PRAKTIKUM VI PEMERIKSAAN NS1 DENGUE dan PEMERIKSAAN ANTI DENGUE IgG dan IgM
Hari/Tanggal Praktikum
: Rabu, 8 Mei 2013.
Tempat
:
Laboratorium
Patologi
Klinik,
Poltekkes
Denpasar.
I.
TUJUAN 1.1 Pemeriksaan Dengue NS1 Ag Untuk mendeteksi secara kualitatif antigen NS1 Dengue virus didalam sampel (serum, plasma, atau whole blood) pasien.
1.2 Pemeriksaan Anti Dengue IgG dan IgM Untuk mendeteksi secara kualitatif sekaligus membedakan antibodi IgG dan IgM terhadap virus dengue di dalam sampel (serum, plasma atau whole blood) pasien.
II. METODE 2.1 Pemeriksaan Dengue NS1 Ag Metode yang digunakan pada pemeriksaan dengue NS1 Ag adalah Imunochromatografi rapid test.
2.2 Pemeriksaan Anti Dengue IgG dan IgM Metode yang digunakan pada pemeriksaan dengue Anti Dengue IgG dan IgM adalah Imunochromatografi rapid test.
1
III. PRINSIP 3.1 Pemeriksaan Dengue NS1 Ag Dengue NS1 Ag yang terdapat dalam serum, plasma atau whole blood sebagai antigen bereaksi dengan anti NS1 Ag yang dilapisi koloidal emas pada strip sebagai antibodi akan bergerak di sepanjang membran secara kromatografi menuju wilayah test yang dilapisi oleh antibodi spesifik terhadap dengue yang akan membentuk garis warna sebagai kompleks partikel emas antibodi-antigen-antibodi.
3.2 Pemeriksaan Anti Dengue IgG dan IgM Ketika sebuah sampel yang mengandung anti dengue IgG dan IgM diteteskan pada sumur uji , anti dengue IgG dan IgM dalam sampel akan bereaksi dengan rekombinan virus dengue yang terdapat dalam protein koloidal emas dan membentuk kompleks antibodi antigen. Kompleks tersebut akan bermigrasi sepanjang membran dengan gaya kapiler yang akan ditangkap oleh anti-human IgG dan atau anti-human IgM yang spesifik sehingga menghasilkan garis warna.
IV. DASAR TEORI 4.1 Demam Berdarah Demam berdarah (DB) atau demam berdarah dengue (DBD) adalah penyakit demam yang disertai perdarahan bawah kulit, selaput hidung dan lambung, yang ditemukan di daerah tropis, dengan penyebaran geografis yang mirip dengan malaria. Penyakit ini disebabkan oleh empat serotipe virus dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4) dari genus Flavivirus, famili Flaviviridae dengan daya infeksi tinggi pada manusia. Setiap serotipe cukup berbeda sehingga tidak ada proteksi-silang dan wabah yang disebabkan beberapa serotipe (hiperendemisitas) dapat terjadi. Virus dengue ditularkan melalui gigitan nyamuk Aedes aegypti yang sebelumnya sudah menggigit orang yang terinfeksi dengue. (Soegijanto S, 2004). Gejala demam dengue akan diawali oleh perasaan menggigil, nyeri kepala, nyeri saat menggerakan bola mata dan nyeri punggung. Kesakitan
2
pada tungkai dan sendi akan terjadi beberapa jam sejak gejala demam dengue mulai dirasakan. Suhu tubuh akan meningkat dengan cepat mencapai 40 derajat celcius dengan detak nadi yang normal serta tekanan darah yang cenderung turun. Bola mata akan tampak kemerahan. Kemerahan juga tampak pada wajah yang dengan cepat akan menghilang. Kelenjar pada leher dan tenggorokan terkadang ikut membesar. Setelah itu mulai muncul antibodi yang spesifik untuk penyakit dengue. (Soegijanto S, 2004). Infeksi virus dengue menyebabkan timbulnya respon imun baik respon imun