nghiệm về kinaza và proteaza, một lượng lớn kết tủa hoặc dược giữ lại trên màng nitroxenluloza có thể bị sử dụng để tách riêng các đại phân tử từ các thành phần hoà tan. Một số trong những phương pháp này đã được thảo luận riêng trong mục 6.3.1.
Hỉnh 6.14. Phép phân tích phóng xạ của đihydroorotat dehydrogenaza, tiêu chuẩn dể dánh giá sự hợp nhất của 14c trong sản phẩm axit orotỉc. 6.2.10. Saì s ố trong đo độ phóng xạ
Ngoài việc sai số kết hợp với sự ghi chép, thông thường nhất, nguyên nhân bắt gặp sự đo hoạt độ phóng xạ không chính xác là sự hấp thụ. Khi sử dụng phương pháp phần tách cùng vổi nghiên cứu môi trường phân tách rắn như sắc ký giấy hoặc sắc ký lớp mỏng, điện di gel hoặc bị băt giữ trên than hoạt tính, vật liệu rắn trong mẫu có thể hấp thụ một số phát xạ được thải ra, sự phòng ngừa các tín hiộu từ nghiên cứu phát 233
hiện được áp dụng vào một mục đích đặc biệt. Sự tự hấp thụ này được hiệu chỉnh tốt nhất từ sự đo tất cả các mẫu và các chất chuẩn ỏ hằng sô' tỷ trọng trong giới hạn miligram mẫu theo mililit. Segel (1976) đã đề nghị sử dụng vật liệu trơ như gelatin để điều chỉnh hằng sô' của tất cả các mâu cho mục đích này. Vì vậy máy đếm nhấp nháy đo sự phát xạ ánh sáng, chính sự nhiễu được thảo luận cho sự đo phát huỳnh quang có thổ xảy ra. Nếu mẫu có màu đậm, sự dập tắt tín hiệu thích hợp cho sự cân bằng của ảnh hưỏng nội lọc có thể quan sát được. Khi xảy ra, điều này có thể phù hợp bỏi sự hiệu chỉnh mật độ quang của các mẫu và các chất chuẩn với mẫu trơ màu giống nhau (Segel, 1976). 6.2.11. Các phưđng pháp phát hiện khác
Độ hấp thụ, phát huỳnh quang, và độ phóng xạ là những phương pháp chung nhất của nghiên cứu động học của enzym, nhưng nhiều loại kỹ thuật khác cũng đã được sử dụng rấ t tốt. Ví dụ: phương pháp miễn dịch cũng dã dược ứng dụng như sự phân giải cơ chất protein bâi phưdng pháp thẩm tách protein (Western blotting), sử dụng các kháng thể để tăng sự kháng cơ chất protein đó. Gần đây, kháng thể đã được phát triển để loại trừ tác động trở lại bởi các dạng phosphoryl hoá của peptit và protein; những thuốc thủ này đã được sỏ dụng rộng rãi để thực hiện hoạt tính của enzym kinaza và phosphataza trong các phương pháp thẩm tách protein (Western) và thẩm tách điểm (dot blotting), cũng như việc phân tích ELISA. Các bài báo về phương pháp phát hiện miễn dịch có thể dược tìm trong Copeland (1994); Harlow và Lane (1988). Cáo phương pháp ảnh phân cực cũng đã được sử dụng rộng rãi thực hiện các phản ứng enzym. Nhiều oxidaza sử dụng các phân tử oxy trong chu trình của chúng, và đi kèm với sự giảm của 0 2 từ dưng dịch hoà tan, trong đó sự xúc tác xảy ra có thể được theo dõi bồi một điện cực 0 2 đặc biệt. Điện cực pH rấ t nhạy có thể được sử dụng để tách, hoặc phổng thích proton trong dung dịch trong suốt quá trình biến đổi của enzym. Các enzym thực hiện tính oxy hoá khử hoá học như một phần của quá trình xúc tác cũng có thể được theo dõi bằng phương tiện điện hoá. Các tài liệu của các phương pháp này có thể được tìm thấy trong các bài báo của Eisenthal và Danson (1992). Sự đa dạng của những phương pháp phát hiện đă được áp dụng cho các phép đo hoạt tính enzym, đảm bảo cho cách nhìn toàn điện trong bất kỳ một khía cạnh nào. Sự thảo luận này có thể cung cấp cho ngưòi đọc 234
một tổng quan đầy đủ về các kỹ thuật phổ biến trong lĩnh vực này. Các tài liệu tham khảo đã đưa ra các giải thích sâu hơn. Một nguồn tài liệu rất tốt khác cho các phương pháp nghiên cứu enzym lý thú và mới là Tạp chí phân tích Hoá Sinh (Academic Press), lịch sử cố quan hệ từ các tò báo với sự phát triển và cải biến của các nghiên cứu enzym. Cuổi cùng, hàng loạt phương pháp trong enzym học bao gồm cốc tập chuyên dụng đôi với các báo chuyên sâu của nhiều chủ đề trong enzym học. Các phường pháp nghiên cứu được chi tiết cho phần enzym có khả năng tiến hành và rốt thường xuyên sẽ chỉ ra ít nhất các nghiên cứu đôì với enzym liên quan. 6.3. C Á C PHƯƠNG PH ÁP PHÂN TÁCH TRONG NGHIÊN cứu ENZYM
Đối với nhiều phương pháp nghiên cứu enzym, các phương pháp phát hiộn đã được mô tả và được áp dụng chỉ sau khi cơ chất hoặc sản phẩm được tách khỏi hỗn hợp từ phần còn lại của thành phần phản ứng, như trong trường hợp khi phương pháp không phát hiện được sự khác nhau giữa đặc tính phân tích và đặc tính khác của chính mình. Ví dụ: nếu các tính chất quang học của cơ chất và các sản phẩm của một phản ứng enzym là giống nhau, chỉ đo phổ của hỗn hợp phản ứng sẽ không cung cấp một phương tiện hữu ích của sự thay đổi quan sát liên tục nồng độ của các thành phần riêng biệt. Phần này được mô tả ngắn gọn một số’kỹ th u ật tách thông đụng được áp dụng cho động học enzym. Các kỹ thuật này thưòng được kết hợp với một trong những phương pháp phát hiện đã được đảm bảo để phát triển nghiên cứu hữu ích cho cốc enzym cần quan tâm. 6.3.1. S ự phân tách các protein từ những chất tan có khối lượng phân tử thấp
Một sô' chiến lược liên quan đến việc đo sự hợp nhất của một chất đánh dấu phóng xạ hay đánh dấu quang học gắn vào một protein, hoặc là một đoạn peptit của protein. Đối với những phương pháp phân tích này thì nó là thuận tiện để tách các protein từ các chất tan khi phát hiện ra số lượng lân của chúng. Điều này có thể được thực hiện theo nhiều cách (xem thêm Chương 4, mục 4.7). Protein có thể được kết tủa ra khỏi dung dịch bằng cách bổ sung các axit mạnh hay chất hữu cơ làm biên tính, sau đó ly tâm. Dung dịch TCA 10% thường được sử dụng cho mục đích này. ĐỐI vói các giải pháp pha loãng protein (< 5|ig), các TCA thường được bổ sung với các chất tẩy rửa deoxychotat (DOC) để có hiệu quả hơn. Protein cũng có thể được kết tủa bỏi nồng độ muối amoni sulphat cao; hầu hêt các protein 235
kết tủa từ dung dịch tại nồng độ amoni sulphat 80% bão hoà. Dung môi hữu cd như axeton, axetoitril, metanol, hoặc kết hợp một số trong các dung môi này cũng được sử dụng để biên tính và kết tủa protein. Ví dụ: pha trộn 100jil của một dịch protein với 900|il của một hỗn hợp axeton/axetonitril vói tỷ lệ là 1:1 sẽ kết tủa protein với hiệu quả tốt. Ngoài những phương pháp này, protein cụ thể có thể được tách ra từ các dung dịch vối một kháng thể cô" định (ví dụ: một kháng thể liên kết trực tiếp đến hạt agaroza, hoặc gián tiếp đến hạt protein A hoặc G làm tăng sự kháng protein đích (Harlow và Lane, 1988)). Protein cũng có thể được tách ra từ các dung dịch có khối lượng thấp bằng cách chọn lọc phân tử gắn lên màng nitroxenluloza. Nitroxenluloza và những vật liệu màng khác liên kết mạnh với các protein, trong khi đó cho phép các thành phần khác của dung dịch đì qua. Do đó, người ta có thể tách được các phân tử protein trong dung dịch bằng cách lọc hoặc ly tâm đi một màng nitroxenluloza. Ví dụ: nhiều nghiên cứu kinaza được dựa trên việc kết hợp enzym với 32p thành cd chất protein. Sau khi ủ, cơ chất protein được giữ lại trên đĩa màng lọc nitroxenluloza. Sau đó màng lọc được rửa để loại bỏ 32p liên kết ngẫu nhiên, tính phóng xạ được giữ lại trốn bộ lọc có thể được đo bằng cách đếm nhấp nháy. Tất nhiên các kinaza (là một protein) cũng bị gắn lên màng nitroxenluloza bằng phương pháp này. Tuy nhiên, vì khối lượng của enzym trong một thí nghiệm có liên quan là rấ t nhỏ đối vói cơ chất protein, điểu cơ bản đối với bất kỳ sự đánh dấu phóng xạ lên enzym là không ảnh hưỏng và có thể tách ra khỏi cơ chất do thực hiện đo kiểm tra thích hợp. Một chiến lược tương tự có thể được sử dụng là các bộ lọc cắt dựa trên khối lượng phân tủ. Cạc bộ lọc này có nhiều hình dạng khác nhau, dược cấu tạo bỏi vật chất xốp với kích thước lỗ chỉ cho phép các phân tỏ có giá trị giới hạn đi qua, các phân tử có khổì lượng phân tử lớn như protein được giữ lại trong bộ lọc này. Một khuyến cáo là dơn đặt hàng yêu cầu đôi vói dụng cụ lọc này: loại bỏ khối lượng phân tử được xác định bởi miêu tả giá trị trung bình của sự phân bô" thông thường của các khôi lượng phân tử lọc. Vì vậy, để ngăn ngừa sự m ất m át trực tiếp, cách tốt nhất là sử dụng dụng cụ lọc có sự loại bỏ khối lượng phân tử thấp hơn nhiều so với khôi lượng phân tử protein đang nghiên cứu. “Các nhà sản xuất” mô tả các màng lọc đặc trứng phải đọc cẩn thận trước khi sử dụng các sản phẩm. Một phương pháp khác cho sự phân tách các protein từ các phân tử có khối lượng phân tử thấp là sắc ký loại bỏ kích cỡ. Các cột nhỏ loại bỏ 236
kích cổ dùng một lần thông thường như các cột loại muối là thương phẩm được dùng cho loại các chất hoà tan khối lượng phân tử thấp từ dung dịch protein. Các nhựa sử dụng trong các cột này được chọn theo phân tử lớn như các protein, giải hấp thụ ở thể tích chưa nạp của cột; các dung dịch khôi lượng phân tử thấp như muốỉ, giải hấp thụ chậm nhất. Loại cột loại muối loại bởi trọng lực, vì sự khác biệt kho'i lương phân tử lớn giữa các protein và các chất hoà tan nhỏ cho phép tách không cần phần tách sắc ký cao. Có thể tham khảo phương pháp này và những phương pháp khác để tách các phân tử lớn từ các chất hoà tan khối lượng phân tử thấp được mô tả rấ t chi tiết trong nhiều tài liệu tham khảo. 6.3.2. Các phương pháp phân tách sắc kỷ
Có 3 phương pháp phân tách sắc ký được sử dụng thông dụng nhất trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu enzym là sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Trước khi thiết bị HPLC trở thành phổ biến, các kiểu sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng đã được sử dụng rộng rãi trong phân tách các cơ chất có khối lượng phân tử thấp. Ngày nay, các phương pháp đó đã được thay thế bâi HPLC. Tuy nhiên, các phương pháp phân tách đó vẫn được dùng cho những chất đánh dấu phóng xạ có cơ chất khối lượng phân tử thấp. Các phương pháp trên đã được lựa chọn cho các thí nghiệm, công việc bao gồm cho cả các chất đồng vị phóng xạ. Lý thuyết và thực hành về sắc ký giấy và TLC rấ t quen thuộc với hầu hết người học về hoá học nói chung và hoá học hữu cơ nói riêng, v ề cơ bản, sự phân tách đó được thực hiện thông qua sự tương tác của các phân tử trong mẫu bằng sự trao đổi ion hoặc giấy có phủ nhựa silica bazd, chúng được phủ lên các tâm giấy, các bản nhựa hoặc các bản kính. Sử dụng ông mao quản để chấm mẫu lên điểm đánh dấu ở gần phần mép của tò giấy, tờ giấy đó được đặt trong một bình với một sô' hệ dung môi (hỗn hợp của nưổc với các đung môi hữu cơ). Bình chứa được đậy kín và dung môi dì chuyển lên tấm giấy thông qua hoạt động mao dẫn (Hình 6.15, bước 1 và 2). Sự di chuyển của từng mẫu phụ thuộc vào mức độ tương tác của chúng với các thành phần trong dung môi. Sau một thời gian cố định, tấm giấy được lấy ra làm khô. Sự định vị của những chất tan đã di chuyển trong suốt quá trình chạy sắc ký được quan sát bởi ifr&ỵ,chup ảnh phóng xa, soi tờ giấy với ánh sáng tử ngoại, hoặc bằng cách phun lên tấm giây một loại hoá chất đặc biệt (ví dụ: ninhydrin), 237
chúng sẽ phản ứng với chất tan đặc biệt để tạo thành các vệt màu (Hình 6.15, bước 3). Xác định các vị trí vệt rồi đánh dấu trên bản giấy và các vệt có thổ được cắt ra hoặc cạo ra để đếm trong máy đếm nhấp nháy. Các phóng xạ của toàn bộ tờ giấy có thể được định lượng bỏi máy quét phóng xạ hai chiểu như mô tả trước đó. Trong quá trình thảo luận về sự phân tích phóng xạ, chúng ta sử dụng ví dụ về sự phân tích dựa trên TLC cho sự biến đổi của [14C] dihydroorolat thành [HC] axit orotic bởi enzym dihydroorolat dehydrogenaza. Hình 6.16 cho thấy sự phân tách của những phân tử trên TLC và sự phát hiện chúng bằng phương pháp chụp ảnh phóng xạ.
1
2
Hlnh 6.15. Sơ đổ đdn giản của nghiên cứu enzym bằngTLC cơ bản Trong bước 1, mẫu của hỗn hợp phàn ứng được cho vào bản TLC. Tiếp theo bản được làm khô và cho vào bình chạy sắc ký (bước 2) có pha di chuyển ngược. Sau khi chạy sắc ký, bản sắc ký lấy ra khỏi bình và lại được làm khô, định vị các vệt cơ chất và/hoặc sản phẩm rồi xác định, ví dụ: bằng cách phun lên bản vối chất nhuộm màu thích hợp (bưốc 3) như thí nghiêm.
Hình 6.16, ví dụ đã cho mục 6,2.9 minh hoạ rõ ràng cho cách sử dụng sự phân tích dựa trên TLC. Sự mô tả tỉ mỉ hơn về cách sử dụng sắc ký giấy và TLC trong phân tích enzym có thể được tìm thấy trong những bài của Oldhan (1968, 1977). Phương pháp HPLC dã được sử dụng rộng rãi để phân tách những sản phẩm và những chất có khối lượng phân tử thấp cũng như những chất peptit cd bản và những sản phẩm của các enzym phân giải protein. Sự giới thiệu về những loại nhựa có hệ số’nén thấp, điển hình dựa trên silica đã làm cho nó có thể chạy sắc ký lỏng ở nhiều áp lực lớn. Tại các áp lực cao (ví dụ: 5.000 psi), độ phân giải được nâng cao đáng kể. Tỷ lộ lưu lượng như vậy nhanh hdn nhiều có thể được sử dụng. Thồi gian cần thiết cho một lần chạy sắc ký được rút ngán với sự hỗ trỢ của máy móc thiết bị hiện đại. Sự phân tách HPLC điển hình được thực hiện Lrong hơn 30 phút. Có ba cơ chế Jifean tách đưộc sử dụng 238
phố biến nhất trong nghiên cứu enzym là ngược pha, trao đổi ion và HPLC loại bỏ kích cỡ.
Hình 6.16. Ảnh chụp tự động bằng phóng xạ của một bân TLC chứng minh sự tách của 14c đánh dấu dihydroorotat và axit orotic, cơ chất và sản phẩm của enzym dihydroorotat dehydrogenaza: ỏ phía bên trải, [14C] dihydroorotat; ở phía bên phải, [14C] axit orotíc; d giữa, là một hổn hợp của 2 mẫu đánh dấu phóng xạ (chứng mình khả năng tách 2 hợp chất trong hỗn hợp phàn ứtìg).
Trong sự phân tích bằng phương pháp ngược pha dựa trên sự tương tác cửa các phân tử vối bề mặt kỵ nưổc của pha dừng dựa vào alkyl silan. Những mẫu đặc biệt cho lên cột trong dung môi phân cực để tương tác kỵ nưóc tối da vói pha tĩnh cột. Sự phân cực nhỏ nhất một chất tan đặc biệt, phần lớn nó được giữ lại. Sự duy trì cũng bị ảnh hưâng bâí nồng độ cacbon trên đơn vị thể tích của pha tĩnh. Do vậy, một cột C18 điển hình, sự giữ ]ại các phân tử không phân cực hơn là một cột C8- Pha tĩnh phải được lựa chọn cẩn thận, dựa vào bản chất tự nhiên của các phân tử được phân tách. Những phân tủ bám vào pha tĩnh được tách ra từ cột trong những dung môi có độ phân cực thấp có thể cạnh tranh hiệu quả với các phân tử phân tích đối với bê' mặt kỵ nước của pha tĩnh. Điển hình là metanol, axetonitril, axeton và hỗn hdp các dung môi hữu cơ với nuớc là được sử dụng cho giải hấp. Sự giải hấp đẳng dòng và gradient cả hai được dùng một cách thông dụng, sự phụ thuộc chi tiết của phân tách được* nỗ lực hoàn thiện. Sự tách pha ngược điển hình có thể bao gồm sự ứng dụng cho mẫu vào cột trong dung dịch axit trifluoaxetic (TFA) 0,1% và giải hấp với một gradien từ 100% dung môi này tới 100% của một hỗn hợp dung môi gồm 70% axetonitrìl, TFA 0,085% và nước. Khi tỷ lộ phần trăm của dung môi hữu cơ tăng lên, liên kết chặt hơn nhiều, các phân tử kỵ nước sẽ bắl đầu tách ra. Khi các phân tử khác nhau trong mẫu lách ra từ cột, chúng có thể được phát hiện bởi sự hấp thu theo đưòng thẳng, hoặc được phát hiện bằng phát huỳnh quang (có một sô phương pháp phát hiện khác cũng được sử dụng, nhưng đây là 2 phương pháp được sử dụng phô’ biến nhất). 239
Đầu dò phản ửng phân tử giải hấp là sản phẩm trên biểu đồ giải hấp băng bằng Gaussian—Lorentzian của tín hiệu như hàm số của thời gian. Chiều dài của thời gian giữa cho mẫu vào cột và sự xuất hiện tín hiệu lốn nhất, được đề cập tới như là thời gian lưu, là đặc tính của một phân tử riêng biệt trên một cột riêng biệt dưới điều kiện nhất định (Hình 6.17).
T hài gian (phút)
Hlnh 6.17. Tín hiệu điển hình từ m ột sắc ký HPLC của m ột phân tử Mau được cho vào cột ở thời gian 0 vả giải hấp, sự phụ thuộc lẻn cột và pha động, sau một
thời gian lưu dác trưng. Nồng độ của phân tử trong mau có thể được xác định bởi vùng hợp nhất dưới đỉnh, hoặc lừ đỉnh cao trên đuởng nền, như được xác định trong hình này.
Để định lượng lượng cơ chất bị mất đi hoặc lượng sản phẩm tạo thành bỏi HPLC, ngưòi ta thưòng tính vùng hợp nhất dưới một đỉnh trong sắc ký và so sánh nó với một đồ thị điểu chỉnh của vùng dưới đỉnh như là một hàm sô' của khối lượng mẫu chuẩn của chât quan tâm phân tích. Chúng ta hãy sử dụng lại phản ứng của dihydroorotat dehydrogenaza như là một ví dụ. Cả cơ chất - dihydroorotat, và sản phẩm - axit o r o t i c , có thể được đặt mua với độ tinh sạch cao. Itta rat và cộng sự (1992) đã phát triển một thí nghiệm nghiên cứu HPLC pha ngược đối với hoạt tính dihydroorotat dehydrogenaza dựa trên việc tách dihydroorotat và axit orotic trên cột C18 sử dụng giải hấp đẳng dòng với hỗn hợp pha dộng (nước/dệm/metanol) và phát hiện bởi sự hấp thụ ở bưốc sóng 230nm. Khi một mẫu đihydroorotat (DHO) tinh sạch được cho lèn trên cột này và được giải hấp đã được mô tả rõ ràng, kết quả sắc ký trình bày là một đỉnh được giải hấp phút 4,9 sau khi cho lên. Một mẫu tinh sạch axit orotic (OA), trôn một hướng khác, xuất hiện một đỉnh dược giải hấp sau 7,8 phút chính điều kiện đó. Sử dụng các mẫu tinh sạch này, các nhân viên đã đo vùng dưới của các đỉnh đối vói các nồng độ 240
tiêm DHO và OA khác nhau, và từ những sô liệu kết quả đã xây dựng nôn đồ thị điều chỉnh cho từng chất phân tích này. Chú ý rằng, vùng dưới một đỉnh sẽ liên quan trực tiếp với khối lượng tra chất phân tích vào cột. Do đó đồ thị điều chỉnh thường xuyên được xây dựng với trục y biểu hiện vùng đỉnh hợp nhất trong một sô' đdn vị của vùng [mm2, đơn vị hấp thụ (AU),...] và trục Xbiểu hiện khối lượng chất phân tích được tra vào vói nanogram, nanomol,... Khi thể tích mẫu tra vào được biết, nó dễ dàng chuyển những đdn vị khối lượng mẫu này thành đơn vị nồng độ chuẩn. Theo cách này, Ittarat và cộng sự (1992) xác định được: vùng dưối các đỉnh tuyến tính với nồng độ của cả DHO và OA trong khoảng nồng độ 0-200fiM. Với kết quả này, ta có thể đo được nồng độ của chất (DHO) và sản phẩm (OA) trong hỗn hợp phản ứng bao gồm dihydroorotat dehydrogenaza và một nồng độ chất ban đầu được biết, như là một hàm của thời gian sau khi phản ứng bắt đầu. Từ đồ thị của nồng dộ DHO hoặc OA như là một hàm của thòi gian phản ứng, do đó tốc độ ban đầu của phản ứng có thể được xác định, Với trang thiết bị phân tích HPLC hiện đại, sự hợp nhất của vùng đỉnh được biểu diễn bơi xây dựng trong chương trình máy tính để phân tích dữ liệu. Nếu thiết bị đo kết hợp vói máy tính, hai phương pháp thay thế thường dùng có thể dùng để xác định số' lượng các đỉnh từ bản ghi biểu đồ giải. Cách đầu tiên là đo chiều cao của đỉnh, đúng hơn là vùng hợp nhất như đo khối phân tích. Điều này được thực hiện bằng cách vẽ một đường thẳng nôì vối đường nằm ngang ở phía bên kia của đỉnh quan tâm. Sau đó vẽ một đưòng thẳng vuông góc vái trục X của bản ghi, từ đỉnh cao n hất đến đường vẽ giữa cốc điểm đường nằm ngang, Chiều dài của đường vuông góc có thể đo bằng thước ghi lại chiều cao của đỉnh (Hình 6.17). Thao tác này được lặp lại vói từng mẫu chuẩn để dựng đưòng cong. Phưdng pháp thứ hai bao gồm ước lượng vùng hdp nhất của đỉnh bằng cách vẽ lại đưòng giữa các điểm nằm ngang. Hai phía của đỉnh và đưòng nằm ngang vừa vẽ xác định vùng xấp xỉ tam giác, được cắt cẩn thận từ tờ biểu đồ bằng kéo. Phần được cắt của tò giấy được cân trên cân phân tích, và khôi lương của nó được coi như ưốc lượng hợp lý của vùng đỉnh liên quan. Rõ ràng, hai phương pháp thủ công có nhiều lỗi hơn phương pháp sử dụng máy tính hiện đại. Tuy nhiên, những phương pháp truyền thông này đã giúp sức cho các nghiên cứu viên từ lâu trước khi ra đời máy tính 241
phòng thí nghiệm và vẫn có thể sỏ dụng thành công khi máy tính không thể sử dụng. Khi pha ngược được hình thành, kiểu sắc ký được sử đụng nhiều trong các thử nghiệm enzym là sắc ký trao đổi ion và HPLC loại trừ kích thước. Trong sắc ký trao đổi ion, chất phân tích kết hợp với pha tĩnh tích điện thông qua các tương tác tĩnh điện. Các tương tác này có thể bị phá võ bằng cách tăng lực ion (ví dụ nồng độ muối) của pha động: tương tác điện giữa chất phân tích và pha tĩnh càng mạnh, nồng độ muối của pha động cần để tách chat phân tích ra càng lớn. Do đó, các chất phân tích đa thành phần có thể được phân tách và định lượng bằng cách giải hấp khác nhau từ cột trao đổi ion. Nguyên lý thông thưòng để tách là cho mẫu lên cột ỏ đệm có lực ion yếu và tách ra với gradient nồng độ muối từ thấp đến cao (thường dùng NaCl hay KC1) trong cùng một hệ thống đệm. Với sắc ký lọc gel, phân tử phân tích được phân tách dựa trên khôi lượng phân tử của nó. Dạng sắc ký này không thông dụng trong kết hợp với các thí nghiệm enzym, ngoại trừ phân tích enzym phân giải protein khi cơ chất và sản phẩm là peptit hay protein. Đối với hầu hết enzym thuỷ phân các phản ứng giữa các phân tử nhỏ, sự khác biệt về khối lượng phân tử giữa cơ chất và sản phẩm quá nhò để có thể đo được bằng phương pháp này. Những pha tĩnh trong loại trừ kích thưởe khả thi trong các phân tử có các phân đoạn khối lượng khác nhau. Trong chọn cột cho sắc ký lọc gel, chú ý là chọn những cột có giói hạn lớn giữa khôi lượng phân tử của chất lổn nhất và nhỏ nhất của pha tĩnh. Cùng lúc đó, chất phân tích có khôi lượng phân tử lổn hờn sẽ nằm trong vùng phân tách và không bị tách ra trong thể tích trống của cột. Theo những hướng dẫn này, sẽ phân tách tốt giữa các chất phân tích trên cột và có thể định lượng tấ t cả các đỉnh phân tích. Ví dụ: một cột với khoảng cách phân tách từ 8.000 - 500 sẽ lý tưởng để nghiên cứu sự thuỷ phân bởi một proteaza của một peptit khôi lượng 5.000 Daỉ thành hai mảnh 3.000 và 2.000 Dal, khi đó 3 chất phân tích sẽ được tách ròi thành các phân đoạn của cột. M ặt khác, một cột với khoảng cách phân tách từ 5.000 - 500 sẽ không phải là một lựa chọn tốt, khi khối lượng phân tử của cơ chất gần vói giói hạn của khoảng cách phân tách, do đó đỉnh cơ chất hầu như tách với thể tích trông của cột, có khả năng gây khó khăn cho định lượng. Phân tích các đỉnh từ cột trao đổi ion và lọc gel là cần thiết để miêu tả pha ngưdc HPLC. 242
6.3.3. Phương pháp điện di trong các thí nghiệm enzym
Điện di là phương pháp thường dùng hiện nay để phân tách các đại phân tử trên gel agaroza hay acrylamit. Kỹ thuật điện di thông thường nhất trong các thí nghiêm enzym là điện di trên gel acrylamit có SDS (SDS-PAGE), dùng để phân tách các protein và peptit dựa vào khối lượng phân tử của chúng. Trong SDS-PAGE, mẫu protein hay peptit được bao bọc bởi lớp SDS tích điện âm làm cho chúng tích điện cùng dấu âm. Khi cho mẫu vào ge 1, có dòng điện chạy qua gel, các protein tích điện âm sẽ chạy về phía cực dương. Dưới cốc điều kiện này, sự di chuyển của các phân tử về cực dương sẽ được làm chậm lại bởi mạng lưới polymer của gel, và mức độ làm chậm lại sẽ phụ thuộc vào khôi lượng phân tử của các chất điện di. Sau đó, các phân tử có khôi lượng lớn sẽ bị di chuyển chậm trong cùng một thời gian, trong khi đó các phân tử nhỏ sẽ di chuyển nharih hơn trong mạng lưới gel và sẽ di chuyển quãng đường dài hơn trong cùng một khoảng thòi gian. Đó là nguyên tắc của sự tách các băng protein và peptit bỏi SDS-PAGE. Các ví dụ của việc sử dụng SDS-PAGE có thể được thấy trong các thí nghiệm nghiên cứu hoạt tính enzym của các enzym thuỷ phân protein, các kinaza, các nucleaza phân cắt ADN và các chất tương tự. Mục đích của điện di trong các thí nghiệm proteaza là phân tách các cơ chất protein hay peptit của các phản ứng enzym từ sản phẩm. Khoảng phân tách của SDS-PAGE đa dạng tuỳ theo tỷ lệ % của acrylamit trong gel. Nói chung, phần trãm acrylamit khoảng từ 5% đến 20% được dùng để phân tích các protein dạng cầu có khối lượng phân tử từ 10.000 đến 100,000 Dal. Phần trăm acrylamit cao hơn, dùng để phân tách các peptit có khối lượng phân tử thấp hơn (thưồng là gel 10 - 20%). Trong một thí nghiệm điển hình, protein hoặc peptit cơ chất được ủ với proteaza trong một ổng (lọ) phản ứng nhỏ, như là ông ]y tâm. Sau thời gian phản ứng được định trước, một thể tích của hỗn 'hợp phản ứng được trộn với một thể tích tương đương đệm mẫu chứa SDS 2x để làm biên tính các protein và phủ lên chúng chất tẩy tích điện âm (Copeland, 1994). Chất đệm này chứa SDS làm duỗi protein và phủ nó, đồng thòi là tác nhân cắt đứt liên kết disulfua (điển hình mercaptoetanol), glyxerol tạo nên tỷ trọng của dung dịch, và một phân tử khôi lượng thấp, thuốc nhuộm trơ làm dấu hiệu trong quá trình điện di trên gel (điển hình là blue bromophenol). Hỗn hợp mẫu sau đó được ủ ở nhiệt độ nước sôi trong 1 - 5 phút và được tra lên bản gel acrylamit có nồng độ % tương ứng để 243
thực hiện phân tách. Điện trường được áp dụng lên bản gel từ nguồn điện, và điện di được tiếp tục trong một khoảng thời gian cố’định cho tái khi chất chuẩn màu blue bromophenol ở phía trước chạy tói đáy của bản gel (đôi với gel 10%, chạy điện di điển hình thưòng được thực hiện ở điện thế Ổn định là 120V trong 1 ,5 - 3 giờ, tuỳ thuộc vào kích thước của gel). Sau khi điện di, các băng peptit hoặc protein được quan sát thấy nhờ chất nhuộm peptit đặc hiệu, như Comassie Brilliant Blue hoặc nhuộm bạc (Hames và Rickwood, 1990; Copeland, 1994). Giếng đối chứng chỉ chứa peptit hoặc protein cơ chất luôn là dải liên tục, được tra ở cùng nồng độ như nồng độ lúc đầu của cơ chất trong phản ứng enzym. Khi có thể, một giếng đổi chứng thứ hai nên được chạy chứa các mẫu của sản phẩm mong đợi của phản ứng enzym. Giếng thứ ba, chứa các chất chuẩn (marker, một tập hợp các protein có khôi lượng phân tử đã biết) thông thường cũng được chạy trên cùng bản gel. Lượng cơ chất còn lại và lượng sản phẩm được hình thành cho mỗi phản ứng nhất định có thể được xác định nhờ tỷ trọng từ các băng được nhuộm trên gel. Có nhiều loại máy đo tỷ trọng có giá trị đối với mục đích này (từ Biorad, Pharmacia, Molecular Devices và các công ty khác). Hình 6.18 minh hoạ cho phép phân tích proteaza sử dụng SDSPAGE. Trong ví dụ này, proteaza phân cắt cơ chất protein 20kDa thành hai mảnh không bằng nhau (12 và 8kDa). Khi thòi gian phản ứng tăng, lượng cơ chất còn lại griảm, và lượng sản phẩm được hình thành tăng lên. Dựa vào kết quả đọc gel nhờ đo tỷ trọng, một lượng liên quan của cả cơ chất và sản phẩm có thể được xác định bằng cách xác định mức độ nhuộm của các bảng này. Như minh hoạ trong Hình 6.8, việc thực hiện phép tính toán này là chính xác và dễ dàng. Tuy nhiên, việc biến đổi các đơn vị tỷ trọng thành các đdn vị nồng độ của cơ chất và sản phẩm là ít phức tạp hơn. Đốỉ với lượng cơ chất mất đi, nó có thể chạy trên gel tương tự vối tra mẫu cơ chất nồng độ khác nhau (ỏ các nồng độ đã biết) và thiết lập đưòng cong mật độ nhuộm như một hàm số cùa nồng độ cơ chất. Ta có thể thực hiện tương tự đôi với sản phẩm của phản ứng enzym khi mẫu chính xác của sản phẩm đã biết. Để peptit tổng hợp, việc này được hoàn thành dê dàng. Mẫu chuẩn đôĩ vói sản phẩm protein đôi khi có thể thu được bằng cách sản xuất các protein sản phẩm tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn chủ. Tuy nhiên, điểu này thường không phải là một lựa chọn thuận lợi, và trong những trường hợp như thế, báo cáo có thể bị giới hạn tới các nồng độ liên quan dựa trên cường độ nhuộm màu. 244
Phân tích như đã trình bày ở trên có thể thực hiện tốt đôĩ với mẫu proteaza được tinh sạch, nơi mà các băng protein duy nhất trên gel là từ cơ chất và sản phẩm.
10
(b)
20
30
40
so
Thòi gian (phút)
Hình 6.18. Mô hình sơ lược của phân tích proteaza dựa trên phân tách SDS-PAGE của cơ c h ấ t protein (20kDa) và sản phẩm (12 và SkDa) của enzym (a) Kết quả SDS-PAGE điển hình của thí nghiệm như trên: sự giảm của cơ chất sau đó có thề đuợc xác định về số lượng nhờ nhuộm hoặc các phương pháp phân (ách khác; (b) Hướng theo thòi gian của sự giảm cd chất dựa trên nhuộm bâng cơ chất trong gel và xác định số lượng bằng tỷ trọng kế.
Enzym đích - chứa các băng protein có thể làm khó khăn cho sự phân tích cơ chất và các báng sản phẩm trên gel. Một cách giải quyết thông thường trong trường hợp này là thực hiện phân tích thẩm tách protein (Western blot), sử dụng kháng thể để nhận biết các cơ chất đặc hiệu hoặc sản phẩm của phản ứng enzym trong nghiên cứu này. Quy trình chi tiết thẩm tách protein đã được mô tả (Harlow và Lane, 1988; Coreland, 1994, cùng các tập san kỹ thuật của các nhà sản xuất thiết bị điện di như Biorad, Pharmacia và Novex). Tóm lại, trong thẩm tách protein, gel SDS-PAGE được chạy dưới điểu kiện điện di thông thường. Sau đó, bản gel sẽ được đặt trong dung dịch đệm được chuẩn bị tạo điều kiện cho sự di chuyển tối ưu của protein trong chất nền của gel. Bản gel sau đó được trải lên một màng nitroxenluloza, các vị trí bám protein còn lại trên màng nitroxenluloza sẽ được tiền ủ bởi sô' lượng lớn các protein không đặc hiệu (như sữa bột không béo, gelatin hoặc albumin huyết thanh bò). Sau khi ủ, màng nitroxenluloza sẽ được nhúng vào dung dịch có chứa các kháng thể nhận biết đặc hiệu các protein hoặc peptit quan tâm (ví dụ trong trường hợp này là cơ chất hoặc sản phẩm của phản ứng enzym). Kháng thể này được gọi là kháng thế sơ cấp, thu được từ động vật được miễn dịch (chuột hoặc thỏ) với mẫu protein hoặc peptit tinh khiết (Harlow và Lane, 1988). 245
Sau khi xử lý vói kháng thể sơ cấp và ủ bởi protein không đặc hiệu, màng nitroxenluloza sẽ được xử lý tiếp với kháng thê thứ cấp nhận biết những kháng thể sơ cấp từ những loài động vật đặc biệt. Ví dụ: nếu kháng thể sơ cấp thu được từ thỏ được miễn dịch, thì kháng thể thứ cấp sẽ là một kháng thể kháng thỏ. Kháng thể thứ cấp này sẽ chứa các dấu hiệu giúp nhận biết sự có m ặt của kháng thể một cách đơn giản và nhạy. Các kháng thể thứ cấp này có chứa các đồng vị đánh dấu. Một phương pháp phổ biến là sử dụng một kháng thể thứ cấp đã được đánh dâu đồng hoá trị với biotin, một phối tử liên kết chặt chẽ và đặc hiệu với streptavidin, có bán sẵn và được gắn kết với các enzym như enzym peroxidaza cỏ ngựa hoặc phosphataza kiềm. Kháng thể thứ cấp có gắn biotin này bám chặt với màng nitroxenluloza tại vị trí liên kết với kháng thể sơ cấp. Vị trí của kháng thể thứ cấp trên màng nitroxenluloza sau đó được phát hiện bằng cách xử lý màng nitroxenluloza với một dung dịch chứa streptavidin gắn vổi enzym. Sau khi phức hợp streptavidin gắn enzym được bao lấy vị trí thầm, thẩm tách sẽ được xử lý với dung dịch chứa nhóm mang màu cơ chất cho enzym gắn vối streptavidin. sản phẩm của phản ứng enzym tạo ra một kết tủa màu trên màng thấm nitroxenluloza tại bất cứ vị trí nào có phức enzym - atreptavidin. Theo con đưòng vòng này, sự có mặt của băng protein quan tâm có thể được phát hiện đặc hiệu từ gel quá đầy với các protein thô. SDS-PAGE cũng được sử dụng trong các thí nghiệm enzym để thấy được sự kết hợp chặt chẽ giữa phosphat với một protein đặc thù, hoặc peptit có nguồn gốc từ hoạt động của kinaza đặc hiệu. Có hai phương pháp phổ biên để phát hiện hoạt động kinaza bỏi điện di. Phương pháp thứ nhất, hỗn hợp phản ứng chứa nguồn phosphat được đánh dấu 32p hoặc 33p (ví dụ: ATP như một đồng cơ chất của kinaza) có kết hợp chặt chẽ đồng vị phóng xạ vâi sản phẩm của phản ứng enzym. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được tách phân đoạn trên SDS-PAGE. Khi gel đã khô, các băng có chứa 32p hoặc 33p được định vị trên gel bằng phóng xạ tự ghi hoặc bằng hình ảnh phóng xạ của gel đã khô. phương pháp thứ hai là sử dụng kháng thể sẵn có thương mại nhận biêt đặc hiệu các protein hoặc peptit có biến đổi phosphat tại một vài gốc axit amin đặc hiệu. Ví dụ như: kháng thể có thể nhận biết phosphotyrosin hoặc phosphoserin/phosphotreonin. Những kháng thể này có thể được sử dụng như những kháng thể sơ cấp trong phân tích thẩm tách protein như đã miêu tả ỏ trên. Vì các kháng thể chỉ nhận biết các protein, hoặc 246
peptit có chứa phosphat, do đó chúng đưa ra một phương pháp đo hoạt động kinaza đặc hiệu. Bên cạnh ứng dụng trong thí nghiệm động học định lượng, phương pháp điện di cũng được sử dụng trong enzym học để nhận biết các băng protein có liên quan tới hoạt động của enzym sau khi phân đoạn trên gel. Kỹ th u ật này dựa vào vết nhuộm đặc trưng của băng enzym trên gel, dựa trên biến đổi enzym từ cơ chất thành sản phẩm, có thể là công cụ hữu hiệu cho sự nhận biết ban đầu một enzym mói hoặc định vị một enzym trong suốt quá trình cố’gắng tinh sạch. Để các phương pháp này cỏ thể thực hiện được, phải có một phương pháp nhuộm đặc hiệu đối với hoạt động enzym quan tâm và enzym trên gel phải ở cấu hình dạng tự nhiên của nó (ở trạng thái hoạt động). Vì SDS-PAGE thương làm biến tính protein, do vậy phương phốp đo phải đảm bảo rằng, enzym sẽ hoạt động trên gel sau khi điện di, hoặc phương pháp điện di phải thay đổi để nó không bị biến tính, hoặc một phương pháp khác phải được tìm ra để khôi phục lại đặc tính của enzym tại chỗ (in situ) sau khi điện di. Điện di trên gel nguyên thể thưòng được ứng dụng trong những trưòng hỢp này. Trong phương pháp này, SDS và tác nhân khử disulfit bị loại ra khỏi mẫu và đệm chạy điện di, và các mẫu protein không được làm biến nhiệt trưỏc khi tra vào bản gel. Dưới những điểu kiện này, hầu hết các protein sẽ khôi phục lại nguyên thể trong chất nền gen sau khi điện di. Tuy nhiên, tốc độ di chuyển trong quá trình điện di không còn phụ thuộc duy nhất vào khối lượng phân tử protein dưới những điều kiện nguyên thể. Nếu không có SDS, các phân tử protein sẽ không có mật độ điện tích đồng đệu, do vậy sự di chuyển của chúng trong điện trường sẽ phụ thuộc vào sự kết hợp giữa khối lượng phân tử của chúng, tổng điện tích và hình dạng chung. Do vậy không thích hợp khi so sánh sự di động điện dì của protein sau khi biến tính và các dạng gel nguyên thể của điện di. Enzym đôi khi có thể được điện di dưới các điều kiện biên tính và sau đó được khôi phục lại trong chất nền của gel điện di. Trong những trường hợp này, bản gel thường chạy dưới điều kiện không có tính khử (tức là không sử dụng các chất khử như mercaptoetanol, hoặc các tác nhân khử cầu nối disulfua có trong đệm chạy mẫu, vì chỉ khi có m ặt các chất này, sự hình thành cầu nối disulfua sẽ thường gây khó khãn bên trong bản gel. Một sô' phương pháp để khôi phục lại nhiều loại enzym 247
sau khi điện di đã được báo cáo và được nghiên cứu bởi Mozhaev và cộng sự (1987). Quy trình sau đưa ra bởi Novex, Inc., được nhận thấy rấ t phù hợp với rấ t nhiều enzyra trong phòng thí nghiệm của tác giả. Tuy nhiên, từ đó, không phải tất cả các enzym sẽ có lại các đặc tính trước đây một cách thành công sau khi xử lý khắt khe của quá trình phân tách điện di, sự thích hợp của một số’phương pháp phải được xác định dựa theo kinh nghiệm cho mỗi enzym. Quy trình cho sự phục hổi của các enzym sau SDS-PAGE: 1. Sau khi điện di, gel được ngâm trong 30 phút ở nhiệt độ thường với sự lắc nhẹ. 2. Gạn dung dịch và thay thế bằng 1Q0ml dịch đệm gồm 1 ,219/1 trìs bazơ; 6,3g/l tris HCI; 11,7g/l NaCI; 0J4g/l CaCI2 và 0,02% (w/v) chát tẩy Brig 35. Thay bằng gel trong dung dịch này trong 30 phứt ở nhiệt độ phòng bằng sự lắc nhẹ. Thay thế dung dịch bằng 100ml khác cùng loại đệm và ủ ồ 37°c trong 4 - 1 6 giờ.
Các tài liệu điện di của Hames và Rickwood (1990) cung cấp một danh sách các enzym (khoảng 200) có thể được phát hiện bằng cách nhuộm màu hoạt tính sau khi điện di gel nguyên thể và đưa ra các tài liệu tham khảo cho các quy trình chi tiết cho mỗi enzym trong danh sách. Hình 6.19 minh hoạ hoạt động nhuộm màu sau khi điện di gel nguyên thê enzym dihydroorotat dehydrogenaza ngưòi (DHOaza), loại enzym sử dụng cofactơ oxy hoá khử ubiquinon để xúc tác sự chuyển hoá của dihydroorotat thành axit orotic. Như nhiều dehydrogenaza khác, có thể kết hợp sự hoạt động của enzym này để sự tạo thành một sản phẩm có màu mạnh bằng việc khử nitroblue tetrazoli (NBT), hoặc metyl thiazolyl tetrazoli (MTT). Sản phẩm formazan kết tủa trên gel tại các vị trí hoạt động của enzym. Giếng bên trái của Hình 6.19 minh hoạ một bản gel nguyên thể của một dịch chiết của màng ty thể gan ngươi được nhuộm màu với Coomassie blue. Như mong đợi, có một lượng lớn các protein có m ặt trong mẫu này hiển thị một m ật độ cao của các băng protein trên gel. Giếng bên phải Hình 6.19 hiển thị một bản gel nguyên thể khác của mẫu tương tự đã được ngâm sau khi điện di trong dung dịch của 100jiM dihydroorotat, IOOịiM ubiquinon và lm M NBT (trong đệm 50nM tris pH 7,5). Có một băng tôi do sự nhuộm màu NBT của protein hoạt tính enzym trong mẫu. Do vậy, điều đó dường như là sự hoạt động của enzym trong phức hệ mẫu có thể liên quan đến một protein đặc hiệu, hoặc một tập hợp các protein. Các băng hoạt tính có thể được cắt từ bản gel để phân tích sâu hơn, ví dụ như đọc trình tự đầu N, hoặc một phần cho quy trình tinh sạch một enzym đặc thù; như một trong những giải pháp có thể được sử dụng cho việc sản xuất các kháng thể kháng lại enzym cần quan tâm. 248
Hình 6.19. Vi dụ về nhuộm màu hoạt tinh của enzym sau khi điện di
Giếng bên trái: gel chuyển thể của một dịch chiết màng ty thể tế bào ngi/ởi được nhuộm với coomassie btưe; chú ý một số lượng lớn các protein di động điện di khác nhau trong mẫu; Giếng bên phải: gel ngưyến thể của mẫu tương tự (chạy dưới điểu kiện giống nhau được sử dụng như giếng bên trái) được nhuộm màu với NBT với sự có mặt các cơ chất của enzym dihydroorolat dehydrogena 2a; một băng protein được nhuộm màu mạnh tương ứng vởi hoạt linh của dihydroorotat dehydrogenaza.
Trong trường hợp các enzym phân giải protein, một sự thay đổi nhuộm hoạt tính là kỹ thuật zymography gel đã được biết. Trong phưdng pháp này, gel acrylamit được xử lý đổ vào khuôn vổi sự có mặt một nồng độ cao của cơ chất có bản chất protein của enzym được quan tâm (casein, gelatin,...). Gel được trùng hợp là do được thấm với các protein từ đầu đến CUÔ1. Các màu enzym phân giải protein sau đó được điện di trên gel. Nếu các điều kiện biến tính được sử dụng, các enzym được phục hồi hoạt tính bằng quy trình được mô tả ở trên, và bản gel sau đó được nhuộm màu với coomassie brilliant blue. Bỏi vì có một nồng độ cao của protein (ví dụ cơ chất) suổt từ đầu đến cuối bản gel, toàn bộ dải sẽ có màu xanh sáng. Tuy nhiên, ỏ nơi mà sự phân giải protein nhiều thì cưòng độ màu xanh sẽ giảm nhiều. Từ đây, các vị trí của các enzym phân huỷ protein trên gel có trên các bản gel có thể được xác định bằng nhuộm ngược (ví dụ: sự vắng mặt của chất nhuộm màu coomassie), như minh hoạ ở Hình 6.20 cho metalloproteaza gelatinaza (MMP9). Liên quan tối điểu này, phương pháp ít trực tiếp nhất của việc phát hiện protein cũng đã được thông báo. Trong kỹ thuật “sandwich gel” (gel
kẹp kiểu bánh sandwich), một dung dịch aga bão hoà với cơ chất protein và đông đặc trên đĩa petri, hoặc một dụng cụ chứa thích hợp khác. Một bản gel acrylamit tiêu chuẩn được sử dụng đê điện di mãu chứa proteaza. Sau điện di (và hồi tính trong trường hợp các bản gel bị biến tính) aga chứa cơ chất được phủ lên gel acrylamit chứa proteaza và bản gel được chạy trong 30 - 90 phút tại 37°c. Cấc vị trí hoạt động phân huỷ protein có thể sau đó được xác định bằng xử lý aga với một đung dịch ammonium sulphat, axit trichloro axetic, hoặc một vài tác nhân kết tủa protein khác. Sau xỏ lý này, phần lân aga mò đục lại như là kết quả của sự kết tủ a protein. Tuy nhiên, các vị trí phân huỷ protein sẽ xuất hiện là các vùng trong ngược lại các vùng mò đục.
Hình 6.20. Zymography gelatin của toàn bộ dịch tan tế bào từ tế bào côn trùng Sf9 bị nhiễm với một baculovirus cấu trúc gồm gen gelatinaza người 93kDa (MMP9). Các VỊ trí hoạt động của enzym dè dàng đuợc quan sát từ sự mất nhuộm màu coomassie của cơ chất gelatin trên gel (hình ảnh được cung cấp bởi Henry George, các phòng thí nghiêm Dupont Merck).
6.4. C Á C YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN Tốc ĐỘ CỦ A PHÀN ỨNG ENZYM
Tôc độ của một phản ứng enzym có thể cho thấy đáng kể độ nhạy đôi vối một sô điểu kiện của dung dịch (ví dụ như nhiệt dộ, pH, lực ion, các nồng dộ của một anion hay cation nào đó). Thất bại trong việc kiểm 250
soát các thông sô" này có thể dẫn đến những sai sót đáng kể và thiếu sự lặp lại trong việc đo tốc độ phản ứng. Do đó, việc giữ các thông số này ổn định từ thí nghiệm này tỏi thí nghiệm tiếp theo là rấ t quan trọng. Trong một số trường hợp, những thay đổi về tốc độ phản ứng mà được quan sát thấy khi thay đổi một số điểu kiện của môi trường phản ứng này có thể cung cấp thêm các thông tin có giá trị về cơ chế hoạt động của enzym. Trong phần này, chúng ta sẽ thảo luận về ảnh hưởng của 5 thông số: Nồng độ enzym, nhiệt độ, pH, độ nhớt và sự tạo thành các đồng vị dung môi. Mỗi thông sô" này có thể ảnh hưởng đến tốc độ enzym theo các phương pháp đã biết và mỗi thông số này có thể được kiểm soát để thu được các thông tin quan trọng, 6.4.1. Nồng độ enzym
Trong Chương 4, khi thảo luận về phương trình Henri-M ichaelisMenten, ta đã thấy rằng, nồng độ cơ chất —enzym có ảnh hưởng đến tốc dộ của một phản ứng enzym như thế nào. Và ở cuối của Chương 4, đã viết lại phương trình này bằng cách thay thế thông số Vcực Jại bằng sản phẩm của kxúc tác và [E] và tổng nồng độ của enzym trong mẫu (phương trình 4.22). Từ phương trình này, chúng ta thấy rằng, tốc độ của một phản ứng xúc tác bởi enzym sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ enzym có trong dung dịch khi nồng độ cơ chất là xác định. Trong khoảng nồng độ enzym xác định, đồ thị tốc độ ở dạng hàm số của [E] ở dạng đường thẳng, như minh hoạ ỏ đưòng a trong Hình 6.21. Khoảng giới hạn mà ở đó mối quan hệ tuyến tính này kéo dài tuỳ thuộc vào khả nãng đo vận tốc thực ban đầu của phản ứng với các nồng độ enzym khác nhau. Chúng ta cần nhổ lại ở Chương 4, sự đo tốc độ ban đầu hợp ]ệ chỉ khi mức tiêu thụ cơ chất từ 0% đến 10% tổng nồng độ cơ chất ban đầu. Khi cho thêm càng nhiều enzym, vận tốc phản úng có thể tăng lên đến một thời điểm mà ở đó lượng cơ chất ban đầu bị m ất đi trong thòi gian của sổ của thí nghiêm là rất lớn. Khi cơ chất tiêu thụ rất lớn, sự tăng thêm nồng độ enzym cũng không thể nào thể hiện sự thay đổi về vận tốc xúc tác của enzym dưói dạng đường dốc như là một hàm sô' của [E]. Kết quả là, đồ thị tốc độ phản ứng quan sát được dưổi dạng một hàm sô' của [EJ tuyến tính trong khoảng nồng độ [E] thấp, nhưng sau đó là dạng đưòng cong và thậm chí là hiộu ứng bão hoà ở các giá trị nồng độ [E] cao hơn như đường b trong Hình 6.21. 251
[El. nM Hình 6.21. Tốc độ tương đối của một phản ứng enzym ỏ dạng hàm s ế của nồng độ enzym lổng số [E] dưới các diểu Kiện môi trưởng đã dược kiểm soát
Đường a là dạng đổ thị theo ước đoán. Đường b minh hoạ cho biểu hiện hay quan sát thấy khi sự tiêu thụ cơ chất quá lớn tại các [E] cao hdn. Đuờng c minh hoạ cho số liệu thu duọc khi mẫu quan sát chứa một chất ức chế thuận nghịch.
Như đã trình bày trong Chương 4f các thao tác viên nên bắt đồu phản ứng ỏ nồng độ enzym thấp hơn rấ t nhiều so với nồng độ cơ chất. Khoảng nồng độ này có thể thay đổi từ hệ thống enzym này tới hệ enzym khác, nhưng trong một phản ứng tiêu chuẩn, cơ chất có mặt ở nồng độ ịamol đến mmol và enzym có mặt ỏ nồng độ pmol đến nmol. Trong khoảng nồng độ này, nồng độ [E] nhỏ hơn rấ t nhiều nồng độ cơ chất, và sự đo vận tốc ban đầu của một enzym phải thực hiện qua một sô nồng độ nhất định để có thể xác định được khoảng nồng độ [E] mà ở đó sự tiêu thụ cơ chất là không đáng kể. Cơ chất giảm đi không phải là nguyên nhân duy nhất gây ra hiện tượng đồ thị vận tốc - [E] hướng xuống như đưòng b của Hình 6.21. Dạng đồ thị tương tự cũng có thể quan sát thấy do sự bão hoà của hệ thống phát hiện khi nồng độ [E] cao và giá trị vận tốc cao hơn khoảng phát hiện của thiết bị. Chúng ta đã thảo luận vân đề đó trong chương này. Ví dụ: giả thiết rằng, khi đo vận tốc của một phản ứng enzym tại số dọc quang phổ điểm cuô'i, tức là đo sản phẩm tạo thành, thì khi tăng nồng dộ enzym, vận tốc phản ứng tăng và đo đó lượng sản phẩm tạo thành trong của sổ thời gian xác định của thí nghiệm cũng tăng lên. Nếu nồng độ sản phẩm tăng cho đến khi sự hấp phụ vượt quá giới hạn của định luật Beer (xem phần thảo luận về phương pháp phát hiện bằng quang học trong mục 6.2.4) chúng ta sẽ quan sát thấy sự bão hoà rõ rệt về tốc độ tại các giá trị [E] cao. Khi cơ chất tiêu hao, hiệu ứng phát hiện bão hoà dẫn đôn đồ thị vận tốc - [E] hướng xuống, không phải như là sự 252
giảm của thông sô" nào bên trong hệ enzym mà là do sự th ất bại đo vận tốc ban đầu thực sự của phản ứng dưới các điều kiện nồng độ enzym cao. Các đồ thị vận tốc dưới dạng hàm sô" của nồng độ enzym cũng có thể được biểu thị ở dạng đường cong hướng lên như đường c trong Hình 6.21. Nguyên nhân tiềm năng của hiện tượng này có thể là do sự cân bằng nhiệt độ chưa đủ, như đã nêu qua trước đó, và sự có m ặt của chất ức chế hay chất hoạt hoá enzym trong hỗn hdp phản ứng. Ví dụ: nếu một lượng nhỏ chất ức chế không thuận nghịch có m ặt ở một trong số các thành phần của hỗn hợp phản ứng, thì sự thêm enzym ỗ nồng độ thấp sẽ ức chế hoàn toàn enzym và ta sẽ không quan sát thấy có hoạt tính. Hoạt tính của enzym sẽ được xác định trong một hệ thống chỉ sau khi enzym được bổ sung đến một nồng độ mà vượt quá nồng độ của chất ức chế không thuận nghịch. Do vậy, tại các giá trị [E] thấp, ta sẽ quan sát thấy tốc độ phản ứng thấp hoặc không có, trong khi vượt qua một nồng độ nào đó thì đồ thị tốc độ sẽ dốc hơn. Một nguyên nhân tiềm năng khác nữa gây ra đường cong hướng lên là do sự có mặt trong dung dịch bảo quản enzym các chất hoạt hoá hay các cofactd bị thiếu trong phần dung dịch phản ứng còn lại. Giả thiết là enzym nghiên cứu cần một yếu tô" cofactơ phân ly cho hoạt tính đầy đủ (như đã thấy trong Chương 2, nhiều enzym nằm trong nhóm ĩiày). Nồng độ của enzym tự do [Er] và coíactơ tự do [Cf] sẽ nằm trong mối cân bằng với nồng độ của phức hdp enzym—cofactơ có hoạt tính [EC] và nồng độ của [EC] có m ặt dưới bất kỳ điều kiện môi trường nào sẽ được xác định bởi hằng sô cân bằng Kerrcf!i =
(6.14)
Trong dung dịch bảo quản enzym, các nồng độ enzym và cofactơ có một tỷ lệ n hất định nào đó. Khi pha loãng mẫu dự trữ này vào hỗn hợp phản ứng, tổng lượng enzym thêm vào sẽ bằng tổng enzym tự do và phửc hdp enzym—coíactơ, điều đó có nghĩa là [E] - [Ef] + [EC]. Do đó, nồng dộ coíactơ thêm vào hỗn hdp phản ứng từ dung dịch enzym sẽ tỷ lệ với tổng lượng enzym thêm vào, nghĩa là [C] = a[E]. Tipton (1992) cho rằng, lượng phức hdp hoạt tính trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng sẽ phụ thuộc vào tổng enzym thêm vào và hằng sô cân bằng enzym-cofactơ n h ư phương trìn h dưới đây:
(6.15)
253
Ta thấy rằng, từ phương trình (6.15), lượng enzym hoạt hoá (ví dụ như [EC]) sẽ không tuyến tính với lượng enzym tổng số’được thêm vào ỏ các giá trị [E] thấp và do đó, đồ thị sẽ có dạng đường cong hướng lên như đưòng c trong Hình 6.21. Nếu ta nhận thức được vai trò cần thiết của một coíactơ đối với enzym nghiên cứu thì ta có thể tránh được các hiệu ứng trên bằng cách bô sung vào hỗn hợp phản ứng vói một lượng dư các coíactơ. Ví dụ: enzym prostaglandin syntaza là một enzym oxy hoá khử cần có nhân hem liên kết với cofactơ nhân hem theo mô hình phân ly không cộng hoá trị. Phần apoenzym (không chứa nhân hem) sẽ ở dạng không hoạt động nhưng có thể được tái tạo cấu trúc khi hem dư thừa để tạo thành dạng holoenzym hoạt động. Hoạt tính của enzym vẫn có thể tiếp tục bằng cách pha loãng dung dịch holoenzym thành hỗn hợp phản ứng chứa một thuôc nhuộm oxy hoá khử và đo sự thay đổi trong phổ hấp phụ thuốc nhuộm tiếp sau sự khởi đầu phản ứng với axit arachidonic —cơ chất của phản ứng. Đe quan sát được đầy đủ hoạt tính của enzym, cần phải bổ sung nhân hem vào hỗn hợp phản ứng tới nồng độ hem cuối cùng phải vượt quá tổng lượng enzym. Ta chỉ cần chú ý đến vấn đề này thì đưòng đồ thị giữa vận tốc đối với [E] của enzym prostaglandin syntaza sẽ tuyến tính trong một dải nồng độ enzym tương đôi rộng (Copeland và cộng sự, 1994). Tổng kết lại, khi vận tốc ban đầu thực được đo, vận tốc của một phản ứng enzym xúc tác sẽ tăng tuyến tính theo nồng độ enzym. Những chênh lệch từ đường biểu diễn tuyến tính này có thể quan sát được khi khả năng do vận tốc thực ban đầu của chất phân tích bị ảnh hưởng bởi giới hạn của thiết bị hay dung dịch. Khác biệt về độ tuyến tính cũng dược quan sát thấy khi một sô" chất ức chế hay chất hoạt hoá enzym nào dó có m ặt trong hỗn hợp phản ứng. Ta có thể tìm thấy nhũng thảo luận tương đối dễ hiểu vể những khác biệt này trong tài liệu của Dixon và Webb (1979). 6.4.2. Ảnh hưỏng của pH
pH của dung dịch enzym có thể ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác tổng thể theo một số con đường khác nhau. Giông như tấ t cả các protein, các enzym có cấu trúc bậc 3 nguyên thể tương đối nhạy cảm với pH và nói chung, sự biến tính của các enzym xảy ra tại các giá trị pH cực cao hay cực thấp. Một sô" phương pháp vật lý có thể gây ra sự biến tính enzym. Sự mất cấu trúc bậc hai có thể theo dõi bởi máy quang phổ lưỡng hướng sắc vòng, và những thay đổi về cấu trúc bậc 3 thường có thể quan 254
sát thấy bằng máy quang phổ hấp phụ và huỳnh quang (Copeland, 1994). Nhiều protein đông tụ hay kết tủa dưới tác dụng biến tính bơi pH và hiện tượng này được quan sát thấy bằng các phương pháp phân tán ánh sáng và đôi khi bằng quan sát dưới mắt thưòng. Mỗi enzym có dải pH vẫn giữ trạng thái gốc ổn định, nó thay đổi từ enzym này tới enzym khác. Hầu hết enzym có sự ổn định tại vùng gần pH sinh lý (xấp xỉ pH 7,4), một sô”enzym khác cho thấy có hoạt tính cực đại tại giá trị pH cao hơn hay thấp hơn nhiều. Dải pH thích hợp cho một enzym phải được xác định theo thực nghiệm. Ta thấy rằng, cấu hình enzym có thể duy trì qua một dải pH tương đốỉ rộng, có thể lên tới 4 - 5 đơn vị. Tuy nhiên, trong dải pH này, vận tốc của enzym sẽ thay đổi theo pH. Hình 6.22 cho thấy dữ liệu đặc trưng về vận tốc của một phản ứng enzym dưới dạng hàm của pH. Trong giói hạn pH mà ở đó quá trình pH không phải là yếu tố chính. Điều hiển nhiên nhất từ sơ đồ này là dải pH mà ở đó hiệu quả xúc tác enzym là tối đa. Đối vối các thí nghiệm phổ biến nhất về hoạt tính enzym, người ta thường duy trì giá trị pH tối ưu cho phản ứng xúc tác xảy ra. Để giữ pH trong giới hạn này, hỗn hợp phản ứng phải được đệm hoá bởi thành phần có giá trị pKa tại hay gần giá trị pH đã thiêt kê.
pH Hình 6.22. Vai trò của pH lân vận tốc phản ứng của m ột enzym điển hinh
Đệm là một loại hoá chất mà sự có mặt trong dung dịch kháng lại sự thay đổi pH của dung dịch đó do s ự thêm vào các axit hay bazơ. Đối với các nghiên cứu về enzym, ta có thể sử dụng một sô đệm đã được thương mại hoá trên thị trường, một 30 đệm này được liệt kê trong Bảng 6.6. Khả năng đệm của đệm này hay đệm khác giảm dần khi dung dịch vượt qua khỏi giá trị pK* của một chất. Nói chung, những đệm này cung cấp khả 255
năng đệm tốt trong khoảng giá trị dưối giá trị pKa một đơn vị đến trên giá trị pK„ một đơn vị. Do đó, ví dụ: đệm HEPES có thể được sỏ dụng để ổn định pH của một dung dịch giữa giá trị pH là 6,55 đến 8,55, nhưng sẽ không phải là đệm phù hợp trong khoảng pH dưới 6,5 và trên 8,6. Bảng 6.6. Một số đệm hay được sử dụng trong nghiên cứu enzym Tên ph ổ biến
Khối lượng phân tử
pK, ở 25°c
ApK*/A°C
MES
195,2
6,15
-0,011
PIPES
324,3
6,80
-0,0085
Imidazol
60,1
7,00
-0,020
MOPS
231,2
7,20
-0,013
TES
251,2
7,50
-0,020
HEPES
260,3
7,55
-0,014
HEPPS
252,3
8,00
-0,015
Trixin
179,2
8,15
-0,021
Tris
121,1
8,30
-0,031
CHES
207,3
9,50
-0,029
CAPS
221,3
10,40
-0,032
Các đệm dược nêu ra trong Bảng 6.6 bao gồm một dải rộng pKa, qua dó cho phép chọn lựa các đệm đơn câu phần cho việc duy tri các giá trị pH dung dịch đặc trưng. Tuy nhiên, ta cần lưu ý rằng, các giá trị pKa được liệt kê trong Bảng 6.6 là cho các đệm tại nhiệt độ tại 25°c và giá trị pha loãng vô hạn. Nhiệt độ, nồng độ đệm và lực ion tổng thể có thể gây rôi loạn giá trị pK, này, do đó làm thay đổi giả trị pH của dung dịch CUỐI cùng. Trong hầu hết các nghiên cứu enzym, các đệm sẽ có m ặt ở nồng độ cuối là 0,05 đên 0, IM và lực ion dung dịch thường thưòng giữ ở 0,1 —0,2M (gần điều kiện sinh lý). Thông thưồng, ngưòi ta chuẩn bị dung dịch đệm gốc có nồng độ cao đã được điều chỉnh giá trị pH, sau đó đệm này sẽ được pha loãng để chuẩn bị cho phản ứng cuối cùng. Do đó, việc đo giá trị pH của dung dịch CUỐI cùng để xác định sự mở rộng giá trị pH khi pha loãng là rất quan trọng. Tuy nhiên, những ảnh hưởng này thưòng thưòng là tương dôi nhỏ và ta chỉ cần chỉnh lại rấ t ít nếu cần. Một sô vấn để tiềm tàng khác nữa là sự thay đổi giá trị nhiệt độ trong dung dịch. Trong một sô" trường hợp, pH của dung dịch đệm có thể thay đổi giữa giá trị nhiệt độ là 4 - 37°c. Bảng 6.6 đã liệt kê sự thay đổi của giá trị pK„ trên sự thay đổi về nhiệt độ của đệm kể ra ở trên. Xét vể nguyên lý, ta có thể tính toán được sự thay đổi của pH dung dịch khi 256
nhiệt độ môi trường thay đổi, nhưng đây là công việc buồn tẻ và việc thực hiện nó thường là không thực tế. Thay vào đó, nếu thí nghiệm là để thực hiện tại giá trị nhiệt độ cao hơn (ví dụ 37°C), máy đo pH có thể được căn chỉnh tại nhiệt độ thí nghiệm và tất cả sự đo pH sẽ được thực hiện tại giá trị pH tương tự. Điều này sẽ đảm bảo rằng, các giá trị pH đo phản ánh một cách chính xác giá trị pH thực dưới các điểu kiện thí nghiệm. Trong một số trường hợp, ta có thể ước đo hoạt tính enzym qua một dải nhiệt độ trong khi vẫn duy trì giá trị pH tại một giá trị xác định. Cho các thí nghiệm như vậy, việc sử dụng đệm với giá trị ApKa/ A°c thấp là tốt nhất nhằm giữ thay đổi về giá trị pH nhỏ nhất trong khoảng nhiệt độ quan tâm. Từ Bảng 6.6, PIPES (pKa = 6,8; ApKa/A°C = -0,0085) và MOPS (pKa = 7,2; ApKa/A°C = -0,013) sẽ là lựa chọn tốt cho ứng dụng này. Sự phụ thuộc vào pH của hoạt tính enzym có ý nghĩa thực nghiệm quan trọng trong việc tối ưu hoá các điều kiện thí nghiệm, nhưng tính phụ thuộc này chủ yếu là hiện tượng học. Ngược lại, thông tin vể cơ chế hữu ích liên quan đến vai trò của các nhóm axit, bazơ và có liên quan đến sự quay vòng của enzym có thể được thu thập từ các nghiên cứu thực nghiệm pH. Bằng cách đo vận tốc dưới dạng hàm sô của nồng độ cơ chất ỏ pH thay đổi, ta có thể xác định đồng thòi ảnh hưởng của pH iên các giá trị kxúc t&c, Km và kxiic tic/Km đối với một phản ứng xúc tác bởi enzym, Nếu sự chuẩn độ của các nhóm được ion hoá trên phân tử cơ chất không xảy ra trong khoảng giá trị pH được nghiên cứu, các hình ảnh dữ liệu về pH này có thể sẽ giúp một SC) kết luận chung về vai trò của các nhóm axit bazơ trong phân tử enzym. Nói chung, sự phụ thuộc vào pH của kxúct6c chủ yếu phản ánh sự tham gia của nhóm axit —bazơ trong các bước xúc tác chuyển hoá cơ châ't thành sản phẩm, đó là các bước ion hoá này xảy ra trong phức hợp enzym - cơ chất. Cuối cùng, đồ thị kxúetá(/ Kmdưới dạng hàm của pH được cho là phản ánh các nhóm ion hoá cần thiết của enzym tự do giữ vai trò quan trọng trong liên kô’t gắn cơ chất và quá trình xúc tác (Palmer, 1985). Kêt quả là, ví dụ: ta sẽ cân nhắc hình ảnh pH của enzym chymotrypsin proteaza serin. Trưng tâm hoạt động của a —chymotrypsin chứa một tam giác xúc tóc (Hình 6.23a) câu tạo bởi Asp 102; His í>7 và Ser 195. Cả hoạt tính axy] hoá của Ser 195 để tạo trạng thái trung gian và sự thuỷ phân của cơ chất peptit đểu phụ thuộc vào liên kết hydro và các bưóc chuyển proton giữa các gốc trong tam giác hoạt động này. Từ các dữ liệu pH lý tưởng hoá, cho kxúc tAc, Km và kxúc lằJKm đối với a-chymotrypsin Hình 6.23b, đ; chúng ta thây rằng, cả Kmvà kxlictác hiển 257
thị các giá trị hình ảnh pH mà phù hợp với phương trình Henderson Hasselbalch đã nêu ra trong Chương 2, nhưng với các dữ liệu khác. Trong trường hợp của dữ liệu Km đối vái pH ái lực gắn cơ chết giảm (ví dụ Km tăng), khi tăng pH với một giá trị pKa xác định là 90, người ta thấy rằng, giá trị pKa này phản ánh mức độ ion hoá của một gốc isolơxin đầu N, gốc mà phải được proton hoá để enzym có thể chấp nhận một cấu hình mà có thể liên kết với cơ chất. Giá trị kxlkUc đối vối enzym này tăng khi pH tàng và hiển thị một giá trị pKa rõ rệt ở pKa 6,8. Giá trị pK„ này được cho là do gốc Asp 102 hoặc His 57 của tam giác hoạt động. Bây giò, ngưòi ta nghĩ là pK„ này có mối liên quan chính xác vối tam giác trung tâm hoạt động như là một thể thông nhất chứ không phải với các gốc axit, bazơ đơn lẻ. Trong Hình 6.23d, hình ảnh pH lý tưỏng của kxức đối với a-chymotrypsin, chúng ta không quan sát thấy đưòng cong dạng chữ s như dự tính trong mối tương quan với phương trình HendersonHasselbalch mà thay vào đó, là cố dạng đường cong hình chuông. Đồ thị này hiển thị hiệu ứng tích lũy của hai nhóm có thể chuẩn độ mà ảnh hưởng đến hiệu quả xúc tác của enzym theo cách ngược lại (ví dụ: một nhóm thúc đẩy sự xúc tác trong trạng thái bazơ cộng hợp, trong khi nhóm kia lại xúc tác trong trạng thái axit Bronsted-Lowry). Một đưòng dữ liệu pH được quan sát thấy như trong Hình 6.23d có thể phù hợp với phương trình sau: y=
(6 .16)
Trong đó, y là kết quả đo thí nghiệm được hiển thị theo trục y, ycựcđại là giá trị cực đại quan sát thấy của các sô" liệu thí nghiệm và pK„i, pK„2 là các giá trị pKa đối với hai nhóm axit, bazơ thích hợp được chuẩn độ. Sự phù hợp về đưòng cong trong Hình 6.23d với phương trình (6.16) cho ta thấy các giá trị pKoỉ và pKa2 tương ứng là 6,8 và 9,0. Do cả hai giá trị pKa được tìm thấy đều có ảnh hưởng đến kxlic tác và Km, chúng được phản ánh ở trong đưòng biểu thị pH tăng của kllktac/Kmđối vói enzym này. Dạng dữ liệu hiển thị trong Hình 6.23 thường được sử dụng để dự đoán định dạng các gốc axit amin chìa khoá tham gia vào hoá học axit bazd trong quá trình xúc tác. Tuy nhiên, một số chú ý cần được quan tâm trong việc thực hiện các ý tưởng dự đoán như vậy. Khi chúng ta quan sát enzym chymotrypsin, trong một sô" trường hợp, gi á trị pKn được 258
đo không thể mô tả chính xác đối vối một axit a min riêng lẻ mà là sự phản ánh một tập hợp đặc trưng của các tương tác của các gốc bên trong phân tử enzym tạo nên một trung tâm axit - bazơ độc nhất in vitro. Tương tự như vậy, cấu trúc bên trong kỵ nước của phân tử enzym cũng có thể ảnh hưởng rấ t lốn đến giá trị pKa của chuỗi bên axit amin trong mối tương quan vối các giá trị pK„ đặc trưng trong dung dịch nước. Một số ví dụ về các ảnh hưởng như vậy của pKa chuỗi bên axit amin được liệt kê trong Bảng 6.7. Những ví dụ này có thể làm sáng tỏ rằng, ta không thể đơn thuần dựa vào việc so sánh giữa pKa đo được của một thông sô" động học enzym và các giá trị pKa của chuỗi bên axit amin trong dung dịch. Do đó lấy ví dụ, dữ liệu của kxlíc tá c - pH đối với một enzym cụ thể được biểu thị một giá trị pK„ rõ ràng là 6,8 có thể phản ánh sự ion hoá của một nhóm histidin thiết yếu, nhưng nó cũng có thể phản ánh sự ion hoá của gốc axit glutamic gây ảnh hưởng, hoặc cũng có thể gốc khác bên trong môi trường đặc biệt của cấu trúc bên trong của protein. T y r 396 His 54
S e r 195
Val 213
Hlnh 6.23. (a) Hình mẫu của cấu trúc trung tâm hoạt động cùa Ct-chymotrypsin dựa trên cấu táic tinh thể do Tsukada và Blow (1985) cong bố, hình mau này cho thấy tam giác trung tâm hoạt động của các axit amin; (b) dữ liệu pH lý tưởng của kxuc táo đối với a-chymotrypsin cho thấy gia trị pKa là 6,8; (c) Dữíiệú pH lý tương của Km đối vối a-chymotrypsin cho thấy giá (rị pKa la 9,0; (d) dữ liẹu pH lý tưởng cùa kxlii;tSc/Kmđối với a-chymotrýpsin cho thấy đường cong dạng chuông phù hợp với phương trình (6.16) có giá trị pKa là 6,8 và 9,0 (Nguồn: Copeland, R-A., Enzymes, 2000).
