INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓIGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA CURSO PRÁCTICO DE MÉTODOS DE ANALISIS DTERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY, DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD PROFESOR: LARIOS SERRATO VIOLETA CEVADA SANTIAGO KAREN JAZMIN 5QM1 SECC. 4 Equipo utilizado: espectrofotómetro No. 10 Compañero de equipo: Irving Rodriguez sanchez
OBJETIVOS Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico. Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry. Conocer el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color. Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry y Bradford , con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas. FUNDAMENTO La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes. Entre los métodos calorimétricos destacan tres: el método de Biuret, el método de Lowry y el método de Azul de Coomasie. El segundo de ellos tiene el inconveniente principal es que al evaluar, como veremos, los fenoles presentes en la proteína (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante varía entre las distintas proteínas. Pero cuando tratamos con mezclas biológicas complejas, podemos perfectamente calibrar el método con alguna proteína comercial, como es la seroalbumina bovina. La reacción que tiene lugar en el método de Lowry es bastante compleja y no del todo conocida. Se desarrolla en las siguientes fases: 1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+, en presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico. 2.-Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dos máximos de absorción a las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La elección de una u otra depende de la concentración proteica de la muestra estudiada. El método de Bradford se basa en un principio diferente: se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac. Fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales
como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta más rápido y fácil de emplear que otros métodos alternativos, y más sensible que la medida de absorbancia a 280 nm. RESULTADOS TABLA 1.- CURVA DE CALIBRACIÓN DE HEMOGLOBINA MÉTODO DE LOWRY Tubo no.
Cantidad de proteína (µg)
1 2 3 4 5
A 590 Serie a 0.104 0.101 0.154 0.187 0.271
25 50 75 100 125
Serie b 0.070 0.100 0.160 0.188 0.207
Cálculos para la cantidad de proteína: (hemoglobina 0.25 mg/mL). 1 mg--- 1000 µg
250 µg---- 1 mL
0.25 mg--- = 250 µg
25 µg ---- 0.1 mL
Se calculó así para todos los tubos
Regresión lineal: R=0.9820 A= 0.0338 B= 1.4933 X 10 -3 (se eliminaron los valores de 0.271 y 0.104 para tener los datos más homogéneos). Curva tipo para determinación de proteínas en hemoglobina por el método de Lowry 0.25 m n 0.2 0 9 5 a 0.15 a i c n 0.1 a v r o s b 0.05 A
0 0
20
40
60
80
100
120
140
Cantidad de proteína (µg) Serie A
Serie B
Figura 1.- Curva de calibración de la determinación de proteínas por el método de Lowry a absorbancia de 590 nm respecto a la concentración de hemoglobina en μg.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Fórmula para calcular la cantidad de proteína: X= Y (absorbancia) – A (0.0338) / B(1.4933 X 10 -3 ) Fórmula para calcular los límites de confianza: X ± t (S)/ √ = 83.52 ± 2.262(13.95) / √10 / límite superior: 93.49 Límite inferior: 73.54 Fórmula para él %C.V.= S/X (100)
TABLA 2.- RÉPLICAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Tubo no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A590 0.140 0.186 0.142 0.152 0.146 0.181 0.147 0.183 0.131 0.177
Cantidad de proteína (µg) 71.13 101.94 72.47 79.16 75.15 98.59 75.82 99.93 65.10 95.91
TABLA 3.- RESULTADOS DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICO X 83.52
S 13.95
S2 194.60
% C.V 16.70
µ 73.54 - 93.49
TABLA 4.- EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS NO PROTEICAS EN EL MÉTODO DE LOWRY Tubo no.
Sustancia
A590
1 2 3 4 5
Fenol al 1% Mercaptoetanol al 1% Tris 1M pH 10 Urea al 5% (NH4)2 SO4
1.827 0.189 0.120 0.181 0.163
Cantidad de proteína (µg) 1201.07 103.95 57.73 98.59 86.53
Tipo de interferencia generada + + + SI
TABLA 5.- CURVA DE CALIBRACIÓN DE HEMOGLOBINA, MÉTODO DE BRADFORD.
