Cadena Respiratoria
“Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento de la Educación” Universidad Nacional Del Perú Facultad de Medicina Humana Escuela profesional de Enfermería
Practica de Laboratorio #7 CADENA RESPIRATORIA
ASIGNATURA:
BIOQUIMICA
DOCENTES:
DRA.VIOLETA MORIN GARRIDO DR. CARLOS HOLGUIN MAURICCI
ALUMNA:
FIORELLA DIOSESFERNANDEZ
Piura - 2015
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Cadena Respiratoria
INDICE
1. Marco Teórico
Cadena respiratoria
La cadena respiratoria se abastece de poder reductor
La cadena respiratoria en las células eucariotas ocurre en mitocondrias
Los transportadores de cadena respiratoria tienen diferente afinidad por los electrones
Inhibidores
Tipos de Inhibidores
Los inhibidores de la cadena respiratoria impiden el pasaje de electrones
2. Practica de Laboratorio
Cuestionario
3. Bibliografía
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Cadena Respiratoria
1. MARCO TEORICA Cadena respiratoria La misión de la cadena transportadora de electrones es la de crear un gradiente electroquímico que se utiliza para la síntesis de ATP. Dicho gradiente electroquímico se consigue mediante el flujo de electrones entre diversas sustancias de esta cadena que favorecen en último caso la translocación de protones que generan el gradiente anteriormente mencionado. De esta forma podemos deducir la existencia de tres procesos totalmente dependientes: Un flujo de electrones desde sustancias individuales Un uso de la energía desprendida de ese flujo de electrones que se utiliza para la translocación de protones en contra de gradiente, por lo que energéticamente estamos hablando de un proceso desfavorable. Un uso de ese gradiente electroquímico para la formación de ATP mediante un proceso favorable desde un punto de vista energético.
La cadena respiratoria se abastece de poder reductor Las células eucariotas y procariotas obtienen energía, principalmente bajo forma de ATP, a partir del poder reductor (o H2) presente en las moléculas de glúcidos, lípidos y aminoácidos, entre otras. Como se observa en la figura 1, el aceptor final de los H2 es el O2, se trata de un ejemplo de célula aerobia. Sin embargo, hay otros tipos de células en que los aceptores finales de H2 son moléculas diferentes del O2, esas células son anaerobias y fermentativas. Ahora vamos a centrar el estudio en células aerobias. Los azúcares, ácidos grasos y aminoácidos cuando son oxidados (degradados) proveen de poder reductor, de manera más o menos directa, a la cadena respiratoria. Así, se reducen cofactores como el NAD y el FAD dando inicio a la transferencia del poder reductor (H2) hasta el aceptor final, que en los organismos aerobios es el O2. La variación de energía de los electrones desde los precursores reducidos (aminoácidos, glúcidos y ácidos grasos) hasta el agua, es un proceso exergónico, que impulsa la reacción endergónica de síntesis de ATP a partir del ADP y P.
La cadena respiratoria en las células eucariotas ocurre en mitocondrias La mitocondria en un organelo presente en las células de vegetales, animales y hongos, es decir en todas las eucariotas. Su número por célula es variable, y está limitada por dos membranas, una externa y
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otra interna. Estas membranas delimitan dos espacios: la cámara externa o espacio intermembrana y la matriz ( En la membrana interna se localiza la cadena respiratoria, que consta de una serie de transportadores de electrones como el NAD, CoQ, citocromos y diversas enzimas. En las bacterias la cadena respiratoria está asociada a la membrana celular. La cadena respiratoria siempre está asociada a una membrana, porque para su funcionamiento es necesario un ordenamiento espacial bien definido de los transportadores y proteínas que la integran, como se verá más adelante.
