Exercice 1 Soient les enzymes de restriction BamH I, Pst I, Xho I et Mbo I dont les sites reconnus sont : BamH I : 5' G/GATCC 3' ; Pst I : 5' CTGCA/G 3' ; Xho I : 5' C/TCGAG 3' ; Mbo I : 5' /GATC 3'. Recopier la séquence de l’ADN et encadrer les sites de restriction en indiquant la position des coupures. 5’ ATACGGGATCCGAGCTCTCGATCGTCTGCAGAAATTCC 3’ 3’ TATGCCCTAGGCTCGAGAGCTAGCAGACGTCTTTAAGG 5’
Seule MboI a une coupure franche Les autres enzymes aboutissent a des bouts cohésifs Facile a faire par vous-même
Exercice 2 : Un fragment d’ADN 1. coupé par l’enzyme EcoRI donne un fragment de 8Kb, un de 4 Kb et un de 3 Kb 2. coupé par l’enzyme SmaI donne un fragment de 9 Kb et un de 6 Kb
3. coupé par les deux enzymes EcoRI et SmaI produit un fragment de 6 Kb, un de 4 Kb, un de 3 Kb et un de 2Kb. Choisir votre réponse par ce qui suit : 1. la digestion par l’enzyme EcoRI produit des fragments d’ADN à bouts francs non 2. la taille des fragments d’ADN digérés est évaluée par électrophorèse oui 3. lors d’une électrophorèse, les fragments d’ADN les plus longs migrent les plus vite non 4. les fragments d’ADN deviennent fluorescents lorsqu’ils sont illuminés par des rayons UV non (il faut les mettre en contact avec le bromure d’ethidium) 5. dans cette expérience, l’analyse de la taille permet de déduire que l’ordre des sites de restriction sur le fragment d’ADN est EcoRI-SmaI-EcoRI ( il suffit de tracer la carte de
restriction)
Exercice 3:
Si nous travaillons avec avec un ADN linéaire tel que celui montré dans la figure cidessous, Quelle est la taille en paires de bases (pb) ( pb) des fragments d'ADN obtenus en effectuant effectuant des digestions simples par les enzymes d, e et f et des doubles digestions avec diverses combinaisons entre eux?. NB : Les chiffres correspondent correspondent au nombre de paires de bases d'ADN (taille totale totale est de 1500 pb).
Digestion e : 250 pb + 1250pb Digestion f : 500 pb Digestion d : 650pb+750+100 Digestion d+e : 250pb+400+750+100 Digestion d+f : 500+150+350+400+100 Digestion e+f :250+250+500+500 :250+250+500+500
Exercice 4:
Exercice 4:
Exercice 5
L'ADN d’un plasmide recombinant de 48,6 kpb a
été hydrolysé par l'enzyme de restriction Sal I. Cet ADN est analysé par électrophorèse sur gel d’agarose (pistes 2 et 4). Un marqueur de taille
(l'ADN du phage lambda hydrolysé par l'enzyme de restriction Hind III ) est déposé dans les puits 1 et 3. Ce marqueur de taille est un mélange équimolaire de fragments d’ADN de tailles
connues. La quantité d’ADN total déposé dans les puits 1 et
2 est le double de celle des puits 3 et 4. Après coloration par le bromure d’ethidium, l’image suivante est obtenue.
Exercice 5 suite
déduire la taille des fragments issus de la digestion par l'enzyme de restriction Sal I de l'ADN du cosmide recombinant (pistes 2 et 4). (tracer la gamme etalon puis deduire la taille des fragment) La somme des tailles des fragments obtenus vous semble-t-elle en accord avec la taille attendue de 48,6 kpb ? Non vue les erreurs du au manipulateur lors de la determination des distances de migration et a l’extrapolation des tailles de fragment a partir de la gamme etalon
Exercice 6 Un plasmide recombinant contenant le gène M (appelé pBM1) est digéré par les enzymes de restriction Bam HI et Eco RI. Après migration et séparation des fragments d'ADN sur gel d'agarose puis coloration au bromure d'éthidium, on obtient les profils de restriction suivants:
Donnez la carte de restriction du plasmide recombinant pBM1.