Tubo no.
Cantidad de proteína (µg) 25 50 75 100 125
1 2 3 4 5
A595 Serie a 0.203 0.242 0.296 0.479 0.510
Serie b 0.224 0.263 0.378 0.505 0.607
Cálculos para la cantidad de proteína: (Hemoglobina 0.25 mg/mL). 1 mg--- 1000 µg
250 µg---- 1 mL
0.25 mg--- = 250 µg
25 µg ---- 0.1 mL
Se calculó así para todos los tubos
Regresión lineal: R=0.9575 A= 0.0918 B= 3.718 X 10 -3 (no se eliminó ningún valor).
Curva tipo para determinación de proteínas en Hemoglobina por el método de Bradford
0.7 0.6 0.5
a i c n0.4 a b r o0.3 s b A
0.2 0.1 0 0
20
40
60
80
100
120
140
Cantidad de proteína (µg) Serie A
Serie B
Figura 1.- Curva de calibración de la determinación de proteínas por el método de Bradford a absorbancia de 595 nm respecto a la concentración de hemoglobina en μg.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO Fórmula para calcular la cantidad de proteína: X= Y (absorbancia) – A (0.0918) / B(3.718 X 10 -3) Fórmula para calcular los límites de confianza: X ± t (S)/ √ = 91.254 ± 2.262(5.629) / √10 / límite superior: 95.28 Límite inferior: 87.23 Fórmula para él %C.V.= S/X (100)
TABLA 6.- RÉPLICAS PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Tubo no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A595 0.407 0.405 0.400 0.460 0.425 0.446 0.452 0.441 0.437 0.438
Cantidad de proteína (µg) 84.77 84.25 82.89 99.03 89.61 95.26 96.88 93.92 92.84 93.11
TABLA 7.- RESULTADOS DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICO X 91.254
S2 31.685
S 5.629
% C.V. 6.16
µ 87.23 – 95.28
TABLA 8.- EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS NO PROTEICAS EN EL MÉTODO DE BRADFORD Tubo no.
Sustancia
A595
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tris 1 M pH 7 Glicerol al 1% (v/v) Detergente comercial Dodecil sulfato de sodio al 1% Fenol al 1% Mercaptoetanol al 1% Tris 1M pH 10 Urea al 5% (NH4)2 SO4 Fenol al 1%
0.421 0.420 0.208 0.166 0.472 0.502 0.450 0.485 0.470 0.478
Cantidad de proteína (µg) 88.54 88.27 31.25 19.95 102.25 110.32 96.34 105.75 101.72 103.87
Tipo de interferencia generada SI SI + + + + + +
COMPARACIÓN DE AMBOS MÉTODOS TABLA 9.- DETERMINACIÓN DE LA PRUEBA T DE STUDENT. Tubo No.
Cantidad de proteína (µg) método Bradford
Cantidad de proteína (µg) método de lowry
Di
Di -D
(Di –D)2
1
84.77
71.13
13.64
5.964
35.5692
2
84.25
101.94
-17.69
-25.366
643.4339
3
82.89
72.47
9.82
2.144
4.5967
4
99.03
79.16
19.87
12.194
148.6936
5
89.61
75.15
14.46
6.784
46.0226
6
95.26
98.59
-3.33
-11.006
121.1320
7
96.88
75.82
21.06
13.384
179.1314
8
93.92
99.93
-6.01
-13.686
187.3065
9
92.84
65.10
27.74
20.064
402.5640
10
93.11
95.91
-2.8
-10.476
109.7465 ∑=1878.1964
D= 7.676
Fórmula:
Sd=∑
√( –)2 −
878.96 9
sustitución: Sd=∑√
= 14.44
Hipótesis: Ho: no hay diferencia significativa entre los métodos. Hi: hay diferencia significativa entre los métodos. Ttablas= 2.262
√
Tcalculada=
Tcalculada=
(7.676)√ =1.6810 .
