1. Informe de Preparacion de Medios de Cultivo

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA ALIMENTARIA

FACULTAD DE OCEONOGRAFÍA, PESQUERÍA, CIENCIAS ALIMENTARIAS Y ACUICULTURA ESCUELA DE INGENIERIA ALIMENTARIA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DOCENTE: Dra. NILDA QUISPE ALVARADO TEMA: INFORME DE PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO AÑO: 3° “B” INTEGRANTES:      

POCLIN DELGADO,KATIA QUEVEDO MEZA,CRISTIAN VENTURA FLORES,MARJORIET VELIZ MIRANDA,ANNABELLA VERASTEGUI,MARJORIE VERDI HUAMANI,DANIXSA

LIMA, MIRAFLORES 24 DE MAYO 2017

Página 1 de 22


PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO FUNDAMENTO El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer. MERK(2002) OBJETIVOS Aprender a preparar los medios de cultivo mas comunes que se utilizan para el cultivo de los microorganismos Diferenciar los diversos tipos de medios y su aplicación adecuada de acuerdo al tipo de microorgaanismo a cultivar

MARCO TEORICO: MEDIOS DE CULTIVO: Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. (López T. & Torres C., 2006)

Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. (Ramón P. & Juárez A., 2002)

Fig. 1 Microorganismo

Página 2 de 22


El desarrollo de un microorganismo en un medio de cultivo depende de diversos factores, entre los cuales los más importantes son: -

Disponibilidad de los elementos nutritivos necesarios Existencia del oxígeno requerido Grado de humedad apropiado Valores de pH adecuados: Usualmente neutro o ligeramente alcalino (7.2 – 7.4), salvo excepciones. Temperatura de incubación precisa: 35 – 37°C para las bacterias patógenas. Condiciones de esterilidad del medio y protección de posibles contaminaciones. (García M., Fernández T. & Paredes S., 2005)

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Según su origen:  Naturales: Son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.  Sintéticos: Son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.  Semisintéticos: Son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura. (López T. & Torres C., 2006)

Según su consistencia:  Líquidos: Se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa. Favorecen mucho el desarrollo y la multiplicación de las bacterias porque al difundirse estas por todo el medio encuentran con facilidad las sustancias que necesitan para nutrirse.  Sólidos: Se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo). El agar es una sustancia inerte polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningún elemento nutritivo, en ellos las bacterias crecen con mayor dificultad, pues los nutrientes se agotan con rapidez en el punto donde se desarrollan.  Semisólidos: Se utilizan para determinar la motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de agar. (García M., Fernández T. & Paredes S., 2005)

Página 3 de 22


Fig. 2 Cultivos sólidos y líquidos Según su composición:  Comunes o universales: Su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos poco existentes. Es el medio más frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemplo: agar común o caldo común.  Selectivos: Son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de inhibir el crecimiento de especies químicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos estafilococos). (López T. & Torres C., 2006)

Según su aplicación:  Generales: También llamados comunes, son apropiados para el cultivo de la mayoría de los microorganismos por la facilidad con que se desarrollen en ellos.  Especiales: Conocidos también como específicos, van dirigidos al cultivo de determinadas especies bacterianas o son utilizadas con fines de diferenciación.  Enriquecidos: Van añadidos de nutrientes muy ricos que permiten el crecimiento de ciertas bacterias difíciles de cultivar. COMPONENTES USUSALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

 Extractos: Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hígado, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En Página 4 de 22








  

el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrógeno y carbono. Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad química definida; se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Fluidos Corporales: Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH. Indicadores de pH: Indicadores ácido- base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. Agentes reductores: Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo (ver más adelante, clasificación de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, ácida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. (Rodríguez C., Gamboa C. & Hernández Ch., 2005)

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN LABORATORIO: 

AGAR NUTRITIVO: Es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difícilmente observables. (Uberoa F, 1981) Página 5 de 22


Fig. 3 Agar nutritivo



CALDO BRILA: Medio selectivo recomendado para la prueba confirmatoria en la detección del grupo coliforme en aguas, leche, derivados lácteos y otros productos de importancia sanitaria, mediante la determinación del NMP. López T. & Torres C. (2006)