259
Bảng 6.7. Ví dụ về các nhóm axit amin với các giá trị pKa chuỗi bén gây ảnh hưỏng pK. Axit amin tự do
Enzym
Glu
3,9
6,5
Lysozym
His
6,8
3,4
Papain
His
6,8
5,2
Ribonucleaza
Cys
8,3
4,0
Papain
Lys
10,8
5,9
Axetoaxetat dehydrogenaza
Chuỗi bỗn
Enzym
Các ảnh hưởng của pH lên các thông sô' động học như kxúc tác và Kq, cũng đã được phân tích bằng cách lập sơ đồ giá trị hằng số động học trên một tỷ lệ logarit dưới dạng hàm số của pH (Dixon và Webb, 1979). Đối với một 9ự kiện chuẩn độ đơn lẻ như các sơ đồ biểu thị sự chồng lên nhau cả hai hàm sô' tuyến tính, một với đường dốc bằng 0 và đường kia độ dốc là một đơn vị, tương tự, một thông sô' động học mà trải qua hai sự kiện chuẩn độ trong một dải pH đặc trứng sẽ thu được một sơ đồ mà cho thấy sự chồng nhau của 3 đưòng thẳng, một vói độ đốc có giá trị dương, một với độ dốc là 0 và đưòng cuôi cùng có độ dốc âm như trong Hình 6.24.
pH Hinh 6.24. Đồ thị của log(kjnic,ac/Km) dưôi dạng hàm số của pH đối với một enzym dâc trưng, hai giá trị pKa xác định từ sự giao nhau của các đưòng thảng vẽ qua dữ liệu trong các vừng khác nhau của dải pH.
Một lợi ích khác nữa của các đồ thị này là giá trị pK* có thể được xác định bằng đồ thị mà không phải sử dụng đến các đường cong không tuyến tính, hơn nữa, pK0 dược xác định bỏi điểm cắt của hai đưòng thang vẽ qua các điểm số liệu trong vùng uốn cong nhỏ nhất của đồ thị. 260
Tiện ích thứ hai là sô" các nhóm axit - bazơ tham gia vào sự ion hoá có thể được ước đoán: độ dốc của đường đồ thị trong vùng chuyển tiếp phản ánh sô" các nhóm ion hoá mà được chuẩn độ qua dải pH này. Do đó, độ dốc là một đơn vị chỉ ra rằng, có một nhóm đơn lẻ được chuẩn độ, độ dốc là 2 cho thấy có sự tham gia của hai nhóm ion hoá,... Một thảo luận mở rộng về các đồ thị này và các ví dụ về ứng dụng của chúng đối vối các enzym dặc trưng có thể tìm thấy trong các tài liệu của Dixon và Webb (1979). Trong thiết kế thí nghiệm đo ảnh hưởng của pH lên các động học trạng thái ổn định của một phản ứng enzym, điều quan trọng đôi vói một nhà nghiên cứu là đảm bảo rằng, những thay đổi vể pH dung dịch không được thực hiện theo các cách có thể gây ảnh hưởng đồng thời lên các điều kiện khác của dung dịch, do đó, làm rối sự phân tích của các thí nghiệm. Ví dụ: sự thay đổi trong nhóm được dùng làm đệm cho dung dịch có thể theo nguyên lý, tự nó có thể tạo ra sự thay đổi trong động học. Do các nghiên cứu này được thực hiện tiêu biểu qua một dải giá trị pH rộng nên một loại đệm sẽ không thể tạo đệm trong toàn bộ dải pH được nghiên cứu. Do đó, sẽ có hơn một loại đệm được sử dụng trong các thí nghiệm này. Có một cách để kiểm tra ảnh hưởng của đệm mà không gây ảnh hưỏng đến dữ liệu pH là sử dụng các đệm có khoảng pH chồng lên nhau. Ví dụ: để tạo vùng pH từ 5,5 đến 8,5, ta có thể chọn đệm MES (giá trị trong khoảng 5,15 đến 7,15) cho các giá trị pH thấp hơn và HEPES (giá trị trong khoảng 6,55 đến 8,55) cho các giá trị cao hơn. Trong khoảng khả năng tạo đệm chồng nhau giữa 6,55 đến 7,15, ta có thể thực hiện đo đối vối cả 2 đệm riêng rẽ. Nếu không có sự khác biệt đáng kê giữa các giá trị đo với cả hai đệm tại cùng các giá trị pH thì ta có thê coi là tưdng đối an toàn khi kết luận rằng, không có các tướng tác lớn đặc trưng về đệm có thể xảy ra, Một cách khác tô't hơn để thực hiện các thí nghiệm này là sử dụng một hệ đệm phức hợp mà có khả năng tạo đệm tốt trong toàn bộ dải pH nghiên cứu. Gomori (1992) đã đưa ra một quy trình cho việc chuẩn bị các hệ đệm được tạo thành từ hai hay nhiều loại đệm khác nhau thích hợp cho nghiên cứu enzym và trải dài tới vài khoảng giá trị pH khác nhau. Ví dụ: Gomori giâi thiệu sử dụng một đệm phức hợp Tris—maleat cho các nghiên cứu vói pH trong khoảng pH 5,2 đến 8,6. Loại đệm này cần chuẩn bị hai dung địch đệm dự trữ. Đệm 1 gồm 24,2g Tris (hydroxymetyl aminometan) và 23,2g axit maleic hoà tan trong 1 lít 261
nước cất (để tạo thành dung dịch 0,2M Tris-maleat). Dung dịch thứ hai là 0,2M NaOH trong nước cất. Để chuẩn bị dung dịch đệm cuối cùng có nồng độ 0,05M tại các giá trị pH đã cho, ỗOml dung dịch dự trữ Trismaleat được trộn đều với X m l dung dịch NaOH dự trữ như trong Bảng 6.8 và pha loãng vói nước cất để đạt thể tích cuối cùng là 200ml. Các công thức cho các hệ đệm khác nhau để nghiên cứu trong dải pH cao hơn hay thấp hơn có thể được tìm thấy trong các tài liệu biên soạn bâi Gomori (1992) và các tài liệu tham khảo có liên quan trong đó. Bảng 6.8. Thể tích NaOH 0,2 cẩn được thêm vào trong 50ml Tris-maleat gốc 0,2M để tạo ra 200ml dung dịch đệm Tris-maleat 0,05M có các giá trị pH đ i liệt kẽ trong bảng
'
X (ml)
pH
(ml)
pH
7,0
5,2
48,0
7,0
10,8
5,4
51,0
7,2
15,5
5,6
54,0
7,4
20,5
5,8
58,0
7,6
26,0
6 ,0
63,5
7,8
69,0
8 ,0
X
31,5
6 ,2
37,0
6.4
75,0
8 ,2
42,5
6 ,6
81,0
8,4
45,0
6,8
86,5
8,6
Nguồn: Dữ liệu lừGomori (1992)
6.4.3. Ảnh hưỏng của nhiệt độ
Ta đã biết rằng, tốc độ của một phản ứng hoá học thông thường gấp đôi khi ta tăng nhiệt độ lên một khoảng 10°c. Hầu hết các chất xúc tác hoá học đều thể hiện sự tăng hoạt tính như vậy khi tăng nhiệt độ và các enzym cũng không phải là ngoại lệ. Tuy nhiên, các enzym lại là các protein nên giông như protein, chúng cũng trải qua giai đoạn biến tính do nhiệt độ tại các giá trị nhiệt độ cao. Do đó, sự tăng cưòng hiệu quả xúc tác bằng cách tăng nhiệt độ bị hạn chế do ảnh hưỏng bởi sự biên tính protein thông thường tại nhiệt độ cao. Do lý đo này, hoạt tính của một enzym cụ thể sẽ tăng lên khi nhiệt đô tăng trong môt khoảng nhiệt độ nhất định và sau đó giảm dần nhanh chóng khi trên điểm nhiệt độ tđi hạn làm biến tính protein (Hình 6.25). Cùng với dữ liệu về pH, các thông tin thu nhộn được từ các đồ thị trong Hình 6.25 có ý nghĩa thực tê cho việc thiết k ế các thí nghiệm có liên quan đến enzym. Chúng ta sẽ đo 262
| I
I 1
được hoạt tính của enzym tốt nhất tại một nhiệt độ nào đó nhưng lại không gây biến tính protein nhiều và tiện lợi cho quá trình làm phản ứng. Khi cân bằng các yếu tô" này, chúng ta thấy rằng, phần lớn các thí nghiệm enzym đã công bố trong các tài liệu đều được thực hiện ở 25°c hoặc 37°c (ví dụ nhiệt độ sinh lý).
Nhiệt đ ô (°C)
Hĩnh 6.25. Hình ảnh đác trưng cho hoạỉ tính tương đối của một enzym theo dải nhiệt độ
Nếu ta giới hạn sự chú ý vào dải nhiệt độ mà quá trình biến tính protein là không đáng kể thì sự phân tích về những thay đổi hoạt tính enzym đi kèm sự thay đổi vê nhiệt độ có thể cung cấp các thông tin về mặt cơ chế. Mốỉ quan hệ này vẫn giữ nguyên ý nghĩa thực tế đổi với các phân tích enzym miễn là sự biến tính protein không phải là yếu tố”làm rối loạn kết quả thí nghiệm trong dải nhiệt độ nghiên cứu. Chúng ta có thể liên hệ hằng sô' động học kxúctác đôì với năng lượng hoạt hoá như sau: húctàc =
A e x p ( - ^
)
(6 1 7 )
Trong đó R là hằng sô" khí lý tưỏng (R = l,98.10-3kcal/mol. độ); T là nhiệt độ theo độ Kelvin và đối với đối tượng nghiên cứu của chúng ta, ta có thể xử lý trưóc A như là hằng số tỷ lệ (xem Chương 2 để hiểu rõ hdn định nghĩa về A). Lấy log10 hai bên của phương trình (6.17) ta có: ỉog(kxúctíc) = ị - E &—
+ log(A) j
(6.18)
Do đó, nếu ta lập sơ đồ logCk^ tíc) của một phản ứng enzym dưới dạng hàm số của 1/2,3RT trong phương trình 6.18, theo đự đoán, ta sẽ thu được một đường thẳng vối độ dốc tương ứng là —Ea, năng lượng hoạt 263
hoá theo đơn vị kcal/mol. Xin ghi nhớ rằng, mối quan hệ mô tả theo phương trình 6.17 và 6.18 vẫn giữ với Vcục (tại tại nồng độ enzym cố định cũng như với k*lictàc. Khi thiếu một ưóc đoán chính xác về nồng độ enzym trong đung dịch dự trỡ, ta có thể giữ lượng dung địch enzym được sử đụng trong các thí nghiệm là không đổi và xác định năng lượng hoạt hoá của phản ứng bằng cách sử dụng các giá trị đo VaỊcdại thay vì kxúctác trong phương trình (6,18). Hình 6.26 là đồ thị Arrhenius như vậy đối với một enzym giả thiết vói mức năng lượng hoạt hoá là l2,5kcal/mol, đo qua một dải nhiệt độ từ ữ-40°c.
0,7
0,72
0,73
0,76
0,78
Thời gian (giãy)
Hình 6.26. Đổ thị Arrhenius của log(VCLÍCđại) của một phản ứng enzym dưới dạng hàm số của 1/(2,3RT). Độ dốc cùa đường thảng trong dạng dồ thị này cho thay một ước đoán về giá trị Eaâm, giá trị rìãng lượng hoạt hoá của phản ứng.
Do nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng có thể có một tác dụng đặc biệt như vậy lên các thông số động học của phản ứng xúc tác bởi enzym nên việc điều khiển nhiệt độ cẩn thận trong quá trinh đo vận tốc ban đầu là rất quan trọng. Đôi vổi các phản ứng khởi đầu bằng việc cho cơ chất vào, hỗn hợp phản ứng và dung dịch cơ chất nện được cân bằng nhiệt độ tại cùng một nhiệt độ trước khi trộn đều lại với nhau. Vđi các phản ứng khỏi đầu bằng việc thêm enzym, đôi khi chúng ta khao khát tôì ưu hoá độ ổn định protein bằng cách duy trì nhiệt độ của dung dịch dự trữ enzym ở 4°c (nhiệt độ nưóc đá) trước khi làm thí nghiệm. Trong những tình huống như vậy, điều tốt nhất ta nên làm là sử dụng một dung dịch dự trữ enzym ỏ nồng độ cô đặc đến mức mà chỉ một lượng nhỏ dung dịch là cần thêm vào hỗn hợp phản ứng tổng thể, dung dịch này đã được cân 264
băng trưóc đó ở nhiệt độ thí nghiêm. Trong một thí nghiệm đặc trưng cho dạng này, chúng ta có thể thêm từ 10 - 50^1 dung dịch enzym dự trữ (ở 4°C) vào lm l hỗn hợp phản ứng đã cân bằng ở 25°c hay 37°c.
Thài gian (giày)
Hỉnh 6.27. Vỉ dụ về quá trình phản ứng của một phản ứng cho thấy một pha chậm dài trước khi đạt tới trạng thái ổn định thực sự. Một pha chậm dài như vậy có thể bị gây ra bởi một số yếu tố bao gồm sự cản bằng nhiệt độ của enzym và dung dịch hỗn hợp phản ứng là không đủ.
Thể tích nhỏ này sẽ không gây biến đổi nhiều đến nhiệt độ tổng thể của hỗn hợp phản ứng và enzym thí nghiệm sẽ đạt tái nhiệt độ tối ưu ngay trong quá trình trộn đều. Nếu thể tích dung dịch dự trữ enzym quá nhiều thì sự cân bằng nhiệt độ trong quá trình trộn đều là không đủ. Điều này sẽ được phản ánh bởi một pha chậm trong các kết quả đo tốc độ ban đầu n h ư minh hoạ trong Hình 6.27, Các pha chậm dạng này có thê làm ảnh hưỏng đáng kể độ chính xác của các thí nghiệm dạng điểm cuối trong khi sự xuất hiện một pha trễ bị bỏ qua. Các thí nghiệm kiểm chứng tại một vài điểm thòi gian nên được thực hiện trong những trường hợp này để đảm bảo rằng, những tác động của sự cân bằng nhiệt độ không đủ như vậy là không ảnh hưởng đến kết quả đo độ hoạt tính. 6.4.4. Ảnh hưỏng của độ nhổt
Khi một hiện tượng khuếch tán, chẳng hạn sự tiếp xúc va chạm ban đầu của E và s để tạo thành phức hợp ES, hay sự phân rã của sản phẩm từ phức hợp EP bị giới hạn về mặt tốc độ, thì độ nhớt của dung dịch có thể ảnh hưởng đến tốc độ tổng thể của phản ứng. Độ nhớt vi mô của dung dịch được cho là sự kháng lại chuyển động cùa một phân tử trong dung dịch. Điều này là tương phản với độ nhát vĩ mô đo bâi các thiết bị đo độ nhót thông thường, đây chỉ là một đặc tính chính của dung dịch. 265
Do sự tăng độ nhớt vi mô sẽ làm tăng sự kháng lại chuyển động của phân tử trong dung dịch nên tần sô' khuếch tán sẽ bị giảm xuống. Các chất tạo độ nhốt dạng polyme như polyetylen glycol chỉ ảnh hưởng đến độ nhớt vĩ mô, trong khi các chất tạo độ nhớt dạng monome như sucroza hay glyxerol lại ảnh hưởng cả độ nhót vi mô và độ nhớt vĩ mô. Do vậy con đưòng đơn giản nhất để làm tăng độ nhớt vi mô của một dung dịch enzym !à bằng cách cho thêm các chất tạo độ nhớt dạng monome. Độ nhớt của các dung dịch vói nồng độ sucroza hay glyxerol khác nhau đã được lập thành bảng và có thể được tìm thấy trong các tài liệu như: “The CRC Handbook of Physics and Chemistry”. Độ nhớt thực sự của các dung dịch cuối cùng chứa các chất tạo độ nhớt này nên được thực hiện theo kinh nghiệm với một mốy đo độ nhớt tiêu chuẩn (như máy đo độ nhớt Cannon-Fenskie hay Ostward) được bán trên thị trường.
*ệ % 5
■3
■Ị
Hinh 6.28. Ảnh hưởng của độ nhớt vi mô lên kxúctẳc/Kmcủa một phản ứhg enzym bị giới hạn tốc độ phản ứng do quá trình khuếch tán. Các chấm tròn đậm biểu thị các điểm dữ liệu cùa enzym triozaphosphat isomeraza khi độ nhởt gày ra bâi glyxerol, do đó ảnh hưởng đến cả độ nhât vi mô và độ nhớt vĩ mô của dung dịch. Đường gạch đứt nét biểu thị tác động của sự thay đổi độ nhớt đung dịch bỏì polyetylen glycol, chất chỉ tác động đến độ nhớt vĩ mô (dữ liệu tham khảo từ Blacklow và cộng sự, 1988).
Nếu một phản ứng enzym bị giới hạn khuếch tán, giá trị của kxú<.tác/Kn, sẽ phụ thuộc vào độ nhốt của dung dịch như sau: n0 K„
K„
(6.19)
n Trong đó: Tì là độ nhớt, số 0 phía trên được cho là các giá trị của kXúctá
thấy rằng, một đồ thị của (k„úc tác/Km)°/(kx 10® M "V !. Do đó, các nhà khoa học đã suy xét rằng, tốc độ phản ứng thì bị giới hạn bởi sự tạo thành phức hợp ES mà phức hợp này bị tác động bởi sự khuếch tán. Để kiểm tra điều này, Blacklow và cộng sự đã đo những tác động của sự thay đổi về độ nhớt lên phản ứng của enzym triozaphosphat isomeraza dưổi tác dụng của sự bổ sung thêm thành phần glyxerol (chất ảnh hưởng đến độ nhớt vi mô và độ nhớt vĩ mô) và thành phần polyetylen glycol (chất chỉ ảnh hưởng đến độ nhớt vĩ mô). Như đã quan sát thấy trong Hình 6.28, các kết quả thu nhận như mong đợi là một đường thẳng kxúc tJ K m phụ thuộc vào độ nhớt vi mô nhưng lại không bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi về độ nhát vĩ mô. Như tác giả đã chỉ ra, nhũng dữ liệu này không chứng minh được rằng, sự giôi hạn tốc độ trong phản ứng xúc tác bởi enzym triozaphosphat isomeraza là ỏ sự tạo thành phức hỢp ES. Hơn nữa, dữ liệu chỉ ra rằng, cho dù bước nào là bưổc giói hạn tốc độ đối với enzym đi nữa thì đó dường như đều bị điều khiển bỏi sự khuếch tán. 6.4.5. Các tác động của đồng vị trong dộng học enzym
Khi một phản ứng xúc tác bởi enzym bị giới hạn về m ặt tốc độ bởi một bưóc chuyển nhóm thì tốc độ phản ứng bị suy giảm sẽ được quan sát thấy nếu như nhóm bị chuyển được làm giàu về m ặt đồng vị tại các đồng vị nặng. Các tác động của đồng vị động học như vậy có thể được sử dụng để xác định các nguyên tử trong phân tử cơ chất mà chịu sự chuyển nhóm trong quá trình xúc tác của một enzym. Đê thực hiện những phân tích như vậy, các nhà nghiên cứu phải tổng hợp một phiên bản cơ chất mà được đánh dấu bởi một đồng vị tại một vị trí nguyên tử xác định. Do các proton là các nguyên tử được chuyển nhóm phổ biến nhất nên trong 267
các phản ứng enzym, chúng ta thường tập trưng sự chú ý vào việc sử dụng các đồng vị nặng của hydro trong các nghiên cứu như vậy.
Tại sao một đồng vị nặng hơn có thể dẫn đến sự suy giảm tôc độ phản ứng trong các phản ứng chuyển proton? Đe trả lời câu hỏi này, ta hãy cân nhắc đến một phản ứng mà ở đó một phân tử hydro bị chuyển từ một nguyên tử cacbon sang một nhóm bazơ nào đó. C - H :B [Cỉ+ ••■H ••• B5+]* C“HB Như đã thây trong Chương 2, trạng thái tích điện của một chất tham gia phản ứng có thể được diễn tả như một th ế năng có thể tạo ra các trạng thái rung động. Trong số các dạng cơ chất vận động này, các thế năng có liên quan đến sức căng của liên kết C—H. Trạng thái chuyển dổi của phản ứng đạt đến do sự kéo dài liên kết C-H trước khi sự đứt gãy cầu liên kết này xảy ra. Do đó, từ trạng thái của cơ chất phản ứng đến trạng thái chuyển, th ế năng của trạng thái vận động kéo căng C-H sẽ dược chuyển hoá thành năng lưdng chuyển đổi đóng góp vào năng lượng hoạt hoá tổng thể của phản ứng. Bây giờ, mức nhỏ nhất về thế năng (ví dụ: ở tận đáy của giếng) của trạng thái chất phản ứng là đặc trưng về câu hình điện tử của phân tử chất phản ứng khi tấ t cả các ngttyên tử trong phân tử là ở trạng thái cân bằng (ví dụ khi động năng của các liên kết bị “đóng băng”). Nếu chúng ta thay thế proton của cacbon bằng một nguyên tử dơteron (D), trạng thái điện tử của phân tử sẽ không bị thay đổi và do đó đáy của th ế năng đôi với trạng thái của chất phản ứng sẽ không thay đổí, tuy nhiên các tiểu trạng thái xung động có liên quan đến mô hình C-H sẽ bị tác động bởi sự thay đổi đồng vị này. Thế năng của một mô hình xung động tỷ lệ trực tiếp vói tần sô' V , tần sô' tại đó liên kết chuyển động. Trong trường hợp một xung động mà kéo căng một liên kết giữa 2 nguyên tử, như trong liên kết C—H, thì tần sô" xung động có thể biểu diễn ỏ dạng hằng sổ" lực cho xung động đó (một số đo tương đưdng với sức căng hay sức kháng lại lực nén của một lò xo vĩ mô) và các khối lượng của hai nguyên tử tham gia vào liên kết bởi: v=
(6.20)
Vmr Trong đó k là hằng số lực, mr là khối lượng khử của hệ thống lưỡng nguyên tủ có liên quan đến xung động. Khối lượng khử có liên quan đến khôi lượng của hai nguyên tử trong hệ thông (m, và m-ị) như sau: 268
(6.21) Năng lượng hoạt hoá liên quan đến trạng thái chuyển giữa trạng thái của chất phản ứng sang trạng thái chuyển, ở đây chúng ta sẽ đo chính xác dưới kính hiển vi Raman hay hồng ngoại và có giá trị dặc trưng khoảng 2.900cm'1. Nếu chúng ta thay thế proton với một đdteri (C-D hay C-2H), tần sô" xung động này sẽ chuyển tối đại khái khoảng 2.200cm-1. Tần sô' này tương ứng với các giá trị De khoảng 4,16 và 3,01kcal/mol cho các liên kết C-H và C-D tương ứng. Do đó, nàng lượng tại điểm 0 cho một liên kết C-D sẽ nhỏ hơn liên kết C—H khoảng l,15kcal/mol (Hình 6.29). Nếu tất cả thế năng xung động của một trạng thái nền của chất phản ứng được chuyển hoá thành năng lượng chuyển đổi để thu được trạng thái chuyển đổi thì sự khác biệt về nãng lượng tại điểm 0 tương đương với việc tăng năng lượng hoạt hoá tổng thể lên l,15kcal/ mol đối vỏi liên kết C-D khi so sánh vởi liên kết C-H. Như ta đã thấy trong Chương 2, sự tăng năng lượng hoạt hoá sẽ tương ứng với sự giảm tốc độ phản ứng và do đó làm giảm năng lượng tại điểm 0, điều này giải thích sự giảm tốc độ phản ứng với đồng vị nặng trong các thí nghiệm động học.
K hoảng cách phân tử
Hỉnh 6.29. Đồ thị thể nãng cho mộl trạng thái điện tử của một phân tử minh hoạ khoảng cách giữa năng lưạng tại điểm 0, AAe cho các liên kết C-H và C-D.
Tác động của sự thay thê" bằng đồng vị đơteri lên trạn g thái của các phản ứng được biểu thị đặc trưng bồi tỷ lệ (tựi/VDcục (lọi hay k“xúc iá«ADxiíc tảc. Dựa trên sự khác biệt vể năng lượng tại điểm 0 của liên kết C-H và của liên kết C-D, ta sẽ trông đợi sự khác biệt về năng lượng 269
hoạt ho á cho 2 sự chuyển nhóm này là l,15kcal/mol nếu tất cả thế năng xung động đều được chuyển hoá thành năng lượng chuyển đổi. Đồng vị động học ở đây sẽ là: (6.22)
Cần nhớ rằng, tác động của đồng vị sẽ được nhận thấy trong các động học đo chỉ khi bước chuyển hydro bị giới hạn tốc độ (hay bị giới hạn tốc độ một phần) trong phản ứng tổng thể. Cũng như vậy, tầm quan trọng của hiệu ứng đồng vị sẽ thay đổi từ enzym này tới enzym khác và phụ thuộc vào mức độ mà ở đó trạng thái chuyển đổi sẽ chuyên hoá thế năng xung động của trạng thái nền của chất phản ớng sang năng lượng chuyển đổi. Trong các phản ứng chuyển nhóm proton, chúng ta cũng thấy rằng, tầm quan trọng của hiệu ứng đồng vị động học bị ảnh hưởng bởi pK0 của nhóm bazơ thông thường tham gia vào bưóc chuyển đổi. Kết quả là các hiộu ứng đồng vị lớn nhất xảy ra khi pKa của bazđ thông thưòng phù hợp tốt với pKn của axit cacbon của chất cho proton; tầm quan trọng của các hiệu ứng đồng vị động học có thể rấ t có hữu ích trong việc xác định các phân tử đặc trưng tham gia trong các bưđc chuyển nhóm giói hạn tốc độ trong quá trình xúc tác. Một phương thức phổ biến khác để tổng hợp các phân tử cơ chất mà một nguyên tử đặc trưng được đánh dấu đồng vị, và sau đó so sánh tốc độ của phản ớng cho cơ chất này với tốc độ của phản ứng với các cơ chất thông thường. Khi một nhóm tham gia vèo một bưốc chuyển giới hạn tốc độ được đánh dấu, chúng ta sẽ quan sát thấy hiệu ứng đồng vị động học. Thông tin này không chỉ được sử dụng để xác định các nhóm có liên quan các phản ứng chuyển đổi đặc trưng, mà còn có thể giúp xác định các bước quyết định tốc độ phản ứng trong cơ chế xúc tác của enzym. Các xử lý thông tin toàn diện vể việc sử dụng các tác động đồng vị động học trong việc làm sáng tỏ cơ chế enzym cố thể được tìm thấy trong các tài liệu của Cleland và cộng sự (Cleland và cộng sự, 1977) và Northrop (1975) và trong sự biên dịch của các bài báo chọn lọc từ “Methods in enzymology” sửa đổi bởi Purich (1996). Sự thay thê" đồng vị của các hydro trong dung dịch dung môi có thể ảnh hưởng đến động học của các phản ứng enzym nếu bản thân dung môi hoạt động như một chất cho proton trong quá trình xúc tác, hay nếu các nhóm cho proton trên phân tử enzym hay cơ chất có thể trao đổi nhanh chóng vái dung môi. Những hiệu ứng này được coi là “các hiệu ứng đồng vị dung môi”. Trong hệ enzym đơn giản nhất, các hiệu ứng 270
đông vị dung môi có thê dùng để xác định cốc proton được chuyển đổi trong các bưóc xác định tốc độ của quá trình xúc tác. Điều này có thể thực hiện bằng cách đo tốc độ của phản ứng dưới dạng một hàm của sự phân mảnh nguyên tử của đơteri (n) hay phần trăm của D20 trong một hệ dung môi H20 / D20. Đồ thị của Vcực đ?i hay kxúc tác dưới dạng hàm sô" của n hay %DaO sẽ cho thấy một sự suy giảm trong các thông sô" động học này khi lượng D20 trong hệ dung môi tăng lên. Nếu một proton được chuyển thì số' liệu trong đồ thị sẽ tương ứng với một hàm tuyến tính (bậc 1). Nếu có 2 proton được chuyển, số liệu trong đồ thị sẽ tương ứng với hàm bậc 2. Nếu có 3 proton được chuyển, số liệu sẽ tương ứng với hàm bậc 3,...
Các phẩn DjO, (n) Hình 6.30. Đồ thị proton tóm tắt cho các phản ứng có liên quan đến sự chuyển đổi của 1 proton (vòng tròn trắng) hay 2 proton (vòng tròn đậm) trong các bước giới hạn tốc độ phản ứng của quá trinh xúc tác. Trục y lã tỷ lệ của kIiietíc trong một số hòn hợp phản ứng H20 / Dịò (kxlic Iảj và giá trị của kxuc lảc trong 100% nước. Dữ liệu cho phản ứng chuyển 2 proton phù hợp VỚI phương trình bậc 2. Các phàn ứng liên quan đến hơn 3 proton thường phù hợp với một hàm bậc 3 mà hàm này cho thấy sự không giới hạn của các proton tham gia chuyển đổi trong các bước giãi hạn tốc độ. Phưđng pháp kiểm kẽ proton này không cung cấp thêm sự hiểu biết sâu sắc về cấu trúc hay các vị trí của nhóm chuyển proton nhung thụt sự cho phép chúng ta xác định được số luạrtg các nhóm (ham gia vào bước giới hạn tốc độ (Nguồn: Copeland, R.A., Erưymes, 2000).
Ta cần phải thực hiện một số chú ý khi biên dịch các dữ liệu này. Sự diễn giải dựa trên sự phù hợp về đường cong trên đồ thị cho thấy rằng, một bưởc đơn lẻ, bước giâi hạn tốc độ, sẽ ehịu trách nhiệm cho hiệu ứng đồng vị dung môi khi quan sát tổng thể. Trong hầu hết các hệ enzym đơn giản, sự phỏng đoán này vẫn là chính xác. Tuy nhiên, trong các hộ phức tạp hơn, có sự chuyển đổi trạng thái nhiều hơn, sự phỏng đoán này lại không phù hợp. Sự hợp lộ của dữ liệu còn phụ thuộc vào sự giữ cân bằng 271
tất cả các điểu kiện khác của dung dịch khi tỷ lệ %D20 trong hệ dung môi thay đổi. Ví dụ: ta phải nhớ rằng, có sự khác biệt giữa giá trị pD thực của một dung dịch D20 và giá trị đo bởi một máy đo pH thông thường (với một dung dịch D20 tinh khiết, sô đọc thực của pD = pH ở +0,41 tại 25°C); những hiệu ứng này phải được tính đến trong quả trình chuẩn bị các dung dịch cho sự đo số lượng proton. Nếu quan tâm tói việc áp dụng các kỹ thuật này, nên tham khảo các cách xử lý toàn diện hơn đôĩ với mục tiêu (Schowen, 1982; Venkatasubban và Schowen, 1984). 6.5. BÁO CÁO DỬ LIỆU VỀ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM
Như chúng ta đã thây trong các chương trưốc, nhiều điều kiện dung dịch cố thể ảnh hưởng đến hoạt độ tổng thể của một phản ứng xúc tác bởi enzym. Do đó, để các nhà nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm khác nhau có thể đưa ra các kết quả tương đương nhau thì việc các dữ liệu được công bố từng đơn vị có ý nghĩa và được kèm theo bỏi đủ thông tin chi tiết về phản ứng là rấ t quan trọng. Trong việc báo cáo các đo hoạt độ, chúng ta luôn chỉ rõ hệ đệm được sử dụng trong hỗn hợp phản ứng, giá trị pH và nhiệt độ mà ỏ đó ta thu nhận được giá trị thí nghiệm, khoảng cách thời gian đo vận tốc ban dầu và phương thức phát hiện được sử dụng. Các vận tốc ban đầu và các giá trị Vcưc dại luôn nên được công bô" theo sự thay đổi đơn vị mol (của cơ chất hay sản phẩm) trong một đơn vị thòi gian, trong khi các giá trị K™ và kXúc tàc nên được công bố theo đơn vị mol và thòi gian nghịch đảo (m irr1 hay s '1) tương ứng. Các con số’quay vòng thưòng được ghi nhận theo sự thay đổi vể mol trên một đơn vị thòi gian trên mol enzym hay tương đương, các phân tử cơ chất mất đi hay sản phẩm tạo thành/ đơn vị thòi gian/ mol enzym. Nhiều lần, việc đo hoạt tính enzym của m ẫu có chứa nhiều protein hơn là enzym quan tâm là rấ t cần thiết. Ví dụ: trong suốt quá trình tinh sạch enzym ban đầu, việc theo dõi hoạt tính enzym ở nhiều bước khác nhau của quá trình tinh sạch, công đoạn mà có nhiều protein tạp nhiễm là rấ t quan trọng. Để chuẩn hoá việc báo cáo về hoạt tính trong những trường hớp như vậy, Hiệp hội Hoá sinh Quốc tế (The I n t e r n a t i o n a l Union of Biochemistry - IUB) đã thông qua một đơn vị quốc tế (IU) làm đơn vị đo hoạt tính chuẩn: một đơn vị quốc tế (1 IU) là lượng enzym (hay mẫu enzym thô) cần cho việc xúc tác chuyển hoá một Ịimol cư chất/ phút, hay nơi có hơn một liên kết của mỗi phân tử cơ chất bị tấn cóng, micro đương lượng của nhóm quan tâm dưới một bộ các điều kiện môi trường xác định. Định nghĩa này cho phép các nhà nghiên cứu riêng rẽ có thể xác định rõ các điều kiện dung dịch nhưng IUB cũng khuyến cáo các đơn 272
vị được công bô cho các sô đo là ỏ 25°c. Các điều kiện dung dịch đặc trưng không có tầm quan trọng nội tại nhưng chúng phải được công bô' để đảm bảo sự lặp lại. Trong các mẫu enzym thô, khối lượng tổng thể của protein có thể được xác định bởi một số phương pháp phân tích (Copeland, 1994) để có thêm thông tin chi tiết, nhưng để đo một cách xác định, khôi lượng hay nồng độ enzym quan tâm trong các mẫu như vậy thì thường rất khó. Để định lượng hàm lượng enzym có mặt, các nhà nghiên cứu thường công bố-về hoạt tính đặc hiệu của mẫu đó là: Sô" các đơn vị quôc tế của hoạt độ enzym trên Img protein tổng sô" dưới một dãy các điều kiện của dung dịch. Thưòng phổ biến hiện nay là các giá trị hoạt tính đặc hiệu được công bô" dưới các điều kiện cơ chất bão hoà (ví dụ: khi V~Vcựcdại) và các điều kiện dưng dịch là tôi ưu (ví dụ: pH, nhiệt độ,...). Do sự tinh sạch enzym tăng lên, nên khôi lượng protein tổng số của mẫu được tạo thành ngày càng cao bỏi enzym quan tâm. Hoạt tính đặc hiệu của mẫu sẻ tăng lên không ngừng. 6.6. Đ ộ ỔN ĐỊNH C Ủ A MAU ENZYM
Một trong số’các vấn đề thực tế phổ biến nhất thách thức các nhà hoá sinh thực nghiệm là sự mất hoạt tính của enzym đo sự không ổn định. Giốhg như hầu hết các protein, các enzym dễ dàng bị biến tính dưói nhiều diều kiện của phòng thí nghiệm và bước đặc trưng cần được thực nghiệm để làm ổn định các đại phân tử hết mức có thể. Các khuyến cáo phổ biến cho thao tác chung các protein để thu được độ bển tối đa đả được mô tả chi tiết trong một sô" văn bản dành riêng cho protein (ví dụ: Copeland, 1994). Khuyến cáo phổ biến cho việc dự trữ và thao tác với các protein dưới đây có thể giúp duy trì hoạt tính xúc tác của các protein này. 6.6.1. Ổn định hoá enzym trong quá trinh dự trữ
Giống như các protein, các enzym ở trạng thái nguyên gôc sẽ được làm ổn định tôì đa bởi các điều kiện dung dịch đặc trưng vể pH, lực ion, thành phần cation/ anion,... Không có một công thức chung nào có thể được công bô" cho tất cả các điều kiện này, các điều kiện tốt nhất cho từng enzym riêng lẻ phải được xác định theo kinh nghiệm thực hành. Tuy nhiên, ta cần nhđ rằng, các điều kiện dung địch tối ưu cho sự ổn định protein không nhất thiết phải giống như các điều kiện tôi ưu cho hoạt động của enzym. Khi sự kiện đã biêt này được áp dụng, các dung dịch dự trữ enzym nên được duy trì dưới các điều kiện tôi ưu hoá sự ổn định trong khi các thí nghiệm phải được thực hiện dưới các điều kiện cho hoạt tính là tối ưu. 273
Đê duy trì enzym lâu dài, các enzym cần được giữ ồ nhiệt độ đông lạnh trong các tủ -70°c hay trong nitơ lỏng. Các tủ lạnh thông thường vận hành phổ biến tại -20°c, nhưng hầu hết những tủ này sẽ được quay vòng qua các nhiệt độ cao hơn để chúng không bị đóng đá. Điều này có thể làm cho xuất hiện chu trình đông - rã đông không chủ đích các enzym và gây biến tính enzym rấ t mạnh. Nếu các enzym được bảo quản trong tủ lạnh như vậy, đtì ổn định của enzym có thể được tăng cường rất nhiểu bằng cách bổ sung một thể tích tương đương glyxerol vào mẫu và trộn th ậ t đểu. Dung dịch chứa 50% glyxerol này sẽ giúp duy trì mẫu enzym ở pha lỏng tại nhiệt độ -20°c và do đó ngăn ngừa quá trình đông rã đông lặp lại. Thực tế nhiều enzym cho thấy sự ổn định tối đa khi dự trữ trong tủ —20°c và có chứa tói 50% glyxerol. Trước khi mẫu được làm đông đá, mẫu cần được lọc tiệt trùng qua màng lọc có kích thưốc lỗ là 0,22|am, làm từ vật liệu ít dính protein và sau đó được cho vào các ếng chịu lạnh đã tiệt trùng để tránh nhiễm khuẩn. Để trán h biến tính trong quá trình đông - rã đông, các mẫu được làm đông nhanh và rã đông nhanh là rất quan trọng. Quá trình làm lạnh nhanh có thể được thực hiện tốt nhất bằng cách nhúng ngập ông chứa mẫu trong một hỗn hợp đã khô và etanol. Quá trình rã đông nhanh có thể được thực hiện bằng cách cho mẫu vào bể ổn nhiệt ỏ 37°c cho đên khi hầu hết (chứ không phải tấ t cả) mẫu trong ống tan ra. Khi chỉ còn một lượng nhỏ đông đá trong ống, lấy ống mẫu ra khỏi bể và cho phép tiếp tục quá trìn h rã đông còn lại trên đá (ví dụ ỏ 4°C). Các chu kỳ đông - rã đông lặp lại có thể gây biến tính protein rất nhiều, vì vậy cần tránh lặp lại các bước này nhiều. Do đó, một mẫu enzym đông đá chỉ nên được rã đông một lần và sử dụng nhanh chóng. Mẫu còn sót lại ỏ cuối mỗi phản ứng không nên để đông đá trở lại. Tuy nhiên, một enzym có thể duy trì các trạng thái ổn định trong vòng vài ngày tại 4°c nên các mẫu dư có thể được bảo quản tại 4°c cho các thí nghiệm tiêp đó sau lần sử dụng đầu tiên. Nếu một enzym nào đó không bền dưối các điều kiện này, thì bất cứ lượng mẫu enzym nào còn dư cũng nên bỏ đi. Để tránh lãng phí mẫu enzym, các mẫu nên được chia ra thành từng lượng nhỏ và nồng độ cao. Theo cách này, thể tích mẫu cần cho thí nghiêm trong ngày có thể được rã đông trong khi lượng lớn mẫu còn lại vẫn duy trì đông đá trong tủ. Một khi đã rã đông, enzym được bảo quản trên đá ở 4°c càng lâu càng tốt trước khi cân bằng ở nhiệt độ thí nghiệm. Thêm vào đó, nếu enzym được bảo quản ỗ nhiệt độ cao, chỉ cần một lượng nhỏ enzym dự trữ cho việc pha loãng vào hỗn hợp phản ứng cuối cùng. 274
Lấy ví dụ: một thí nghiệm enzym đặc trưng cần nồng độ enzym cuối cùng trong hỗn hdp phản ứng là lOnM, giả thiết là enzym được duy trì ỗ -70°c, với nồng độ bảo quản là IOOịiM trong 50(4.1 dịch lỏng. Trong ngày làm thí nghiệm với enzym cần một lượng nhỏ enzym được rã đông và pha loãng 100 lần bằng đệm thích hdp tạo thành 5ml dung dịch enzym có nồng độ pha loãng là 1|j M. Dung dịch dự trữ pha ra này được đặt trên đá cả ngày hay lâu hơn nêu có thể. Hỗn hợp phản ứng cuôì cùng sẽ được chuẩn bị khi pha loãng 100 lần dung dịch dự trữ này để thu được nồng độ enzym cuối cùng theo mong muốn là lOnM. Một sô" chất phụ gia làm tăng cường độ ổn định của enzym khi bảo quản ]âu dài tại nhiệt độ đông ]ạnh và đôi khi cũng cho việc bảo quản ngắn hạn trong dung dịch. Glyxerol, sucroza và xyclo dextran thường được bổ sung vào để làm bền enzym. Các nồng độ chính xác của các tá dược thêm vào này làm ổn định tốt nhất với một enzym đặc trưng phải được xác định theo kinh nghiêm thực tế. Một sô' enzym cho thấy sẽ ổn định khá lớn trong sự có mặt của cofactd, cơ chất và thậm chí chất ức chế gắn vào trung tâm hoạt động. Thêm vào đó, các điều kiện bảo quản tốt nhất cho mỗi enzym phải đưdc thiết lập riêng rẽ. Một vấn đề phổ biến nữa trong việc thao tác với dung dịch enzym là sự mất hoạt tính enzym do sự hấp thụ protein lên trên bề mặt của ống chứa dung dịch và đầu hút pipet. Các protein gắn bám mạnh lên trên bề mặt của thuỷ tinh, thạch anh và polystyren. Do vậy, các ống chứa từ các chất liệu này không nên được dùng với các mẫu enzym. Các bình chớa và dụng cụ chuyển mẫu phải được làm từ các vật liệu có ái lực gắn protein thấp như polypropylen, polyetylen và nên được sử dụng bất cứ khi nào có thể. Có rấ t nhiều dạng ống chứa và đầu tip làm từ các chất liệu này có sẵn trên thị trưòng. Thậm chí với các vật liệu bám protein ít, ta vẫn bị m ất mẫu protein do hấp thụ, do đó, để làm giảm hiệu ứng này, người ta thường bổ sung thêm các protein mang vào mẫu ngay khi có thể, miễn là ta đã khẳng định được rằng, protein mang này không tương tác với thí nghiệm enzym theo bất cứ phương diện nào. Một protein mang là một protein trơ mà dược thêm vào dung dịch enzym ở nồng độ cao hơn nồng độ enzym rấ t nhiều. Theo cách này, các bề mặt có thể gắn bám protein sẽ bị bão hoà bồi các protein mang và đo đó không còn hấp phụ các enzym quan tâm nữa. Đây là phương thức hay được áp dụng thực tế bởi cốc nhà nghiên cứu enzym trong việc cho thêm các protein mang vào dung dịch dự trữ enzym và hỗn hợp phản ứng cuối cùng. BSA —albumin từ huyêt 275
thanh bò, gelatin và casein là các protein hay được sử dụng làm protein mang. Hàm lượng gelatin khoảng lmg/ml là phù hợp với nhiều loại enzym khác nhau. Sự thiếu các axit amin vòng thơm giúp gelatin trỏ thành một protein có ích cho các nghiên cứu về enzym sử dụng máy đo quang phổ hấp thụ tia u v hay máy đo quang phổ huỳnh quang. Gelatin, casein và BSA có mặt trên thị trường từ nhiểu hãng khác nhau và với nhiều loại có độ tinh sạch cao. Một sô" nhà nghiên cứu cũng thấy rằng, polyetylen glycol với khốĩ lượng phân tử là 8.000 Dal (PEG-8000) là chất thay thế hữu ích cho các protein mang trong việc làm giảm độ hấp phụ của enzym lên bể mặt ông đựng (Andrew M. Stern, thông tin cá nhân), sự bổ sung lượng PEG-8000 lên đến 0,1% đã được sử dụng trong phản ứng này bất kể sô" lượng enzym. Nếu PEG-8000 được sỏ dụng cho ứng dụng này thì các PEG-8000 đạt tiêu chuẩn chất lượng cao (tiêu chuẩn sinh học phân tỏ hay tương đương) nên được sử dụng, ta không nên sử dụng các PEG-8000 chất lượng thấp hơn do có thể chứa các chất tạp nhiễm mà có tính nâng tiêu diệt hoạt tính enzym. Các thí nghiệm với PEG-8000 cho thấy, chất phụ gia này là thích hợp cho một số chứ khõng phải tất cả hoạt tính enzym. Do đó, thêm một lần nữa, độc giả nên kiểm tra sự hữu dụng của phương pháp này dựa trên nền tảng của từng thực nghiệm. 6.6.2. S ự bất hoạt của enzym trong các thí nghiệm về hoạt tính
Một sô" enzym được ổn định dưới các điểu kiện đã tối ưu cho việc bảo quản lâu dài (như đẵ mô tả ở trên) sẽ không hoạt hoá trong suốt quá trình thí nghiệm về hoạt tính. Biểu hiện này đặc trưng bỏi đưòng cong hoạt động sẽ phẳng ở giai đoạn đầu trước khi sự m ất cơ chất đáng kể xảy ra (xem mục 6.1.2 để hiểu rõ hơn về nguyên nhân gây ra hiện tượng này). Có hai lý do phổ biến cho hiện tượng này. Đầu tiên, cấu hình hoạt động của enzym này không ổn định dưới một số’ điều kiện (ví dụ như: nhiệt độ, pH, lực ion, và sự pha loãng nồng độ enzym) được sử dụng trong thí nghiệm. Lấy ví dụ: nếu dạng hoạt động của enzym là dimer, sự pha loãng thành nồng độ thấp ở giai đoạn đầu của phản ứng có thể gây ra sự phân ly đồng thời của các enzym từ dạng dimer thành dạng mono. Nếu thòi gian cho quá trình phân ly là chậm, tương ứng với thời gian của phản ứng enzym thì sự giảm hoạt tính có thể quan sát thấy trong khoảng thời gian tiến hành thí nghiệm đo hoạt tính. Đôi khi một sô" thay đổi nhỏ về nồng độ enzym cuối cùng có thể giúp cải thiện tình huống 276
này. Tương tự như vậy, những thay đổi như trong các điều kiện dung dịch khác cũng có thể kéo dài thòi gian hoạt động của các nhóm enzym hoạt động trong sucít quá trình thí nghiệm vối các enzym đa cơ chất (xem Chương 4), sự ổn định của enzym cũng có thể đôi khi tăng thêm đáng kể bởi việc tạo trước một phức hợp đôi enzym - cơ chất và khởi động phản ứng bằng việc thêm vào một cơ chất thứ hai. Nguyên nhân thứ hai gây ra sự mất hoạt tính trong suốt quả trình làm thí nghiệm là sự bất hoạt đồng thời enzym do kết quả trực tiếp từ sự quay vòng các chất xúc tác. Với một số enzym, sự quay vòng có thể dẫn đến sự bất hoạt enzym do sự tạo thành các kẹp hoá trị, hay bỏi sự phá huỷ một axit amin quan trọng trong trung tâm hoạt động chính hay cofactơ. Lấy ví dụ: một sô' enzym oxidoreductaza (enzym oxy hoá khử) tạo nên các gốc tự do có khả năng gây phá huỷ cao như là sản phẩm phụ của quá trình xúc tác. Khi điều này xảy ra, các gốc tự do tích lũy trong quá trình quay vòng có thể tấn công trung tâm hoạt động của enzym và qua đó làm cho enzym m ất hoạt tính. Trong những trường hợp này, sự bất hoạt do các gốc tự do đôi khi có thể được giảm thiểu bằng cách bổ sung các chất tiêu thụ gốc tự do như phenol vào hỗn hợp phản ứng. Sự thêm vầo một lượng nhỏ enzym peroxidaza như các catalaza, đôi khi cũng có thể giúp ổn định hoá enzym quan tâm khỏi sự bất hoạt do gốc phóng xạ. Dĩ nhiên việc xác định rằng, sự thêm vào các nhóm như vậy không ảnh hưởng đến việc đo hoạt tính enzym theo các cách thức khác là rất quan trọng. Bất kể là do nguyên nhân gì, sự bất hoạt enzym trong quá trình thí nghiệm cũng có thể được kiểm tra bởi hai thí nghiệm đơn giản. Thí nghiệm đầu là cho phép đưòng cong quá trình phản ứng đi tới trạng thái phẳng tiền trưởng thành và sau đó thêm một lượng nhỏ enzym dự trữ vào mà làm gấp đôi nồng độ enzym cuôì cùng trong hỗn hợp phản ứng (ví dụ: thêm vào một lượng enzym bằng với lượng enzym ban đầu cho vào hỗn hợp phản ứng). Nếu enzym bị bất hoạt trong quá trình làm thí nghiệm chính là nguyên nhân gây ra trạng thái phẳng tiền trưởng thành này thì pha thứ hai của phản ứng sẽ xuất hiện sau khi thêm lượng enzym mói vào này. Thí nghiêm thứ hai được biết đến dưới tên thí nghiệm Selwyn (Selwyn, 1965), bao gồm việc đo đường cong tốc độ phản ứng tại một sô" điểm nồng độ enzym khác nhau. Thí nghiệm này được sử dụng do bất kể 277
tính phức tạp của các phản ứng enzym riêng lẻ, phương trình tốc độ tổng hợp có cùng dạng chung là: [E]t = l ( [ p j
(6.23)
Khi tất cả các điều kiện khác được giữ ổn định, do đó nồng độ sản phẩm [P] là một hàm hằng sô" nào đó của các sản phẩm lặp lại nhiều lần của nồng độ enzym và thòi gian làm thí nghiệm. [E] trong phưdng trình (6.23) là nồng độ các phân tử enzym hoạt động trong dung dịch. Nếu enzym là ổn định trong khoảng thòi gian làm thí nghiệm thì đồ thị [P] dưới dạng hàm của [E]t sẽ cho đường cong chồng nhau tại tấ t cả các điểm nồng độ của enzym (Hình 6.3la). Tuy nhiên, nếu enzym trải qua sự bất hoạt đơn phân tủ trong thời gian xảy ra phản ứng thì nồng độ của enzym hoạt hoá tự nó sẽ cho thấy sự phụ thuộc thòi gian theo thứ tự. Do đó, sự phụ thuộc của [E] và [P] sẽ có dạng phức tạp hơn như ồ phưdng trình (6.24). [P]=
(6.24) X, Trong đó: k là hằng sô' tỷ lệ; X là hằng sô' thuỷ phân đầu tiên cho sự bất hoạt enzym. Bây giò các đồ thị của [P] dưâi dạng hàm số [E]t sẽ thay đổi khi nồng độ enzym thay đổi (Hình 6.31b). Sự vắng m ặt điểm chồng lên nhau của đồ thị dữ liệu như trong Hình 6.31b là một chỉ thị cho thấy rằng, sự bất hoạt enzym đã xảy ra trong quá trình làm thí nghiệm.
Hình 6.31. Thí nghiệm Selwyn vể sự bất hoạt enzym trong suất quá trinh phản úng xảy ra
(a) Dữ liệu tại một số nồng độ enzym cho các E mã ổn định trong suốt quá trình làm thí nghiệm, c ầ n ghi nhớ rằng, dữ liệu khác biệt cho các nổng độ enzym khác nhau (thể hiện bởi các ký hiệu khác nhau trên hình đồ thị) đều phù hợp với một đường cong; {b) Dữ liệu tường ứng cho enzym bị bất hoạt trong quá trình làm phân ứng. Dữ liệu cho các nồng độ enzym khác nhau không phù hợp với đường cong dữ liệu.
278
Trong chương này đã trình bày một cái nhìn tổng quát về một sô' phương pháp phổ biến cho việc thu nhận các giá trị đo vận tốc ban đầu của các phản ứng enzym. Các phương pháp và kỹ thuật phát hiện phổ biến nhất sự phân tách của phân tử cơ chất và sản phẩm sau phản ứng đều được thảo luận. Những thay đổi về điều kiện phản ứng như pH và nhiệt độ có thể có tác động lớn đến tốc độ phản ứng enzym. Chúng tôi cũng nhận thấy thêm rằng, sự thay đổi có thể điểu khiển về các điều kiện này cũng có thể được sử dụng để thu nhận thông tin theo cd chế của các enzym quan tâm. Cuối cùng, một sô" lòi khuyên cho việc dự trữ và thao tác chính xốc với các enzym để đảm bảo hoạt tính enzym xúc tác là tối đa vẫn được duy trì trong các phòng thí nghiệm.
CÁU HỎI ÔN T Ậ P
1. 2. 3. 4.
Phương pháp đo vận tốc ban đầu của hoạt độ enzym. Các phương pháp đo hoạt độ enzym trong nghiên cứu enzym. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng enzym. Độ ổn định của m ẫu enzym.
279
Chương 7
CÁC CHẤT ỨC CHẾ
7.1. C Á C CHẤT ử c CHÊ'THUẬN NGHỊCH
Hoạt tính của một enzym có thể bị ức chế bởi một sô" con đường khác nhau. Ví dụ, một phân tử chất ức chế có khả năng gắn vào những vị trí nào đó trên phân tử enzym, từ đó can thiệp vào chuỗi phản ứng của enzym. Khái niệm về cơ chất và sản phẩm của quá trình ức chế sẽ được làm rõ ở Chương 4 (Động học của phản ứng enzym) và Chương 5 (Các cơ chế xúc tác hoá học của enzym). Những phân tử chất ức chế có khả năng tạo ra những phần cấu trúc giống như cơ chất của phản ứng và do đó chúng có khả nãng gắn vào vị trí hoạt động của enzym. Quá trình này làm ngăn cản sự phản ứng của cơ chất và enzym. Cách ức chế mà trong đó cơ chất và chất ức chế cùng cạnh tranh nhau để gắn vào cùng một enzym thì gọi là ức chế kiểu cạnh tranh. Tuy nhiên, ở những quá trình ức chế không cạnh tranh hoặc ức chế cạnh tranh không hoàn toàn thì chất ức chế không gắn vào chính enzym đó mà gắn vào một enzym khác vẫn có khả năng ngăn cản chuỗi phản ứng. Chương này sẽ nói về các con đường ức chế đó và phân biệt chúng bằng phương pháp động học. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến quá trình nghiên cứu sự ức chê enzym. ở mức độ nghiên cứu cơ bản thì chất ức chế được xem như là công cụ để phân biệt sự khác nhau trong cơ chế luân chuyển của các enzym, đặc biệt là các enzym đa cơ chất (xem mục 7.1.3). Bằng cách nghiên cứu môi quan hệ ái lực gắn kết của các chất ức chế cạnh tranh vối những câu trúc khác nhau, mỗi cấu trúc sẽ cho ta biết thông tin về vị trí hoạt động của một enzym thông qua hình ảnh không gian 3 chiểu có độ phân giải cao bằng phương pháp tinh thể học tia X, hoặc quang phố học NMR (Nuclear Magnetic Resonance — cộng hưỏng từ hạt nhân). Những chất ức chế tồn tại ngay trong tự nhiên và nó đóng vai trò quan trọng trong các cơ chế điều khiển sinh học. Hất nhiều các enzym thuỷ phân tham gia vào quá trình tổ chức lại mô tê bào, chẳng hạn như những chất ức chế có bản chất là protein của những phản ứng xúc tác được tìm thấy trong cùng một loại mô như là enzym đặc trưng của mô đó. Đe đạt được trạng thái cân bằng giũa các enzym thuỷ phân protein 280
(proteaza) và các chất ức chê chúng, mỗi sinh vật cần đạt được một trạng thái ổn định nhất định. Những chất ức chế enzym đều có những ứng dụng thương mại. Ví dụ như; một sô" chất ức chế enzym là cơ sở hình thành các chế phẩm trong nông nghiệp như thuốc diệt côn trùng và thuốc diệt từng loại cỏ khác nhau. Các chất ức chế ngày càng mỏ rộng ứng dụng trong việc giảm thiểu tác hại của các vật ký sinh, hoặc sinh vật gây hại khác nhau bằng cách ức chế từng enzym của sinh vật này, đồng thời “tiết kiệm” được enzym cho sinh vật chủ. Rất nhiều loại thuốc chữa bệnh có cơ chế là sự ức chế những enzym đặc hiệu có liên quan đến các khôi u bệnh tật (ví dụ minh hoạ ỏ Bảng 1.4 ở Chương 1). Do vậy mà chất ức chế enzym chính là một trong những tâm điểm nghiên cứu đặc biệt của ngành Dược phẩm. Chất ức chế có thể hoạt động bằng cách gắn không thuận nghịch với một enzym và biến chúng thành trạng thái không hoạt động. Đặc trưng của quá trình này là sự hình thành một liên kết cộng hoá trị giữa một sô" nhóm trên phần tử enzym và trên phân tử chất ức chế. Một số’chất ức chế có khả năng gắn rất chặt vói phân tử enzym (tỷ lệ phân ly của phức tạo thành là rấ t thấp). Những chất ức chế này được xếp vào một nhóm riêng gọi là các chất ức chế liên kêi chặt. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp, các chất ức chế là các phân tử có khả năng gắn thuận nghịch với các enzym, quá trình gắn và tách đều xảy ra nhanh. Những phân tử có những đặc tính này được gọi là những chất ức chế thuận nghịch. Những cơ sỏ và ững dụng của chất ức chế thuận nghịch đều dựa trên khả năng gắn đặc hiệu và ái lực gắn cao vâi những enzym đích của chúng. Hiệu lực gắn của một chất ức chế thuận nghịch được xác định bởi khả năng gắn của nó vối enzym đích và có thổ định lượng được bằng cách xác định hằng sổ phân ly của phức hệ enzym —chất ức chê: [E] + [ I ] ^ J ^ [ E I ] K - IM Ì d [EI] Khái niệm hằng sô phân ly được coi là thước đo môi tương tác giữa các protein sẽ được đề cập à Chương 3 (Sự cân bằng liên kêt protein — phôi tử). Trong những trường hợp ngoại lệ, hằng sô phân ly thưồng được định nghĩa như là hằng sô" của chất ức chê và được ký hiệu là Kị. Giá trị Ki của chất ớc chế enzym thuận nghịch có thể được xác định bằng thực nghiệm thông qua rấ t nhiều con đường. Phương pháp thực nghiệm cho 281
sự xác định sự liên kết giữa protein và tác nhân ở trạng thái cân bằng được nói rõ trong Chương 3, bao gồm phương pháp thẩm tách, sắc ký và phương pháp quang phổ. Các thiết bị đo đạc mới nhất dựa trên kỹ thuật cộng hưởng hệ chất nguyên sinh di truyền cho phép xác định được môì tương tác giữa các tác nhân và các phân tử lốn trong một thời gian chính xác (Chaiken và cộng sự, 1991; Karlsson, 1994). Trong khi đây là phương pháp chính được áp dụng để xác định ái lực của phản ứng kháng nguyên - kháng thể và mối tương tốc giữa các thụ thể với các tác nhân, thì cũng có những phương pháp tương tự khác đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu mối tương tác giữa enzym - cốc tác nhân. Ví dụ: phương pháp này đã được dùng để nghiên cứu mối tương tác giữa protein - những chất ức chế enzym thuỷ phân (proteaza) và các enzym đích của chúng (Ma và cộng sự, 1994). Mặc dù phương pháp này, hoặc rất nhiều phương pháp hoá lý khác khi được ứng dụng để xác định hệ số K| của các chất ức chế enzym, nhưng thông thưòng và đơn giản nhất để đánh giá khả năng gắn của chất ức chế là xác định ảnh hưởng của nó lên khả năng xúc tác của enzym. Bằng cách xác định sự giảm tốc độ ban đầu của phản ứng cùng vói sự tăng nồng độ của chất ức chế, ngưồi ta có thể xác định được mối quan hệ giữa nồng độ enzym tự do và phức hệ enzym - chất ức chế tại bất kỳ nồng độ nào của chất ức chế, và từ đó có thể tính được hằng số cân bằng của phản ứng. 7.1.1. Trạng thái cân bằng của quá trình ức chếthu ận nghịch
Để hiểu được cơ sỏ phân tỏ của quá trình ức chế thuận nghịch phải dựa trên trạng thái cân bằng giữa enzym, cơ chất và các tác nhân ức chê trong dung dịch. Hình 7.1 cung cấp sơ đồ khái quát hoá về khả năng tương tác giữa các phân tử này. Trên sơ đồ, Kg là hằng sô" cân bằng của quá trình phân ly của phức hệ ES thành enzym và cơ chất tự do, Kị là hệ số phân ly của phức hệ EI, và kp là hằng số tốc độ của phản ứng thuận tạo thành sản phẩm từ phức hệ ES hoặc ESI. Hệ sô' (3 phản ánh ảnh hưởng của chất ức chế lên ái lực của enzym đối vói cơ chất của nó cũng như phản ánh ảnh hưỏng của cơ chất lên ái lực của enzym và chất ức chê. Hệ số p phản ánh sự biến thiên của tốc độ hình thành sản phẩm khi có m ặt của châ't ức chế. p bằng không khi chất ức đó ức chế hoàn toàn hoạt tính của enzym. 0 < p < 1 khi chất ức chế chỉ ức chế một phần hoạt độ của enzym. Mặt khác p >1 khi enzym được hoạt hoá: 282
Ks
E + s + I
ES + I
Ki
a K i
F
El
+
!
pkp
a K -s
ESI
El +
p
Hỉnh 7.1. Sơ đổ ỏ trạng thái càn bằng của phản ứng enzym khí có và không có chất ức chê'
Câu hỏi đặt ra là: Tại sao a là hằng sô" khi Kị và K„ thay đổi? Câu trả lời: a là hằng số” của hai hệ số’ trên bởi nền tảng nhiệt động học của chúng. Đê minh hoạ, chúng ta hãy theo dõi cốc cặp phản ứng sau: E + s
k
9
ES + I
ES
AG = RTln(K )
(7.1)
ESI
AG = RTln(aKj)
(7.2)
Khi cộng hai phản ứng ta có (phản ứng chung của chúng là): E + s +I
" ESI
AG = RTln(aK,K.)
