INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
Determinación de proteínas por el método de Lowry y Bradford
Alumno: Rico Inocencio José Orlando Compañero: Salinas Ceja Fernando Grupo: 5Qv2 Sección: 2 Fecha de entrega: 04/Sep/2017 Profesores: Rosas Sandoval Guillermina Hernández Fernando Macías Martínez Victor Manuel Luis Rivas Farias Arturo
Determinación de proteínas por el método de Lowry Fundamento El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de proteínas, en la que la muestra forma un complejo coloreado proporcional en intensidad a la concentración de proteínas, determinada acorde a la ley de Lambert-Beer, en donde la reacción se efectúa en dos etapas: 1) Formación de un complejo colorido azul, en medio alcalino, entre los iones cúpricos (Cu2+) y cuatro átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos, en el que se produce un desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiendo los residuos fenólicos y aromáticos de aminoácidos como la tirosina y el triptófano, con los que se va efectuar la segunda etapa, 2) La reducción, también en medio alcalino, del reactivo de Folin-Ciocalteau (Ácido fosfomolíbdicofosfotúngstico), de color amarillo, en donde estos grupos aromáticos van a transferir electrones al complejo fosfomolibdato/fosfotungstato para producir un producto inestable de coloración azul que se lee a 590 nm.
Determinación de proteínas por el método de Bradford Fundamento Éste método fundamenta su determinación en la unión a los residuos de Arg, Trp, His y Phe de las proteínas al colorante azul brillante de Coomassie G-250, específicamente a la interacción de aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos provocando un desplazamiento del máximo de absorción de este compuesto, desde 465 nm a 595 nm. Por lo tanto las medidas de absorbancia del complejo proteína-colorante se realizarán a 595 nm.
Objetivos Aplicar los métodos de determinación de proteínas de Lowry y Bradford, para la cuantificación de la concentración de diferentes soluciones de albúmina y hemoglobina, empleando una curva de calibración. Conocer el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo del color. Determinar a partir de un análisis estadístico, si existe diferencia significativa en la precisión y exactitud entre los métodos de Lowry y Bradford e inferir las ventajas y desventajas de ambos.
Resultados Espectrofotómetro Genesys 20, thermo spectronic 12 Método de Lowry Tabla 1.1 Curva de calibración de alúmina. Método de L owry.
Tubo No. 1 2 3 4 5
Serie a 0.064 0.116 0.174 0.226 0.278
Cantidad de proteína (μL)
25 50 75 100 125
Serie b 0.067 0.121 0.177 0.224 0.269
0.3 0.25
a i c n a b r o s b A
0.2
0.15
Serie a Serie b
0.1
y = .00209x + 0.0148 R² = 0.9996
0.05 0 25
50
75
100
125
Cantidad de proteína ( μL)
Gráfica 1.1: Curva de calibración de la albúmina Ecuación general de la recta: y = bx+a y = 0.00209x + 0.0148 A590 = 0.00209x + 0.0148 y = A590 x = Cantidad de Albúmina (µg) Pendiente (b) = 0.00209 Ordenada al origen (a) = 0.0148 Coeficiente de correlación (r) = 0.9996
Coeficiente de determinación (r 2)=0.9992
¿Cumple su curva la Ley de Bouger y Beer? Si ¿Entre qué limites de cantidad de proteína? Si se cumple porque la ley relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción, se observa en un intervalo de 50 a 125 µg de proteína.
La determinación de la cantidad de proteína en las muestras problema despejando los valores de “x” de la ecuación de la recta (y = 0.00209X +0.0.148) quedaría:
0.0148 0.00209 Análisis Estadístico: Tabla 2.1 Réplicas para el análisis estadístico. A590
Cantidad de albúmina (µg)
1
0.169
73.77
2
0.177
77.60
3
0.174
76.17
4
0.174
76.17
5
0.175
76.65
6
0.171
74.73
7
0.178
78.08
8
0.173
75.69
9
0.172
75.21
10
0.138
58.94
Tubo No.
Tabla 3.1 Resultados del análisis estadístico
̅
S
S2
% C. V.
µ
74.30
5.546
30.76
7.46
70.33 – 78.26
Cálculos: 0.25 mg – 1 ml 0.025 mg – 0.01 ml 0.025mg = 25 µg Ejemplo, cálculo de la cantidad de proteína, tubo 1 x = (0.169-0.0148)/0.00209 =73.77
̅ ∑= ̅ . = 74.30 (− ̅) = 5.546 ∑=− S2= (5.546)2 = 30.76
.. ̅ .. .. 100= 7.46 ̅ ± √ 74.30 ± (.)(..) 74.30+ 3.96= 70.33 74.303.96= 78.26 Tabla 4.1 Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el Método de Lowry. Tipo de Cantidad de interferencia Albumina (µg) generada
Tubo No.
Sustancia
A590
1
Fenol al 1 %
2.122
1008.22
Positivo
2
Mercaptoetanol al 0.1 %
0.171
74.73
-
3
Tris 1M, pH 10.0
0.155
67.08
Negativo
4
Urea al 5 %
0.175
76.65
-
5
() 3 %
0.157
68.03
Negativo *- =No tiene efecto
Método de Bradford Tabla 1.2 Curva de calibración de alúmina. Método de Br adford.
