RESUMEN Para realizar este método se tiene que hacer una curva de calibración con disoluciones de concentración conocida utilizando una solución estándar de glucosa para determinar las absorbancias y hacer una modelo para poder seguir e interpolar las absorbancias de las muestras y conocer las concentraciones, para preparar las muestras tomamos una solución de muestra se le añadió ácido sulfúrico y fenol que ayudan a formar complejos con las proteínas, después se tomó la medida de la absorbancia de las muestras y se determinó la concentración de las proteínas en las muestras problema. INTRODUCCION El análisis de azúcares es muy importante en tecnología de alimentos por diversos motivos. Para llevarlo a cabo existe una gran variedad de métodos, basados en distintos principios. Cuando se quiere determinar el contenido en azúcares reductores o en azúcares totales, el empleo de los métodos químicos basados en la reducción del cobre es una opción muy adecuada. A su vez, este tipo de metodología incluye una gran variedad de métodos, entre los que cabe destacar el método de Fenol-sulfúrico. En este objeto de aprendizaje se va a explicar la forma de llevar a cabo los cálculos para determinar el contenido en azúcares totales de una muestra, que ha sido analizada por el método fenol-sulfúrico. Los carbohidratos se logran destruir por calor y por adición de ácido y son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simples, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos obscuros o compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol y es un método fácil, eficaz y rápido. Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que estos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. La forma en que procede la reacción no es estequiométrica y depende de la estructura del azúcar, por lo tanto se realiza una curva patrón. La intensidad del color naranja es proporcional a la cantidad total de carbohidratos presentes. Esta absorbancia puede ser medida a 492nm y la concentración total de carbohidratos de las soluciones problema puede ser medida con respecto a una curva estándar preparada.
1. Fundamento de la técnica utilizada para determinar azucares totales. Se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones
complejas toman lugar empezando con una deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol. Este método es fácil, eficaz y rápido. Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que éstos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos.
2. las posibles interferencias de otros compuestos en la cuantificación de azucares. Entre otros compuestos que pueden interferir en la cuantificación de azucares están las proteínas en altas cantidades de concentración así como la influencia de la luz, el aire y ciertos compuestos de metales como cobre y hierro.
3. Las medidas de precaución que deben tenerse al trabajar con fenol y ácido sulfúrico FENOL.- Los riesgos principales que albergan los fenoles es que son tóxicos y corrosivos por lo que pueden provocar quemaduras y afectar al SNC y es por eso que se debe hacer uso de mascarillas, lentes y guantes de Viton, Butilo y/o Neopreno (no se recomiendan de Goma Natural, Nitrilo, PVC o de PVA) así como el equipo cotidiano en el laboratorio como bata, pantalón de mezclilla y zapato cerrado. Entre los riesgos secundarios de este compuesto están que es inflamable por lo que se debe contar con extintores de polvo químico seco; y reacciona levemente produciendo CO y CO2. El área de trabajo con fenoles debe ser ventilada o en campanas de laboratorio con extracción forzada. En caso de inhalación trasladar a la persona donde exista aire fresco, sí hay paro respiratorio emplear la reanimación cardiopulmonar y suministrar oxígeno. En caso de contacto con la piel u ojos se debe lavar el área rápidamente con abundante Agua mínimo durante 20 minutos. En caso de ingesta se debe inducir al vómito, lavar la boca y dar a beber abundante agua así como aplicar el antídoto contra Fenol. ÁCIDO SULFÚRICO.- Los riesgos principales que alberga el ácido sulfúrico es que es muy fuerte y corrosivo además que produce ácidos volátiles y es deshidratante por lo que se debe hacer uso del equipo descrito en los fenoles. Entre los riesgos secundarios están que reacciona con todos los metales produciendo SO2 e hidrogeno gaseoso (altamente explosivo y tóxico), además al ser un oxidante fuerte reacciona violentamente con materiales reductores y bases. También se sabe que no es inflamable pero al entrar en reacción con compuestos de este tipo es capaz de generar calor e iniciar la ignición. En caso de ingesta, parte del ácido naturalmente se exhala a manera de amoniaco y parte se neutraliza minimizando el riesgo en el organismo. El ácido restante se 1
disocia y pasa al torrente sanguíneo en forma de ion Sulfato y finalmente se elimina por orina y sudor. Para ayudar a minimizar el riesgo se debe dar a beber agua o leche en cantidad de 2 vasos para diluir los contenidos estomacales y no se debe inducir al vómito. En caso de contacto con piel u ojos reaccionar de la misma manera que con los fenoles con la excepción de que se debe aplicar bastante jabón y no mucha agua. Al mezclar este ácido con agua se debe tener precaución ya que genera una gran cantidad de calor. Se recomienda agregar el ácido al agua y no viceversa. Y el agua no debe estar caliente.