Los transportadores de cadena respiratoria tienen diferente afinidad por los electrones A través de la cadena respiratoria se dan reacciones de óxido reducción que se suceden desde el NAD y el FAD hasta el oxígeno Los electrones pueden ser captados o cedidos de diferentes formas: a. un electrón individualmente, b. un electrón unido a un protón; como un átomo de H, c. dos electrones unidos a dos protones; como dos átomos de H. Inhibidores Los Inhibidores enzimáticos son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Ya que el bloqueo de una enzima puede matar un organismo patógeno o corregir un desequilibrio metabólico, muchos medicamentos actúan como inhibidores enzimáticos. También son usados como herbicidas y pesticidas. Sin embargo, no todas las moléculas que se unen a las enzimas son inhibidores; los activadores enzimáticos se unen a las enzimas e incrementan su actividad. Tipos de Inhibidores Reversibles: Unión no covalente de un inhibidor a la enzima a. Competitiva b. No competitiva c. Acompetitiva Irreversibles: Unión covalente del inhibidor al enzima
Los inhibidores de la cadena respiratoria impiden el pasaje de electrones Las moléculas que actúan como inhibidores impiden el flujo de e- entre los transportadores, y por lo tanto la síntesis de ATP. Estas moléculas pueden actuar como venenos. El Amital (un barbitúrico) o la Rotenona (un insecticida) bloquean el flujo de e- desde el NADH a la CoQ, mientras la Antimicina (un antibiótico) lo hace entre CoQ y Cit b, y el cianuro, la azida y el monóxido de carbono actúan sobre la citocromo oxidasa.
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La aplicación de estos inhibidores bloquea el pasaje de e- por la cadena respiratoria. De esta forma “por detrás” del punto de inhibición los transportadores quedan reducidos. Como consecuencia de esto no se produce ATP porque no se genera el gradiente protónico, ni agua porque los e- no llegan a reducir al O2: la cadena está interrumpida.
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2. PRACTICA DE LABORATORIO “
FUNCIONAMIENTO DE LA CADENA RESPIRATORIA
”
OBJETIVO: Demostrar el funcionamiento de la cadena respiratoria a través del efecto de inhibidores sobre la cadena oxido-reducción biológica. I.
GENERALIDADES
Se ha demostrado que muchas sustancias inhiben la cadena respiratoria en mitocondrias aisladas, células intactas y tejidos, produciendo en consecuencia deficiente respiración celular y deficiente oxidación de los sustratos. Algunos antibióticos como la antimicina A, la elaborada por un Streptomyces, inhiben la cadena respiratoria en, o cerca del sitio II. Algunos barbitúricos como el amital y el seconal inhibirán la NADH 2. El cianuro, la azida sódica (NaN 3) y el CO pueden inactivar en forma eficaz la citocromooxidasa. El estudio de estos inhibidores es importante porque permite comprender la causa de la toxicidad de estos compuestos y también porque contribuyen a la realización de trabajos de investigación relacionados con la estructura y función de la cadena respiratoria. En el presente trabajo se trata de demostrar el efecto de algunos inhibidores de la óxido-reducción empleando como fuente enzimática el homogenizado celular de hígado. II.
REACTIVOS
Buffer fosfato de sodio 0.1 M, ph 7.4 2.6 diclorofenolindofenol 0.02% P-fenilondiamina 1% Succionato 0.1 M Malonato 0.1 M Cianuro de sodio 0.1 M Barbiturato de sodio 0.1 M Homogenizado hepático
-
III.
PROCEDIMIENTO A. SISTEMA DE SUCCINATO:
-
COMPONENTES Buffer fosfato de sodio 0.1 M, ph 7.4 2.6 diclorofenolindofenol 0.02% Succionato 0.1 M Malonato 0.1 M Cianuro de sodio 0.1 M
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1 1.5 1.0 0.2 -
2 1.2 1.0 -
3 1.0 1.0 0.2 -
4 0.5 1.0 0.2 0.5 -
5 0.5 1.0 0.2 0.5 -
6 0.5 1.0 0.2 0.5
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- Barbiturato de sodio 0.1 M - Homogenizado hepático
-
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Mezclar: Dejar en reposo a temperatura ambiental. Observar: Constantemente los cambios de color del indicador. Interpretar sus resultados.