Ttablas> Tcalculada = se acepta Ho
TABLA 12.- DETERMINACIÓN DE LA PRUEBA F DE FISHER
S2
Método de Lowry
Método de Bradford
194.60
31.685
Hipótesis: Ho: No hay diferencia significativa entre los métodos Hi: Sí hay diferencia significativa entre los métodos Ftablas= 4.03 Fcalculada= S12 /S22 DISCUSION
9.6
Fcalculada=3.685=6.1417 Ftablas< Fcalculada =Se rechaza Ho.
Se realizó una determinación de proteínas por el método de Lowry en el cual se basa en la realización de 2 fases, la primera es la utilización del cobre (2+) para que se forme un complejo con la proteína y cambie la estructura tridimensional de la misma, causando que se expongan los grupos fenólicos de las proteínas con aminoácidos aromáticos, de esta manera puede darse lugar la segunda fase la cual consta de la utilización de reactivo de Folin (ácido fosfomolibdotúngstico) de un color amarillo, el cual actúa como agente reductor de los grupos fenólico y da lugar a un complejo de color azul. Cabe destacar que la reacción debe llevarse a cabo en un medio alcalino para que los grupos funcionales a reaccionar no estén protonados y por tanto esto provocaría que no se lleve a cabo la reacción redox de la segunda fase. Como parte de los resultados se realizó una curva tipo que es una representación gráfica de algún parámetro en función de la concentración de un analito y sirve para estimar la concentración de hemoglobina en las muestras en función de su absorbancia a 595 nm, de esta manera permite determinar la linealidad de esa curva y en consecuencia, la capacidad del método de Lowry para obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentración de proteína en las muestras. Obteniéndose valores de regresión lineal que son utilizados en el análisis estadístico del método, el cual se realiza para conocer la exactitud, precisión y sensibilidad del mismo, resultando que todos los valores estadísticos están elevados, pues la media indica la exactitud del método y en la cual debería haber obtenido valores muy cercanos a los 75µg de hemoglobina y se obtuvo uno de (83.52 µg), de la misma forma con la varianza que sirve para medir el grado de precisión pues este parámetro mide la dispersión de los datos, donde entre menor sea la desviación estándar mayor es la precisión de un método y obteniendo un resultado de ( 13.95 µg) y finalmente con el coeficiente
de variación que fue de 16.70% y para que un análisis estadístico tenga confianza debe de ser menor o igual a 5%, esto es debido en gran medida a errores del analista, ya que al manejar volúmenes pequeños una sola gota de más arrastra cerca del 50% de error en el método, también puede deberse a errores en la calibración del espectrofotómetro o al error fotométrico de este. Posteriormente se procedió a la determinación de proteínas pero por el método de Bradford en el cual se emplea un colorante hidrofóbico en disoluciones de ácido fosfórico que le dan un color pardo y que, depende de la interacción entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, originando un color azul intenso que se puede medir fácilmente a una absorbancia de 590 nm. Como consiguiente se le realizó la curva de calibración y los análisis estadísticos correspondientes y cuya importancia ya se ha abordado. Finalmente se obtuvo que por este método tampoco se tuvo exactitud pues la media resultó de 91.254 µg y que debió ser de 75 µg, en cambio por este método se obtuvo mayor precisión en comparación al método de Lowry pues la varianza fue de 5.629, y finalmente el coeficiente de variación resultó ser menor (6.16%) que aún está por encima del nivel de confianza estándar, pero es mucho más bajo que en comparación con el método de Lowry. Como parte de la práctica se procedió a realizar una comparación estadística entre ambos métodos, mediante la utilización de la T de Student, la cual es una prueba de