Fig. 4 Caldo brila 

AGAR NUTRITIVO: El medio contiene extracto de carne, peptona y agar, siendo una formulación suficiente para el desarrollo de los microorganismos. El extracto de carne proporciona al medio fuente de carbohidratos, de nitrógeno y vitaminas. El empleo de este medio es de acuerdo al tipo de estudio por realizar. (García M., Fernández T. & Paredes S., 2005)

Página 6 de 22


Fig. 5 Agar nutritivo

PARTE EXPERIMENTAL DE AGAR NUTRITIVO Materiales:               

Espátula Balanza mecánica Papel kraft Balón de base plana Probetas Autoclave Extracto de carne Peptona Agar Agua destilada Agar tripticasa soya Agar TSI( agar con hierro y tres azucares) Tubos de ensayo Tubos con campanas Durham Lápiz marcador

Procedimiento: 1. Preparación de medio de cultivo de Agar nutritivo:  Se midió en una probeta de 500 ml, 300ml de agua destilada.

Página 7 de 22


Fig.1: Probeta con 300 ml de agua destilada

 Se pesó 8.4 g de agar nutritivo en un papel kraft.

Fig.3: Pesado de los 8.4 g de agar nutritivo

Fig.2: Agar nutritivo

 Se pasó el agar nutritivo del papel kraft a un balón de base plana y se agregó los 300ml de agua destilada.

Página 8 de 22


Fig.4: Agar nutritivo siendo pasado a un balón

Fig.5: Agar nutritivo siendo mezclado con agua destilada

 Se homogenizo y se colocó un tapón de algodón en el pico del balón.

Fig.6: Medio de cultivo final de agar nutritivo

 Se calentó a la llama del mechero el balón hasta que este hierva.  Finalmente se cubrió con papel kraft el balón y con un lápiz marcador se le puso fecha y hora de entrada al autoclave.

 Luego agregamos los tubos a una lata, se envolvió con papel y se rotulo.

Página 9 de 22


Fig.7: Lata envuelta rotulada

 Finalmente se colocó las latas donde el autoclave.

Fig.8: Latas en el autoclave

Fig.9: Autoclave

DISCUSION: Según Delgado A., Polanco A. & Prieto S. (2001) “Las técnicas de esterilización han de destruir todos los tipos de vida microbiana. El vapor de la presión (autoclave) es el método más eficaz y práctico para esterilizar con calor. La exposición al vapor en una autoclave, a 15 libras de presión (121 ° C) y durante 20 minutos, matara todas las formas de vida.” En la práctica desarrollada en laboratorio, esterilizamos en autoclave tal como dice el autor, con la diferencia que lo sometimos a 121 °C por 15 minutos.

Página 10 de 22


PARTE EXPERIMENTAL DEL CALDO NUTRITIVO MATERIALES        

Espátula Balanza de torsión Papel Kraft Balones Probetas Encendedor Caldo nutritivo Agua destilada

EQUIPO  

Autoclave Mechero Bunsen

PASOS QUE SE SIGUIÓ PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO: CALDO NUTRITIVO 

Se observó las indicaciones para preparar el medio de cultivo.

Ilustración 2. Indicaciones de la preparación del medio de cultivo

Ilustración 1. Caldo nutritivo

Página 11 de 22




Se pesó 2 g del “caldo nutritivo” que estaba en estado sólido (polvo).

Ilustración 3. Dos gramos de caldo nutritivo



Se midió 100 ml de agua destilada en una probeta y se añadió una cierta cantidad de agua al balón para evitar que cuando se agregue el caldo, éste se pegue al frasco.

Ilustración 4. 100 ml de agua destilada



Ilustración 5. Balón con un poco de agua destilada

Se agregó el “caldo nutritivo” al balón y luego de disolver se añadió el resto de agua destilada.

Página 12 de 22


Ilustración 4.



Se calentó agitando constantemente para que termine de disolverse y no se queme.

Ilustración 5. Preparación del medio de cultivo



Se distribuyó el medio de cultivo en tubos de ensayo, luego se taponó los tubos con algodón no absorbente, dándole el ajuste necesario para que impida la contaminación después del proceso de esterilización.

Página 13 de 22


Ilustración 8. Distribución de medio de cultivo en tubos de ensayo.



Se colocaron los tubos en un envase de hojalata forrado con papel y se rotuló.

Ilustración 10.



Ilustración 9.

Ilustración 11.

Se esterilizó en autoclave a 121°C durante 15 minutos y se retiró inmediatamente.