B. SISTEMA USANDO P-FENILENDIAMINA
- -
COMPONENTES Buffer fosfato de sodio 0.1 M, ph 7.4 Cianuro de sodio 0.1 M Malonato 0.1 M Barbiturato de sodio 0.1 M P-fenilendiamina Homogenizado hepático
1 2.0 0.5 -
2 1.5 0.5 0.5
3 1.0 0.5 0.5 0.5
4 1.0 0.5 0.5 0.5
5 1.0 0.5 0.5 0.5
Mezclar: Dejar en reposo a temperatura ambiental. Observar: Constantemente los cambios de color del indicador. Interpretar los resultados. IV.
CUESTIONARIO de interpretación de la practica
1. ¿Qué interpretación le da a los tubos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 del primer experimento? Tubo 1: Está presente el dador de electrones (2,6 diclorofenolindofenol), pero no está presente el homogenizado hepático, por lo cual no se produce reacción. Además no se puedo observar cambio de color alguno ya que como se dijo anteriormente no se encontraba el homogenizado hepático (medio en el que se encontraban las mitocondrias esenciales para el proceso) que nos brindaría el sistema enzimático necesario para el funcionamiento de la cadena respiratoria. Tubo 2: Está presente el dador de electrones, el homogenizado hepático, pero no está presente el succinato, que es el sustrato, por lo cual no se produce reacción. Ya que la cadena respiratoria no se cumple (por la carencia de succinato) por consiguiente no se evidencia coloración alguna. Tubo 3: Está presente el dador de electrones, el sustrato, el homogenizado hepático, por lo cual se completa la reacción y se obtiene que se colorea de color azul (esto nos indicara el cumplimiento total del recorrido de la cadena respiratoria), dando por hecho que el ciclo se completa.
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Así tenemos las mitocondrias (proporcionado por el homogeneizado), el donador de electrones (succinato), el aceptor de electrones (2,6 diclorofenolindofenol) y el sistema enzimático Tubo 4: Está presente el dador de electrones, el sustrato, el homogenizado hepático, pero la presencia de un inhibidor de la cadena respiratoria como el malonato (bloquea al inicio de la cadena respiratoria ya que impide el paso de los electrones procedentes del succinato hacia la flavoproteina y de esta a la coenzima Q), no permite que se lleve a cabo el ciclo, por lo cual no se produce reacción. Tubo 5: Está presente el dador de electrones, el sustrato, el homogenizado hepático, pero la presencia del inhibidor de la cadena respiratoria, cianuro de sodio, quien bloquea al final de la cadena respiratoria (se opone a que haya transporte de electrones a nivel de citocromo a, de esta forma el 2,6 diclorofenolindofenol no recibe ningún flujo de electrones), no permite que se lleve a cabo la reacción. No hay cambio de color Tubo 6: Está presente el dador de electrones, el sustrato, el homogenizado hepático, pero la presencia del inhibidor de la cadena respiratoria, como el barbiturato de sodio, que inhibe a nivel de FAD, impide que se lleve a cabo el ciclo, y no se produce reacción.
2. ¿Qué interpretación le da a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5 del segundo experimento?