significancia que nos sirve para comparar medias, el resultado indica que no hay diferencia significativa entre las medias por lo tanto, aunque el método de Bradford es más inexacto que el método de Lowry, esta diferencia no es significativa para el análisis estadístico. Con la prueba F de Fisher se comparan la varianzas de ambos grupos de datos (de su precisión) y según los resultados hay diferencia significativa entre las varianzas de ambos métodos, indicando que el método de Bradford es más preciso que el de Lowry , lo cual haría que se realizara el método de Bradford en vez del de Lowry, ya que tiene bases estadísticas que lo avalan. Sin embargo esta diferencia es en gran medida a errores del analista, pues en los análisis estadísticos las absorbancias debieron ser entre 0.200-0.400, en cambio salieron por arriba de 0.400, esto se sustenta debido a que en la actualidad se siguen utilizando ambos métodos para la cuantificación de proteínas, y el uso de uno sobre del otro radica en características económicas, tiempo, ventajas y desventajas, debido a que el de Lowry se realiza en 2 etapas, ocupa más reactivos, y su tiempo de realización es más largo, en cambio el de Bradford se lleva a cabo en menor tiempo y con menos reactivos, otro factor que los clasifica para su uso es que el de Bradford es 4 veces más preciso que el de Lowry (demostrado por la pendiente en la ecuación de nuestra curva de calibración) porque el de Lowry determina proteínas con amioácidos aromáticos, en cambio el de Bradford identifica cualquiera, sin embargo este método tiene como desventaja que deteriora el material (colorea intensamente las celdas para lectura en espectrofotómetro), lo cual derivaría en costos de material o la lectura errónea de posteriores muestras al usar celdad maltratadas, otra desventaja radica en la estabilidad del complejo formado, pues el de Bradford es estable por 40 minutos y el de Lowry por 120 minutos. Finalmente se determinaron las interferencias no proteicas que pueden afectar a ambos métodos y que mediante los intervalos de confianza se determina si la interferencia es positiva (por arriba del valor máximo del intervalo de confianza) o negativa (por abajo del valor máximo del intervalo de confianza), resultando que las interferencia por compuestos fenólicos afectan el método de Lowry, debido a que el reactivo de Folin reduce precisamente este tipo de estructuras en las proteínas y al tener otras de ellas derivadas de otras fuentes aumenta el valor de las absorbancias resultando ser una interferencia positiva, en cambio el Tris 1M pH 10 es una interferencia negativa, debido a que el pH desprotona las proteínas y por tanto los grupos funcionales a reaccionar. Para el método de Bradford las interferencias negativas son debidas a detergentes (SDS) debido a que estos alteran las 4 formas iónicas que tiene el colorante utilizado (azul brillante de Coomassie G-250) tiene, por lo cual la forma azul más aniónica se une a proteínas y absorbe a 590 nm no puede formarse. CONCLUSIONES Hay una diferencia significativa estadística en la precisión entre el método de Lowry y Bradford.
No hay diferencia significativa estadística en la exactitud entre el método de Lowry y Bradford. La determinación de proteínas por el método de Lowry es afectada por la presencia de compuestos fenólicos. La determinación de proteínas por el método de Bradford es afectada por la presencia de detergentes. La determinación de proteínas por el método de Bradford es 4 veces más sensible que la determinación de proteínas por el método de Lowry. Los métodos fotométricos para la determinación de proteínas son más precisos y exactos estadísticamente. CUESTIONARIO 1.- Calcule y escriba los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación. Diga cómo se interpretan en la curva de calibración. El coeficiente de correlación indica un comportamiento lineal de los valores, por tanto cumple con la Ley de Bouguer Y Beer, esto se traduce en se pueden cuantificar nuestros datos y saber que los valores que arroje esta serán confiables, sin embargo en el primer caso de determinación de proteínas por el método de Lowry, tuvimos que eliminar valores de las réplicas para así obtener un coeficiente de correlación cercano a uno. Para el método de Bradford no se logró tener un coeficiente de correlación adecuado, asi que en este caso los datos no serán confiables al realizar repeticiones estadísticas. 2.- ¿cumple con la ley de Bouguer y Beer? ¿Entre que límites de cantidad de proteína? Si cumple con esta ley debido a que las lecturas de trasmitancia y leídas como valores de absorbancia van aumentando con las concentraciones; los límites de proteína entre los que se cumple esta ley son en todos al menos en las curvas tipo (25-125 µg) y análisis estadístico de ambos experimento, los únicos que no cumplen son los experimentos de interferencias de origen no proteico . 3.- A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína Fórmula para calcular la cantidad de proteína: x = (y - a)/b A (0.0918)) / B(3.718 X 10 -3).
