EFECTO DE LOS INHIBIDORES EN LA CADENA RESPIRATORIA
I.
INTRODUCCIÓN Según se ha indicado, en las oxidaciones biológicas los hidrógenos sustraídos al sustrato son transferidos en forma gradual a través de aceptores que experimentan cambios reversibles en su estado redox. En la membrana interna de las mitocondrias estos aceptores están dispuestos ordenadamente según un gradiente de potencial de reducción creciente y asociados íntimamente a las enzimas que catalizan las transferencias. El conjunto recibe el nombre de cadena respiratoria o cadena de transporte de electrones. (Blanco 2001) Dos hidrógenos cedidos en una reacción redox representan la suma de dos protones (H+) y dos electrones (e-). Hidrógenos y electrones frecuentemente son denominados equivalentes de reducción. La cadena respiratoria comprende una serie de etapas. Durante todo el recorrido, los electrones fluyen naturalmente en el sentido que les fija el desnivel en el potencial de reducción de los aceptores. En este sistema, los electrones se deslizan desde A a B, a C, a D, y al oxígeno secuencialmente, impulsados por el potencial creciente. Todos los integrantes de la cadena de transporte de electrones se encuentran en la membrana interna de la mitocondria, constituyendo un sistema multienzimático altamente ordenado. Su inclusión en la membrana asegura la disposición espacial adecuada para un óptimo funcionamiento. (Blanco 2001) Al analizar el proceso de oxidación de un sustrato y la transferencia de electrones, uno podría preguntarse por qué el sustrato no entrega sus hidrógenos directamente al oxígeno o a otros aceptores con mayor potencial de reducción que el NAD por ejemplo ya que esas reacciones son termodinámicamente más favorables. Esto se explica si se recuerda que, en las condiciones existentes en la célula, toda reacción química transcurre gracias a la existencia de catalizadores. Sólo la presencia de enzimas específicas asegura el cumplimiento de las etapas y la liberación de energía en forma gradual y controlable. Los hidrógenos no pasan directamente de un sustrato dado al oxígeno o a cualquier otro aceptor si no existen enzimas que catalicen la transferencia. (Blanco 2001)
A excepción de la ubiquinona (CoQ), que se encuentra libre en el interior de la doble capa lipídica, y del citocromo c, cuyas moléculas están adosadas a la cara externa de la membrana interna, los restantes componentes de la cadena respiratoria se agrupan en cuatro complejos multimoleculares que ocupan todo el espesor de la membrana. Estos complejos son designados con números romanos. Complejo I es la NADH-ubiquinona reductasa. Por intermedio de NAD, recibe hidrógenos de sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a esa coenzima. Contiene FMN y varios centros Fe-S. Entrega los hidrógenos a ubiquinona. Complejo II corresponde a la Succinato-ubiquinona reductasa. Posee un grupo prostético FAD y tres centros Fe-S. Transfiere equivalentes de reducción desde succinato a coenzima Q. Complejo III es la Ubiquinona-citocromo c reductasa. Contiene citocromos b566, b562 y c1 y un centro Fe-S, Transfiere electrones desde ubiquinona a citocromo c. Complejo IV es la Citocromo oxidasa, en la cual están incluidos los citocromos a y aa3 y dos iones Cu. Cataliza la reducción de O2 a H2O. Un recurso útil para establecer la secuencia de la cadena ha sido el uso de inhibidores que actúan en sitios específicos. El estado redox de los distintos componentes puede determinarse por espectrofotometría directamente en suspensiones de mitocondrias. Cuando se agrega a la preparación un inhibidor que bloquea la transferencia de electrones en un punto determinado, los componentes de la cadena que participan en las instancias previas al sitio afectado aparecerán reducidos y los de etapas posteriores estarán oxidados, pues no reciben electrones. Los estudios con distintos agentes bloqueantes del transporte de electrones apoyan el ordenamiento propuesto. Como ejemplo se mencionarán algunos de los inhibidores más utilizados. Actúan a nivel del complejo I (NADH-ubiquinona reductasa): rotenona, producto vegetal, poderoso veneno de peces, amital y otros barbitúricos, y anestésicos como halotano. Estas sustancias impiden la llegada a la CoQ de hidrógenos procedentes de sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a NAD. No afectan, en cambio, la oxidación de succinato y otros sustratos que ceden hidrógenos a flavoproteínas con FAD, probando así que éstos siguen otra vía. El antibiótico antimicina A inhibe el transporte de electrones en el complejo III. Cianuros (CN), monóxido de carbono (CO)
y azidas (N3-) inhiben específicamente la citocromo-oxidasa o complejo IV y bloquean la etapa final de activación del oxígeno. (Blanco 2001) El uso de inhibidores no sólo ha ayudado a deducir la secuencia de la cadena respiratoria, sino que ha permitido conocer mejor el mecanismo de acción de algunos fármacos y venenos. El objetivo de la presente experiencia es demostrar el efecto de algunos inhibidores sobre el flujo de electrones a través de la cadena respiratoria ubicada en la mitocondria.
II.