Tubo No. 1 2 3 4 5
Serie a 0.205 0.356 0.427 0.515 0.628
Cantidad de proteína (μL)
25 50 75 100 125
Serie b 0.203 0.348 0.413 0.536 0.638
0.7 0.6 0.5 a i c n a b r o s b A
0.4 Serie a
0.3
Serie b
0.2
y = 0.00412x + 0.1174 R² = 0.9875
0.1 0 25
50
75
100
125
Cantidad de proteína ( μL)
Gráfica 1.2: Curva de calibración de la hemoglobina Ecuación general de la recta: y = bx+a y = 0.00412x + 0.1174 A590 = 0.00412x + 0.1174 y = A590 x = Cantidad de Albúmina (µg) Pendiente (b) = 0.004126 Ordenada al origen (a) = 0.1174 Coeficiente de correlación (r) = 0.9937 Coeficiente de determinación (r 2)=0.9875
¿Cumple su curva la Ley de Bouger y Beer? Si ¿Entre qué limites de cantidad de proteína? Si se cumple porque la ley relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción, se observa en un intervalo de 50 a 125 µg de proteína.
La determinación de la cantidad de proteína en las muestras problema despejando los valores de “x” de la ecuación de la recta (y = 0.00209X +0.0.148) quedaría:
0.1174 0.004126 Análisis Estadístico: Tabla 2.2 Réplicas para el análisis estadístico.
A595
Cantidad de hemoglobina (µg)
1
0.412
71.49
2
0.455
81.92
3
0.434
76.83
4
0.468
85.08
5
0.451
80.95
6
0.470
85.57
7
0.482
88.48
8
0.480
87.99
9
0.459
82.90
10
0.463
83.87
Tubo No.
Tabla 3.2 Resultados del análisis estadístico
̅
S
S2
% C. V.
µ
82.50
5.1653
26.6806
6.26
78.80 – 86.19
Cálculos: 0.25 mg – 1 ml 0.025 mg – 0.01 ml 0.025mg = 25 µg Ejemplo, cálculo de la cantidad de proteína, tubo 1 x = (0.412-0.1174)/0.004126 =71.49
̅ ∑= ̅ . = 82.50 (− ̅) = 5.1653 ∑=− S2= (5.1653)2 = 26.6806
.. ̅ .. .. 100= 6.26 ̅ ± √ 82.50 ± (.)(..) 82.50+ 3.69= 78.80 82.503.69= 86.19 Tabla 4.2 Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el Método de Bradford. Cantidad de Tipo de Hemoglobina interferencia (µg) generada
Tubo No.
Sustancia
A595
1
Tris 1 M, pH 7.0
0.435
77.08
Negativo
2
Glicerol al 1 %
0.464
84.12
-
3
Detergente comercial al 1 %
0.192
18.10
Negativo
4
Dodecil sulfato de sodio al 1 %
0.145
6.69
Negativo
5
Ácido tricloroacético al 5 %
0.483
88.73
Positivo
6
Fenol al 1 %
0.527
99.41
Positivo
7
Mercaptoetanol al 0.1 %
0.394
67.13
Negativo
8
Tris 1M, pH 10.0
0.524
98.68
Positivo
9
Urea al 5 %
0.498
92.37
Positivo
10
() 3 %
0.512
95.77
Positivo * - = No tiene efecto
Pruebas de significancia Prueba t de Student Tabla 5. Comparación de métodos por prueba de t de Student
Muestra
Cantidad de albúmina Método de Lowry (µg)
Cantidad de hemoglobina Método de Bradford (µg)
Di
Di-D
(DiD)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
73.77 77.6 76.17 76.17 76.65 74.73 78.08 75.69 75.21 58.94
71.49 81.92 76.83 85.08 80.95 85.57 88.48 87.99 82.9 83.87
2.28 -4.32 -0.66 -8.91 -4.3 -10.84 -10.4 -12.3 -7.69 -24.93
10.487 3.887 7.547 -0.703 3.907 -2.633 -2.193 -4.093 0.517 -16.723
109.9772 15.1088 56.9572 0.4942 15.2646 6.9327 4.8092 16.7526 0.2673 279.6587
Cálculos
=() Σ =-8.207 = (−) Σ − =7.49 √ =-3.4649
3.4649
2.262 > ∴
Se acepta
Hay evidencia con una confianza del 95% para afirmar que hay diferencia significativa en la exactitud entre ambos métodos. Prueba F de Fisher
F=
5. 5 46 F=. =1.15
=1.15 =4.03 < ∴
Se acepta
Hay evidencia con una confianza del 95% para afirmar que no hay diferencia significativa en la precisión entre ambos métodos.
