DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS COMPUESTOS ACTIVOS ACTIVOS DE PIPER AURITUM KUNTH POR CROMATOGRAFIA Y ANÁLISIS FTIR. Objetivo Gee!"#. Identificación de los compuestos activos presentes en el aceite de P. auritum kunth (hierba santa) mediante el análisis de sus grupos funcionales obtenidos por medio
de cromato cromatograf grafía ía y FTIR, FTIR, dando dando énfasis énfasis en el contenido contenido de la molécula molécula safrol safrol y realizando una comparación con la literatura.
Objetivo e$%e&'(i&o$. omp ompro roba barr !ue !ue e"is e"iste ten n comp compue uest stos os acti activo vos s pres presen ente tes s en la plan planta ta por por romatografía y análisis FTIR. Identifi Identificar car la composic composición ión !uímica !uímica del aceite aceite esencia esencial, l, identif identifican icando do los grupos grupos funcionales del safrol por romatografía y análisis FTIR.
P#"te")ieto *e# %!ob#e)". #n la actualidad en la industria se $a desarrollado un amplio interés por los principios principios activos de diversas plantas. #n %é"ico gran variedad de plantas silv silves estr tres es cont contie iene nen n comp compue uest stos os acti activo vos s de las las cual cuales es se cono conoce ce
poca poca
información. #l presente traba&o buscó obtener información de la composición !uímica de la planta ' piper auritum kunth ( com)nmente conocida como $ierba santa, santa, utilizada utilizada en la cocina cocina me"icana me"icana,, dando énfasis énfasis en el compuesto compuesto activo activo safrol. *l safrol se le atribuyen atribuyen propiedade propiedades s antibacteria antibacterianas, nas, además, tiene una alta demanda en la industria de insecticidas y plaguicidas en sentido general.
+,$ti(i&"&i-.
Piper auritum kunth +$ierba santa es una planta !ue posee actividad
antiinflamatoria, antibacteriana, antif)ngica y antidermatofítica generada por sus fenilpropanoides, lignanos, ses!uiterpenos y monoterpenos como son- el borneol, alcanfor, cineol, eugenol, safrol y una amplia variedad de componentes bencénicos. i bien uno de los compuestos activos más destacados de esta planta !ue se encuentra en un /01 es el safrol. u importancia también radica en sus propiedades antibacterianas, además de tener una alta demanda en la industria de insecticidas y plaguicidas. #l safrol, es un monoterpeno o"igenado, presente como compuesto mayoritario en especies tales como, sassafras +234531 y 6cotea cymbarum +/31. Forma parte de la lista de sustancias controladas por las autoridades, debido a su uso como precursor en la síntesis de drogas de uso ilícito como %7%* y por su efecto carcinogénico y citotó"ico. 8o obstante, es )til en la $emisíntesis de compuestos de elevada actividad biológica 9:enerar información !uímica de piper auritum kunth, para validar la e"istencia de componentes activos, !ue sirva como instrumento para estudios posteriores de variabilidad e implementación de tecnología para la e"plotación adecuada de este recurso. .
HIPOTESIS 7eterminar !ue e"isten los principales componentes !uímicos del safrol en el aceite esencial de la $ierba santa
MARCO TEORICO
;os e"tractos vegetales son compuestos $ec$os a base de plantas de las cuales se e"traen metabolitos secundarios mediante varias técnicas de e"tracción como la maceración, las tisanas e infusión, con la ayuda de solventes como agua, etanol, metanol, etc. ;a calidad y concentración de las sustancias activas pueden llegar a variar de una estación a otra o con la localización de la planta, edad y madurez del material vegetal con el !ue se prepara el e"tracto. ;a sustancia activa se encuentra a menudo concentrada en una parte especifica de la planta, aun!ue frecuentemente se localiza en $o&as, flores y semillas +:utiérrez,
;os aceites esenciales son también desec$os del metabolismo de la planta, comprende las esencias vegetales y resinas. e presentan en emulsiones !ue tienden a formar gotas y son los compuestos !ue dan perfume a los vegetales. ;os monoterpenoides son compuestos de los aceites vegetales +alfa pineno, 04 careno, gosipol y cucurbitacina, cuyos efectos se $an estudiado en la conducta, fisiología sensorial, y metabolismo de insectos. ;os alcaloides poseen un sabor amargo, son componentes nitrogenados cuya función en la planta no está bien
determinada. ;a !uímica vegetal es comple&a y se le clasifica seg)n a la composición del n)cleo, órganos o seg)n su especie vegetal.
