PRÁCTICA N°06 DEMOSTRACION DE LA DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE OXIDOREDUCCIÓN OXIDOREDUCCIÓN BIOLÓGICA I.
REACTIVOS A UTILIZAR - Buffer fof!"o #e o#$o 0.% M &' (.) - *+6 #$,-orofeo-$#ofeo#$,-orofeo-$#ofeo- 0.0* / - Su,,$!"o 0.% M - &fe$-e#$!1$! % / - 'o1o2e$3!#o "o"!- #e 452!#o #e r!"! e u,ro! 0.* M - 7r!,,$o u,-e!r #e- 4o1o2e$3!#o - 7r!,,$8 1$"o,o#r$!- #e- 4o1o2e$3!#o 4o1o2e$3!#o - 7r!,,$8 1$,roo1!- o-u9-e #e- 4o1o2e$3!#o. - :C- 0.%) M
II.
PROCEDIMIENTO Fraccionamiento celular
-
L! r!"! r!"! !-9$ !-9$! ! ;R!" ;R!""u "u r!"" r!""u u er> !,r !,r$f$f$, $,!# !#!+ !+ $1e $1e#$ #$!" !"!1 !1e e"e "e e 4!r> 4!r> u ,or" ,or"e e -o2 -o2$"$"u# u#$ $!!- e e- !9#o !9#o1e 1e+ +
-
&ro,e#$e#o ! e?"r!er e- 452!#o Se ,o-o,! e- 452!#o e Pe"r$+ e e-$1$! -! ,>&u-! #e- 452!#o @ o"ro "e$#o &er$fr$,o
-
Homoge Homogeniz nizado ado al 10 %: e &e! %0 2r #e 452!#o @ e ,or"! e
fr!21e"o &eueo @ e ,o-o,! e e- 4o1o2e$3!#or &o""er @ e -e !2re2! o-u,$8 #e :C-0.%) N. Se 4!,e &re$8 1!u!-1e"e ,o -
e19o-o 2$r!#o 4!,$! e- fo#o. To#o #e9e "r!9!!re e"re 0 @ ) °C E- 4o1o2e$3!#o e ,e"r$fu2!#o ! 00 re#o-o e "u9o #e &o-$e"$-eo+ &re<$! ,!-$9r!,$8 e -! 9!-!3!. Se e1&-e! u! ,e"r5fu2! refr$2er!#!. E- o9re!#!"e e e&!r!#o e u 9e!Fer #e 00 M-. E- e#$1e"o e#$1e"o ,o"$"u@e -! fr!,,$8 fr!,,$8 u,-e!r u,-e!r @ e
-
,o-o,! e u 9e!Fer #e %00 1-. E- o9re!#!"e !"er$or e ,e"r$fu2!#o ! %00 re
1$u"o e -! ,e"r5fu2! refr$2er!#!. - Ar1!r e- $2u$e"e $2u$e"e $"e1!
COMPONENTES
I
II
III
IV
V
u!!er !o"!ato 0#1 M $H &#'
%.0
0.
0.
0.
0.
($) dicloro!enolendo!enol
%.0
%.0
%.0
%.0
%.0
Succinato de "odio 0#1 M
0.*
0.*
0.*
0.*
0.*
Fracci*n nuclear
- 0.
Fracci*n
mitocondrial
-
- 0.
Fracci*n
micro"omal
-
-
- 0.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
"olu+le Homogenizado total
-
- 0.
Me3,-!r @ #e!r e re&oo ! "e1&er!"ur! !19$e"e O9er
COMPONENTES
1
(
,
'
-
u!!er !o"!ato 0#1M$ H&$'
%.
%.0
%.0
%.0
%.0
.!enilendiamina
0.
0.
0.
0.
0.
1%
/"u"trato indicador Fracci*n nuclear Fracci*n mitocondrial Frracci*n
0. 0.
micro"omal.
0.
"olu+le Homogenizado total
0.
Me3,-!r @ #e!r e re&oo ! "e1&er!"ur! !19$e"e. O9er
III.