(7.3)
Còn bây giò, xét cặp phản ứng khác: E + I —^
El
AG = RTln(Kj)
EI + s ^ ?Ks * ESI
AG = RTln(aKa)
(7.4) (7.5)
Và phản ứng chung của chúng cũng là: E + S+I
ESI
AG = RTln(aKsK i)
(7.6)
ở cả hai trưòng hợp ta đều thu được một phản ứng chung. Như đã nói ở chương các phản ứng hoá học và cốc phản ứng hoá sinh, AG là một hàm không phụ thuộc vào đường đi, theo đó phương trình (7,3) và (7.6) có chung một giá trị AG. Do đó: RTln(aK,Ka) = RTln(aK1Ki) (7.7) ctK;Ks - a(K;Ka) (7.8) a =a (7.9) Bởi vậy giá trị a thực tê là giống nhau khi Ka bị thay đổi bởi chất ức chế hay Kịbị thay đổi bởi cơ chất. Giá trị của a và (3 phản ánh mức độ thay đổi của một tác nhân (chất 283
nền hoặc chất ức chễ) lên khả năng gắn tác nhân còn lại và chúng chỉ rõ phương thức tương tác của chất ức chế với enzym.
(2)
b) C ạnh tranh khòng h o à n toàn (1), (2) h o ặ c (3)
Hình 7.2. C á c mô hỉnh động học cho các loại ức chê'Khác nhau
284
Bảng 7.1. Các luật tốc độ và các tham số cho các loại ức c h ế khác nhau Phàn loại
a) Cạnh tfanh (1) Tinh khiét
Điểu kiện
Các ảnh hưởng lẻn Phẩn bị chặn -1 /V ^ k',và K', 4* 1
IES, IE không theo K is = K , = * khuôn k' = 0
IES, IE khủng theo Kj = k' {2) Hypecbol khuon, ảnh hưởng k = 00 của chát ức ché chỉ lá mối quan hẽ của EvàS
_
1
^cUCSạl
keũ
1
1
Độ d6c = K/K'
K'
Ks — s— (1 + i/ K '. ) V ' cực đại
K s =(1 + i / K | )
^ (1 +i/K 'i)
K e< 1+ i/K,) < 1 + iK ,/K ,K ls)
X:ục đại
b) Cạnh tránh kh&ng hoằn toàn (1) Tinh khiết
B không tteo khuôn
K 'j = 00
1 + i K, / K teKj) V
EIS không bị bé gãy i / K ị
El không theo khuOn
K. X:ựz đạl
K, U i K . / K lsK,
K ’. = 03
I đu’ ảnh huâng dén k V K „ = k / K , vận tóc (3) CỔ điển
cụt dại
Chỉ ES có thể kết K ,l = ® , K , - K . hợp với I một cách nhanh chóng
V CIJC dại
Như trên
Như trên
1 + i/K ,,] X:ục dại
K, V vcục đại
1 + i / K is
i/Kị « 1 c) Kh&ng cạnh tranh (1) Tinh khiiẽt
El khủng theo khuôn
K ' =00
1 + i /K^)
I không cỏ tác động K ,- K a lên một quan hệ wS S. EIS không bị bẻ gãy k « k '
(2) Bộ phận Như t/Ến, El khổng Như trên nhung bị bẻ gẫy; I ảnh k*k' hướng đến liên kết KS* K B với s
dại
d) ử c CÍ1Ỗ có chất
1+s/i^
e) Sản phẩm co chất
K; =}<', = «>
K,
K .n + i/ K ) 1 + iK , / KjKj,
Ks 1 + ik Y k ^>
K ’m K s = K m K ' 5
Tương tự như trường Tương tự như truờng 1 hạp tinh khiết oủa ức hợp tinh khiết cùa ức V cuCđạl chẽ cạnh tranh, chế cạnh tranh, El = EP
lựi+i/R;)
\ U ( W k V k 'W
1+ i/ĩ^
IE S = S E S
V Tcực đại
1+»VHR>
(3) Hypecboi Như IrSn với tníờng Như trường họp tinh hcp tinh ktiiẾt, nhung khiết nhung W IES không bị bẻ gãy k' * k * 0
IE = S E
K s(1 + i/K ()
^{1+s/py N ^ + ik ’/ k X j
ư
1+s/ K b
a /1 1 rp // Kk p' )\ K5(1+ P/kV) ^1 1
''cụt dại
Kị = kp
285
7.1.2. Các phương trình ức chê' thuận nghịch
Nếu chúng ta quan tâm đến cách một chất có thể ảnh hưởng lên tác động phản ứng enzym đơn giản gồm chỉ một cơ châ't, chúng ta có thể đưa ra ba cách khác nhau (từng cái một hoặc kết hợp với nhau) trong đó có thể thay đổi. 7.1.2.1. C hất ÚC c h ế cạnh tranh
ứ c chế cạnh tranh dùng để mô tả trường hợp chất ức chế chỉ gắn vào enzym tự do và không gắn vào phức hệ ES. Do đó, theo sơ đồ Hình 7.1 thì ức chế cạnh tranh hoàn toàn được đặc trưng bỏi giá trị a = 00 và p = 0. Trong ức chế cạnh tranh, hai tác nhân (chất ức chế và cơ chất) cạnh tranh nhau cùng một kiểu enzym và thường theo một cách duy nhất. Theo đó, enzym chỉ có thể gắn vào một trong hai chất đó mà không thể gắn cả hai cùng một lúc được. Hầu hết các chất ức chế đều gắn vào vị trí hoạt động của enzym, hình thành nên một phức hệ EI thay vì một ES, do đó mà chỉ có khả năng cạnh tranh với cơ chất ở khả năng gắn vào các enzym tự do, được minh hoạ ở Hình 7.3a. Phức EI này hoặc là không có khả năng chuyển hoá thành sản phẩm, trong trường hợp đổ chất ức chế được gọi là chất ức chế “đầu chết” (dead —end); hoặc tốc độ chuyển hoá của nó nhỏ hơn nhiều tốc độ chuyển hoá của phức ES. Biểu thị động học ỏ trong đồ thị thuận nghịch kép, độ dốc bị ảnh hưỗng bởi sự có m ặt của chất ức chế, đoạn chắn vẫn duy trì không đôì (Hình 7.2a). Trong những trường hợp này, chất ức chế thưòng có cấu trúc giông với cơ chất, do đó cho phép các chất ức chế có thể tương tác với các nhóm ở vị trí hoạt động của enzym. Tuy nhiên, đó không phải là cách duy nhất để chất ức chế ngăn cản quá trình gắn của cơ chất với enzym, mà có thể khi chất ức chế gắn vào một vị trí khác trên enzym cách xa vị trí gắn của cơ chất, làm thay đổi cấu hình không gian của enzym, từ đó làm biến đổi vị trí hoạt động và do đó làm cho cơ chất không thể gắn vào đó được. Do đó không thể coi bản chất của quá trình ức chế cạnh tranh là do cơ chất và chất ức chế có cùng vị trí gắn. Điều căn bản là do hình thức riêng biệt của từng tác nhân khi cạnh tranh gắn vào cùng một kiểu enzym - enzym tự do. Các sản phẩm kết hợp tương tự vào chỗ trống của trung tâm hoạt động của enzym và vì th ế làm chậm sự chuyển hoá cơ chất. Tuy nhiên, các phức hợp EP tạo ra trong trường hợp này hình thành nên một phần của chuỗi phản ứng tổng thể cơ bản và vì thế tác động của chúng lên phản ứng sau ngược vói nó cho tối khi nó bị ngăn chặn bỏi một bước không th u ận nghịch. Vì thế sự ức chế bỏi sản phẩm rấ t giông vối những 286
gì quan sát được với chất ức chế "đầu chết" và quy luật tốc độ cho cả hai loại không thể phân biệt được trong trường hợp phản ứng s ->• p (Bảng 7.1). Những khác nhau trở nên rõ ràng hơn trong trường hợp nhiểu chất phản ứng. Khi nồng độ chất ức chế nhỏ hơn 100% nồng độ của các phân tử enzym xung quanh nó thì các enzym tự do còn lại sẽ hoạt động. Những phân tử này sẽ phản ứng vói cơ chất với tốc độ giông như khi không có chất ức chế cho đến khi đạt tốc độ cực đại. Tuy nhiên, sự tăng nồng độ cơ chất sẽ có những ảnh hưởng đến quá trình cạnh tranh giũa chất ức chế và cơ chất cho đến khi đạt một nửa tốc độ phản ứng cực đại. Do đó, sự có mặt của một chất ữc chế tới enzym sẽ là động lực làm tăng giá trị Km của enzym và cơ chất mà không ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng cực đại của phản ứng (Vcục dại), đây là một đặc điểm để nhận biết quá trình ức chế cạnh tranh. Một dấu hiệu để nhận biết ức chế cạnh tranh là có thể được khắc phục khi ở nồng độ cơ chất cao, tức là Kj tăng cùng vói sự tăng nồng độ của cơ chất. 7.1.2.2. Chất ức c h ế không cạnh tranh
ức chế không cạnh tranh là trường hợp chất ức chế có khả năng gắn vào cả enzym tự do và enzym trong phức hệ enzym - cơ chất (ES). Do đó, hiện tượng ức chế không cạnh tranh sẽ được đặc trưng bởi giá trị a và p đều bằng 0. Các kiểu ức chế, theo Hình 7.1 thì thực tế ức chế cạnh tranh hay cạnh tranh không hoàn toàn đều là các trường hợp đặc biệt, hãn hữu của ức chế không cạnh tranh khi mà các giá trị a và p là vô cực hoặc bằng 0. Các chất ức chế không cạnh tranh thì không cạnh tranh với cơ chất để gắn vào trung tâm hoạt động, mà chúng gắn vào ở một vị trí khác của enzym. Bỏi vậy, sự ức chế không cạnh tranh không thể khắc phục được bằng cách tăng nồng độ cơ chất. Do đó, có thể thây rõ ảnh hưỏng của các chất ức chế không cạnh tranh là làm giảm giá trị của Vcưcd(U mà không ảnh hưởng đến K„, của cơ chất. Hình 7.3b minh hoạ cho mối quan hệ giữa chất ức chê không cạnh tranh và enzym đích của nó. Biểu thị động học cho trường hợp ức chế không cạnh tranh nằm trong đồ thị thuận nghịch kép mà cốc độ dôc đuy trì không đổi (nghĩa là các đường thẳng song song) nhưng các đoạn chắn biến thiên theo i (Hình 7.1). Dạng ức chê này hiêm xảy ra với các cơ chất đơn, cũng có thê xảy ra nhưng không có cơ chất phù hợp đưa ra sự tổ hợp riêng của I với phức ES. Dạng này trở nên khá phổ biến ở nhiều trưòng hợp phức. 287
(a)
ị-
c = ^ỹ = 2
(b)
Y
3 3
- A.
I_____
.
EZ ZZ Z Z23 - ^ 1
■i :
n n r.
FM CĩTTĩ7
------►
(c)
—
i
Hình
7.3. Hình
minh hoạ của
3 tương tác của
ch ấ t
úc c h ế với
enzym
(a) Chất ức chế cạnh tranh; {b) Chất ức chế không cạnh tranh; (c) Chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn (Nguồn: Copeland, R.A., Enzymes, 2000).
Các học thuyết enzym đâu đó có những hiểu biết không rõ ràng về chât ức chế không cạnh tranh. Một vài tác giả dùng th u ật ngữ “ức chê không cạnh tran h ” để chi trường hợp ái lực của chất ức chế gắn với enzym tự do và vói enzym trong phức hệ ES là như nhau (a = 1). Khi chất ức chê có ái lực khác nhau với 2 dạng enzym này thì một sô tác giả lại dùng khái niệm “chất ức chê hỗn hdp” (a ở có hạn nhưng không bằng 1). Tuy nhiên, chúng ta thấy rằng, th u ật ngữ “chất ức chế hỗn hợp” rấ t khó 288
hiểu và thường dẫn đên sự hiểu sai lệch về bản chất của môi tương tác giữa enzym và chất ức chế. Do đó, việc sử dụng sự ức chế không cạnh tranh với nghĩa bao trùm rộng hơn và tránh đi thuật ngữ ức chế hỗn hợp. Tuy nhiên, bạn đọc cần chú ý phân biệt các th u ật ngữ để tránh sự hiểu lầm khi đọc cuốn sách này. 7.1.2.3. Chất ức c h ế cạnh tranh không hoàn toàn
Chất ức chê có thể liên kết với enzym ồ một vị trí thứ hai, không giốhg hệt hoàn toàn hoặc một phần với vị trí gắn cơ chất. Vì th ế chúng có sự hình thành các phức ES cũng như IES, với kết quả là tốc độ chuyển hoá s —►p chậm hơn nhưng khồng dừng lại. Sự tác động có thể lên ái lực của enzym đốì với s , trong trường hợp đó, Ks tăng; hoặc lên tốc độ xúc tác, trong trưòng hợp đó V giảm. Hai khả năng khác nhau có thể phân biệt được. Phức IES được chuyển thành sản phẩm ồ cùng tốc độ như phức ES nhưng sự có mặt của I trên enzym ảnh hưỏng đến ái lực của nó đối với s, nghĩa là KjB> Ks , cơ chế động học không thể phân biệt so vỗi trường hợp ức chế cạnh tranh ở trên trong chừng mực đồ thị l/v đối vói l/s liên quan, nhưng nó dẫn tới một đồ thị l/v đổí với i và độ dôc với i khác (dạng hypecbol thay cho tuyến tính). Chúng ta có thể gọi trường hợp này là cạnh tranh bên ngoài hay cạnh tranh dạng hypecbol Hình 7.2a - và có thể xem như một trường hợp của ức chế dị lập thể. Sự có m ặt của I trên enzym ảnh hưởng đến ái lực của nó đối với s như trên đã trình bày, nhưng phức IES cũng được chuyển hoá thành sản phẩm ở một tốc độ mà thấp hơn tốc độ của phức ES. Điểu này thường xuyên được nói đến như giải thích cho sự ức chế không cạnh tranh, nghĩa là, dạng ức chế mà ỏ đó chúng ta quan sát thấy những tác động lên độ dốc cũng như lên đoạn chắn đồ thị thuận nghịch kép. Các đưồng thẳng luôn giao nhau ở một diêm vê phía trái của gốc tọa độ, điểm này có thể trên, dưới hoặc ngay trên trục l/s (Hình 7.2c). Đồ thị của các độ dốc hoặc đoạn chắn đối với i là hypecbol. Trong trường hợp đặc biệt, nếu điểm này ở trên trục, chúng ta có sự ức chê cạnh tranh không hoàn toàn, và điều này được giải thích dưới dạng sự vắng mặt hoàn toàn của bất kỳ ảnh hưỏng nào của I lên ái lực của E đôi với s, nghĩa là K = K , - Hình 7.2b - một điều hầu như không xảy ra. Sự kìm hãm không cạnh tranh thực tế trong nhiều trường hợp đa ed chất có thể hoàn toàn là do tương tác với vị trí gắn cơ chất. Các chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn thường gắn vào các 289
enzym trong phức hệ ES hdn là gắn vào các enzym tự do. Đặc điểm của các chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn là làm giảm Vcực d(,i và chính xác hơn là làm giảm giá trị Km. Do đó, chất ức chế cạnh tran h không hoàn toàn được đặc trưng bởi a « 1 và p = 0 (Hình 7.3c). Chú ý rằng, chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn có thể không có ái lực với dạng enzym tự do, do đó giá trị Ki sẽ ở vô cực. Tuy nhiên, ái lực của chất ức chế vối phức hệ ES có thể đo được, do vậy aKị có giới hạn (một giá trị nhất định). Hình 7.1 không thể mô tả được hết trưòng hợp này. Vì lý do này mà rất nhiều tác giả phân biệt hằng số phân ly của [E] và [ES] bằng cách dùng ký hiệu riêng như KiE và Kìes, Kị và KI, KiBvà Kjj. Tuy nhiên, chi rấ t hiếm trường hợp chất ức chế không có ái lực với các enzym tự do. Hơn nữa, các chất ức chế không cạnh tran h hầu hết các trường hợp có KjE » KjES. Do đó chúng ta vẫn có thể sủ dụng Hình 7.1 vối điều kiện a « l . 7.1.2.4. Chất ức c h ế từng phẩn
Đến nay, chúng ta thừa nhận rằng sự gắn của các chất ức chế vào phân tử enzym làm ức chế hoàn toàn sự hình thành các sản phẩm tiếp sau đó. Theo Hình 7.1, ô trạng thái cân bằng cho thấy p = 0 trong những trường hợp này. Tuy nhiên, trong một vài trường hợp, enzym vẫn có thể vượt qua giới hạn của các chất ức chế mặc dù là â một tốc độ thấp hơn nhiêu so với khi enzym không bị ức chế. Trưàng hợp này gọi là ức chê từng phần (partial inhibition) được đặc trưng bởi 0 < p < 1. Đặc điểm để phân biệt chất ức chế này là hoạt tính của enzym không bao già bằng không, thậm chí ở nồng độ chất ức chế cao. Để có được điều này, các thí nghiệm phải được thực hiện một cách chặt chẽ, chính xác trước khi đưa ra kết luận một chất ức chế hoạt động theo cơ chế ức chế một phần. Ví dụ: chất ức chế bị sai hỏng sẽ ức chế hoàn toàn hoạt động của enzym khi ỏ nồng độ cao bởi vì tính tan của hỗn hợp là có giới hạn. Chẳng hạn, khả nãng hoà tan của chất ức chế là 10JJ.M, và tại nồng độ này chỉ ức chô 80% tốc độ của phản ứng enzym. Khi thêm để nồng độ hỗn hợp ỉán hơn 10|^M thì khả năng ức chế vẫn là 80% vì nồng độ chất ức chế trong dung dịch không thể vượt qua được 10|J.M. Do đó, những thông số’ của thí nghiệm phải được kiểm tra một cách cẩn thận để xác định đúng nguyên nhân của sự ức chế đó. Tuy nhiên, thực sự ức chế từng phần là rấ t hiếm. Sự mô tả đầy đủ về vấn đề này dã được dề cập đến trong một vài bài viết (Segeỉ, 1975). 290
7.1.3. Trường hợp nhiều c ơ chất
Khi có nhiều hơn một cơ chất tham gia vào một phản ứng enzym, các hiệu ứng động học bởi các chất ức chế có thể trở nên khá phức tạp. Trong những sô" đó, độ dốc và đoạn chắn của đồ thị thuận nghịch kép không những tuyến tính mà còn có thể trở thành hàm bậc cao hơn (thường là bậc hai) của i. Ngoài ra, các cơ chế khác nhau cũng tạo ra các dạng khác nhau đối với sự ức chế sản phẩm và sự ức chế cơ chất cũng như đối với các tác động có được lên sự bổ sung chất ức chế cạnh tranh “đầu chết”. Để có được sự mô tả hoàn toàn, tất nhiên phải đưa ra phương trình tốc độ hoàn thiện, mà lần lượt phải tính đến các phức hỢp thích hợp giũa tấ t cả các dạng enzym và chất ức chế vào, sau đó viết lại phương trình để xác định tác động lên tốc độ tạo ra do biến thiên bất cứ thành phần nào. Nếu phương trình tốc độ, khi vắng m ặt chất ức chế mà chúng ta đã biết, thì phương pháp tương đối đơn giản; nhân các số’hạng mẫu số tương ững với bất kỳ dạng enzym nào (E, EA, EB,...), như được xác định bởi phương pháp của King, có khả năng phản ứng với chất ức chế, vối (1 + i / K- )> trong đó K. là hằng số phân ly đối với các phức tưdng ứng có chất ức chế. Nếu tất cả đều yêu cầu định tính loại ức chế (nghĩa là cạnh tranh, cạnh tranh không hoàn toàn hay không cạnh tranh), thì có thể được thực hiện bỏi việc kiểm tra cơ chế đưa ra với việc sử dụng các nguyên tắc đơn giản sau (Copeland): (1) Chất ức chế ảnh hưỏng đến độ dốc đồ thị thuận nghịch (l/v đối với 1/S) khí chết ức chế đó và cơ chất s biến đổi, hoặc là cạnh tranh trực tiếp đối với cùng dạng enzym, hoặc phản ứng với các dạng được tách khỏi nhau trong con đưòng phản ứng chỉ bởi các bưốc thuận nghịch, do đó thành phần này, hoặc thành phần kia có thể ảnh hưởng đến nồng độ enzym sẵn có đổi với thành phần khác bằng sự thay thê đơn giản của các dạng cân bằng khác. Vì thế tác động của I có thể khắc phục bằng cách tãng s. (2) Chất ức chế ảnh hưởng đến đoạn chắn của đồ thị thuận nghịch khi nó kết hợp với một dạng của enzym mà dạng này khác vối dạng có vai trò kết hợp với s tự do và do đó giảm lượng enzym tổng số có sẵn cho sự phân phôi giữa các dạng enzym bình thường theo cách không thể vượt qua bởi sự bão hoà s. (3) Những tác dộng này có thể xảy ra riêng rẽ, trong trường hợp đó 291
chúng ta tạo ra dạng cạnh tranh (trưòng hợp 1), hoặc cạnh tran h không hoàn toàn (trường hợp 2) hoặc, cùng chung, dạng không cạnh tranh. Nếu cơ chết hoặc chất ức chế kết hợp với nhau nhiều hơn một dạng của một enzym, dạng tạo nên vì thế là tổng các ức chế khác nhau được tạo ra từng cái một. Bất kỳ dạng nào cũng có thể tuyến tính, hoặc ở bậc cao hơn (ví dụ như: parabol hoặc hypecbol). Một ví dụ chúng ta sẽ thảo luận ngắn gọn là trưòng hdp bổ sung một chất ủc chế (bao gồm sản phẩm Q) cạnh tranh enzym tự do vỏi A, A là cơ chất đầu tiên gắn vào trong trường hợp cơ chế chất phản ứng kép - phương trình (4.58), (4.59) và (4.61). Phương trìn h tốc độ bây giò trở thành: K i + K à [i+ (1+ i ) ã « ] * - 1 + 1+ 7= b Kj a K: a vl
(7.10a)
Chúng ta thấy rằng, nếu A là cơ chất biến thiên, sự ức chế luôn luôn là cạnh tranh, nhưng nếu A được giũ không đổi và B, cơ chất thứ hai, biến thiên, dạng ức chế rõ ràng phụ thuộc vào độ lớn tương quan của K* và K„. a) Nếu Ka và Ka, phương trình trỏ thành: 'V
^
jF*
í t
= [1+ 1+=L — ] + - i [ i + (i + =Lr) —5-]: canh tranh hoàn toàn. (7.1 Ob) K a b K- a \ i/ 1 b) Nếu Ka < Ka , dùng luôn phương trình, là không cạnh tranh từng phần. c) Nếu K* «
Ka, để (1 + i/KJK^/a as 0
— * 1 + ^ - [ 1 + (1 + JL)-Ĩ^2-]: cạnh tranh bên ngoài, b 1 Kị d) Nếu Kg »
Ka để (1 + i/IQKg/a Ss 0
í-^5- «[1 + (1+
Ki
a
+ — : canh tranh không hoàn toàn. b
Nếu chúng ta xem xét cơ chế này một cách tổng quát: A
E 292
B
EA
(7.10c)
p
EAB -> EPQ
Q
EQ
E
(7.10d)
và xem xét ba loại chất ức chế khác nhau, một chất ức chế "đầu chết" kết hợp với EA hoặc EQ, sản phẩm p và chất ức chế đầu chết kết hợp với enzym tự do, áp dụng nguyên tắc Cleland, dự đoán được các dạng sau: D ạng c h ấ t k ìm hãm
EAI EQI EQP EI
A là cơ c h ấ t có t h ể th a y đổi
B là cơ c h ấ t có t h ể th a y d ổ i
Cạnh tranh không hoàn toàn Cạnh tranh không hoàn toàn Không cạnh tranh Cạnh tranh
Canh tranh Cạnh tranh không hoàn toàn Không cạnh tranh Không cạnh tranh
Nhận thây các cơ chế tham gia các phức EAI, EQI, EI có thể dễ dàng phân biệt được. Một dạng không cạnh tranh tuyến tính trong đó các đường thẳng cắt qua trục X là ngẫu nhiên thì có nghĩa là K’, (độ dốc) = K’i (đoạn chắn). Các trường hợp không tuyến tính, ví dụ parabol, sự ức chế được nhận thấy ở trường hợp khi I có thể kết hợp nhiểu hơn vái một dạng enzym. Với chất ức chế "đầu chết", điều này có nghĩa là cả phức EI và EI2 đều hình thành; vớí các sản phẩm trường hợp này không rõ ràng. Các kiểu ức chê sản phẩm cũng có thể sử dụng như các tiêu chuẩn cho chọn lọc các cơ chế có thể chấp nhận được; như vừa đề cập, Q được thêm vào phản ứng trước, gây cạnh tranh ức chế với A, không cạnh tranh với B, p thêm vào là không cạnh tranh vổi cả A và B đốì với cd chế đã đặt ra, nhưng đô'i với các cơ chế cân bằng ngẫu nhiên, cả p và Q gẫy các dạng cạnh tranh với A hoặc B. 7.1.4. Biểu đồ minh hoạ các kiểu ức chế 7.1.4.1. ứ c c h ế cạnh tranh
Có một vài cách vẽ đồ thị khác nhau để mô tả các kiểu ức chế. Trong đó, dạng hàm thuận nghịch kép hay Líneweaver-Burk, là dạng đồ thị được dùng phổ biến nhất để mô tả sự ảnh hưởng của các chất ức chế. ở Chương 4 (Động học của phản ứng enzym) đă trình bày, đồ thị minh hoạ cho giá trị của vận tốc như là một hàm của nong độ cd chât trong hầu hết các trưòng hợp đều là một đường thẳng. Chúng ta sẽ thấy, sử dụng đường đồ thị dạng hàm thuận nghịch kép cho phản ứng của một enzym tai mồt vài nồng đô chât ức chê nhất định sẽ cho từng đương đô thị tương ớng đặc trưng với từng loại chất ức chế. Đồ thị hàm thuận nghịch được dùng phổ biến trong thời gian gần đây đã sử đụng những 293
phương pháp khớp đường cong trên máy tính, bằng cách đó có thể dễ dàng dự đoán được giá trị của Kmvà Vcựcđại dựa vào đồ thị. Tuy nhiên, có những lỗi hệ thống liên quan đến quá trình nhập dữ liệu bằng tay cần phải được chú ý khi xây dựng đồ thị. Để tránh những lỗi không mong muôn và vẫn sử dụng được đồ thị này để xác định phương thức tác động của chất ức chế thì cần phải làm theo các chỉ dân. Để dự đoán được kiểu chất ức chế, cần xác định tốc độ ban đầu của phản ứng như là một hàm của nồng độ cơ chất tại một vài nồng độ nhất định của chất ức chế mà ta quan tâm. Nhằm chọn ra nồng độ chất ức chế phù hợp với từng thí nghiệm, đầu tiên xốc định ảnh hưởng của một phổ rộng nồng độ chất ức chế với nồng độ cơ chất tại giá trị Kro của nó (xác định đường đẳng nhiệt của quá trình ức chế. Từ những kết quả thu được, lựa chọn nồng độ chất ức chế tại đó hiệu quả ức chế là 30 - 75%. Với phương pháp này sẽ chắc chắn thu được sô" liệu chính xác về hiệu quả ảnh hưỗng của chất ức chế khi mà duy trì đầy đủ các yếu tô" của phản ứng. Với nồng độ chất ức chế cố định đã lựa chọn được, xây dựng đồ thị dựa trên cơ sở tốc độ phản ứng là mọt hàm của cơ chất, và khớp sô" liệu vào phưđng trình Henri-M ichalelis-M enten (phương trình 4.26). Xác định giá trị K^ỂUh‘ện (giá trị Kn, biểu hiện tại các nồng độ chất ức chế khác nhau) và v ^ ị ^ ” trực tiếp từ những hình vuông nhỏ không tuyến tính, Cuổì cùng, thay những giá trị K^fuhlỉn và cực dại
vào phươngE> trình nghich đảo — =V & í V
-----— + -—-— để thu fS l V cực đại
t
J
cực ctại
được một đồ thị đưòng thẩng, và dựng đường thẳng cho từng chất ức chê khác nhau trên cùng một đồ thị. Bằng cách đó, đồ thị này có thể dùng để xác định phương thức tác động của từng chất ức chế dựa trên đưòng chuẩn thu được từ những nồng độ cơ chất khác nhau, nhưng không có sai số’hệ thông. Hãy xem ví dụ sau đây để minh hoạ cho phương pháp, và để xác định mẫu mong đợi là một chất ức chế cạnh tranh. Chúng ta sẽ xác định tốc độ ban đầu của phản ứng như là hàm nồng độ cơ chất tại giá trị nồng độ các chất ức chế là 0,10 và 25ịiM và thu được các giá trị như ở Bảng 7.2. Nêu như vẽ đồ thị theo những sô” liệu này, và thay chúng vào phương trình 4.26, ta sẽ thu được một đồ thị minh hoạ ỏ Hình 7.4a. Từ đó ta sẽ thu được các giá trị tạm thòi của các hằng sô' động học: 294
K ra= 10,00|iM
[I] = IO^iM
v cựcđíU— 100 v cựcđ?i = 100
[I] = 25[iM
Vcvjcd?i = 100
Km- 60,00|iM
[I] = OuM
K „ = 30,00jiM
Bảng 7.2. Tốc độ giả thuyết coi như một hàm của nổng độ cơ chất tạí 3 nống độ khác của một chất ức ch ế cạnh tranh [S] (mM) 1 2 4 6 8 10
Vim tấc (các đơn vị tuỳ ý) II] = 0 9,09 16,67 27,57 37,50 44,44
20
50,00 66,67
30
75,00
40
80,00 83,33
50
[I] = 10 nM 3,23 6,25 11,77 16,67 21,05 25,00 40,00 50,00 57,14 62,50
[I] = 25 ỊiM 1,69 3,23 6,25 9,09 11,77 14,29 25,00 33,33 40,00 45,46
Hình 7.4. Đồ thị thực (a) và đồ thị hàm nghịch đảo kép (b) minh hoạ cho ảnh huỏng của một chất ức chê' cạrih tranh lên tốc đọ của một phản ứng có sự xúc tác của erưym; Hình (b) thu được bằng cách ứng dụng phương trình (4.26) với các số liệu của hình (a) và các giá trị tạm thời của các hằng số động học liên quan đến phương trinh nghịch đảo, Xem phần văn bản để biết chi tiết hơn.
Nếu thay nhũng giá trị của K ^ uhlện và v ^ iện vào phương trình nghịch đảo và vẽ đồ thị thì sẽ thu được kết quả ở Hình 7.4b. ' Các đường thẳng bị chặn (bị giới hạn) bởi giao điểm trên trục tung y thể hiện trên Hình 7.4b là đặc điểm của chất ức chế cạnh tranh. Các đường thẩng giao với trục tung y tại điểm chặn (điêm giói hạn) bởi vì một chất ức chế cạnh tranh không làm ảnh hưống đến giá trị tạm thời 295
của VfUc đíl. Độ dốc tạo ra do K ^ uhiện / v “
*n rấ t khác nhau ỏ các đường
bỏi ảnh hưỏng của chất ức chế lên Km. Mức độ biến thiên của Kmsẽ khác với nồng độ chất ức chế, đồng thòi sẽ phụ thuộc vào giá trị K, của chính chất ức chế đó. Những ảnh hưởng của các yếu tô này lên tốc độ ban đầu sẽ được minh hoạ bởi: v =' —
(7, 11)
[S] + Km(l + ^ ) Hoặc nghịch đảo 2 vế của phương trình ta thu được: - = v
V d ại
+( ~ T p ^ )a +| l ) [S] Vcựcdại
(7.12)
K;
Bây giò so sánh phứơng trình (7.12) và phương trĩnh nghịch đảo chúng ta nhận thây rằng, độ dốc của đồ thị tại nồng độ 0 và i bất kỳ khác nhau bởi nhân tô" (1 + [I]/K|). Do đó tỷ sô' của giá trị độ dôc là: Độ dôc0
=
Kj
■
(7.13)
Khi viết lại ta có:
ro_
Độ dỎC; -1 Độ dốc0J
(7-14)
Do đó, trong công thức, ngưòi ta có thể đo tốc độ như một hàm của nồng độ cđ chất trong trưòng hợp không có chất ức chế và tại một giá trị nhất định của [I], đồng thòi sử dụng phương trình (7.14) để xác định Ki của chất ức chế từ đồ thí hàm nghịch đảo kép. Tuy nhiên, phương pháp này có thể tiềm tàng những sai sót bởi vì nó dựa trên một nồng độ đơn nhất để xác định Ki Một phương thức khá phổ biến khác để xác định Ki của chất ức chế cạnh tran h là dựng lại đồ thị dựa trên những thông sô" động học thu được từ đồ thị trên như Hình 7.2a khi mà giá trị tạm thòi Kmcoi như là hàm số của nồng độ chất ức chế. Hoành độ giao điểm X của “đồ thị thứ cấp” này là giá trị âm của K; như minh hoạ ở Hình 7.5, sử dụng số liệu của Bảng 7.1. Cách thứ ba để xác định giá trị Kị của một chất ức chế cạnh tranh được đưa ra bòi Dixon (1953), người ta đo tốc độ ban đầu của phản ứng như là hàm của nồng độ chất ức chế tại hai hay nhiều nồng độ cơ chất 296
nhất định. Sau đó, xậy dựng đổ thị dựa trên các sô" liệu dưới dạng l/v là hàm của [I] cho mỗi nồng độ cơ chất, và giá trị Ki được xác định từ giá trị hoành độ tại đó các đưòng đồ thị cắt nhau, hình ảnh minh hoạ ở Hình 7.6. Đô thị Dixon (l/v là hàm của [I]) cũng được dùng để xác định giả trị Kị của các loại chất ức chế khác.
[I]
Hinh 7.5. "Đổ thị thứ cấp” của một chất ức chế cạnh tranh khi là hàm của [I], Giá trị hằng số K, của chất ức chế cỏ thề được xác định thông qua giá trị âm của hoành độ giao điểm giữa đổ thị và trục hoành
[II Hĩnh 7.6. ĐỔ thị Dixon (1/v là hãm của [I]) của một chất úc chế cạnh tranh tại hai nổng độ cơ chất khác nhau. Giá trị K) của dạng chất ức chế này đưạc xác định từ giá trị âm của hoành độ giao điểm của hai đường.
7.1.4.2. Chất Ú t c h ế không cạnh tranh
Chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn có ái lực với cả hai dạng enzym tự do và enzym trong phức hệ ES, do đó hằng sô phân ly cho mỗi dạng enzym trên phải được tính đên trong quá trình phân tích động học của các chất ức chế này. Phương trình cd bản biểu diễn tốc độ của một phản ứng enzym khi có m ặt của một chất ức chế là: 297
Cực dại
[S]
(7.15)
[SKl + J f - l + K . d + ffi) và đây là phương trình thích hợp cho việc đánh giá chất ức chế không cạnh tranh. So sánh phương trình (7.15) và (7.11) cho thấy chúng tương đương nhau khi a là vô cực. Lúc này, [S] (l+[I]/aKj) chỉ còn là [S] và phương trình (7.14) sẽ rú t gọn thành phương trình (7.15). Do vậy, như trường hợp trên, chất ức chế cạnh tranh có thể xem như là trưòng hợp đặc biệt của chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn. Trong những trường hợp đặc biệt khi aKj= Kị (tức là a = 1) thi ta có thể thay thế Ơ.K, bởi Kj và do đó phương trình (7.15) sẽ trở thành dạng đơn giản: V.cực dọi [S] (7.16) ([S]+Km)(l + | l ) Dạng nghịch đảo của phương trình 7.15 có dạng: K„ 1cựe d ại
1
1 +-N
)+
í® ]
aK ;
(7-17)
cự c d a i
Như Hình 7.7 mô tả, cả độ dốc và tung độ giao điểm của đồ thị đều bị ảnh hưởng bởi sự có m ặt của chẩt ức chế. Các vị trí của các đưòng thang khi ở các nồng độ cơ chất khác nhau sẽ phụ thuộc vào giá trị a. Khi a lớn hơn 1 thì các đường thẳng sẽ giao nhau tại giá trị 1/[S] nhỏ hơn 0 và giá trị 1/v lớn hơn 0 (Hình 1.1 à). Mặt khác, nếu a < 1, thì các đường thẳng sẽ cắt trục X và y ỏ phần bên dưới, tại giá trị âm của 1/[S] và 1/v (Hình 7.7b). Nếu a = 1 thì các đưàng thẩng đồng quy tại giá trị 1/[S] nhỏ hơn 0 tại trục hoành (khi đó 1/v = 0). 0,07
..I.. ’— — r—T— 1 1 • 1 ’
0,20
0,06 “
------ 1—
, ■
0,15
0,05 0,04
>
0,03 -
0,10
^ 0,05
0,02 "
0 00
0,01
0,00 dffiLlj..■>.
. 1 . 1_*— 1— . 1 . -0,05 -0,4-0,2 0,0 0,2 0,4 0.6 0,8 1,0 -0,5 0,0 1/[S] (b) 1/[S] (a) Hình 7.7. Các đưòng thẳng trên đồ thị nghịch đảo kép của chất ức chê' không cạnh tranh (a) tt > 1 và (b) a < 1
298
0,5
1,0
Đổ nhận được giá trị Kị và cxKị phải xây dựng hai đồ thị thứ cấp. Đầu tiên là một đồ thị Dixon (tại nồng độ cơ chất bão hoà) coi 1/Vcựe dại như là hàm của [I], tử đó giá trị của -aK ị có thể được xác định như là hoành độ giao điểm (Hình 7.8a). Trên đồ thị thứ hai, độ dốc của đường đồ thị nghịch đảo kép (từ đồ thị Lineweaver —Burk) được vẽ như là một hàm của [I], ơ dạng đồ thị này, hoành độ giao điểm X sẽ bằng vâi giá trị -K; (Hình 7.8b). Kết hợp thông tin từ hai dạng đồ thị thứ cấp trên cho phép xác định cả hai dạng hằng số phân ]y của chất ức chế trên cùng một sô" liệu thí nghiệm.
(a)
-15,0 -10,0 -5,0
[I]
(b)
10,0
m
Hình 7.8. Đố thị thứ cãp xác định hằng số ức chê' của chất ức chê' không cạnh tranh
(a) 1/V ^ đại coi như hàm của [I] và giá trị -K t được xác định tại giaọ điểm vâi trục hoành của đồ thị; (b) Giá trị -K| đuợc xác định tại giao điểm với trục X của đổ thị minh hoạ cho độ đốc của đường thảng từ đồ thị nghịch đảo kép (Lineweaver -Burk).
7.1.4.3. ứ c c h ế cạnh tranh không hoàn toàn
Cả hai giá trị Vtụcdại và Kmđều bị ảnh hưỏng khi có mặt của chất ức chê này. Dạng phương trình biểu diễn tôc độ phản ứng chứa hăng sô phân ly aKi trên cả tử số và mẫu số. rựcdại [S] 1+ V= ■
aK.
K
(7.18)
■+ [S]
1+J L aK;
Nếu nhân cả tủ số và mầu số của phương trình (7.18) vái (1+ [IJ/aKi) thì thu được dạng đơn giản hơn: cựeđaiAS] (7.19) V =■ [ S J O ^ l +K 299
Ta có thể thấy phương trình (7.19) là trường hợp đặc biệt của phương trình (7.18). Bằng phép toán học đơn giản ta có thể tính được giá trị nghịch đảo của V từ phương trình (7.19): i =( - ^ — - ) +( ơKM V V ^ js r VcựcđạJ
(7.20)
Hình 7.9. Đưòng thẳng minh hoạ trên đổ thỉ nghịch đ ào kép của một chấl ức chê'cạnh tranh không hoán toàn
Từ phương trình (7.20) thấy rằng, độ đốc của đồ thị ngược không phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế và độ tăng giá trị tung độ giao điểm sẽ tỷ lệ cùng với sự tăng của nồng độ chất ức chế. Do đó, các đưòng trên đồ thị nghịch đảo kép của một chất ức chế không cạnh tranh tại các nồng độ khác nhau là những đường song song, đồng thdi cắt trục tung tại các giá trị khác nhau, như minh hoạ ồ Hình 7.9. Với một chất ức chế không cạnh tranh, giao điểm X của đồ thị Dixon sẽ có giá trị bằng vói —aK^l+Kn/S). Nhìn thoáng qua thì có vẻ như môi quan hệ là rấ t phức tạp. Tuy nhiên, với điều kiện nồng độ bão hoà, tức là [ S ] » Km, thì giá trị Km/[S] trỏ nên rấ t nhỏ và có thể coi là bằng 0. Khi đó, hoành độ giao điểm của đồ thị Dixon sẽ bàng giá trị —aKj. Do đó, dưới điều kiện cơ chất bão hoà, ta cố thể xác định giá trị aK, trực tiếp từ hoành độ giao điểm của đồ thị Dixon, như đã được mô tả ở phần chất ức chế không cạnh tranh. 300
7.1.4.4. Ph u ơn g pháp phân tích dụ9 trên s ự khớp toàn bộ cá c s ố liệ u bất biến (G LO B A L FITTING O F UNTRANSFORM)
Phương pháp tốt nhất để xác định kiểu tác động của chất ức chê và giá trị của hằng sô" ức chế là khớp trực tiếp và tất cả các sơ đổ biểu diễn vận tốc với nồng độ cơ chất tại một số nồng độ chất ức chế nhất định với phương trìn h bất biên của chất ức chế cạnh tranh (phương trình 7.11), chất ức chê không cạnh tranh (phương trình 7.15) và chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn (phương trình 7.19). Dựa trên những phép phân tích thống kê tốt nhất (điển hình là phương pháp X2)i đã đưa ra một phương pháp xác định phương thức tác động của chất ức chế hiệu quả nhất, đã mô tả các số liệu thí nghiệm như là một tập hợp đầy đủ và có thê xác định các hằng số của các chất ức chế một cách riêng biệt. Phương pháp phân tích dựa trên sự khớp toàn bộ các sổ* liệu chỉ mới được sử dụng phổ biến trong thời gian gần đây. Các chương trình GraphFit và SigmaPlot là những ví dụ cho phép phân tích này (biểu diễn đường đồ thị phức tạp của hàm có dạng y = f(x,z), trong đó trục hoành X là nồng độ cơ chất và trục z là nổng độ chất ức chê). Celanđ (1979) cũng đã công bố ngôn ngữ lập trình cho chương trình FORTRAN cho phép sự khốp các sô' liệu chung. Các bạn đọc được khuyến cáo nên dùng những loại chương trình này nếu có thể. 7.1.5. Đường cong định lượng quá trình ức chế enzym
Trong rấ t nhiều các phép phân tích sinh học, người ta có thể xác định được một yếu tổ' đặc biệt như là một hàm nồng độ của một số cơ chất bên ngoài. Đồ thị thu nhận được từ hàm này gọi là đồ thị định lượng (dose-response plot), đồng thời hàm này mô tả sự thay đổi của yếu tố khi nồng độ của chúng biên thiên, do đó được gọi là một đường cong định lượng (Hình 7.10). Những đồ thị này có dạng của đưòng đẳng nhiệt Langmuir như đã nói đến ồ Chương 4. Rõ ràng các đồ thị này cũng rất thuận tiện cho việc theo dõi trạng thái liên kết cân bằng của protein tác nhân. Các đồ thị dạng này cũng được sử dụng cho việc theo dõi sự bão hoà trong một số quá trình sinh học khác, chẳng hạn như ảnh hưởng của các chất đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Đồ thị định lượng cũng được dùng để theo dõi ảnh hưởng của chất ức chế lên vận tổc ban đầu của một phản ứng enzym ở nồng độ cơ chất nhất định. Nồng độ chất ức chế đòi hỏi phải đạt được hiệu quả ức chế là 50% hay còn gọi là giá trị IC50, và phương trình thể hiện ảnh hưởng của nồng
được
301
dộ chất ức chế lên tốc độ phản ứng có liên quan đến phương trình của đường đẳng nhiệt Langmuir như sau: 1
V;
1+
(7.21)
_[I]_
ICKn
Trong đó V j là tốc độ ban đầu của phản ứng khi có m ặt của chất ức chế, V là vận tốc ban đầu khi không có mặt của chất ức chế.
[I], nM
Hình 7.10. Đổ thị định lượng hoạt tính enzym như là một hàm của nồng độ chất ức chế. c ầ n chú ý rằng, nồng độ chất ức chế được vẽ tại giá í rị logarit của nó. Giá trị của ICjtf của chất ức chế có thể được xác định như minh hoạ trên đổ thị.
Chú ý tới hai sự khác biệt giữa dạng phương trình (7.21) và phương trình của dường đẳng nhiệt Langmuir chuẩn (phương trìn h 3.23). Đầu tiên, ta thay thế hằng sô' phân ly Kd (hoặc Kj đôi vói sự ức chế enzym) bằng th u ật ngữ IC50. Đó là bỏi vì nồng độ chất ức chế tại điểm mà sự ức chế đạt 50% có thể được thay thế đúng bởi giá trị Kj do ảnh hưởng của nồng dộ cơ chất khi chúng ta rút gọn. Điểm thứ hai khác biệt giũa phương trình (7.21) và (3.23) là ta có thể nghịch đảo tỷ sô của [I] và IC50. Đó là do phương trình đường đẳng nhiệt Langmuir dùng để theo dõi sự phân đoạn của các phân tử thụ thể bao quanh các tác nhân. Ký hiệu V;/V đùng để chỉ hoạt tính từng phần của enzym tương ứng vói từng nồng độ của chết ức chế. Thuật ngữ này phản ánh sự phân đoạn của các enzym tự do hơn là của các enzym bao q u a n h các chết ức chế. Theo đa số các ý kiên, các enzym bao quanh các chất ức chế sẽ có hoạt tính từng phần là 1 - (v;/v). Do đó ta có thể viết lại phương trình (7.20) dưới dạng của phương trình đưòng đẳng nhiệt Langmuìr như sau: 302
Giới hạn phân đoạn -
1- — V
1
(7.22)
v
Đồ thị định lượng được dùng rất phổ biến khi đánh giá khả năng ức chê của một hỗn hợp các chất ức chế lên cùng một enzym với điểu kiện các chất ức chế hoạt động tôt. Phương pháp này được phổ biến rộng rãi bởi vì nó cho phép các nhà phân tích xác định được giá trị IC50 bằng cách đo trên một phổ rộng cốc chất ức chế tại nồng độ cơ chất nhất định. Một phổ nồng độ chất ức chê mở rộng có thể làm cho quá trình nghiên cứu thuận lợi, nghĩa là sơ đồ pha loãng dãy lưỡng phân như trong Chương 4 đã nói đến với chất ức chế thay cho cơ chất. Chiến lược này rất thuận tiện cho việc sàng lọc các phức hợp chưa rõ và khác nhau về khả năng ức chế. Ví dụ: trong công nghệ dược phẩm, người ta mong muốn sàng lọc hàng nghìn phức hợp có khả năng ức chế để tìm ra một vài trong sô" chúng chất ức chế cho enzym đích. Những phức hợp này có phổ rộng của giá trị ICS0. Do đó, người ta sẽ thiết lập một quy trình sàng lọc chuẩn, trong đó tốc độ ban đầu của phản ứng enzym được đo bởi 5 hoặc nhiểu hơn giá trị logarit của nồng độ chất ức chô". Bằng cách này, giá trị IC50 của nhiều hỗn hợp có thể xác định được mà không cần bất kỳ sự hiểu biết nào trước đó về dải nồng độ. Giá trị IC50 chính là một kết quả đọc được của sự ảnh hưởng tương đối lên hoạt tính enzym của các cơ chất khác nhau dưối một tập hợp đặc biệt của các điều kiện trong dung dịch. Trong rấ t nhiểu trưòng hdp, có một mạng lưới ảnh hưỏng của chất ức chế lên hoạt tính của enzym, đứng hơn là hằng số phân ly thực của nó với enzym, là tiêu chuẩn cơ bản thông qua đó xót đoán được ảnh hưởng của một hỗn hợp. Trong một sô" Irưòng hợp, một giá trị K, không thể xác định được một cách tuyệt đôi bởi vì thiêu những hiểu biết, hoặc điểu chỉnh vượt quá điổu kiên thí nghiệm, đôi khi, những trường hợp này, người ta chỉ xác định khả nàng của chất ức chế thông qua một giá trị ICM- Ví dụ: xem xét công việc xác dịnh sự ảnh hưởng của một dãy các chất ức chế vói một enzym đích trong một tế bào. Thông thường, trong những trường hợp này, chất ức chế được thêm vào bào tương của tế bào và ảnh hưởng của chất ức chê' được xác định gián tiêp bằng một chỉ thị hoạt tính sinh học phụ thuộc vào hoạt tính của enzym đích. Trong mội môi trường tế bào như vậy, người ta thường không biết cả nồng dộ cơ chất lẫn sô lượng tương đôi của 303
’
enzym và cơ chất (cần nhắc lại là: trong điều kiện ìn vitro, chúng ta bô' trí các điều kiện thí nghiệm ở trạng thái ổn định, bởi vậy [S] » [E], nhưng nó không cần thiết trong điều kiện tế bào). Cũng trong những trường hợp này, người ta cũng không thể biết chính xác ảnh hưồng nồng độ chất ức chế bên trong tế bào, cái mà tạo nên mức độ ức chế đo được. Đó là bỏì vì màng tê bào có thể ngăn cản sự vận chuyển phần lớn các chất ức chế thêm vào bên trong tế bào. Hơn nữa, sự trao đổi chất của tế bào có thể làm giảm bớt ảnh hưởng nồng độ của chất ức chế bắt cặp với enzym đích. Bởi vì những nhân tôi’không thể kiểm soát này ở môi trường của tế bào, nên việc cần thiết là xác định ảnh hưởng của một chất ức chế thông qua giá trị ICsoMặc dù được phổ biến và có những ưu điểm, việc xác định giá trị IC50 có thể có những sai sót nếu như sử dụng không phù hợp. Giá trị ICM của một chất ức chế có thể thay đẩi cùng với những điều kiện thí nghiệm, vì vậy, điều rấ t quan trọng là cần mô tả một cách chi tiết những điều kiện của thí nghiệm cùng vói giá trị ICB0. Chẳng hạn, trong trường hợp chất ức chế cạnh tranh, giá trị IC50 thu được của một chất ức chế phụ thuộc vào nồng độ của cơ chất trong thí nghiệm, liên quan đến giá trị Kmcủa cơ chất. Điểu dó được minh hoạ trên Hình 7.11 cho một chất ức chế cạnh tranh tại điều kiện [S] = Kmvà [S] = 10 X Km. Do đó khi so sánh một số các chất ức chế cạnh tranh thì điều quan trọng là các giá trị IC50 phải được đo ỏ cùng một điều kiện cơ chất. Cũng bởi lý do này mà sẽ không chính xác khi so sánh tiềm năng của các châ't ức chế thuộc các kiểu phương thức khác nhau bằng cách sử đụng giá trị IC 50. M ặt khác, giá trị IC50 của một chất ức chế cạnh tranh và một chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn khác vói nồng độ cơ chất nhưng theo các cách thức khác nhau. Do đó, hiệu quả tương đối thu được trong điều kiện in vitro (phòng thí nghiệm) sẽ có thể khác so với những kết quả tương tự thu được trong điều kiện in vivo (trong cd thể sống), nơi mà những điều kiện khá là khác hơn. Bồi vậy, bất cứ trường hđp nào, giá trị Kị cũng được dùng để so sánh tiềm năng ức chế của các phức hợp khác nhau. Sẽ !à râ't thuận lợi cho việc tính toán giá trị IC50 và vẫn đánh giá được tiổm năng ức chế trên cơ sỏ giá trị thực của Kj và khi biết được phương thức tác động (kiểu) cũng như giá trị [S], Km của phức hợp chất ức chế đó. Mối quan hệ giữa các giá trị Kị, Km, [S] và giá trị ICB0 có thể dược bắt nguồn từ phương trình tốc độ đã có. Quá trình biến đổi này được mô tả chi tiết bởi Cheng và Prusoff (1973) cho cả chất ức chế cạnh 304
tranh, cạnh tranh không hoàn toàn và chất ức chê không cạnh tranh, ở đây chỉ đưa ra công thức cuối cùng đơn giản nhất để diễn đạt mối quan hệ này. Với chất ức chế cạnh tranh: (7.23)
Với chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn: (7.24)
Nếu a = 1 thì Kị = IC50. Và với chất ức chế không cạnh tranh: (7.25)
nếu [S ]» K m thì ccKì -IC bo. Những phương trình từ (7.23) - (7.25) được hiểu như là mối liên hệ giữa Cheng và Prusoff, tức là thường có thể tiện lợi khi thay giá trị ICao bằng giá trị Kj. Tuy nhiên, để chắc chắn rằng, đã sử dụng đúng mối liên hệ trên hay chưa thì điều then chốt là cần biết rõ về phương thức ức chế của phức hợp nghiên cứu. Do đó, dường như không có một lợi th ế nào đáng kể khi sử dụng môi liên hệ Cheng - Prusoff nếu như phương thức hoạt động cùa châ't ức chế được xác định bằng bất kỳ phân tích Lineweaver - Burk. Tuy nhiên trong rất nhiều trường hợp, ngưồi ta mong muốn xác định được tiềm năng ức chế tương đối của một chuỗi, hỗn hợp các dẫn xuất có liên quan về cấu trúc. Nếu như lo ngại rằng, các phức hợp này chỉ là đại diện một phần nhỏ của cả phân tử chung ban đầu, thì có thể nói một cách chắc chắn rằng, tết cả những dẫn xuất này đều có chung phương thức ức chế giông như chất đã sinh ra chúng, Trong những trưòng hợp như thế, người ta có thể chỉ cần xác định phương thức ức chế của các phân tử ban đầu và sau đó áp dụng mối liên hệ ChengPrusoff cho việc giải quyết chuỗi phân tử dẫn xuất. Đương nhiên cũng có những sự thay đổi vô tình trong phương thức ức chế là kết quả của sự rối loạn cấu trúc. Nó thưòng không quá nguy 305
hiểm, nếu như sự rối loạn này là nhỏ, và có thể kiểm tra lại trường hợp đó bằng việc thực hiện phân tích Lineweaver - Burk trên một phân nhóm của những phức hợp đại điện cho một phổ rộng các biến đổi bên trong chuỗi. Tuy nhiên, rấ t nhiều nhà khoa học cho rằng, giá trị Kị thu được khi ứng dụng mối liên hệ Cheng - Prusoff có vẻ ít chính xác hơn so vói khi dùng các phương pháp truyền thống trước kia. Độ tin cậy thấp hơn so với những kết quả trước là bởi vì ảnh hưởng của chất ức chế chỉ được kiểm tra tại một nồng độ cơ chất riêng lẻ, nhất định. Tuy vậy, do những thuận tiện của nó mà môì liên hệ Cheng - Prusoff vẫn thường được sử dụng trong định lượng chất ức chế. Như đã đề cập ở phần đầu của chương này, có một sô chất ức chế không làm ngừng hoàn toân hoạt động của enzym. Những chất ức chê từng phần này sẽ không có đường cong định lượng giống như các chất ức chế hoàn toàn, bởi vì nhũng bợp chất này không thế làm cho vận tốc phản ứng bằng không ngay cả khi chúng có nồng độ rấ t cao. Hơn nOa, đưòng cong định lượng của các chất ức chế từng phần này sẽ được hợp lý hoá bằng cách phát triển thêm từ phương trình (7.21) có dạng: (7 26) 1+
IC„
trong đó y là hoạt tính từng phần khi có m ặt của chất ức chế tại nồng độ [I]. ycực itại là giá trị cực đại của y tại nồng độ chất ức chế bằng 0, ycựctj|u là giá trị nhỏ nhất của y tại nồng độ chất ức chế lón nhất. Không giông như một chất ức chế hoàn toàn, đường cong định lượng của chất ức chế từng phần tại nồng độ chất ức chế cao nhất sẽ có giá trị Vị/Vo nhỏ n h ất, nhưng không bằng 0. Ví dụ như trê n H ình 7.1 la, giá trị p là 0,05, đo vậy mặc dù nồng độ chất ức chế rấ t cao nhưng phản ứng của enzym vẫn còn là 5%. Khi khảo sát đặc tính của loại chất ức chê' này, người ta phải đảm bảo rằng, không có sự ức chế hoàn toàn trong thí nghiệm. Ví dụ: bằng phép đo m ật độ bằng quang phổ, người ta thường phải khảo sát m ật độ một số’ chất hữu cơ - chất mà không thể loại bỏ hoàn toàn ra khỏi cơ chất và chính nó có thể là nguyên nhồn tạo ra quá trình ức chế từng phần trong thực tế đó lại là một quá trình ức chế hoàn toàn. Nhiều các dấu hiệu nhận biết quá trình ức chế từng phần có thể quan sát được bằng cách sắp xếp các số' liệu theo sơ đồ Dixon. Trong khi chất ức 306
chế hoàn toàn thu được hình biểu diễn là những đưòng thẳng, thì chất ức chế từng phần lại theo đường hypecbol (Hình 7.1 lb). Trong những trường hợp này, người ta có thể bỏ bớt các giá trị a, K;, và [3 của chất ức chế phụ thuộc vào phương thức tác động của chất ức chế đó. Tuy nhiên, những phân tích đó vượt qua tầm giới hạn của cuốn sách này. Bạn đọc có thể tìm hiểu sâu hơn về vấn đề này thông qua bài viết của Segel (1975).
[I]. nM
(b)
[III
Hinh 7.11. Đổ thị định lượng (a) và Dixon (b) của một chất ức chế từng phần. Giá trị v/v đạt đến một giá trị khác không ổn định tại nồng độ chất ức chế cao. Đặc trưng của chất ức chế 'ừng phần là một đường hypecbol trên đổ thị Dixon (b).
7.1.6. Quá trình gắn loại trừ nhau của haí chất ức ch ế
Nếu có hai chất ức chế I và J khác nhau về cấu trúc cùng tương tác vổi một enzym, thì có thể chúng gắn đồng thòi để tạo thành phức EIJ (hoặc là tạo thành một phức hệ ESIJ nếu như cả hai chất cùng có khả năng gắn vào phức ES). Hoặc nếu, cả hai chất ức chế có cùng một kiểu gắn như nhau (tức là cạnh tranh lẫn nhau), khi đó thì chỉ có phức EI hoặc EJ được hình thành. Có một sô' phương pháp để xác định xem hai chất ức chế có phải cùng cạnh tranh để gắn vào một enzym hay không. Hầu hết cách trực tiếp là dùng phương pháp đánh dấu phóng xạ hoặc đánh dấu huỷnh quang một trong hai chất ức chế, Nếu như cách đánh dấu được dùng để theo dõi trực tiếp quá trình gắn của một chất ức chế vào enzym thì khả năng chất ức chế còn lại cản trở quá trình gắn này như thê' nào có thể được xác định như mô tả trong Chương 3. Một sô' các thông số dộng học cũng được xác định để kiểm tra quá trình tương tác loại trừ của các chất ức chế với cùng một enzym đích (xem Marline - Irujo và cộng sự, 1998). Tất cả những phương pháp này đều liên quan đến sự xác định tôc độ ban đầu của enzym tại những sự kết hợp khác nhau của hai chất ức chế. Những ảnh hưỏng của hai chất 307
ức chế lên tốc độ của một phản ứng enzym có thể được mô tả thông qua môì quan hệ nghịch đảo sau: 1
1
f
_
(7.27) K, K, aK ,K jy ỊJ trong đó: Vy là tốc độ ban đầu khi có m ặt của cả hai chất ức chế, Kị và Kj lần lượt là hằng sô" ức chế của hai chất I và J, và a là hệ sô' tương quan thể hiện ảnh hưởng của chất ức chế này lên ái lực của chất ức chế kia với enzym. Nếu như hai chất ức chế cùng gắn vào một kiểu khuôn giống nhau thì a = 00. Nêu hai chât gắn độc lập hoàn toàn thì a = 1. Nếu hai chất ức chế gắn vào khuôn không giông nhau hoàn toàn nhưng gây ảnh hưỏng đến ái lực gắn vói enzym của nhau thì a là một sô" hữu hạn lớn hơn 1 hoặc nhỏ hơn 1. Khi a nhỏ hơn 1 thì quá trình gắn của chất ức chế này sẽ làm tăng ái lực của enzym với chất ức chế kia và được gọi là hiện tượng gắn bổ trỢ (synergistic). Khi a lón hơn 1 thì quá trình gán của chất ức chê này sẽ làm giảm ái lực của enzym với chất ức chế kia và trong trường hợp này được gọi là gắn đốỉ kháng (antagonistic). Loewe (1957) đã sử dụng phương pháp isobologram để xác định quá trình gắn loại trừ. Trong phép phân tích này, các nồng độ khác nhau của I và J được tổ hợp với nhau để tạo cùng hoạt tính từng phần (v/v). Các nồng độ khác nhau của I sẽ được biểu diễn trên trục y, và các giá trị J tương ứng được biểu diễn trên trục X . Nếu như hai chất ức chế gắn loại trừ nhau thì điểm biểu diễn sẽ nằm ngoài dưòng thẳng. Tuy nhiên, nếu như hai chất ức chế gắn không loại trừ nhau hoàn toàn thì điểm biểu diễn sẽ cố dạng đường cong lõm phía ngoài trên isobologram (để phân tích thuốc dùng phương pháp montercarlo) và độ lõm của đường cong phụ thuộc vào giá trị a. Có một sô" các phương pháp đồ hoạ khác cũng được mô tả trong kiểu phân tích này (xem Choư và Talalay, 1977); trong tất cả các phương pháp này, phương pháp phổ biến nhất là phương của Yonetani và Theorell (1964). Trong phương pháp của Yonetani và Theorell, các sô" liệu được biểu diễn theo đồ thị Dixon, trong đỏ 1/Vjj được vẽ như là một hàm của [I] tại các nồng độ J nhất định khác nhau. Theo phương trình (7.27) cho thấy, khi a bằng vô cực thì trên đồ thị Yonetani -Theorell, các điểm sô" liệu được minh hoạ dưới dạng các đường thẳng song song (Hình 7.12a). Đó là một đấu hiệu cho thấy rằng, hai chất ức chế gắn vào một kiểu khuôn giông nhau, cạnh tranh nhau để gắn vào cùng một dạng enzym. Nếu a = 1, hai chất ức chế gắn không phụ thuộc vào nhau thì các đường biểu diễn trên đồ thị Yonetani-Theorell sẽ giao nhau ở trên trục hoành (Hình 7.12b). V-;
308
Nếu a >1, hai chất ức chê gắn đối kháng nhau, thì các đưòng biểu diễn lúc này lại cắt nhau ỏ phía dưới trục hoành (x). Và nếu hai chất ức chế là gắn bổ trỢ cho nhau, khi đó a < 1 và các đường biểu diễn sẽ giao nhau ở phía trên của trục hoành X. Với bất cứ đồ thị Yonetani-Theorell, mà tại đó, các đưòng biểu diễn cắt nhau (tức là a É oo), thì hoành độ giao điểm của các đường sẽ cung cấp một sự ước lượng giá trị -ccKj khi [I] được biểu diễn trê n trục hoành X, hoặc giá trị -aK j khi [J] là nồng độ khác nhau của chất ữc chế. Nếu hai giá trị Kị và Kj được xác định từ nhũng phép đo độc lập thì giá trị a sẽ dễ dàng tính được. Một động cơ chung thúc đẩy việc thực hiện các phân tích trong phần này là để xác định xem có hay không hai chất ức chế khác nhau về cấu trúc chung nhau một vị trí gắn trên phân tử enzym. Nếu như hai chất được nhận thấy rằng, gắn vào một kiểu khuôn giông nhau, thi thông qua không chỉ các phân tích động học mà còn qua các phép đo mốĩ liên kết trực tiếp, đã đưa ra kết luận rằng, chúng có cùng một vị trí gắn trên phân tử enzym.
(b)
[I]
Hinh 7.12. (a) Đồ thị Y o n e t a n i - T h e o r e l l của hai chất ức chế I và J có chung một kiểu khuôn gắn duy nhất ( a * 00) với cùng một enzym; (b) Đồ thị Yonetani-Theorell của hai chất ức chế khòng ioại trừ có a = 1. Các chấm tròn rỗng là minh hoạ cho các số liệu khi [J] = 0, các chấm tròn tô đâm là minh hoạ cho các số liệu tại [J] = Kj.