PARTE EXPERIMENTAL Material. Se utilizó extracto de las
hojas de P. auritum como materia prima, la cual
fue recolectado de arboles ubicados en la zona sur del estado de Morelos. Como reactivos se empleó lo siguiente: acetato de etilo (c!t, Mer" CS: #$#%&'%), *exano (reactivos Karal CS:#+#%&+%-), cido sulf/rico (Sigma%ldrich CS: &$%0+%0),
cloruro de
cobalto 0&1 (Sigma%ldrich CS: &$%&0%0). 2lacas de cromatograf3a con revelador 45, columna de vidrio de 6 cm, silica gel para columna (.-%.6 mm, Mer" CS: &+#%'% 0). 7odo sublimado (8aga%9ab, CS: &66+%6%-) Equipo.
!l instrumental utilizado fue: 2arrilla con agitador magntico, modelo
MS400 Magnetic Stirer , marca Science MED. 9ampara 45 con longitud de onda dual -6$
nm;+ nm Marca Camag. 8<=>? marca PerkinElmer modelo Spectrum Two. Metodología. Obtención del extracto.
Se recolecto la hoja de P. auritum en la región de
9a separación de compuestos Aue absorben en la luz
visible del extracto de P. auritum en agua @ en etanol se llevó cabo mediante la tcnica de absorción de papel filtro, la cual consiste en mostrar la separación de compuestos visibles, logrando visualizar sus distintas tipos de clorofilas. 9os extractos analizados fueron posteriormente concentrados. ro!atogra"ía de capa "ina:
9os dos extractos de P. auritum en etanol @ agua se
concentraron con l rota vapor, posteriormente se les agregó acetato de etilo esperando una separación de fases, @ se lavó con agua destilada, obteniendo muestras , B, C, , ! @ 8, (ver figura -), las cuales fueron colocadas sobre una placa de cromatograf3a con indicador con diferentes sistemas de elución, cetato de etilo #1, &:+, #:0 @ 6:6 de cetato de !tilo;*exano.
B
C
!
8
8igura -. Muestras obtenidas en los lavados. ro!atogra"ía en colu!na:
una vez identificados la cantidad de componentes
presentes en cada una de las muestras , B, C, , ! @ 8, as3 como el sistema adecuado para la elución, se escogió la muestra B Aue conten3a ma@or n/mero de componentes @ se colocó dentro de una columna cromatogrfica previamente empaAuetada. 9a muestra se dejó eluir en un sistema de acetato de etilo = hexano 6:6, recolectando las fracciones obtenidas. estas fracciones se les volvió a tomar placa para identificar las fracciones idnticas. E#pectro#copia In"rarro$a por Tran#"or!ada# de %ourier &%TIR':
las fracciones
idnticas fueron concentradas @ analizadas por espectroscopia infrarroja por
ro!atogra"ía en papel:
Do se logró observar la separación de las clorofilas en el
extracto Aue estaba en agua, en cambio el extracto en etanol si se observaron (ver figura +).
8igura +. Cromatograf3a en papel, del extracto en etanol. ro!atogra"ía de capa "ina:
2ara la preparación de las muestras el proceso se realizó cortando placas de silica gel de 6x& cm. 4na vez Aue se llevo a cabo la elución se revelaron con la lmpara 45, @ posteriormente en @odo sublimado, encerrando los componentes Aue se lograran observar, por /ltimo se aplico solución reveladora de cido sulf/rico, cloruro de cobalto @ agua, calentando la placa observando los colores de los componentes Aue estn presentes en cada una de las muestras. !n la tabla # se observan las placas Aue contienen los resultados para la selección de muestras con las Aue se lograron trabajar para el anlisis de componentes, el sistema de elución 61 acetato de etilo = 61 hexano fue la seleccionada para trabajar posteriormente.
&1 acetato de etilo % +1 hexano
#1 acetato de etilo
#1 acetato de etilo % 01 hexano
: .0$ cm B: .0&' cm C: .0$ cm
B: .0-+ C:.& :.#'$
B: .--6cm
61 acetato de etilo % 61 hexano
B: .0-+
ro!atogra"ía en colu!na:
9a muestra B se colocó dentro de una columna
cromatogrfica previamente empaAuetada con s3lica gel @ como fase móvil acetato de etilo% hexano 6:6. Se dejó eluir la muestra recolectando un total de - fracciones. estas fracciones se les volvió a tomar placa para identificar las fracciones idnticas. 9as cuales se juntaron @ se concentraron etiAuetndolas de la siguiente manera 8-%+, 8#6%- @ 8-#%-+ (ver figura $).
8igura $. Cromatograf3a en columna de la muestra B. E#pectro#copia In"rarro$a por Tran#"or!ada# de %ourier &%TIR':
9as fracciones
obtenidas se analizaron por 8<>?, as3 como las muestras obtenidas Aue no se separaron en cromatograf3a en columna, obteniendo como resultado los siguientes espectros (ver figura +):
a)
c)
b
d
8igura +. 8<>? de Muestras a) , b) C, c) @ d) !, sin separación por columna.
