Preparación, Preparación, Esterilización y Prueba Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton Méndez, Helena – Palacios, Hasleidy Universidad de Boyacá – Facultad Ciencias de la Salud – Bacteriología y Laboratorio Clínico
RESUMEN En condiciones de laboratorio se realizó la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparación dadas por la casa casa come comerc rcia ial.l. Basa Basado doss en esta esta info inform rmac ació ión n se real realiz izar aron on los los cálc cálcul ulos os adecua adecuados dos para para la prep prepara aració ción n de 20ml 20ml de Agar Agar Muelle Muellerr Hinton, Hinton, que que serian serian distribuidos en dos cajas de petri pequeñas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del agar (en polvo) incluido incluido el peso del papel, papel, necesarios para la preparación del medio de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de precipitad precipitado o que contenía contenía 20 ml de agua destilada, destilada, y se calentó a 250ºC hasta que que hirviera; una vez obtenida la preparación, se llevo a esterilizar en autoclave durante durante 15 minutos minutos a 121ºC. 121ºC. Luego se proced procedió ió a distrib distribuir uir en las dos cajas cajas de petri petri el medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cámara de flujo laminar, para evitar la contaminación de este. Finalmente se realizo la prueba de esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una temperatura de 37ºC. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido para para la incubac incubación ión del medio medio de cultiv cultivo, o, arrojar arrojaron on resultad resultados os negativo negativoss para para el crecimiento de colonias, indicando que el método de esterilización empleado es efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de diferentes microorganismos.
PALABRAS CLAVE : Agar Mueller Hinton, esterilización, medios de cultivo, prueba de esterilidad. INTRODUCCIÓN Fue en 1876 cuando Koch fue capaz de prop propag agar ar una una bact bacter eria ia pató patóge gena na (Bac (Bacill illus us anth anthra raci cis) s) en culti cultivo vo puro puro,, fuera fuera del cuerpo cuerpo que la portab portaba; a; en 1881, utilizando un medio liquido, lo solidifico con gelatina y desarrollo los métodos de rayado y siembra en placa para ara aisla islam mient iento o de bac bacteri terias as.. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al utilizar como agente solidificante un produc producto to denom denomina inado do agar, agar, extraí extraído do de las algas rojas. El agar era muy supe superi rior or a la gelat elatin ina a, ya que era resistente a la digestión microbiana y a la licu licuef efac acci ción ón.. Se enri enriqu quec eció ió la composición de los cultivos solidificados utilizando extractos de
carne e infusiones, a fin de equi equipa para rarl rlos os con con el teji tejido do infec infecta tado do portador (1). Para el aislamiento, estudio y clasificac clasificación ión de los microorgan microorganismos ismos,, es nece necessario ario util utiliz izar ar un med medio de cultivo en el que se dispongan de las sust sustan anci cias as orgá orgáni nica cass e inorg inorgán ánic icas as neces necesaria ariass e indisp indispens ensabl ables es para para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos además de poder multipl iplica icarse, pueden pueden manifestar manifestar caracterís características ticas de crecimiento y propiedades bioquímicas, aspectos de gran importancia para su clasificación. (2). Estos preparado, poseen
características especificas por ejemplo: contener sustancias nutritivas como proteínas, azucares, minerales y vitaminas; tener un pH adecuado; estar protegidos de posibles contaminaciones; y estar esterilizados. (2).
Ventajas al Utilizar los Medios de Cultivo. permite el aislamiento de un microorganismo a partir de un sustrato natural (suelo, agua, plantas, aire, excrementos, pus, etc.). permite la identificación del microorganismo, según las características de crecimiento, morfología celular, propiedades tintoriales y reacciones bioquímicas. Conservación durante meses y años de las cepas identificadas. Obtención de células de microorganismos patógenos o de sus toxinas para la elaboración de productos biológicos (vacunas, antitoxinas, etc.) (2).
El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que esta cultivando y el porque de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida (3).
menor que en los medios de cultivo sólidos. - líquidos: no contiene ningún agente solidificante
Según se Composición: - empíricos: en su composición aparecen sustancias orgánicas. - sintéticos: en su composición aparecen sustancias químicas definidas. - semisintéticos: en su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas. Según el uso a que se destinen: - medios enriquecidos: suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores, tales como la sangre de carnero. Son medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes. - Medios diferenciales: contienen colorantes, azucares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida, generalmente el color. - Medios selectivos: además de contar en su composición con los mismos productos que los medios diferenciales, presentan una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar, y aislar, de esta forma, el microorganismo que se busca. - Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos, sin exigencias nutritivas especiales (1).
Clasificación de los Medios de Cultivo
Preparación del Agar Mueller Hinton
Según se Estado Físico: - Sólidos: presentan en su composición una agente solidificante, el agar, en una proporción de 12 a 15 gramos por litro. - semisólidos: presentan agar en su composición pero en una proporción
1. se disuelven 38g en un litro de agua destilada, calentándolo y agitándolo al mismo tiempo, hasta su completa disolución. El matraz se cierra con doble capa de papel aluminio.
2. se
esteriliza en autoclave, a 121ºC durante 15 minutos. 3.se dosifica en placa de petri a un volumen de 20ml (1).