Có một sự th ật hiển nhiên khi mô tả quá trình ức chất cạnh tranh với cơ chất chỉ ra rằng: vị trí tương tác duy nhất có thể quan sát được khi hai chất ức chế cùng gắn vào một vị trí trên phân tử enzym, nhưng, nó cũng có thể có khả năng quan sát được nêu như haí chất ức chê gắn vào hai vị trí độc lập nhau, trong đó có sự ảnh hưởng mạnh mẽ lẫn nhau trong quá trìn h tương tác, bởi vậy sự liên kết tác nhân tại một vị trí sẽ làm ngừng quá trình gắn của tác nhân tại vị trí kia. Do đó, có một vài chú ý đặt ra trong quá trình giải thích những kết quả của quá trình nghiên cứu những chất này. 309
7.2. C Á C CHẤT ỨC C H Ế LIÊN KẾT CHẶT
Trong chương này chúng ta đã thảo luận về các chất ức chế enzym thuận nghịch, chúng liên kết và được giải phóng nhanh chóng khi so sánh vói tỷ lệ quay vòng hoá enzym và có hằng số phân ly lớn với các nồng độ enzym tổng sô". Chúng ta có thể phân tích sự tác động lẫn nhau của các chất ức chế này với các enzym đích của chúng bằng các phương trình của Henri —Michaelis —Menten đã được thảo luận ở các chương trên. Có thể cho rằng, nồng độ chất ức chế tự do là mô hình của nồng độ tổng số khi đã thêm chất ức chế, vì thế, khi [E] rấ t nhỏ so với Kị, nồng độ của phức hợp EI là rấ t nhỏ 80 với [I]. Tuy nhiên, trưòng hdp này không đúng với tất cả các chất ức chế. Một vài chất ức chế liên kết enzym đích của chúng với ái lực cao đến nỗi mà m ật độ các phân tử chất ức chế tự do bị giảm đi đáng kể bởi sự hình thành phức châ't enzym - chất ức chế. Đôì với các chất ức chế liên kết chặt này, việc sử dụng sự gần đúng trạng thái ổn định sẽ có hiệu quả hơn; trên thực tế nó đã được kiến nghị rằng, những giả định này nên được bỏ qua bất kỳ khi nào Kị của một chất ức chế ít hơn 1.000 so vói nồng độ enzym tổng sô" (Goldstein, 1944; Dixon và Webb, 1979). Trong chương này chúng ta sẽ trình bày những phương pháp khác để phân tích sô' liệu trong trường hợp các chất ức chế phức tạp và xác định chính xác hằng số phán ly cho phức chất enzym - chất ức chế. 7.2.1. Nhận biết sự ức ch ế liên kết chặt
Trong phần này chúng ta sẽ xem xét trạng thái ổn định để nghiên cứu các chất ức chế liên kết chặt. Các điểu kiện phân tích yêu cầu nghiên cứu phải đưa tất cả đến trạng thái cân bằng bao gồm chất ức chế, cơ chất và enzym đểu phải đạt được một cách nhanh chóng liên quan đến việc đo vận tốc trạng thái cân bằng. Tuy nhiên, một số chất ức chế liên kết chặt bị hạn chế hoạt động của chúng do sự ức chế tác dụng chậm, nghĩa là tác động của thành phần phụ thuộc thời gian lên sự ức chế. Chúng ta sẽ thảo luận sự ức chế phụ thuộc thời gian một cách rõ ràng, trong đó sẽ cùng giả định rằng, sự thiết lập thế cân bằng là nhanh chóng, hoặc thòi gian đủ để trước khi sự bắt đầu phản ứng bởi cơ chất đối với chất ức chế và e n z y m thiêt lập thế cân bằng (sự ủ sơ bộ enym với chất ức chế đã được thông nhất trong bản phác thảo thực nghiệm). Cách xác định đơn giản nhất sự ức chế có liên kết chặt là khi đo đường cong phản ứng định lượng cho chất ức chế. Giá trị IC50 đã thu được từ sự xử lý số' liệu này là tương tự với nồng độ enzym tổng số' ở trong mẫu 310
(nhân tô thứ 10) là một dấu hiệu tốt mà chất ức chế là một dạng liên kết chặt. Một đặc điểm rõ ràng hơn của chất ức chế liên kết chặt là sự thay đổi giá trị ICMcủa các ức chế so với nồng độ enzym tổng số tại nồng độ cơ chất định trước. Điều này là đúng, bởi vì một chất ức chế liên kết chặt tiếp xúc với enzym theo kiểu hoá học lượng pháp tuyến tính. Vì thế nồng độ các enzym có m ặt càng cao thì nồng độ các chất ức chế càng cao để đạt tới trạng thái nửa bão hoà của các vị trí gắn ức chế. Nhiều tác giả đã thành lập các phương trình tương tự như phương trình (7.28), phương trình biểu thị giá trị ICso của chất ức chế liên kết chặt sẽ chuyển dịch tuyến tính với nồng độ enzym tổng sô', [E], (Myers, 1952; Myers và cộng sự, 1975; Williams và Morrison, 1979; Greco và Hakala, 1979): ICgo= ^[E] + K*ấpxỉ ù
(a)
(7.28)
[I], nM
Hỉnh 7.13. (a) Đổ thị phản ứng định lượng vận tốc phân ly là một hàm số nồng độ chất ức chế liên kết chạt tại các nồng độ enzyrri khác nhau. Lưu ý rằng, đổ thị này giống như các đổ thị phản ứng định iuợng; (b) Đồ thị giá trị ICso đã thu được từ đưởng đổ thị (a) là một hàm số của nồng độ enzym.
Do đó, một điểm IC50 là một hàm của [E] (tại một thời điểm đơn, nồng độ cơ chất đã được cô" định), để tạo ra được một đưàng thẳng với độ dốc 0,5 và cắt y tại K*tfp” . Giá trị K*íp xi liên quan tói từ K, thực do các nhân tô' gồm nồng độ cơ chất và Km, phụ thuộc vào kiểu tiếp xúc giữa chất ức chế và enzym. 7.2.2. Phân biệt các loại chất ức c h ế liên kết chặt
Morrison (Morrison, 1969; Willimam và Morrison, 1979) đã đưa ra các cách xử lý toán học hiệu quả cho các chất ức chế có khả năng liên kêt tại vận tốc khởi đầu của các phản ứng enzym. Nhũng nghiên cứu này được dùng để phát hiện những dạng khác, ỏ đó các điểm tương tác được 311
sử dụng để phân biệt kiểu chất ức chế đối với các chất ức chế enzym đơn giản được xếp vào loại các chất ức chế liên kết chặt. Ví dụ: dựa vào trích dẫn nghiên cứu của Morrison và cộng sự, điểm tương tác cho một chất ức chế cạnh tranh liên kết chặt sẽ đưa ra mô hình các đường thang như được minh hoạ ở Hình 7.14. Trong đồ thị này, số" liệu ỏ các nồng độ cơ chất cao làm đưòng đồ thị cong xuống, và các đường cong tại các nồng độ cơ chất cao và khi có nồng độ chất ức chế cao. Cách phân tích sô' liệu này rất khó thực hiện, hoặc các điều kiện không thể đáp ứng được cho thí nghiệm. Do đó, một vài điểm số liệu trong vùng cơ chất cao bị bỏ qua, số liệu tương ững phù hợp ỏ Hình 7.14, sô" liệu này thích hợp cho hàng loạt hàm sô" tuyến tính, như đã biểu diễn trong minh hoạ này. Mô hình các đường thẳng thấy rõ ràng từ cách xử lý số’ liệu này là một chuỗi các đường thẳng giao nhau hoặc tiến gần tới trục X , về phía trái của trục y. Đây là một kết quả được mong đợi cho một chất ức chế không cạnh tranh cổ điển, và chúng ta có thể quy ước chung cho dù kiểu tiếp xúc thực của chúng vổi enzym, các chất kìm hãm liên kết chặt hiển thị các điểm tương tác làm xuất hiện mô hình cổ điển tương tự cho các chất ức chế không cạnh tranh.
Hinh 7.14. Đồ thị thuận nghịch chất ức chế cạnh tranh có khằ năng liên kết chạt: mô hình các đường thẳng được tạo ra cho một chất ức chế không cạnh tranh cổ điển.
Sau đó có thể xác định kiểu tiếp xúc thực giữa một enzym và chất ức chế liên kết chặt như thế nào? Một vài phương cách gần đúng đã được đề xuất. Một trong những cách đơn giản nhất là xác định các giá trị I C 5 0 (đối với nồng độ chất ức chế có sự ức chế 50%) chất ức chế tại một nồng độ enzym đã được cố' định, nhưng với các nồng độ cd chất khác nhau. 312
Như với các chất ức chế thuận nghịch cơ bản, IC50 chất ức chế liên kết chặt phụ thuộc vào Kj của chất ức chế, nồng độ cơ chất, và Km cơ chất theo các kiểu khác nhau, phụ thuộc vào kiểu ức chế. Đối với các chất ức chê liên kêt chặt, chúng ta phải xem xét thêm nồng độ enzym trong mẫu, điều này sẽ ảnh hưởng nhất định đến ICso, giống như đã thảo luận lúc đầu. Các mối liên kêt thích hợp giữa các nhân tố này và IC50 cho các kiểu chất ức chế liên kết chặt khác nhau đã được trình bày trong tài liệu (Cha, 1975; Willimam và Morrison, 1979; Copeland và cộng sự, 1995). Chúng ta sẽ trình bày đơn giản các dạng liên kết. Với các chất ức chế cạnh tranh liên kết chặt: (7.29)
(7.30) K, Khi a = 1
aK s (7.31)
IC5„ = K i + H
Các chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn có liên kêt chặt: IC „ = a K l(i + ^ ) +
f
(7.32)
Từ dạng của các phương trình này, chúng ta thấy rằng, đồ thị giá trị IC50 là một hàm sô' của nồng độ cơ chất sẽ tạo nên các mô hình khác, phụ thuộc vào kiểu chất ức chế. Đối vối một chất ức chế cạnh tranh liên kết chặt, giá trị IC50 sẽ tống một cách tuyến tính vối việc tăng nồng độ cơ chất; đối vói một chất ức chế cạnh tranh không hoàn toàn, dồ thị giá trị IC50 là một hàm sô' của nồng độ cơ chất sẽ uốn cong đường đồ thị đi xuống đột ngột (Hình 7. lõa). Trong khi đó, với một chất ức chế không cạnh tran h IC50 sẽ uốn cong đường đồ thị lên hoặc xuống, hoặc sẽ phụ thuộc [S], bằng cách phụ thuộc vào dù a lớn hơn, nhỏ hơn, hay bằng 1,0 (Hình 7. lõ a và b), Một trong những phương pháp vẽ đồ thị dùng để xác định kiểu chất ức chế, và đưa ra dự đoán chất ức chế Ki, vận tốc phân ly của phản ứng enzym được biểu thị như một hàm số của nông độ chất ức che tại những nồng độ cơ chất đã xác định (Dixon, 1972). Số liệu phù hợp có thể đưa 313
đến phương trình (7.15) tạo nên một đường cong phù hợp như biểu thị ò Hình 7.16a (Lưu ý rằng, đây giông như các đồ thị phản ứng định lượng đă được thảo luận ở mục 7.2, ngoại trừ ở đây trục X được vẽ trên đường tuyến tính, chứ không phải là một hàm loga hay tỷ lệ). Một đường thẳng được vẽ từ giá trị v/v0 tại [I] “ 0 (được xem là điểm khỏi đầu) thông qua điểm V = V q / 2 (n = 2) trên đưòng cong và được kéo dài tới trục X . Đưòng thẳng thứ 2 được vẽ từ điểm khởi đầu thông qua điểm V = vJ3 (n = 3) trên đường cong, tương tự như vậy, các đường thẳng thêm vào được vẽ từ điểm khởi đầu thông qua các điểm khác V = Vq/ii trê n đưòng cong (với n là một số nguyên). Do đó, điểm tập trung các đường thẳng sẽ cắt trục X tại một khoảng liên tiếp được xác định bằng K.
(a)
Hỉnh 7.15. (a) Các tác động của nồng độ cơ chất lên các giá trị ICso của các chất ức chế liên kết chặt cạnh tranh (cảc chấm tròn đen), cảc chất ức chế liên Kết chặt không cạnh tranh (các chấm vuông đen); (b) Các tác động của nồng độ cơ chất lên các giá trị ICM của các chất ức chế liên kết chặt không cạnh tranh khi a < 1 (chấm vuông) và khi a > 1 {chấm tròn).
Khi biết được giá trị K từ diểm khỏi đầu của các đường thẳng này, ta có thể vẽ các đưồng thẳng thêm vào từ trục X tới gốc tại khoảng K trên trục X, cho các giá trị n = 1 và n = 0. Từ cách xử lý này, đường thẳng tương ứng tới n - 0 sẽ cắt trục X tại một điểm thay thế từ gốc bằng nồng độ enzym tổng số, [E]. Dixon đã trình bảy trường hdp chất ức chế không cạnh tranh (a = 1), giá trị khoảng K bằng chất ức chế Kj, và đồ thị K ìà một hàm nồng độ cơ chất sẽ là một đưòng thẳng ngang; đó là giá trị K cho một chất ức chê không cạnh tranh phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Tuy nhiên, cho một chất ức chế cạnh tranh, việc xử lý giá trị K sẽ tăng ỉên cùng với việc tăng nồng độ cơ chất. Thay th ế đồ thị K bằng một hàm số nồng độ cơ chất tạo ra bằng sự ưốc đoán chất ức chế K; và cơ chất Kmtừ các điểm cắt lần lượt trục y và X (Hình 7.16b).
0,02
0,015
Ị
0.01 0,005
0,0
0
10
20 30 [I], nM
40
50
60
0,000 -1 5 -1 0 -5
(b)
0 5 IS], mM
10
15 20
Hinh 7.16. (a) S ự xác định K bằng phương pháp vẽ đổ thị của Dixon (1972): Các đ u ờ n g thảng xiên nối điểm khởi đầu (v/v0 = 1, íij - 0) VỚI các điểm trên đường cong tại v/v0 = Vp/n (n - 2, 3 ,4 và 5). Các âuỡng thẳng thêm vào được vẽ cho n = 1 và n = 0 phfa ngoài, cân cứ vào trục X khoảng giá trị K được xác định từ các đường thảng n = 2 - 5 (xem đoạn trích chi tiết hon); (b) ĐỔ thị thứ 2 của K là một hàm số nồng dọ cơ chất cho một chất ứ t chế cạnh tranh liên ket chặt. Việc xác định đồ thị K vả Kra lần luợt từ các điểm cắt y và X, như đồ thị trên.
7.2.3. Xác định Kỉ cho các chất ức ch ế liên kết chặt
Tài liệu đã trình bày một phương pháp xác định giá trị Kị của một chất ức chế liên kết chặt. Chúng ta đã thảo luận phương pháp vẽ đồ thị của Dixon (1972), phướng pháp này đã cho phép phân biệt đồng thòi kiểu chất ức chế và dự tính Kị. Một phương pháp xử lý chính xác hơn cho các chất ức chế liên kết chặt đã được Morrison (1969) trình bày, đưa đến một phương trình tổng quát biểu diễn vận tốc phân ly của phản ứng enzym là một hàm sôTnồng độ chât ức chê, tại các nồng độ enzym và cơ chất đã xác định. Phương trình này được tham khảo như phương trình Morrison, được trình bày theo dạng phương trình (3.38), ngoài ra ở đây, phương trình biểu diễn vận tốc enzym phân ly với sự có m ặt của chất ức chế (liên quan đến sự phân ly enzym tự do thay th ế cho sự phân ly enzym liên kết với chất ủc chể): ( [ E j + m + K ; áp,ti - Ậ m + m + K g g - 4 [E ] [iị
2[E]
(7.33)
Dạng Kị gần đúng ỏ phương trình (7.33) làm biến đổi cùng vói dạng chất ức chế. Theo các dạng xác định của tham số này cho các dạng chất ức chế khác nhau như đã được trình bày ở phương trình (7.29) và (7.32) cho các giá trị ICsoCho các chất ức chê cạnh tranh liên kết chặt: (7.34) 315
Cho các chất ức chế không cạnh tranh: xi _
[^ ]
^ m
(7.35)
Khi a = V. (7.3 6) Khi mà máy tính chưa được sử dụng rộng rãi để tạo ra các đường đồ thị thích hợp, sử dụng trực tiếp phương trình Morrison đã gây bất tiện cho việc khai căn hằng B ố chất ức chế từ sô" liệu thí nghiệm. Khắc phục sự giới hạn này, Henderson (1972) đã đưa ra phép lây đạo hàm dạng phương trình tuyến tính của phương trình Morrison, đã cho phép việc xác dinh K, và [E] bằng đồ thị từ việc đo vận tốc phân ly bởi một hàm của nồng độ chất ức chế tại nồng độ cơ chất đã xác định. Dạng phương trinh Henderson tổng quát được trình bày như sau: (7.37) V0 Tại điểm K*apxi được thiết lập giông như đã trình bày ở phương trình (7.34) - (7.36) cho các dạng chất ức chế khác nhau. Xem xét ở các mức độ thấy rằng, phương trình (7.37) là phương trình tuyến tính. Do đó, nếu một điểm được tạo ra [I]/(l - v,/v0) là một hàm của v/v0 (hàm thuận nghịch của vận tốc phân ly), số”liệu có thể phù hợp để tạo ra một đường thẳng với độ dốc bằng Kxâ|í!ti và cắt y tại [E], như đã minh hoạ ở Hình 7.18. Điểm đáng lưu ý của phương pháp Henderson tạo ra các điểm thẳng hàng không liên quan đến kiểu chất ức chế. Tuy nhiên, độ dốc của đường thẳng cho các điểm sẽ thay đổi cùng vối nồng độ cơ chất khác nhau phụ thuộc vào kiểu chất ức chế. Hình 7.17 trìn h bày sự thay đổi giá trị IC50 cho các chất ức chế liên kết chặt bằng một hàm của nồng độ cơ chất. Do đó, đồ thị Henderson cũng có thể sử dụng để phân biệt giữa các cd chế liên kết vói chất ức chế khác nhau.
316
Hình 7.17. ĐỒ thị Henderson cho một chất ức chê' liên kết ch ặt
Đồ thị tuyến tính Henderson khá thuận tiện trong khi chưa có một chương trình máy tính thích hợp để vẽ đồ thị, việc xử lý số liệu đã tạo ra một số mức độ sai số hệ thống (xem Henderson, 1973, Bàn về cách xử lý số liệu theo phương pháp thống kê). Ngày nay, có thể dễ dàng vẽ đồ thị bằng máy tính trong phòng thí nghiệm, nó là giải pháp thiết yếu dùng để xử lý số liệu giống như đồ thị Henderson. Việc điều chỉnh tốc độ phân ly thích hợp ngược với số liệu nồng độ chất ức chế tạo ra phương trình Morrison (phướng trình 7.33), điều này cần thiết hơn và đã được giói thiệu rõ ràng. Hình 7.18 minh hoạ cho việc điều chỉnh phù hợp tốc độ phân ly ngược với sô" liệu nồng độ chất ức chế tạo ra phương trình (7.33). Số liệu có thể dùng để dự đoán giá trị Km cho cơ chất (như đã được trình bày ỏ Chương 5) và sự nhận biết nồng độ cơ chất trong việc phân tích. Sau đó, số liệu như đồ thị ở Hình 7.18 sẽ tạo ra phương trình Morrison, bằng cách cho phép cả Kxàpx! và [E] có thể xác định một cách đồng thòi bằng các tham sô' thích hợp. Theo kiểu xử lý này, ở một vài nồng độ cơ chất khác nhau sẽ cho phép xác định dạng chất ức chế, và do đó các giá trị Kxấpxi dược xử lý qua thực nghiệm có thể được chuyển đổi thành Kị thực. Trong trường hợp một chất ức chế liên kết chặt cạnh tranh, một trong nhũng phương pháp xác định chất ức chê Kị là đo vận tốc ban đầu dưới các điều kiện nồng độ cơ chất cực đại (Tomheim, 1994). Bằng cách xem xét phương trình (7.29), chúng ta thấy rằng nếu tỷ lệ [S]/Kmlớn, thì ICso sẽ cao hơn nhiều so với nồng độ enzym, -dù rằng, Kị có tầm quan trọng trong việc tạo ra [E]. Do đó, nếu nồng độ cd chất đủ cao có the thực 317
hiện được thí nghiệm, đặc tính tự nhiên liên kết chặt của chất ức chế có thể khắc phục được, và Kị có thể xác định được từ việc đo IC 50 bằng cách sử dụng sắp xếp lại dạng phương trình (7.29). Tornheim đưa ra các điều chỉnh [S] đến tỷ lệ mà cả [S]/Kmvà [I]/Ki đểu bằng nhau theo cách xử lý này. Tuy nhiên, không phải tất cả các phản ứng enzym đều tuân theo cách này, nguyên nhân sự giới hạn thí nghiệm về nồng độ cơ chất là do cơ chất hoà tan và khả năng phân tích để đo vận tốc ban đầu tuyến dưối các điều kiện cực đại. Tuy nhiên, trong các trường hđp thích hỢp thì cách này có thể sủ dụng được để tạo ra kết quả chuẩn.
[I], nM
Hình 7.18. Đổ thị vận tốc phân ly là một hàm của nồng độ chất ức chế cho một chất ức chế liên kếi chãt. Đường cong liên tục được vẽ thông qua các điểm số liệu đại diện thích hợp nhất với phương trình Morrison (phương trình 7.33).
7.2.4. s ử dụng các châ't ức ch ế liên kết chặt để xác định nồng độ enzym hoạt động
Trong nhiều chiến lược thí nghiệm, chúng ta thưòng muốn biết nồng độ enzym trong mẫu để phân tích các số' liệu kế tiếp. Cách này không chỉ được úng dụng tạo ra sô" liệu động học mà còn tạo ra các nghiên cứu hoá sinh và lý sinh khốc nhau về các enzym. Tài liệu đã đưa ra nhiều phương pháp xác định nồng độ protein tổng sô" trong mẫu, dựa trên nguyên tắc của quang phổ, sắc kế và những kỹ th u ậ t phân tích khác (xem Copeland, 1994, dối vổi một sô' mẫu). Tuy nhiên, tất cả những phương pháp này đều xác định nồng độ protein tổng số thích hdp hơn nồng độ enzym đích (theo khía cạnh nào đó). Hơn nữa, các phương pháp này cũng không cần thiết phải phân biệt giữa các phân tử enzym hoạt động và các phân tử enzym đã bị biến tính. Giá trị của chất ức chế liên kết chặt của enzym đích cung cấp một phương tiện tin cậy để xác định nồng độ của enzym hoạt động trong mẫu ngay cả trường hợp enzym bị biến tính hay protein không có tính enzym. 318
m. Hlnh 7.19. Sự xảc định nổng độ enzym hoạt động bằng sự chuẩn độ với một chất ức chế liên kết chăt. [E] = 1nM, Kị = 5nM([E]/K( = 200). Đường cong liên tục được vẽ thông qua số liệu phù hợp nhất theo phương trình Morrison (phương trình 7.33). Các đuờng thảng tiếp xúc được vẽ lần lượt theo số liệu thích hợp tạí nổng độ cơ chất ức chế thấp (0 - 0,6nM) và cao (1,4 - 2,0).tM) Nồng độ enzym hoạt độrtg được xác định từ giá trị trục X tại điểm cắt của haí đường thẳng.
Trở lại tham khảo phương trình (7.33), nếu chúng ta thiết lập một thí nghiệm mà ở đó cả hai [E] và [I] đều lớn hơn , chúng ta có thể bỏ qua chỉ số Kxấpltỉ ở phương trình này. Dưới nhũng điều kiện này, vận tốc phân ly của phản ứng enzym sẽ giảm xuống tuyến tính vài việc tăng nồng độ chất ức chế cho đến khi [I] = [E]. Tại điểm này, vận tôc phân ly sẽ là 0 và không thay đổi ỏ các nồng độ chất ức chế cao hơn. Trong trường hợp này, đồ thị vận tốc phân ly là một hàm số' nồng độ chất ức chế như trình bày ỏ Hình 7.19 phù hợp với phương trình Morrison. Sô" liệu ở Hình 7.19 đưa ra giả thuyết: chất ức chế Kị, 5nM; nồng độ enzym hoạt động của mẫu, l,0^iM ([E]/Kj = 200). s ố liệu tại nồng độ cơ chất thap hơn có thổ tạo ra một đường thẳng dốc kéo dài đến trục X (đường thẳng dốc ở Hình 7.19), và các điểm sô' liệu tại nồng độ chất ức chế cao hơn có thể tạo nên một đường thẩng ngang tại V;/V0 = 0 (đưòng thẳng dốc dài hơn ở Hình 7.19). Do vậy 2 đường thẳng vẽ sẽ cắt nhau ở một điểm trên trục X tại [I] = [E]. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng, cách xử lý này có thể chỉ thực hiện khi [E] nhiều hơn K; rấ t nhiều. Khi [E] ít hơn khoảng 200 lần K; thì số liệu sẽ không được mô tả như đường thẳng. Trong các trường hợp, sô" liệu có thể điều chỉnh phù hđp theo phương trình (7.33) để xác định [E], như đã được trình bày ỏ trên. Cách xử lý này thực sự thuận tiện cho việc xác định nồng độ enzym hoạt động của dung dịch enzym gôc (tại nồng độ enzym cao) sẽ được pha loãng trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng cho thí nghiệm. Ví dụ: có thê giữ một mẫu enzym ở nồng độ enzym lý thuyêt 100M trong một dung dịch có 319
chứa lmg/ml gelatin cho những mục đích khác nhau (xem ở Chương 6). Sự có m ặt của gelatin sẽ gây khó khăn cho việc xác định chính xác nồng độ enzym bằng một trong những phân tích protein theo sắc kế truyền thông; hơn nữa, nồng độ enzym hoạt động cũng không thể xác định được bằng cách phân tích như vậy. Cho một chất ức chế phân tử thấp của enzym đích, một cách có thể pha loãng một mẫu enzym gốc thành một vài nồng độ thích hợp cho phân tích enzym mà vẫn lốn hơn Ki rấ t nhiều (lịiM). Cách điều chỉnh vận tốc phân ly làm giảm nồng độ chất ức chế như đã miêu tả ở trên sẽ dẫn đến sự xác định nồng độ thực hoạt động của cnzym trong dung dịch hoạt động, và từ đây tính toán để đưa đến nồng độ thực của enzym hoạt động trong enzym gốc. Đây là một cách thông thường trong một số phòng thí nghiệm enzym học, và số’ lượng lớn mẫu dược ứng dụng có thể tìm thấy trong tài liệu. Cách đánh giá bằng phương pháp so sánh nồng độ enzym hoạt động có thể thực hiện bằng thí nghiệm thuận nghịch mà tại đó nồng độ chất ức chế đã được xác định ở một vài giá trị lớn hơn Kj (khoảng 200Kj hoặc cao hơn), và số lượng lón enzym được thêm vào hỗn hợp phản ứng là thay đổi. Kết quả của một thí nghiệm như vậy minh hoạ ở Hình 7.20. Vận tốc ban đầu là 0 được duy trì cho đến nồng độ enzym và chất ức chế cân bằng trong dung dịch. Khi nồng độ enzym chuẩn độ vượt quá điểm này, sự ức chế theo kiểu hoá học lượng pháp sẽ khắc phục đưdc, và sau đó quan sát sự tăng tuyến tính vận tốc khởi đầu. Ngoài ra, từ điểm cắt nhau của hai đường thẳng dốc được vẽ thông qua số liệu như ở Hình 7.20, nồng độ thực của enzym hoạt động này là sử dụng kiểu tăng, giảm enzym gốc để hoàn thành việc chuẩn độ. Do đó, khi enzym cung cấp bị giói hạn, một trong những khả năng này đã được nói đến.
[E], nM Hình 7.20. Sự xác định nồng độ enzym hoạt động bằng chuẩn độ nồng độ xác định của chất ức chế liên ket chặt với enzym: [I] = 20nM, K, - 1nM ([IJ/K, = 200). Phân tích số liệu giống trình bày ở Hình 7,19 và trong tài liệu. Vận tốc là các đơn vị tuỳ ý.
320
Trong phần này chúng ta đã miêu tả một trường hợp đặc biệt của sự ức chê enzym, ở đó hằng số phân ly của chất ức chê bằng với nồng độ enzym tổng sô trong mẫu. Những chất ức chế này đưa ra một thách thức đặc biệt cho các nhà enzym học, vì rằng chúng không thể phân tích được theo các phương pháp truyền thông như đã trình bày ở chương này, Chúng ta thấy rằng, các chất ức chế liên kết chặt tạo ra các điểm thuận nghịch, từ đó xuất hiện giả thuyết sự ức chế không cạnh tranh mà không cần quan tâm đến kiểu tác động thực giữa enzym và chất ớc chế, Do vậy, bất kỷ khi nào, sự ức chế không cạnh tranh được chuẩn đoán thông qua việc sử dụng các điểm thuận nghịch, sô' liệu nên được đánh giá lại để đảm bảo rằng, sự ức chế liên kết chặt không xảy ra. Các phương pháp xác định kiểu ức chế và Ki thực cho các chất ức chế liên kết chặt đã được trìn h bày trong phần này. Các chất ức chế liên kết chặt là một lóp phân tử quan trọng trong những ứng dụng enzym vào công nghiệp. Một sô' chất ức chế enzym cũng được sử dụng đồng thời để trị bệnh, ví dụ; hoạt động như các chất ức chế liên kết chặt. Các mẫu gần nhất bao gồm các chất ức chế khử dihydrofolat (là các thuốc chống ung thư), các chất ức chế aspartyl proteaza HIV (là các thuôc chống AIDS), và các chất ức chế metalloproteaza (là các chất bảo vệ tái sinh xương sụn). Một sô' chất ức chế enzym tìm thấy trong tự nhiên, chúng giữ vai trò quan trọng trong cân bằng trao đổi chất, các chất ức chế liên kết chặt là một lớp châ't ức chế enzym đích của chúng. Do đó, các chất ức chế liên kết chặt là những chất ức chế enzym quan trọng và phổ biến. Sự xử lý động học enzym đặc biệt khi có mặt các chất ức chế này là rất cần thiết. 7.3. S ự ỨC CHÊ' PHỤ THUỘC THỜI GIAN
Tất cả các chất ức chê' chúng ta biết đủ để thiết lập thế cân bằng liên kết của chúng với enzym ở một khoảng thời gian mà tốc độ cụng tỷ lệ quay vòng hoố của phản ứng xúc tác enzym. ở mục 7.2, chúng ta đã lưu ý rằng, một vài chất ức chế liên kết chặt thiết lập thế cân bằng này ở khoảng thời gian chậm hơn, nhưng trong thảo luận, chúng ta đã không xét đến sự phức tạp này bằng cốch xử lý enzym trước với chất ức chế trong một thời gian đài, đủ để đảm bảo rằng, nó đã đạt được th ế cân bằng trước khi quay vòng ở trạng thái ổn định bằng cách thêm cơ chất. Trong phần này, chúng ta sẽ thảo luận một cách rõ ràng về các chất ức chế liên kết chậm dẫn đến enzym phụ thuộc vào khoảng thời gian quay vòng hoá enzym và do vậy tạo ra một sự thay đổi ở vận tốc ban đầu cùng với thòi gian. Những chất ức chế này hoạt động giông như các chất liên kết chậm, hoặc các chất ức chế phụ thuộc thời gian của enzym.
Có thể phân biệt được 4 kiểu tiếp xúc khác nhau giữa một chất ức chế và một enzym mà tạo ra được các động lực học liên kêt chậm. Thế cân bằng bao gồm các quy trình như đã được miêu tả ỏ Hình 7.21. Hình 7.21 biểu diễn thế cân bằng kết hợp với sự quay vòng hoá không bị ức chế của enzym, như chúng ta đã thảo luận ở Chương 5: Ki hằng số tỷ lệ kết hộp với liên kết cơ chất tạo ra enzym từ dạng phức chất ES, đôi khi được xem như kkỄthựl) (cơ chất tấn công enzym). Hằng số k2 ở Hình 7.2la là hằng sô" tỷ lệ phân ly, hoặc là hằng sô" tỷ lệ tách phức chất ES quay trở lại dạng enzym tự do và cơ chất tự do, và kKÚCtáe là hằng sô" tỷ lệ xúc tác như đã được xác định rõ ỏ Chương 5. (a) E' / kl'S1 t ES — kj
—►E + P
(b) E ^ ± E I k4 (c) E r~=^~± EI K
(Phản ứng không bi ức chế) (Liên kết chậm thuận nghịch đơn giản)
E * I(Sựđồ
ks
(d) E < ~íĩ~ ^_ị. EXĨ — >E- 1 4 * X
(Đánh dấu ái lực và sự ức chế cơ chế cd bản)
Hình 7.21. Sơ đổ sự ức chế enzym phụ thuộc thdi gian
Sơ đổ (a) miêu tả sự quay vòng hoá enzym khi không có chất ức chế, lả một phản úTig cạnh tranh chúng cho tất ca cac sđ đồ khác; Set đồ (b) minh hoạ thế cân bằng cho quá trình ức chế thuận nghịch cơ bản dẫn đến sự ức chế phụ th u ộ c thời gian do các giá trị ks và k4 thấp là có liên quan đến quay vòng hoá enzym; Trong sơ đỗ (c), liên kết bail đẩu của một chất ức chế với enzym để tạo thành phức chất El, phức chất nàỵ trải qua một quá trình đồng phân hoả ertzym tạo ra dạng phức chất mới E*l; Sd đổ (d) bieu diễn các phản ứng cộng hợp làm bất hoạt enzym mất khả năng thuận nghịch do sự tạo thành đổng liên kết hoá trị giữa enzym vã một số nhóm tác động lên chất ức chế, bằng cách đưa E - I vao cùng hoá trị. Các chất ức chế tuân theo sơ đổ (d) có thể hoạt động giống enzym có cùng ái lực, hoặc chứng cỏ thể dựa vào cơ chế chất ức chế.
Tuy nhiên ở đây, hằng sô" tỷ lệ liên kết và hằng số tỷ lệ phân ly (lần lượt là ka và thiết lập th ế cân bằng một cách chậm chạp, bằng với tốc độ các chất ức chế liền kết, hằng số phân ly ở thế cân bằng K; được biểu diễn như sau: Ị C = h ± = I M 1] k3
322
[HI]
(7.38)
Morrison và Walsh (1988) đã chỉ ra rằng, nếu Kj thấp và [I] bị làm thay đổi trong vùng Kị, cả k3[I] và k4 sẽ có giá trị thấp. Do vậy, dưới những điều kiện này, sự ức chê sẽ tốn công chậm dù rằng k3 có vai trò làm cho phản ứng nhanh. Điều này giải thích tại sao hầu hết các chất ức chế liên kêt chặt đều có biểu hiện ức chế phụ thuộc thời gian. Nếu sự phụ thuộc thời gian quan sát được là do tỷ lệ liên kết chậm vốn có, thì chất ức chế được nói đên là một chất ức chế liên kết chậm, và hằng sô" phân ly của nó được đưa ra ở phương trình (7.38). Mặt khác, nếu chất ức chế cùng là một chất liên kết chặt, thì nó được nói đến như là một chất ức chế liên kết bám chặt, chậm, và làm giảm nồng độ enzym tự do và nồng độ chất ức chế tự do là nguyên do tạo ra dạng phức chất EI, phải được tính bằng phương trình:
JiBLEEihE!) 1
(7,39)
(EI)
[E] biểu diễn nồng độ enzym tổng sô" (trong tất cả các dạng) hiện có trong dung dịch. Trong Hình 7.2Xc, enzym bắt gặp chất ức chế và thiết lập một thế cân bằng được xác định bỏi việc tăng hoặc giảm hằng sô' tỷ lệ k3 và k4 chỉ có ỏ Hình 7.21b. Tuy nhiên, trong Hình 7.21c, bằng việc liên kết chất ức chế làm thay đổi cấu trúc enzym hoặc đồng phân hoá enzym, đã tạo ra một phức chất mối E*I là enzym. Trưóc khi và khi hằng sô" tỷ lệ nghịch tạo được thê cân bàng giữa hai dạng cấu trúc liên kết chất ức chế này của enzym tạo ra k5 và k6. Hằng số phân ly cho phức chất EI ban đầu vẫn được tạo ra bởi: ■
K- ; . . - M B k , + k 6 [EI] + [E*I]
(7.40)
Để quan sát sự ức chế tấn công chậm, K*j phải ít hơn Ki nhiều. Do đó, trong trường hợp này, sự đồng phân hoá enzym sẽ dẫn đến liên kết giữa enzym và chất ức chế chặt hơn nhiều. Như ở Hình 7.21b, nêu chất ửc chế tự đo thì cồn phải tính toán một cách chính xác cho cả hai biểu thức Ki và K* (xem Morrison và Walsh, 1988). Cần lưu ý khi quan sát các động học liên kết chậm, nó không thích hợp do sự chuyển đổi EI thành E*I riêng biệt một cách chậm chạp, mà phản ứng nghịch cũng chậm như vậy. Trên thực tế, có thể nhận biêt liên kết chậm, hằng số tỷ lệ nghịch (k6) phải nhỏ hơn nhiổu tỷ lệ trước khi dồng phân hoá (k5). Trong trường hợp cực đại (k6« k5) không quan sát được sô' lượng hoàn trả dạng câu trúc EI và bướcđồng phân hoá enzym 323
sẽ tạo ra sự ức chế không thuận nghịch. Dưới những điều kiện này, k6 có thể không cần xét đến, và sự đồng phân hoá có thể xác định được là một bước không thuận nghịch bị chi phối bởi hằng số’tỷ lệ k5. Cuối cùng, Hình 7.2ld chúng ta xem xét hai dạng tương tác giữa chất ức chế với enzym tại k6 thực bằng 0; do đó chúng ta sẽ nói đến sự bất hoạt enzym không thuận nghịch. Ớ đây chúng phải tạo ra khác biệt giữa sự ức chế thuận nghịch và không thuận nghịch. Trong tấ t cả các sơ đồ ức chế chúng ta đã xem xét kỹ, thậm chí trong trường hợp sự ức chế liên kết chặt, chậm, k6 khác 0. Hằng sô' tỷ lệ này có thể rấ t nhỏ, và các chất ức chế có thể hoạt động được cho tất cả các mục đích cần thực hiện, như là không thuận nghịch. Tuy nhiên, với phức chất EI pha đủ loãng và đủ thời gian, là một cách cuối cùng có thể tạo lại được nồng độ enzym tự do hoạt động. Trong trưòng hợp chất ức chế không thuận nghịch, phân tử enzym liên kết với chất ức chế đó sẽ bị bất hoạt vĩnh viễn. Không đủ khoảng thời gian và không đủ độ pha loãng sẽ dẫn đến sự tái kích hoạt enzym bắt gặp các chất ức chế theo kiểu này. Do đó các chất ức chế thường được biết đến như là các chất bâ't hoạt enzym. Ví dụ đầu tiên của sự ức chế không thuận nghịch là một quy trình được biết đến như đánh dấu ái lực enzym, hoặc sự biến đổi liên kết hoá trị enzym. Trong trường hợp này, các liên kết hợp chất ức chế với enzym và liên kết đồng hoá trị làm thay đổi phần dư cần thiết được xúc tác, hoặc các phần dư trên enzym. Sự biến đổi liên kết đồng hoá trị bao gồm một sô thay đổi về thành phần hoá học của phân tủ chất ức chế, nhưng quy trình được dựa vào cấu trúc và tính chất hoá học xuất hiện ở vị trí biến đổi khi không có bất kỳ một phản ứng xúc tác enzym nào. Đánh dấu ái lực không chỉ sử dụng là các chất ức chế hoạt động enzym, mà chúng còn trở thành các công cụ nghiên cứu có giá trị. Một sô" hợp chất này rấ t có khả năng lựa chọn cho các gốc axit amin đặc trứng và từ đó có thể được sủ dụng đe nhận diện các nhóm khoá, bao gồm chu trình enzym xúc tác. Kiểu bất hoạt không thuận nghịch thứ 2 chúng ta sẽ xem xét là sự ức chế dựa vào cơ chế, phân tử chất ức chế kết hợp vào vị trí hoạt động của enzym và dược enzym nhận ra theo như là một cd chất. Do vậy, chất ức chế bị thay đổi tính chất hoá học thông qua cơ chế xúc tác của enzym tạo ra dạng phức chất EI, là dạng có thể thực hiện chức năng xúc tác nhanh hơn. Một số chất ức chế này làm bất hoạt enzym bằng cách tạo ra dạng khép E —I có liên kết đồng hoá trị không thuận nghịch. Trong các trường hợp khác, phân tử chất ức chế tiếp tục được tách ra từ enzym (quá trình được biết như sự bất hoạt enzym không cùng hoá trị), nhưng enzym sẽ ồ dạng không thể xúc tác enzym tại vị trí hoạt động, các chất ức chế dựa vào cơ chế luôn hoạt động như các chất bất hoạt enzym cạnh 324
tranh. Các chất ức chê này được biết đến theo các tên gọi khác nhau trong tài liệu: các cơ chất tự huỷ, các chất bất hoạt enzym tự huỷ, các chất ức chế kX(ktic; các chất ức chế hoạt tính enzym không thuận nghịch, các chất bât hoạt Trojan horse, các chất bất hoạt cảm ứng enzym, đồng vị đánh dấu ái lực động lực học, các cơ chất bẫy,... (Silverman, 1988). Trong thảo luận tiếp theo chúng ta sẽ trình bày các phương pháp thực nghiệm để phát hiện sự phụ thuộc thòi gian của các chất ức chế liên kết chặt, và các phương pháp phân tích sô' liệu cho phép chúng ta phân biệt giữa các dạng tương tác điện thế khác nhau với enzym. Chúng ta cũng sẽ thảo luận sự xác định hằng số ức chế Kị và Kj* phù hợp cho các chất ức chế này. 7.3.1. Các đường cong tăng dần cho các chất ức ch ế liên kết chậm
Các đường cong táng dần cho một phản ứng enzym khi có mật chất ức chế liên kết chặt sẽ không diễn tả được mối liên hệ sản phẩm chống lại thời gian một cách tuyến tính đơn giản, mà chúng ta thấy được các chất ức chê' th u ận nghịch đơn giản. Hơn thế, sự hình thành sản phẩm qua thời gian sẽ là một hàm đường cong do sự ức chê tấn công các hợp chất này chậm.
Thòi gian (phút) Hlnh 7.22. Các dạng đường đổ thị tăng đần khi có các nồng độ thay đổi một chất ức chế enzym phụ thuộc thời gian cho một phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm enzym để tạo ra
hỗn hợp co chứa cơ chất và chất ứd chế. Các đường cong đã được đánh dấu chì ra các nồng độ liêri quan đến chất ức chế hiện có, lưu ý rằng, trong khoảng thời gian hơn 10 phút, enzym không bị ức chế tạo ra đưởng đồ thị tăng tuyến tính.
Hình 7.2 minh hoạ các đường cong tăng dần đặc trưng cho chất ữc chế liên kết chậm khi phản ứng enzym được bắt đầu bằng việc thêm enzym, thời gian enzym không bị ức chê tạo ra một đưòng đồ thị tăng tuyen tính cơ bản, sô liệu khi có mặt chất ức chê liên kết chậm sẽ tạo ra một môi quan hệ 325
tuyến tính vói thời gian ở phần đầu của đường cong, bằng cách chuyển đổi chậm hdn tạo ra môì liên hệ tuyến tính khác nhau (thấp hơn) giữa sản phẩm và thòi gian. Cần lưu ý rằng, nó là giới hạn để thiết lập cả một khoảng thời gian phần đường cong tuyến tính tăng dần phản ứng không bị ức chế, trong khi đó có thể quan sát được việc thay đổi độ nghiêng xảy ra khi có sự ức chế. Nếu sự ức chế tấn công chậm, khoảng thòi gian dài có thể cần quan sát những thay đổi như đã minh hoạ ỏ Hình 7.22. Tuy nhiên, với các khoảng thòi gian dài có nguy cơ đưa đến sự thiếu hụt cơ chất, điều này sẽ làm m ất khả năng phân tích số liệu tiếp theo. Do vậy, nó có thể là cần thiết đê đánh giá một số’to hợp enzym, cd chất, và các nồng độ chất ức chế để tìm ra giới hạn khác nhau thích hợp cho việc điều chỉnh các phép đo phụ thuộc thòi gian. Với những dự báo được nói đến này, các đường cong tãng dần tại các nồng độ chất ức chế khác nhau có thê được biểu thị bằng phương trình (7.41). [P] = v.t +
Vi~ Vs
[1 - exp(-kquan sảt(lư(?et)]
(7.41)
^ q g a n s á t dược
Với Vj và v8: vận tốc ở trạn g thái khởi đầu và trạn g thái cân bằng, vận tôc (cuối cùng) của phản ứng khi có m ặt chất ức chế, kquan 3át ciược là hằng sô' tỷ lệ bậc đầu tiên có thể thấy sự hoán chuyển giữa V, và va và t là thòi gian. Morrison và Walsh (1988) đã đưa ra biểu thức toán học rõ ràng cho V; và V, trong trường hợp châ't ức chế liên k ết chặt cạnh tra n h , bằng cách minh hoạ Vj và v8 là các hàm sô" (tương tự phương trình 7.11) của Vcực <|ỊÙ, [S], Kin, và Kj hoặc K*i (các chất ức chế hoạt động theo Hình 7.21c). Mục tiêu của chúng ta là xem xét phương trình (7.41) như một phương trìn h thực nghiệm có thể tạo ra từ các giá trị số” liệu thực nghiệm V j, vs, k qunn a&tJư(?c. Cần lưu ý rằng, V ị có th ể hoặc không th ể thay đổi cùng vâi nồng độ chất ức chế, phụ thuộc vào giá trị tương đôi của K; và K*i và tỷ lệ của [I] tạo thành Kị (Morrison và Walsh, 1988). Giá trị v8 sẽ bị hạn chế, giá trị khác 0, miễn là chất ức chế không phải là một chất bất hoạt enzym không thuận nghịch. Trong trường hdp tiếp theo, giá trị v„ cuối cùng sẽ bằng 0. Cách thứ hai để xác định các đường cong tăng dần cho sự ức chế liên kết chặt là ủ tniốc enzym cùng với chất ức chế trong một khoảng thời gian dài tuỳ theo tốc dộ liên kết chất ức chế, và sau đó khởi đầu phản ứng bằng việc pha loãng đung dịch chất ức chế —enzym với một dung dịch có chứa cơ chất của enzym. Trong giai đoạn ủ, thế cân bằng giữa enzym và chất ức chế được thiết lập, và việc cho thêm cơ chất sẽ làm thay đổi thế cân bằng này. Vì rằng làm giảm tốc độ chất ức chế, đường cong tăng dần sẽ hiển thị độ nghiêng ít ồ điểm khởi đầu, ở cuối đưòng cong quay trở lại 326
toe độ ở trạng thái ổn định, như minh hoạ ở Hình 7.23. Các dường cong tăng dần được xem xét ở đây cũng được trình bày bằng phương trình (7.41), ngoại trừ vận tốc khởi đầu hiện tại, thấp hơn so với vận tốc ỏ trạng thái ổn định. Nhưng trái lại, sô"liệu đã thu được bằng việc khởi đầu phản ứng vói enzym, vận tốc bắt đầu lổn hơn so với vận tốc ở trạng thái ổn định. Đe làm nổi bật sự khác nhau này, một số tác giả thay th ế giới hạn Vị trong phương trình (7.41) với vr trong trường hợp các phản ứng được bắt đầu với cơ chất. Morrison và Walsh (1988) lại đưa ra một dạng thức toán học rõ ràng cho vt, nó phụ thuộc vào v<.ựcdạị, [S], Kro, K„ K*i và tỷ lệ thể tích giữa dung dịch ủ chất ức chế - enzym và thể tích cuôì cùng của hỗn hợp phản ứng tổng số. Mặt khác, mục đích của chúng ta là có thể sử dụng được phương trình (7.41) như một phương trình thực nghiêm bằng cách cho phép V ị (hoặc vr), V B và vquan sát đư?e trở thành các tham số cố thể điểu chỉnh được, các giá trị của chúng được xác định bằng cách phân tích làm cho đường cong không tuyến tính. Các chất ức chế bám rấ t chặt, cũng như ức chế phụ thuộc thòi gian, hầu hết luôn luôn thích hợp với Hình 7.21c (Morrison và Walsh, 1988). Trong trưòng hợp các đường cong tăng dần cũng sẽ bị ảnh hưởng bởi sự giảm m ật độ enzym tự do và chât ức chê tự do. Để tính toán m ật độ bị giảm này, phương trình (7.41) phải biến đổi như sau: [P] = V 8t
(7.42)
+ ^ q '.i a n s á t r t ư ợ c ^
1 -Ỵ
Hỉnh 7.23. Ví dụ minh hoạ các đường cong tâng dần khi các nồng độ củạ chất ức chế enzym phụ thuộc thời gian thay đổi cho một phân ứng được bắt đầu bằng cách pha loãng hỗn hợp chất ức chế - enzym vào trong đệm phân ứng có chứa cơ chất. Các đường cong được ghi số cho biết nồng độ chất ức chế tương ứng.
327
Tính theo công thức: y
K;blè'uh'ện+[Et]-f[IJ~ Q K ,biểuhlện+[E J + [IJ + Q
V , vĩ
(7.43)
Tại Q ^ Ị ^ tó u h iệ n + [ I t ] - [ E ; ] ) 2 +4ỢỢ*
+ [E j]1/2
+[lt]-[E k]) (7.44)
Thông qua phương trình (7.42) —(7.44), [EJ và [It] xem xét các nồng độ tổng số theo th ứ tự (tất cả các dạng) của enzym và chất ức chế. Hơn nữa, phân tích số liệu cho các chất ức chế liên kết chặt, chậm có thể được tìm thấy trong bài thảo luận của Morrison và Walsh (1988),
0
20
40 60 80 Thời gian ủ
100 200
0
20
40
60 80 Thài gian ủ
100 200
Hỉnh 7.24. Sự phụ thuộc thài gian ủ của vận tốc phân ly một phản ứng xúc tác enzym khi thay đổi các riổng độ của một chất ức chế liển kết chậm: số liệu dựa theo (ỷ lệ tuyến ứnh (a) và theo tỷ lệ semilog (b).
Nếu sự liên kết chất ức chế (hoặc giải phóng) rấ t chậm so vối tốc độ quay vòng hoá enzym không bị ức chế, một phương pháp thực nghiêm thích hợp khác có thể được sử dụng để xác định kqUfln sát đuợc. Thực chất, enzym được ủ với chat ức chế theo các khoảng thòi gian dài khác nhau trưốc khi vận tốc của phản ứng được đo ở trạng thái ổn định. Ví dụ: nếu vận tốc phản ứng ở trạng thái ổn định có thể đo được vượt quá khoảng thòi gian 30 giây, nhưng liên kết chất ức chế thậm chí xuất hiện trong khoảng hơn 10 phút, thì enzym có thể được ủ với chất ức chế, từ 0 - 120 phút vói các khoảng thòi gian cách nhau là 5 phút, và vận tốc phản ứng được đo sau mỗi thòi gian ủ khác nhau. Hình 7.24 minh hoạ kết quả thu được theo cách xử lý sô' liệu này. Cho một nồng độ chất ức chế đã xác định, vận tôc phân ly đo được sau khoảng thời gian ủ sẽ giảm theo phương trình (7.45): 328
(7.45) Do vậy, tại nồng độ chất ức chế đã được xác định, vận tô"c phân ly sẽ bị giảm theo cấp sô' mũ cùng với thời gian ủ, như ở Hình 7.2la. Để cho thuận tiện, chúng ta có thể điều chỉnh lại phương trình (7.45) bằng cách đưa đến một hàm loga theo cách khác để đạt được hàm sô' tuyến tính: 2,3041og10( — ) = - k
Rát dượct
(7.46)
Vn
Từ đó, giá trị kquan sát (1ược tại nồng độ chất ức chế đă được xác định có thể đo được một cách trực tiếp từ độ nghiêng của đồ thị semolog vận tốc phân ly là một hàm số thời gian ủ, như ỏ Hình 7.24b. 7.3.2. Phân biệt giữa các sơ đổ liên kết chậm
Để phân biệt các sơ đồ đã được minh hoạ ở Hình 7.21, một cách hiệu quả là phải xác định ảnh hưởng của nồng độ chất ức chế lên hằng số tốc độ đầu tiên biểu hiện kqUans á t ( I ư ạ c . Chúng ta sẽ xem xét các mối liên quan giũa kquan 8àl duợc và [I] cho hàng loạt sơ đồ này cùng với việc trình bày chúng không rõ ràng. Một cách xử lý đầy đủ bắt nguồn từ các phương trình này có thể được tìm thấy ở Morrison và Walsh (1988) và sự chú thích trong đó. 7.3.2.1.ĐỒ th ỉ (b)
Vối một chất ức chế theo sơ đồ b Hình 7,21, mối liên quan giữa kqunO8átưu0c và [I] được thể hiện ở phương trình (7,47): u /1 .
Bftt chide - K j \ ± ' T
K
♦ 7TT“
(7.47)
Tại Kbi“u hiện thì Kị xác định, giá trị này liên quan tới K, thực bằng các hàm số khác nhau phụ thuộc vào dạng tác động chất ức chế với enzym (cạnh tranh, không cạnh tranh, xem ở mục 7.3.3). Từ phương trình (7.47) chúng ta thấy rằng, đồ thị \ aan SÁldư^ là một hàm của [I] nên tạo ra một đường thẳng vổi độ nghiêng bằng k ,/K ^ u hiẻn và cắt y tại k4 (Hình 7.25). Do vậy, từ phân tích số liệu hồi quy tuyến tính, là một cách có thể cùng đồng thời xác định các giá trị k4 và K,b,ếu h,ận nếu cách thức ức chế được biết, Kbiốuhiện có thể chuyển đổi được Kị (mục 7.3.3) và từ giá trị k3 này có thể xác định được bằng phương trình (7.38). Do đó, từ những phân tích tuyến tính lùi của những số liệu này, ta 329
có thể đồng thời xác định được giá trị k 4 và KỊ,iểu hiệ" . Nếu đã biết kiểu ức chế, Kl,iếuhlỂn có thể biến đổi thành Kị (mục 7.3.3) và từ đây, giá trị k3 có thể được xốc định là nghiệm của phương trình (7.38). 7.3.2.2. Đ ổ th ị (c)
Với những chất ức chế tương ứng với đồ thị c Hình 7.21, kquanaát đựạc liên hệ với [I] theo phương trình: V , ■ *\jijan a á t được = - k r
+
k5[I]
___, . .— “ T--------------
K
(7.48)
+ [I]
Có thể viết lại thành: 1 + p ^ * b i[I] ố u h iệ n
(7.49)
k q u a n s á t 'iuợc. = lC g
[I]
1 + Ị^ b iỂ u
hìộn
[I]
Hlnh 7.25. Đổ thị kquanM td ư ọ c là m ột hàm của nóng độ ch ấ t ửc c h ế liên kết chậm tường ứng vãi s đ đồ b Hỉnh 7.21
se Dạng của phương trình cho thấy kq U11U1 (7.48) và va. y(7.49) i . H Ì V ) CI1U L im y rrằng, ang, K qulln sát được oc thay đổi như một hàm hypecbol của [I], như trên Hình 7.26. y của đường cong trong hình cho ta một ưóc tính hằng số k 6, trong khi giá trị lớn nhất của k()uan „át jưỢc mong đợi tại nồng độ chất ức chế vô hạn tuân theo phương trình (7.49), là k6 + k5. Vì thế, bằng cách làm phù hợp đường cong của số liệu vói phương trình (7.49), ta có thể đồng thời tính được giá trị kG) K ^ 1' Kiện và K*bièu hi’". Chú ý rằng, nếu Kị lón hơn nhiều so với 330
Kj* thì các nông độ của chât ức chê yêu cầu cho sự ức chế liên kết chậm lại có thê nhỏ hơn nhiều 80 với K,. Trong những trường hợp này, nồng độ ở trạng thái cân bằng của [E] có thể là không đáng kể, và phương trình (7.49) có thể rú t gọn lại thành: k
^ —)
4--------J £ * b iễ u hiện
(7.50)
Do đó, với trưòng hợp này, một đồ thị của kqunnsát đưcic là phương trình của [I] có thể là một đường thẳng như chúng ta đã thấy với các chất ức chế liên kết như ỏ sơ đồ b Hình 7.21. Thực tế, khi muôn quan hệ tuyến tính được phát hiện trên đồ thị của kqimn s6t được và [I], chúng ta sẽ khó phân biệt hai trạng thái này.
[I] Hình 7.26. Đổ thị kquan.u dlA?c tà một hàm của nổng độ chất ức chê'liên kết chậm tương ứng với sơ đồ c Hinh 7.21
7.3.2 3. Đ ố th ị (d)
Nếu hằng sô' động lực ktì là rất nhỏ trong sơ đồ c, hoặc là 0 như trong sơ dồ d (Hình 7.21), chất ức chế hoạt động như là chất bất hoạt không thuận nghịch của enzym. Trong trường hợp đó, phương trình (7.64) sẽ rú t gọn thành: k ..
;
ks[Ị] K
b 1 Ể u h iê n
(7.51) +
ị jị
Xem lại, một đồ thị của kauan 8ấl do* là một hàm của [I] sẽ cho ta đưòng cong hypecbol (Hình 7.27a) nhưng bây giờ, đoạn chăn y sẽ là 0. Vối các chất ức chế không thuận nghịch, trở lại E tự đo và I tự do từ phức hệ EI sẽ bị làm xáo trộn bởi sự bất thuận nghịch của các sự kiện bât hoạt sau đó. 331
Vì lý do này, Tipton (1973) và Kitz, Wilson (1962) đã chú ý rằng, với các chất bất hoạt không thuận nghịch, Kị không biểu diễn cho hằng số phân ly đơn cho phức hệ EI. Thay vào đó, Kj”ểuh,ện ở phương trình (7.48) là nồng độ rõ ràng của chất ức chê cần có để đạt đến tôc độ nửa tôi đa của sự bất hoạt enzym. Kitz và Wilson (1962) cũng thay th ế k5 ở phương trình (7.51) thành Kkh6„Khoạt dộnĩ tốc độ tối đa của sự bất hoạt enzym. Với nhũng định nghĩa này, các hệ số Kkhang hoạt dộng và K ^ uhiện lại là Vcực đại và Km như trong phương trình Henri-M ichaelis—Menten (Chương 5). Khi tỷ lệ kxúc tkjKị là thước đo tốt nhất của sự xúc tác của một phản ứng xúc tác trong enzym, thì thước đo tốt nhất của ức chế điện th ế - ức chế cho một chất ức chế không thuận nghịch là hằng sô' tốc độ thứ cấp có được từ tỷ lệ Kkllfinghoạt độn 1,5
Hình 7.27. (a) Đổ thị kquan gýt dưỢc là một hàm của nồng độ chất ức chế liên kết chậm tương ứng với sơ đồ d của Hỉnh 7.21; (b) số liệu trong (a) biểu diên cho đổ thị hai bước. Đường đi qua điểm 0 biểu diên cơ chế hai bước: bước liên kết đầu tiên và tiếp đến là bước ức chế chặm.
Cũng giông như các đồ thị Lineweaver - Burk ở Chương 5, đồ thị của 1/kcụmn sảLduợc là hàm của 1/[I] cho ta một đưòng thẳng. Hầu hết các chất ức chế không thuận nghịch (biểu diễn K|>ièuhiện) trước khi diễn ra sự bất hoạt chậm (biểu diễn ks). Do đó, như biểu thị trên sơ đồ d của Hình 7.21, sự bất hoạt của enzym yêu cầu hai bước nối tiếp, là liên kết và bất hoạt. Các chất ức chế thuận nghịch theo kiểu này cho ta thây một mối liên hệ đường thẳng giữa l/kqU(mBảt dược và l/[ĩj và cắt trục y tại điểm có giá trị lớn hơn 0 (Hình 7.27b). Tuy nhiên, nếu sự hình thành phức hệ EI thuận nghịch là không đáng kể so với tốc độ bất hoạt thì đồ thị sẽ cắt tại điểm gôc, như là một quá trình bất hoạt một bước (Kitz & Wilson 1962): k, E+I * E - I ‘XÚC tá o
332
Mặc dù không phổ biến như đồ thị bất hoạt hai bước như trên sơ đồ Hình 7.21d, kiêu ức chê này cũng thỉnh thoảng tìm thấy ở các enzym phân tử nhỏ có đánh dấu ái lực. Ví dụ: Kitz & Wilson (1962) chỉ ra rằng, hợp chất metylsolfomil florit làm bất hoạt axetylcholinesteraza bởi sự hình thành không thuận nghịch một enzym - sulfonyl trong một bước bất hoạt đơn. 7.3.3. Phân biệt mô hình tương tác giữa chất ức ch ế và enzym
Morrison cho rằng, hầu hết các chất ức chế liên kết chậm đểu hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh, liên kết tại vị trí hoạt động của enzym, (Morrison, 1982; Morrison và Walsh, 1988). Các chất ức chế liên kết chậm, tương tác với enzym theo kiểu cạnh tranh, không cạnh tranh, chưa cạnh tranh. Trong những phương trình sau đây, mô! quan hệ giữa K,biểuhiện và Kị, giữa K*biểuhlện và
k ỵ *1"*1 là
giống
nhau như đã đề cập ở mục 7.1 và 7.2 đốì với các mô hình ức chế khác nhau. Để phân biệt mô hình ức chế này đang diễn ra, và để chắc chắn được ứng dụng của các mối liên hệ KịVà Kj* trong các phương trình, chúng ta phải xác định dược ảnh hưởng của nhiều nồng độ cơ chất khác nhau liên hệ giá trị của k [|Unn9àt(jưflc tại một nồng độ chất ức chế đã định trước. Tian và Tson (1982) đã đưa ra các đạo hàm về mốỉ liên hệ giữa kr|UB„ 9nt dưỢc và nồng độ cd chất cho các chất ức chế không thuận nghịch cạnh tranh, không cạnh tranh và chưa cạnh tranh.Các dạng tổng quát hơn cho các môi liên hệ này được đưa ra trong phương trinh (7.52) - (7.54): vỏi chât ức chế cạnh tranh: k
_
k_ 1 + [S]/K m
£2)
Với chất ức chế không cạnh tranh: slít dược
^
( 7 .5 3 )
Vổi chất ức chê chưa cạnh tranh: b . ,
= _______Ạ -
flat dược
1
K
/ [S ]
(7.54)
Từ các dạng của các phương trình (7.52) - (7.54), chúng ta có thể thấy rằng, một chầt ức chế cạnh tranh li ôn kêt chậm sẽ cho một k,limn floL khi nồng độ cơ chất tăng lên. Mặt khác, vỏi một chất ức chê không cạnh tranh, k,|Uon sẽ không thay đổi theo nồng độ cơ chất (khi a - 1); trong khi đó với chất chưa cạnh tranh, giá trị kquan sát t o sẽ tăng khi nồng độ cơ chất 333
tăng. Các môi liên hệ giưa kquail SỂ,tdược và nồng độ cơ chất được biểu diễn như trong Hình 7.29.
Hinh 7.28. (a) Đồ thị kqus, sàtdupc là một hàm của nồng độ chất ứt chế của axetylcholinesteraza bởi metylsulfonyl florua; (b) Dữ liệu ỏ (a) là đ6 thị hai bước (Theo Kitz & Wilson, 1962). 0,06 0,05' I 0,04 '1 0,03, (9
* 0 , 02 :
0,01
a 0
50
100 150 Nồng độ cơ chất
200
250
Hình 7.29. Sự phụ thuộc của
5^1duọc vào nồng độ cơ chất của chất ức chế thuận nghịch phụ thuộc thởi gian tương ủng với cạnh tranh (hình tròn), không cạnh tranh (hình tam giác), chưa cạnh tranh (hình vuông) biểu diên cho các phản ứng với enzym.
7.3.4. Xác định sự thuận nghịch
Khi một sự tạo thành chất ức chế như ở sđ đồ c Hình 7.21 có giá trị kfi rât thấp thì nó rấ t khó để phân biệt mô hình ức chế này với sự bất hoạt không thuận nghịch như sơ đồ đ. Để phân biệt hai trưòng hợp này, La phải xác định, liệu hoạt tính enzym có thể được hồi phục khi loại bỏ chất ức chế bao quanh khỏi dung dịch enzym. Điều này thường đi cùng vúi sự thẩm tách hay lọc, hoặc sác ký ngoại eõ. Ví dụ: giả sử rằng, một chất, ức chế liên kêt chậm làm giảm trạng thái cân bằng của một phản ứng enzym vổ 50% tại nồng độ lOOnM. Nếu chúng ta so sánh lm l mẫu enzym với chất ức chế là lOOnM và cho mẫu này vào 1 lít đệm, nồng độ 334
cuối cùng của enzym trong ống thẩm tách sẽ không thay đổi, nhưng nông độ cơ chất ức chê tự do sẽ giảm 1.000 lần. Nêu chất ức chế liên kết thuận nghịch với enzym, chúng ta có thể quan sát sự phục hồi hoạt tính enzym như trước thẩm tách. Với một giá trị k6 rất nhỏ, chúng ta cần nhiều giò hoặc nhiều ngày để đạt đến trạng thái cân bằng giữa chất ức chế tự do và chất ức chế bao quanh. Tuy nhiên, nếu k6 lớn hơn 0, hiện tượng ức chế ngược lại sẽ xảy ra. Tất nhiên, chúng ta phải chắc chắn rằng, bản thân enzym là ổn định trong suốt quá trình này. Ngoài ra, ta cũng sẽ không phân biệt được sự ức chế tại chỗ (tạo ra bởi chất ức chê) và sự bất hoạt enzym (do sự biến tính protein). Để phân biệt sự bất hoạt của hoá trị với sự ức chế không hoá trị, chúng ta phải xem xét sự giải phóng của phân tử ức chế gốc lên sự biến tính của mẫu enzym. Giả sử rằng, môt chất ức chế liên kết chậm thực sự hoạt động như một chất đốnh dấu ái lực hoá trị của enzym đích, nếu chúng ta cho biến tính enzym sau khi bị ức chế và tách những protein bị biến tính ra khỏi dung dịch, phân tử chất ức chế có thể vẫn đi theo protein biến tính, như là một kết quả liên kết hoá trị giữa chất ức chế và enzym. Một ví dụ của thí nghiệm này được tiến hành tại phòng thí nghiệm lên một chất ức chế của dạng đồng phân của enzym prostaglanxin G/H syntaza (PGHS2). Một hợp chất đã phát triển được, DuPe97, là một chất ức chế enzym có khả năng cạnh tranh, liên kết rất chậm và không thuận nghịch (Copeland và cộng sự, 1994). Một dồ thị của kquan aảt là hàm của nồng độ DuP697, là một đường hypecbol đi qua điểm gốc của đồ thị. Thẩm tách enzym bị ức chế ra khỏi đệm sẽ không làm phục hồi hoạt tính của enzym, qua đó ta có thể thấy rằng, chất ức chế liên kết hoá trị với enzym hoặc là giá trị rấ t nhỏ. Để xác định xem DuP637 tương tác theo con đường nào đối với etv/ym, người ta dã xử lý một dung dịch enzym ở nồng độ micro với một nồng độ của chất ức chế và để chúng đạt tới trạng thái cân bằng sau một thòi gian dài, có liên quan đến tổc độ của sự bất hoạt enzym. Sau đó, enzym bị biến tính và cho vào them 4 lần thể tích hỗn hợp metanol: axetonitol (1:1). Dung dịch protein biến tính sau đó được ly tâm bằng màng lọc 30 kDa, và dịch nổi dược làm khô bởi nitơ và được hoà tan bởi dimetyl sulforua hoặc axetonenitril. Lượng DuPe97 giải phóng ra từ enzym qua thí nghiệm này được xác định bởi HPLC pha đảo và bằng cách xem xét khả năng tái hoà tan chất sau khi lọc lên sự ức chế của mẫu enzym môi (Copeland và cộng 335
sự, 1994, 1995). Dựa vào 97% DuP 697 đưa vào mẫu enzym ban đầu và được thu lại theo cách này, chúng ta đưa ra kết luận rằng, DuP€97 không phải là một dạng cộng hoá trị của enzym nhưng cũng đưa đến sơ đồ c ỏ Hình 7.21 khi k6 rấ t nhỏ.