DESCRIPCIÓN PRIMER SISTEMA •
TUBO I Au5 !2re2!1o 9uffer fof!"o ! u &' (+) 8&"$1o+ u"r!"o e for1! #e u,,$!"o #e o#$o @ e- 1!r,!#or *+6 #$,-orofeo-$#ofeo-. E- $#$,!#or -e #! ,o-or !3u- ! -! 1e3,-! ;o?$#!#o= $ ,!19$o #e ,o-or #e9$#o ! ue o 4!@ e3$1! u,,$!"o #e4$#ro2e!! ue o?$#! !- u"r!"o @ "r!f$ere e-e,"roe &!r! ue e &ue#! re#u,$r !- $#$,!#or.
•
TUBO II Au5 -! 1e3,-! ,o"$ee -o 1$1o ue e- "u9o uo @ e -e !#$,$o! fr!,,$8 u,-e!r $ ,!19$o e e- ,o-or !3u- ;o?$#!#o= e e- $#$,!#or #e9$#o ! ue
•
e -! fr!,,$8 u,-e!r o e e,ue"r! -! e3$1! ue o?$#e !- u"r!"o. TUBO III A #$fere,$! #e- !"er$or e -e !#$,$o! fr!,,$8 1$"o,o#r$!-+ o9er
•
#e u,,$!"o #e4$#ro2e!!. TUBO IV E e"e "u9o e !2re28 fr!,,$8 1$,roo1!- o-u9-e+ -! ,u!- ,orre&o#e !re"5,u-o e#o&->1$,o+ ue for1! &eue!
•
,!"!-$,e -! o?$#!,$8 #e- u,,$!"o. TUBO V E e"e "u9o e !2re2! u 4o1o2e$3!#o "o"!-+ e- ,u!- ,o"$ee fr!,,$8 u,-e!r+ 1$"o,o#r$!- @ 1$,roo1!-. Por -o ue o9"ee1o e- 1$1o reu-"!#o ue e e- "u9o + &or -o ,o1&oe"e 1$"o,o#r$!-e @ -! &ree,$! #e -! e3$1! ue o?$#! !- u,,$!"o. SEGUNDO SISTEMA E"e $"e1! ,!19$!1o e- $#$,!#or e "o#o -o "u9o &or -! & fe$-e#$!1$! ue e o?$#! @ &ro#u,e u ,!19$o #e ,o-or #e ro3!#o "r!-u,$#o ! 1!rr8 o,uro
•
TUBO I E- $#$,!#or e !2re2! ,o e- u"r!"o. A#e1> -o reu-"!#o o &!re,$#o !- &r$1er $"e1! ,o -! #$fere,$! ue e- $#$,!#or e o?$#! !,"u!#o #$re,"!1e"e o9re e- ,$"o,ro1o , #o>#o-e e-e,"roe. Pero
•
#e9$#o ! ue o "$ee e3$1! o 4!@ ,!19$o #e ,o-or. TUBO II A- $2u!- ue e- $"e1! !"er$or -! fr!,,$8 u,-e!r ,!re,e #e ,$"o,ro1o , @
•
&or -o "!"o o e &ue#e o?$#!r e- $#$,!#or. S$ ,!19$o #e ,o-or TUBO III E e"e "u9o e o9er#oe 1!rro o,uro #e9$#o ! ue e -! fr!,,$8 1$"o,o#r$!- ,o"$ee e- ,$"o,ro1o C+ ue f or1!
•
•
&!r"e #e -! ,!#e! re&$r!"or$!. TUBO IV E e"e "u9o e !2re28 fr!,,$8 1$,roo1!- J o-u9-e. L! o-u,$8 o &ree"! ,!19$o #e ,o-or. TUBO V
E e"e "u9o+ e !2re2! u 4o1o2e$3!#o "o"!- ;fr!,,$8 u,-e!r K 1$"o,o#r$!- K 1$,roo1!-=. L! o-u,$8 e "or! #e ,o-or 1!rr8 o,uro+ &ue !- e"!r &ree"e -! fr!,,$8 1$"o,o#r$!-+ e- ,$"o,ro1o , !,e&"e -o e-e,"roe ue &fe$-e#$!1$! -e ,e#e. E"e $#$,!#or ue !,"! ,o1o u"r!"o+ e u e"!#o o?$#!#o+ "or! ! -! o-u,$8 #e ,o-or 1!rr8 o,uro. IV.