yang didapat (humoral dan seluler). Respon Imun bawaan melibatkan berbagai sel dalam sistem imun bawaan misalnya monosit, leukosit, polimorfonuklear, natular killer cell. Respon imun humoral diperankan oleh antibodi sedangkan respon imun seluler diperankan oleh MHC class II- restricted CD4 T cells dan MHC class I- restricted CD 8 T cells ( Hadinegoro SR. 1999). Antibodi yang muncul pada umumnya adalah IgG dan IgM, untuk Infeksi primer ditandai dengan timbulnya antibodi IgM terhadap dengue sekitar tiga sampai lima hari setelah timbulnya demam, meningkat tajam dalam satu sampai tiga minggu serta dapat dideteksi sampai tiga bulan. Antibodi IgG terhadap dengue diproduksi sekitar dua minggu sesudah infeksi. Titer IgG ini meningkat cepat, kemudian menurun secara lambat dalam waktu yang lama dan biasanya bertahan seumur hidup. Pada infeksi sekunder terjadi reaksi anamnestik dari pembentukan antibodi, khususnya dari kelas IgG dimana pada hari kedua saja, IgG ini sudah dapat meningkat tajam. (Rejeki, sri. Hadinegoro dan Hindra Irawan Satari.1999). Dalam tubuh manusia virus dengue berkembang biak didalam sel retikuloendotelial, kemudian terjadi viraemia yang diikuti dengan respon imun terhadap virus dengue baik humoral maupun seluler. Virus bersirkulasi dalam darah perifer di dalam sel monosit, sel limfosit B dan sel limfosit T. Sebagi reaksi terhadap infeksi virus, tubuh akan membuat antibodi antidengue, baik berupa anti netralisasi, anti-hemaglutinasi dan anti komplemen. Diduga bahwa kebocoran vaskuler pada DBD disebabkan oleh pelepasan sitokin (IL-1β dan TNF-α) serta PAI oleh monosit dan pelepasan IL-2, IL-1β
3
serta TNF-α oleh limfosit T yang terinfeksi oleh infeksi virus tersebut (Aryati, Yolanda Probohoesodo, 2000).
4.2 Protein Non Struktural-1 (NS1 dengue) NS1 adalah glikoprotein non struktural dengan berat molekul 46-50 kD dan merupakan glikoprotein yang sangat conserved. Pada mulanya NS1 digambarkan sebagai suatu antigen Soluble Complement Fixing (SCF) pada kultur sel yang terinfeksi. NS1 diperlukan untuk kelangsungan hidup virus namun tidak diketahui dengan pasti aktivitas biologisnya. Dari bukti yang sudah ada menunjukkan bahwa NS1 terlibat dalam proses replikasi virus. NS1 dihasilkan dalam dua bentuk yaitu membrane associated (mNS1) dan secreted form (sNS1). NS1 pada mulanya ditranslokasikan ke retikulum endoplasma melalui sekuens signal hidrofobik yang dikode dibagian C terminal E, dan secara cepat didimerisasi di dalam organel-organel intrasel, kemudian ditransfer ke membran sitoplasma. NS1 dilepaskan dalam bentuk hexameric solubilized (sNS1), yang terbentuk di 3 sub unit dimerik yang heksamer dihubungkan secara kovalen. Selama infeksi sel NS1 ditemukan berkaitan dengan organel-organel intrasel atau ditransfer melalui jalur sekresi ke permukaan sel (membran sitoplasma). Bentuk yang larut dilepaskan dari sel mamalia yang terinfeksi. NS1 bukan bagian dari struktur virus
tetapi
diekspresikan pada permukaan sel yang terinfeksi dan memilki determinan – determinan dan spesifik grup dan tipe. NS1 falvirus telah dikenal sebagai imunogen yang penting dan menunjukkan peran dalam proteksi terhadap penyakit.