CÂU HỎI ÔN TẬ P
1. Thế nào là chất ức chê thuận nghịch? 2. Các ức chế liên kết hẹp. 3. Thế nào là ức chế phụ thuộc thòi gian?
336
Chương 8
CÁC COENZYM 8.1, GIỚI THIỆU V Ề COENZYM
Như chúng ta đã biết cấu trúc các chuỗi bên của 20 axit amin có thể quyết định một loạt chuỗi hoạt tính hoá học lên các enzym (enzym một thành phần). Tuy nhiên thông thường, các phản ứng được xúc tác bởi enzym có một nhóm hoá học thêm vào (nhóm ngoại — prosthetic) để phản ứng diễn ra nhanh hơn (enzym hai thành phần), nhóm không phải protein này liên kết chặt hay lỏng lẻo vói phần protein. Nhũng nhóm hoạt động không phải protein này được gọi là cofactd hay coenzym. Hình 8 . 1 giối thiệu cấu trúc của một sô" cofactd enzym phô biến. o
R
R Nicolinamit
Flavin o,
o
Ubiquinon(n)
Pyridoxal phosphat
;h5- cooh Hem Hình 8.1. Các vi dụ một số cotactơ phổ biến tìm thấy trong các enzym
337
Thuật ngữ nhóm ngoại được sử dụng cho những phân tử liên kết chặt chẽ với enzym. Sự phân biệt giữa một cơ chất với một coenzym trong một phản ứng' có enzym xúc tác thưồng biểu hiện không rõ ràng, vì cả enzym cũng như cơ chất đều thay đổi về m ặt cấu trúc trong phản ứng. Tuy nhiên, sau những phản ứng, cấu trúc ban đầu của coenzym thường được tái tạo lại và cơ chất thường trải qua quá trình biến đổi hoá học xa hơn. Những trường hợp như vậy, coenzym thường biểu hiện ở dạng biến đổi cấu trúc, sự phân biệt giữa coenzym và cơ chất có thể dựa trên cơ sồ của quá trình tái tạo này. Trong những phản ứng phụ thuộc coenzym, sự liên kết của coenzym và enzym thường tạo mối tương quan enzym —cơ chất theo một nguyên tắc n h ất định. Trong hầu hết các trường hợp, cofactd và enzym liên kết qua tưdng tác không hoá trị như đã được mô tả ở Chương 2 (ví dụ như liên kết hydro, tương tác kỵ nước). Tuy nhiên, trong một số trường hợp, các cofactơ liên kết hoá trị với mạch polypeptit của enzym. Ví dụ: nhóm hem của protein vận chuyển điện tử của xytocrom c liên kết vói protein bằng cốc liên kết tioeste với hai vị trí xystein đã bị biến đổi; coíactơ pyridoxal phosphat của enzym aspartat aminotransferaza liên kết cộng hoá trị vối protein bằng cách hình thành một bazơ Schiff với vị trí lysin lên vị trí hoạt động. ở những enzym yêu cầu có một cofactd mới có hoạt tính, phần protein được gọi là apoenzym, phức hợp hoạt động của protein và cofactd được gọi là holoenzym. Trong một số trường hợp, các cofactd có thể được loại bỏ đê hình thành apoenzym và có thể được tái kết hợp lại để tạo nên holoenzym hoạt động. Các cofactơ tham gia vào toàn bộ các phản ứng của các enzym. Một trong nhiều chức năng chung của các cofactơ enzym là cung cấp vị trí cho phản ứng oxy hoá / khử tại vị trí hoạt động. Một ví dụ thể hiện cho đặc tính này là cofactd flavin. Trong chương này, những coenzym quan trọng sẽ được giới thiệu chi tiết để thấy rõ sự cần thiết của coenzym đối với cđ chế phản ứng cơ bản. Phần lớn coenzym tạo nên vai trò của chất mang trung gian cho những phản ứng chuyển nhóm. 8.2. C Á C NUCLEOTIT TRIPHOSPHAT 8.2.1. A denosin triphosphat (ATP)
Những quá trình oxy hoá sinh học là nguồn năng lượng chủ yếu cần thiết cho vô số nhũng quá trình sinh học tiêu thụ năng lượng. Nâng lượng tự do từ quá trình vận chuyển một cặp điện tử từ một cơ chất đến 338
oxy phân tử hay một chất nhận điện tủ được chuyển hoố hoàn toàn thành năng lượng hoá học ở dạng hỢp chất trung gian giàu năng lượng là adenosin triphosphat (Hình 8 .2 ). Năng lượng tự do bắt nguồn từ quá trình thuỷ phân cuổì cùng của những liên kết pyrophosphat của ATP giúp cho các phản ứng enzym hoàn thành một cách nhanh chóng. Chức năng cơ bản của quá trình thuỷ phân ATP là lực điều khiển cho những quá trình hoá sinh đã được Lipmann làm sáng tỏ lần đầu tiên. Những quá trình hoá sinh phụ thuộc vào sự thuỷ phân ATP như quá trình co cơ, quang tổng hợp, phát quang sinh học, sự phóng điện của những cd quan tích điện, và quá trình sinh tổng hợp protein, axit nucleic, phức hợp cacbonhydric và lipit cũng như nhiều quá trình khác nữa.
Hình 8.2. A denosintriphosphat (ATP)
Số lượng enzym cần ATP như một cơ chất hay một nguồn nàng lượng rấ t lớn và nhiều phản ứng đã được mô tả chi tiết có liên quan đến quá trình trao đổi chất trung gian. Những phản ứng phụ thuộc ATP có thể phân th àn h 2 lớp lổn: Lớp thứ nhất liên quan đến quá trình vận chuyển một vài nhóm của phân tủ ATP tới một phân tử chất nhận thích hợp và lớp thủ hai là ATP cung cấp năng lượng cho những phản ứng không thuận lợi khác. Những phản ứng trong phân loại trước đây có thể được phân lâp nhiều hơn như theo tính chất của nhóm nhận được từ phân tử ATP: phosphoryl, pyrophosphoryl, adenyl, và những phần của adenosinyl. Vị trí phân cắt của phân tử ATP có liên quan đến mỗi nhóm vận chuyển này, Trong các phản ứng chuyển nhóm, ATP đóng vai trò n h ư nguồn năng lượng được xúc tác bởi ligaza (hay syntetaza). 8.2.2. Uridin nucleotìt
Một trong những bước tiến quan trọng nhất gần đây trong sự hiểu biết về những quá trình trao đổi chất là việc xác định được vai trò của 339
những coenzym ưridin nucleotit trong quá trình trao đổi hydrat cacbon. Khám phá này xuất phát từ sự phân lập được ba chất: uridin diphosphat, đường amin và axit từ vi khuẩn xử lý penixilin của Lelior. SỐ lượng đường uridin diphosphat bổ sung được phân lập từ những nguồn khác nhau và khá phổ biến trong tự nhiên. Câu trúc của những hợp chất này cơ bản giông nhau, chỉ khác nhau về bản chất của thành phần đường và bao gồm một liên kết giũa phần phosphat cuôì cùng của uridin điphosphat và cacbonaldehyt của đường.
— o
\
C— o \
H
OH
O'
Hình 8.3. Uridin diphosphat glucoza (UDPG)
Trong quố trình sinh tổng hợp, U D P- đường được tạo thành trong những phản ứng có enzym xúc tác giữa UTP và đưòng - 1 phosphat. Đường—1—phosphat + U T P ^ ^ UDP —đưòng + pyrophosphat. Các enzym xúc tác cho những phản ứng này được gọi là UDPđường pyrophosphorylaza hay uridyltranferaza. Một số sai khác của những enzym như vậy cho thầy rằng, sự xúc tác cho quá trình tổng hợp của một số phức hợp U D P- đường. + fructoza — ► sucroza + UDP
UDPG 'COOH
^ — o — glucoza + UDP
0 (glucoza)n+i + UDP
Tương tự, ƯDP—axetyl glucosamin và axit UDP—glucuronic là những hợp chất trung gian. Trong quá trình tổng hợp của phức hợp p o ly s a c c a r it, axit hyaluronic. 340
Kiêu phản ứng thứ 2 liên quan đến XJDP—đưòng được xác định thông qua quá trình trao đổi hoá học của chính phân tử đường đó. Ví dụ: UDPG—4 epimeraza (UDP glucoza- 4 epimeraza) xúc tác cho những chuyển hoá bên trong của UDP glucoza và UDP- galactoza. Những ví dụ khác bao gồm quá trình oxy hoá phụ thuộc NADf của UDP —glucoza tạo thành axit ƯDP-glucoronic và quá trình decacboxyl hoá của axit U D P- glucuronic, tạo thành ƯDP-xyloza. CH2OH
c h 2o h o
NAD
ỌH 1/
HÒ
Ô —-U D P
(8.1)
NADH
OH UDP-glucoza
UDP-galactoza COOH NAD NADH
OH HO
o — UDP
(8.2)
OH UD P—glucuronic
UDP-glucoza COOH kO H
HO
\J
n o-
UDP
OH
UDP-glucuronic 8.2.3. Xytidin nucleotit
Adenin nucleotit và uridin nucleotit đóng vai trò như là tác nhân vận chuyển nhóm trong những phản ứng vổi cơ chất ở mức độ axyỉ và aldehyt của quá trình oxy hoá. Ở mức độ alcohol của quá trình oxy hoá, những phản ứng chuyển nhóm của những dẫn xuất xytidin nưcleotit được Kennedy và Weiss xác định đầu tiên, các ông phát hiện ra rằng CDP-cholin và 341
CDP-etanolamin (Hình 8.4) là những hợp chất trung gian cần thiết trong. quá trình sinh tổng hợp lơxitin, một lớp quan trọng của lipit. CDP—alcohol được tạo thành trong quá trình sinh tổng hợp từ CTP và alcohol- 1 —phosphat. CTP + alcohol-l-phosphat V — - CDP -alcohol + pyrophosphat (8.4) Những coenzym này vận chuyển một nhóm phosphat alkyl đến những chất nhận khác. Ví dụ: CDP-cholin phản ứng với các a, b —diglyxerit để tạo thành lơxitin và CMP. Chú ý rằng, những phản ứng vận chuyển Hên quan đến adenosin và uridin xảy ra sự phân cắt liên kết axyl phosphat và glucosyl phosphat một cách tương ứng và liên quan đến xytidin xảy ra sự phân cắt liên kết pyrophosphat. NH2
ĩ
0 - — P—o— P—o —P—o —CH?
ù
O
Ổ
ù
Õ
ũ
OH ÒH Hlnh 8.4. Xytidin triphosphat (CTP) N H 2
O H
Hỉnh B.5. CDP - cholin và CDP - etanolam in
342
OH
o
o
C H 20 — c — R
CH2D— c — R
o
0
C D P-cholin + HC— o — c — R
HC—o — C -R + CMP
(8.5)
0
1
c h 2o h
c — 0 _ p — OCH2CH 2- N +(CH 3)3 O"
1 ,2-Diaxylglyxerol
Phosphatidyl cholin
8.2.4. G uanosin và Inosin nucleotit
Các vai trò coenzym quan trọng của guanosin và inosin theo thứ tự như sau: (1) GTP phản ứng với m anoza- 1 -phosphat, tương tự n h ư phản ứng giữa UDP và glucoza-l~phosphatf để tạo thành GDP-manoza là một chất trung gian cho quá trình vận chuyển gốc manosyl. NH2
Ọ
o1—P—O—P—o—P—O—CH-> IJ Í1 11 (b) Hình 8.6. G uanosín vả inosin nucleotít (a) Guanosin triphosphat (GTP); (b) Inosin tríphosphat
(2) GTP (hay ITP) được tạo thành trong quá trinh phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất cùng với quá trình oxy hoá a - 0 X 0 glutarat theo thứ tự phản ứng: a-Oxoglutarat + NAD + CoA-SH Sucxinyl-SCoA + NADH + C0 2 (8 .6 ) Sucxinyl- SCoA + GDP (TOP) + p«
Sucxinat + CoA-SH + GTP ỢTP) (8.7)
(3) Và cuối cùng GTP (hay ITP Hình 8 .6 b) được phân huỷ trong phản ứng oxaloaxetic cacboxylkinaza xúc tác cần thiêt cho quá trình chuyển hoá bên trong của oxaloaxetat và phosphoenolpyruvat. Oxaloaxetat + GTP
.— Phosphoenolpyruvat + C0 2 + GDP + Pw (8 .8 )
Hơn nừa, GTP còn hoạt động như một chất cho năng lượng trong 343
quá trình tạo thành adenyl sucxinat từ IMP và L -aspartat, một bưâc chìa khoá trong quá trình tổng hợp AMP. Vai trò của GTP còn rấ t quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein. 8.3. CO ENZYM HEM 8.3.1. Câu tạo hoá học và đặc tính của nhóm HEM
Coenzym có nguồn gốc từ một ion kim loại và nhân porphyrin chiếm giữ một vị trí trung tâm của quá trình sống. Ví dụ như: clorophyl - một chất càng cua magie của một porphyrin đã thay thế, có liên quan mật thiết với quá trình quang tổng hợp, dạng ban đầu của quá trình sử dụng năng lượng nhiệt trong hệ thống sống. Trong phần này, chúng ta sẽ tập trung vào chức nồng hoá sinh của coenzym có nguồn gốc từ porphyrin chứa sắt n h ư một chất càng cua kim loại. Những porphyrin có nguồn gốc từ tetrapyrrol porphyrin ban dầu (Hình 8 .8 ) bằng cách thay thế nguyên tử hydro ở vị trí 1 đến 8 bằng những chuỗi bên khác nhau, thưòng là metyl, etỵl, vinyl và những nhóm chức năng axit propionic: (CH3) I
^-(C H = C H 2)
c
c
y HN
NH
=
3 - ( C H 3)
ÌOOH) 6 l --------- ' 5
I (CH2
Ị (CHa)
CH2COOH) Hlnh 8.7. Totrapyrrol porphyrin
Các porphyrin được phân loại dựa vào tính chất tự nhiên của những chuỗi bên này. Một số lớp đặc biệt quan trọng bao gồm etylporphyrin có 4 nhóm etyl như những thành phần vòng mesoporphyrin, có 4 nhóm metyl, 2 nhóm etyl và 2 đơn vị chức năng axit propionic; protoporphyrin được xác định bỏi 4 nhóm metyl, 2 nhóm etyl và 2 đđn vị chức năng axit propionic; và coproporphyrin chứa 4 nhóm metyl, 4 nhóm axit propionic ở chuỗi bên. 344
Porphyrin chứa sô lượng cân bằng về 2 kiểu chuỗi bên như etyl porphyrin hay coprophyrin, có thể tồn tại ỏ 4 dạng đồng phân phụ thuộc vào kiểu nhóm ngoại được sắp xêp vào nhân porphyrin. Những porphyrin giông như protoporphyrin chứa 3 kiểu nhóm ngoại, có thể tồn tại 15 dạng đồng phân. Những porphyrin được nói đến trên báo chí rất sớm vào nhũng năm 1840. Cấu trúc vòng của nhân được Kurter để xuất chính xác vào năm 1913. Năm 1914, Temberg và Leegg đã giải thích về hoá học và hoá sinh học của porphyrin và những dẫn xuất của chúng. Những porphyrin tạo thành phức càng cua kim loại (metal chelat) với các ion kim loại khác nhau như: Mg, Fe, Ni, Co, Cu, Ag, Zn. Trong những dạng chất càng cua này, ion kim loại nằm ở trung tâm nhân porphyrin 4 vị trí phối tử của nó được chiếm giữa bởi 4 nguyên tử nitơ pìrol, phức hợp này bao gồm Fe và protoporphyrin IX (Hình 8.10), thường được gọi là hem nếu Fe ở trạng thái sắt (II) và hematin, nếu sắt ò trạng thái sắt (III) là quan trọng nhất về mặt hoá sinh. Hem đóng vai trò là một coenzym cho protein liên quan đến quá trình vận chuyển oxy từ một vị trí này trong cơ thể sang vị trí khác, cho những enzym xúc tác những phản ứng oxy hoá khác nhau và cho những enzym xúc tác cho sự phân cắt của peroxit. (Xem sự oxy hoá sinh học). Hemoglobin ngưòi, một lớp protein có cấu trúc phân tử khác biệt thực hiện chức năng quan trọng của quá trình vận chuyển oxy từ phổi vào các mô khác nhau trong cơ thể, tại đó xảy ra quá trình trao đổi chất oxy hoá. Cấu trúc hoá học của hemoglobin được trình bày trên Hình 8 .8 . CHj CH,
c h = ch2
(Fe:*)
f°‘ CH,
cm 3
CH ị 1 ,CƠO
; :
GLOBIN
CH2 COO— J_ imidazol
N
im id iiz o i
GLOBIN
Hình 8.8. Cấu trúc của coenzym hem, s ự kết hợp của nhân porphyrin với sắt tạo thành hem và s ự kết hợp của hem với apoprotein và oxy
Hemoglobin được cấu thành từ 4 chuỗi polypeptit về cấu trúc bậc I thường xuất hiện thành từng cặp, cùng với 4 nhóm hem liên hết với phần globin qua lực liên kết yêu. Chứng tỏ vị trí phối tử sô 5 và 6 của nguyên tử sắt, hem bị chiếm giữ bởi 2 nhóm imidazol của histidin của phần globin được xác định bằng cách nghiên cứu nhiễm xạ tia X góc rộng của hemoglobin. Tính chất đáng chú ý về sự kết hợp thuận nghịch với oxy phân tử, tạo thành oxyhemoglobin, trong đó oxy thay th ế một imidazol như phối tử số 6 của nguyễn tử sắt, không có sự oxy hoá đồng thòi của nguyên tử sắt. Thực vậy, hemoglobin, trong đó sắt bị oxy hoá thành trạng thái sắt (III) thì không thể kết hợp với oxy. Khi gắn oxy vào, hemoglobin cũng kết hợp với một sô' ion hay phân tử nhỏ khác, bao gồm một phức hợp liên kết rấ t chặt chẽ với c o dẫn đến bị ngộ độc do chất này. Hem cũng được xem như coenzym cho những protein khác thực hiện chức năng sinh hoá cần thiết tương tự, giông như myoglobin (protein mang oxy ở cơ), vổi khôi lượng phân tử xấp xỉ một phần tư khối lượng phân tử của hemoglobin và gồm có một chuỗi polypeptit. 8.3.2. Xytocrom
Xytocrom, một lóp enzym oxy hoá khử liên quan với quá trình vận chuyển điện tử từ flavoprotein vảo oxy hay những chất nhận điện tử khác cũng sử dụng hem như một coenzym. Ngược lại với trưòng hợp hemoglobin, sắt tồn tại ở trạng thái sắt (II) qua quá trình biến đổi hoá sinh, nguyên tử sắt trong phần hem của xytocrom trải qua quá trình oxy hoá vòng và quá trình khử trong tiến trình phản ứng được xúc tác bỏi những enzym này. Wang và Binigar đã xây dựng mô hình tổng quát phản ứng xytocrom oxidaza. Các ông đã chứng minh rằng, một polyme không hoà tan được tạo thành từ hem: 4,4-bipyridin, và polylysin là một chất xúc tác ảnh hưởng rõ ràng đến quá trình vận chuyển điện tử từ xytocrom c đến oxy phân tử. Xytocrom là nhũng hemoprotein có chứa sắt (Fe). Nguyên tử sắt có khả năng biến đổi thuận nghịch giữa Fe2+ và Fe3+ (Fe2+ — Fe3+). Nhờ đặc tính này mà các chất xytocrom có khả năng vận chuyển điện tử trong chuỗi hô hấp tê bào. Ngưòi ta tìm thấy một hệ thống x y to o ro m gồm nhiều chất như cyt.b, cyt.c, cyt.a3. Cyt.a 3 còn được gọi là enzym hô hấp của W arburg hoặc xytocrom-oxidaza. Trong số các xytocrom này, 346
chỉ có cyt.c là hoà tan, nhóm hem của cyt.c được gấn vào apoprotein và bằng liên kết cộng hoá trị giữa hai mạch nhánh của nhóm hem với hai nhóm SH (cys) của apoprotein bằng liên kết phối trí của sắt với nguyên tử nitd của imidazol (His) của phần protein. Xytocrom - oxidaza phân bố rộng rãi trong các mô động vật và cả trong nhiều loại cây củ. Mỗi đơn vị chức năng của xytocrom - oxidaza có hai nhóm hem và hai nguyên tử đồng (Cu). Chất này là cấu tử cuối cùng trong hệ thông vận chuyển điện tử của chuỗi hô hấp tế bào và là chất duy nhất có khả năng vận chuyển điện tử trực tiếp đến oxy là chất nhận điện tử. Enzym này bị đầu độc bởi CO (chỉ trong bóng tối), CN- và H 2S. Các chất độc này thưòng khoá nguyên tử sắt hoạt động của hem, đặc biệt là CN - rất háo dạng oxy hoá (Fea+) của xytocrom oxidaza cho nên độc tính của chất này rấ t cao đôì vói chuỗi hô hấp tế bào. c o tạo nên phức hdp khá bền vững với xytocrom oxidaza dạng khử (Fe‘2+). Dưới đây là sơ đồ mô tả sự kết hợp của xytocrom c với apoprotein:
ịỉíet NH
CH3
Lys
ẩer
-C H -I-S— CH2— C H -C . 1 1 Xystein ^
-N ỉ I
M
I
N
. Fe-
iN'
NH —
r
I\
V
-N .
=
L
ch4
C LH 3
- s — CH2— C H - C — .. . Xystein
Q ,' y
'
Cilu 7- Ẹis Thr ýal
Qlu Lys ■M hem
-N
Imidazol---- ' apoprotein
Hình 8.9. Sơ đố mô tả sự kết hợp của nhóm hem với apoprotein trong xytocrom c
347
S-CV. ClOl,
OI
'N
CHi
ì
' n----- Fc---- n" a------/ : V
Qks—S CHjO^
,CH,
"..I
CHf
r
y-
' C T ỊrQ M X O
—■ N\ w C H jC H jO X f
CHj'
■ V Clự
C H p ỊịC O Ơ
CHÍ
C H ^C H ;C O Ơ
H em c (tro n g x y to cro m c)
s ắ t p ro to p o rp h y rin IX (tro n g xytocrom b)
O H =CU 2
CHr
?: h! .
.CH,
QỈY íV / Y V Y V /Í: CH,
CH,
CHj
-Fe-
/■ C H j'
CHÍ
i I I
A, 'C H ị C H i C O O '
'C H , C H , C O O
Hem A (trong xytocrom a) Hỉnh 8.10. Hem trong một s ố xytocrom Các nhóm ngoại của xytocrom có bốn bộ phận, có nitỡ trong cấu trúc vòng được gọi là prophyrin. 4 nguyên tử nitơ được kết hợp với ion sắt ở trung tâm" nó có thể là Fe2* hoặc Fe3*. Sắt protoporphyrin IX loại xytocrom đuạc tạo thành trong các loại b, trong hemoglobin và trong myoglobin. Hem dược liên kết cộng hoá trị vcri protein của xytocrom qua các liên kết thioete đối với 2 gốc Cys. Hem A, tạo thành trong các xytocrom a có đuôi isoprexit dài tác dụng đến 1 trong 5 thành phần vòng. Hệ thống liên kết kép của vòng porphyrin giải thích sự hap thụ ảnh sáng nhìn thấy bỏi các hem này.
8.3.3. Một s ố enzym khác có Hem
Ngoài vai trò vận chuyển điện tử trong chuỗi hô hấp tế bào, hem còn là chất phối hợp của nhiều enzym khác. Hem được coi như một cofactd của hydro peroxidaza, enzym này tồn tại trong 2 dạng: catalaza và peroxidaza. a) C atalaza Enzym này là một hemoprotein, có 4 nhóm hem làm chất cộng hợp, xúc tác cho phản ứng giải phóng oxy phân tử từ H 20 2. 348
H 20 2 ------> H20 + l/2 0 2 (8 .9 ) Enzym này còn có nhiều trong gan và máu, b) P eroxidaza Enzym này có một nhóm hem làm chất cộng hợp, nhóm này được gắn lỏng lẻo với apoenzym, nó vận chuyển điện tử đến H20 từ chất cho điện tử tương ứng; phản ứng có dạng tổng quát như sau: AH2 + H 20 2 ------> A + 2H20 (8 . 1 0 ) Enzym này có nhiều trong bạch cầu và sữa. c) D ioxigenaza Một sô" dioxigenaza như L-tryptophan dioxigenaza (tryptophan pyrolaza cũng cần chất cộng hỢp là nhóm Hem). Phản ứng tổng quát của dioxigenaza như sau: R - H + 0 2 ----- > R —o —0 —H (8 . 1 1 ) Phản ứng này đưa cả hai nguyên tử của phân tử oxy vào cơ chất. d) Mono oxigenaza Mono oxigenaza là những enzym xúc tác đưa một nguyên tử oxy của phân tử oxy và cơ chất tạo nên nhóm hydroxyl (cho nên còn có tên là hydroxilaza) còn nguyên tử oxy thứ hai được khử hoá thành nước (H20) nhò một chất cho điện tử khác, Quá trình phản ứng tổng quát như sau: A - H + 0 2 + ZH2 ------> A - 0 H + H20 + Z (8.12) Trong số những mono oxigenaza, người ta thấy có những enzym tham gia vào quá trình tạo nhóm hydroxyl của các chất thuốc. Các enzym này thường thấy có trong tiểu thể (microsom) của gan cùng với xytorom P-450 (P-450) và xytocrom b5. Theo một sô" tác giả thì quá trình phản ứng xảy ra như sau: Trước hêt, các xytocrom được NADH và NADPH khử bằng cách nhường điện tử, sau đó đến lượt các xytocrom lại được cơ chất oxy hoá trở lại trong một phản ứng do hydroxilaza xúc tác. Quá trình tổng quát như sau: Thuốc- H + 0 2 + 2Fe2+(P-450) + 2H Thuốc- OH +H20 + 2Fe (P-450) Sự có m ặt của nguyên tử sắt nhân hem trong cả hemoglobin và xytocrom, quá trình xúc tác của các hydroperoxidaza thực hiện để tạo thành dạng oxy hoá tạm thời của sắt III để phân huỷ H20 2 và có thể nó là ví đụ tiêu biểu phản ứng kiểu mẫu cho quá trình xúc tác. Mốì quan tâm đặc biệt là phức càng cua sắt (III) của trietylen tetram in H 2NCH2 CH2 - NHCH 2 - CH2 - NH2, đã được nghiên cứu. Trong dung dịch lỏng ở 349
25°c, phức càng cua này xúc tác phân huỷ 11.000 phân tử H 20 2 trong 1 phút trên 1 phân tử phức càng cua. Mặc dù phản ứng này chậm hơn khoảng 300 lần so với quá trình xúc tác enzym, nhưng nó cho thấy rằng, nhiều phản ứng chuẩn có thể đạt đên tốc độ giông như enzym. Đại diện cho những phản ứng này, có liên quan đên quá trình vận chuyển oxy, oxy hoá - khử và sự phân cắt của peroxit và coenzym hem tương tự được sử dụng, tính chất đặc hiệu của những enzym này cho kiểu phản ứng cũng như cơ chất, phải nằm trong phần protein của holoenzym. Đó là một điều chắc chắn của hầu hết nhũng ví dụ về tính đặc hiệu được quy ước cho những phản ứng có enzym xúc tác. 8.4. MỘT SỐ VITAMIN LIÊN QUAN ĐEN COENZYM
Ngoài các thành phần protein, axit nucleic, saccarit và các lipit, các tế bào sông còn chứa các chất hữu cơ ỏ dạng vết, có những chức năng đặc biệt là các vitamin. Tầm quan trọng sinh học của chúng trước tiên được nhận thấy là cần cho sự sông của nhiều cơ thể sông, vì một số’ sinh vật không thể tổng hợp được chúng và phải lấy từ các nguồn bên ngoài. Lịch sử về vitamin, một trong nhũng thành phần quan trọng nhất của lịch sử hoá sinh học, có ảnh hưỏng sâu rộng đến sức khoẻ và hạnh phúc của con người, đồng thòi lên hiểu biết của chúng ta về quá trình xúc tác xảy ra trong trao đổi chất của sinh vật sống. Chê độ ăn liên quan dến bệnh lậ t đã được biết đến trong thời xa xưa, như con người đã sớm biết chữa bệnh quáng gà. Vào thế kỷ XVIII, dầu gan cá được sử dụng đầu tiên để chữa bệnh còi xương và sau đó quả chanh được khám phá là ngăn cản các triệu chứng bệnh scobut (bệnh m áu thiếu vitamin c trong đồ ăn thường ngày) ở các thuỷ thủ Anh. Nhưng tới năm 1912, nhà khoa học ngưòi Anh F.G. Hopkins đã đưa ra các thí nghiệm cho thấy, các động vật cần nhiều protein, chất béo và saccarit hơn trong chê độ ăn đe có sự sinh trưởng bình thường. Ong xem một hoặc nhiều nhân tố phụ có mặt trong các thức ăn tự nhiên cũng cần thiết trong dinh dưỡng của động vật. Cũng vào năm đó, Casimir Funk đã có lượng cô đặc một amin từ vỏ gạo làm giảm nhẹ các triệu chứng của bệnh beri—beri, phổ biên 0 các thuỷ thủ N hật Bản do chế độ ăn với gạo xay quá kỹ. Ông đã đặt tên cho nó là vitamin, nghĩa là một amin cần thiết cho sự sổng (ngày nay dọc là vitam in vì có rất nhiều chất trong đó không phải là các amin). Thời gian ngắn sau đó, ngưòi ta thấy rõ ràng là phải có một vài loại vitamin và E.v. McCollum ở Mỹ khám phá ra rằng, chuột con cần cả các nhân té) sinh trưởng hoà tan trong chất béo và hoà tan trong nước. Những khám phá ban đầu này đã dẫn đến sự phát triển của một hệ phương pháp để tách các yếu tố vết cần thiết trong chê độ dinh dưdng 350
cua chuột và các động vật khác ở phòng thí nghiệm. Các chế đô ãn tổng hỢp cho các động vật thí nghiệm còn nhỏ được tạo ra từ các phần đặc biệt của các thành phần hoá học đã biêt, như các protein hoặc các axit amin, chất béo, saccarit, các chất khoáng, Nhưng các thành phần này không đủ để tạo ra sự sinh trương bình thường của chuột, khi khẩu phân được‘bô sung thêm thức ăn tự nhiên giàu các nhân tố sinh trưởng thì sự sinh trưởng của chuột tăng trông thấy. Nhờ các nhân tố sinh trưởng được chiêt xuât một cách có hệ thống từ các nguồn tự nhiên và các thử nghiệm vê nồng độ hiệu quả dựa trên tốc độ sinh trưởng cua các động vật, các nhãn tố sính trưởng đã đạt được dạng tinh khiết về mặt định dạng hoá học. Ngoài tốc độ sinh trưởng, các hội chứng thiếu hụt như da có vảy, xỉn lưỡi, dáng đi thay đổi,... cũng được thử nghiệm vói vitamin. Sự xác định hàm lượng chính xác vitamin cần thiết từ bên ngoài cho các động vật cần chú ý đến cả sự có m ặt của các sinh vật đưòng ruột, chúng có thể tổng hợp một số các vitamin. Một sự đột phá quan trọng vào giữa năm 1930, khi một số”vitamin lần đầu tiên được phân lập và các cấu trúc phân tủ của chúng được thiết lập, đó là một thành công của phòng thí nghiệm vì vào lúc đó muốn có được ỏ mức miligam chất tinh khiết, thường phải dùng từ hàng tấn nguyên liệu ban đầu. Trong vài năm, thiamin (vitamin Bi) là chất chữa bệnh beri-beri; riboflavin (vitamin B2) và axit nicotinic, nhân tô” chữa bệnh nứt da đă dược xác định. Sau đó không lâu, ngưòi ta đã khám phá ra rằng, những vitamin có chức năng như là thành phần thiết yếu của các coenzym. Ví dụ như pyruvat decacboxylaza xúc tác sự khử cacboxyl của axit pyruvic thành axetalđehyt vè COa, một bước quan trọng trong quá trình lên men rượu từ đưòng nhờ nấm men, cần một cofactơ hữu cơ bồn nhiệt gọi là cocacboxylaza, chất mà K. Lohmann và p. Schuster đã phân lập thành công vào năm 1936. Trong vòng vài tháng, họ đã tìm ra rằng, các cocacboxylaza chứa một phân tử thiamin. Riboflavin và axit nicotinic được xác định rất sớm, ]à thành phần quan trọng của các coenzym khác cần thiết cho sự oxy hoá cacbohydrat. Những khám phá đó không chỉ chứng minh chức năng sinh học của nhiều vitamin ở lượng vết, mà chúng còn giúp chúng ta hiểu cd chê phân tử vê coenzym và enzym điều khiển tốc độ các phản ứng hoá học. Trong phần này chúng ta miêu tả các vitamin chính hiện nay được biết, tính hiệu quả sinh học. Trong đó các vitamin là các thành phần thiết yếu của các coenzym và các ví dụ về chức năng coenzym trong các phản ứng trao đổi chất được xúc tác bằng enzym đặc hiệu. 8.4.1. Thiam in (vitamin BO và coenzym thiamin pyrophosphat
Thiamin cần thiết trong chế độ ăn của hầu hêt các động vật có xương sống và một số vi sinh vật. Sự thiếu hụt nó gây bệnh beri - beri ở 351
người và viêm đa dây thần kinh ở chim. Sau thành công ban đầu của F u n k t r o n g v iệ c c h i ế t x u ấ t n h â n tô k h á n g b e r i — b e r i, n ó được k ê t tin h vào năm 1925 bởi B.c.p. Jansen. a) Cấu tạo và tín h chất CH—N — C -C H ,
2 11
II
HC
NHj
3
C-CH,-CH,-OH
s
(a)
CH2- N — C-CHj
Ọ
0
C - C H2 f O ít O - y P - O - Py— OH OH
OH
Hình 8.11. Thiamin (a) và thiamin pyrophosphat
Cấu trúc phân tử của nó được thiết lập bởi một nhà hoá học Mỹ William R.R. và các cộng sự vào năm 1935. Thiamin là tổ hợp của một pyridin liên kết qua cầu metylen vối một thiazol (Hình 8.12). Trong cơ thể sinh vật, thiamin tồn tại dưới dạng thiam in diphosphat (pyrophosphat), còn dạng monophosphat hay triphosphat thì ít gặp hơn. Thiamin tương đối bền vững trong dung dịch axit nhưng dễ bị phá huỷ khi đun nóng trong môi trường trung tính hay môi trường kiềm. Thiamin xuất hiện trong tế bào ở nhiều dạng coenzym, hoạt tính của nó là thiamin pyrophosphat, trước đây gọi là cacboxylaza. H
Vòng thiazol của thiamin pyrophosphat
ẻ -í R - +N s
^c= c I _
ch3
Pyruvat c h 3 - ■ C -C O O H
f
COOH CH3 - i - O H
I
X.C s R —H ~ I \C = C -R j ch3
Dẫn xuất
a-Hydroxyetyl H / COj
-O H CH3 -ĩ-c I > c “ s _ I
\C = C -R i I
Axetaldehyt C H 3 -C -H H I C -S
1
R - +N
ch2
Hlnh 8.12. Các bước hoạt động của thiamin pyrophosphat trong decacboxy hoá của pyruvat
352
I
\C = Ò - * 1 CH3
Thiamin pyrophosphat được xem như là coenzym cho hai loại phản ứng xúc tác enzym trong xu hướng chủ đạo của trao đổi chất hydrocacbon mà trong đó aldehyt bị loại bỏ hay chuyển đi: (1 ) sự khỏ cacboxyl của axit a-keto và (2) sự hình thành và phân huỷ của a-ketol. Trong nhũng phản ứng này, vòng thiazol của thiamin pyrophosphat được xem như chất mang tạm thời của một nhóm aldehyt hoạt động gắn cộng hoá trị. Mg2* cũng cần thiết như là một cofactơ. Thiamin có tác dụng điểu trị rấ t tốt đối với bệnh tê phù, bệnh viêm thần kinh vì nghiện rượu, viêm thần kinh lúc mang thai, hoặc bị bệnh pellagra (do thiếu axit nicotinic, gây ra viêm da có vảy ỏ những nơi không che phủ, tiêu chảy và suy dinh dưỡng). b) N guồn vita m in B ị và n hu cầu hàng ngày Vitamin Bi là loại vitamin rấ t phổ biến trong thiên nhiên, đặc biệt trong nấm men, mầm lúa mỳ, cám gạo, gan, tim, thận, thịt lợn nạc. Vitamin này dễ hoà tan trong nước và dễ bị nhiệt phá huỷ, cho nên dễ bị mất mát trong khi nấu thức ăn. Nhu cầu hàng ngày về vitamin Bi phụ thuộc vào chế độ ăn và các điều kiện nghề nghiệp, vào trạng thái sinh lý và bệnh lý,... Chế độ ăn nhiều tinh bột thì nhu cầu vitamin Bi tăng lên và cũng tăng lên khi cường độ quá trình chuyển hoá tăng, như trong trường hỢp sốt, cường giáp trạng, tăng hoạt động cd, có thai, cho con bú. Ngưòi bình thưồng cần 1 - 3mg vitamin trong 24 giờ, Khi thiam in bị loại bỏ khỏi chế độ ăn của các động vật thí nghiệm, khả năng của các mô khác nhau sử dụng pyruvat không bị suy giảm đi một cách đồng bộ. Trong một số mô, sự gắn thiamin pyrophosphat được giữ bền vững trong khi đó một số' mô khác thì bị m ất nhiều hơn qua sự phân giải hoặc bài tiết trao đổi chất. Ví dụ, ỏ chim bồ câu, nếu thiếu thiamin, khả năng sủ dụng pyruvat suy yếu thấy rõ trong não, vì sự mất mát coenzym; trong khi đó hoạt tính của mô cơ chỉ bị ảnh hưởng nhẹ nhàng. Sự khác nhau ỏ mô này giải thích tại sao triệu chứng đầu tiên của sự thiếu h ụ t thiam in ồ bồ câu là sự suy yếu trong hoạt động hệ thần kinh Hồn quan đến tư th ế và khả năng phối hợp, vì th ế cái tên viêm đa dây thần kinh được đặt cho sự thiếu hụt thiamin ỏ chim. Sự chú trọng cũng tương tự vói vitamin hoà tan trong nước khác, hầu hêt mô mẫn cảm với sự thiếu hụ t khác nhau, từ vitamin này đến vitamin khác và trong nhiều trường hợp là từ loài động vật này đến loài khác. Các triệu chứng thiếu hụt thiamin cố thể được tạo ra bởi việc ăn các chất tương tự thiamin, như pyrithiamin, trong đó nhóm thiazol được 353
thay thế bởi một nhóm hydroxyl. Những chất tương tự này không có hoạt tính vitamin, chúng cạnh tranh với hoặc là “h ấ t cang” thiamin pyrophosphat khỏi các enzym mà bình thường nó đang gắn vào. Enzym thiaminaza có trong các vi sinh vật đường ruột. Bất hoạt thiam in bằng cách cắt cầu nôi giữa các vòng. Enzym này gây chứng liệt Chastek, bệnh của các con chồn và cáo trang trại ăn ruột động vật. Thông thưòng, con người lấy thiam in từ một số" thức ăn như bánh mỳ trắng hoặc phải bổ sung vitamin. R’
CH,
C H ,— C - C
C H ỉW R'
C H ,— C - C
CH
W
R' c h
O—
3
R’
"
R—
, VIII
<ỊỊ)
C
ị
CH, t
C H 3— c - < p — C H 3 + V H(Ị> < p A
C H 3- J
-
ỉ
- C H 3
H
Hình 8.13. Cơ c h ế các phản ứng phụ thuộc thiamin của pyro p h o sp h at
354
V
Ú ị - c °J
ị C H jC H O + V
Cl t ,
Khi thiêu vitam in Bj, sự chuyển hoá cốc keto - axit bị ngưng trệ và các chất này bị ứ đọng lại trong cơ thể, dẫn tới sự hỗn loạn chuyển hoá và gây ra nhiều hiện tượng bệnh lý trầm trọng, điển hình nh ất là bệnh tê phù. Thiamin pyrophosphat cũng là coenzym trong các phản ứng transketol hoá polysaccarit xảy ra rất mạnh cho nên nhu cầu về vitamin Bi rấ t cao. Có lẽ vì th ế mà khi thiếu vitamin Bj đã ảnh hưởng nhanh chóng đên sự hoạt động của hệ thần kinh, ảnh hưỏng rõ rệ t đến hệ thần kinh ngoại vi, đồng thòi cũng ảnh hưởng đến ống tiêu hoá và hệ tim mạch. Ngoài ra, vitamin B, cùng vớí axit pantothenic (nhóm hoạt động của coenzym A) tham gia vào quá trình sinh tổng hợp axetyl cholin, là chất có vai trò quan trọng trong việc truyền các xung động thần kinh. 8.4.2. Riboflavin (vitamin B 2) và coenzym flavin nucleotit
Sụ phát hiện ra riboflavin và nghiên cứu chức nàng của nó trong hệ thống sông mở ra một chương quan trọng trong lịch sử hoá sinh. Riboflavin được Blyth phân lập từ nhựa cây nguyên chất vào năm 1789, gọi là lactochrom. Sau nửa th ế kỷ bỏ qua, một sô' nghiên cứu đã phân lập được sắc tổ' vàng nguyên chất từ những nguồn khác nhau trong tự nhiên, chúng gồm xytoflavin được tách bởi Banga và Szent Ggorgyi, lyochrom được tách chiết bởi Ellinger và Keschara, lactoflavin được tách chiết từ sữa, Elliger-W agner-Tausegg và cộng sự đã tách chiết được vài milligam ovoflavin tinh thể nguyên chất từ lòng trắng trứng đưa đến kết quả khám phá ra chất này, sau này gọi là vitamin B2. Cấu trúc của lactoflavin, ngày nay gọi là riboflavin được K aurer và cộng sự giới thiệu vào năm 1935. Riboflavin được cấu tạo từ một vòng isoalloxarin đã thay th ế liên kêt với D-ribotol. Riboflavin được tổng hợp bởi tất cả các thực vật và nhiều vi sinh vật nhưng không được tạo ra bởi các động vật. Nó là nhân tố sinh trưởng thiết yếu cho động vật có vú. a) Cấu tạo và đặc tin h Ve cấu tạo hoá học, riboflavin hay vitamin B2 là một hợp chốt do nhân đimetyl —isoalloxazin kết hợp với gôc ribotyl tạo nên (Hình 8.14). Riboflavin tương đối bển với nhiệt và với axit nhưng rất nhạy cam đôi với ánh sáng. Sự phosphoryl hoá riboflavin xảy ra trong niêm mạc ruột và cũng là điểu kiện cần thiết cho sự hấp thụ riboflavin. 355
Vòng isoalloxazin
Hlnh 8.14. Flavin adenin dinucleotit (FAD) và các dạng khử của nó
(Nguổn: Lehninger A.R., Nelson D.R., Cox M.M., Principles of Biochemistry, 2004)
b) Chức năng sìn h học của riboflavin Riboflavin là thành phần cấu tạo của nhiều hệ thống enzym trong quá trình chuyển hoá trung gian. Trong cơ thể sông thưòng thấy hai dạng riboflavin kết hợp với phosphat là flavin mononucleotit (FMN) và flavin adenin dinucleotit (FAD). Các chất này thường gắn chặt với apoprotein tạo thành những phức hợp flavoprotein có hoạt tính enzym. FMN là cấu tử của enzym vàng Warburg, xytocrom c reductaza và L - amino axit oxidaza. FAD thường hay gặp hơn và là cofactò của nhiều enzym loại ílavoprotein như D-amino axit oxidaza, glyxin oxidaza, alkyl oxidaza, enzym này có chứa cả Fe và Mo. FAD cũng là cofactd của axyl - CoA dehydrogenaza, là enzym tham gia vào phản ứng oxy hoá đầu tiên của quá trình oxy hoá axit béo. Một khám phá quan trọng đặc biệt, cả về cấu trúc và chức năng hoá sinh của riboflavin là sự oxy hoá của glucoza—6 phosphat được xúc tác bởi glucoza-6 -phosphat dehydrogenaza (D-glucoza-6 -phosphat NADP oxidoreductaza) tạo thành NADPH, một coenzym mà sự tái oxy hoá cửa nó được xúc tác bỏi “enzym vàng cũ”. Quá trình xử lý metanol của enzym vàng đã hoà tan nó thành protein có màu và một sắc tô" protein tự do, sau đó Kuln xác định là có quan hệ cấu trúc vối riboflavin (Hình 8.14). Theorell H. (Thụy Điển) chứng minh rằng, nhóm ngoại của e n z y m vàng không phải là riboflavin, mà là riboflavin-5’-phosphat. Chất này 356
thường được xem như là một riboflavin mononucleotit (FMN) mặc dù sự gọi tên này chưa hoàn toàn chính xác, liên kết giữa những thành phần bazơ và đường không phải là một liên kết glycosit. Tinh thể enzym màu vàng có khối lượng phân tử xấp xỉ 100.000 và chứa hai phân tử FMN trong một phân tử enzym. Năm 1938, W arburg và Christian đã phát hiện ra rằng, một enzym xúc tác sự oxy hoá hiếu khí của D - axit amin, được gọi là D - axit amin oxidaza, là một flavoprotein chứa một nhóm ngoại khác với FMN. Cấu trúc của coenzym mới này là flavin adenin dinucleotit (FAD), được xác định bồi Told, năm 1954 (Hình 8.14). Số lượng flavoprotein đã biết, sử dụng FMN hay FAD như một coenzym, là rấ t lởn, và những enzym này đã đóng góp một phồn đáng kể trong tự nhiên, Flavoprotein là chất xúc tác loại hydro. Những kiểu cơ chất được loại hydro bồi flaroprotein bao gồm nucleotit pyridin, a —axit amin và a - axit hydroxy, aldehyt và nhũng chất chứa liên kết cacbon cacbon bão hoà được chuyển hoá thành những olefin. Trong quá trình oxy hoá, hệ thông vòng isoalloxabin của coenzym tương ứng, FMN hay FAD trở thành dạng khử.
R
H
Flavoprotein dạng oxy hoá
R
H
Flavoprotein dạng khử
( 8 . 13)
M ặt khác, những flavoprotein dạng khỏ trở thành những cd chất cho những phản ứng có liên quan đên chết nhận điện tử khác, tái tạo dạng oxy hoá của coenzym. Vì vậy chất nhận điện tử tự nhiên của nhũng phản ứng này thưòng không có giá trị, những ílavoprotein thường được th ỏ nghiệm bằng cách sử dụng chất nhận ái điện tích như xanh metylen, indophenol, hay thuôc nhuộm phenazin hoặc tetazoin, hay oxy phân tử. Cả hai quá trình có và không có enzym xúc tác của ílavoprotein được mô tả bởi sự xuất hiện của những dấu hiệu cộng hưdng điện tích tạm thòi và những băng hấp thụ bước sóng dao động trong khoảng 550-700nm. Chúng phù hợp với quá trình khử xảy ra theo hai quá trình vận chuyển môt điện tích liên tiếp liên quan đến phân quinon flavin như một chât trung gian. 3§7
FAD(FMN)
FADH* (FMNil*)
FADlli (FMNHi )
= 2 8 0 ,-3 70,~450nm ) ( ^ cd„ = 280,~ 370> 450 ~ 590nm ) (Xe
Nó xuất hiện giông với nhiều phản ứng loại hydro có enzym xúc tác được xúc tác bởi những flavoprotein diễn ra theo flavosemiquinon. Khi thiếu vitmin sự tổng hợp một số enzym oxy hoá khử bị ngưng trệ, do đó ảnh hưởng đến quá trình oxy hoá khử tạo năng lượng trong cơ thể. Ngoài ra, sự sinh sản của tế bào biểu bì ruột cũng bị ảnh hưởng, do đó có thể xảy ra hiện tượng chảy máu ruột và rối loạn sự hoạt động của ống tiêu hoá. Vitamin B2 cũng liên quan đến khả nàng chống nhiễm khuẩn, làm tăng tổc độ tái tạo máu, tác dụng đến sự phát triển của bào thai. Cùng vói vitamin p p và vitamin A, vitam in B2 tham gia vào quá trình thu nhận ánh sáng và màu sắc. Tuy vitam in B2 có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá, nhưng các triệu chứng lâm sàng của sự thiếu vitamin B2 thường nhẹ và không đặc hiệu vì sự thiếu vitamin Bj; thường đồng thời kết hợp vối sự thiếu một sô" chất dinh dưỡng khác như sắt, vitamin pp. Khi thiếu vitamin B2, thường thấy một số triệu chứng như vết loét ở môi, nứt mép, một số rối loạn cơ năng hoặc tổn thương hữu cơ của mắt. 6.4.3. Axit nicotinic (niaxin, vitamin pp, vitamin B 3) và các pyridin nucleotit
a) Cấu tạo m và đặc > tín h Vitamin p p là một hợp châ't hữu cơ có tác dụng chữa bệnh pellagra (viêm da có vảy). Cấu trúc hoá học khá đơn giản, đó là axit nicotinic, hoặc dạng amit của nó l à nicotinamit (Hình 8.15).
&
COOH
i^ ^ j p C O N H n
N (b)
(a)
-CONH1
í^ >
-C O N H 2
o N"
I
CH3 (c)
N'
I
ch3
(d) Hinh 8.15. Vitamin pp (vitamin B 3)
(a) Axit nicotinic; (c) N-metyl nicotinamit; (b) Nicotinamit; (d) 6-Pgrodon-N-metyl nicotinamit
ơ dạng axit nicotinic, nó bền với nhiệt, với axit và kiềm. Dạng amit của vitamin p p kém bên với axít so với dạng axít, Trong cơ thể động vật, vitamin p p có thể được tổng hợp từ axit amin tryptophan. Quá trình này xảy ra với sự tham gia của vitamin B2 và Be. Vì vậy, khi chế độ ăn thiếu các protein giàu tryptophan cũng cố thể gây ra hiện tượng thiếu vitamin pp. b) Vai trồ của vitam in p p Ngoài tác dụng chông bệnh pellagara, nicotinamit là cấu tử quan trọng của coenzym NAD và NADP. Đây là những coenzym vận chuyển hydro và diện tử trong các quá trình oxy hoá khử thuận nghịch, do đó có vai trò rấ t quan trọng trong quá trình chuyển hoá. Sự thiếu h ụ t axit nicotinic (Hình 8.15) dẫn tói bệnh nứt da và bệnh đen lưỡi ở chó. Nứt da là bệnh địa phương ở trẻ em vùng Nam Mỹ vào đầu năm 1900. Nó được biết đến trong suốt từ 1915 - 1920 như là một bộnh do thiếu h ụ t trong chế độ ăn qua sự nghiên cứu phân loại dinh dưỡng được thực hiộn trên trẻ em ở trại mồ côi bởi Joseph Goldberger, một nhà sinh lý của Hiệp hội sửc khoẻ cộng đồng Mỹ. Goldberger đã chỉ ra rằng, bệnh không do lây nhiễm mà nó kết hợp với chế độ ăn ít tinh bột, và có thể được ngăn ngừa bởi sự bể sung vào chế độ ăn thịt, trứng và sữa. Tuy nhiên, yếu tố chế độ dinh dưỡng không biết đến axit nicotinic cho tới nám 1937, xuất phát từ một hưổng nghiên cứu hoá sinh học độc lập bắt đầu vào năm 1904, khi nhà hoá sinh học người Anh Harden, A. và Young, W.J. đã khám phá ra một cofactơ bền nhiệt, có tính thấm cần cho lên men rượu từ đưòng nhồ dịch chiết nấm men. Cofactd này ban đầu gọi là cozymaza hay coenzym I, đuỢc phân lập bởi Voneuler H. ở Thụy Điển vào năm 1933. Một coenzym gần tương tự, dược gọi là coenzym II, dược phân lập bởi Warburg và Christan w. vào năm 1934. Thời gian ngắn sau đó đã xác định được nicotinamit (Hình 8.15), am it của axit nicotinic là yếu tổ' dinh dưdng ngăn cản bệnh đen lưỡi chó vồ bệnh nứt da ở người nhờ các nhà hoá sinh Mỹ Elevenhem, C.A. và Woolley, D.W. vào năm 1937. Tên gọi axit nicotinic là vì nó là một thành phần của chất độc alkaloit nicotin của thuốc lá, người ta đã đưa ra tên gọi ngắn thông thường là niaxin. Các thực vật và hầu hết là các động vật có thể tạo nên axit nicotinic từ các tiền chất khác nhau, đặc biệt là axit amin tryptophan. Nếu các động vật có đủ protein giàu tryptophan, chúng không thể hiện sự thiếu hụt khi axit nicotinic bị loại bỏ khỏi chế độ ăn. Tuy nhiên, nếu hàm lượng protein thấp trong chế dộ ăn, không đủ tryptophan cho sự tạo 359
niaxin thì sẽ dẫn đến hiện tượng thiếu hụt. Mặc dù bệnh nứt da phần lớn là vì thiếu axit nicotinic, nó còn thường là tổ hợp sự thiếu hụt các vitamin khác và các axit béo thiết yếu. Hình 8.16 cho thấy cấu trúc của hai coenzym chứa nicotinam it như là một thành phần thiết yếu, nicotinamit adenin dinucleotit (NAD), được gọi là diphosphopyridin nucleotit (DPN) và nicotinamit adenin dinucleotit phosphat (NADP), được gọi là triphosphopyridin nucleotit (TPN) (các tên cũ là coenzym I hay cozymaza và coenzym II không được sử dụng). Hai coenzym này cũng được xem là pyridin coenzym hay pyridin nucleotit, vì nicotinamit là một dẫn xuất của pyridin.
NH2
NADH (khử)
Trong NADP+ nhóm hydroxyl này được eate hoá với phosphat
(a) Hỉnh 8.16. (a) Nicotìnamit adenin dinucleotit (NAD*) và sự phosphoryl hoá của nó cũng như NADP+ bị khử thành NADH và NADPH. Khi nhận ion hydro có thể thêm ở mặt trước (type A) hoặc mãt sau (type B) cùa vòng nìcotinamit; (bj phổ hấp thụ uv của NAD’ vá NADH. s ự khử của vòng nicotinamit tạo thành điểm mới, tăng hấp thụ rộng vởi cực đại ở 340nm. Sự tạo thành NADH trong sự oxy hoá được xúc tác bãi enzytĩi có thể phù hợp bài sự quan sát bể ngoài của sự hấp thụ ờ 340nm.
8.4.4. A x it pantothenic (vitamin B 5) và coenzym A
Axit pantothenic là một chất quan trọng trong sự dính dưỡng của người cũng như nhiều loại động vật, cây cỏ, vi khuẩn, men bia. a) Cấu tạo và đặc tín h Axit pantothenic là thành phần cơ bản của coenzym A. Trong thành phần cấu tạo có axit pantoic và alanin (Hình 8.17). Axit pantothenic được biết đến đầu tiên bỏi William R.J. như là một nhân tố sinh trưởng 360
cho nấm men. Nó được hình thành bởi thực vật và nhiều vi khuẩn nhưng yêu cầu trong chế độ ăn của các động vật có xương sống. Sau đó không lâu nó mới được xác định là coenzym A (A chỉ axetyl) bởi Kaplan N.o. và Lipmann F., người dã sốm tìm ra các phản ứng axetyl hoá enzym cần cho một coenzym bền nhiệt.
3'-Phosphoadenosin diphosphat Hình 8.17. Coenzym A
b) Vai trò của axit pantothenic Là một thành phần cấu tạo quan trọng của coenzym A, pantothenic có chức năng cơ bản trong chuyển hoá tế bào. Chức năng của coenzym A là chất mang của các nhóm axetyl trong các phản ứng enzym tham gia vào sự oxy hoá axit béo, sự tổng hởp axit béo, sự oxy hoá pyruvat và axety] hoá sinh học. Cơ chê hoá học chính xác coenzym A được viết tắt là CoA hay CoA-SH (khi chức năng thiol của nó được chú trọng). ATP + coenzym A + axetat Í = ^ A M P + axetyl CoA + pyrophosphat Coenzym A được hình thành có thể phản ứng enzym với chất nhận nhóm axyl như là cholin để tạo axetyl cholin hoặc với axit oxaloaxetic đe tạo axit xitric, như trong phản ứng: Axetyl-CoA + cholin cholm axetyl cholin + CoA-SH Axetyl-CoA + axit oxaloaxetic + H20 —’"Ual 3y-nteta— xitrat + CoA-SH Một mô hình phản ứng không enzym, trong đó các thioete như axetyl CoA là các nhân tổ’axyl hoá hiệu quả hơn các oxy este tương ứng, vì liên kết thioete ít bền vũng hơn liên kết oxy este. Những đẫn xuất axyl của CoA—SH thưòng được tạo thành trong những phản ứng tổng hợp phụ thuộc ATP, trải qua râ t nhiều phản ứng trao dổi chất, có thể chia thành 4 nhóm: 361
(1 ) Các phẳn ứng có liên quan đến sự tác dụng của những tác nhân phản ứng ái lực vói nucleotit trên nguyên tử cacbonaxyl với quá trình vận chuyển nhóm chức axyl tới tác nhân tác dụng và giải phóng CoA-SH. (2) Có liên quan đến sự thêm vào những phần có một liên kết olefin irong phần axyl. (3 ) Những phản ứng có liên quan đến sự ngưng tụ ở Ca của axyl SCoA (những phản ứng như vậy thường trải qua sự tạo thành cacbonion ở vị trí này). (4). Những phản ứng có liên quan đến quá trình trao đổi nhóm axyl. Vai trò của axit pantothenic không chỉ giới hạn ỏ chỗ nó là thành phần cấu tạo của coenzym A mà còn là thành phần quan trọng của ACP, là một chất protein đặc hiệu vận chuyển gốc axyl trong quá trình tổng hợp axit béo. Trong trường hợp này, axit pantothenic liên kết cộng hoá trị vối nhóm hydroxyl của serin trong phần apoprotein qua gốc phosphat làm trung gian. Tuy axit pantothenic có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, nhưng ít khi thây có hiện tượng thiếu vitamin này ở ngưòi. ở một số động vật, khi thiếu axit pantothenic, thưòng thấy hiện tượng thiếu máu. Điểu này cố thể giải thích là do thiếu coenzym A, để tạo nên sucxinyl-CoA. Chất này cùng với glyxin là nguyên liệu quan trọng để tổng hợp hem (một thành phần quan trọng của hemoglobin). Khi thiếu axit pantothenic, có thể xảy ra hội chứng tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm ruột, ỉa chảy, hội chứng da bị sừng hoá (rắn), m ất sắc tô' (mất màu da), bong da, rụng tóc. Nhũng con vật thiếu vitamin Bg có thể xuất hiện hiện tượng hoại tử xuâ't huyết ố vỏ thượng thận và đòi hỏi nhiểu muôi. Nếu tình trạng này kéo dài, tuyến thượng thận có thể bị kiệt quộ và biến m ất các steroit, ngoài ra còn có thể xảy ra hiện tượng suy cấp vỏ thượng thận. 8.4.5. Vitam in Bu và coenzym pyridoxal phosphat
a) Cấu tạo và đặc tín h C H ,O H Vitamin Bg được xác định lần đầu tiên là chất thiết yếu trong dinh dưỡng của chuột để ngăn ngừa chứng viêm da được gọi là acrodynia. Một chất kết tinh có hoạt tính này là pyridoxin (Hình 8.18) được phân lập và được xác định vào năm 1930. Kết quả làm viộc của Snell E. và các cộng sự Hinh 8.18. Vitamin Bt (pyridoxin) của ông đã cho thấy pyridoxamin là các nhân tô' sinh trưởng hiệu quả hơn cho vi khuẩn và là các tiền chất trực tiếp cho dạng hoạt động của vitamin này. Các dạng hoạt động coenzym của vitamin này là pyridoxal phosphat và pyridoxamin phosphat (Hình 8.19). 362
b) Vai trò của vita m in Be Các coenzym pyridoxin rất linh động, có chức năng trong nhiều phản ứng enzym khác nhau, trong đó các axit amin, hoặc các nhóm amin được biến đổi, hoặc được chuyển đi. Loại chung nhất của phản ứng enzym cần pyridoxal phosphat là coenzym chuyên hoá amin, sự chuyển của một nhóm a - amin của axit a min cơ chất sẽ tạo ra một bazơ Schiff giữa pyridoxal phosphat gắn vối enzym và axit amin (Hình 8.19). Nhóm amin sau đó tách khỏi axit amin, chuyển nó thành một axit a-keto, được gọi là chất nhận nhóm amin, trong một phản ứng ngược với các phản ứng đã mô tả ở trên, để tạo nên một axit amin mới và enzym pyridoxal phosphat. Các phản ứng transaminaza là một ví dụ của phản ứng thay thế kép. o O' I O"-—p = o I Ỏ
ỊẼnzj- Lys -
N= c
(b) Pyrkioxamin phosphat
Bazơ Schiff
Hình 8.19. Nhóm ngoại cùa am inotransferaza (a) Pyridoxal phosphat (PLP) và amin hoá của nó lạo thành p y rid o x a m in phosphat (b) được liên kết chặt các coenzym của các aminotransferaza. Nhóm chức năng trong hoạt đọng cua chúng trong ô vuông. Pyridoxal phosphat được liẻn kết với enzym cả qua tương tác không cộng hoá trị vững chắc và tạo thành liên kết với bazd Schiff với gốc Lys ơ vị trí hoạt hoa (c).
363
Pyridoxal phosphat là cofactd của các enzym khử cacboxyl của tyrosin, arginin, axit glutamic và một sô" axit amin khác, do đó còn có tên là codecacboxylaza. Pyridoxal phosphat còn là coenzym của enzym deaminaza (dehydraza) đối với cơ chất là serin và treonin. Nhưng nhiệm vụ rất quan trọng của vitamin này là đóng vai trò coenzym vận chuyển amin (transaminaza). Đây là quá trình biến đổi thuận nghịch giữa pyridoxal phosphat và pyriđoxamin phosphat dưói tác dụng của enzym đặc hiệu. Pyridoxal phosphat còn được coi là coenzym vận chuyển nhóm sulfua từ metionin đến serin để tạo ra xystein. Sự khử nhóm sulfua của xystein và homoxystein dưới tác dụng của các enzym desulfohydraza cũng cần coenzym là pyridoxal phosphat. Ngoài ra, pyridoxal phosphat cũng cần cho sự hoạt động của kynureninaza trên con đường chuyển hoá của tryptophan và cần cho sự vận chuyển axit amin vào tế bào. Trong não có một loại enzym đặc hiệu cần coenzym pyridoxal phosphat để khử nhóm cacboxyl của axit glutamic tạo ra axit Ỵ—aminobutyric, chất này thường thấy trong chất xám của hệ thông thần kinh trung ương và được coi là chất điều hoà hoạt động của nơron. Một nghiên cứu sơ đồ tổng quát của phản ứng chuyển nhóm amin glutam ic-aspartic của Facella và Hammes đã khẳng định những phản ứng có xúc tác diễn ra theo một con đường phản ứrig giống với con đưòng phản ứng của những phản ứng không có enzym xúc tác. Hai bazơ Schiff hỗ biến cho phản ứng này đã được xác định rõ ràng như những chất trung gian phản ứng và tốc độ tạo thành chúng, quá trình chuyển hoá trung gian, sự phân huỷ đã đo được. Bước quyết định tốc độ trong quá trình chuyển nhóm imin trong trưòng hợp có, hoặc không có enzym xúc tác, là sự chuyển hoá của bazơ Schiff trung gian. 8.4.6. Vitam in B 12 và coenzym cobamit
Năm 1926, nhà sinh lý học ngưòi Mỹ Minot G.R. và Murphy W.P. đã thấy rằng, trong chế độ ăn cho bệnh nhân thiếu máu ác tính thiếu một nhân tô" sông. Một sô' quy trình đã được tạo ra, vì bệnh không thể tạo ra ỏ các động vật làm thí nghiệm nên các bệnh nhân thiếu máu ác tính phải được sử dụng để thử nghiệm khả năng chiết xuất nhân tôi’sống. Vào năm 1948, nhân tô" sông được gọi là vitamin B12, đã được phân lập ở dạng kết tinh bởi các nhóm Smith E,L. ở Anh và Rickes E., Folker K. ỏ Mỹ. a) Cấu tao và đăc tín h Để làm sáng tỏ cấu trúc của vitamin B 12 (Hình 8.20) là một vân đề khó khăn, nó được giải quyết vào năm 1957 bôi sự kết hợp phương pháp hoá học và nhiêu xạ tia X. Vitamin Bj2 là xyanocobalamin. Nó khác vói coenzym B 12 là phôi tử xyanua được thay bởi nhóm 5 -deoxyadenosyl (Hình 8 .2 0 ), đó là một dạng khác của vitamin B12 (giả vitam in S 12). 364
Trong một sô trường hợp, nhóm xyanit được thay th ế bằng nhóm hydroxyl hoặc nhóm nitơ,... được gắn vào nguyên tử coban, những hợp chất này có tên là hydroxycobalamin và nitrocobalamin. Hydrocobalamin còn được gọi là vitamin B 12a. Tất cả các đẫn xuất trên đểu có hoạt tính sinh học như vitamin B12. Vitamin B12a cũng được hấp thụ dễ dàng như vitamin B1Z, nhưng có hoạt tính mạnh hơn, và được giữ lại trong cd thể lâu hơn do đó có thể có tác dụng tốt hơn trong việc chữa bệnh.
Hlnh 8.20. Vitamin B12 (cobalamin) và các dần xuất của nó. Trong xyanacobalamin, R là xyanua; (rong clorocobalamin, R là clorua; Cobalamin tạo thành các phức chât có tên tương ứng với cac ion sulphat, hydroxyl và nitrit. Trong coenzym, R là nhóm 5’-deoxyadenosyl, thường đuạc viết tắt là DAcobalamin.