CONCLUSIONES •
Co1&ro9!1o -! &ree,$! #e -! ,!#e! re&$r!"or$! e -! 1$"o,o#r$!
•
&or -o e-e1e"o &ree"e @ u !,,$8 o9re -o $#$,!#ore. E- *+6#$,-orofeo-$#ofeo- e u ,o1&ue"o u51$,o u"$-$3!#o ,o1o u ,o-or!"e re#o? e- ,u!- e #e,o-or! !- re#u,$re. E"! re#u,,$8 e #! ,u!#o e- u,,$!"o e o?$#! ! fu1!r!"o &!r! -o ,u!-+ e e- $"e1! #e9e
•
e"!r &ree"e -! fr!,,$8 1$"o,o#r$!- o e- 4o1o2ee$3!#o "o"!-. L! &fe$-e#$!1$! e u $#$,!#or ue ,!19$! #e ,o-or ! 1!rr8 o,uro ,u!#o - o?$#!re+ &!r! -o ,u!- e- ,$"o,ro1o , #e9e !,"u!r ,o1o e- !,e&"or #e -o e-e,"roe ue -! &fe$-e#$!1$! ,e#e e e- $"e1! #e9e 4!9ere !2re2!#o fr!,,$8 1$"o,o#r$!- u 4o1o2ee$3!#o "o"!-.
V. CUESTIONARIO %. u e e- *+6 #$,-orofeo-$#ofeo- @ ,81o !,"! e -! ,!#e! re&$r!"or$! E- *+6#$,-orofeo-$#ofeo- ;DCPIP= e u ,o1&ue"o u51$,o u"$-$3!#o ,o1o u ,o-or!"e re#o? . Cu!#o e"> o?$#!#o+ e !3u- ,o u! !9or,$8 1>?$1! ! 600 1 ,u!#o e"> e u for1! re#u,$#!+ e $,o-oro. E u !,e&"or #e e-e,"roe !r"$f$,$!-. E -! &ree"e &r>,"$,!+ e re#u,e !- &ro#u,$re -! o?$#!,$8 #e- u,,$!"o ! fu1!r!"o. *. u e e- &fe$-e#$!1$! @ ,81o !,"! e -! ,!#e! re&$r!"or$! L! &!r! fe$-e#$!1$! e u $#$,!#or ue ! -!
). u e u 4o1o2e$3!#o #e 452!#o @ ,81o e o9"$ee -! fr!,,$oe ,e-u-!re &or ,e"r$fu2!,$8 #$fere,$!- L! ,e"r$fu2!,$8 #$fere,$!- e 9!! e -! e?$"e,$! #e #$fere"e &!r"5,u-! e -! u&e$8 ue #$f$ere e u #e$#!# #e -! #e- 1e#$o. Se <$er"e u! 1e3,-! $$,$!-+ &or -o 2eer!- u 4o1o2ee$3!#o ,e-u-!r+ e u "u9o @ e ,e"r$fu2! &or u &er5o#o ue fuer3! ! -o or2>u-o ,e-u-!re ,o1o e- ,-eo ! e#$1e"!r e u &re,$&$"!#o e e- fo#o -! &ro"e5! o-u9-e &er1!e,e e e- o9re!#!"e. Lue2o -! fr!,,$8 o9re!#!"e e re,o-e,"! @ &ue#e er o1e"$#! ! o"ro 1"o#o #e &ur$f$,!,$8 &!r! e&!r!r -! u1ero! &ro"e5! #$fere"e ue ,o"$ee. S$ e ,e"r$fu2! e ,o#$,$oe u! -! &!r"5,u-! 1!@ore @Qo 1> #e!. Cu!#o eo9re!#!"e #e -! &r$1er! ,e"r$fu2!,$8 e ,e"r$fu2!#o #e ue "$e1&o @ 1> fuer3! #e !,e-er!,$8+ e#$1e"! #e ue #e! &ree"e @ !5 u,e$
PRÁCTI CA E7ECTO DE IN'IBIDORES SOBRE LA CADENA DE OXIDOREDUCCIÓN BIOLÓGICA I. REACTIVOS A UTILIZAR
Buffer fof!"o #e o#$o 0.%M+ &' (.) *+6#$,-orofeo-$#ofeo- 0.0* / &fe$-e#$!1$! %/ M!-!"o #e o#$o 0.%M Ro"eo! 0.%M B!r9$"ur!"o #e o#$o 0.%M A3$#! #e o#$o 7r!,,$8 1$"o,o#r$!- %0/ ;452!#o #e r!"!= II. PROCEDIMIENTO E e- $"e1! De4$#ro2e!! 1>-$,! K 1!-!"o K ,!#e! r#o? 1$"o,o#r$!-+
0.* 0.* 0.* 0.* 0.*
Ro"eo! 0.%M B!r9$"ur!"o #e o#$o A3$#! #e o#$o 'o1o2e$3!#o 1$"o,o#r$!-
0.
