DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR MEDIO DEL MÉTODO MILLER (DNS)
DANIEL GÓMEZ ANDRES GUTIERREZ JENNY VILLANUEVA
SENA. CENTRO DE GESTIÓN INDUSTRIAL COMPLEJO PALOQUEMAO BOGOTÁ D.C. 2010
DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR MEDIO DEL MÉTODO MILLER (DNS)
DANIEL GÓMEZ ANDRES GUTIERREZ JENNY VILLANUEVA
EVIDENCIA PARA EL ÁREA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS ENSAYOS DESARROLLADOS EN EL LABORATORIO DE ACUERDO CON LOS PROCEDIMIENTOS DEFINIDOS POR LA EMPRESA
INSTRUCTOR DEL AREA DE QUÍMICA APLICADA ALA INDUSTRIA JOSE MENDIETA
SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENA CENTRO DE GESTIÓN INDUSTRIAL QUÍMICA APLICADA A LA INDUSTRIA BOGOTÁ D.C.
2010
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN....................................................................................................... 4 OBJETIVOS............................................................................................................... 5 MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 6 MATERIALES Y REACTIVOS................................................................................... 7 PROCEDIMIENTO..................................................................................................... 8 BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................... 9
INTRODUCCIÓN Los carbohidratos son moléculas formadas por carbono, hidrogeno y oxigeno. Todos los carbohidratos son azucares pequeños, solubles en agua (glucosa y fructosa, por ejemplo) o bien cadenas, como el almidón y la celulosa, que se elaboran enlazando subunidades de azúcar. Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la capacidad de los azucares reductores de reducir los iones cúpricos (Cu2+) y aportan un ensayo sencillo para reconocer azucares que pueden existir como aldehído o cetona libre. Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma inespecífica a otras moléculas; los que no lo hacen, azucares no reductores. El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares reductores.
OBJETIVOS Realizar la determinación de carbohidratos en una muestra específica de almidón extraído de la cáscara de plátano verde (Mussa paradisiaca), por medio del método Miller o DNS.
MARCO TEÓRICO DETERMINACIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA DE ABSORCIÓN DEL PRODUCTO DE REDUCCIÓN DEL DNS La longitud de onda de absorción del producto de la reducción de la glucosa con el DNS, se realizó desde una longitud de onda de 500 a 700 nm. La longitud de onda de mayor absorción del producto fue obtenida por interpolación de la curva obtenida del espectro de absorción complejo, que dio como resultado 570 nm. Esta longitud de onda es la empleada para la lectura de las demás soluciones patrón de glucosa a diferentes coordenadas.
CURVA DE CALIBRACIÓN PARA PATRONE DE GLUCOSA PRO EL ME´TODO DE DNS La curva de calibración obtenida para el método de cuantificación de GLUCOSA por el método de DNS, presenta una tendencia lineal donde se aplica a la ley de beer que representa la relación entre la absorbancia y la concentración del complejo obtenido por la reducción de la glucosa con el DNS directamente proporcional. El coeficiente de correlación de esta curva de calibración encontrado es de 0,9972, este valor nos indica que los datos se ajustan en una línea recta. La pendiente de la gráfica relaciona el coeficiente de extinción molar, la sensibilidad del método analítico, se expresa en unidades de concentración y está asociado al cambio mínimo de glucosa que puede detectar el instrumento, este corresponde a 0,0934 mg/ml.
MATERIALES Y REACTIVOS REACTIVOS
Ácido dinitrosalicílico (DNS)
Sulfito de sodio
NaOH
Tartrato de sódico potásico
MATERIALES
Balón aforado de 50 mL
Balón aforado de 100 mL
Balón aforado de 1000ml
Agitador de vidrio
Espátula
Vidrio reloj
Pipeta aforada de 1 ml
Pipeta aforada de 5 ml
Pipeta aforada de 10 ml
Frasco lavador
Beacker de 100 ml, 250ml
Tubos de centrífuga de 15 ml
Placa y malla de asbesto
Frasco lavador
Plancha de agitación
PROCEDIMIENTO PREPARACION SOLUCION DE ALMIDÓN (Hidrólisis de la muestra) Diluir 2 g de almidón en 100 ml de agua destilada. Se prepara utilizando tampón de acetato 0.02 M a pH 5; se debe calentar el tampón y cuando este ebulla se adiciona lentamente el almidón una vez adicionado todo el almidón se deja ebullir por 2 minutos.
PREPARACIONDEL TAMPON ACETATO 0.02M pH 5. Acetato de sodio 0.36g/L Acido acético 0.3ml/L
PREPARACIÓN DEL DNS Acido 3,5-dinitrosalicílico (C7H4N2O7; PM 228,1) al 0,1 % (p/v), tartrato sódico Potásico [NaK(COO)2(CHOH)2⋅4H2O; PM 282,23] al 30 % (p/v) en NaOH (PM 40) 0,4 M. 1. Disolver 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico y 300 g de tartrato sódico potásico en 200 ml de hidróxido sódico 2 M (16 g de NaOH en 200 ml de agua destilada) 2. Diluir hasta 1000 ml con agua destilada. 3. El reactivo debe guardarse en bote oscuro (color topacio), siendo estable durante varias semanas.
SOLUCIÓN DE GLUCOSA (C6H12O6, PM 180) 1.
40 mM en agua destilada. Disolver 1,8 g de glucosa en 250 ml de agua destilada.
La solución, cuando no se esté utilizando, se guardará en frío.
PROTOCÓLO 1. Siga los pasos 1 a 3, como en Nelson-Somogyiâ € ™ s método para extraer los azúcares reductores de el material de prueba. 2. Pipeta de 0,5 a 3 ml de extracto en tubos de ensayo e igualar el volumen de 3 ml con el agua en todos los tubos. 3.
Añadir 3 ml de reactivo DNS.
4.
Calentar el contenido en un baño de agua hirviendo durante 5 min.
5. Cuando el contenido de los tubos son todavía caliente, agregar 1 ml de solución salina al 40% Rochelle 6. Dejar enfriar y leer la intensidad de color rojo oscuro a 510 nm. 7. Ejecutar una serie de normas con la glucosa (0A € "500 Î ¼ g) y trazar un gráfico.
CÁLCULOS Calcular la cantidad de azúcares reductores presentes en la muestra con el gráfico estándar.
BIBLIOGRAFÍA 1. Miller, G.L. (1972). Anal. Chem., 31, p. 426. 2. http://www.newagepublishers.com/samplechapter/000091.pdf