Página 14 de 22


Ilustración 12. Medios de cultivo listos para ser esterilizados



Ilustración 13. Autoclave

Medios de cultivo ya esterilizados

Ilustración 6. Medios de cultivo esterilzados



Se acondicionó los tubos en una estufa después de esterilizados.

Página 15 de 22


RESULTADOS Se obtuvo un medio de cultivo en buenas condiciones.

Ilustración 7

DISCUSIÓN Para poder identificar los microorganismos es necesario observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por ello, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y peptona a la que se añaden otros ingredientes. Estos materiales sirven al medio de cultivo como fuente de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre. Con el extracto de carne y otros materiales se puede preparar un caldo nutritivo utilizado para el mantenimiento de cultivos de bacterias (Pinto & Martín, 2012). El uso de extracto de carne para preparar medios de cultivo como caldo nutritivo es muy importante para poder observar el crecimiento de microorganismos, estamos de acuerdo con el autor.

PARTE EXPERIMENTAL DEL CALDO BRILA 1. Materiales      

Probeta de 250 ml Balón de 1000 ml Pipeta de 5 ml Tubos de ensayo Gradilla Espátula Página 16 de 22


 Papel kraft  Algodón

2. Equipos de laboratorio  Balanza mecánica  Mechero Bunsen  Autoclave

3. Muestra  Extracto de carne (caldo brila)

Figura 1. Extracto de carne

Página 17 de 22


4.Procedimiento experimental

 Con un papel kraft doblado en 4 se pesó 8 g del extracto de carne (caldo brila) en la balanza mecánica.

Figura 2. Peso de la muestra

 Se midió 200 ml de agua destilada en la probeta.

Figura 3. Medida de 200 ml de agua destilada

Página 18 de 22


 Se disolvió el polvo ya pesado añadiendo una pequeña cantidad de agua para evitar que el polvo se adhiera al balón, luego se agregó el agua restante hasta el volumen deseado y se agito el balón con el contenido.

Figura 4. Adición de la muestra y agua destilada

 En una bureta se distribuyó el medio de cultivo en tubos de ensayo previamente esterilizados y en cantidades constantes (9ml).

Figura 5. Agregando el medio de cultivo a la bureta

Página 19 de 22


Figura 6. Distribución del medio de cultivo en tubos

 Se colocó tapones de algodón a los tubos de ensayo para evitar una contaminación después de la esterilización.

Figura 7. Cerrando con tapones de algodón

 Se distribuyó los tubos de ensayo en un recipiente y se llevó posteriormente a la autoclave para la esterilización a 1210C por 15 minutos.

Página 20 de 22


Figura 8. Distribución de los tubos en un recipiente

Figura 9. Esterilización en la autoclave

RESULTADOS

Figura 10. Cultivo de caldo brila

Página 21 de 22


DISCUSIONES Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. En nuestra practica elaboramos el cultivo brila (caldo verde), éste nos determinará las probabilidades de microorganismos coliformes

CONCLUSIONES.  

Se aprendió a preparar los medios de cultivo como el caldo nutritivo, caldo brila y agar nutritivo Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos.

 

Nuestro cuerpo también es un excelente portador de microorganismos Se diferenció los tipos de medios de cultivo y su aplicación adecuada

BIBLIOGRAFIA:  Delgado A., Polanco A. & Prieto S. (2001) Manual de laboratorio clínico básico “Microbiología”. España: Mc Graw  García M., Fernández T. & Paredes S. (2005) Microbiología clínica práctica. España: Repeto  López T. & Torres C. (2006) Microbiología General. Argentina  Ramón P. & Juárez A. (2002) Bioquímica de los microorganismos. España: Editorial Reverté  Rodríguez C., Gamboa C. & Hernández Ch. (2005) Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio. Costa Rica  Uberoa F. (1981) Medios de cultivo para microbiología. Barcelona: ADSA – MICRO  Camacho A., Giles M., Ortegón A., Palao M., Serrano B. y Velázquez O. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México o G. Prats Microbiología Clínica. Editorial panamericana.2007.  Pinto, G., & Martín, M. (2012). Enseñanza y Divulgación de la Química y la Física. Madrid: Garceta.  Merck. 2002. Microbiology Manual

Página 22 de 22

1. Informe de Preparacion de Medios de Cultivo

Recommend Documents