0.
0. 0.
0. 0.
0. 0.
%0/
Me3,-!r+ #e!r e re&oo ! "e1&er!"ur! !19$e"e &or *0 1$u"o. O9er
0.
0. 0.
0. 0. 0.
1$"o,o#r$! %0/
0. 0. 0.
0. 0. 0. #e!r
e
re&oo ! "e1&er!"ur! !19$e"e &or *0 1$u"o. O9er
TUBO I E"e "u9o ,o"$ee 9uffer fof!"o ! u &' o&"$1o+ $#$,!#or *+6 #$,-orofeo-$#ofeo- @ 4o1o2e$3!#o 1$"o,o#r$!-. E"! 1e3,-! ,!re,e #e u"r!"o &or -o ue o 4!@ ,!19$o e -! "o!-$#!# !3u- ue -e #! e- $#$,!#or ! -! 1e3,-!+ @! ue o 4!@
•
re!,,$8 $ #o!"e #e e-e,"roe ue re#u3,! !- $#$,!#or. TUBO II
E ,o"r!"e ,o e- "u9o !"er$or !u5 !&-$,!1o u"r!"o &!r! for1!r -! 1e3,-! &ero ,!re,e #e e3$1! &ro -o ue o 4!@ re!,,$8. E- ,o-or #e- $#$,!#or o ,!19$! e •
1!"$ee !3u-. TUBO III E e"e "u9o ue er> ue"ro "u9o $#e!- ,o"e#r> u! 1e3,-! #e 9uffer+ $#$,!#or+ u"r!"o @ e3$1! ;1!-!"o 1!-!"o #e4$#ro2e!!=. O,urre -! re!,,$8 #e o?$#!,$8 #e- 1!-!"o+ -o e-e,"roe #o!#o -o re,$9e e- $#$,!#or re#u,$#oe @ &ro
•
-e- ,!19$o #e ,o-or #e -! 1e3,-! ! u "oo ,e-e"e "r!-u,$#o. TUBO IV A #$fere,$! #e- "u9o !u5 ! -! 1e3,-! !#e1> e -e !2r! ro"eo! ue !,"! ,o1o $4$9$#or #e- ,o1&-eo I #e -! ,!#e! re&$r!"or$! $"erru1&$e#o e- &!o #e e-e,"roe ! -! u9$u$o! @ &or ,o$2u$e"e -! re#u,,$8 #e- $#$,!#or. No 4!@ ,!19$o e e-
•
,o-or. TUBO V E e"e "u9o o-o "$ee o"ro $4$9$#or e -! 1e3,-! #e e3$1! u"r!"o+ e- $4$9$#or u!#o e e- 9!r9$"ur!"o #e o#$o @ !,"! ! $
•
&er1$"e u ,!19$o &!r,$!- e ,u!"o !- ,o-or. E- ,o-or er> !1!r$--o. TUBO VI E e"e "u9o u!1o o"ro $4$9$#or !o,$!#o ! ,!#e! re&$r!"or$!+ -! !3$#! #e o#$o. E"! !,"u! ! $
•
•
•
TUBO I C!re,e #e e3$1! &or -o ue e- ,o-or ro!#o "r!-u,$#o #e- $#$,!#or o ,!19$!. TUBO II E e"e "u9o e #! -! re!,,$8 e3$1! u"r!"o &or -o ue e e- "u9o $#e!-. '!@ u ,!19$o #e ,o-or ! 1!rro o,uro &or o?$#!,$8 #e- $#$,!#or. TUBO III E- ,o1&-eo IV e"u
•
o?$#!r $ ,!19$!r #e ,o-or+ 1!"e$#oe u ,o-or ro! ,-!ro. TUBO IV
E e"e "u9o+ S$ 4!@ u"r!"o+ e3$1! e $4$9$#or ;9!r9$"ur!"o #e o#$o=. E9!r9$"ur!"o #e o#$o !,"! ! $
•
$
E- efe,"o #e -o $4$9$#ore e -! ,!#e! #e o?$#ore#u,,$8 9$o-82$,! e
•
re&$r!"or$! !fe,"!#o. E- $4$9$#or Ro"eo! !,"! e e- ,o1&-eo I @ o &er1$"e -! re#u,,$8 #e U9$u$o!+ B!r9$"ur!"o #e o#$o $4$9e !- ,o1&-eo I !- $
•
#e So#$o !,"! e e- ,o1&-eo IV. E- *+6 #$,-orofeo-$#ofeo- @ e- &fe$-e#$!1$! !,"! ,o1o $#$,!#ore #e $4$9$,$8 #e -! ,!#e! #e o?$#orre#u,,$8 9$o-82$,!.