Discusiones De acuerdo a los resultados obtenidos, en la tabla 1.1 la curva de calibración de la albúmina presenta una linealidad cercana a 1, lo cual proporciona una idea a cerca de la relación absorbanciaconcentración que se da durante la determinación, y así mismo la especificidad del método de Lowry, denotando relativa proporcionalidad según las concentraciones de la proteína; Tendencia la cual se confirma en las réplicas del análisis estadístico; Situación que no sucede con el método de Bradford acorde a la amplia variación en la cantidad de proteína observada en la tabla 2.2 de las réplicas del análisis estadístico. Respecto a las interferencias de sustancias no proteicas en el método de Lowry, este se ve afectado por moléculas que modifiquen las condiciones de reacción o por moléculas que intervengan en la reacción, dada la especificidad del método; Tal es el caso de proteínas con alto contenido en tirosina y triptófano que producen un incremento en la absorbancia sin ser necesariamente proporcionales a su concentración, pero si a su estructura y el fenol. En cuanto a las interferencias de sustancias no proteicas en el método de Bradford, este se ve afectado principalmente por detergentes ocasionando interferencias negativas. Comparando los resultados a través de las pruebas de significancia de t de Student y F de Fisher, ambos métodos presentan una diferencia significativa en cuanto a su exactitud y también no presenta diferencia significativa en su precisión, sin embargo la linealidad de ambos métodos refleja que el método de Lowry es más sensible a la cuantificación de proteínas.
Conclusiones El método de Lowry es más eficaz y confiable que el método de Bradford a pesar de que este es más eficiente en la administración de los reactivos para la determinación. Las sustancias no proteícas pueden generar interferencias positivas o negativas según el método.
Cuestionario Tabla 6. Comparación de métodos para determinación de proteínas Método Lowry
Ventajas Es el método más sensible. 100 veces más sensible que el de Biuret. Relativamente rápido
Biuret
Es el método más simple para medir proteína total. Muy pocas interferencias de otros compuestos en el desarrollo del color.
Bradford
Es un método muy rápido y sencillo. Requiere de un solo reactivo. El color desarrollado es estable.
Absorbancia a 280 nm
Es un método muy rápido: requiere de muy poca cantidad de proteína. El sulfato de amonio no interfiere, mientras que en la mayoría de los métodos si existe interferencia.
Desventajas Requiere de muchos cuidados en la estandarización ya que: La intensidad de color varía entre proteínas El color no es siempre proporcional a la concentración. Existe interferencia de sacarosa, lípidos, amortiguadores de pH, monosacaridos y hexosaminas, ya que reaccionan con los reactivos de Lowry. El sulfato de amonio, los sulfhidrilos y los fosfatos también interfieren en la determinación. Tiempo de incubación. Se requiere de 20-40 mg de proteína. Existen varios pigmentos de absorben a 540 nm de longitud de onda. La presencia de NH4+ interfiere con la reacción. El desarrollo de color es diferente para cada proteína. Interfieren lípidos e hidratos de carbono por formación de complejos con el ion coordinado. El lavado del material después de la determinaciòn resulta un poco difícil, dado que el colorante azul brillante de Coomassie G-250 se queda adherido fácilmente. Se puede hacer una corrección por presencia de ácidos nucleicos, ya que estos tienen absorción máxima a 260. Si se conoce la relación de absorción de la proteína a 280/260 nm es fácil
Kjeldahl
Dumas
La muestra no se destruye y puede distinguir la interferencia de ácidos ser usada en otros análisis. nucleicos. Varía la cantidad de aromáticos entre proteínas. Es el método más común y por lo Puede haber pérdidas de nitrógeno tanto permite comparar debido a la temperatura de digestión y fácilmente resultados con otros al catalizador. laboratorios. El contenido de nitrógeno en la Determina todo el contenido de proteína puede variar nitrógeno de un alimento. considerablemente y por lo tanto el El nitrógeno no proteico puede ser factor usado para convertir nitrógeno analizado después de precipitar la a proteína. proteína con acidotricloroacético. El nitrógeno no proteico se debe tomar en cuenta ya que éste se mide junto con el proteico. Se usan reactivos y condiciones un tanto peligrosas. El proceso es largo. Se pueden hacer análisis hasta en Se requiere de equipo muy costoso. 10 min, con los equipos La presencia de nitrógeno no proteico automatizados que existen en el interfiere en las determinaciones. mercado.
Referencias bibliográficas Valoración de proteínas por el método de Lowry. Manual de prácticas, Universidad de Alcalá, licenciatura en química. Pág: 1 a 3. Cuantificación de proteínas: una revisión. Humberto García, Rafael Vázquez. Bitácora 1998/ Vol. 3 Instituto de biotecnología UNAM. Cuernavaca, Morelos. México. Pág: 77 a 82. Revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de curva estándar de proteína. Material de apoyo para los estudiantes del curso de bioquímica experimental. Sobeida Sánchez. UNAM, facultad de química, 2013. Pág: 11 a 19. Determinación colorimétrica de compuestos fenólicos en agua mediante el reactivo de FolinCiocalteau. 23/08/2010 Pág: 1 a 6. Biomoléculas, Battaner Arias Enrique, Edit. Universidad de Salamanca, España, 1993, Págs. 163164. Bioquímica: técnicas y métodos. ROCA, P. (2003). Editorial Hélice. Madrid, España. Págs. 57 -58.