X= (Y (absorbancia) –
4.- Diferentes métodos para cuantificación de proteínas Ácido bicinconínico (BCA) o ensayo basado en cobre (rango: 20-2000 ug/ml) Tanto el ensayo de BCA como el de Lowry se basan en la conversión del Cu 2+ a Cu1+ en condiciones alcalinas. Esta conversión es definida como la reacción de Biuret. Esta reacción es influenciada por cuatro aminoácidos (cisteína, cistina, tirosina y triptófano) y también por la cadena peptídica.
Figura 1. Representación esquemática del ensayo de BCA.
BCA es un reactivo cromogénico específico para Cu 1+ y en el segundo paso de la reacción dos moléculas de BCA reaccionan con una de ión Cu 1+. La cantidad de Cu2+reducido es una función de la concentración de proteínas y ser determinada espectrofotométricamente por un cambio en el color de la solución a púrpura, el cual absorbe a 562 nm. La absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución y puede ser estimada por comparación con un estándar de proteína conocido, tal como la albúmina sérica bovina (ASB). El ensayo de BCA es más tolerante a un rango de detergentes iónicos y no iónicos tales como el NP-40, Triton X-100 y agentes desnaturalizantes como la urea y el cloruro de guanidinio, que tienden a interferir con otros ensayos proteicos colorimétricos tales como el Lowry. Algunas moléculas químicas como: ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA), azúcares reductores y lípidos pueden interferir con el ensayo de BCA. Otro factor que interfiere con la exactitud del ensayo de BCA es la presencia de residuos modificados en las proteínas. Comparado con otros métodos, el ensayo de BCA es uno de los más sensibles (puede detectar proteínas en concentraciones tan bajas como 5 ug/mL). Tiene menos variabilidad que otros (por ej., el ensayo de Bradford), y puede ser utilizado para medir un amplio rango de concentraciones de proteínas. Absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm (rango: 0.1-100 ug/ml) Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano le dan a las proteínas su característico espectro de absorción ultravioleta (UV) a 280 nm. Fenilalanina y puentes disulfuro también pueden contribuir a la absorción en esa longitud de onda, aunque ligeramente. Este método es simple y requiere de un volumen de muestra extremadamente pequeño ya que los nuevos espectrofotómetros emplean un sistema de retención de muestra durante la medición. Sin embargo, la muestra proteica debe encontrarse pura y no contener componentes no proteicos con el mismo espectro de absorción, tales como ácidos nucleicos contaminantes. Se debe conocer la secuencia exacta de aminoácidos de la proteína analizada y se debe calcular el coeficiente de absorción específico de esa proteína previo a la determinación de la concentración en solución. Este método es el más rápido, pero propenso a errores. REFERENCIAS DETERMINACION DE PROTEINAS: METODO DE BRADFORD. [internet] Disponible en: https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/3.pdf [acceso 2 de septiembre del 2017].
DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LOWRY. [internet] Disponible en: https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/4.pdf [acceso 2 de septiembre del 2017]. Cuantificación de proteínas Mary Johnson. [internet] Disponible en: http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html [acceso 2 de septiembre del 2017].