V. CUESTIONARIO %. u $4$9$#ore #e -! ,!#e! #e 8?$#o re#u,,$8 ,oo,e @ ! u $ $1&or"!"e $4$9$#ore ,oo,$#o #e -! ,!#e! #e "r!&or"e #e e-e,"roe o e- A1$"!-+ -! Ro"eo!+ e- A"$1@,$ A+ e- Mo8?$#o #e C!r9oo ;CO=+ -! A3$#! o#$,! @ -o C$!uro. •
A1$"!-+ 9!r9$"ur!"o+ @ -! Ro"eo! $1&$#e -! u"$-$3!,$o #e- NAD' ,o1o #o!"e #e eu$
. E- efe,"o #e- A1$"!- 4! $#o o9er
!1$"!- o9re e- Co1&-eo I. A"$1@,$ A e u !"$9$8"$,o &ro#u,$#o &or S"re&"o1@,e 2r$eou ue 4! $#o u!#o ,o1o
•
!- $2u!- ue -o ,$"o,ro1o ! @ ! #e- Co1&-eo IV. E- 1o8?$#o #e ,!r9oo ;CO= L! $"o?$,!,$8 &or 1o8?$#o #e ,!r9oo ,!u! "r!"oro e -! e"re2! #e o?52eo ! -o "e$#o @ e u u"$-$3!,$8 ,e-u-!r. L! !f$$#!# #e -! 'e1o2-o9$! &or e- 1o8?$#o #e ,!r9oo e ,!$ 00 u&er$or ! -! ue "$ee &or e- o?52eo. U !19$e"e e e- ,u!- 4!@ !&e! %00 &&1 #e CO e uf$,$e"e &!r! ue -! for1!,$8 #e 'e1o2-o9$! --e2ue ! %6 /. L! $"u!,$8 e1&eor! !#e1> @! ue -! u$8 #e CO ! uo #e -o 2ru&o 'e1 #e -! 'e1o2-o9$! !u1e"! -! !f$$#!# &or e- o?52eo #e -o o"ro "re 2ru&o 'e1 #e -! 1o-,u-!+ &or -o ,u!- -! e"re2! o -$9er!,$8 #e- o?52eo ! -o "e$#o e"> 1u@ !fe,"!#!. De9$#o ! u !-"o ,ou1o #e o?52eo+ e- ,ere9ro @ e- ,or!38 o -o 8r2!o 1> !fe,"!#o. L! 1$o2-o9$! "$ee 1> !f$$#!# !u &or e- CO ue -! 'e1o2-o9$!+ &or -o ue e- 1u,u-o ,!r#$!,o e"> e
•
$"o?$,!,$8 &or CO e u! $1&or"!"e ,!u! #e 1uer"e e "o#o e- 1u#o. L! A3$#! !fe,"! ! -! ,!#e! re&$r!"or$! #e u! for1! 1u@ $1$-!r !- C$!uro+ $4$9$e#o ! -o 2ru&o 'e1 #e -o ,$"o,ro1o e -! C$"o,ro1o O?$#!! ;Co1&-e? IV=. Co1o reu-"!#o #e -! !,,$8 #e ,u!-u$er! #e e"o $4$9$#ore+ e #e"$ee -! re!,,$oe re#o? #e -! ,!#e! re&$r!"or$!+ o e -$9er! eer25!+ -! 9o19! #e &ro"oe o fu,$o!+ &or -o ue o 4!@ &ro"oe ue re2ree ! "r!