4. Se calculo la cantidad de residuos peligrosos que se generaron con esta técnica para cuantificar azúcares totales. Propone un procedimiento para manejar estos residuos. Para calcular la cantidad de residuos peligrosos generados con esta técnica se puede hacer una diferencia de lo que tenemos al principio menos el resultado dado del espectrofotómetro. Para el manejo de estos residuos se debe tomar en cuenta el material del bidón en el cual se van a almacenar, es decir, que el material con el que este hecho no reaccione con los residuos además que hay que tener una temperatura estable así como la gradiente de luz Por ejemplo, el Fenol se debe almacenar en recipientes galvanizados, acero inoxidable, y plástico, estos recipientes deben ser cerrados, grandes cantidades de fenol deben almacenarse en tanques o bidones de acero inoxidables o de acero inoxidable revestido de níquel, o una aleación de níquel apropiada, no debe utilizarse cobre, los envases de vidrio solo son adecuados para el manejo de pequeñas cantidades en el laboratorio. El fenol no debe almacenarse junto a cloratos, nitratos u otros materiales oxidantes y fuera del alcance de cualquier fuente de ignición. Los bidones deben estar ubicados en lugares de fácil acceso a todas las partes y con buena ventilación. Durante su almacenamiento el fenol adquiere un color amarillo, rosado o pardo, ocasionada por la acción del agua, la luz, el aire y los catalizadores como vestigios de hierro o cobre. OBJETIVO Ensayar la cuantificación de carbohidratos totales por el método Fenol-ácido sulfúrico para la aplicación en diversas muestras de interés en el estudio de alimentos. REQUERIMENTOS Material
Reactivos 2
20 tubos de ensaye 16 x50 mm con tapa. 10 Microtubos de 1.5 mL 1 Gradilla 1 Pipeta graduada de 10 mL 1 Pipeta graduada de 5 mL. 1 Pipeta automática de 1000µl. 1 Pipeta automática de 200 µl. 10 Puntas de 1000µl. 10 Puntas de 200 µl 1 Celda de vidrio de 3.5 mL 1 Baño con hielo. 1 Cronómetro. 1 Par de guantes de látex 1 Lentes protectores
10 mL de fenol al 5% 40 mL de H2SO4 concentrado. 1 mL Sulfato de zinc 10% 1 mL NaOH 0.5N Equipo Espectrofotómetro 490 nm. Centrifuga para microtubos 10,000 rpm Vórtex Muestra 1mL Solución de sacarosa 1% 1mL Solución de almidón 1% 5 mL de medio de cultivo con sacarosa
CÁLCULOS Preparación de la Curva Estándar de Glucosa Conc. De glucosa Sol. Estándar de Agua µg/mL Glucosa (100 µg/mL) (mL) 0 0 1.0 10 0.1 0.9 20 0.2 0.8 40 0.4 0.6 60 0.6 0.4 80 0.8 0.2 100 1.0 0.0 Cuadro 1 Cantidades a mezclar de agua con solución estándar de Glucosa para obtener las concentraciones de 0, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 µg/mL. Dilución para Sacarosa 1% y Almidón 1% Como se tiene que realizar una dilución de 1,000 veces, entonces se toma una relación de 1,000 (ya sean µL, mL, etc.). En este caso se tomó un factor de 100x100 por lo que se tiene una razón de 1:99 de muestra y agua respectivamente, pero estás muestras son muy pequeñas para las micropipetas por lo que se toma un factor de dilución de 20 dando una razón más conveniente de 20:1980 con los mismos reactivos. Dilución para El Medio Cultivo con Sacarosa Dado que la dilución en este caso es de 10,000 veces simplemente se realiza el mismo paso anterior por duplicado. Es decir, ya que se tenga la nueva muestra con 20:1980 se toma otra nueva muestra de 20 y se le añaden 1980 de agua.