MATERIALES 1. Material biológico: Homogenizado hepático 2. Material y equipo de laboratorio: Juego de pipetas 10,5, 2 y 1 mL Tubos de ensayo Gradillas 3. Reactivos: Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4 2,6 Diclorofenolindofenol 0,02% Malonato 0,1 M Cianuro de sodio 0.1 M Barbiturato de sodio 0.1 M 4. Sustratos: Succinato 0,1 M(sustrato natural) p-Fenilendiamina(sustrato artificial)
III.
PROCEDIMIENTO Se prepararon los siguientes sistemas. A. SISTEMA DE SUCCINATO: TUBOS DE VIDRIO
COMPONENTES(mL) 1
2
3
4
5
6
Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4
1.5
1.2
1.0
0.5
0.5
0.5
2,6 Diclorofenolindofenol 0,02%
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Succinato 0,1 M
0.2
---
0.2
0.2
0.2
0.2
Malonato 0,1 M
---
---
---
0.5
---
---
Cianuro de sodio 0.1 M
---
---
---
---
0.5
---
Barbiturato de sodio 0.1 M
---
---
---
---
---
0.5
Homogenizado hepático
---
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Mezclamos el contenido de cada sistema de reacción (tubo). Dejamos en reposo a temperatura ambiente.
B. SISTEMA DE LA p-FENILENDIAMINA COMPONENTES(mL)
TUBOS DE VIDRIO 1
2
3
4
5
Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4
2.0
1.5
1.0
1.0
1.0
Malonato 0,1 M
---
---
0.5
---
---
Cianuro de sodio 0.1 M
---
---
---
0.5
---
Barbiturato de sodio 0.1 M
---
---
---
---
0.5
p-Fenilendiamina
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Homogenizado hepático
---
0.5
0.5
0.5
0.5
IV.
RESULTADOS: 1. Sistema de Succinato TUBO
1
2
3
4
5
6
COLOR
Azul
Azul
Incoloro
Azul
Azul
Incoloro
2. Sistema de p-Fenilendiamina TUBO
1
2
3
4
5
COLOR
Marrón claro
Marrón oscuro
Marrón oscuro
Marrón claro
Marrón oscuro
V.
DISCUSIÓN
Sistema de Succinato
El tubo ºN 1 contiene 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato (sustrato) pero no tiene el homogenizado hepático (enzima- cadena respiratoria) por lo que no se lleva a cabo ninguna reacción de reducción.
En el tubo ºN 2 contiene 2,6 diclorofenolindofenol (indicador) pero a diferencia del tubo Nº 1 no tiene Succinato (sustrato) pero si tiene el homogenizado hepático (enzima-cadena respiratoria) por lo que no se reduce el indicador.
En el tubo ºN 3 al contener el 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato (sustrato) y homogenizado hepático (enzima- cadena respiratoria) se produce la reducción de el indicador, porque este capta los e- liberados por la Flavoproteina reducida (fp H2) cadena.
En el tubo ºN 4 el Malonato agregado actúa a nivel del complejo II inhibiendo a la succinato deshidrogenasa evitando la reducción del 2,6 diclorofenolindofenol.
En el tubo ºN 5 la reacción no fue la esperada.
En el tubo ºN 6 el barbiturato inhibe a nivel de complejo II e impide que la Flavoproteina done sus electrones a la CoQ. Por lo que el 2,6 diclorofenolindofenol acepta los e- reduciéndose.
Sistema de p-Fenilendiamina
El tubo ºN 1 contiene solo p-Fenilendiamina (sustrato indicador) por lo que no hay reacción redox.
En el tubo ºN 2 la cadena respiratoria contenida en el homogenizado hepático oxidada a la p-Fenilendiamina (marrón oscuro) a nivel del Cyt c a la vez que este se reduce, luego este sigue transfiriendo los electronos por el resto de la cadena transportadora.
En el tubo ºN 3 el Malonato actúa a nivel de complejo II inhibiéndolo, pero la pFenilendiamina dona sus e- al Cyt c oxidándose (marrón oscuro).
En el tubo ºN 4 el Cianuro de sodio actúa a nivel de complejo IV, impidiendo que reciba los electrones del Cyt c, donados por la p-Fenilendiamina, impidiendo que esta siga oxidándose, manteniendo su color claro.
En el tubo ºN 5 el Barbiturato de sodio inhibe la transferencia de e- de las flavinas a la CoQ, pero la p-Fenilendiamina dona sus e- al Cyt c oxidándose (marrón oscuro).
VI.
CONCLUSIONES
El Malonato inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo II.
El cianuro de sodio inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo IV.
El Barbiturato de sodio impide la transferencia de e- a nivel de complejo I y II.
BIBLIOGRAFIA Blanco. Antonio, QUÍMICA BIOLOGICA, 8ta edición, 2001, Editorial El Ateneo. Stryer. Lubert, BIOQUÍMICA, 5ta edición, 2002, Editorial Reverte S.A.