Namun,
peran
NS1
dalam
imunopatogenesis
juga
telah
dikemukakan berdasarkan temuan anti SCF antibodies dalam serum pasienpasien dengan infeksi sekunder tetapi tidak pada primer, ( Alcon S, Talarmin A, Debruyne M 2002). NS1 dengue diekskresikan ke dalam sistem darah pada individuindividu yang terinfeksi dengan virus dengue. NS1 bersikulasi pada konsentrasi yang tinggi di dalam serum pasien dengan infeksi primer maupun sekunder selama fase klinik sakit (clinical phase of illness) dan hari-hari pertama fase konvalesens (pemulihan). Dari penelitian juga ditunjukkan
4
bahwa deteksi NS1 dapat memberikan diagnosis spesifik dengue. (Rothman AL. 2004).
4.3 Pemeriksaan laboratorium Infeksi Virus Dengue Pemeriksaan laboratorium untuk infeksi virus dengue ada yang bersifat spesifik dan non spesifik. Pemeriksaan yang bersifat spesifik diantaranya isolasi virus/identifikasi virus dan pemeriksaan serologi (uji hambatan hemaglutinasi) (HAI), anti dengue IgM dan IgG. Pemeriksaan yang bersifat non spesifik misalnya pemeriksaan hematologi dan radiologi. Saat ini telah dikembangkan suatu pemeriksaan baru terhadap antigen Non Struktural-1 dengue (NS1) yang dapat mendeteksi infeksi virus dengue dengan lebih awal bahkan pada hari onset demam (Kaniawati M, 1996).
4.3.1 Pemeriksan dengue NS1 antigen Baru-baru ini telah ditemukan rapid test yang mendeteksi adanya antigen dari protein struktural virus dengue. Untuk mempertahankan hidup, virus dengue memerlukan dukungan dari protein yang mempertahankan tubuhnya, terutama untuk membantu masuk dalam sel inang. Protein ini disebut sebagai protein struktural yang berfungsi sebagai enzim dan katalis dalam upaya virus mempertahankan hidupnya. Pemeriksaan NS1 Ag yang berarti nonstruktural 1 antigen adalah pemeriksaan yang mendeteksi bagian tubuh virus dengue sendiri. Karena mendeteksi bagian tubuh virus dan tidak menunggu respon tubuh terhadap infeksi maka pemeriksaan ini dilakukan paling baik saat panas hari ke-0 hingga hari ke -4, karena itulah pemeriksaan ini dapat mendeteksi infeksi virus dengue bahkan sebelum terjadi penurunan trombosit. Setelah hari keempat kadar NS1 antigen ini mulai menurun dan akan hilang setelah hari ke-9 infeksi. Angka sensitivitas dan spesifisitasnya pun juga tinggi. Bila ada hasil NS1 yang positif menunjukkan kalau seseorang ‘hampir pasti’ terkena infeksi virus dengue. Sedangkan kalau hasil NS1 Ag dengue menunjukkan hasil negatif tidak menghilangkan kemungkinan infeksi virus dengue dan masih perlu dilakukan observasi serta pemeriksaan lanjutan. Ini terjadi karena untuk mendeteksi virus
5
dengue diperlukan kadar yang cukup dari jumlah virus dengue yang beredar, sedangkan pada fase awal mungkin belum terbentuk cukup banyak virus dengue tetapi apabila pengambilan dilakukan setelah munculnya antibodi maka kadar virus dengue juga akan turun. Keuntungan mendeteksi antigen NS1 yaitu untuk mengetahui adanya infeksi dengue pada penderita tersebut pada fase awal demam, tanpa perlu menunggu terbentuknya antibodi. Dengan demikian kita dapat segera melakukan terapi suportif dan pemantauan pasien . Hal ini tentunya akan mengurangi risiko komplikasi seperti demam berdarah dengue dan dengue shock syndrome yang dapat berakibat kematian (Anonim, 2011). Hal yang perlu diperhatikan dalam pemeriksaan (NS1 AG)
:
1.