MATERIALES Y MÉTODOS Para la preparación del medio de cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton y se tomaron en cuenta las especificaciones de preparación dadas por la casa comercial. Inicialmente se realizo el cálculo de la cantidad de agar necesario para la preparación del medio de cultivo, o sea se tomo 1.86gr de agar (incluido el peso del papel: 1.1gr), el cual se adicionó en una vaso de precipitado que contenía 20ml de agua destilada que se uso como diluyente del agar. Seguidamente se calentó a 250ºC hasta que iniciara a hervir.
RESULTADOS Cálculos Necesarios para Preparar la Cantidad de Medio de Cultivo Deseado Se deben preparar dos cajas de petri pequeñas con agar Mueller Hinton. 20ml para cajas grandes 15ml para cajas medianas 10ml para cajas pequeñas
Después de obtenida la solución de agar, se realizo proceso de esterilización con autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121ºC. Finalizado este proceso se procedió a dispensar el medio, realizando inicialmente limpieza con alcohol alrededor del vaso de precipitado para evitar contaminación del medio de cultivo, luego se adiciono en dos cajas de petri pequeñas aproximadamente 10ml de la preparación, esto en condiciones estériles en cámara de flujo laminar, a la cual se le realizo limpieza previa con alcohol al 70% y se puso a funcionar el aire estéril de la cámara durante 30 minutos. Una vez dispensado el medio de cultivo en las cajas de petri, estas se sellaron con cinta de enmascarar y se colocaron a incubar a 37ºC durante 24 horas para verificación de prueba de esterilidad.
Después de realizado el proceso de esterilización en el autoclave se observo en el vaso de precipitado la formación del agar con textura semilíquida y de color amarillo muy claro, como se observa en la figura #1.
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Figura #1 agar Mueller Hinton después de proceso de esterilización. Los resultados obtenidos en las cajas de petri luego de la prueba de esterilidad, permitieron observar que el medio de cultivo con agar Mueller Hinton continuaba de color amarillo claro, sin observarse crecimiento sobre la superficie de ninguna población bacteriana, indicando ser un medio de cultivo viable para su uso. Figura #2.
Figura #2 agar Mueller Hinton después de prueba de esterilidad.
Como se menciono anteriormente, se utilizo agar Mueller Hinton de la casa comercial OXOID, (código CM 337) para la preparación del medio de cultivo. El agar Mueller Hinton se utiliza en la comprobación de la susceptibilidad de microorganismos a antibióticos. Es un medio simple, transparente y sin materiales termolabiles (1) como se observa en la figura #1. Dentro de su composición en un litro encontramos: - Infusión de carne ……………. …...2g - Ácidos de casamino……….......17.5g - Almidón……………………......... 1.5g - Agar ……………………………... 17g Estando con pH de 7.3 y una Tº entre 0.1 a 25ºC. El almidón contribuye al fomento en el crecimiento, así como la infusión de carne y los ácidos de casamino, que sirven de nutrientes al medio (seleccionados estos para dar la mayor transparencia posible al medio). La técnica de trabajo con este medio consiste en depositar, en la superficie, discos de papel impregnados de antibiótico a probar, una vez sembrada la placa, para poder ver el halo que se forma alrededor del disco, y constatar así la inhibición de los distintos discos en sus distintas concentraciones de antibiótico (1) El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados, lo cual se observo durante la preparación del medio de cultivo (2). La cantidad de agar encontrada en la composición química (17g), indica que
corresponde a un medio de cultivo solidó, y debido a componentes como la infusión de carne y los ácidos de casamino, se observa de color amarillo claro. Figura #2. Referente a la esterilización del medio de cultivo, debe ponerse mucha atención en el tiempo de esterilización, porque si el proceso no dura el tiempo preciso, el medio puede presentar problemas de esterilidad, y si excediera el tiempo preciso, el medio se sobrecalentaría y afectaría a las cualidades del medio y su pH (1). Las técnicas de esterilización han de destruir todos los tipos de vida microbiana (4). El vapor a presión (autoclave) es el método más eficaz y practico para esterilizar con calor. La exposición al vapor en un autoclave, a 15 libras de presión (121ºC) y durante 20 minutos, matara todas las formas de vida. El vapor a presión penetra mucho y es particularmente eficaz ya que se condensa sobre un objeto frió para liberar 596 cal por g (calor de condensación). La condensación permite que mas vapor entre en contacto con los objetos que se están esterilizando (4). Antes de proceder a realizar un cultivo se microorganismos se debe considerar como evitar los contaminantes. Los microorganismos se encuentran en todas partes y, debido a su pequeño tamaño, se dispersan fácilmente por el aire y las superficies. Por consiguiente se debe esterilizar el medio de cultivo inmediatamente después de su preparación para eliminar los microorganismos que lo contaminan, esto se hace normalmente por calor. Pero es también importante tomar las debidas precauciones durante el manejo posterior de un medio de
cultivo estéril para lograr excluir de el todos los microorganismos (5).
CONCLUSIONES •
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Se aprendió y manejo la técnica empleada para la preparación de medios de cultivo. Se aplico la técnica de esterilización de vapor a presión (autoclave), para medios de cultivo en agar y caldo nutritivo. Se conoció el método de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los medios de cultivo.
BIBLIOGRAFÍA 1.
2.
3.
4.
5.
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