365
b) Coenzym vitam in B I2 Những cô" gắng ban đầu để tinh sạch vitamin B ,2 tồn tại ở dạng trung gian và phải sử dụng của nhũng bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu do nhiễm độc nó như một biện pháp thử nghiệm cho vitam in này. Phải có nhà máy sản xuất để thu nhận vitamin B12 từ gan, vitam in B 12 đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp. Năm 1948, nhóm nghiên cứu đứng đầu là Folkerstai ở Mỹ và một nhóm nghiên cứu đứng đầu là Smith E.L. ở Anh đã thông báo đồng thời đã tách chiết và tinh thể hoá vitamin Bi2 sạch từ gan. Xác định cấu trúc của vitamin Bia củng khó khàn như quá trình tách chiết nó. Những nghiên cứu hoá học, đặc biệt trong phòng thí nghiệm của Folkers, Smith và Todd cùng với những nghiên cứu nhiễm xạ tia X mạnh bởi Hodgkin và những cộng sự của bà, đã góp phần xây dựng nên công thức của vitamin B 12 vào năm 1957. Vitamin B;ĩ> cũng được biết đến là xyanocobalamin, có hai thành phần đặc trưng. Thành phần lớn hơn là hệ thống vòng corrin, tương tự với hộ thống vòng porphyrin của hemoglobin, trong đó có chứa 4 loại vòng pyroì nhưng có 1 cặp trong 5 vòng thành viên là liên kết trực tiếp, còn lại đều qua cầu metylen. Kết hợp vối 4 nguyên tử nitơ ỏ bên trong của hệ thông vòng corrin là 1 nguyên tử coban, đã được biết là cần thiết cho sự sinh trưởng. Thành phần chính thứ hai của vitam in B ,2 là một ribonucleotit, trong đó đặc biệt chứa bazơ 5,6 -dimetylbenzimidazol trong liên kết thưòng. a —N-glycosyl vối D-ríboza, liên kết (3 có mặt trong hầu hết các nucleotit khác. Ribonucleotit này được nôì với corrin bằng 1 Hên kết nối giữa nguyên tử nitđ khác của nucleotit và nguyên tư ooban, và bằng 1 liên kết este giũa nhóm 3’—phosphat của ribonucleotit và 1 chuỗi bên của coban, vì thế có tên là xyanocobalamin. Tuy nhiên, xyanua có mặt một sản phẩm của sự phân tách, các phức hợp tương tự vối các ion nitrit, sulphat và hydroxyl, o coenzym B12, phổi tử xyanua được thay thế bỏi nhóm 5—deoxyadenosyl (Hình 8 .2 0 ). Đó là một dạng khác của vitamin B12, giả vitamin B 13 cũng xuất hiện như là một coenzym. Coenzym B]a hay õ-deoxyadenosylcobalamin cần cho hoạt dộng của một vài enzym. Các phản ứng cần coenzym B 12 có một điếm chung là sự chuyên đổi vị trí 1 , 2 của một nguyên tủ hydro từ một nguyên tử cacbon của phân tử cơ chất tối phân tử tiếp theo, thường đồng thòi vởi sự chuyển ngược lại, hoặc chuyển vị trí 2 , 1 của một nhóm khác như hydroxyl, amin hoặc cacboxyl (Hình 8 .2 0 ). Cơ chế chính xác của phản ứng là sự kích thích riêng biệt không hoàn toàn được định rõ. Tuy nhiên, có the coenzym BVAphản ứng với một hydrua bị chuyển khỏi phân Lử cơ chất bởi một enzym, mà có ion hydrua thay th ế nguyên tử cacbon metylen của nhóm 5’—đeoxyadenosyl khỏi Hên kết của nó với nguyên tử 366
coban. Ion hydro sau đó được chuyển tới nguyên tử cacbon kế cận của cơ chất, đông thời với sự thay thê của nhóm khác được chuyển tới. Trong các phàn ứng đó, nguyên tử coban vẫn duy trì ỏ dạng coenzym (II) là chủ yêu. Phản ứng quan trọng khác của coenzym B |2 là sự khử nguyên tử cacbon 2’ của ribonucleotit 5-triphosphat. Trong loại phản ứng enzym thứ hai, vitamin B 12 có chức nâng như là một coenzym bởi vị trí kêt hợp thứ sáu của nguyên tử coban được lấp đầy bởi một nhóm metyl, đúng hơn là nhóm 5-deoxyadenosyl, hợp chất được tạo ra là metylcobalamín. Trong những phản ứng này, metylcobalamin có chức năng như là một chãt mang một nhóm metyl từ 5—metyltetraíolat tói các phân tử chất nhận, đặc biệt là homoxystein, homoxystein được metyl hoá để trở thành metionín. c) Vai trò của vita m in B Ị2 Vitamin B 12 là thành phần cấu tạo chủ yếu của coenzym B12, do đó vitamin B ,2 có vai trò cơ bản trong quá trình chuyển hoá. Khi thiếu vitamin B 12 thưòng gây ra thiếu máu hồng cầu, hoặc gây ra những tổn thương đặc hiệu của hệ thần kinh, hoặc gây ra cả hai loại triệu chứng. Vai trò của vitam in B 19 không chỉ giới hạn vào hẹ thông sinh huyết. Vitamin này còn có vai trò quan trọng trong sự tạo ra nhóm metyl, hoậc làm chất cộng tác trong những phản ứng vận chuyên metyl như trong quá trình sinh tổng hợp metionin. Vitamin B I2 còn có liên quan đến sự khử gốc monocacbon (format) để tạo thành nhóm metyl của thymin, đặc biệt là sự khử axit formic thành formaldehyt để chuẩn bị cho sự tổng hợp nhóm metyl. Vitamin B 12 tham gia vào sự tổng hợp axit nucleic (có lẽ trong quá trình metyl hoá uridin thành thymidin) và cũng có thể tham gia vào sự tổng hợp protein õ ribosom. Vitamin B 12 là chất cộng tác tvong quá trìn h biến đổi axit glutamic thành axit (3—metyl - aspartic, hoặc trong quá trình biến đổi metyl malalonyl —CoA thành sucxinyl — CoA là một chất quan trọng trong quá trình tổng hợp nhân porphyrin. 8.4.7. B ỉo ỉin (Vitamin H) và coenzym
Biotin là một yếu tố tăng trương cho nấm men và ngưòi đã được Kogl tách chiết vào năm 1935 từ 227kg lòng đỏ trứng khô và thu được lmg chất này. Cấu trúc của biotin được Vigneaud giới thiệu năm 1942. Những nghiên cứu mồ đầu do Lardy và các nhà khoa học khác đã cho thấy chức năng của biotin như một cocnzym cho các phản ứng cacboxy] hoá. a) Cấu tao và đăc tin h Biotin là một chất có cấu trúc vòng và một mạch nhánh, có mang nhóm cacboxyl. Trong cơ thổ sông, biotin thường gãn chặt với phân apoprotein tạo ra một phức hợp biotin - enzym (xem công thức coenzym 367
biotin, Hình 8.21). Biotin có thể có hình kim, không màu, dễ tan trong nước, ít tan trong rượu và khó tan trong ete. Chất này cũng bền với oxy và H 2S 0 4 nhưng dễ bị thuỷ phân bởi H 20 2, HC1 và chất kiềm. Biotin là coenzym cho hai kiểu phản ứng có enzym xúc tác. Lớp đầu tiên bao gồm cacboxyl hoá phụ thuộc ATP với sự phân cắt ATP thành ADP và Pvc. OH (d ạ n g e n o l)
ì / ' XNH \ /
/
N h ó m u re íd o (d ạ n g keto) HN^
' 'N H
s
ch 2
^ch2"
O’ /= 0
V a le r a t H ìn h 8 .2 1. B io t in
o C II3 — C — S C o A
o +
C0
2
+
ATP
------ ► I I O O C - C H
2
—
c
— SCoA
+ ADP
+ p vc
Kiểu thứ h a i‘của phản ứng có enzym xúc tác phụ thuôc biotin, ví dụ: phản ứng xúc tác bởi metyl malonyl oxaloaxetat transcacboxylaza (metyl malonyl CoA: pyruvat cacboxitransferaza) trong đó nhóm cacboxyl được trao đổi giữa hai cơ chất. Những nghiên cứu chứng tỏ rằng, biotin liên kết lỏng lẻo vói enzym phụ thuộc biotin và tồn tại dạng E-N-biotinyllysin (bioxytin). Trong những nguồn tự nhiên cho thấy, biotin có thể liên kết cộng hoá trị vối coenzym của nó qua một liên kết amit giữa nhóm e-am in của lvsin trong enzym với nhóm cacboxyl của nhóm ngoại axit valenic trong biotin. Lanen và Lynen khẳng định rằng, đây là những trường hợp cho enzym propionyl cacboxylaza và nó biểu hiện giống vối những enzym biotin khác, đặc biệt là axetyl cacboxylaza. Kết quả những nghiên cứu cho thấy, các quá trình cacboxyl hoá phụ thuộc biotin thực hiện theo hai bước có liên quan đến sự tạo thành hợp chất trung gian cacboxyl biotin liên kết enzym. C0 2 + ATP + biotinyl-enzym------> ADP + Pw+ cacboxy-biotinyl—enzym Cacboxy—biotinyl— enzym + cơ chất-------> biotinyl-enzym + cacboxy-cơ chất 368
b) Vaỉ trò sin h hoc của bỉotỉn Biotin có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá. Nó tham gia vào nhũng phản ứng hoạt hoá và vận chuyển nhóm C 02; dưới tác dụng của axetyl —CoA cacboxylaza, nhóm C 0 2 trên phức hợp biotin enzym được vận chuyển đến axetyl - CoA để tạo thành malonyỉ - CoA, đây là bưốc khởi đầu quan trọng của quá trình tổng hợp axit béo ngoài ty thể. Dưối tác dụng của propionyl — CoA cacboxylaza, biotin vận chuyển nhóm C 0 2 từ metylmalonyl - CoA sang cho pyruvat để tạo thành oxaloaxetat. Biotin còn tham gia vào quá trình tổng hợp cacbamyl phosphat tham gia vào quá trình tổng hợp nhân purin, biotin vận chuyển nhóm C 0 2 đến để tạo ra C6 của nhân này. Ngoài ra biotin còn liên quan gián tiếp đến sự hoạt động của nhiều hệ enzym deaminaza của một số axit amin như aspartat, serin và treonin,... Trong lòng trắng trứng có một số chất glycoprotein gọi là avidin, khốỉ lượng phân tử vào khoảng 70.000 Dal, gỗm 4 chuỗi polypeptit, mỗi chuỗi đều có tác dụng gắn chặt với một phân tử biotin. Dưới dạng phức hợp này, biotin không được hấp thụ qua màng ruột, do đó avidin là chất chông biotin. 8.4.8. Axit fo lic
a) Cấu tao và đặc tín h Ỹ H* N
^
'
c r ^
c -
__ c h 2- n
-
0
V
/
H
Ỉ - N - C - c h 2- c h 2 -
'— ---2-Amino-4 hydroxyl -6-mctylpíerin
CO O H
“H ÌOOH
Axit p-aminobenzoic
Axit glutarrúc
Axit pteroic Axit pteroylglutamic (axit íblic) h , oh )H
ụ
N a' 4^ I
II
H2N - c 4 ’ ^
N
°
N £ -C H 2 - N - 4 IT| \ h) c
ịjN ’ íỉ
H
H
C —N —C —CH2—CH2 —COOH /
v—^
I
H
I
COOH
Axit tetrahydro&lic (FRị)
Hinh 8.22. c ấ u trúc của axit folic và tetrahydrofolic 4 nguyên tử hydro (chữ đậm) đuợc gắn thêm vào axit folic tạo thành axit tetrahydrofolic. Cac nguyen tử niiỡ N5 và N10 tham gia và sự vận chuyển các nhóm một cacbon.
369
Axit folic (tiếng Latin là folium nghĩa là lá) được tìm thấy lần đầu tiên trong lá bina (spinach), sau đó thấy nó phân bố rộng trong thực vật. Axit folic rấ t cần thiết đối với sự sinh trưỏng của người và động vật. Khi thiếu h ụ t nó, động vật sinh trưởng kém và sinh ra bệnh thiếu máu. Ớ các vi khuẩn, nấm men, thực vật bậc cao có khả nâng tổng hợp được axit folic. Đây là một nhóm chất tương tự nhau về cấu tạo hoá học cũng như về tác dụng sinh học. Triệu chứng hoá sinh dễ nhận thấy nhất của sự thiếu hụt axit folic là sự suy yếu tổng hợp purin và pyrimidin tymin. Trong một số' sinh vật cần có axit folic như s. faecalis, nhu cầu dinh dưỡng đổi với axit folic có thể nhận được bâi tymin và adenin. Tuy nhiên, sự khám phá quan trọng là axit folic và các dẫn xuất của nó có chức năng phổ biến liên quan với sự vận chuyển các phức chất một cacbon. Cấu tạo của axit folic, gồm 3 thành phần: preridin, axit aminobenzoic và axit glutamic. Axit folic còn được gọi là axit pteroylglutamic hay folaxin (Hình 8.22). Pteridin là vòng kép chứa nitơ, hợp chất của pterin, là dẫn xuất 2 -amino—4 hydroxypteridin. Trong nhóm axit folic, người ta thường OH 1 nói đến vitamin BC, vitamin M, yếu tố u , /CL N. yếu tô" R và yếu tố Streptococus lactic R N c C—OH ■ I II i (SLR). Người ta đã phân lập được từ gan nhiều dẫn xuất của axit pteroic như axit NH- C^ % - CH folinic (feucovorin) và rhizopterin. Axit Hình 8.23. Xantopterin folinic là dạng khỏ của axit folic có mang (2^am ino-4,6-d»hydroxynhóm formyl ở vị trí N5, còn rhizopterin là pterin) dẫn xuất có mang gốc formyl ỏ vị trí N 10 của axit pteroic (Hình 8.22). b) Vai trò sin h học của axit folic Một số pterin như xantopterin hay margin (Hình 8.23) cần cho sắc tô mắt và sắc tô* bảo vệ côn trùng. Pterin có m ặt trong axit folic là 6 -m etyl-pterin. Một sô" sinh vật chỉ cần axit p— aminobenzoic của axit folic, chúng có thể tổng hợp axit folic nếu axit p-aminobenzoic có sẵn. Axit folic tự nó không có hoạt tính coenzymnhưng nóđược chuyển hoá bởi sự khử thành coenzym hoạt động dạng axit tetrafolic (Hình 8.22). Các nghiên cứu vể enzym và sự trao đổi chất đã cho thấy rằng, dạng coenzym của axit folic có chức năng vận chuyển các nhóm một cacbon trong các con đường sinh tổng hợp. Axit folic được biến dổi do sự khử trong hai bưóc thành dạng coenzym của nó là axit tetrahydrofolic (viết tắ t là FH4) (Hình 8.22). Bưổc cuối cùng trong quá trình này là khử axit dihydrofolic được xúc tác bởi axit dihydrofolic reductaza: NADPH + H+ + axit dihydrofolic —» NADP++ axit tetrahydrofolic 370
8.4.9. Coenzym quỉnon
_ch3 ch3 ch3 ch3 rCH2-CH=(*:-CH2- (CHj-CH=é- CHjV-CH2-CH=:(i—CH3 Ubiquinon: chuyển điận tửtrong ty thể (coenzym O) (n =4,8) CHị 0ỈI3 CH3 f CHỉ-CH=C—CHj-i-(CH2“CH=Ổ— CHj- CH=ổ—CH3 Ubiquinon: chuyển điện tử trang lục lạp (5 = 4,8)
CH'j
CH3
CH 3
CHj- CH=C-CH2-(CH^CHì-ổH—CH3)—-CH}iCH3-Ì1I—CHs CHj
Vitamin «!■' cofactor gảy đỏng máu
CH3 ch3 ch3 ch2Ich2- ch2- CH-CH2-í-CHì-CHa-Ổh- ch2^ch2- ch2-Ìh- ch3 Vitamin E: antìoxidant (a-tocopherol)
(CHỉ-CH=C—CHjJnH Vitamin K2: I (Menaquìnon, n =6 - 7 hoạc 9) CH3
Hj 9^ I C—c=c—c-ftg-H H
Ubíquinon: (UQ) {oxy hoá hoàn toàn)
H*+eCH.O
CH H
^
4_
Gốc semiquinon (UQH*)
UM 1^ 'j.rig Ubiquinon: (UQH2) CH30 v^ L UC—0= 0 -0 -}^H (Khửhoàn toàn) if T f H* CH30 Ỵ ch, OH Hình 8.24. Ubiquinon (UQ hoặc coenzym Q) mang điện tử của chuỗi hô hấp
371
Coenzym này được gọi là coenzym Q hay ubiquinon, trên thực tế có hàng loạt coenzym quinon, đều là dẫn chất của benzo—quinon và đều có một mạch nhánh dài gồm nhiểu gốc terpen. Mạch nhánh này mỗi chất có chiều dài khác nhau, nghĩa là có số lượng (n) gôc terpen khác nhau. Coenzym Q ò sinh vật thường có mạch nhánh terpen ngắn. Ở động vật có vú, coenzym này thường có mạch nhánh dài tới 1 0 gổc terpen, Q. 1 0 (n = 1 0 ). Tất cả các chất này đều có chức năng hoá sinh giông nhau, đều là những coenzym oxy hoá khử. Nhờ có khả năng biến đổi thuận nghịch giữa dạng quinol và quinon, các chất này thường tham gia vào quá trình oxy hoá khử giữa những dehydrogenaza và xytocrom b trong chuỗi hô hấp tế bào của ty thể. Ở thực vật, người ta thường thấy plastoquinon là chất có cấu trúc và chức năng tương tự. Vitamin K là cofactd cần cho sự đông máu bình thưòng. Vitamin Kj (phylloquinon) được tìm thấy trong lá xanh thực vật, vitamin K2 (meraquinon) được hình thành bồi vi khuẩn có trong ruột động vật. 8.4.10. A xit lipoic
Axit lipoic được tách chiết đầu tiên S—S ở dạng tinh thể từ dịch chiết không hoà c H ịC H ịC H ịC H2C O jS tan trong nước của gan bò. Quá trình 0
đặc hiệu dihydrolipoic dehydrogenaza. Axit lipoic liên kết cộng hoá trị vối phức hệ loại hydro tương ứng trong phản ứng tổng quát qua một liên kết amit giũa nhóm chức năng cacboxyl của coenzym và một nhóm e-amin của gốc lysin. Sự tạo thành và thuỷ phân của liên kết amit này được xúc tác bởi một syntetaza phụ thuộc ATP đặc hiệu và một hydrolaza. 8.5. C Á C CO EN ZYM KH ÁC 8.5.1. Glutathỉon
Cấu trúc của glutathion là một tripeptit phổ biến trong hệ thống sống. Năm 1929, Hopkins xác định là 8 -L-glutamyl-L-xysteinylgIyxin. COOH
o
H
CHCH2— SH V H II I HzN —
Mặc dù rấ t nhiều chức năng sinh học và hoá sinh được giả thiết cho glutathion từ khi khám phá ra T1Ó, nhưng những trưòng' hỢp mà glutathion đóng vai trò là coenzym thì còn khá ít, Trong đó phản ứng được xúc tác bởi glyoxilaza được nghiên cứu rộng rãi.
9
9H
ỵ°
CH3 — C— c
c h 3— H
cooh
(8.14)
H
Sự chuyển hoá của metyl glyoxal thành lactat xảy ra theo hai bước. Bưóc đầu được xúc tác bỏì glyoxilaza I, tạo thành este lưu huỳnh của lactat và glutathion; bưóc thứ hai, được xúc tác bỗi glyoxilaza II, kết quả trong quá trình thuỷ phân este lưu huỳnh này tạo thành lactãt và tái tạo glutathion. Các nghiên cứu cho thấy rằng, thiohemiaxetat của metyl glyoxal và glutathion là một cơ chất cho phản ứng có enzym glyoxilaza I xúc tác và hydro ỏ cacbon a của' lactat có nguồn gốc từ hydrocacbonyl của metyl glyxal, đúng hơn là có nguồn gốc từ dung môi cho thấy rõ rằng, phản ứng có glyoxilaza xúc tác kèm theo sự thay đổi hydrua (hợp chất chớa hydro và một nguyên tô khác) bên trong của chât trung gian thiohemiaxetal. _ o
H
C h h - C - C — s — glutathion
o
O-J
----------► CH 3- C - C ~ S — glutathion
<8 -15)
H 373
Frazen đã cải biến mô hình mẫu đơn giản cho phản ứng glyoxilaza. Phenyl glyoxal được chuyển hoá hoàn toàn thành axit mandelic trong dung dịch ở nhiệt độ phòng khi có mặt N,N-dimetyl-(3-mercaptoetylamin. Những lưu huỳnh đơn và amin đơn là chất xúc tác cho những phản ứng này, mặc dù chỉ một hỗn hợp của hai nhóm này thường ít hiệu quả. Nhóm lưu huỳnh tự do cần cho hoạt tính xúc tác vì ete thiometyl của chất xúc tác ở trên là không hoạt động. Tuy vậy, dẫn xuất trimetyl amoni của chất xúc tốc ở trên hầu như không có hoạt tính xúc tác, cho thấy sự cần thiết của một vị trí cơ bản trên phân tử xúc tác. Phản ứng mô hình mẫu như là trường hợp glyoxilaza I, thực hiện quá trình vận chuyển hydro bên trong. Trên cơ sở lý thuyết này, cơ chế phản ứng được mô tả như sau: ch3
ch3
\ ỉ?
Ỹ ? C— c
/CH 3 + HS— CH2— CH2 — H
nC
/ x 012
^
s ----- -CH2 H
/C H 3
h ĩ^ c h 3 ọ —
^
c
° C — s — CH2
V" c o 2h
+
hs
— c h 2 — CH2
N(CH3)2
“ ù (8.16) Glutathion cũng đóng vai trò như một coenzym trong phản ứng enzym formaldehyt dehydrogenaza. H2C = 0 + NAD++ H20 H C 02H + NADH + H+ (8.17) Và trong phản ứng có maleyl axetoaxetat isomeraza xúc tác. H ^ /C C ^ H H
Y ^ Y ^ ' C O jH o O Và một số phản ứng khác.
8.5.2. S-adenosyt-m etionin
Trong hoá sinh, phản ứng metyl hoá là loại phản ứng mà metionin là chất cung cấp nhóm metyl quan trọng nhất. Nhóm metyl trong metionin 374
được kết hợp bằng Hên kêt thioete, thế năng vận chuyển của loại liên kết này rất thấp. Vì vậy quá trình vận chuyển nhóm metyl phải qua một giai đoạn hoạt hoá trung gian bằng cách gắn một phân tử adenosin (của ATP) vào metionin, tạo nên hợp chất S—adenosyl-metionin. Trong dạng hợp chất này, nguyên tử lưu huỳnh (S) trở thành ion sulfonyl và có tính quang hoạt. Do tác dụng của ion sulfony], nhóm metyl được ìon hoá dễ dàng thành carbanion, chuẩn bị cho quá trình vận chuyển nhóm metyl đến chất tiêp nhận. Sau khi tách nhóm metyl ra, phần còn lại là một phân tử adenosyl homoxystein, phân tử này sẽ được tách ra khỏi nucleosit và được metyl hoá trỏ lại theo raột cơ chế có axit tetrahydrofolic tham gia. S-adenosy]metionin + cơ chất —»ađenosylhomoxystein + metyl-cơ chất Adenosylhomoxystein —*■homoxystein + adenosyl (8.19)
Hỉnh 8.27. S-adenosylmetionin
8.5.3. Coenzym protein sắt
Người ta phát hiện thấy tầm quan trọng của một số protein có hoạt tính oxy hoá khử có chứa sắt làm nhóm chức năng, nhưng không phải là sắt của hem, Những protein này thấy phồn lỏn ồ các loại te bào và tham gia vào rấ t nhiều loại phản ứng khác nhau như phản ứng găn nitơ, phản ứng quang hợp và nhiều phản ứng gắn nhóm hydroxyl. Apoprotein của nhũng enzym này thường có khối lượng phân tử thấp, có mang 1 , 2 , 4 , 6 hoặc 8 nguyên tử sắt. Các nguyên tỏ sắt được kết hợp bằng liên kết phối trí vói các nguyên tử lưu huỳnh cua xystein của apoprotein. Trong một sô' trường hợp, những liên kết phối trí của sắt chưa sỏ dụng hết, dược kết hợp với những phân tử lưu huỳnh vô cơ và có dạng cấu trúc như sau: 375
s Protein
w Fe
s
s
Fe
Protein
AA s
Trong một số' protein loại này như rub redo xin (6.000 Dal) của các vi khuẩn quang hợp thì 1 nguyên tử sắt phối trí vối 4 xystein của apoenzym (số 6 , 9, 38 và 41 của chuỗi peptit bậc một có 53 gốc). Trong ferredoxin của Azotobacter (13.000 Dal) có 6 nguyên tử sắt phối trí vói 1 2 xystein và 6 lưu huỳnh (S). Sắt tham gia vào thành phần cấu tạo của các loại cấu trúc này có khả năng biến đổi thuận nghịch giữa trạng thái sắt III và sắt II, do đó sắt là chất trực tiếp vận chuyển điện tử. Trong trưòng hợp này, phản ứng khử xảy ra vói thế năng oxy hoá khử rấ t thấp (-0,4 volt). Đôi với ferredoxin, hình như chính cấu trúc của chuỗi peptit đâ gây ra những sự biến động trong các quỹ đạo điện tử của sắt và do đó đã ảnh hưởng trực tiếp đến thế năng oxy hoá - khử và làm cho ferredoxin ở dạng khử trỏ thành một trong nhũng chất khử m ạnh của tế bào. Các yếu tố này tham gia vào những phản ứng đưa C 0 2 gia nhập vào thành phần cấu tạo của chất hữu cơ không qua con đường quang hợp. Với pyruvat syntetaza, có sơ đồ phản ứng như sau: Axetyl - CoA + C0 2 + ferredoxinkhừ—*■pyruvat + CoA + ferredoxirVyhoa Cấu trúc đơn giản của những protein này gợi lại những cấu trúc phân tủ lớn có hoạt tính oxy hoá - khử xa xưa của th ế giới sinh vật. Một sô kim loại khác n hư đồng (Cu) trong ascorbic oxidaza và uricaza cũng có vai trò tương tự như vai trò của sắt kể trên.
CÂU HỎI ÔN T Ậ P
1. Coenzym là gì? 2.
Thế nào là coenzym nucleotidtriphosphat? cho ví dụ. 3. Thế nào là vitamin liên quan đến coenzym? cho ví dụ
376
Chương 9
ISOZYM 9.1.
ĐẠI CƯƠNG V Ề ISOZYM
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng, hoạt động của một sô" enzym có thê được điều khiển qua cấu trúc phân tử của chúng. Nhiều enzym được tìm thấy dưới những dạng phân tử khác nhau trong cùng một loài, thậm chí trong cùng một tế bào do chúng là nhũng phân tử đặc biệt có độ tích điện khác nhau. Những enzym như thế được gọi là isoenzym hay isozym. Như vậy, isozym là các protein khốc nhau xúc tác cho một phản ứng (Lehninger, A.L., Nelson, D.L. và Cox, M.M., Principles of Biochemistry). Một trong những enzym được tìm thấy các dạng isozym sớm nhất và được nghiên cứu nhiều nhất là Iactat dehydrogenaza (LDH). LDH có trong các mô động vật có xương sống với ít nhất 5 loại isozym khác nhau khi phần chia nhờ điện di. LDH được tách chiết và tinh sạch từ mô chuột, cả 5 dạng isozym LDH đều xúc tác cho cùng một kiểu phản ứng, nhưng chúng vẫn có nhũng giá trị Km và V cụt (iại khác nhau với cùng cơ chất. Các isozym của LDH có khôi lượng phân tử giống nhau, khoảng 134.000 Dal và đều chứa 4 chuỗi polypeptit, mỗi chuỗi có khối lượng phân tử là 33.500 Dal, song 5 dạng isozym này có tỷ lệ khác nhau của hai loại polypeptit về phức hợp và trình tự. Chuỗi A (hay còn gọi là chuỗi M-muscle, chiếm ưu th ế trong cơ) vầ chuỗi B (còn được gọi là H - heart, chiếm ưu th ế trong tim). Trong cơ xương, isozym chiếm ưu th ế có 4 chuỗi A, ký hiệu là A 4 (hay M4); và trong tim, isozym chiếm ưu th ế có 4 chuỗi B, ký hiệu là B 4 (hay Hj). Các isozym của LDH trong những mô khác nhau là hỗn hợp của 5 dạng isozym, chúng được gọi là Aj, A3B, A2B2, AB3 và B, (hay M4, M 3H, M a i, MH3 và H4). Các chuỗi đơn M(A) và H(B) đã được phân lập và tìm thấy hoạt tính enzym, chúng khác nhau đáng kế về thành phần và trình tự các axit amin. Tất cả các isozym khốc nhau của LDH đều được tạo ra trong thí nghiệm khi tổ hợp các chuỗi M và H theo tỷ lệ tương ứng thích hợp: M M
M M
M M
M H
H
H
H H H H H H M H M M Các nghiên cứu cũng đã cho thấy rằng, 2 chuỗi polypeptit M và H được mả hoá bởi 2 gen khác nhau, từ đó tạo nên nhũng dạng isozym 377
LDH khác nhau trong những tê bào nhất định và dược điểu hoà ồ mức độ gen. Hình 9.1 giới thiệu các isozym LDH tồn tại trong các mô khác nhau với tỷ lệ khác nhau. Tính chất của isozym lactat dehydrogenaza là làm giảm nhanh nồng độ pyruvat thành lactat trong xương, ngược lại isozym H 4 lại có khuynh hướng oxy hoá nhanh lactat thành pyruvat ỏ trong cơ tim. Sự phân biệt các dạng isozym khác nhau của enzym phản ánh ít nhất 4 yếu tố: ( 1 ) Các kiểu trao đổi khác nhau trong các cơ thể khác nhau. Hai dạng glycogen phosphorylaza tìm thấy trong cơ xương và gan khác nhau về tính chất điều hoà của chúng, phản ánh vai trò khác nhau của sự phân giải glycogen trong 2 mô này. (2 ) Sự định vị khác nhau và vai trò trao đổi của enzym bên trong của một loại tế bào. Ví dụ; các isozym isoxitrat dehydrogenaza của tế bào chất và của ty thể. (3) Sự khác nhau và sự phát triển của các mô trưởng thành từ phôi, hoặc các dạng bào thai, Ví dụ: isozym lactat dehydrogenaza gan thai có đặc tính sai khác qua các giai đoạn phát triển của nó. Điều đáng chú ý là: một số enzym của quá trình trao đổi glucoza trong các tế bào ung thư ác tính tương tự như các isozym của bào thai chưa trưởng thành. (4) Có sự điều chỉnh tốt tốc độ trao đổi qua sự đáp ứng khác nhau của các dạng isozym đến các chất điều biến dị lập thể (alloster-ic). Ví dụ: các isohexokinaza D (glucokinaza) của gan và các isozym hexokinaza ở các mô khác có sự nhạy cảm khác nhau về sự ức chế bồi các sản phẩm của chúng là glucoza- 6 -phosphat. M4 m3h
M2h2
mh3
h4
ị Gan Cơ hoành Tim
* Thận # I
I
ề
#
•
*
,
,
I
#
*
ề
ề
t
Bắt đầu + Hình 9.1. Mối quan hệ số luợng của các isozym lactat dehydrogertaza trong các mõ của chuột nhắt trưởng thành được xác định bởi các vùng điện di trẻn gel tinh bột. Dịch chiết được cho vào điểm bắt đầu. 4 isozym di chuyển về cực ẳni ở pH đả lựa chọn. Kích thước và tỷ trọng của các vết phẳn ánh số lượng isozym. Các isozym của LDH đươc đât tên là M4l M3H, MH3 và H4.
378
Nhiều enzym khác nhau được biêt hiện nay tồn tại dưới dạng isozym. Trong mỗi trường hợp, các isozym được tim thấy có chứa nhiều tổ hợp thay đổi của các chuỗi polypeptit khác nhau. Thường thì các isozym của một sô' enzym nhất định khác với những isozym khác ở các đặc tính động học. Nghiên cứu các isozym có ý nghĩa về nghiên cứu cd bản là cơ sở phân tử của sự biệt hoá tê bào và sự phát triển hình dạng. Ngưòi ta cho rằng, nhiều protein trong các tế bào (không chỉ là những protein cô hoạt tính xúc tác) có thể tồn tại ở nhiều dạng có chứa các tổ hợp của các phần dưới đơn vị khác nhau được mã hoá bỏi các gen khác nhau. 9.2. ISOZYM LA C T A T DEHYDROGENAZA 9.2.1. S ự khử pyruvat thành lactat
Trong giai đoạn cuối của quá trình đường phân, pyruvat bị khử thành lactat phải sử dụng các điện tử từ glyxeraldehyt - 3 - phosphat. Các điện tử này do NADH mang đến. Phản ứng khử được xúc tác bỏi lactat dehydrogenaza, enzym này đã được tách chiết ở dạng tinh thể. Pyruvat + NADH + H+
lactat + NAD*
Sự cân bằng của phản ứng này chuyển về bên phải, điều đó được chứng minh bằng giá trị âm của Gơ. Lactat dehydrogenaza được tạo thành ở những dạng phân tử khác nhau, hay còn gọi là các isozym. Trong các động vật, cốc dạng này khác nhau về ái lực của chúng vái cơ chất. Trên con đường đường phân, phản ứng này hoàn thành chu trình oxy hoá khử. Lactat là sản phẩm cuối cùng của quá trình đường phân dưới điều kiện kỵ khí và nó được chuyển qua màng sinh chất của tê bào đên lớp nưốc bao bọc bên ngoài. Khi các tế bào cơ của động vật bậc cao hoạt động mạnh trong điều kiện kỵ khí, lactat được thoát từ các tế bào cơ đi vào máu với một lượng lớn và khôi phục lại lượng glucoza trong gan. Sự mỏi và cứng đờ các sợi cd là do sự axit hoá khi phân tử glucoza bị phân giải thành 2 phân tử axit monocacboxilic. 9.2.2. Sự kiểm soát quá trình đuông phân bỏỉ isozym lactat dehydrogenaza
Lactat dehydrogenaza là enzym cần thiết để chuyển hoá glucoza trong điều kiện yếm khí. Lactat dehydrogenaza chủ yếu có trong ty thể, lạp thể, trong nguyên sinh chât của tê bào và chỉ có một lượng không đáng kể trong huyết thanh. Các isozym lactat dehydrogenaza được tạo thành do 2 loại chuỗi polypeptit (M và H) trong 5 kiểu kết hợp: M4, M3H, M2H2, MH3, H4. Các 379
isozym M 4 và M3H chiếm ưu thế trong các mô phụ thuộc cao về năng lượng của quá trình đường phân. Ví dụ: cơ xương trắng và các mô phôi. Các isozym MH 3 và H 4 chiếm ưu th ế trong các mô hiếu khí hoàn toàn hoặc trao đổi hô hấp. Khi nghiên cứu tính chất động học của các isozym lactat dehydrogenaza khác nhau cho thấy, ở các mô có quá trình đường phân chuyển hoá nhanh có ái lực cao đối vói pyruvat, còn các mô có liên quan đến hoạt động hô hấp thì ái lực thấp với pyruvat. Các enzym lactat dehydrogenaza có m ặt trong quá trình đưòng phân của các cơ đã ảnh hưởng đến sự oxy hoá lại pyruvat của NADH đối với sự hình thành lactat, vì các isozym có trong cơ hiếu khí phản ứng yếu với pyruvat, và vì vậy NADH tồn tại nhiều hdn do sự oxy hoá hiếu khí của ty thể, Sự tổng hợp các isozym lactat dehydrogenaza khác nhau được điều khiển chưng, vì sự điều hoà các phản ứng tạo năng lượng có liên quan đến giai đoạn phát triển, hoặc sự biệt hoá tế bào. 9.3. ISOZYM H EXO KIN AZA
Sự phosphoryl hoá D - glucoza ở vị trí thứ 6 bởi ATP tạo thành D glucoza - 6 - phosphat, phản ứng này được xúc tác bởi 2 loại enzym hexokinaza và glucokinaza do sự khác nhau ở gổc đưòng đặc hiệu của chúng. Phản ứng đối vổi hai loại enzym là: ATP + a -D - glucoza -—1** .. >ADP + a-D - glucoza - 6 phosphat AG°’ = - 4,0kcal Hexokinaza là một enzym quan trọng có ỏ hầu hết ỏ trong các tế bào. Nó xúc tác cho quá trình phosphoryl hoá không chỉ đôì với D - glucoza mà còn vói nhiều hexokinaza khác nhau như: D - fructoza, D - manoza và D glucozamin, Nó có ái lực với aldohexoza cao hơn ketohexoza. Hexokinaza được tìm thấy trong nấm men, vi khuẩn. Chúng đã được tách và kết tinh (khối lượng phân tử 96.000 Dal). Hexokinaza của não động vật có sự tồn tại khác nhau ồ dạng đa phân tử, có thể phân chia hexokinaza thành các phân tử isozym khác nhau bằng điện di. Hexokinaza xúc tác cho quá trình glueoza tự do đi vào con đường đường phân. Glueoza được chuyển từ máu vào tế bào, làm cho nồng độ glucoza cao, vì vậy hexokinaza hoạt động trong điểu kiện nồng độ glucoza cao. Ớ cơ chuột, hexokinaza bị ức chế điều hoà bởi sản phẩm của nó là glucoza —6 —phosphat. Mỗi khi nồng độ glucoza —6 —phosphat cao, hexokinaza tạm thời bị ức chế, sự cân bằng phản ứng được thiết lập lại ỏ trạng thái bền vững. Ỏ các động vật có vú, có một sô" dạng hexokinaza đều xúc tác cho sự 380
biên đôi glucoza thành glucoza —6 phosphat. Các enzym khác nhau này cũng xúc tác cho phán úng trên được gọi là các isozym hexokinaza. ở trong gan, isozym hexokinaza chiếm ưu th ế được gọi là hexokinaza D, hay củng được gọi là glucokinaza, nó có hai sự sai khác đặc biệt so vổi các isozym hexokinaza có trong cơ. ( 1 ) Nong độ glucoza gan (ở đó có hexokinaza) bán bão hoà (khoảng lOmM) cao hơn nồng độ glucoza bình thường trong máu, vì nồng độ glucoza trong gan phải duy trì ở một mức độ giới hạn so với nồng độ glucoza trong máu do khả năng vận chuyển glucoza. Tính chất này được điều hoà trực tiếp bởi glucokinaza và phụ thuộc vào nồng độ glucoza trong máu. Trong khi nồng độ glucoza trong máu cao, như sau bữa ăn giàu polysaccarit, glucoza sẽ vượt qua giới hạn và được chuyển vào gan, khi đó glucokinaza sẽ biến đổi glucoza thành glucoza —6 - phosphat. (2 ) Glucokinaza không bị ửc chế bỏi sản phẩm của phản ứng của nó mà bị ức chế bởi fructoza - 6 - phosphat, chất đồng phân của nó. Chất đồng phân này luôn luôn được cân bằng với glucoza —6 —phosphat bởi sự xúc tác của phosphoglucoza isomeraza. Sự ức chế hoạt động của glucokinaza bởi fructoza - 6 - phosphat được hạn chế khi thêm một loại protein điểu hoà. protein diều hoà này cũng có ối lực đôi với fructoza 1 - phosphat, nố cạnh tranh vâi fructoza - 6 - phosphat và loại bỏ ảnh hưởng ức chế lên glucokinaza, mà fructoza - 1 - phosphat lại là sán phẩm trung gian khi có fructoza trong máu. Đặc tính này eủa protein điều hoà đã giải thích rằng, sự hấp phụ fructoza làm kích thích sự phosphoryl hoá của glucoza ỏ trong gan. Tê bào p —tuyên tuỵ có chức nàng tiết insulin khi nồng độ glucoza trong máu tăng lên trcn bình thường, bao gồm cả glucokinaza và protein điểu hoà ức chế. 9.4. C Á C ISOZYM TRO N G Q UÁ TRÌNH BIỂN Đ ổ l A S PARTAT
Trong tế bào E. coli có sự phốĩ hợp tổng hợp lysin, metionin, threonin và isolơxin, tấ t cả được hình thành từ aspartat (Hình 9.2). Các bước từ aspartat đến aspartyl —p —phosphat được xúc tác bởi 3 dạng isozym. Từ aspartat —(3 —semialdehyt đến homoserin được xúc tác bởi 2 dạng isozym. Từ threonin đến a - ketogìutarat được xúc tác bởi 2 dạng isozym. Mỗi một isozym phụ thuộc vào sự kiểm soát của các tác nhân điều khiên khác nhau. Sự biến đổi từ aspartat đên isolơxin qua nhiều giai đoạn. Sự ức chế hoán ngược âm tính chồng lên nhau. Ví dụ: isolơxin ức chê sự biến đổi của threonin thành a —ketoglutarat. Threonin lại ức chê sự biến đổi của aspartyì —p —semialdehyt và homoserin,... Sự hoạt động chung này gọi là ức chế hoàn ngược thứ tự. 381
--------,------í
Ạ'
aspartat
I
i
ỉ
Ai ®•
í
a s p a rty H Ỉ-p h o s p h a t
Ị '- ®
a s p a r t a t- -se m ia lớ e h y t
_^ il»@ihomoserin
ìs o lo x in
Hinh 9.2. Mạng liên kết của cơ chế điếu hoà trong sinh tổng hợp một số axit amin dược hình thành từaspartat trong E co//.
Ba enzym (A, B, C) có 2 hoặc 3 dạng isozym được ghi bằng các chữ số. Trong mỗi trường hợp của isozym (A?, B„ Cj) được giới thiệu không có sự điều chỉnh điều hoà mà đuạc điều chỉnh bởi sự thay đổi số lượng tổng hợp ở mức độ di truyền. Sự tổng hợp của các isozym A ị vá B, bị kìm hàm bỏi khi lượng metionin cao và sự tổng hợp isozym c 2 cũng bị kìm hãm ® khi isolơxin ô mứt độ cao. Enzym A là aspartokinaza; B là homoserin dehydrogenaza; c là threonin dehydrogenaza.
9.5. ISOZYM SU CXIN YL - C o A SYN TETAZA
Sucxinyl —CoA syntetaza hay còn gọi là sucxinic thiokinaza, enzym này hoạt động có sự tham gia của phản ứng nucleosit triphosphat: ch2
—coo
Ị
CH2
C—s. ĩ
GDP 4-Pvc GTP
^
CoA
~
y _
CoA— SH
coo
7
CH2
sucxinyl-CoA syntetaza
AG°’ = - 2 ,9 k J/m o l
382
Ì h2
ioo' sucxinat
ở các mỏ động vật, enzym này chỉ sử dụng dạng GDP, ngược lại ở các mô thực vật và vi khuẩn thì ưu thế sử dụng lại la ADP. Hiện nay ở một số’ tê bào động vật có hai loại isozym, một loại chuyển hoá ADP và một loại chuyển hoá GDP.
V7 'Sucxinyl-CoA Oil 1 ”
< A r Hỉnh 9.3. Các bước trung gian trong phàn sucxinyl - CoA syntetaza. Trong bước 1, sucxinyl CoA tách nhóm CoA và liên kết với nhóm phosphat và enzym sucxinyl-CoA syntetaza tạo Ihành axyl phosphat năng lượng cao. Trong bước 2, sucxinyl phosphat cho nhóm phosphat liérj kết với gốc His của enzym tạo thành enzym phosphohistiđyl năng lượng cao. Trong bưức 3, nhóm phosphat được chuyển lừ gốc His đến gốc phosphat cuối của GDP để tạo thảnh GTP.
Phản ứng bảo tồn năng lượng này có một bước trung gian trong đó phân tử enzym tự nó tiến hành phosphoryl hoá ỏ gốc His ở vị trí trung tâm hoạt động (Hình 9.3). Nhóm phosphat có tiềm năng chuyển nhóm cao, nó dược chuyển đến ADP (hoặc GDP) tạo thành ATP (hoặc GTP). Sự tạo thành liên kết của ATP (hoặc GTP) tiêu tốn năng lượng, năng lượng này được giải phóng bởi oxy hoá decacboxy hoá của a-ketoglưtarat, đó là 383
một ví dụ khác của sự phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất giông vái sự tổng hợp liên kết ATP do sự oxy hoá của glyxeralđehyt - 3 - phosphat trong quá trìn h đường phân. Phản ứng này được gọi là sự phosphoryl ỏ mức độ cơ chất, nó phân biệt với sự oxy hoá, hoặc sự phosphoryl hoá liên kết hô hấp. Sự phosphoryl hoá mức độ cơ chất như gốc phosphohistidin trong sucxinylCoA syntetaza hoặc 1,3-bisphosphoglyxerat trong con đường đường phân. Sự phosphoryl hoá liên kết hồ hấp gồm các enzym liên kết màng và các gradient chuyển màng của các proton. GTP được tạo thành do sucxinyl—CoA syntetaza có thể cho nhóm phosphat CUỐI của nó đến GDP dể tạo thành ATP do hoạt động ngược của nucleosit disphosphat kinaza: GTP + ADP
= £ * GDP + ATP
AG°’ = 0 kJ/mol Vì vậy, sự hoạt động của các isozym sucxinyl—CoA syntetaza là sự đảm bảo năng lượng ATP (hoặc GTP) do sự xúc tác của nucleosit diphosphat kinaza. 9.6. MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỬ A NGHIÊN
cứu ISOZYM
Đổ nghiên cứu isozym, ngưòi ta dùng phương pháp điện di với mục đích xác định xem enzym có isozym hay không. Trong một sô" trường hợp, sự khác nhau về các cấu tử điện di của các isozym được đùng cho những mục đích nghiên cứu khác nhau. 9.6.1. Điện di
Nguyên lý chung của điện di là dựa vào tính chất tích điện của phân tử protein. Trong dung dịch, các phân tử protein có hiện tượng phân cực do các nhóm NH8+ và COO~. Khi điện di, phân tử protein được xử lý để mang thuần n hất một điện tích (thường là điện tích âm). Trong điện trường của máy điện di, các phân tử protein tích điện di chuyển về cực trái dấu. Thông thường, protein tích điện âm sẽ di chuyển từ cực ầm (cartode) đến cực dương (anode). Giá thể mà trên đó protein di chuyển có thể là giấy, m àng xenlulo axetat, gel tinh bột, gel polyacrylamit, gel agaroza. Cấu trúc không gian của gel như là một cái “rây” phân tử, các phân tử protein sẽ đi qua trong quá trình điện di. Các gel agaroza, polyacrylamit có thể thay dổi kích thưỏc các m ắt lưôi trên gel cho phù hợp với kích thước của từng loại protein. Để phân tách các isozym, gel tinh bột và gel polyacrylamit thường được dùng hđn cả. Tuỳ từng đối tượng và từng hệ thống isozym mà lựa chọn phương pháp diện di thích hợp. 384
Các phân tử protein có khối lượng phân tử, độ tích điện khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong quá trình điện di và kết quả là chúng được tách thành các băng khác nhau trên giá thể điện di. 9.6.2. Hiện màu các băng isozym
Khi kết thúc quá trình điện di trên gel polyacrylamìt, các phân tủ protein, trong đó có các isozym, có cấu trúc khác nhau được tách ra trên chiều dài của bản gel nhưng không nhìn thấy được. Để hiện màu các băng isozym, không thể đùng phương pháp nhuộm protein thông thường bằng các thuốc nhuộm như amido đen, coomasie birilliant blue, chúng sẽ làm cho tấ t cả các băng protein đều được hiện màu. Lợi dụng tính xúc tác cho một cơ chất đặc hiệu của một enzym, người ta đã để ra phương pháp hiện m àu các băng isozym bằng cách cho chúng tiếp xúc với dung dịch có chứa cơ chất đặc hiệu. Các isozymtrên bản gel sẽ thể hiện tính chất xúc tác là tạo nên cốc sản phẩm. Thường các sản phẩm này cũng không có màu, nhưng nó sẽ phản ứng vói chất khác có trong dung dịch tạo nên phức có màu kết tủa trên gel ngay tại vị trí băng isozym. Các hợp chất sử dụng trong thuốc nhuộm có thể là muôi tetrazoli, diazoni, muối kim loại (có chứa các ion Ca2+, Pb2+), phenol phtalein, dititreitol,... chúng tạo nên một phức hợp thuốc nhuộm phổ biến là: _ MTT (muối monotetrazoni). - NBT (muối ditetrazoni), - Nhóm fast (muối diazoni) gồm: + Past Red TR (WM = 178); + Fast blue B (WM = 244); + Past blue BB (WM = 300); + Past blue RR (WM = 225). Trong quá trình nhuộm gel, các isozym xúc tác có điểu kiện phản ứng phải giống như trong cơ thể: nhiệt độ, pH thích hợp, các coenzym (NAD+ NADP , NADH, NADPH) và các chất cho, nhận điện tử (ví dụ PMS) nếu như cơ chế xúc tác của loại enzym nào đó đòi hỏi. Một ví dạ cụ thể khi sử đụng MTT 3-(4,4-Dimetyltiazol-2-yỉ)-2,5 diphenyltetrazoli bromua (hay đơn giản hơn metyltiotetrazon) đôi vói homoserin dehydrogenaza (EC 1 .1.1.3). Cơ chất của isozym này là L-homoserin. Cđ chế hiện màu homoserin dehydrogenaza sử dụng MTT, PMS, ,VADh: nguyên tử H và hai điện tử bị tách ra khỏi cơ châ't được gán vào 385
NAD+ (dạng oxy hoá). PMS (phenazin methosulphat) tham gia vào quá trình với chức năng nhận H và điện tử từ NADH, rồi chuyển cho phân tử oxy hoá cuối cùng*, trong ví dụ này là MTT từ dạng oxy hoá không màu, tan trong dung dịch sau khi nhận H và điện tử thì trở thành dạng khử, kết tủa và có màu xanh lam. Đối với enzym thuỷ phân, sử dụng thuốc nhuộm có chứa muối diazoni là một phương pháp rấ t nhạy (đối với nhũng cơ chất có chứa nhổm naphtol). Sau phản ứng thuỷ phân, nhóm naphtol bị tách ra khỏi cơ chất sẽ liên kết với muôi này để tạo kết tủa có màu. Trong cơ chế này, không cần đến các coenzym và các chất cho nhận điện tử. Cơ chế phản ứng được minh hoạ bằng ví dụ đối vói Lơxin aminopeptidaza (3.4.9.1) và cơ chất là L-Lơxin-naphtylaminit, 9.6.3. Phân tích hình ảnh các băng điện di
a) Xác đ ịn h cấu trúc isozym, sốỉo cu s Sau khi nhuộm cấc băng isozym trên gel (subunit) và phân tích trạng thái các locus (đồng hợp hay dị hdp). Việc xác định dựa vào nguyên tắc: Trong một cơ 'thể bình thường, mỗi loeus có một cặp alen. Đối vởi trường hợp oligomeric (mỗi isozym gồm một sô" subunit) các chuỗi polypeptit sau khi được tổng hợp sẽ kết hợp với nhau một cách ngẫu nhiên tạo nên enzym hoàn chỉnh,... Giả sử trong một quần thể, -tại một locus nào đó có 3 alen A, a, aj. Chúng ta quy định cho 3 ch-uỗi nentit tươns ứng có kích thước và khôi lượng tăng dần X, Y, z. Sau khi điện di, ứng vổi các kiểu gen và các kiểu cấu trúc isozym khác nhau mà có thể có các trường hợp sau: + Nếu isozym là monome: cơ thể đồng hợp cho một băng, cơ thể dị hợp cho 2 băng. Nếú là dime hoặc tetrame: cốc chuỗi polypeptit thuộc cùng một locus (intralocus) ghép với nhau ngẫu nhiên và sẽ tạo 3 hoặc 5 băng tương ứng (ở cđ thể dị hợp) với xác suất lý thuyết là 1 : 2 : 1 hoặc 1 : 4 : 6 : 4 : 1. + Thực tế, sư phân tích các băng đôi khi rấ t phức tạp và dễ nhầm lẫn ỏ những trường hợp sau: Hiện tượng mullalen: một alen nào đó tổng.hợp chuỗi p o l y p c p t i t không có hoạt tính. Khi này, nếu isozym là monome thì sẽ không phân biệt được cơ thể đồng hợp và dị hợp. Nếu là dime hoặc tetram e thì sẽ thây 2 hoặc 4 bảng (ỏ cơ thể dị hợp) thay vì 3 hoặc 5 băng như trường hợp binh thường. 386
Hiện tượng bắt cặp giữa các chuỗi polypeptit được tổng, hợp từ các aỉen khác nhau ở các locus khác nhau (interlocus hybrit form): như đã bíêt, trong tê bào có thể có nhiểu locus cùng mă hoá cho một hệ isozym. Bình thường, các chuỗi polypeptit thuộc về các locus khác nhau thì không bắt cặp vói nhau (đối với dime hoặc tetrame). Còn nếu hiện tượng này xảy ra thì sẽ làm tăng sô" các băng lên rất nhiều ỏ cơ thể dị hợp. Ví dụ ở cây Cỉarkia: isozym PGI (phosphoglucoza isomeraza) là một dime có 2 locus A và B với 4 alen tương ứng Aj, A2 và Bb B2 đã có thể tạo ra 10 băng của các cặp chuỗi polypeptit là: AjAi, AiAa, A2A2, AjBj, AjB2, A2B2, B]Bj, B2B2. Hệ quả của trưòng hợp này là trường hợp thứ ba: các băng khác nhau lại gối trùm lên nhau. Ngoài ra, hiện tượng đa bội, hiện tương gen ỉiên kết với nhiễm sắc thể giới tính cũng làm cho các băng trỗ nên phức'tạp. Một biện pháp rắt hiệu quả có thể sử dụng để khắc phục hiện tượng khó khăn trên là phân tích isozym ở mô lưỡng bội, mô đơn bội và so sánh với nhau. Khi điện di đồng thời nhiều mẫu, kết quả các băng thu được phân bố rất đ a dạng. Để xác định Gấc locus và số các dưới đơn vị (su b u n it) củ a isozym thuộc mỗi locus đó, người ta thường dùng phương pháp phân vùng. Ví dụ: các báng thu được khi điện di hệ isozym PGM (phospho glucomutaza EC 2 .7.5.1) ở Hình 9.4. Xét mẫu một (Ml) (bên trái cùng) thấy 5 bãng có thể lầm tưởng đây là một tetram e của một cặp gen dị hợp. Hay ồ mẫu thứ hai (M2) (trái sang) lại giông nhaù như một dime vì thấy 3 băng. Nhưng khi xét đồng thời các mẫu kết quả này thì có thể giải thích đây là 3 monome thuộc về 3 locus khác nhau tương ứng với 3 vùng phân chia bằng gạch đứt. M2
M1 PGM „ PGM 1b
---------
PGM 2s >GM a
PG M *
PGM 3*
Hình 9.4. Một ví dụ vể các băng của PGM
387
b) Đ ặt tên cho các alen Sau khi xác định được cấu trúc và số locus của hệ isozym thì cần phải đặt tên cho các locus đó. Việc đặt tên tuân theo nguyên tắc: Tên của locus là tên viết tắ t của isozym mà nó mã hoá cộng với một số nguyên. Sô" 1 chỉ locus là tên viết tắt của isozym chạy xa nhất trên gel, lần lượt là số 2, 3... (ở Hình 9.4 là các locus PGM1( PGM2, PGM3). Trong mỗi locus, alen mã hoá cho chuỗi polypeptit (enzym) chạy xa hơn sẽ mang tên locus đó cộng với hậu tố a, và lần lượt cho alen có chuỗi polypeptit ở sau là b, c... (ở locus PGMj có 2 alen PGMla và PGMlb). Cách gọi tên như trên cho biết tương quan về thứ tự của các băng isozym (tương ứng là các alen) trên gel một cách định tính. Tương quan này được biết đến một cách định lượng hơn ở cách gọi tên thứ hai. Đôì với cách này, quá trình điện di phải được tiến hành cùng một mẫu chuẩn là m ẫu được Quốc tế công nhận. Sau khi phân tích kết quả điện di, alen nào có tần sô' lổn nhất thì quãng đường của m ẫu chuẩn được coi là 1 0 0 , và tên của alen đó là tên viết tắt của hệ isozym + 1 0 0 (ví dụ OdhlOO), các alen khác sẽ có con số ở hậu tố trên cơ sở so sánh quãng đưòng với alen tần sô"cao nhất này (ví dụ: Odh78, nOdhl20...). c) Các chỉ s ố thường đưtíc sử dung đ ể đ ả n h g iá m ức đô quan hệ về p h á t sin h chủng loai (phylogenetic relationship) Độ di chuyển tương đối: R„= X 1
Vối X: chiều dài tuyệt đốì (cm) từ vị trí xuất phát đến điểm dừng của mỗi băng; 1 : chiều dài gel (cm). Tính bằng công thức này có hai nhược điểm: —Những isozym có kích thưóc rấ t lốn sẽ di chuyển không đáng kể nên giá trị Rf rấ t nhỏ. - Điều kiện điộn di rấ t khó giống nhau hoàn toàn giữa các lần điện di khác nhau, dẫn đến Rf cùng một mẫu nhưng điện di ỏ những lần khác nhau có thể rấ t khác nhau. Cách tính thứ hai sẽ khắc phuc được nhược điểm đó: ilổu chuẩn
Với 1 dấu chuẩn là quãng đường của một chất chuẩn, thưòng là bromophenol blue vì chất này chạy xa hơn bất kỳ loại protein nào. 388
Hình anh của các băng trên gel có thể được quét và được ghi lại trong máy tính dưới dạng các file TIFF (tagged - image file format) rồi xil lý băng chương trình WinCam 2.0 để xây dựng ma trận tương quan (correlation matrix) và phân loại (dendrogam). Việc quét hình ảnh các bãng thực hiện râ t dễ nêu điện di trên polyacrylamit. Tần số' alen được tính theo công thức của Nei, 1972: D _ 2Ho+lH e Kf —---------- — 2N Nếu locus có hai aỉen: Với Ho: Số cơ thể có kiểu gen đồng hợp chứa alen đó; He: Sô" cơ thể dị hợp; N: Số' cá thể của quần thể nghiên cứu. Ví dự: Ho (AA) = 8 , Ho (aa) = 15, He (Aa) = 26, N = 49 2.8 ------------+ 1.26 _ _ ----------------------2.15 + 1.26 ---------- ►p q A 2.49 8 2.49 Nếu locus có 3 a len a, b, c với tần số tương ứng là p, q, r: 2 aa + lab + lac 2 bb + lab + lac 2 cc + lac + lbc p -----------------------------------p ---------------- -----------------p = — ---------------2N 2N 2N Chú ý: với các muỉlalen (silent allele) phải áp dụng định luật Hardi Weinber: p2AA + 2 pqAa + q2aa - 1 9.6.4. Tính trạng di truyền sô'lượng và các dấu chuẩn isozym lập bản đồ
Hầu hết các đặc điểm nông học quan trọng (ví dụ: năng suất, chín sốm, khả năng chông chịu) đều là tính trạng di truyền sô lượng. Trước đây, những tính trạng này được phân tích dựa trên những phương pháp thông kê được thiết lập sẵn cho phép một nhà khoa học mố tả hoạt tính của tấ t cả các gen tác động lên đặc điểm mình quan tâm; tuy nhiên, thưòng không thể phân lập và đo được các thông sô đơn lẻ hay tương tác của một gen đơn hay một mảnh nhiễm sắc thể (Falconer, 1960). Nếu, trong một phép lai đơn và một thế hệ phân ly, ta có thể theo dõi quá trình di chuyển của một mảnh nhiễm sắc thể thông qua xác định các dấu chuẩn di truyền đã xác định, ta có thể kiểm tra từng mảnh hay toàn bộ hệ gen đối với các gen điều khiển biến dị sô lượng. Từ đó xác định trực tiếp tác động của từng vùng nhiễm sắc thể mà trước đó có thể được xác định là đơn độc không có tác động, về m ặt lý thuyết, ta có thể vẽ được bản đồ chi tiết của tất cả các gen chính điều khiển các tính 389
trạng di truyền sô" lượng, mô tả vị trí nhiễm sắc thể và những hiệu quả tương tác và đơn lẻ. Kỹ th u ật nhuộm băng nhiễm sắc thể cũng được dùng để nghiên cứu nhưng có quá nhiều giói hạn, kỹ th u ật này lại không được áp dụng rộng rãi, và khả năng giải quyết các vấn đề kém chỉ có thể cung cấp một số ít câu trả lời giới hạn. Việc sử dụng các dấu chuẩn enzỷm dã được lập bản đồ trong nghiên cứu di truyền về lý thuyết có thể giúp giả thuyết cả một hệ gen với độ chính xác cao hơn, cung cấp một hướng nghiên cứu mạnh mẽ để nghiên cứu di truyền học các đặc điểm di truyền số lượng ỏ thực vật bậc cao. Ý tưởng s,ử dụng các dấu chuẩn đã được lập bản đồ và dâu chuẩn đơn gen để khảo sát các đặc điểm di truyền sô' ìưòng và đặc điểm đa gen không phải là mới. Đã có nhiều nhà khoa học cống hiến cho những nghiên cứu này (như Breese và Mather, 1957, 1960; Thoday, 1961). Tuy nhiên, những nghiên cứu này có trước việc sử dụng các dấu chuẩn isozym. Vì những nhà nghiên cứu chỉ làm được vâi những dâu chuẩR di truyền đơn hình nên những nghiên cứu trên chỉ được áp dụng rấ t hạn chế và trong các áp dụng thực tế. Những đặc điểm di truyền của các dâ'u chuẩn enzym cho phép nhữrig hướng nghiên cứu tiên phong đầu tiên trở thành phương pháp rất mạnh để khảo sát sự biến dị số lượng. Đặc điểm quan trọng phân biệt các dấu chuẩn phân tử với eác dấu chuẩn đơn hình và giúp chúng trở nên hữu ích hơn đê nghiên cứu đặc điểm số’ lượng là: 1) Không giống như các dấu chuẩn đơn hình; ở các locus, dấu chuẩn enzym có thê thấy số lượng khá lớn các alen xảy ra tự nhiên. 2) Thông thưòng thì không có sự tác động có hại nào xảy ra với sự biến đổi alen của những dấu chuẩn phân tử. Điểu này không giống như với dấu chuẩn đơn hình thường xảy ra những tác động kiểụ hình không mọng muốn khi có sự biến đổi alen. 3) Alen hầu hết các dấu chuẩn phân tử là đồng trội, vì th ế cho phép tất cả các kiểu gen có thể đều được phân biệt nhau qua bất kỷ một thế^hệ phân ly nào, Àlen ở các locus dấu chuẩn đơn hình thường tương tác theò phựơng thức trội lặn, vi th ế không cho phép sự dùng trong nhiều phép lai. 4) 'Vội các locus dấu chuẩn đơn hình, tác động lân át gen m ạnh làm giới hạn sô' lượng các dấu chuẩn phân ly có thể ghi lại chắc chắn trong cùng một th ế hệ phân ly. Những tác động lấđ át yếu hdn hoặc tác động đa hướng có thể quan sát thấy ỏ các dấu chuẩn phân tử, như vậy có thể điều khiển được một sô lượng dấu chuẩn phân ly không giói hạn trong một quần thể đơn. Điều kiện đầu tiên để sử dụng các dấu chuẩn phân tủ cho phân tích 390
biến dị sô lượng là có một sô lượng các dấu chuẩn đã được lập bản đồ phân ly trong thê hệ đang phân tích, ví dụ như: một sô" phần chính của nhiễm sắc thể được đảnh dâu ở ít nhất một'vị trí. Đến nay đã có một số lượng dấu chuẩn nhất định đã được lập bản đồ ở một số loài lương thực đủ dể tiến hành hướng nghiên cứu trên. Trong các thí nghiệm ở ngô, đã chứng minh có sự liên kết của gen tác động lên nãng suất với các dấu chuẩn enzym (Stuber et al., 1980, 1982). ở cà chua, ba thí nghiệm riêng rẽ đã được tiến hành để lập bản đồ đa gen (Tanksley et al., 1982; Valleyjos và Tanksley, 1983). Những nghiên cứu ở hai loài này đã đưa tới nhiều hướng nghiên cứu khác. Đó là các nghiên cứu ở cà chua sẽ được mô tả dưói đây. Một phép lai cà chua nội loài đưdc sỏ dụng như là một hệ thống mô hình để kiểm soát và lập bản đồ các locus tính trạng sô" lượng *quantitative trait loci -(QTL) với các dấu chuẩn isozym (Tanksley et al., 1982). Nguyên liệu được chọn cho thí nghiệm là một phép lai giữa các nguồn dồng hợp tử cao của Lycopersỉcon penneỉliỉ Rick (tên cũ là Solatium penneỉỉiỉ) và Lycopersicon escuỉentum lai ngược với nhau. Thế hệ con lai từ phép lai trên phân ly một sô tính trạng đa gen. Bổn tính trạng chọn để nghiên cứu là: tỷ sô" chiều dài/ chiều rộng của lá, lỗ khí lộ ra, khôi lượng quả và khối lượng hạt. Sự phân ly của các đặc điểm trên và 1 2 dấu chuẩn isozym khác nhau được theo dõi trong khoảng 300 con lai thuận nghịch. Tất cả locus isozym (Asp-1, Asp-2, Gữt-2, Prx-1, Prx-2, Prx-4, Prx-7, Esị^4, Est-7, Pgi-1, Pgm-2 và Skdk-1) được lập bản đồ và đánh dâu 9 trong số 1 2 nhiễm sắc thể. a) Mối liên kết giữa locus ernyrn và locus tính trạng số lượng (QTL) . Đối với phân tích thông kê, các con lai được chia thành 2 lớp: Lâp đồng hợp về một locus enzym cụ thể và lớp dị hợp. Sự khác biệt có ý nghĩa biểu hiện cho mỗi. một đặc điểm sau đó sẽ được xác địnlĩ băng thống kê. Nếu có sự khác biệt có ý nghĩa giữa lớp đồng hợp và dị hợp, thì có thể kết luận đấy là do sự liên kết của các dấu chuẩn isozym với một hay vài gen góp phần tạo nên biến dị đơn hình. Với sự hô trd của máy yi tính, phân tích thống kê có thể được lặp lại với tất cả các locus enzym và tất cậ đặc điểm di truyểrv-số lượng. Kêt quả là một biêu đô mô tả các locus enzym nào liên kết vôi gen điều khiển từng đặc điểm. Bằng cách này, 2 1 gen (hay cụm gen) của các gen điều khiển bien dị di truyền sô lượng đã Xấc định được vị trí nhiễm sắc thể. Đối với những _gen liên kết chéo (P r x -ỉS k d h -1 của nhiễm sắc thể 1; 391
E st-l-P rx —của nhiễm sắc thể 2; P g i-l—Est—4 của nhiễm sắc thể 1 2 ), ta có thể xác định được vị trí locus nếu locus đó có quan hệ vói các dấu chuẩn isozym đă được biết vị trí. Điều này được thực hiện bằng cách sử dụng mô hình dự đoán hướng đi khác nhau giữa các lớp tái tô hợp về các đặc điểm đơn hình (Tanksley et aỉ., 1982). b) Thêm bổt tác động của QTL So sánh giá trị của những đặc điểm đơn hình ở bô' mẹ và con lai, ta có thể dự đoán được QTL thu được từ bô" mẹ có tác động dương hay âm lên thế hệ con lai nghịch phân ly. Trong một số trường hợp, QTL được phát hiện nhờ phương pháp isozym tạo ra hiệu quả trái ngược với những dự đoán từ đặc điểm bố mẹ của chúng. Những QTL như vậy là chất chỉ thị cực tốt cho những gen nằm trong biến dị vượt ngạch (con lai mang tính trạng vượt trội hơn ngoài phạm vi của bô mẹ) —nhũng hiện tượng này được quan sát rấ t tốt ỏ cà chua cũng như một sô" loài thực vật khác (Rick và Smith, 1953; Rick, 1967; Lindqvist, 1960).
c) Tương tác lấn át giửa các QTL Khi đã biết được QTL liên kết với các dấu chuẩn isozym, ta có thể đưa ra câu hỏi nếu bắt kỷ một locus nào xác định được đang tương tác theo kiểu không bổ trợ hay lấn át gây ra những tác động của chúng lên các tính trạng nghiên cứu. Trong lúc nghiên cứu này được bàn luận thì 18 sự tương tác giữa hai locus đã được phát hiện ở 4 tính trạng di truyền sô' lượng nghiên cứu. Tuy nhiên, để kiểm tra sự tương tác đa gen thì kích thưốc quần thể phải tăng lên để có được sự tin cậy cao trong nghiên cứu. d) S ử dụng các nguồn dấu chuẩn alen hiếm trong lập bản dồ gen s ố lương Như vậy cho đến nay, các thí nghiệm sử dụng dấu chuẩn isozym được lập bản đồ trong nghiên cứu di truyền số lượng đều dựa trên sự khác biệt alen isozym đã có giữa những dòng được kiểm tra. Trong những ví dụ được mô tả ở trên, vổi một thế hệ lai nội loài được sử dụng, các dấu chuẩn phân ly bao trùm lên khoảng 60% hệ gen. Trong những nghiên cứu không sử dụng lai nội loài, số lượng các locus isozym phân ly có thể quá thấp để sử dụng cho lập bản đồ gen số lượng một cách có hiệu quả. Tuy nhiên, nêu có sẵn các nguồn di truyền mang các alen biến dị với số lượng lớn các locus isozym được định vị tốt khi 80 sánh với hầu hết các dòng nội loài hay ngoại loài khác, thì áp dụng kỹ th u ật lập bản đồ gen sô' lượng sẽ được tăng lên nhanh chóng, ở cà chua, đã có hơn 1 . 0 0 0 392
kiểm tra về alen isozym (Rick, 1983), rấ t ít biến dị được tìm thấy đối với hâu hêt các locus. Băng cách tập tru n g các aỉen hiếm này vào trong một nguồn thông qua các phép lai lặp lại và chọn lọc, ta có thể tạo ra được một nguồn d ấu chuẩn isozym phục vụ cho nghiên cứu lập bản đồ gen sô' lượng cũng như các ứng dụng khác trong nghiên cứu di truyền đòi hỏi tới các locus isozym được lập bản đồ. Cuối cùng, các nguồn có sẵn đã phân ly dấu chuẩn lên hơn một vị trí trên tấ t cả các nhiễm sắc thể sẽ bao trùm lên 100% hệ gen. e) K ế t lu â n và triể n vong Nhờ đặc tín h siêu di truyền của chúng, các gen mã hoá enzym được xác định vị trí khá dễ dàng. Những đặc tính tương tự cho phốp chúng dễ dàng lập bản đồ th ì cũng giúp sử dụng chúng để lập bản đồ các gen khác. Đặc biệt quan trọng là lập bản đồ gen di truyền sô" lượng và tính trạn g đa gen. Những công trìn h giói hạn trong lĩnh vực này đã đề xuất rằng, có thể nghiên cứu biến dị sô" lượng trên một gen đơn chỉ cần dựa trên một phép lai đơn và một th ế hệ phân ly. Khi các bản đổ liên kết của những loài nông sản được đánh dấu đủ hiệu quả bởi các dấu chuẩn enzym và các dấu chuẩn có đặc tính tương tự (ví dụ: protein không enzym hay dấu chuẩn vị trí cắt giói hạn ADN), thì ta có thê phân tích một cách n h an h chóng, hiệu quả và đầy đủ biến dị sô" lượng bằng những phương pháp đã mô tả ở trên. 9.6.5. Lập bản đồ gen 9.6.5.1. G iớ i thiệu Gen mã hoá cho enzym, cũng giông như các gen khác, đều là đôi tượng để lập bản đồ của các nhà di truyền thực vật. Điểu làm cho các phương pháp lập bản đồ gen mã hoá enzym trỏ nôn đặc biệt là do chúng có thể được lập bằng nhiều phương pháp khác nhau và những ứng dụng th ú vị từ áp dụng các thông tin thu được. 9.6.5.2. Phương pháp lập bản đồ Hiộn trạ n g của các nghiên cứu bản đồ gen trong các loài thực vật riêng rẽ có th ể được tìm thấy trong các tài liệu khác nhau. Một tổng quan của các kỹ th u ậ t lập bản đồ gen được trình bày ở đây.
a) T hí n g h iêm liên k ết đ a đ iểm ở các loài đã xác định được số lương lớn các dấu chuẩn (marker) thì ta có thể xác định VỊ trí các locus trê n nhiễm sắc thể bằng th í nghiệm liên kết 2 hoặc 3 điểm vôi các dấu chuẩn đã biêt vị trí. Một sô gen 393
isozym trong cà chua và ngô đã được định vị theo phương pháp này (ví dụ Schwartz, 1971; Rick và Fobes, 1977). Nếu đủ thời gian và kiên nhẫn, một nhà khoa học có thể tìm thây liên k ết với một hoặc một vài dấu chuẩn đa hình, nhưng số lượng các con lai và th ế hệ phân ly đòi hỏi để có th ể th àn h công với kỹ th u ậ t này chậm hơn so với việc xác định vị trí nhiễm sắc thể của các locus isozym. Tuy nhiên, chỉ m ột số' ít thực vật 'CÓ đủ các dấu chuẩn hình thối đã được xác định để áp dụng cho kỹ thuật này. Cà chua và ngô là các trường hợp được xét đên ỏ đây. Thậm chí nếu các dâu chuẩn không có sẵn, mối quan hệ liên kết giữa các gen m ã hoá enzym vẫn có thể xác định được. Điểu này liên quan đến việc kiểm tra tấ t cả các sự k ết hợp b ắ t cặp (pairwise) của các locus isozym riêng biệt cho các phân ly độc lập. Điều này cũng có thể đòi hỏi một số lượng lớn con lai và tốn nhiều thời gian nếu chỉ có một s ố ít các locus riêng rẽ được kiểm tra trên một phép lai. Tuy nhiên, không giống vói trường hợp dấu chuẩn hìn h thái, alen của các locus enzym thưòng đồng trội và không lấn á t gen. K ết quả là, một sô" lượng lý thuyết giới hạn các dâu chuẩn isozym phân biệt có thể được tín h đến trong một phép lai đơn và th ế hệ riêng rẽ. Nếu con lai Fj được hình th à n h là dị hợp vê sô" lượng lớn các locus enzym, thì đa sô* các quan hệ liên k ết có thể xác định trong một th ế hệ đơn, ở ngô và cà chua, cách ly cùng trong loài có thể được sử dụng để xác định đồng thời một quan hệ liên k ết của hơn 20 dấu chuẩn isozym (Tanksley và Rick, 1980a, Vallejos và Tanksley, 1983; Tanksley và H arris). Khi càng nhiều locus isozym được lập bản đồ ỏ một loài, thì ta có thể sử dụng các dấu chuẩn isozym đã được lập trưóc đó để nhan h chóng xác định vị trí của các locus chưa biết, ở cà chua, các locus isozym đã lập bản đồ ngày nay có th ể đánh dấu được 10 trong số 12 nhiễm sắc thê trong ít n h ấ t một vị trí. Ta có th ể lựa chọn bô" mẹ thích hđp để tạo ra thế hệ con lai F ! phân ly như vậy, xác su ấ t các liên k ế t được tìm thấy giữa một dấu chuẩn chưa biết và dấu chuẩn đã biết trưóc đó là khá cao. sử dụng phương pháp phân ly đa dấu chuẩn íiày, có th ể xác định vị trí một gen trê n nhiễm sắc th ể chỉ qua một phép lai đơn. Với phương pháp này, hầu hết các locus isozym được lập bản đồ ở cà chua ngày nay đều được định vị trong bộ gen chính xác nhờ liên kết chặt chẽ vối một hay nhiều locus isozym đã được biết trước đó (Tanksley và Rick, 1980a, Tanksley và Jones, 1981; Vallejos và Tanksley, 1983). M ột phương pháp tương tự cũng có thể được sử dụng trong lập bận đồ gen ỏ ngô (Goodman và 394
Stuber, 1983). Vì phương pháp này rấ t thuận lợi khi càng nhiều các dấu cbuân isozym được lập bản đồ, chúng ngày càng được sử dụng nhiều. Ở cà chua, hiện đang xây dựng một nguồn kiểm định di truyền, trong đó mang alen hiêm hầu h ết nằm trên các locus isozym. Bằng cách lai vói nguồn này, có th ể bảo đảm thu được th ế hệ con phân ly ở một hay nhiều các dâu chuẩn trên mỗi nhiễm sắc thể. b) Thê ba n h ìềm (T risom ics) Thể ba nhiễm đóng vai trò kép trong nghiên cứu ỉập bản đồ isozym. Đầu tiên, kỹ th u ậ t phân tích th ể ba nhiễm cổ điển áp dụng để lập bản đồ các locus isozym, giông như sử dụng với các locus di truyền khác. Bằng cách điểu khiển tỷ lệ phân ly ở th ế hệ con lai từ phép lai thể ba nhiễm, ta có th ể suy ngược lại vị trí củá các locus trên nhiễm sắc thể nghiên cứu (B urnhan, 1962). Thứ hai, quan trọng hơn, với các dấu chuẩn isozym, ta có thể phân biệt liều lượng alen trong các cơ thể dị hợp tử th ể ba nhiễm. Khả năng này là kết quả từ thực tế: các alen của hầu hết locus enzym là đồng trội và sô lượng tương đối của enzym được hình thành từ các alen có thể quan sát và^định lượng được. Điều đó có nghĩa là, trong những trưòng hỢp m ột locus enzym được xác định ở một nhiễm sắc thể cụ thể bằng cách kiểm tra các con lai th ể ba nhiễm thu được từ phép lai tói một tập hợp th ể ba nhiềm. Điều nậy ngăn cản sự cần thiết tiếp tực tói các th ế hệ tiếp theo khi cần cho những phân tích thể ba nhiễm cổ điển. Điều này . không những bảo đảm cho một th ế hệ mà còn làm giảm sô lượng thực v ật cần được kiểm tra để so sánh với những mô hình cổ điển. Có một số loại th ể ba nhiễm- thích hợp để lật) bản đồ gen bằng xác đ ịn h liề u
lư ợn g
— v í d ụ : sơ c ấp , t h ứ c ấp , ta m
cấp , b ù tr ừ v à th ể b a m ú t.