Antikoagulan ( EDTA, Heparin, citrate) tidak mempengaruhi hasil test
2.
Gunakan pipet kapiler dan tip mikropipet yang berbeda untuk setiap sampel untuk menghindari kontaminasi silang
3.
Sampel yang ikterik, hemolysis dan mengandung factor rheumatoid dapat memberikan hasil uji yang tidak sesuai.
4.3.2 Anti Dengue IgM dan IgG Rapid Test IgG/IgM Dengue adalah rapid test yang muncul lebih dulu dibanding NS1 Ag Dengue, pemeriksaan ini mendeteksi adanya antibodi terhadap virus dengue. Ada dua antibodi yang dideteksi yaitu Imunoglobulin G dan Imunoglobulin M, dua jenis antibodi ini muncul sebagai respon tubuh terhadap masuknya virus ke dalam tubuh penderita. Imunoglobulin G akan muncul sekitar hari ke-4 dari awal infeksi dan akan bertahan hingga enam bulan pasca infeksi. Atas dasar hal diatas maka antibodi ini menunjukkan kalau seseorang pernah terserang infeksi virus dengue, setidaknya dalam enam bulan terakhir. Imunoglobulin M juga diproduksi sekitar hari ke-4 dari infeksi dengue, tetapi antibodi jenis ini lebih cepat hilang dari tubuh. Adanya Imunoglobulin M dalam tubuh seseorang menandakan adanya infeksi akut dengue atau dengan kata lain menunjukkan kalau penderita sedang terkena infeksi virus dengue. Sensitivitas dan spesifitas pemeriksaan ini cukup tinggi dalam menentukan adanya infeksi virus dengue.
6
Pemeriksaan IgG/IgM anti dengue meskipun cukup baik dalam mendeteksi adanya infeksi virus dengue dalam tubuh seseorang tapi masih memiliki kekurangan dalam mendeteksi virus dengue secara dini. Karena yang diperiksa adalah antibodi terhadap virus dengue dan antibodi baru muncul hari keempat pasca infeksi, maka pemeriksaan ini seringkali tidak dapat mendeteksi infeksi virus dengue pada penderita yang mengalami gejala panas hari ke-0 hingga hari ke-4. Saat ini talah banyak dikembangkan reagen untuk peneriksaan anti dengue IgM dan IgG dengan pemeriksaan yang ceat (rapid test). Metode yang digunakan adalah imunokhromatografi dimana pengerjaannya sangat sederhana dan hanya membutuhkan waktu 15 menit sehingga hasil pemeriksaan dapat diperoleh dengan cepat. Reagen ini dapat mendeteksi antibodi terhadap keempat serotif virus dengue dan dapt membedakan antara infeksi primer dengan infeksi sekunder. (Kaniawati M, 1996). Pemeriksaan IgG/IgM anti dengue meskipun cukup baik dalam mendeteksia danyainfeksi virus dengue dalam tubuh seseorang tapi masih memiliki kekurangan dalam mendeteksi virus dengue secara dini, karena yang diperiksa adalah antibody terhadap virus dengue dan antibody baru muncul hari keempat pasca infeksi, maka pemeriksaan ini seringkali tidak dapat mendeteksi infeksi virus dengue pada penderita yang mengalam igejala panas hari ke-0 hingga hari ke-4. Hal yang perlu diperhatikan dalam pemeriksaan (IgM/IgG Dengue) : 1.
Semua specimen sebaiknya dikerjakan layaknya spesimen infeksius. Direkomendasikan untuk mengerjakan specimen yang berpotensi infeksius pada Biosafety Cabinet level 2
2.
Jangan memipet menggunakan mulut dan jangan biarkan specimen atau reagen mengalami kontak dengan kulit
3.
Reagent harus ditambahkan secara hati – hati untuk memperoleh hasil yang akurat dan tepat
4.
Penggunaan alat diluar suhu dan waktu yang ditentukan dapat menyebabkan hasil invalid.
5.