CUESTIONARIO 1. Señalar los componentes de un sistema de oxido-reducción biológica. Para que exista una reacción redox, en el sistema debe haber un elemento que ceda electrones y otro que los acepte: 5. El agente reductor: Es aquel elemento químico que suministra electrones de su estructura química al medio, aumentando su estado de oxidación, es decir; oxidándose. 6. El agente oxidante: Es el elemento químico que tiende a captar esos electrones, quedando con un estado de oxidación inferior al que tenía, es decir; reducido. Cuando un elemento químico reductor cede electrones al medio se convierte en un elemento oxidado, y la relación que guarda con su precursor queda establecida mediante lo que se llama un par redox. Análogamente, se dice que cuando un elemento químico capta electrones del medio se convierte en un elemento reducido, e igualmente forma un par redox con su precursor reducido.
2. Señalar los componentes de la cadena respiratoria. Los tres componentes de la cadena respiratoria son:
Tres grandes complejos proteicos con moléculas transportadoras y sus
enzimas
correspondientes.
Un componente no proteico: UBIQUINONA (Q) que están embebidos en la membrana.
Una pequeña proteína llamada citocromo c que es periférica y se ubica en el espacio intermembrana, pero adosado laxamente a la membrana interna.
3. De ejemplos de sustratos y el nivel al que ingresan en la cadena respiratoria. El succinato: Ingresa a nivel del complejo II. La P – Fenilendiamina: Ingresa a nivel del complejo IV.
4. De ejemplos de inhibidores de la cadena respiratoria. Los inhibidores reciben este nombre porque su principal función es el inhibir el transporte de electrones en la cadena de la respiración. Los inhibidores del transporte de electrones más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan: a. Sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando la transferencia de electrones entre la flavina y la ubiquinona. (Inhibidores del sitio I):
Barbitúricos, como el amobarbital.
Piericidina A (antibiótico).
Rotenona (insecticida).
b. Actúa bloqueando la transferencia de electrones entre el citocromo b y el citocromo c1. (inhibidores de sitio III):
Antimicina.
c. Actúan sobre el Hemo a3 de la citocromooxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno (inhibidores de sitio IV):
Cianuro.
Monóxido de carbono.
H2S.
5. Que entiende por fosforilación oxidativa. La fosforilación oxidativa es una ruta metabólica que utiliza energía liberada por la oxidación de nutrientes para producir adenosín trifosfato (ATP). Se le llama así para distinguirla de otras rutas que producen ATP con menor rendimiento, llamadas "a nivel de sustrato".
6. De ejemplos de desacopladores de la fosforilación oxidativa. Una clase importante de antimetabolitos son los agentes desacopladores ejemplificados por el 2,4-dinitrofenol (DNP). Los agentes desacoplantes actúan como ácidos lipofílicos débiles, que se asocian con protones en el exterior de la mitocondria, que pasan a través de la membrana unidos a un protón, y que se disocian del protón en el interior de la mitocondria. Estos agentes causan tasas de respiración máxima pero el transporte de electrones no genera ATP, debido a que los protones translocados no regresan a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa.
7. Que entiende por fosforilación a nivel de sustrato. Es la síntesis de ATP (o de otro nucleótido trifosfatado) por transferencia de un grupo fosforilo y una molécula fosforilada de ADP (o de otro nucleótido difosfatado) en la que no participa la ATP-sintasa. Una fosforilación a nivel de sustrato es la formación de un nuevo enlace de fosfato de alta energía en la que NO PARTICIPA EL OXIGENO. Por ejemplo la fosfoglicerato quinasa y la piruvato quinasa catalizan la fosforilación a nivel de sustrato en la glicolisis.
8. Establezca diferencias y semejanzas entre fosforilación oxidativa en la cadena respiratoria y la fosforilación a nivel de sustrato. La fosforilación oxidativa a nivel de sustrato no utiliza la ATP sintasa, por el contrario las fosforilación oxidativa si la utiliza. Las dos producen ATP, debido a la fosforilación del ADP. La fosforilacion oxidativa a nivel de sustrato aparece en la glicolisis, la fosforilación oxidativa aparece luego de la cadena de transporte de electrones. La fosforilación oxidativa es apoyada por una fuerza protón motriz generado por los complejos de la cadena de transporte de electrones. La fosforilación oxidativa es endergónica, pero la fosforilación oxidativa a nivel de sustrato es exergónica.
La fosforilación oxidativa se da en aerobiosis, la fosforilación oxidativa a nivel de sustrato puede darse en anaerobiosis (glicolisis).
9. Interpretar el cambio del estado incoloro ha coloreado del p-Fenilendiamina. La p-Fenilendiamina participa como sustrato además de ser indicador. La p-Fenilendiamina es un sustrato indicador artificial que en estado oxidado presenta un color marrón oscuro, en la cadena de electrones acepta electrones liberados por el Cyt c reducida, reduciendo a la forma marrón claro. La velocidad de transferencia de electrones puede entonces medirse siguiendo la perdida de color del pigmento.
10. Graficar en una cadena de oxido-reducción biológica la vía de entrada del 2,6 Diclorofenolindofenol y la p-Fenilendiamina.