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Cabe mencionar que se puede tomar cualquier razón para las mezclas dependiendo de la capacidad de la micropipeta con la que se cuente en el laboratorio o de la cantidad de las sustancias. PROCEDIMIENTO Se preparara las mezclas como muestra el con el fin de obtener las concentraciones de Glucosa (µg/mL) de 0, 10, 20, 40, 60, 80 y 100. Estas se enumeraron del 1 al 7. Después, se toma 1 mL de cada una de las mezclas, se les añadió 500 µL de Fenol 5% y 2,500 µL de ácido sulfúrico concentrado a cada una y se mantuvo en reposo durante 10 minutos. Posteriormente, se agita cada una de las muestras y se ponen en agua fría (25 a 30 °C) durante 15 minutos. Para finalizar, teniendo las muestras listas, se lee la absorbancia de cada una de las muestra en el espectrofotómetro a 490nm. Se realiza la desproteinización de la muestra de Medio de Cultivo con Sacarosa. Esto se llevó a cabo tomando 500 µL de la muestra, poniéndola en un tubo, añadiendo 250 µL de Sulfato de Zinc al 10% y 250 µL de NaOH 0.5N y dejando reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después, se centrifuga la muestra de Medio de Cultivo con Sacarosa a 10,000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante resultante se transfirió a otro tubo de centrífuga. Posteriormente, se realizaron las diluciones necesarias de cada una de las muestras y para determinar los azucares totales se les añadió 500 µL de Fenol 5% y 2,500 µL de ácido sulfúrico concentrado a cada una de las muestras y se mantiene en reposo durante 10 minutos a todas. Para continuar, se agitó cada una de las muestras y se pusieron en agua fría (25 a 30 °C) durante 15 minutos. Teniendo las muestras listas, se lee la absorbancia de cada una de las muestra en el espectrofotómetro a 490nm. Lo que se va estudiar es la cantidad de azucares totales en un cultivo utilizando una curva de calibración con estándares de concentración conocida utilizando el método de regresión lineal simple y correlación para modelar una ecuación que describa la relación entre la absorbancia y la concentración de azucares totales dada los siguientes datos de la curva de calibración. 4
Concentración de glucosa [µg/mL] X 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0.0
Volumen final mL
Fenol 5% mL
H2SO4 mL
Absorbancia 490 nm Y
1 1 1 1 1 1
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
0.43 0.361 0.272 0.158 0.086 0
Realizar la regresión lineal para obtener la ecuación de la recta que nos ayude a describir la relación entre la absorbancia y la concentración de glucosa [µg/mL]. Se utiliza esta relación basado en que la glucosa absorbe a esta longitud de onda y entre mayor absorbancia tenemos mayor concentración. Resultados a obtener Muestra problema Sacarosa Almidón Medio de Cultivo Muestra
Absorbancia 490 nm 0.306 0.810 0.724 0.074
Concentración de glucosa µg/mL X X X X
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Referencias
Robert K. 1988. Harper Bioquímica Ilustrada. Editorial: El manual moderno. México Df.
Dubois, M.; Gilles A.; Hamilton, J.; Rebers, P. y Smith, F. 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analitycal chemistry 28(3): 350-356.
Nielsen, S. 1998. Food Analysis. Kluwer Academic Publications
http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/5.pdf