,o1&-eo V+ @ -! &ro#u,,$8 #e ATP ,e!. *. S$ u"$-$3! e- $#$,!#or r#o? *+6#$,-orofeo-$#ofeo- e u $"e1! ,o ,!#e! re&$r!"or$!+ ue ,!19$o o9er
BARBIBURATO DE SODIO SE REDUCE EN 7ORMA MODERADA E- $4$9$#or 9!r9$"ur!"o #e o#$o !,"! e -! re2$oe ,er,!! !- $"$o II ;COMPLEO III= @ 9-oue! #9$-1e"e -! "r!fere,$! #e e-e,"roe #e- ,o1&-eo I. AZIDA DE SODIO SI SE REDUCE E- $4$9$#or !3$#! #e o#$o !,"! e eCOMPLEO IV+ $4$9$e#o e- "r!&or"e #e e-e,"roe &or -o ue o !fe,"! !- ,o1&-eo I @ eo "r!e ,o$2o u re#u,,$8. . S$ u"$-$3! e- $#$,!#or &Jfe$-e#$!1$! e u $"e1! ,o ,!#e! re&$r!"or$!+ ue ,!19$o o9er
. Gr!f$ue u"e# e u! ,!#e! #e 8?$#o re#u,,$8 9$o-82$,!+ -! !,,$8 #e -o $4$9$#ore e $#$,!#ore u"$-$3!#o e e- e?&er$1e"o.
PRÁCTICA N° DETERMINACIÓN DE AMILASA SRICA
I.
INTRODUCCION L! !1$-!! e u! e3$1! ue 4$#ro-$3! e- !-1$#8+ -$9er!#o !-f! o 9e"! 1!-"o! #er$"$,! 4u1!! o !-f! !1$-!!. L! !-f! !1$-!! ro1&e -o e-!,e !-f! %) 2-u,o5#$,o for1!#o 1$?"ur! #e &eue! #e?"r$! 1> 1!-"o!. E e- uero 4u1!o ,o1o e -! or$! e?$"e !,"$<$#!# !1$->$,!+ ,u@! fue"e &r$,$&!-e o -! !1$-!! &!,re>"$,! @ !-$ e 9!! e -o 1"o#o ,o-or$1"r$,o #er$ fre,ue"e e $1&or"!"e e e -! &!,re!"$"$ !2u#!+ e e--! e e-e
&or -o 2eer!- "re o 1>
or1!-$3!re #e&u #e "re ! $e"e #5!. V!-ore 1> 9!o e &!,re!"$"$ ,r8$,! o ,!r,$o1! &!,re"$,o. L! e-e#u-! !-$"r$,! &ee"r!"e o &erfor!#!+ #e&u #e ,o-!2$o2r!f5!+ efer1e#!# &"$,! !2u#! #e- ,o-#o,o+ "ro19o$ 1e"er$,!+ &er$"o$"$+ ,$rro$+ ru&"ur! e&-$,!+ e",.
II. III.
REACTIVOS A UTILIZAR So-u,$8 #e !-1$#8 "!1&o!#! So-u,$8 @o#!#! PROCEDIMIENTO Ar1!r e- $2u$e"e $"e1!
2eacti3o Control Mue"tra % 1% 14lmid*n Suero 0 0.*00 Incu+ar or &#- minuto" a ,& 5C en +a6o mar7a % 1% 1Soluci*n 8odada 9eer a )'0 nm Clculo Le,"ur! #e ,o"ro--e,"ur! #e- &ro9-e1! %00 Q-e,"ur! #e- ,o"ro-
V!-ore #e refere,$! 4!"! %*0 U$#!#e !1$-oF$"
IV.
CONCLUSIONES •
Se e<$#e,$! 1e#$!"e e"e 1"o#o u!#o e -! &r>,"$,! -! &ree,$! #e -!
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RE7ERENCIAS BIBLIOGRÁ7ICAS %. '!rr$ D+ Bere2uer V. A>-$$ u51$,o ,u!"$"!"$
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