!n la figura + para todos los casos se observaron las seEales correspondientes a la región aliftica de estiramiento @ flexión de los +%-' cm%# @ #$6%#- cm%#, as3 como en la región de los +6 = ++ cm%# el estiramiento del hidrógeno enlazado al ox3geno para las $ muestras. 2ara la figura +a se observa en los #& cm%# la seEal correspondiente a CFG, en # cm%# CFC @ en # cm%# C%G. 2ara la figura +b) se observa en +& cm%# la vibración correspondiente al *%D, en #6 cm%# el estiramiento de los hidrógenos enlazados al nitrógeno @ en la región de los ##%0 cm%# C%G. 2ara la figura +c), se observa en # cm%# una seEal Aue puede corresponder a un CFC o hidrogeno enlazado a nitrógeno. !n la región de ##=0 cm%# la seEal correspondiente a C%G. 7 para la figura +d) se observa la presencia de CFC en los # cm%#. !n la figura $, se observa la primer fracción (8-%+) de la muestra B separada por cromatograf3a de columna. !n los +6 cm%# se observa la seEal correspondiente del hidrógeno enlazado a al ox3geno, de los +%-' cm%# se observa el estiramiento asimtrico @ simtrico del C*+ @ C*-, en #&6 cm%# se observa el estiramiento de CFG, el cual puede corresponder al grupo carbonilo del acetato de etilo con el cual fue separada esta fracción.
8igura $. 8<>? de fracción 8-%+
!n la figura 6, se observa el 8<>? de la segunda fracción 8#6%-, en la cual podemos observar en los +& cm%# una seEal Aue puede corresponder a un carbono = carbono triple enlace o un nitrógeno%carbono triple enlace. !n los +$ cm%# la seEal correspondiente para hidrógeno enlazado al ox3geno. !n la región de +=-' cm%# se observa el estiramiento asimtrico @ simtrico del C*+ @ C* -. !n #&6 cm%# el estiramiento CFG. de los #6 %#- cm%# las vibraciones correspondientes a la flexión de balanceo del C*+, tijereteo del C*- @ sombrilla del C*+. !n la región de ##=0 cm%# C%G.
8igura 6. 8<>? de fracción 8#6%-
!n la figura , se observaron las seEales correspondientes a la región aliftica de estiramiento @ flexión de los +%-' cm%# @ #$6%#- cm%#. !n los #&6 cm%# se observó la seEal correspondiente a CFG @ en # cm%# C%G.
8igura . 8<>? de fracción 8-#%-+
ONL)(IONE(
9a muestra B debido a su ma@or cantidad de componentes revelados por cromatograf3a en capa fina fue la seleccionada para su separación en cromatograf3a en columna. e acuerdo a los resultados de espectros de las figuras 6 @ , en estas fracciones se pudiera encontrar la molecula llamada safrol la cual es reportada Aue existe en la planta Piper. 9as tcnicas cromatograf3as demuestran Aue son viables para demostrar Aue se pueden obtener buenos resultados. 2or medio de estudios realizados previamente se pudo identificar @ comparar ciertos compuestos de P. auritum kunth, la cual en un futuro puede servir para realizar un estudio ms completo acerca de las propiedades @ beneficios de esta. !ntre los compuestos a los Aue se le atribu@en propiedades antibacterianas, componente principal al safrol. !l safrol, adems, tiene una alta demanda en la industria de insecticidas @ plaguicidas en sentido general. *asta este momento, las variables estudiadas @ los resultados obtenidos aportan información valiosa para continuar con este tema de investigación, se sugiere continuar con anlisis de ?esonancia Magntica Duclear de *# (?MD) @ espectrometr3a de masas (MS), para corroborar las molculas @a encontradas. +I+LIO,RA%IA
H#I 5irinder S. 2armar, et al. (#00&) J2h@tochemestr@ of the genus piper”. 2h@tochemisrr@ , $, $ H-I 7a3ma Snchez, et al. (-##) Jctividad 2romisoria de aceites esenciales de especies pertenecientes a la tribu pipereae frente a Artemia alina @ !anthomona al"ilinean”, #e$. Protecci%n &eg. -, # H+I Karc3a ?ios . et. al. (-&) Jeterminación de la Composición Au3mica @ actividad antioxidante in vitro del aceite esencial de Piper auritum Kunth 'Piperaceae( difundida en la costa colombianaL. Scientia et >>, Do ++ H+I Daciones 4nidas, Gficina contra la droga @ el delito,