Thể ba nhiễm sơ cấp là những thể có mang một nhiễm sắc thể bình thường, chúng thưòng dược sử dụng trong các nghiên cứu lập bản đổ sô' lượng ở thực v ật bậc cao. Mô hình lập bản đồ sô lượng bằng thê ba nhiễm sơ cấp rấ t thích hợp và nguyên lý tương tự có thể ứng dụng để lập bản đồ vối các kiểu ba nhiễm khác. Để lập b ản đồ số lượng với thể ba nhiễm sơ cấp, dữ liệu then chốt để xác đính vị trí nhiễm sắc thể sẽ thu được từ thê hệ Fị ba nhiễm băt nguồn từ phép lai hàng loạt ba nhiễm. Bố mẹ lưổng bội phải m ang một alen khác vôi các alen có trong tập hợp thể ba nhiễm. Ví dụ: ỏ cà chua, có 12 nhiễm sác thể ỏ dạng đơn bội, sẽ cần phải lai vói 12 th ể ba nhiễm sơ cấp độq nh ạt. Nguyên tắc của th í nghiệm là nếu gen đang nghiên cứu nằm trê n nhiễm sắc th ể điỉdc nhân ba lên trojig một thê ba nhi em sơ câp 395
nào đó, th ì th ế hệ con lai F1! sẽ có phân bố hoạt tính allozym phản ánh sô' lượng của 1 alen từ bố”và 2 từ thể ba nhiễm. Một số gen isozym đã được lập bản đồ bằng cách này (Nielsen và Frydenberg, 1971; Leilsen và Scandalios, 1974; Tanksley, 1979; Fobes, 1980). Đôl vói các loài đã có sẵn tập hợp các thể ba nhiễm sơ cấp, phương pháp có thể giúp xác định vị trí nhiễm sắc thể của các gen m ã hoá enzym một cách nhanh nhất. Hình ảnh của một bản gel cho thấy số’ lượng của con lai ba nhiễm của phép lai Adh-1 với cà chua thể ba nhiễm 4 (thể ba n h ílm ở nhiễm sác thể số 4). Những p hân tích sau đó cho thấy, chỉ có th ể quan sát được alen sô" lượng trong phép lai với th ể ba nhiễm số 4; như vậy, A dh-1 nằm trê n nhiễm sắc thể số 4 (Bảng 9.1). Bảng 9.1. s ố lượng con lai mang thể hai nhiễm và thể ba nhiễm đối với A d h -1. Thế hệ con lai từ phép lai với các cây cà chua ba nhiễm (từ Tanksley, 1979) Thể ba nhiễm
Sô' lượng con lai m ang băng hai nhiỗm
S ố tượng con lai m ang băng ba nhiễm
1
97
0
2
59
0
3
93
0
4
54
34
5
33
0
6
41
0
7
50
0
8
179
0
9
42
0
10
46
0
11
43
0
12
54
0
Trong một sô' th í nghiệm xác định vị trí các gen m ã hoá isozym bằng cách xác định hoạt độ enzym hoặc protein tổng số (Carlson, 1972; Fobes, 1980). Phương pháp này chỉ đặc biệt có hiệu quả khi các nhiễm sắc thể thêm vào không tă n g thêm hoạt độ enzym của locus isozym nằm trên nhiễm sắc th ể đó và số' lượng của các gen nằm trên các nhiễm sắc thể khác cũng không tác động đến được (Brichler, 1983). c) Thê đơn nhiễm , thê không nhiễm và các th ể lê c h bội lẻ kh ác Lập b ản đồ gen trong các thể đa bội thường chỉ được tiến h àn h nhò sử dụng các th ể lệch bội lẻ khác thể ba nhiễm. Trong củ cải lục bội, Triticum astivum , các dòng lộch bội lẻ có sẵn nằm trong khoảng 0 đến 4 396
sô" lượng của môi nhiễm sắc thể và hầu hết các cánh nhiễm sắc thể. Bằng cách kiêm tra xem sự có m ặt hay không của những isozym cụ thể trong các thê lệch bội lẻ như vậy, trong một thòi gian tương đối ngắn, ta có th ể xác định được vị trí nhiễm sác thể thích hợp của một sô’ lượng lớn các gen mã hoá enzym trong ba hệ gen (Hart, 1979, 1983). Ở cây thuổc lá Nicotiana tabacum, một thể dị tứ bội (2n = 4x = 48) có thê không nhiễm từ các giống. Các thể đơn bội khác cung cấp cho chúng ta m ột con đưòng hứa hẹn dể lập bản đồ gen mã hoá isozym (Moore và Collins, 1982). d) C huyển v ị B - A Trong m ột sô" loài thực vật, sự có m ặt của các nhiễm sắc thể B hoặc nhiễm sắc th ể bổ sung mở ra phương pháp mới và hiệu quả để lập bản đồ. Yêu cầu của phương phốp này là phải có sẵn một nguồn chuyển vị đã biết giũa các nhiễm sốc thể A và B. Mô tả chi tiết sử dụng phương pháp chuyển vị B—A có th ể được tìm thấy ở Beckett (1982). Trong số những loài thực v ậ t được tiến hành lập bản đồ, chỉ có ngô là có sẵn các nguồn chuyển vị B-A. Những nguồn này đặc biệt có ích trong việc lập bản đồ các gen m ã hoá isozym được biểu hiện trong cả nội nhũ và lá m ầ m giai đoạn đầu (scutellem). Khi một dòng đồng hợp đôì với chuyển vị A-B được dùng làm h ạ t phấn bố mẹ trong phép lai với một đòng nội phối có m ang một biến dị isozym khác, thì các hạt thu được từ sự không phân ly của chuyển vị B-A sẽ cho thấy sơ đồ enzym khác nhau trong lá mầm giai đoạn đầu và trong nội nhũ nếu locus nghiên cứu nằm trên nhiễm sắc thể A có liên quan đến chuyển vị (McMillin và cộng sự, 1979). Vì vậy, phương pháp trê n cho phép lập bản đồ nhanh chóng các gen mã hoá cho một số enzym như m alat dehydrogenaza (McMiilin và cộng sự, 1979) và catalaza (Roupakias và cộng sự, 1980) ở ngô. e) C huyển vị đơn và chuyển vị k ết hợp Cũng giống như chuyển vị B-A, ứng dụng phương pháp chuyển vị đơn và chuyển vị kết hợp dể lập bản đồ locus isozym chỉ giới hạn ở ngô. Chuyển vị không chỉ được sử dụng trong định vị locus isozym trong bản đồ di truyền mà còn trong bản dồ tế bào và bản đồ vật lý (Birchỉer, 1980). f) D ò n g th êm n g o à i (a lie n a d d itio n lines) Bằng cách đưa các nhiễm sắc thể đơn, hoặc cánh nhiễm sắc thế’ từ một loài vào trong nhân của loài khác, ta có thể kiếm tra th àn h phần gen trong nhiễm sắc th ể "ngoài" (alien) đó. Điểu này đặc biệt chính xác đô'i với các locus isozym. Vì đồng trội, nên sự biểu hiện của các alen 397
enzym trong một cá thể từ nhiễm sắc thể thêm vào đó có th ể p h át hiện dễ dàng khi so sánh bản đồ gen của các dòng thêm vào với dòng bình thường (không thêm vào). Các dòng thêm ngoài, sử dụng củ cải lục bội làm nhân chủ, đã cung cấp hầu hết dữ liệu bản đồ gen của lúa mạch (Brown, 1983; H a rt và Tuleen, 1983) và lúa m ạch đen (H art và Tuleen, 1983; Jaask a, 1983). 9.6.S.3. Lập bản đ ổ gen so sánh
Trước khi đưa các kỹ th u ật hoá sinh và phân tử trong lĩnh vực di truyền học, thưòng ta rấ t khó để xác định được sự tương đồng của một gen đơn trong các đơn vị phân loại (taxon) đa dạng lớn. H ầu h ết các bản đồ liên kết đểu m ang các gen ảnh hưởng các đặc điểm đơn hình như màu m ắt ở động vật, hay hình dạng lá và sự thiếu h ụ t sắc tô" ở thực vật. Vì số lượng của những gen tác động tiềm ẩn lên các đặc điểm này trong một sinh vật n h ấ t định thường r ấ t lớn, vì th ế trong h ầ u h ết các trường hợp, ta rấ t khó nếu không nói là không có th ể xác định được những locus nào là đơn hình trong các loài khác nhau, Việc cải biến và ứng dụng kỹ th u ật xác định protein trong nghiên cứu di truyền đã cho phép xác định được các locus đơn hình và thứ tự tuyến tính trong các loài đa hình. Những kết quả trong các nghiên cứu lập bản đồ so sánh không chỉ cho thấy những hiểu biết về tiến hoá nhiễm sắc thể và phát sinh, mà còn cung cấp những thông tin vô cùng hữu ích để xác định mối quan hệ p h át sinh giữa các đơn vị phân loại xa nhau. a) N h ừ n g tiê u ch u ẩn tro n g xác địn h g en tương đ ồ n g tro n g các loài kh ác n h a u Như chúng ta đã biết, đối với một enzym nắo đó được tìm thấy trong một cơ thể, thì thường có thêm hơn một dạng isozym, đây thường là kết quả từ hoạt động của hơn một gen. Để so sánh quan hệ liên k ết của các gen mã hoá enzym tương đồng trong các loài khác nhau, trước hết cần phải th iế t lập được gen nào tương đồng. Trong trưòng hợp các gen nghiên cứu bị nhân đôi trong một loài, thì phải xác định đồng thòi gen tương đồng nào là tương dồng thẳng đứng và gen nào là tương đồng song song (nhân đôi). Điểu này thường được thực hiện bằng cách sử dụng các đặc tính của các dạng isozym khác nhau trong một loài và cố’ gắng gắn chúng với các dạng khác ở loài khác. Danh sách chung của các tiêu chuẩn này thường có thể làm được với việc phải hiểu rằng, chỉ một phần tiêu chuẩn dược áp dụng trong một vài ví dụ cụ th ể và trong h ầu h ế t các 398
trưòng hợp th ì cân phải có sự k ết hợp nhiều bằng chứng từ vài trong số các tham số’này để th iết lập được sự tương đồng. b) Vỉ t r i b ô n g Qua quá trìn h điện di, các isozym có thể được phân tách theo khôi lượng và diện tích. Các isozym mã hoá bởi các alen của một locus đơn thường nằm trong một vùng nhất định của gen. Đây là trường hợp tương đồng khác loài có thu được qua các so sánh zymogram đdn giản. Điều này đặc biệt chính xác khi làm việc vói các taxon có quan hệ gần nhau, ở đó vị trí băng của các isozym tương đồng trong khuôn gel thường được bảo tồn. Ví dụ: kết quả từ nhuộm bãng peroxidaza có bản đồ gen rấ t giống nhau đôi vối các loài thuộc về ba chi của họ cà, Lycopersion, Capsicum và Soỉanum, đã cho thấy bằng chứng về sự tương đồng của các locus khác nhau trong các đơn v ịp h â n loại (taxon) này (Tanskley, Quiros). c) Đ ặ c h iệu m ô Có nhiều các ví dụ đặc hiệu mô được sử dụng làm bằng chứng để xác định sự tương đồng giữa các isozym đặc trứng trong các loài khác nhau (ví dụ của: Leslie và Pontier, 1980; Wocmack và Sharp, 1976). ơ cà chua, một số’iso/ym esteraza và peroxidaza có thể phân biệt được dựa trên đặc hiệu mô (Tanskley và Rick, 1980 a,b). ở ngô, đặc trưng mô và quá trình phát triển chứng minh cho một số isozym có chức năng peptidaza, amylaza và xúc tác (Scandalios, 1974; Goodman và Stuber, 1983). d) C ấu tr ú c bậc 4 Dựa trên số lượng của các cá thể dị hợp, việc so sánh khối lượng phân tử của các protein nguyên vẹn và protein bị phân tách (Nicolas và Crouzet, 1980), hoặc qua điện di hai chiều biến tính SDS (Newton và Schartz, 1980), ta có thể xác định được cấu trúc bậc bốn của các isozym đặc trưng. N hững thông ti>n rấ t có giá trị cho việc sắp xếp sự tương đồng trong hộ thông enzym mã hoá bởi nhiều gen. Ví dụ: trong cà chua, 4 trong số các gen esteraza mã hoá cho các tiêu phần enzym lưởng phân (dimeric), trong khí đó các Ễ»en khác lại mã hoá cho các monome hoạt dộng khác (Tanskley và Rick, 1980b). Điều này không giống như trưòng hợp của các cấu trúc bậc 4 khác được mã hoá bởi các gen đồng hợp. e) L a i dư ới đơn v ị nội lo à i Trong một số trưòng hợp, có thể phân tách và tái liên kết các tiểu phần isozym nhiều thành phần, mà không làm m ất hoạt tính cúa enzym. Từ đó cung cSp những bằng chứng thuyết phục về dị dime (heterodime) 399
nội loài ở rấ t nhiều trường hợp : Torres, 1974; Freeling, 1974). Bằng cách tương tự ta cũng xác định được mối quan hệ của các gen lặp lại trong một loài, có thể đưa ra các bằng chững về sự tương đồng qua th í nghiệm phân tách và tái liên kết các tiểu phần ở các tiểu phần isozym của các đởn vị phân loại khác biệt nhau. Các dưới đơn vị của những gen tương đồng sẽ lai với nhau để hình th àn h đạng đa đơn vị có hoạt tính, đã được chứng minh trong nuôi cấy tế bào lai sinh dưỡng (soma) cùng đdn vị phân loại (chuột và ngưòi, Shows, 1972; chuột và chuột đồng, Lally et al, 1978). Khi nghiên cứu các enzym hai th à n h phần phosphoglucoisomeraza, Weeden và Gottlied (1982) đã chứng minh có th ể làm n h ân tạo các dị dime (heterodime) có hoạt tính từ các dưới đơn vị có nguồn gốc thực vật thuộc các họ cách xa nhau (ví dụ như: hoa hưâng dương và cải hoa). Các dime hoạt tính th u được từ các dưới đơn vị được m ã hoá bởi các gen tương đồng m ã hoá các vùng tế bào chất và sinh chất, nhưng lại không có phân tử lai nào được tạo ra từ phép lai chéo của các dưới đơn vị từ hai nguồn này. f) Đ ịn h v ị dư ởi t ể bào Isozym thường được định vị trong tế bào (ví dụ như: tế bào chất, ty thể, glyoxysom, peroxisom). Như đã được chỉ ra (Gottliec, 1982), định vị dưói tế bào của các isozym đặc biệt thường được bảo tồn rấ t cao trong suốt quá trình tiến hoá. Bằng cách xác định vị trí của các isozym được mã hoá bỏi gen, ta có th ể xác định được sự tương đồng của các gen nghiên cứu. Chẳng hạn, khi so sánh hai loài cây, và thấy trong mỗi loài chỉ có hai gen mã hoá cho phosphoglucomutaza và isozym được mã hoá bởi một trong các gen trên được tìm thấy trong tế bào chất và các nơi khác trong lục lạp, ta có th ể kết luận một cách hdp lý là: dạng tế bào chất đồng hợp cũng như dạng ỏ lục lạp. Để xác định vị trí dưói tế bào của một isozym nào đó, ta cần phải phân lập được các bào quan khác nhau và so sán h bản đồ gen từ những phần tách được và những phần tách thô. Phương pháp này được sử dụng râ t thành công trong so sánh nội loài (ví dụ như nghiên cứu của Womark và Sharp, 1976; Gottlieb, 1982). g) C ảm ứ n g isozym Một số isozym, hoặc các gen tương ứng, được cảm ứng bởi các tác động của môi trường. Alcohol dehydrogenaza là trường hợp đầu tiên ở thực vật. Trong thực tê, tấ t cả các loài được kiểm tra đều có ít n h ấ t một gen ADH được tìm thây ở dạng hoạt động (hoặc nhiều hơn) khi các cây hoặc mô cây được đưa và điều kiộn yếm khí. Các gen ADH khác thường 400
được tìm th ấy trong các sinh vật cùng loại không đáp ứng với môi trường yếm khí, như ng lại chỉ biểu hiện ỏ vài mô và giai đoạn p h át triển đặc trưng (M arshall et. al., 1974; Torres et. al., 1977; Tanksley và Jones, 1981). Trong trường hợp các cá thể được kiểm tra có mang nhiều hơn một gen ADH, ta có thể kiểm tra sự tương đồng ở ít n h ấ t một phần bằng các đáp ứng khác nhau của các gen đối với áp lực yếm khí. Một ví dụ khác về cảm ứ ng khác nhau có thể được tìm thấy ở gen esteraza trong cà chua: EST—4 chỉ được tim thấy ở rễ cây đang tăng trưởng và có th ể cảm ứng ở các mức độ không đáng kể đến mữc độ rấ t cao trong vài ngày bằng phưđng pháp cấy mô - một kỹ th u ật nhằm làm tăng nhan h sự sinh trưởng của rễ (Tanksley và Rick, 1980b). Các esteraza khác đểu không có đáp ứng tương tự như trên. Vì th ế ta có thể phân biệt được EST- 4 với các isozym esteraza một th àn h phần (monome) khác bằng đáp ứng khác biệt trên. Trong cây h ạt tiêu, Capsium annum (và một số họ như cà chua, Soỉanaceae), đã p h át hiện được một gen mã hoá cho một protein một th à n h phần, cũng là esteraza đặc trưng của rễ di chuyển cùng vị trí với E S T -4 ở cà chua trên bản gel điện di. Và cũng trong h ạt tiêu, các esteraza cũng được cảm ứng trong rễ qua cấy ghép mô. Kết hợp các bằng chứng trên, ta có thể thấy các esteraza này tương đồng với E ST -4 cà chua. Bằng cách điều khiển cảm ứng của các isozym đặc trưng với kích thích môi trường, trong một số trường hợp, ta có thể phân biệt được các cặp isozym tương đồng trong các đơn vị phân loại khác nhau. h) K h ố i lư ợn g p h â n tử Khôi lượng phân tử của các isozym được xác định dựa trên sắc ký loại trừ, hoặc điện di trên gel sử dụng nồng độ acrylam it khác nhau (Hedrick và Sm ith, 1969), có thể được sử dụng như là một tham sô' bổ sung dể xác định tương đồng locus. Tuy nhiên, khõì lượng phân tủ của các protein tương đồng có thể rấ t khác nhau, vì th ế nó được xem là một dặc điểm tương đồng tương đối. i) T ín h đ ặ c trư n g cơ ch ấ t Ta có th ể xây dựng được phổ đặc trưng cơ chất nhân tạo của một sô" e*izym phân tích bao gồm esteraza, phosphotaza và peptidaza. Sử dụng các cơ chất n h ân tạo trên, ta có thể xác định được tính đặc hiệu cho mỗi một isozym và sử dụng cơ sỏ dữ liệu này để so sánh nội loài. Leslie và Pontier (1980) sử đụng phương pháp trên để phân biệt các isozym về hoạt tính esteraza trong một nghiên cứu bản đồ so sánh giữa hai chi cá, 401
Các isozym peptidaza khác nhau trong ngô cũng được p h ân biệt dựa trên đặc trưng cơ chất (O tt và Scandalíos, 1976). j ) Đ á p ứ ng củ a isozym với các c h ấ t ức c h ế N hững cơ chất làm giảm hoặc loại bỏ hoạt tính của các isozym đặc trưng có th ể được đùng để mô tả v.à phân biệt các isozym. Womack và Sharp (1976) đã điều khiển đáp ứng của esteraza chuột n h ắ t và chuột nhà khi có m ặt của 5 chất ức chế esteraza. Kết quả cho thây r ấ t rõ sự tương đồng từng cặp của các lơcus giữa hai loài chuột này. Các chất ức chế cũng được sử dụng để phân biệt các isozym esteproteaza ở chuột (Otto và Von Diemlíng, 1981). k) X ét n g h iệm m iễn d ịch P hản ứng đường chéo của các kháng th ể với các isozym tưdng đồng trong các loài khác nhau có th ể cung cấp các bằng chứng thuyết phục của sự tương đồng gen (ví dụ F isher và W hitt, 1978). Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi isozym được nghiên cứu phải tin h sạch của ít n h ất một loài. Việc tinh sạch isozym và các bước sản xuất kháng thể tiếp sau có thể tốn nhiều thời gian và công sức. Tuy nhiên, kỹ th u ậ t này có thể được dùng trong một sô trường hợp đặc biệt, nhưng không thể dùng nó để có thể kiểm tra được tấ t cả các isozym trong lập bản đồ so sán h gen. I) T rìn h tư a x ỉt a m in và n u c le o tit Phương pháp th iế t lập sự tương đồng gen nội loài là chính xác nhất xác định trìn h tự protein m ã hoá bởi các gen tương đồng giả thiết, hoặc tốt hơn nữa là xác định trìn h tự của chính cậc gen đó. Tuy nhiên, vì điểu kiện thòi gian và kinh phí liên quan đến việc tách chiết và giải trìn h tự từng isozym hay từ ng gen, nó dưòng như không th ể th u được đủ dữ Liệu trình tự của đủ các loài để nghiên cứu lập bản đồ gen so sánh. Tạm thời, chỉ cần dựa trê n nhữ ng hướng đi khác nhau nhưng sẽ tích luỹ các thông số’ khác n h au để đưa ra được những dữ liệu tưdng đồng đủ cho việc lập bản đồ gen so sánh. 9.6.5.4. Lập bản đ ồ gen so sánh ở động vật cà xương số n g
Các nhà khoa học thực nghiệm với hệ thống động vật có vú đã quan tâm đến vấn dề lập bản đồ gen so sánh hơn 10 nãm nay. Sự p h át triển của phương pháp lai tê bào soma đã giúp xác định n h an h chóng vị trí nhiễm sắc thể và đôi khi là vị trí cánh nhiễm sắc th ể của các gen mã hoá enzym đặc trưng (Ruddle và Creagan, 1975). Kết quả của những nghiên cứu này và các kết luận th u được đã tìm hiểu được nhiều locus liên kết 402
(Syntenic —các locus nằm cùng nhiễm sắc thể) của các loài động vật có vú khác nhau (McKusick, 1980; Womack, 1983; Morizot và Siciliano, 1983). Nhuộm băng nhiễm sắc thể là phương pháp được sử dụng để nghiên cứu lập bản đồ di truyền cho linh trưởng và phương pháp này đã được khảng định lại nhờ nghiên cứu dấu chuẩn điện di. Theo đó, hầu h ết các locus tìm th ấy đều là liên kết ở người thì cũng liên kết ở tình tinh, khỉ đột, đười ươi, khỉ đầu chó, khỉ, khỉ xanh Châu Phi và khỉ mũ. Mưòi sáu nhóm locus liên kết được tìm thấy nhiều ở chuột và người, đã cho thấy sự ổn định của các m ảnh nhiễm sắc thể này trong hơn 80 triệu năm từ khi hai loài này tách nhau ra (Lalley et ai., 1978;'McKusick, 1980; Womack, 1983). Hiện tượng bảo tồn nhóm quan trọng eũng được tìm thấy ở hệ gen các loài chuột, chuột nhắt, chó, cừu và linh trưởng (McKusick, 1980; 0 ’Brein và Nash, 1982; Womack, 1983; Pearson et al., 1983). Các loài cá cũng được tập trung nghiên cứu lập bản đồ gen so sánh. Trong họ Poeciliidae, giống Xiphophorus và Poecilwpsis được tìm hiểu kỹ lưỡng nhất. Morizot và Siciliano (1983) đưa ra danh sách 41 gen mã hoá protein được kiểm tra về sự phân ly ồ Xỉphophorus.. 70% sô" thí nghiệm theo cặp về sự liên kết cũng đã được tiến hành. Dữ liệu vể phân ly và liên kết cũng thu được 17 locus ở Poeciliopsis (Leslie, 1982). Các so sánh từ hai giông trên cho thấy không có sự tái sắp xếp nào trong tấ t cả các nhóm liên kết được kiểm tra (Leslie 1982; Morizot và Siciliano, 1983). Các dữ liệu liên k ết khác nhau cũng có ở các họ cá Centrachidae cá trăn g (sunfishes) và họ cá hồi Salmonidae —cá hồi (salmon) (Morizot và Siciliano, 1983). Một so sánh trong dữ liệu liên k ết ở các.giông của cá hồi Salm onidae đã cho thấy có sự bảo tồn hệ gen ở mức độ rấ t cao (May et al.( 1982). Vì số lượng các loài đã được lập bản đồ còn bị giới hạn và khó khăn trong phân biệt locus song song —locus thẳng đứng, nên r ấ t khó khi đánh giá sự bảo tồn hệ gen của các bậc phân lóại trên họ. Tuy nhiên, hiện tại đã có một sô cụm liên kết được đề xuất. Một trong sô đó là liên kết của gen 6—phosphogluconat dehydrogenaza và gluco—&-phosphat ở động vật có vú, ếch (Rana pipỉens) và cá Ợíiphophorus) (Morizot và Siciliano, 1983). Tóm lại, từ các nghiên cứu lập bản đồ so sánh ỏ động vật, đã phát hiện được những bằng chứng về các cụm liên kết gen được bảo tồn trong một giai đoạn rấ t lâu trong thài gian tiến hoá. Ngay cả khi quá trình tiến hoá nhiễm sắc th ể che lấp sự tương tự về hình thái vật lý của nhiễm 403
sắc th ể trong các loài khác nhau, th ì vẬn có th ể xác định được các gen tương đồng qua nghiên cứu liên kết gen, để mở ra được nhũng vùng bảo tồn liên kết. 9.6.6. ứng dụng trong phân loại, tiến hoá và đa dạng sinh học 9.6.6.1. Ỷ nghĩa Trang phân loại học truyền thống, các chỉ tiêu dùng để phân loại là đặc điểm hình thái. Cho đến nay, phần lớn các kết quả th u được là do phương pháp này. Tuy nhiên, trong quá trìn h nghiên cứu đă nảy sinh một sô" trường hợp m à phương pháp phân loại truyền thống không giải quyết được. Ví dụ: hiện tượng loài đồng hình, là những loài có hình thái r ấ t giống, th ậm chí giống hệt n h au nhưng thực chất là hai loài khác nhau. Hiện tượng này thấy ở côn trùng, ký sinh trùng. Ví dụ, giun đũa người và giun đũa lợn.
Ngược lại, sự biến dị hìn h th ái lại thể hiện trong m ột loài nhưng có nhiều kiểu hình thái khác nhau. Hiện tượng này thấy ở các cá thể của cùng một loài nhưng sông trong các điều kiện khác nhau. Tương tự, nếu dựa vào đặc điểm hình thái để phân biệt 2 loài chị em - loài đồng huyết (sìblinh species), hai loài phụ (sub species) hay phần biệt biến dị trong loài (variation) cũng rấ t khỏ khăn. Có một thực tế là mọi quá trìn h trao đổi chất xảy ra trong cơ thể đều là chuỗi các phản ứng phức tạp do một hệ thống gen điều khiển mỗi loại enzym thực hiện một chức năng, thường không chỉ có một mà có nhiều cấu trú c khác nhau, chúng là các isoenzym. Có những hệ thông isoenzym m ang tín h bảo th ủ và đặc th ù rấ t cao đặc trư ng cho mỗi loại taxon nên chúng đã và đang được áp đụng cho những nghiên cứu trong phân loại và hệ thông tiến hoá. P h ân loại các vi sinh v ật chính là sự đ án h giá mớc độ khác nhau về m ặt di truyền. Thông thường các nhà nghiên cứu phải dựa vào hai chỉ sô" sau: - Hệ số tương đồng di truyền. - K hoảng cách di truyền. Hệ số tương đồng di truyền càng lớn thì sự giông n h au về m ặt di truyền càng lân. Khoảng cách di truyền càng lớn thì sự giông n h au về di truyền càng nhỏ. Từ những đặc tính đó có thể xác định được mối quan hệ họ hằng, xây dựng cây chủng loại p h át sinh. 404
9.6.6.2. Phân biệt kiểu gen
Khi nghiên cứu cấu trúc phân tử protein của các isozym cho thấy, chúng tồn tại dưới nhiều dạng kết hợp các phân tử dưới đơn vị được mã hoá bởi các gen khác nhau. Khi p h ân tích isozym để phân biệt kiểu gen của thực v ậ t thường lấy hạt, lá và có th ể nhận biết được sự đa dạng gen, từ đó có thể nhận biết dược dòng th u ần , các dòng giao phối gần, giao phối xa, các con lai,... râ't có ý nghĩa cho việc nghiên cứu cây trồng có năng su ấ t cao và phẩm chất tốt. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, ỏ lúa mạch, nhiễm sắc th ể số 4 m ang gen m ã hoá cho phosphataza axit và các isozym p-am ylaza; nhiễm sắc th ể số 5 m ang gen mã hoá cho phosphoglucoza, isomeraza; nhiễm sắc th ể số 2 mang một gen mã hoá cho glucoza-6-phosphat dehydrogenaza chưa hoạt hoá. Phân tích các isozym của các loài khoai sọ Colocasia esku.lenta đã phân loại được chính xác giông khoai sọ lưỡng bội trên vùng rộng lớn của Nepal và Thái Lan, đồng thời dựa vào biến thể isozym, người ta cũng p h át hiện th ây rằng, hầu hết cốc giống khoai sọ là tam bội, chúng được xem như là sự tiến hoá từ dạng ỉưSng bội. 9.Ổ.6.3. S ơ lư ợc nghiên cứt/ ở thụt: vật bậc cao Câu trúc nhiễm sắc thể: Số lượng lớn nghiên cứu để so sánh kiểu nhân giữa những loài có quan hệ ở thực vật và thông tin bổ ích cho nghiên cứu p h ân loại và nguồn gốc p h át sinh. Từ những nghiên cứu này cho thấy rõ ràn g kiểu nhân không được bảo tồn cao. Mặc dù thông tin bổ ích thu được từ những nghiên cứu so sánh vể hình thái nhiễm sắc thể, nhưng phương pháp này vẫn còn rấ t nhiều trồ ngại. Đầu tiên, vì các nghiên cứu này dựa trên tiêu bản nhiễm sắc thể cho quan sá t dưới kính hiển vi, trong hầu hết các trường hợp, không thu được thông tin gì về dữ liệu di truyền so sánh trong quan hệ gen của các loài. Vì kiểu nhân giông nhau thường không đồng nghĩa với cấc thông tin di truyền như nhau. Ví dụ: ta đã biết rấ t rõ là có sự khác biệt r ấ t lớn trong kích thưóc nhiễm sắc th ể và lượng ADN ở các loài thực vật bậc cao có cùng sô lượng nhiễm sắc thể đơn bội thuộc cùng một họ (có thể lên tới 36 lần) (Stebbins, 1971; B ennett và Smith, 1976). Điều này có thể được giải thích do các nguyên nhân đưa ra sau đây: Sô lượng ADN lớn hơn có thê cho thấy số' lượng lớn hơn của các gen cấu trúc có hoạt tính, hoặc là làm tăng số lượng ADN phản ánh số lượng lổn các trìn h tự lặp lại và trin h tự 405
không có nghĩa. Những nghiên cứu sự hồi tính của các sợi ADN đã bị biến tính bằng nhiệt ủng hộ cho giả th iêt thứ hai (Thompson et al., 1980). Một vấn đề cố hữu khác nữa trong so sánh thực v ậ t bậc cao ở các loài có quan hệ là chỉ có một sô" hiện tượng tiến hoá n h ấ t định liên quan đến nhiễm sắc th ể được p h át hiện. Sự khác biệt về số' lượng nhiễm sắc thể giữa các loài thường dễ dàng n h ận biết. Một số đảo đoạn và chuyển ’ đoạn thường quan sát khi biến đổi trong hình th ái nhiễm sắc thể, hoặc mô h ình băng khác nhau. Và vì th ế m à rấ t nhiều sự tá i sắp xếp như đảo đoạn ngoài tâm , m ất đoạn hay lặp đoạn không làm biến đổi nghiêm trọng toàn bộ cấu trú c nhiễm sắc th ể đã không được p h á t hiện. a)
L ậ p b ả n đ ổ so s á n h gen m ã hoá en zym
, R ất nhiều nghiên cứu về di truyền enzym thực vật đã được tiến hành. Tuy nhiên, môi quan hệ liên kết giũa các gen mã hoá enzym mới chỉ được xác định ở một sổ”ít loài. Vì thế, khác với động vật, hiện tại ta chỉ biết rất ít về sự bảo tồn liên kết qua thời gian tiến hoá ồ thựè vật bậc cao. Khi xem xét đến cốc locus enzym, đơn vị p hân loại được lập bản đồ tốt n h ấ t là ngô Zea mays (Goodman et al.f 1982), củ cải đưòng Triticum aestivum vằ các loại họ hàng (lúa mạch đen, lúa mạch, Agropỵron spp) H art, 1983; H a rt và Tuleen, 1983; Brown, 1983; Ja a sk a , 1983), cà chua Lycopersicon escuỉentum (Tanksley và Rick, 1983) và dứa Pinus (Conkle, 1981). Ba loài đầu tiên đều là thực v ật h ạ t k ín trong đó hai loài đầu là cây một lá mầm của họ G ram ineae (hoà thảo). Cà chua là cây hai lá m ầm thuộc họ Solanaceae. Dứa là đại điện duy n h ấ t của thực v ật hạt trần. Thực v ật h ạ t kín dưòng như tách ra từ m ột thực v ật h ạt trầ n có quan hệ gần gũi n h ấ t từ hơn 100 triệu năm trong kỷ P hấn trắng (Stebbin, 1974). Mối quan hệ p h át sinh của cây một lá 'm ầ m và hai lá mầm đến nay vẫn còn tra n h luận. Với so sánh liên kết, những bậc phẫn loại đại diện của thực v ật bậc cao phải lấy m ẫu cho p h ân tích có lẽ 1Ậ quá rộng lổn đốỉ vói một n h à nghiên cứu. Tuy vậy vẫn còn có thể phân biệt được m ột số vùng có th ể có sự bảo tồn liên kết. H a rt và Tuleen (1973) đâ đưa ra một so sánK"vị trí nhiễm sắc thể của 13 locus enzym tương đồng trong các loài họ hàng với củ cải đưòng Trìticum aestivum, đại m ạch Hordeum vuỉgare, Eỉytrigia elongữta (Ậgropyron eỉongatum) và lúa mạch đen Secale cereale. Không có bằng chứng nào về sự tá i sắp xếp liên k ế t trong ba loài đầu tiên. B ối với hệ gén R của cereale có bằng chứng vể nhũng khác biệt trong chuyển vị.
s.
406
Với mục đích so sánh sự sắp xếp liên kết trong các loài khác nhau, và các bậc p h ân loại xa nhau, nên có một tóm tắ t chuẩn của các nhóm hên kết gen isozym của các loài lúa mạch, ngô và cà chua (Bảng 9.2). Vì những tín hiệu gen khác nhau được dùng cho cùng enzym trong ba loài này, 'nên t ấ t cả các ký hiệu đểu được dịch ra thành một nhóm thông thường dựa trê n quy ưởc ở loài ngô. Ba nhóm tương đồng của locus tổng hợp có thể xác định được ỏ ngô và lúa mạch. Trên nhiễm sắc thể sô" 3 của lúa mạch chỉ có một gen MDH ty thể được mô tả, một gen GOT (phần dưới tế bào của sản phẩm isozym chưa dược xác định) và m ột dãy các gen mã hoá cho esteraza một thành phầp. Nhiễm sắc thể s ố 3 của ngô cũng chứa một gen MDH ty thể, một gen jmã hoá glyoxysom GOT, và một gen esteraza một th à ụ h phần. Khoảng cách bản đồ giữa các locus này trong lúa mạch chưa biết, và trong chúng trả i dài với tổng khoảng cách khoảng 86cM. Những gen này có tương đồng với hai loài kia hay không, nếu có, thì những gen liên kết lỏng lẻo như vậy là syntenic dưđi tác dụng của bảo tồn liên kết hay tiến hoá hội tụ tối nay vẫn chưa biết được. Một k h ả năng khác đôi với nhóm liên kết được bảo tồn giữa ngô và lúa mạch được tìm th ấy ở locus Amp và Got 2 (Aat2) trê n nhiễm sắc thể của lúa mạch, ở ngô, có th ể các gen tương đồng nằm trên cánh ngắn của nhiễrriỉ sắc th ể số 5. Ổ ngô, gen Adhl (mã hoá cho alcohol dehydrogenaza) và Pgmỉ (mã hoá cho phosphoglucom ataza nội bào) nằm cách n h au 6cM trê n nhiễm sắc th ể sô' 1. H ai gen Adh liên kết chặt trên nhiễm sắc thể của lúa mạch nằm cách 20cM với một gen mã hoá cho PGM (thành phần dưới tế bào chưa xác định được). Cũng trong cà chua, một gen của Adh, A d h l liên kết vối gen m ã hoá cho PGM cytosolic (Pgm-2) (Tanksley, 1979). Gen Adh và gen Pgm cũng được chứng minh là có liên k êt chặt chẽ ồ cần tây, Apium graveoỉens, một th àn h viên của họ Umbelliferae (Arus và Orton, 1983). Nếu liên kết A dh - pgm trong những loài này chứng m inh do có sự bảo tồn liên k ết éủa các gen tương đồng thay vì sự tiến hoá riêng rẽ, thì điều này sẽ là đại diện cho sự sắp xếp của một gen cổ xưa có lẽ tồn tại trước khi có sự phân hoá thực vật một lá mầm và thực vật hai lá mầm. Trưóc k hi khẳng định điều này, ta cần phải xác định sự sắp xếp liên kết của những gen này ở các loài thuộc họ thực v ật bậc cao khác và/hoặc để p h á t hiện thêm gen tương đồng khác trong cụm liên kết này cũng là syntenic như trong các loài đã nghiên cứu trước đó. 407
Bảng 9.2 So sánh bản đồ liên kết gen enzym ở cà chua, ngô và lúa mạch. Những locus dưới đây có thể thuộc vể các cụm gen được bảo tồn LÚA MACH 1 Nhiễm Sắc thể 1. 2. 3. (3)
Locus a-Am y, End, E3, E 5 (mon) E7, Gpd, Id2 E1 (mon), E 2 (mon), E4 (mon), E 6 (won), E10, Got3, Mdh2(M), Tpi-1
Acp2, Adh 1, A d 2, p-Am y, Pqm 4.(1) Mdh (C). Pgd2, P g i 1 5. 6. (5) Amp, a-Am y1, Pip1, Got 2, Adh - 3 Sdh 7. NGÔ* A d 1, Amp1(C), Amp2(C), Cat 2. Gdh 1(M), Pqm1(C). Pai(C) 1. E3(dim), E4(mon), E8(dim), Go 1(C), Mdb 3(M), Pgd2(C) 3. Adh 4. 5. Am p 0 - Amy, Cat, Got Mdh, Pqm End1, Idh 2(C), Mdh 2(M). P ad 1(C) 6. 7. EKdim ), E16(M), Pox3 Idh 1(C), Mdh 1(M) 8. Acp1 (C) 9. G d 2 (M ), Glu1 9. CÀ CHUA* 1. E3(mon}, Pox1, Sdh 1 E 1(dim), E5(dim), E6, E7(dim), Pox2, Pox3 2. 3. Pgm1(P), Pox7, Pox6 4. A dh 1, G0t1, Pgd1 Ppm2(C), Tpi2(C) 6. A dh 2, Acp1 7. Got 2(P), Got 3 8. Got 4, A cp2 9. E2 Pox4 9. 12. E(mon), Pgd2, Pqi(C) 1 Theo Brown (1983). Hart và Tuleen (1983). 2. Theo Goodman et al. (1982), Goodman và Suer (1983), 3. Theo Tanksley và Rick (1980a), Tanksley và Harris (1983). Nhiêm sắc thể tương ứng ở ngô được đánh dấu trong ngoặc, (mon): isozym một thành phần, (dim): hai thành phần, (C): isozym trong tế bào chat, (P): plastid, (M): ty thể, (G): glycoxysom. Acp: axil phosphataza (EC 3.1.3.2), Adh: alcohol dehydrogenaza (EC 1.1.1.1), Amp: aminopeptidaza (EC 3.2.1.1), a-Amy: a-am ylaza (EC 3.2.1.1), p-Amy: p-amylaza {EC 3.2.1.2), Cat: Ca alaza (EC 1.9.1.6), Es Esteraza (EC 3.1.1.-), En: endopeptidaza {EC 3.4.21-24.-), Gd: glutamat dehydrogenaza (EC 1.4.1.2), Glu: p glucosidaza (EC 3.2.1.21), Got: glutamat oxaloaxetic transaminaza (EC 2.6.1.1), Gpd: 6 phosphogluconat dehydrogenaza (EC 1.1.1.37), Pgi: phosphoglucosomeraza (EC 5.3.1.9), Pgm:phosphoglucomutaza (EC 2.7.5.1), Pox: peroxidaza (EC 1.9.1.7), Sdh: shikimat dehydrogenaza (EC 1.1.1.25), Tpi: trioza phosphat isomeraza (EC 5.3.1.11.
408
b) So s á n h m ô i quart hê so lương 1>Ò liên k ế t củ a các g eti m ở h oá h o ạ t tín h A d h Di truyền học của alcohol dehydrogenaza (EC 1.1.1.1) đă được nghiên cứu ở r ấ t nhiều loài thực vật bậc cao hơn bất kỳ enzym nào khác. Vì th ế rất khó so sánh với một sô' lượng tương đôì lớn của thực vật bậc cao. Băng 9.3 tóm tắ t dữ liộu di truyền học Adh đã có ỏ thực vật bậc cao. Chi các những loài có quan hệ liên kết mới có m ặt trong bảng trên. Trong tấ t cả các loài đã liệt kê, có hai gen Adh được mô tả. Dưới điều kiện không yếm khí, isozym Adh có thể được tìm thấy ở h ạ t giống (phôi và/hoặc nội nhũ) và h ạ t phấn. Trong hầu hết trưòng hdp, chỉ có một trong hai gen Adh là trội ở hạt giống trưởng thành. Gen đảm nhiệm hầu hết các hoạt tính trong h ạ t chín thường là gen mã hoá cho Adh ở h ạt phấn. Các gen Adh khác nhau có thể, hoặc không thể được cảm ứng bỏi điều kiện yếm khí. Trong tấ t cả các loài thực vật một lá mầm kể trên, tấ t cả các gen Adh đểu được cảm ứng bởi kích thích của môi trường sông. Còn ở thực v ật hai lá mầm thì chỉ có một trong số hai gen của mỗi loài quan s á t thấy có sự hoạt hoá bởi áp lực yếm khí. Ngô Zea mays, lúa mỳ Tritỉcum aestivum, đại mạch Hordeum vulgare và kê Pennisetum typhoỉdeSy tấ t cả thành viên của họ hoà thảo G ram ineae đều m ang các gen Adh có đặc tính tương tự nhau. Gen này và các gen khác đều được hoạt hoá bởi tác động yếm khí. Ó ngô, isozym của các cá th ể trội trong h ạt cũng được tìm thấy ở h ạ t phấn, Sự biểu hiện gen Adh của h ạ t phấn không được kiểm tra ở 3 loài còn lại. ơ ngô, hai gen độc ỉập nhau, nhưng ở 3 loài kia, thì cũng lại được liên kết chặt chẽ, điều có th ể dược cho là do sự lặp lại liên tiếp nhau. Nếu các cặp gen Adh của 4 loài th ân cỏ này có vị trí thẳng hàng nhau, thì ta có thể cho rằng, sự sắp xếp lặp lại liên tiếp xảy ra sau sự phân ly của Zea, nhưng trước sự p h ân ly của Triticum. Giả thiết sau đòi hỏi phải có sự quan hệ gần gũi hơn giữa Pennỉsetum vái Tritìcum và Hordeum hơn là vói Zea thuộc cùng một dưới họ Panicoideae; còn hai giông kia thì lại thuộc vào dưới họ Poeae (Gould, 1968). Một giả th iết khác nữa là sự lặp lại liên tiếp ỏ Triticum, Hordeum và Pennỉsetum có cùng nguồn gổc vì hai giống này thuộc cùng m ột tộc (trên chi, dưới họ), Triticeae, và hai loài đại diện ở bảng có th ể lai được với nhau. 409
V
Bảng 9.3. Di truyền so sánh của gen m i hoá Adh (EC 1.1.1.1) trong các loài thực vật khác nhau Loài Ngô Zea m ays
+
Adh1** Adh2“
D
Adh1 Adh2
s
+
s*
+
Adh1
s*
+
Adh2
s
+
Adh-1 Adh-2
s*,p
D
D
Hướng dương ' Helianthus
s
H
Cà chua Lycopersicon ẽsculentum
+
Adh1 Adh2
Kê Pennisetum typhoides
s*. p
D
Đại mạch Hordèum vulgare
Indue.
Locus
Lúa mì Triticum aestivum
T.s.
M úc bội
D
annuus
s
s
+ +
+
Adh1
s
Adh2
s*pp
+
s
+
stephanom er ia axigua
D
Adh1 Adh2
Lupinus angustifolius
T
Adh1 Adh2
s*. p s ,p
+
s
Liên kỗ't
Tham
Khảo
I
1
L
2
L
3
L
4
I
5
L
6
L
7
I
8
* Locus đóng góp tỷ lệ hoạt động Adh lớn hơn trong hạt. ** Tập hợp lặp lại ba lần của các locus nằm ngang nằm trên các nhiễm sắc thể tương đổng. Tham khao: 1: (Sc war, 1967, 1971), 2: (Har, 1970, 1980), 3: (Brown, 1980), 4: (B an u eBourillon, 1979,1982), 5: (Tanksley, 1979; Tanksley và Jones, 1981), 6: (Torres, 1974; Torres el al., 1977), 7: {Roose và Gottlie, 1980), 8: (Mars all et al., 1974). Ghi chú: {T.S.: đặc hiệu mô - bao gồm tất cả các mô hay cơ quan có gen biểu hiện, S: hạt giống, P: hạt phấn, D; lưỡng bội, T; tứ bội, H: lục bội, I : độc fàp, Indue. : cảm ứtig bởi môi trường yếm khí, L: liên kết).
Cây hưóng dương Helianthus annuus và Stephanomeria đều là thành viên của họ Compositae. Tuy nhiên, chúng lại ít giông nhau về quan hệ điểu hoà và liên k ết về các gen A dh . ở Helỉanthus, gen Adh chịu trá ch nhiệm làm tăng hoạt tính trong h ạ t và chỉ có một gen có hoạt 410
tính trong h ạ t phân được cảm ứng bởi mồi trường yếm khí. Ngược lại â Stephanomerìa, Adh h ạ t pbấn đặc trưng lại không được cảm ứng. Vì th ế mà ở loài này, hai gen đều liên kết chặt nhau, trái lại chúng lại phân loại độc lập vói hướng dương Helianthus. Lặp lại liên tiếp xảy ra một cách tự n h iên làm x u ất hiện lên tới 3 bản sao của gen đã được p h á t hiện ở locus A d h l của Stephanomeria (Roose và Gottlied, 1980). Bằng chứng này cho thấy, có ít n h ấ t trong sô" các cây hai lá mầm, hiện tượng phân ly quá trìn h điều hoà và lặp lại và một đặc điểm thông thường của sự tiến hoá các gen Adh ở thực vật. c) L o à i đ a bội Khi nghiên cứu lập bản đồ gen so sánh ỏ những loài đa bội, đặc biệt là những loài đa bội cũ, cần hết sức cẩn trọng. Khả năng tồn một số locus lặp lại (do m ang nhiều bản sao của bộ gen) có thể là im lặng. Kết quả là có th ể dẫn tới những dữ liệu liên kết sai iầm. Ví dụ: locus A và B liên k ết vói n h au và có m ặt hai lần trong một thể tứ bội (A—B, A -B ’), thì có khả năng A* là im lặng ỏ một th ể đồng hợp và gen B’ trên thể còn lại. Khi điều này xảy ra, chỉ có một locus đơn A và B được p h át hiện, và chúng được lập bản đồ trên các nhiễm sắc thể khác nhau, mặc dù không có sự tái sắp xếp nào xảý ra. N hững locus lặp lại này sẽ im lặng sau khi quá trìn h đa bội hoá đựdc dự đoán nhờ mô hình toán học (Nie và Roychoudhury, 1977; T ak ah ata và M aruyam a, 1979; Kim ura và King, 1979; Allendorf, 1979). Allendorf đã dự đoán rằng, việc m ất đi các gen lặp lại sau quá trìn h đa bội hoá xảy ra r â t nhan h chóng. Các nghiên cứu cổ điển ở cá tứ bội thuộc họ Salm onidae và Catastom idae đã cho thấy các locus lặp lại sẽ im lặng sau khi đa bội hoá. Trong hai trường hợp này, khpảng 50% các gen lặp lại không biểu hiện ò các loài họ hàng (Ferris và W hitt, 1977; Allendorf, 1979). Tác động đệm của nhiều bản sao hệ gen ả các loài đa bội có thê cung cấp một trạ n g th ái cho phép sự tái săp xêp dân tớí m ất đoạn. Nêu điểu này xảy ra, th ì nhà nghiên cứu có thể mong đợi sự tá i sắp xếp liên kết sẽ xảy ra thưòng xuyên ở các loài đa bội hơn là bản sao lưỡng bội của chúng. Nghiêh cứu về đa bội là thích hợp để lập bản đồ gen so sánh ở thực v ật bậc cao, vì 47% các loài thực vật h ạ t kín đều là đa bội (Grant, 1971) 411
và vì một và có th ể là hai loài thực v ật đã được lập bản đồ, tốt n h ấ t là loài đa bội. Củ cải dưòng là loài lục bội được tạo th àn h từ khoảng 10.000 năm trước (Feldman, 1976). Đây là một cây thực v ật bậc cao duy nhâ't không còn tra n h cãi về lặp bản đồ gen mã hoá enzym. N hư vậy tấ t cả các dược liệu đỂu cho thấy, chỉ một số’ít gen im lặng trong loài đa bội này, hoặc không có sự tái sắp xếp nhiễm sắc thể nào xảy ra trong hệ gen từ khi chúng được đa bội hoá (H art, 1979, 1983). Người ta giả th iết ngô (n = 10) là một loại tứ bội tổ tiên x u ất p h át từ sự kết hợp hệ gen từ hai loài tổ tiên có n = 5. Một số' giông như Coix và Sorghum (n = 5) được cho là có họ hàng với ngô. Bằng chứng về thể đa bội gồm có tỷ sô' phân ly gen lặp lại (Rhoades, 1951) và tập hợp lặp lại của các locus enzym (Goodman et al,, 1980; Gottlied, 1982). Nếu ngô th ậ t sự là một loài tứ bội và một số locus lặp lại im lặng, th ì ta có thể tìm thấy những bằng chứng ít nhầm lẫn về sự bảo tồn liên kết khi so sánh với các loài lưỡng bội có họ hàng khác. d) Đ iêu g ì là cẩ n th iế t Để đánh giá đúng mức độ nhóm liên kết được bảo tồn ỏ thực vật bậc cao qua một thời gian dài phân ly tiến hoá, ta cần phải chọn trước hết một số họ vả cố gắng thiết lập được sự tương đồng gen và làm sáng tỏ mối quan hệ liên kết trong những họ đó. Những gen m ã hoá isozym, chức năng in vitro đã được xác định, là những chỉ th ị lý tưỏng bởi vì chúng giúp thiỗt lập được sự tương đồng isozym ở các bậc phân loại xa nhau dễ dàng hơn. Đó là những gen mã hoá cho: alcohol dehydrogenaza, amylaza, glu tam at oxaloaxetat transm inaza, glu tam at dehydrogenaza, isoxitrat dehydrogenaza, m alat dehydrogenaza," n itrit reductaza, phosphoglucoisomeraza, 6-phosphat gluconat dehydrogenaza, shikim at dehydrogenaza, trioza phosphatisom eraza. Những kỹ th u ậ t nhuộm băng tốt có thể p h át hiện được những enzym này (Vallejos, 1983) và một sô đặc điểm dì truyền cũng có thể được giải quyết trong một, hoặc một vài loài thực v ậ t bậc cao. Họ hoà thảo G ram ineae và họ cà Solanaeeae thích hợp n h ất cho nghiên cứu lập bản đồ so sánh. Trước tiên, chúng là đại diện cho cả cây một lá m ầm và hai lá mầm; và thứ hai, m ột số lượng n h ấ t định công việc lập bản đồ đã được tiến h àn h ở một sô" chi của h ai họ này. Ở họ cà Solanaceae, cà chua Lycopersỉon được lập bản đồ tốt nhất, nhưng dữ liệu 412
lập ban đô có thê th u được một cách dễ dàng ở cây ớt Capsicum, cà độc dược Datura, cây dạ yên Petunia và cây thuốc lá Nicotiana, ỏ những loài này đã có sẵn các đặc điểm di truyền của một vài isozym và có một nguồn đa bội lẻ r ấ t tốt giúp cho việc lập bản đồ nhanh chóng, ở họ hoà thảo G ram ineae, chi được nghiên cứu tốt n h ất là củ cải Tritỉcum, đại mạch Hordeum và ngô Zea. 9.6.6.4. C h ỉ th ị isozym trong nghiên cúu phân lo ạ i các nhóm lúa
a) Đ ặ c đ iểm củ a p h â n tíc h hệ isozym b ằ n g p h ư ơ n g p h á p điện d i câ u tr ú c p h â n tử của các isozym là do cấu trú c đ ă c b iê t của A D N củ a n h iễm sắ c t h ể q u y đ in h Trong điện trưòng, khi điện di, hầu hết các phân tử protein di chuyển từ cực âm đến cực dương. Các isozym sẽ di chuyển vói tốc độ khác nhau do sự tích điện và khối lượng phân tử khác nhau. Đe phân tích các hệ isozym thông thường được điện di trên gel tình bột, hoặc thông dụng n h ất là trên gel polyacrylamit. Bản điện di polyacrylam it thường sử dụng gel 2 lớp (gel cô và gel tách), đôi khi có thể sử dụng bản điện di gradient. Các isozym được p h á t hiện bằng các băng bắt m àu do phản ứng của các sản phẩm do enzym xúc tác tác dụng với thuôc nhuộm. Thông thường các enzym được tìm thấy có 3 loại hình khác nhau, dựa vào tốc độ di chuyển của các băng điện di protein xác định loại hình di truyền: di chuyển chậm (S), tru n g bình (M), và nhanh (F). Mỗi băng trong ba loại hình này được tạo thành bởi một alen đơn của gen mã hoố tổng hợp nôn một protein s , M, F. Các enzym này là enzym dị lập thể (alosteric) có cấu trú c bậc 4, còn được gọi là allozym. Có thê có 6 kiêu gen (genotype):
- 3 đồng hỢp tủ: s/s, M/M, F/F. - 3 dị hợp tử: S/M, S/F, M/F. Các enzym của các kiểu gen này thê hiện băng điện di và được gọi là băng của isozym. Các isozym cho biết về mối quan hệ di truyền của lúa. Vì vậy, phương pháp nghiên cứu phổ điện di isozym được sử dụng đê nghiên cứu di truyền chon giống lúa nói riêng và chọn giông cây trông nóí chung. b) P h ả n lo a i cá c nhóm lú a b ằ n g isozym Đối với lúa, có r ấ t nhiều isozym đã được nghiên cứu và có trên 40 413
loại. Trong đó có hơn 20 loại enzym đã được kiểm chứng lại bằng định luật M endel đối với nhiều alen thuộc các loài của Sativae. Ví dụ như: 1. Alcohol dehydrogenaza 8. Lơxin am inopeptidaza 2. A lanin am inopeptidaza 9. Isoxitrat dehydrogenaza 3. A rginin am inopeptidaza 10. M alat dehydrogenaza 4. Axit phosphataza 11. Phosphoglucoza isom eraza 5. C atalaza 12. Phosphogluconat dehydrogenaza 6. E steraza 13. Phospho peroxidaza 7. G lutam at oxaloaxetat tran sam in aza 14. Shikim at dehydrogenaza Mối quan hệ của các loài lúa hoang dại Sativae và Latifoliae đã được nghiên cữu bằng isozym và sự cách biệt của hai loại h ìn h indica và japonica cũng đã được công bố. Các công trìn h nghiên cứu isozym cho thấy có sự khác biệt trong tần suất alen giữa h ai loại hình indica và japonicã trong 7 locus với sự biểu hiện của các isozym. Peroxidaza (Pox-2), axit phosphataza (Ạcp-1), esteraza (E st-Ĩ và E st-2), phosphoglucoza isom eraza (Pgi-A và Pgi-B) và catalaza (Cat). Trong các loại này, Acp—Ỉ chứng m inh một cách chính xác n h ấ t sự phân nhóm giữa 2 loại hình indica và japonica. Trong sắc ký đồ (zymogram) của axit phosphataza, 2 loại hình này được p h ân biệt bằng khoấng cách di chuyển của các băng c , trong đó ỏ vị trí —4mm (Ạcp—1~*) thuộc loại hình indica và ở vị trí 9mm (Ạcp—1°) thuộc loại hình japonica. G laszm an (1986) đă nghiên cứu nhiều isozym khác n hau của các giống lúa trổng có nguồn gổc châu Á và đã chia th à n h 6 nhóm như sau: - Nhóm 1: Nhóm indica điển hình, tập hdp các kiểu sinh thái (ecotyp) thuộc loại hình Aman (Bangladesh, Đông bắc Ấn Độ), loại hình Jjerh (Indonesia) và Hsien (Trung Quốc). —Nhóm 2: Gồm các giốnê lúa cố nguồn gốc ỏ vùng canh tác dọc theo chân đồi thuộc dãy Him alaya, kéo dài từ Iran đến bang A ssan (An Độ). Tập hợp các loại hình Aus (Bangladesh, An Độ) và một vài giống thuộc loại hình Boro. - Nhóm 3: Gồm 2 giống của Bangladesh và Bhadioa và Aswina, đó là những giông lúa nước sâu, chín sâm, không cảm quang. — Nhóm 4: Tập hợp các giông lúa thuộc indica, như loại hình R atada. Đó là những giống lúa nổi, gieo h ạ t với lúa Koro, chu kỳ sinh trưởng đến 12 tháng.
414
- Nhóm 5: Tập hợp các giông lúa có nguồn gôc địa lý kéo dài từ Iran đen M ianm a, dọc theo dãy Himalaya, rấ t phong phú về di truyển. Nhiểu giống có phẩm chất gạo rất cao như Sadri (Iran), Basm ati (Pakistan, Ấn Độ, Nepal) và một vài giống của Miama. - Nhóm 6: Tập hợp các giông thuộc' họ japonica. Bên cạnh các giông lúa của N h ật và H àn Quốc, có Kinh của Trung Quốc, nhóm bulu của Indonesia, h ầ u h ết các giống lúa rẫy ở Đông Nam Á và lúa trồng trên vùng cao ở H im alaya. c) Ỷ n g h ĩa sin h học và cả ỉ biến g iố n g Sự cải biến giống cây trồng là tạo nèn những giống mới, là sự phối hợp những gen mới trên quỹ gen hiện có. Nhà chọn giống phải nắm rõ cấu trúc di truyền của v ật liệu và những đặc tính của nó. Ví dụ: trong những lúa có khả nãng chịu ngập tốt liên quan rõ vái alcohol dehydrogenaza; các giống lúa chịu hạn liên quan tới hệ enzym tổng hợp prolin,... N ghiên cứu các isozym có th ể giúp chúng ta làm rõ sự phân bố nguồn gen của nhiều alen trên nhiều locus khác nhau, đồng thời lai tạo giống mói có nhũng đặc tính mong muôn. - Sự khác biệt trong điện di chỉ là một phần của sự điện di tổng quát. - Sự phân hoá của các giông trong nhiều nhóm vẫn xảy ra trong thực tế, nhưng các nhóm này có thể còn dị hợp. - Nhóm 1 là nhóm lân n h ất về số' lượng giông, trả i rộng toàn vùng châu Á, trong khi nhóm 2, 3, 4, 5 chỉ tìm thấy ỏ lục địa Ấn Độ, dọc theo dãy Him alaya. - Sự khác n h au giữa tổ hợp lai in d ic a X aus thường gặp khó khăn do tỷ lệ bất th ụ cao, ít có sự tái tổ hợp. Sự lai tạo giữa nhóm 1 và nhóm 5 cũng có hiện tượng giống như vậy. Các dòng con lai giữa B asm ati 370 với các giống indica điển hình đều cho hiện tượng bất thụ và khả năng tái tổ hợp r ấ t kém. - Các giống lúa nổi, lúa nước sâu ỏ châu Á phần lớn thuộc loại hình indica. Tuy nhiên, loại hình japonica cũng được tìm thây ơ nhóm lúa nưóc sâu của M ianm a (25%), Bangladesh (19,5%), và An Độ (53%). Loại hình japonica không tìm thây ở các giốhg lúa nước sâu Thái Lan, Việt Nam và Campuchia. Các giông lúa của Bangladesh có mức độ khác biệt về di truyền duy nh ất, do đó nó sẽ cung cấp một sự đa dạng vê di truyên trong cải tiến giống lúa. 415
Bảng 9.4. Danh sách các gen đối với các isozym Kỷ hiệu A cp A cp A cp A cp
- 1
- 2
A cp - 3
- 3 - 4
A ơ h -1 Am p- 1 Am p- 2 A m p —3 Cat - 1 E st - 1 Est-2 Est-3 Est-4 Est-5 Est-6 Est-7 Est-8 Est-9 Got- 1 Got- 2 Got- 3 led - 1
M dh- 1
Pgd- 1 Pgd-2 P g i- 1 P g i-2 P q i-3 P ox - 1 P ox - 2 P ox - 3 Pox - 4 Sdti - 1
416
Đổng nghĩa theo phân loại củ a Second và Glaszman N akagahra Pai và CTV Trouslot và CTV và CTV (1983) (1984) (1978) (1980) A c p -1 A cp - 1 Axit phosphataza A cp -B (Pac-AMC) P a c -2 A cp - 2 Acp~ C (P a c -F -S ) P a c-1 [EC 3.1.3.2] Enzym (SỐ B.C)
Alcohol dehydrogenaza [EC 1.1.1.1] A m i n o p e p t id a z a
(EC 3.4.11-) Catalaza
Esteraza [EC 3.1.1—]
Aspatat aminotransferaza [EC 2.6.1.11 Isoxitrat dehydragenaza [EC 2.6.1.1] Malat dehydrogenaza [EC 1.1.1.391 Phosphat gluconat dehydrogenaza [EC 1.1.1431 Phosphoglucoza isomeraza [EC 5.3.1.9]
A d h -A
L a p -E C a t-A Est-D Est~E Est-J Est-B Est-C Est-I
E s t - Ca Got-A Got-B Got- c
Shikimat dehydrogenaza fEC 1.1.1.251
Cat Est-3 E s i- 1
Est-2 Est-5 Est-6 Est- 1
Am p - 1 Am p - 1 Cat - 1 Est-2 Est-1 Est-2 Est-3 Est~4
Est~c1
l e d - A (Idh - A)
M dh-A
Pgd-A Pgd-B
Pox-E
Peroxidaza [EC 1.9.1.25]
Lap A ap
Pox-B P ox - c
Px- 1 Px-2 Px-3 Sdh- 1
9.6.7. Đối với Y học N hiều loại bệnh của người có quan hệ m ật th iết với một số isozym như bệnh nhồi m áu có liên quan đến lactat dehydrogenaza, creatin phosphokinaza. L actat dehydrogenaza là một enzym có liên quan đến nhồi m áu cơ tim cấp. Hill. D (1954) là người đầu tiên p h át hiện thấy lactat dehydrogenza tăng trong m áu bệnh nhân nhồi m áu cd tim và trong dịch não tuỷ của người bệnh có tổn thương cơ quan th ầ n kinh trung ương. L actat dehydrogenaza xuất hiện muộn trong m áu nhưng thời gian tồn tạ i kéo dài. S tark W aether và Shock (1962) đã p hát hiện thấy sự phân bô”của 5 loại isozym la cta t dehydrogenaza có chiều hướng tăng theo thời gian ở khối u trong một sô"cơ quan, R ichterich và B urger (1963) cho biết, isozym M của lactat dehydrogenaza tăn g lên một cách khác thường trong quá trìn h phát triển khối u. Trong nhồi máu cơ tim, m alat dehydrogenaza tăng nhất thời cùng với glu tam at oxaloaxetat transam inaza trong huyết thanh. G risuk A.1.(1967) n h ận thấy sự tăng chủ yếu trong nhồi m áu cơ tim là m alat dehydrogenaza toàn phần và m alat dehydrogenaza 3 (loại ty thể), còn m alat dehydrogenaza 1 (thể bào tương) giảm, nhưng đôi khi tình trạn g này cũng xảy ra ở bệnh nhân thiếu m áu cục bộ cơ tim. C reatin phosphatkinaza là phân tử gồm 2 tiểu đơn vị M (muscle type - loại cơ) và B (Brain type - loại não), mỗi tiểu đơn vị có một chuỗi polypeptit gồm 360 axit amin, khốỉ lượng phân tỏ 41.000 Dal. Creatin phosphokinaza có 3 loại isozym như sau: (1) C reatin phosphokinaza loại cơ (muscié type) viết tắ t là CK - MM. (2) C reatin phosphokinaza loại viêm cơ tim (myocardial type) viêt tắ t là CK-MB. (3) C reatin phosphokinaza loại não (brain type) viết tắ t là CK-BB. Trong đó CK-MM có trong cơ vân, CK-MB có trong cd tim và CK BB có trong não, các isozym này tuy có số" lượng khác nhau nhưng chỉ có duy nh ất, hoặc gần như duy n h ấ t trong một cơ quan. Vì vậy, các isozym này rấ t có giá trị trong chẩn đoán hơn là enzym. Tuy chứng xuất hiện trong huyết th a n h ỏ tỷ lệ thấp hơn enzym, nhưng sự tăng lên của chjiing trong huyết th an h là sự báo hiệu chính xác cơ quan bị tôn thương đã giải phóiig ra chúng. Sobel. B.E (1974) và nhiều tốc giả khác đã đưa ra kết luận rằng, CK-MB có vai trò đặc trưng cho nhồi m áu cơ tim cấp. 417
Tuy đã có những kết quả trên, nhưng việc ứng dụng CK-M B trong chuẩn đoán nhồi m áu cơ tim cấp còn bị hạn chế, vì phương pháp xét nghiệm còn phức tạp. Năm 1975, Lang H., Kledel M. và nãm 1997, Pfleider G. áp đụng phương pháp miễn dịch kết tủ a để xác định CK-MB trong h uyết th a n h một cách dễ dàng, nhanh và chính xác.
