FUNDAMENTO DE HEMATOXILINA Y EOSINA La Hema Hemato toxi xili lina na es un comp compue uest sto o que que se obti obtien ene e de la plan planta ta legu legumi mino nosa sa Haem Haemat atox oxyl ylum um camp campec echi hian anum um,, cono conoci cida da tamb tambié ién n con con el nomb nombre re de palo palo de Campeche. Es un producto natural que al ser oxidado constituye una substancia de color morado oscuro denominada denominada hemateina. Se utiliza en histología para teir los componentes ani!nicos "#cidos$ de los te%idos, a los que da una coloraci!n &ioleta. 'ie intensamente los n(cleos de las células, dado que estos contienen #cidos nucleicos ricos en radicales #cidos. 'al como se obtiene de la planta e incluso luego de su)rir el proceso de oxidaci!n, su capaci capacidad dad de tinci! tinci!n n es muy limita limitada. da. *or lo tanto, tanto, debe debe combin combinars arse e con iones iones met#licos, especialmente las sales de hierro "+++$ o aluminio "++$, que act(an como mordientes. Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un colorante b#sico, ya que el componente crom!geno reside en el comple%o cati!nico "b#sico$ de la misma. Es de notar que la tinci!n histol!gica por hematoxilina no indica tanto la consti constituc tuci!n i!n quími química ca de los compo componen nentes tes celul celulare ares, s, sino sino la densi densidad dad de carga cargas s eléctricas negati&as de los mismos La mayoría de las células y matrices extracelulares no poseen un color propio por lo que que su obse obser& r&ac aci! i!n n dire direct cta a al micr micros osco copi pio o !pti !ptico co no perm permit ite e obse obser& r&ar ar sus sus carac caracter teríst ística icas s mor)ol mor)ol!gi !gicas cas.. *ara *ara poder poder obser& obser&arl arlos os se emple emplean an colora colorante ntes, s, sustancias dotadas de color que se unen de manera m#s o menos especí)ica a determinadas determinadas estructuras del te%ido. Las tinciones generales se usan habitualmente en los laboratorios de histología para obtener una &isi!n general de las muestras de te%ido. ormalmente combinan m#s de un colora colorante nte.. La tinci! tinci!n n m#s com(n es la que que combi combina na una sustanci sustancia a como como la hematoxilina y el colorante #cido eosina.
TIPOS DE FIJADORES La )i%aci!n se utiliza para- bolir el metabolismo celular, impedir la degradaci!n enzim#tica de las células y los te%idos por aut!lisis "autodigesti!n$, destruir los microorganismos pat!genos como las bacterias, los hongos o los &irus, endurecer el te%ido como consecuencia de la )ormaci!n de enlaces cruzados o la desnaturalizaci!n de las moléculas proteicas. El )i%ador de uso m#s com(n es la )ormalina, una soluci!n acuosa de )ormaldehído al /01, en diluciones &ariadas y en combinaci!n con otras sustancias químicas y amortiguadores "bu))ers$. El )ormaldehído preser&a la estructura general de la célula y de los componentes extracelulares al reaccionar con los grupos amino de las proteínas "con mucha )recuencia )orma enlaces cruzados entre residuos de lisina$. 2ado que el )ormaldehído no altera en )orma signi)icati&a su estructura tridimensional, las proteínas mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos especí)icos. Esta propiedad es importante en los métodos de tinci!n inmunocitoquímica. La soluci!n comercial est#ndar de )ormaldehído amortiguado con )os)atos "pH 0$ act(a con bastante lentitud pero penetra bien en el te%ido. Sin embargo, el )ormaldehído no reacciona con los lípidos y, por lo tanto, es un mal )i%ador de las membranas.
FIJACION Es un procedimiento cuya )inalidad, al aplicarlo es detener la &ida de las células e impedir las modi)icaciones post morten que pueda su)rir la célula "procesos autolíticos$, manteniendo la estructura mor)ol!gica de células y te%idos sin que ocurran cambios notables en ellos. Esto se consigue inmo&ilizando "por coagulaci!n o precipitaci!n$ las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las enzim#ticas haciéndolas insolubles. Esta acci!n garantiza la integridad de las células y te%idos3 se e)ect(a por mediante agentes químicos denominados )i%adores.
LOS FIJADORES SE CLASIFICAN EN DOS GRANDES GRUPOS: a) Oxidantes: el tetra!xido de osmio "#cido !smico$, el bicromato de potasio, #cido cr!mico, bicloruro de mercurio o 4sublimado corrosi&o5, #cido pícrico, #cido acético.
) Red!"t#$es: el )ormaldehído, el glutaraldehído, el alcohol etílico, el alcohol metílico. La acci!n oxidante o reductora de los )i%adores le con)ieren a las células ciertas condiciones que posibilitan una me%or aplicaci!n de las sustancias colorantes, por e%emplo- el alcohol etílico absoluto conser&a el gluc!geno, el bicloruro de mercurio pro&oca que las anilinas coloreen de manera m#s brillante a las )ibras col#genas, el bicromato de potasio )acilita la coloraci!n de las mitocondrias, el #cido acético permite una me%or tinci!n de los n(cleos, el cloruro de calcio conser&a e insolubiliza parcialmente a los lípidos.