Exercice 6 : correction
Exercice 7: On réalise la carte de restriction d'un fragment amplifié par PCR (1,8 kpb) avec les enzymes de restriction EcoRI, BamHI, XbaI et NcoI. Les tailles des fragments obtenus sont (en kilo paires de bases):
E 0,4 1,4
B 1,8
N 0,8 1
X 0,3 1,5
E-X 0,3 0,4 1,1
E-N 0,4 1
Donner la carte de restriction du fragment amplifié par PCR.
X-N 0,3 0,7 0,8
Exercice 7 suite: reponse
Un fragment amplifié par PCR est linéaire. Les cartes possibles sont:
Exercice 8 On se propose d’étudier la carte de restriction d’un plasmide avec EcoRV et PstI. Quelle est la probabilité théorique de trouver un site de coupure de l’ADN par Pst I et EcoRV (probabilite = 1/4n )
La digestion de ce plasmide par EcoRV et Pst I nous donne le résultat suivant : enzymes
Tailles des fragments de restricti restriction on
EcoRV
4,2
3,4
Pst I
3,6
2,7
1,3
EcoRV+Pst EcoRV+Pst
2,2
2
1,4
Etablir la carte de restriction de ce plasmide (pensez y tous:-)) NB: PstI: CTGCA↑G EcoRV: GAT↑ATC
1,3
0,7
Exercice 9 :
Schématiser le profil électrophorétique des fragments issus de la digestion de ce plasmide par chacune des enzymes et par la double digestion (EcorI+PstI) PstI : 3 bandes (200+600+800 pb) EcoRI : 2 bandes (600+1000 pb) PstI+ EcoRI : 4 bandes (2 de 500pb + 300+200+100 pb)
Exercice 10: Le génome d’un nouveau bactériophage bactériophage à ADN double brin a été isolé et sa séquence nucléotidique a été déterminée (5000 paires de bases). Afin d’avoir plus de renseignement sur la structure de son génome, l’ADN du bactériophage est digéré par plusieurs enzymes de restriction et les fragments obtenus sont analysés par électrophorèse en gel d’agarose natif suivi d’une coloration au bromure d’ éthidium (pistes 1-5, figure 4). L’analyse bioinformatique de la séquence génomique a permis de prédire le nombre de site pour chaque enzyme (tableau 3).
Figure 4: Electrophorèse en gel d’agarose des fragmentsde restriction obtenus après digestion de l’ADN du bactériophage. Piste 1 : témoin, ADN non digéré. NB : Tous les
Tableau 3 : Nombre de sites de restriction prédits par informatique pour les différentes enzymes de restriction utilisées dans l’expérience présentée figure 3.
Exercice 10: interpréter interpréter tous les résultats résultats expérimentaux obtenus obtenus à l’issue des différentes réactions de digestion effectuées Donnez le nombre de fragment(s) que l’on obtiendrait lors des doubles digestions décrites décrites dans le tableau ci-dessous :
Tableau 4 : Doubles digestions du génome du bactériophage Enzymes de restriction Nombre de fragments obtenus Eco RI + Bam HI
3
Bam HI + Hind III
2
Eco RI + Pvu II
5
Exercice 10:
interprétation Ce génome est linéaire car : Piste 3 : 1 seul site Bam HI prédit, obtention de 2 bandes correspondant à des fragments de 3 et 2 kb, soit une taille totale de 5 kb correspondant à la taille de l’intégralité du génome. Si ce génome avait été circulaire, 1 seule bande de 5 kb. Piste 4 : aucun site donc une seule bande correspondant au génome linéaire de 5 kb. Migration plus rapide pour un ADN circulaire généralement constitué de superenroulements et donc plus compact. Piste 5 : 3 sites donc 4 bandes. Si circulaire, 3 bandes. Piste 1 : ADN linéaire non digéré donc migrant à une taille de 5 kb. Idem piste 3. Piste 2 : 1 site EcoRI mais une seule bande d’intensité identique à celle de la piste 1. De ce fait, 2 fragments de 2,5 kb dont la somme totale fait bien 5 kb.
5’ ATACGGGATCCG 3’
A)3’ A)3’ TATGCCCTAGGC 5’ B)3’ B)3’ TATGCCGTAGGC 5’ C) 3’ TAAGCCCTAGCC 5’ D) 5’ TATGCCCTAGGC 3’ E) 3’ TATCCCCTAGGC 5’ F) 3’ TATGGGTAGGC 5’