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Tubo 1: Esta presente la p fenilendiamina, que es un dador de hidrógenos, pero no hay homogenizado hepático (no se aprecia la cadena respiratoria), lo cual no se presenta reacción. Tubo 2: Está presente la p fenilendiamina, y el homogenizado hepático por lo cual se lleva a cabo la reacción y se colorea de color rojo. En este tubo si se va apreciar la cadena respiratoria ya que se cuenta con los componentes esenciales para su desarrollo. Tubo 3: Está presente la p fenilendiamina y el homogenizado, pero está presente el inhibidor como el cianuro de sodio (interviene a nivel del citocromo impidiendo el flujo de electrones hacai el aceptor final que es el oxigeno), por lo que no se lleva a cabo la reacción. Tubo 4: Está presente la p fenilendiamina y el homogenizado, pero está presente el inhibidor como el malonato. Se aprecia un cambio de color en la solucion lo que significa que hay funcionamiento normal en el transporte de electrones a pesar de la presencia del malonato Tubo 5: Está presente la p fenilendiamina y el homogenizado, pero está presente el inhibidor como el barbiturato, que inhibe la cadena respiratoria, por lo cual no se produce reacción
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3. ¿Cómo Ud. separaría Mitocondrias puras? Por el método de centrifugación.- utiliza una serie de pasos de centrifugación diferencial, con velocidades sucesivamente mayores y cada uno produce un sedimento y un sobrenadante, que es centrifugado seguidamente. La centrifugación se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad mayor que la del medio en que se encuentran. Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones: sobrenadante ('supernatant'), fracción homogénea que no ha sedimentado, y el sedimento ('pellet') que ha quedado adherida al fondo del tubo. Para lograrlo con mitocondrias se aplica una centrifugación diferencial. Centrifugación diferencial La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación culmina, se aplica el centrifugado de nuevo en condiciones de más tiempo y a más velocidad, de manera que sedimentan las partículas siguientes y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.
4. Que otros inhibidores existen de 3 ejemplos y en que sitios actúan
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En la inhibición competitiva , el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que también se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero (ver ejemplos expuestos más abajo). En la competitiva el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que el sustrato. Sin embargo, la unión del inhibidor afecta la unión del sustrato, y viceversa. Este tipo de inhibición se puede reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los inhibidores de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibición resulta generalmente de un efecto alostérico donde el inhibidor se une a otro sitio que no es el sitio activo de la enzima. La unión del inhibidor con el sitio alostérico cambia la conformación (es decir,
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la estructura terciaria o la forma tridimensional) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio activo se reduce. La inhibición mixta , es una forma de inhibición mixta donde la unión del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unión con el sustrato. Como resultado, el grado de inhibición depende solamente de la concentración de inhibidor.
5. que son dadores y aceptores artificiales y cuáles y para que se usaron en práctica especifique el sistema. Dadores: Los donadores de electrones más comunes son las moléculas orgánicas. Los organismos que usan moléculas orgánicas como fuente de energía son conocidos como organotrofos. Sin embargo, existen procariotas que son capaces de utilizar fuentes inorgánicas como fuente de energía y se les conoce por ello con el nombre de litotrofos. Estos donadores inorgánicos incluyen al hidrógeno, al monóxido de carbono, el amonio, el nitrito, sulfuro, y el ion ferroso. Los litotrofos se han observado creciendo en formaciones de rocas a centenares de metros bajo la superficie de la Tierra. El uso de donadores de electrones inorgánicos como fuente de energía es de particular interés en el estudio de la evolución. Este tipo de metabolismo tuvo que ser el antececesor de los actuales modelos de organotrofos.
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Aceptores artificiales: Al igual que existen un gran número de donadores de electrones, también existen un gran número de aceptores que pueden ser de ambos tipos, es decir de origen orgánico o inorgánico. Si el oxígeno está disponible, se usará como aceptor, ya que genera mayor producción energética. En los ambientes anaeróbicos, se puede utilizar NO 3-, NO2-, Fe3+, SO42-, CO2 y pequeñas moléculas orgánicas como por ejemplo el fumarato.
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3. Bibliografía http://www.fagro.edu.uy/~bioquimica/docencia/material%20nivelacion/CADENA%2 0RESPIRATORIA.pdf http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/fra ccionamiento.htm http://www.guiametabolica.org/ecm/defectos-sintesis-coenzima-q10/info/escoenzima-q10 https://respiracioncelular.wordpress.com/cadena-respiratoria/ http://www2.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/temas/tema-9_inhibicionenzimatica.pdf https://es.wikipedia.org/wiki/Inhibidor_enzim%C3%A1tico#Tipos_de_inhibidores_re versibles
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