LOS FIJADORES SON: a) Gase#s#s: como el )ormaldehído ) %&'!id#s: como el #cido acético, al alcohol etílico, la acetona, etc. ") s(%id#s: como el bicloruro de mercurio, el bicromato de potasio, etc.
FIJADOR SIMPLE FORMOL O FORMALINA.6 Est# considerado como la sustancia )i%adora de mayor uso en los laboratorios que realizan técnica histol!gica. El )ormol comercial consiste en una soluci!n acuosa del gas )ormaldehido al /7 6 891. Se presenta como un líquido claro, incoloro, que emite &apores sumamente irritantes para las con%unti&as y la mucosa respiratoria. Su acci!n )i%adora se e%erce coagulando las proteínas. Es un )i%ador que posee un buen poder de penetraci!n y di)usi!n. :antiene de manera adecuada la estructura y )acilita la coloraci!n posterior de los componentes celulares y tisulares. Endurece bien las muestras. Conser&a bastante bien a las grasas. El tiempo de )i%aci!n de las muestras, dependiendo del tamao de ellas, debe ser de ;8 a 8< horas como mínimo y si es posible, en re)rigeraci!n.
FIJADORES COMPUESTOS. =na sola sustancia )i%adora di)ícilmente re(ne todas las condiciones para e%ercer una buena )i%aci!n, por lo tanto es aconse%able usar mezclas )i%adoras a tra&és de las
cuales se acrecientan las cualidades de un )i%ador y se aten(an sus de)ectos y des&enta%as.
FORMOL FOSFATO *FORMOL TAMPONADO)
6 soluci!n de )ormaldehído "/01 a 891$ ml
>99
6 agua destilada ml
799
6 )os)ato de sodio monob#sico "aH;*?8 6 H;?$
8.9 gr
6 )os)ato de sodio dib#sico "a;H*?8$
@.A gr
Suele emplearse como un )i%ador de rutina, al igual que el )ormol al >91. *osee un pH de @.< a 0.9 aproximadamente. Es ligeramente hipot!nico.
FORMOL +ICLORURO DE MERCURIO
6 soluci!n de )ormaldehído "/01 a 891$
>A9 ml
6 agua destilada
6 bicloruro de mercurio
A9 gr
Es recomendable usarlo para )i%ar te%idos hematopoyético y lin)#tico reticular. El material nuclear se )i%a de manera precisa y nítida. Bacilita la tinci!n de )ibras col#genas y células con%unti&as mediante el empleo de colorantes que tienen como base a las anilinas. Se utiliza para los te%idos en los que se aplicar# técnicas inmunohistoquímicas.
FORMOL CLORURO DE CALCIO 6 soluci!n de )ormaldehido "/01 a 891$
>99 ml
6 cloruro de calcio
>9 gr
6 agua destilada
799ml
Se recomienda )i%ar las muestras en esta soluci!n cuando se desean preser&ar lípidos, especialmente )os)olípidos- ntes de obtener los cortes, las muestras se incluyen en gelatina o se congelan directamente para seccionarlas con empleando micr!tomos de congelaci!n o el criostato.
L,-UIDO FIJADOR DE +O.IN
6 soluci!n acuosa saturada de #cido pícrico
0A9 ml
6 soluci!n de )ormaldehido "/01 a 891$
;A9 ml
6 #cido acético glacial
A9 ml
Es un buen )i%ador de uso rutinario. 'iene un buen poder de penetraci!n y de di)usi!n. ?)rece resultados satis)actorios con ciertos tricr!micos como el de :asson. *ueden )i%arse piezas de un centímetro de grosor y dos o tres centímetros de longitud. Se le emplea con resultados !ptimos en la )i%aci!n de embriones y )etos pequeos pues e%erce cierto poder descalci)icante.
L,-UIDO FIJADOR DE HELLY 6 soluci!n madre "stoc$ de Dener
79 ml
6 soluci!n de )ormaldehido "/01 a 891$
>9 ml
El )ormol se debe agregar antes de usar la mezcla, pues la acci!n reductora del )ormol inhibe la acti&idad )i%adora del bicromato de potasio. Las muestras deben ser pequeas y )i%arse por un lapso no mayor de ;8 horas, porque se endurecen en exceso, se disminuye la baso)ilia de los n(cleos y se incrementa la acido)ilia del citoplasma. 'iene una &enta%a- preser&a muy bien a los eritrocitos y a los gr#nulos de las células de gl#ndulas endocrinas.
FIJADOR DE CARNOY
6 alcohol etílico absoluto
@9 ml
6 cloro)ormo
/9 ml
6 #cido acético glacial
>9 ml
*osee un excelente poder de penetraci!n y de di)usi!n. Las muestras delgadas de te%idos y !rganos se )i%an en dos o tres horas. *roduce lisis de los eritrocitos. Es el )i%ador adecuado cuando se desea demostrar gluc!geno y la tinci!n de n(cleos y especialmente cromosomas.