CÂ U HỎI ÔN TẬP
1. Định nghĩa isozym. 2. Vai trò của isozym betat dehydroxyelase. 3. Vai trò của isozym hexokinase. 4.
ứ n g dụng của nghiên cứu enzym.
418
Chương 10 PHÂN LOẠI ENZYM
Trong chương này, các th u ật ngữ khoa học chúng tôi giữ nguyên bằng tiếng Anh để không bị nhầm lẫn. 10.1. GIỚI THIỆU VỂ LỊCH s ử PHÂN LOẠI ENZYM
Sự p h á t triển n h an h của ngành khoa học enzym (ngành Enzym học), cùng với sự tãn g nhanh sô” 1ư ợ n g các enzym đã biết đã đưa đến nhiều khó k h ă n về th u ậ t ngữ trong những năm gần đây. Vào khoảng năm 1955, người ta đã chứng m inh rằng, nếu thiếu các nhà chuyên gia trong lĩnh vực này th ì không th ể đưa ra được một danh mục (bảng danh pháp) các enzym. Việc đ ặt tên enzym của từng cá nhân thực sự là không m ang lại sự thoả đáng. Có nhiều trường hợp các enzym giốhg nhau được viết dưới dạng các tên khác nhau; ngược lại, cũng có nhiều trường hợp, các enzym khác nhau lại có tên giông nhau. Nhiều tên ít, hoặc không truyền đạt được bản chất của các phản ứng được xúc tác, và đôi khi các tên tương tự n h au lại được đặt cho các enzym thuộc các kiểu hơi khác nhau. Để giải quyết tình trạng này, các nhóm chuyên gia, hoặc một số các chuyên gia riêng lẻ đã có nhiều nỗ lực trong việc đưa ra một danh mục enzym chung, hoặc một danh mục các nhóm enzym đặc biệt. Tuy nhiên, không có một danh mục nào được chấp nhận. Hơn nữa, cũng chưa có một sự thông n h ấ t nào về một danh mục các coenzym, mà trong đó có rấ t nhiều tên của các enzym chắc chắn phụ thuộc trong các phương trìn h động học enzym, các hệ thông khác nhau và sự tiêu chuẩn hoá các enzym đã ở trong một trạn g thái hỗn loạn, do vô số các đơn vị hoạt động enzym đã được xác định rõ ràng. Để giải quyết vấn đề này, trong suốt thời gian Hội nghị Hoá sinh th ế giới lần thứ III tổ chức ở Brussels vào tháng 8/1955, Hội Hoá sinh th ế giới (International Congress of Biochemistry —IƯB) đã quyết định th àn h lập m ột Uỷ ban th ế giới về các enzym. Đây là kết quả của một cuộc thảo luận với Hiệp hội quốc tê của sự tinh sạch và hoá học ứng dụng (International Union of Pure and Applied chemistry IƯPAC). Uỷ ban Enzym th ế giới được tạo thành lập vào năm 1956, người đứng đầu Hiệp hội Hoá sinh th ế giới, Giáo sư M. Florkin, do một u ỷ ban giới thiệu (ad hoc Commitec). 419
Các th à n h viên được chỉ định bởi u ỷ ban Hiệp Hội hoá sinh th ê giới là A. E. B raustein, Liên Xô; s .p . Colowick, Mỹ; p. A. E. Desnuelle, Pháp; M. Dixon, Anh (Chủ tịch); w . A. Engelhardt, Liên Xô; E. F. Gale, Anh; 0 . Hoffm ann - Ostenhof, Áo; A, L. Lehninger, Mỹ; K. Linderstrom Lang, Đ an Mạch và F. Lynen, Đức. Các th à n h viên liên lạc: F. Egami, N hật; L. F. Leloir, A rgentina, Vào nãm 1959, khi K. Linderstrom Lang m ất, E .c. Webb (Vương quốc Anh, sau đó là Áo) đã gia nhập u ỷ ban này. Một sô" th u ậ t ngũ do u ỷ ban Enzym đưa ra sau đây bỏi u ỷ b an giới thiệu (ad hoc Commitec). “Xem xét sự phân loại và định tên các enzym, các đơn vị hoạt động của chúng và các phương pháp th í nghiệm tiêu chuẩn, cùng với các ký hiệu được sử dụng để mô tả động học enzym”, u ỷ b an Enzym đã gặp phải r ấ t nhiều khó k h ăn b ắ t nguồn từ việc đặt tên không có sự chỉ đạo vổi một số' lượng các enzym đã biết ngày càng tăn g n h an h . Một sô" tên sử dụng hoàn toàn không đúng; một số tên khác ít, hoặc không truyền đ ạt được bản chât của phản ứng xúc tác, ví dụ như tên diaphorase, zwischenfermeat, catalase. Đôi khi các enzym xúc tác cho các p h ản ứng cần th iết tương tự n h au lại có tên thuộc các nhóm khác nhau, trong khi đó một số enzym thuộc các kiểu khác nhau lại được xếp vào cùng m ột nhóm, ví dụ như: các pyrophosphorylase bao gồm cả các glycosyl tran sferase và phosphotransferase. Trong một vài trường hợp, một tên đã được sử dụng tốt trong nhiều năm đă rõ nghĩa, như th u ậ t ngữ synthetase, th ì sau đó lại được sử dụng với nghĩa khác, gây ra sự lộn xộn, Do đó, một trong những nhiệm vụ chính của u ỷ ban là xem xét và đưa ra một danh mục enzym hợp lý nh ất, và có thể đưa ra một bộ lu ậ t nguyên tắc theo hệ thông sẽ được dùng như sự chỉ dẫn cho việc đ ật tê n m ột cách chắc chắn các enzym mói trong tương lai. Đồng thòi, Ưỷ ban này cũng nhận th ấy những khó khăn do một số lượng lớn sự thay đổi tên những enzym đã biết gây ra, và muốn giữ lại các tên hiện có nêu không có nguyên nhân chính đáng cho việc tạo ra một sự thay đổi. Hơn nữa, việc xem xét bãi bỏ một số điều nhằm làm giảm sự rắc rôì và ngăn cản sự nảy sinh thêm những rắc rối khác. Nhiệm vụ này có thể được hoàn th à n h và không gây ra một sự bất tiện nào, đó là yêu cầu để giải quyết vấn đề trong thời gian xem xét. Để giải quyết công việc, Uỷ ban Enzym đã liên hệ chặt chẽ với u ỷ ban định tên Hoá sinh của IUPAC. Hơn nữa, u ỷ ban này cũng xem xét nhiều 420
sự giải thích và gợi ý của rấ t nhiều chuyên gia trong lĩnh vực này, 52 tài liệu chính thức đã được thông qua và thảo luận trong một vài cuộc họp. Cuối cùng, Uỷ ban đã chuẩn bị một bản báo cáo đại diện cho một tập hợp chung của Hiệp hội Hoá sinh th ế giới tại một cuộc họp tổ chức ở Matxcơva năm 1961. Từ 1961, một danh mục đưa ra trong bản báo cáo này đã được sử dụng rộng rãi trong các tạp chí khoa học, sách giáo khoa,... Sau đó Hội nghị của IUB vê' enzym đã giải tá n và lập ra m ạt Uỷ ban Enzym bao gồm s .p . Colowick, o . Hoffmann - Ostenhof, A.L.Lehninger và E .c. Webb (Thư ký). Uỷ ban này đã thảo luận về những n hận xét phê phán n h ận được đối với bản báo cáo đã xuất bản của Uỷ ban Enzym và đã chuẩn bị x u ất bản cho lần xuất bản thứ hai, các lòi giới thiệu năm 1964 của Hiệp hội Hoá sinh th ế giới về sự định tên và phân loại enzym. Chức năng của Uỷ b an về enzym là tiếp quản của Hội đồng IUPAC/ IUB toàn bộ của Ban Uỷ nhiệm danh pháp hoá sinh (Commition on Biochemical N om enclature - CBN). Ban Uỷ nhiệm này ban đầu được giải quyết việc định tên rấ t nhiều hợp chất hoá sinh quan tâm . Tại cuộc họp vào th án g 9/1969, ngưòi ta đã quyết định giói thiệu về danh pháp enzym bao gồm nhiều enzym được phát hiện trong những năm gần đây, và Uỷ ban chuyên môn vể enzym đã được thành lập gồm A.E. Braunstein, J.s. Fruton, o . Hoffmann - Ostehof, B.L, Horecker, W.B. Jaloby, p. Karlson, B. Keil, E .c. S tater, E .c. Webb (triệu tập họp) và W.J. W helan. Với sự dóng góp của các phân ban chuyên môn và những lòi phê phán được đóng góp và gợi ý từ các tác giả và các nhà biên tập. “D anh pháp enzym” dã được tái bản (1972) do Hiệp hội quốc tế sự tinh sạch và hoá học ứng dụng th ế giới và Hiệp hội Hoá sinh quốc tế. Sau khi tái bản lần thứ 3 một bản báo cáo hoàn chỉnh danh sách enzym. Ưỷ ban danh pháp Hoá sinh đã quyết định xuất bản định kỳ một danh sách enzym bổ sung, bao gồm sự thêm, bớt, hiệu đính. Bản danh sách bổ sung đầu tiên được chuẩn bị trong suốt 1974 - 1975 và được xuât bản trong tạp chí Hoá sinh và Lý sinh (Biochimica et Biophysica Acta) tập 429, tra n g 1-45 (1976). Trong suốt năm 1977, tổ chức chịu trách nhiệm vể việc xem xét danh sách Hoá sinh và danh sách enzym được tái thành lập và đã thông qua Uỷ ban danh pháp mới của IUB. Cũng vào thòi điêm này, Hiệp hội Hoá sinh th ế giới đã có th ể thoả thuận với các Viện Sức khoẻ th ế giôi tại Bethesda để đưa đanh sách trong tương lai dưổi dạng thông tin từ máy tính. Giai đoạn khỏi dầu do Richard J. Feldmann thuộc Viện Sức khoẻ 421
I
th ế giới, Công nghệ và nghiên cứu máy tính chỉ đạo, lần xuất bản hiện nay của danh mục enzym là danh mục đầu tiên được tạo ra theo cách này. Nó gồm các sự thay đổi và bổ sung đã được u ỷ ban danh pháp của IUB chấp th u ận tại các cuộc họp tổ chức vào tháng 6/1977 và th án g 6/1978. Số’ enzym của danh sách enzym trong các lần xuất bản khác nhau như sau: Báo cáo của u ỷ ban enzym (1961)
712
D anh mục enzym (1964)
875
D anh mục enzym (1972) D anh mục bổ sung I (1975) Lần xuất bản (1978)
1.770 1.974 2.122
R ất nhiều người đã đóng góp cho sự ổn định của d an h sách enzym. Người có công đóng góp đặc biệt là Otto Hoffmann - Ostenhof, thư ký của u ỷ ban Enzym khởi đầu, và cũng là ngưòi đứng đầu của Hội đồng danh pháp Hoá sinh từ 1965 đến 1976, là người chịu trá ch nhiệm lớn cho tiến trìn h p h át triển của linh vực này. Đến 1976, Alexander E. B raunstein cũng đã có sự gắn bó lâu dài với công việc này. Đến k hi danh sách enzym được chuyển vào m áy tín h năm 1977, người ta lưu giũ nó dưới dạng số' phiếu mục lục trong văn phòng của Edwin Weble, ban đầu ở trường Đại học Tổng hợp Q ueensland, và gần đây hơn là ỏ Đại học Tổng hợp M acguarie, Sydney. M ariam A rm strong chịu trách nhiệm quản lý và đánh máy nhiều bản (1976) danh pháp enzym và những lần x u ất b ản và bổ sung tiếp sau ở cả hai nơi trong suốt 15 năm . 10.2. PH ÂN LOẠI V À C Á C TÊN GỌI C Ủ A ENZYM 10.2.1. Nguyên tắc chung
Do các enzym có mối liên hệ chặt chẽ nên việc giải quyết sự phân loại và tên gọi cùng trong một chương r ấ t th u ận tiện. Nguyên tắc chung đầu tiên của những “lòi giới thiệu” này là các tên của enzym, đặc biệt là các tên k ết thúc bằng aae, chỉ nên sử dụng các enzym riêng lẻ, không nên sử dụng các tên này đôì với các hệ có nhiểu hơn một enzym. Khi m uôn đ ặt tên một hệ như vậy dựa trê n cơ sở toàn bộ các phản ứng do hệ này xúc tác th ì tên nên bao gồm m ột hệ. Ví dụ, hệ enzym xúc tác cho sự oxy hoá succinate nhờ oxy phân tử, bao gồm succinate dehydrogenase, cytochrome oxidase, và một vài chất mang 422
trun g gian không nên đ ặt tên là succinate oxidase mà có thể gọi là hệ succinate oxidase. Các ví dụ khác về cấu trúc và chức năng là hệ pyruvate dehydrogenase, hệ 2-oxoglutarate dehydrogenase tương tự, và hệ tổng hợp axit béo. Trong khuôn khổ của giáo trìn h này rấ t thích hợp để mô tả sự loại bỏ một p h ần thực h àn h mập mờ và lạc hướng thường có trong các tài liệu sinh học. Nó chính là sự đặt tên một cơ chất tự nhiên (hoặc thậm chí theo m ột nguyên tắc hoạt động theo lý thuyết) chịu trách nhiệm cho một hiện tượng sinh lý, hoặc lý sinh mà không thể mô tả bằng một th u ật ngữ của một phản ứng hoá học xác định, bằng tên của hiện tượng kết hợp với tiếp vị ngữ ase, chỉ một enzym riêng biệt. Một sổ ví dụ gần đây về danh pháp phenom enase như vậy, thậm chí có thể bị phản đổì cho rằng, chất p h ản ứng đặc hiệu có th ể có các đặc tính enzym là: permease, translocase, reparase, joinase, codase,... Nguyên tắc chung thứ hai là các enzym được phân loại và tên gọi theo phản ớng mà chúng xúc tác. Phản ứng hoá học được xúc tác là đặc tính đặc hiệu để phân loại một enzym này với một enzym khác, và rấ t thích hợp khi sử dụng nó làm cơ sỗ cho việc phân loại và tên gọi các enzym. Một sô" cơ sò cho sự phân loại và tên gọi đã được xem xét, ví dụ: bản chất hoá học của enzym (nếu đó là một flavoprotein, haemoprotein, pyridoxal-phosphatee-protein, cuproprotein,...), hoặc bản chất hoá học của cơ chất (các nucleotide, các carbohydrate, các protein,...). Nguyên tắc thứ n h ấ t không được sử dụng như một cd sở chung mà chỉ cho một số ít enzym có các nhóm prosthetic (nhóm ngoại) có thể xác định được như vậy. Tuy nhiên, bản chất hoá học của enzym đã được sử dụng một cách khác thường trong bản báo cáo được duyệt lại này trong một số trường hợp khó có th ể dựa vào tính đặc hiệu để phân loại, ví dụ: với các proteinase (các dưới - dưóí nhóm 3.4.21.24). Cơ sở thứ hai cho sự phân loại khó thực hiện được do một sự đa dạng lớn về các cơ chất tham gia phản ứng và vì nó không phải là thông tin có hiệu quả trừ khi kiểu phản ứng cũng được đưa ra. Toàn bộ phản ứng, như đã được biểu diễn bằng phương trìn h chính thức, nên được đưa ra làm cơ sở để phân loại. Do đó, cơ chế bản chất của phản ứng, và sự tạo thành các phức chất trung gian của các chất th am gia phản ứng với các enzym sẽ không được tính đến, mà chỉ nhữ ng sự th ay đổi hoá học quan sát được tạo ra bởi phản ứng được xúc tác hoàn toàn bồi enzym. Ví dụ: trong những trường hợp mà trong đó enzym chứa một nhóm prosthetic được dùng đê xúc tác cho sự 423
ị Ị
chuyển từ một chất cho đến một chất nhận (ví dụ: các flavin, biotin, hoặc pyridoxalphosphate) tên của nhóm prosthetic không có trong tên của enzym. Tuy nhiên, khi các tên chọn được chấp n h ận th ì cơ chế này có thể được đưa ra để lựa chọn giữa chúng. K ết quả của việc dùng phản ứng hoá học làm cơ sở cho việc đ ặt tên các enzym chỉ có th ể đ ặ t tên theo hệ thống cho enzym khi biết p h ản ứng hoá học mằ nó xúc tác. Ví dụ ứng dụng này cho một sô' enzym không xúc tác cho b ất cứ p h ản ứng hoá học nào m à chỉ trao đổi đồng vị, sự tra o đổi đồng vị này đưa ra một sô" ý tưởng vê' một bước trong toàn bộ phản ứng hoá học, mồ cả phản ứng hoá học thì vẫn còn chưa biết. K ết quả thứ h ai của quan điểm này là một tên enzym n h ấ t định sẽ chỉ định lĩhông chỉ một protein enzym đơn ỉẻ m à cả một nhóm protein có đặc tính xúc tác giống nhau. Các enzym có nguồn gốc khác n h au (từ các loài vi khuẩn, thực vật, động vật khác nhau) được định loại như một nhóm. Đối vâi các isoenzym cũng ứng dụng tương tự (xem phần dưâi). Tuy nhiên, có m ột vài ngoại lệ đối vối nguyên tắc chung này. Một ngoại lệ đã được chứng m inh cơ chế phản ứng hay tín h đặc hiệu cơ chất rất khác n h au cho phép định loại th àn h các nhóm khác n h au trong danh mục e n z y m . Ví dụ cho ứng dụng này đôi với 2-cholinesterase, EC 3.1.1.7 và EC 3.11.8, 2 -citra te hydrolyase, EC 4,2.1.3 và 4.2.1.4 và 2-am ino oxidase, EC 1.1.3.4 và 1.4.3.6. Ví dụ lịch sử quan trọng khác là phosphatase axit và kiềm (alkalise). Nguyên tắc chung thứ ba được th ừ a n hận là các enzym được chia thành các nhóm dựa vào kiểu phản ứng xúc tác, bên cạnh đó, tên của cơ chất được dùng làm cơ gồ cho việc đ ặt tên các enzym riêng biệt. Đó cũng là cơ sỏ cho việc định loại và đ ặt tên mã số. Các v ấn đề đặc biệt liên quan đến sự phân loại và việc đ ặt tên các enzym xúc tác cho nhũng sự chuyển hoá phức tạp có th ể được giải quyết trong m ột vài p h ản ứng tru n g gian cặp đôi hay liên tiếp thuộc các kiểu khác nh au , tấ t cả các phản ứng này đêu được xúc tác bỏi một enzym (chứ không phải bồi một hệ enzym). Một số bước tru n g gian có th ể là các phản ứng tự p h át không xúc tác, trong khi một, hoặc m ột vài bước trung gian lại p h ụ thuộc vào 9ự xúc tác bỏi enzym. Khi bản ch ất và trậ t tự của các phần ứng tru n g gian đã biết, hoặc có th ể được xác định chắc chắn thì nên định loại và đ ặ t tên enzym dựa vào bước được xúc tác bởi enzym đầu tiên, bưỏc này r ấ t cần th iết đối với sự biến đổi có th ể được chỉ bằng một th u ậ t ng ũ bổ sung trong ngoặc, ví dụ L -m alate glyoxylatelyase (CoAacetyl hoá) (E c 4.1.3.2). 424
Để định loại theo kiểu phản ứng xúc tác, điểu cần th iế t là lựa chọn trong sô* cách th ay th ế có liên quan đến phản ứng đưa ra. Một số sự xem xét về kiểu này được nêu ở mục 10,2.3. N hìn chung n ên chọn cách thay th ế phù hợp nhâ't với hệ thống định loại chung và làm giảm số’trường hợp ngoại lệ. Một sự mở rộng quan trọng của nguyên tắc này là câu hỏi về hướng phản ứng được viết nhằm mục đích định loại. Để làm đơn giản sự định loại, nên chọn một hưóng chung cho tấ t cả các enzym trong một lớp nhất định, thậm chí hướng này chưa được chứng minh với tấ t cả các enzym. Do đó, các tên hệ thống, cơ sỏ của việc định loại và ghi mã sổ", có thể bắt nguồn từ m ột phản ứng được viết, mặc dù chỉ có phản ứng nghịch là đã được chứng m inh thực sự bằng thực nghiệm. 10.2.2. Các tên hệ thống và tên thường
Uỷ ban Enzym đầu tiên đã đưa ra nhiều ý kiến đối vói danh mục theo hệ thống và sự hợp lý cho các enzym và cuối cùng đã giói thiệu hai đanh mục enzym, một là danh mục hệ thông và một là danh mục cho làm việc thông thưòng. Tên hệ thống của một enzym được tạo ra theo các quy tắc xác định, mô tả chính xác hoạt động của enzym đó, do đó xác định enzym một cách chính xác. Tên thông thường ngắn và thích hợp đô'i với việc sử dụng thông thường, như ng không n h ấ t th iết phải theo hệ thống; trong một số trưòng hợp, đó là tên được sử dụng gần đây. Sự giãi thiệu về các tên hệ thống thường phức tạp và đã bị chỉ trích m ạnh mẽ. Người ta đã chỉ ra rằng, trong nhiều trưồng hợp, phản ứng được xúc tác khống dài hdn nhiều so vối tên hệ thông và chỉ có th ể sử dụng có hiệu quả cho việc nhận biết, đặc biệt là trong việc liên kết với mã sô. Uỷ ban xét duyệt danh mục enzym đã thảo luận vể vấn đề này trong một thời gian dài. Người ta đã quyết định đưa ra các tên thông thường đáng chú ý hơn vào danh mục enzym ngay sau chúng là mã sô" và dã được mô tả như “tên được giới thiệu”. Trong phần Phụ lục, các tên được giới th iệu dưới dạng chữ latin, có in đậm. Tuy nhiên, ngưòi ta cũng quyết định giũ lại các tên hệ thông để làm cơ số cho việc định loại cũng như việc n h ậ n biết (chỉ được đưa ra một lồn trong trang) vì các nguyên nhân sau: (1) M ã số” khi đứng một mình chỉ có lợi cho việc n hận biết một enzym khi có một bản sao danh mục enzym trong tay, coi như tên hệ thống đã rõ. 425
(2) Tên hệ thống nhấn m ạnh kiểu phản ứng, còn phương trìn h phản ứng th ì không. (3) Các tôn hệ thống có thể được tạo ra cho các enzym mới bằng cách phát hiện, ứng dụng các quy tắc, nhưng các mã số’ thì không nên gắn cho các enzym riêng lẻ. (4) Các tên được giới thiệu cho các enzym mới thường được tạo ra như một bản sao rú t ngắn của tên hệ thống; do đó, các tên hệ thống rấ t có lợi trong việc tìm ra các tên đã được giới thiệu phù hợp với m ẫu chung. I I
Người ta đã giới thiệu rằng, đổi với các enzym không phải là chủ đề chính của một bài báo, hoặc phần tóm tắ t thì nên sử dụng các tên đã dược giới thiệu, nhưng các tên này nên được nhận biết ở lần để cập đầu tiên của chúng bởi mã sô" và nguồn gôc của chúng. Khi m ột enzym là chủ đề chính của bài báo, hoặc một phần tóm tắ t m ã số, tên hệ thống, phương trìn h phản ứng và nguồn của nó, lần lượt nên đưa vào lần đế cập đôn nó đầu tiên, sau đó tên đã được giới thiệu có th ể được sử dụng. Sự th ậ t là các tên và mã số enzym liên quan đến các p hản ứng được xúc tác nhiều hơn các protein riêng rẽ, nên điều quan trọng đặc biệt là phải đưa ra nguồn enzym để nhận biết một cách đầy đủ, trong trường hợp có nhiều dạng cùng tồn tại th ì nên giỏi thiệu những hiểu biết về điều này một cách thích hợp. Khi một bài báo đề cập đến một enzym không có trong đanh mục enzym, thì tác giả có th ể giới thiệu một tên mới và nếu cần thì một hệ thống mối, cả hai đều được tạo th à n h theo các quy tắc đã được giới thiệu. Một số lượng enzym được giao cho u ỷ ban danh pháp của IU13. D anh mục enzym sau đây (khác với các bản danh mục trước đây) chứa một hoặc nhiều tài liệu tham khảo đối với mỗi enzym. c ầ n nhấn m ạnh rằng, không có một sự nỗ lực nào đưdc thực hiện để cung cấp một thư mục hoàn thiện, hoặc để chỉ đảm bảo mô tả đầu tiên của một enzym. Các tài liệu th am khảo nhằm mục đích cung cấp đẫy đủ bằng chứng cho sự tồn tạ i của m ột enzym xúc tác cho phản ứng như đã xác định trưóc. Trong nhữ ng trường hợp đố, nếu có một bài báo chính mô tả sự tinh sạch và tín h đặc hiệu của một enzym, th ì các tà i liệu th am khảo được đưa ra cho các enzym động vật, thực vật và vi khuẩn. 10.2.3. S ơ đổ định loại và đặt s ố cho enzym
Trong bản báo cáo năm 1961, Uỷ ban Enzym đầu tiên đã đề xuất một hệ thông đ ịn h loại enzym cũng được dùng làm cơ sỏ cho việc đặt mã số cho các enzym. Các mã số' này có tiếp đầu ngữ là EC - (enzym 426
classification - Hệ thông phân loại enzym), hiện nay được sử dụng rộng rãi, chứa 4 số”được phân chia với các nghĩa sau: (1) Sô đ ầu tiên chỉ 6 lớp enzym chính (2) Sô" th ứ 2 chỉ tổ (3) Số th ứ 3 chỉ nhóm (4) Sô th ứ 4 là số’thứ tự của enzym trong nhóm của nó Tổ và nhóm được hoàn th àn h theo các nguyên tắc được chỉ ra đưồi đây, quy tắc chủ yếu dối với sự định loại được trìn h bày ở mục 10.2.4. Các lớp chính và các tổ hợp là: a) O x íd o re đ u c ta se (lớp enzym oxy hoá, khử) T ất cả các enzym thuộc lớp này đều xúc tác cho cốc phản ứng oxy hoá, khử. Cơ chất bị oxy hoá sẽ đóng vai trò như chất hydrogen. Tên hệ thống dược tạo th àn h theo sơ đồ chất cho “ chất nhận oxidoreductase. Tên được giới thiệu sẽ là dehydrogenase, b ất cứ khi nào có thể sử dụng thay th ế bằng một tên khác là reductase. Oxidase chỉ được sử dụng trong các trường hợp khi 0 2 là chất nhộn, Chữ sô" thứ 2 trong mã sô' của các oxidoreductase chỉ nhóm trong chất cho hydrogen trả i qua sự oxy hoá một nhóm -C H O H -, 2 chỉ 1 nhóm aldehyde- hoặc k e to -v à SỐ’ thứ 3, ngoại trừ các tổ 1.11 và 1.15, chỉ loại chất nhận bao gồm: 1. chỉ NAD(P), 2. chỉ 1 cytochrome, 3. chỉ oxy phân tử, 4. chỉ 1 disulfide, 5. chỉ 1 hợp chất quinone hoặc hợp chất có liên quan,... Cần lưu ý rằng, trong các phản ứng có coenzym nicotinamide thì nó thường được coi là chất nhận, thậm chí khi chiều phản ứng còn chưa được chứng minh. Trường hợp ngoại lệ duy n h ấ t là tổ 1.6, trong đó NAD(P)H là chất cho, một số’chất xúc tác oxy hoá, khử là chất nhận. Mặc dù không được sử dụng làm tiêu chuẩn để phân loại, song hai nguyên tử hydrogen ở carbon 4 của vòng dihydropyridine của các nicotinam ide nucleotide, không tương đương nhau, trong đó hydrogen được chuyển hoá theo lập thể đặc thù. Tính lập th ể đặc thù của một số lượng lớn các dehydrogenase đã được tổng kết. b) C ác tra n s fe ra s e (lớp en zym ch u yển nhỏm ) Các tran sferase là các enzym chuyển nhóm (ví dụ: nhóm methyl, 427
hoặc nhóm glycosyl) từ một hợp chất (thường được xem là ch ất cho) đến một hợp chất khác (thường được xem như một chất nhận). Các tên hệ thống được tạo th à n h theo sơ đồ: chất cho - chất n h ận nhóm chuyển transferase (enzym chuyển nhóm từ chất cho đến ch ất nhận). Trong nhiều trường hợp, chất cho là một cofactơ (coenzym) đóng vai trò là nhóm được chuyển hoá. Trường hợp đặc biệt là trường hợp của các am inotransferase. Một số”phản ứng xúc tác bởi transferase có thể được xem xét theo một sô" cách. Ví dụ: phản ứng được xúc tốc bơi enzym: X —Y + Z = x + Z - Y có thể đóng vai trò như một sự chuyển nhóm Y từ X đến z, hoặc như sự phá võ liên k ết X - Y bỏi sự tham gia của z. Khi z đại diện cho phosphate, hoặc arsen at tương ứng thường nói quá trìn h n h ư kiểu phản ứng phân ly axit phosphoric (phosphorolys), hoặc phản ứ ng phân ly axit arsenic (arsenolys) và sô" của tên các enzym dựa trê n kiểu phosphorylase đã được sử dụng. Những tên này không phù hợp với m ột danh mục hệ thống, vì không có lý do nào để chọn riêng ra những enzym đặc hiệu này từ các tran sferase khác nhau, và tốt hơn là nên xem xét chúng một cách đơn giản như các Y - transferase. Một vấn đề khác được đ ặt ra trong các phản ứng chuyển am in được enzym xúc tác, chúng bao gồm sự chuyển m ột cặp electron và một proton cùng nhóm NH2 từ am in sơ cấp đến hợp chất oxy theo phương trình chung: R1—CH—R2 + R3—c —
J
nh
2
ì
0
C—R2 + R3—CH—R4
I0
ĩ
nh
2
P hản ứng cóth ể được xem như sự deam in hoá loại a min oxyhoá chất cho (ví dụ am ino axit), kết hợp với sự khử oxyhoá ch ất nhận (ví dụ 0X0 axit), và các enzym chuyển am in (pyridoxalphosphateprotein) có thể dược xếp vào oxidoredưctase (lốp enzym oxy hoá khử). Tuy nhiên, đặc điểm duy n h ấ t để nhận th ây của phản ứng này là sự chuyển nhóm am in (nhờ cơ chế th iế t lập hdp chất cơ chất - coenzym liên k ết hoá trị trung gian), m à sắp xếp nhóm enzym này trong lóp tran sferase th àn h một dưới nhóm (sub-group) đặc biệt (2.6.1. Amino transferase). Số th ớ 2 trong m ă sô' của tran sferase chỉ ra nhóm được chuyển: nhóm m ột carbon trong 2.1, nhóm aldehyde hay keto trong 2.2, nhóm glycosyl trong 2.3,... Sô" th ứ 3 cho b iết những thông tin sâu hơn về nhóm được chuyển. Ví 428
dụ dưởi lớp (sub - class) 2.1 được chia thành methyl transferase [2.1.1], hydroxym ethyl và formyl transferase [2.1.2],... chữ số thứ 3 trong 2.7 chỉ ra bản ch ất của nhóm nhận. c) E m y m h y d ro la se (lớp enzyrn th u ỷ p h ả n ) Các enzym này xúc tác cho sự phân cốt thuỷ phân các liên kết C-O, C-N, C—c và một sô liên k ết khác, bao gồm các liên k ết anhydrite phosphoric. Mặc dù tên hệ thông luôn là hydrolase, nhưng tên được giói thiệu trong nhiều trường hợp được hình thành từ tên của cơ châ't với tiếp vị ngữ là... ase. Nó được hiểu rằng, tên của cơ chất với tiếp vị ngữ này, nghĩa là một enzym thuỷ phân. Một sô" hydrolase tác dụng lên các liên kết ester, glycosyl, peptide, amide, hoặc các liên kết khác, chúng được biết đến không chỉ là việc xúc tác cho sự th u ỷ phân loại bỏ một nhóm riêng biệt từ cơ chất của chúng mà còn có vai trò vận chuyển nhóm này tới phân tử chất nhận thích hợp. Về nguyên lý, tấ t cả các enzym thuỷ phân có thể được phân loại là một enzym chuyển nhóm, vì ngoài hoạt tính thuỷ phân, nó còn có vai trò vận chuyển một nhóm đặc trưng tói nưóc, nước đóng vai trò như một chất nhận. Trong h ầu hết các trường hợp, phản ứng với nưức đóng vai trò như một chất n h ận thì được khám phá dễ dàng hơn và được xem như là chức năng sinh lý chính của enzym. Điều này lý giải lý do tại sao các enzym này lại được phân loại vừa là enzym thuỷ phân, vừa là enzym vận chuyển (chuyển nhóm). Một số’ enzym hydrolase (đặc biệt là esterase và glycosidase) đặt ra một sô' vấn đồ là chúng có tính đặc hiệu rấ t rộng và không dễ giải quyết khi có hai sự tách chiết được mô tả bởi các tác giả khác nhau (có lẽ xuất p h át từ các nguồn khác nhau) có các đặc tính xúc tác giông nhau, hoặc chúng có th ể được sắp xếp ở các nhóm khác nhau. Ví dụ: vitam in A esterase trước đây là [EC 3.1,1.12], bây giờ chính là [EC 3.1.1.1]. Một sô' phạm vi lựa chọn sắp xếp là tuỳ ý. Tuy nhiên, sự chia các nhóm có thổ đúng khi có đầy đủ các đặc tính. Một vấn đề khác là protease esterolytic (thuỷ phân este), nó thuỷ phân các liên k ết este trong các cơ chất thích hợp, thậm chí nhanh hơn các liên k ết peptide tự nhiên. Trong trưòng hđp này, sự phân lớp giữa các peptide hydrolase dựa vào giai đoạn lịch sử và chức năng sinh lý. Sô' thứ 2 trong mã sô' của hydrolase biểu thị bản chất của liên kết bị thuỷ phân: 3.1 là các esterase; 3.2 là các enzym glycosiđase và tiếp tục như vậy. 429
Sô' thứ 3 thường đặc trưng cho bản chất của cơ chất, ví dụ: trong các esterase enzym thuỷ phân ester carboxylic [3.1.1]; enzym thuỷ phân ester thiol [3.1.2]; phosphoric monoesterase [3.1.3]; O-glycosidase [3.2.1]; N glycosidase [3.2.2],... trong các enzym glycosidase. Đặc biệt, trong trường hợp enzym peptidylpeptide hydrolase, sô" thứ 3 dựa vào cơ chế xúc tác bởi sự nghiên cứu tru n g tâm hoạt tính hoặc ảnh hưởng của pH. d) E n zym lya se (nhóm, enzym c ẳ t các Hên k ế t h o ă c b ổ su n g cóc n h óm và o liên k ế t đôi) Lyase là các enzym phân cắt các liên k ết C—c , C—o , C - N và một sô" liên kết khác, phá v3 các liên kết đôi, hoặc bổ sung ngược các nhóm vào các liên k ết đôi. Tên hệ thống được tạo th à n h theo kiểu nhóm cơ chất - lyase. D ấu gạch nối là một phần quan trọng của tên và để trán h sự rắc rối th ì không nên bỏ nó. Ví dụ hydro — lyase, không phải “hydrolase”. Tên thông thường được viết là decarboxylase, aldolase dehydratase (trong trường hợp loại nước). Trường hợp phản ứng ngược là rấ t quan trọng. Các dưối lớp của lyase gồm các enzym pyridoxalphosphate xúc tác cho quá trìn h bỏ nhóm th ế p - hoặc Ykhỏi một a —am ino axit, được thực hiện bằng cách th ay th ế nhóm th ế này bằng một sô nhóm thê khác. Trong tổng phản ứng trao đổi sẽ tạo th à n h sản phẩm cuôì cùng là no. Do dó các enzym này thưòng được phân loại th àn h alkyltransferase [EC 2.5.1...]. Tuy nhiên, có bằng chứng rõ ràng là: sự trao đổi là phản ứng gồm 2 bước liên quan tới sự tạo th à n h chuyển tiếp của liên kết enzym a, p (hoặc p, y) - cấc axit am in không no, Theo quy lu ậ t th ì phản ứng thứ n h ất biểu th ị cho lớp enzym này dược phân loại là các lyase. Ví dụ: tryptophan synthase [EC 4.2.1.20] và cystathionin p—synthase [EC 4.2.1.22]. Sô thứ 2 trong mã sô chỉ sự liên k ết bị phá vd: 4,1 là carbon carbon lyase; 4.2 là carbon oxy lyase và tiếp tục. Số thứ 3 đưa thêm thông tin về nhóm bị tách ra (ví dụ C 0 2 trong 4.1.1; H :0 trong 4.2.1). e) Iso m e ra se (ỉởp en zym đ ồ n g p h â n hoá) Các enzym này xúc tác cho sự thay đổi hình học hoặc cấu trúc trong một phân tử. Theo kiểu đồng phân, chúng có thể được gọi là các racem ase, epim erase, cis- tr a n s - isomerase, isom erase, tautom erase, m utase hoặc cyclo —isomerase. 430
Trong một sô trường hợp, sự biên đổi nội phân tử được thực hiện bằng sự oxy hoá khử nội phân tử vì chất cho và châ't nhận hydrogen là các phân tử giông n h au và không xuất hiện sản phẩm oxy hoá chúng không được phân loại th àn h oxiđoreductase, thậm chí nếu chúng có thể có NAD(P)+. Liên k êt vững chắc các dưới lớp được tạo th àn h theo kiểu đồng phân, các dưới dưới lốp phân loại theo kiểu các cơ chất. f) L ig a s e (syn th eta se) (lóp enzym tổn g hợp) Ligase là các enzym xúc tác cho sự gắn kết của hai phần tử với nhau được k ết hợp với sự thuỷ phân của một liên kết pyrophosphate trong ATP hoặc một triphosphate tương tự. Các liên kết được tạo thành thưòng là các liên kết cao nãng. Tên hệ thống được hình th à n h dựa trên hệ thông X: Y ligase (hình th àn h ADP). Trong giới thiệu tên gọi, th u ật ngữ sy n th etase có thể được sử dụng, nếu không khác th u ậ t ngữ ngắn (ví dụ, carboxylase) được dùng. Tên của loại X - hoạt tính enzym có thể không được sử đụng. Số thứ 2 trong mã sô" chỉ liên kết được tạo thành: 6.1 đối với các liên kết C - 0 (các enzym axyl hoá RNA). 6.2 đối với các liên kết C - s (sự chuyển hoá acyl- CoA),... Các dưới lóp chỉ sử dụng cho liên kêt C - N. Trong một vài trường hợp cần thiết sỏ dụng từ khác trong phần mô tả của các dưói lớp và dưói dưói lốp. Thực tế, trong danh mục enzym đã thay đổi trìn h bày ỏ đây, một sô' các dưới lớp và các dưới dưới lớp mới đã được giới thiệu. Một sô enzym đã loại bỏ khỏi danh mục, một sô khác đã được đánh sô'lại. Tuy nhiên, các sô' cũ vẫn chưa được phân chia cho các enzym mới. Hơn nữa, vị trí này vẫn còn bỏ trông và phần trích dân ngang được ghi theo sơ đồ sau. Ịn. m. o. p. Xoá bỏ mục từ: tên cũ] I [n. m. o. p. Chuyển mục từ: bây giò EC q.r.s.t. —tên đê nghị] 10.2.4. Khoá đánh s ố và phản loại của các enzym
1. O x ito re d u c ta se 1.1. Tác đôn g lên nhóm CH -OH của các ch â t cho 1.1.1. Vói NAD+như là chất nhận. 1.1.2. Với cytochrome là chất nhận. 1.1.3. Với oxygen là chất nhận. 431
1.1.99. Vói các chất nhận khác. 1.2. Tác độn g lên nhóm aldehyde hoặc nhóm 0X0 củ a các ch ấ t cho 1.2.1. Với NAD+ là chất nhận. 1.2.2. Vói cytochrome là chất nhận. 1.2.3. Với oxygen là chất nhận. 1.2.4. Vói hợp chất disulfide là chất nhận. 1.2.5. Với protein sắt - lưu huỳnh là chất nhận. 1.2.6. Vối các chất nhận khác. 1.3. Tác độn g lên nhóm CH -CH của các c h ấ t cho 1.3.1. Với NAD+hoặc NADP* là chất nhận. 1.3.2. Với cytochrome là chất nhận. 1.3.3. Với oxygen là chất nhận. 1.3.7. Với protein sắt - lưu huỳnh là chất nhận. 1.3.99. Với các chất nhận khác. 1.4. Tác độn g lên nhóm CH-NHg củ a các ch ấ t cho 1.4.1. Với NADf hoặc NADP+là chất nhận, 1.4.2. Với cytochrome là chất nhận. 1.4.3. Với oxygen là chất nhộn. 1.4.4. Với hợp chất disulfide là chất nhận. 1.4.5. Với protein sắt —lưu huỳnh là chất nhận. 1.4.99. Vởi các chất nhận khác. 1.5. Tác đ ộ n g lên nhóm CH - N H của các ch ấ t cho 1.5.1. Với NAD+hoặc NADP+là chất nhận. 1.5.3. Với oxygen là chất nhận. 1.5.99. Vói các chất nhận khác. 1.6. Tác đ ộ n g củ a N A D H hoặc N ADPH 1.6.1. Với NAD+ hoặc NADP+là chất nhận. 1.6.2. Vồi cytochrome là chất nhận. 1.6.2. Vối hợp chất disulfide là chất nhận. 1.6.4. Vối quinon và hợp chất có liên quan là chất nhận. 1.6.5. Vói nhóm nitrogen là chất nhận. 1.6.6. Với protein sắt - ỉưu huỳnh là chất nhận. 1.6.99. Vói các chất nhận khác. 1.7. T ác đ ộ n g lên các hơp ch ấ t n itơ kh ác ỉà các c h ấ t cho 1.7.2. Với cytochrome là chất nhận. 1.7.3. Vối oxygen là chất nhận. 1.7.7. Với protein sắt - lưư huỳnh là chất nhận.
1.7.99. Với các chất nhận khác. 1.8. T ác đ ộ n g lên nhóm lưu huỳnh của các ch ấ t cho 1.8.1. Với NAD+hoặc NADP* là chất nhận. 1.8.2. Với cytochrome là chất nhận. 1.8.3. Với oxygen là châ't nhận. 1.8.4. Với hợp chất disulfide là chất nhận. 1.8.5. Với quinon và các hợp chất có liên quan là chất nhận. 1.8.6. Với protein sắt - lưu huỳnh là chất nhận. 1.8.99. Với các chất nhận khác. 1.9. T ác đ ộ n g lên nhỏm hem của các ch ất 1.9.3. Với oxygen là chất nhện. 1.9.6. Với nhóm nitrogen là chất nhận. 1.9.99. Với các chất nhận khác. 1.10. Tác độn g lên d iph en ol và ch ấ t liên quan ỉà ch ấ t cho 1.10.1. Với NAD hoặc NADP* là chất nhận. 1.10.2. Với cytochrome là chất nhận. 1.10.3. Với oxygen là chất nhận. 1.11. Tác độ n g lên H ị Oị là ch ấ t n h ậ n 1.12. Tác độn g lên h ydro là ch ấ t cho 1.12.1. NAD+hoặc NADP+là chất nhận. 1.12.2. Với cytochrome là chất nhận. 1.12.7. Vối protein sắt - lưu huỳnh là chất nhận. 1.13. Tác đông lên các ch ất cho đớn lẻ bằng sự k ết hợp của oxygen p h â n tử (các oxygenase) 1.13.11. Với sự kết hợp của 2 nguyên tử oxygen. 1.13.12. Với sự kết hợp của 1 nguyên tử oxygen (các nội monoxynase hoặc các oxidase chức phân hỗn tạp nội). 1.13.99. Sự hỗn tạp (cần xác định sâu hơn). 1.14. Tác động lên các cặp ch ất cho với 8ự k ết hợp của oxygen p h ẫ n tử 1.14.11. Với 2-oxiglutarate như là một chất cho, và sự kết hợp của mỗi nguyên tử oxygen vào cả hai chất cho. 1.14.12. Với NADH hoặc NADPH là một chất cho và sự kết hợp của 2 nguyên tử oxygen vầo một chất cho. 1.14.13. Với NADH hoặc NADPH là một chất cho, và sự kết hợp của một nguyên tử oxygen. 1.14.14. Với flavin khử hoặc flavo protein là một chất cho và sự kết hợp của một nguyên tử oxygen. 433
1.14.15. Vói protein sắt - lưu huỳnh khử như là một chất cho và sự kết hợp của một nguyên tử oxygen. 1.14.16. Với pteridin khử như một chất cho, và sự kết hợp của một nguyên tủ oxygen. 1.14.17. Với ascorbate là một chất cho và sự kết hợp của một nguyên tử oxygen. 1.14.18. Với hợp chất khác là một chât cho và sự kết hợp của một nguyên tử oxygen. 1.14.99. Sự hỗn tạp (cần xác định sâu hơn). 1.15. Tác độn g lên gốc p ero x id e là ch ấ t n h ận 1.16. Sư ojsry h oá các ỉon kim loai 1.16.3. Vói oxygen là chất nhận. 1.17. Tác động lên các nhóm - CH2. 1.17.1. Với NAD+hoặc NADP+là chất nhận. 1.17.4. Với hợp chất disulfide là chất nhận. 1.97. Các oxidoreductase khác. 2. T ra n s fe ra s e 2.1. Chuyển hoá các nhóm 1 carbon 2.1.1. Methyl transferase. 2.1.2. Hydroxymethyl— formyl—và các transferase liên quan. 2.1.3. Carboxyl- và cacbamoyl transferase. 2.1.4. Các amideinotransferase. 2.2. Chuyển hoá các gốc ald eh yd e hoặc keto 2.3. A cyltra n sfera se 2.3.1. Acyltransferase. 2.3.2. Aminoacyltransferase. 2.4. G lycosyltran sferase 2.4.1. Hexosyllransferase. 2.4.2. Pentosyl transferase. 2.4.99. Chuyển hoá các nhóm glycosyl khác. 2.5. Chuyển hoá các nhóm a lk yl hoặc aryl, trừ các nhóm m ethyl 2.6. Chuyên hoá các nhóm n itrogen 2.6.1. Aminotransferase. 2.6.2. Oximinotransferase. 2.7. Chuyển hoá các nhóm chứa ph ospho 2.7.1. Phosphotransferase với nhóm rượu là chất nhận. 2.7.2. Phosphotransferase vái nhóm carboxyl là chất nhận. 434
ị
I
1
Ị '
2.7.3. Phosphotransferase với nhóm nitrogen là chất nhận. 2.7.4. Phosphotransferase với nhóm phosphate là chất nhận. 2.7.5. Phosphotransferase với quá trình tái tạo các chất cho. 2.7.6. Diphosphotransferase. 2.7.7. Nucleotidyl transferase. 2.7.8. T ransferase với các nhóm phosphate được thay thô' bằng các nhóm khác. 2.7.9. Phosphotransferase với các cặp chất nhận. 2.8. Chuyển hoá các nhóm chứa lưu huỳnh 2.8.1. Sulfur transferase. 2.8.2. Sulpho transferase. 2.8.3. CoA—transferase. 3. H y d r o l a s e
3.1. T ác dôn g lên các liên k ết ester 3.1.1. Carboxylic ester hyđroỉase. 3.1.2. Thiolester hydrolase. 3.1.3. Phosphoric monoester hydrolase, 3.1.4. Phosphoric diestcr hydrolase. 3.1.5. Triphosphoric monoejSter hydrolase. 3.1.6. Sulfuric ester hydrolase. 3.1.7. Diphosphoric monoester hydrolase. 3.1.11. Exodeoxyribonuclease tạo ra 5 —phosphomonoester. 3.1.13. Exoribonuclease tạo ra 5' phosphomonoester. 3.1.14. Exoribonuclease tạo ra các sản phẩm khác, không tạo ra 5'-phosphomonoester. 3.1.15. Exoribonuclease tác động vào ADN hoặc ARN và tạo 5'-phosphom onoester. 3.1.16. Exonuclease tác động vào ADN hoặc ARN và tạo các sản phẩm không phải là 5'-phosphomonoester. 3.1.21. Endodeoxyribonuclease tạo 5'-phosphomonoester. 3.1.22. Endodeoxyribonuclease tạo sản phẩm không phải là 5'- phGBphomonoester. 3.1.23. Endodeoxyribonuclease đặc hiệu vị trí: phân cắt đặc hiệu trình tự. 3.1.24. Endodeoxyribonuclease đặc hiệu ví trị: không phân cắt đặc hiệ trình tự. 3.1.25. Endodeoxyribonuclease đặc hiệu vị trí : đặc hiệu các bazơ xcn kẽ. 3.1.26. Endoribonuclease tạo 5'-phosphomonoester. 3.1.27. Endoribonuclease tạo sản phẩm không phải là 5-phosphomonooster. 435
3.1.30. Endonuclease tác động vào DNA hoặc RNA và tạo 5'phosphomonoester. 3.1.31. Endonuclease tác động vào DNA hoặc RNA và tạo sản phẩm không phải là 5'-phosphomonoester. 3.2. Tác độn g lên các hợp ch ấ t glycosyl 3.2.1. Sự thuỷ phân các hợp chất O-glycosyl. 3.2.2. Sự thuỷ phân các hợp chất N—gỉycosyl. 3.2.3. Sự thuỷ phân các hợp chất S—glycosyl. 3.3. Tác đ ộ n g tên các liên k ết eth er 3.3.1. Thíoether hydroỉase. 3.3.2. Ether hydrolase. 3.4. Tác d ộ n g lên các liên kết p e p tid e (p ep tid e hydrolase) ‘ 3.4.11. a —aminoacylpeptide hydrolase. 3.4.12. Peptiđylamino-acid hoặc acylamino acid hydrolase. 3.4.13. Dipeptide hydrolase. 3.4.14. Dipeptidylpeptide hydrolase. 3.4.15. Peptidyldipeptide hydrolase. 3.4.16. Serin carboxypeptidase. 3.4.17. Metallo carboxypeptidasc. 3.4.21. Serin proteinase. 3.4.22. Thiol proteinase. 3.4.23. Carboxyl (acid) proteinase. 3.4.24. Motalloproteinase. 3.4.99. Proteinase của các cơ chế xúc tác chưa biết. 3.5. Tác động lên các liên kêỉ carbon-nitrogen (C-N), không p h ả i liên két peptide 3.5.1. Trong amide mạch thẳng. 3.5.2. Trong amide mạch vòng. 3.5.3. Trong amidin thẳng. 3.5.4. Trong amidin vòng. 3.5.5. Trong nitril. 3.5.99, Các hợp chất khác. 3.6. T ác đ ộ n g lên các a n h yd rid e a cỉd 3.6.1. Trong các anhydride chứa phosphoryl. 3.6.2. Trong các anhydride chứa sulphonyl. 3.7. T ác đ ô n g liên k ếi carbon -carbon 3.7.1. Trong các chát ke to. 436
3.8. Tác động lên các liên kết halogen. 3.8.1. Trong các hợp chất C-halogen. 3.8.2. Trong các hợp chất P-halogen. 3.9. Tác động lên các liên kết phospho-mtrogen. 3.10. Tác động lên các liên kết lưu huỳnh - nitrogen. 3.11. Tác động lên các liên kêt carbon —nitrogen. 4. L y a s e
4.1. C ác carbon - carbon lyase 4.1.1. Carboxy-lase. 4.1.2. Aldehyde-lyase. 4.1.3. Oxo-acid—lyase. 4.1.99. Các lyase carbon - carbon khác. 4.2. Các carbon - oxy lyase 4.2.1. Hydro-lyase. 4.2.2. Tác động lên các polysaccarit. 4.2.99. Các lyase carbon - oxy lyase khác. 4.3. Các carbon - n itrogen lyase 4.3.1. Amoni lyase. 4.3.2. Amidin lyase. 4.4. Các carbon d isu lp h ỉte lyase 4.5. C arbon h a lid e lyase 4.6. Phospho - oxy lyase. 4.99. Các lyase khác. 5. Iso m era se 5.1. R axem ase và epim erase 5.1.1. Tác động lên các amino acid và các dẫn xuất. 5.1.2. Tác động lên các hydroxy acid và các đẫn xuất. 5.1.3. Tác động lên các carbohydrate và các dẫn xuất. 5.1.99. Tác động lên các hợp chất khác. 5.2. C ỉs-tra n s ỉsom erase 5.3. Oxidoreducta.8e nôi p h à n tử 5.3.1. Sự chuyển hoá dẫn nhau qua lại aldose và ketose. 5.3.2. Sự chuyển hoá qua lại các nhóm keto và enol. 5.3.3. Sự chuyển vị các liên kêt c = c. 5.3.4. Sự chuyển vị các liên kêt s = s. 5.3.99. Các oxidoreductase nội phân tử khác.
5.4, Các tra n sfera se nôi p h ả n tử 5.4.1. Chuyển hoá nhóm acyl. 5.4.2. Chuyển hoá nhóm phosphoryl. 5.4.3. Chuyển hoá nhóm amin. 5.4.4. Chuyển hoá các nhóm khác. 5.5. Các lya.se nội p h â n tử 5.99, Các isomerase khác. 6. L ig a s e ( s y n th e ta s e )
6.1. Sự tạo th à n h các liên k ết carbon-oxy 6.1.1. Ligase tạo aminoacyl-tRNA và các hợp chất liên quan. 6.2. S ự tao th à n h các liên két carbon - lưu huỳnh 6.2.1. Acid-thiol ligase. 6.3. Sư tao th à n h các liền kết carbon - n itrogen 6.3.1. Acid-amoni (hoặc amin) ligase (amide synthetase). 6.3.2. Acid—acid amin Iigase (peptide—synthetase). 6.3.3. Cyclo-ligase. 6.3.4. Các ligase carbon - nitrogen khác. 6.3.5. Các ligase carbon —nitrogen với glutamin như là chất cho amido N. 6.4. Sư tao th à n h các lỉên k ết carbon - carbon 6.5. S ự tạo th à n h các este r p h o sp h a te
CÂU HỎI ÔN T Ậ P
1.
Nguyên tắc phân loại enzym.
2.
Cách đánh SCJ phân loại các enzym.
3.
Tại sao khi ngưòi ta luộc ngô lúc mói hái về thì còn ngọt, đế qua đêm luộc th i ngô không ngọt?
438
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
Appled, K,, Bacquet, R.J., Barlett, C.A., Booth, C.L.J., Freer, S.T., Fuhry, M.A.M., e t al., (1991) J.Med. Chem. 34,
2.
Bell, J.E ., and Bell, E.T. (1988) Protein and Enzymes, P renticeH all, Englewood Cliffs, NJ.
3.
Bender, M.L., Bergeron, R.s,, and Komiyana, M. (1984) The Bioorganic Chemistry o f Enzymatic Catalysis, Wiley, New York.
4.
Blundell, T.L., Cooper, J,, Foudling, S.I., Jones, D., A trash, B., and Szelker, M. (1987) Biochemistry 26, 5586.
5.
Bock, R.M., Adenine Nucleotides and Properties of Pyrophosphate compounds, “The enzymes”, Vol.2, p ,l (ef.ref.l).
6.
B randen, c . and Tooze, J. (1991) Introduction to Protein structure, G arland, New York.
7.
Chaiken, I., Rose, s., and Karlsson, R. (1991) Anal.Biochem.
8.
Copeland, R.A., Williams, J.M., G iannaras, J., Nurmberg, s., Covington, M., Pinto, D., Pick, s., and Trzaskos, J.M. (1994) Proc. N atl. Acad. Sci. USA. 91, 11202.
9.
Copeland, R.A. (1994) Methods for protein analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols, Chapman & Hall, New York, pp. 151 - 160.
10.
Cornish —Bowden, A., and W harton, c .w (1988) Enzymes Kinetics, IRL Press, Oxford.
11.
Creighton, T.E., (1984) Proteins, Structure and Molecular Properties, Freem an, New York.
12.
Dean, P.M. (1987) Molecular Foudations o f Drug - Receptor Interactions, Cambridge U niversity Press, New York.
13.
Dohman, G.( ad Prestwich, G.D. (1994) Biochemistry 33, 5661. 439
14.
Dugas, H., and Penny, c., (1981) Bừxỉrganic Chemistry, A Chemical Approach to Enzyme Action, Sprimger —Vevlag, New York.
15.
Duggeby, R.G. (1985) Biochem. J. 228, 55.
16.
Duggeby, R.G. (1994) Biochem. Biophy. Acta. 1205, 2.
17.
E isenthal, R., and Danson, M.J., Eds (1992) Enzymes Assays, A P ratical Approach, IRL Press, Oxford.
18.
Forsen, s., and Linse, s. (1995) Trends Biochem. Sci. 20,
19.
Fresht, A. (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York.
20.
Pierce, C.A., and Hames, G.G. (1995) Methods Enzymol. 249, 3-37.
21.
Gabriel, 0 ., and Gensten, D.M. (1992) In Enzyme Assays, A P ratical Approach, Eisenthal, R. and Danson, M .J., Eds., IRL Press, Oxford, pp, 257 - 259,
22.
Gningauz, A. (1996) Medicinal Chemistry: How Drugs Act and Why, Wiley, New York.
23.
Goldstein, A. (1994) Gen. Physiol. 27, 529.
24.
Guisan, J.M . (2006) Immobilization o f enzymes and cells, 2nd ed., H um ana Press Inc,
25.
Hammes, G.G. (1982) Enzyme Catalysis and Regulation, Academic Press, New York.
26.
Hans, B. (2008) Enzyme kinetics: Principles and methods, Wiley-VCH.
27.
H ansch, c ., and Klein, T.E. (1986) Acc. Chem. Res. 19, 392.
28.
Harlon, E., and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring H arbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
29.
M ahler, H.T. & Cordes, E.H. (1996), Biologycal C hem istry, H arper & Row.
30.
Hulme, E .c . (1992) Receptor - Ligand Interactions: A pratical Approach, Oxford U ni verity Press, London.
31.
Itta ra t, I., W ebster, H.K., Chrom atography. 582, 57.
32.
Kaplan, N.D., The pyrimidine coenzyme, The enzymes, Vol. 3, p. 105 (cf. nef. 1).
33.
K arlsson, R. (1994) Anal. Biochem. 221, 142.
440
and
Yuthavong,
Y,
495.
(1992)
J.
34.
K auer, J.C., Erickson-V iitanen, s., Wotfe, H.R., Jr., and DeGrads, W.F (1986) J. Biol. Chem. 261, 10695.
35.
K ellershohn, N. and Laurent, M. (1985) Biochem. J. 231, 65.
36.
Klebe, G. (1994) J. Mol. Biol. 237, 212.
37.
Knight, C.G. (1995) Methods Enzymol. 248, 18-34.
38.
K night, C.G., WillenBrock, F., and M urphy, G. (1992) FEBS Lett. 296, 263.
39.
Kubinyi, H. (1993) QSAR: Hansch Analysis and Related Approaches, VCH, New York.
40.
Kyte, J. (1995) Mechanisms in Protein Chemistry, Garland, New York.
41. Lackonicz, J,R. (1983) Principles o f Fluorescense Spectroscopy, Plenum Press, New York. 42.
Lehninger, L.A., Nelson, D.L., Cox, M.M. (1993) Principles of Biochem istry, W orth publishers.
43.
Lesk, A.M., and Boswell, D.R. (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 242.
44. Li, R.L., and Poe, M. (1988) V. Med. Chem. 31, 366. 45. Linqiu, c . (2005) C arrier-bround inmobilized enzymes; principles, applications and design, Wiley-VCH. 46. Lum dblad, R. (1991) Chemical Reagents for Protein Modication, CRC Press, Boca Raton, FL, 47. Ma, H., Yang, H.Q., Takano, E., H atanaka, M., and Maki, M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24430. 48. M arshal], G.R., and Cramer, R.D., III (1988) Trends Pharmacol. Sci. 9, 285. 49. M atayashi, E.D., Wang, G.T., Krafft, G.A., and Erickson, J. (1990) Science. 247, 954. 50.
M atthew s, D.A., Bolin, J.T., Burridge, J.M., Film an, D.J., Volz, K W , an d K rant, J. (1985) J. Biol. Chem. 260, 392.
51.
Mcree, D.E. (1993) Practical protein Crystallography, Academic Press, S an Diego, CA.
52.
M etzler, D.E., Thiamine Coenzymes, Vol. 2, p. 185 (cf. ref. 1).
53.
M orrison, J.F., and Walsh, C.T, (1988) Adv. Enzymol. 61, 201. 441
54.
Mozhaev, V.V., Berezin, I.V., and M artinek, K. (1987) Methods Enzymol. 135, 586.
55.
Neet, K.E. (1980) Methods Enzymol. 64, 139.
56.
Nogrady, T. (1985) Medicinal Chemistry, A Biochemical Approach, Oxford U niversity Press, New York.
57.
O’neil, K.T., Erickson-V iitanen, s., and Degrado, W.F. (1989) J. Biol. Chem. 264, 14571.
58.
Oldham, K.G. (1992) In Enzyme Assays, A Practical Approach, IRL Press, Oxford.
59.
Oliver, R.w. (1989) HPLC of Macromolecular: A Pratical Approach, IRL Press, Oxford.
60.
Packard, B.Z., Toptygin, D.D., Komoriya, A., and B rand, L. (1997) M ethods Enzymol. 278, 15 - 28.
61.
Perutz, M. (1990) Mechanisms of Cooperatiuity and AUosteric Regulation in Proteins, Cambridge U niversity Press, New York.
62.
Purich, D.L., Ed, (1996) Contem porary Enzyme Kinetics and M echanism s, 2nd ed., Academic Press, S an Diego, CA.
63.
Purich, L. (1983) Contemporary Enzmyes Kinetics and Mechanism, Academic Press, New York.
64.
Ree, L.J., Lipoic acid, The Enzymes, Vol.3, p .195 (cf. ref. 1).
65.
Sandler, M., Sm ith, M .J. (1994) Design og Enzyme Inhibitors as Drugs, Vols 1 and 2, Oxford U niversity Press, New York.
66.
Schowen, K.B., and Schowen, R.L. (1982) Methods Enzymol. 87, Ỗ51.
67.
Schram m , V.L., H orenstein, B.A., and Kline, p .c . (1994) J. Biol. Chem. 269, 18259.
68.
Schulz, A.R. 1994, Enzyme Kinetics from D iastanse ti M ulti enzyme System s, Cambrige U niversity Press, New York.
69.
Silverm an, R.B. (1988) M echanism - Based Enzym e Inactivation: Chemistry and Enzymology, Vols I and II, CRC Press, Boca Raton, FL.
70.
M ikkelsen, S.R., Corton, E. (2004), Bioanalytical Chemistry, Wiley — interscience.
71.
Targ, M.S., A skanas, L.J., an d Penning, T.M. (1995) Biochemistry. 34, 808.
442
72.
Tian, W.X., and Tsou, C.L. (1982) Biochemistry. 21, 1028.
73.
Tipton, K .s. (1992) In Enzyme Assays, A Pratical Approach, Eisenthal, R.an Danson, M .J., Eds., IRL Press, Oxford, p p .l - 58.
74.
Tone, E.J. (2007) Advances in enzymology and related areas of molecular biology, N.75: Protein evolution, John Wiley & Sons.
75.
Turner, P.M., Lerea, K.M., and Kull, F.J. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 114, 1154.
76.
U tter, M.F.: Guanosine and Inosine Nucleotides, “The enzymes”, Vol.2, p .75 (ef. ref. 1).
77.
Von Itzstein, M., Wu, W —Y., Kok, G.B., Pegg, M.S., Dyason, J.C., Jin, B., Phan, T.V., Smythe, M.L., White, H.F., Oliver, S.W., Colman, P.M., Varghese, J.N,, Ryan, D.M., Words, J.M., Bethell, R.C., H otham , V.J., Cameron, J.M., and Penn, C.R. (1993) Narute, 363, 418.
78.
Waley, S.G. (1991) Biochem. J, 205, 631.
443
Chịu trách nhiệm xuất bản: Chủ tịch Hội dổng Thành viên kiêm Tổng Giám đốc NGÔ TRÂN ÁI Tổng biên tạp kiêm Phó Tổng Giám đốc NGUYEN QUÝ THAO Tổ chức bản thảo vò chịu trách nhiệm nội dung: Phó Tổng biên tâp NGUYÊN VẢN T ư Giám đốc Công ty CP Sách ĐH-DN NGÔ THỊ THANH BÌNH
Biên tập nội dung: NGUYÊN HồNG ÁNH Biên tập mĩ thuật: XUÂN DŨNG Thiết kế sách: KIM DUNG Trình bày bìa: ĐINH XUÂN DŨNG Sửa bản in: NGUYEN HồNG á n h Chế bản: TRỊNH THỤC KIM DUNG
Công ty C P Sách Đại học - Dạy nghề, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam giữ quyền công bố tác phẩm.
ENZYM HỌC Mã sô: 7K886Y2 - DAI Sô' đàng kí KH XB : 13 - 2012/CXB/7- 1985/GD. In 700 cuốn (QĐ in số : 12), khổ 16 X 24 cm. In tại Xí nghiệp ỉn - NXB Lao động xã hội. In xong và nộp lưu chiểu tháng 3 năm 2012.