Jangan mencampurkan reagen dari pabrikan yang berbeda
7
6.
Jaga kotak penyimpanan agar tetap kering
7.
Jangan menggunakan kembali casset test yang telah terpakai
8.
Jangan gunakan casset test apabila kemasan rusak
9.
Reagen dalam kit harus dihindarkan dari kontaminasi. Jangan digunakan apabila terdapat tanda kontaminasi atau endapan yang timbul oleh mikroba.
Penyimpanan reagen 1. Kit disimpan pada suhu 20C dan 300C. Temperatur penyimpanan harus stabil untuk memelihara kestabilan reagen sampai tanggal kadaluarsa dari kit. 2. Komponen kit tidak boleh dibekukan. 3. Test kit boleh digunakan sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada pembungkus. 4. Jangan menggunakan reagen yang sudah kadaluarsa.
V. ALAT DAN BAHAN. 5.1 Pemeriksaan Dengue NS1 Ag A. Alat a. Disposible dropper b. Stopwacth B. Bahan a. Sampel ( serum, plasma, whole blood). b. Cassete test (SD Bioline Dengue NS1 Ag)
5.2 Pemeriksaan Anti Dengue IgG dan IgM A. Alat a. Pipet microsafe 10 µl atau mikropipet 10 µl b. Stopwacth B. Bahan a. Sampel (serum, plasma, whole blood) b. Kit Anti Dengue IgG IgM merck Panboi terdiri atas : 1. Cassete test Merck Panbio
8
2. Buffer
VI. CARA KERJA 6.1 Pemeriksaan Dengue NS1 Ag 1. Alat dan bahan disiapkan. 2. Semua komponen pemeriksaan (cassete test dan sampel) dikondisikan pada suhu ruang. 3. Cassete test dikeluarkan dari kantong pembungkus dan diletakkan pada tempat dengan permukaan yang datar dan kering. 4. Dengan menggunakan disposable dropper, ditambahkan 3 tetes sampel kedalam sumur (well) sampel bertanda (S). 5. Jika tes berjalan dengan baik, akan terlihat pergerakan warna ungu sepanjang jendela casset test hasil menuju kebagian tengah cassete test. 6. Casset test diinkubasi selama 15-20 menit, kemudian dilakukan pengamatan hasil kemudian dilakukan interprestasi hasil. (Interpretasi hasil tidak boleh dibaca lebih dari 20 menit).
6.2 Pemeriksaan Anti Dengue IgG dan IgM 1. Alat dan bahan disiapkan. 2. Semua komponen pemeriksaan (reagen, sampel dan cassete test) dikondisikan pada suhu ruang. 3. Sebanyak 10 µL sampel (whole blood atau serum atau plasma) ditambahkan kedalam cassete test pada sumur uji yang berbentuk bulat dengan menggunakan mikropipet atau Microsafe pipet. 4. Untuk penggunaan Microsafe pipet cara kerjanya : a. Microsafe pipet dipegang secara horisental b. Untuk mengumpulkan sampel, ujung Microsafe pipet ditempelkan pada sampel darah, serum atau plasma. c. Untuk mengeluarkan sampel, bagian atas Microsafe pipet dipencet dengan lembut.
9
5. Kemudian buffer diteteskan sebanyak 2 tetes ke dalam cassete test pada sumur uji yang berbentuk persegi dengan botol buffer diposisikan vertical dan 1 cm diatas sumur uji. 6. Hasil pemeriksaan dibaca setelah 15 menit dihitung setelah penambahan buffer 7. Apabila hasil yang dibaca setelah 15 menit menunjukkan hasil invalid maka pemeriksaan harus diulang.
VII. INTERPRETASI HASIL 7.1 Pemeriksaan Dengue NS1 Ag
1. Negatif
: Terbentuk garis berwarna hanya pada tanda C saja.
NS1 Ag
C
T
C 2 1
2. Positif
: Terbentuk garis berwarna pada C dan T. NS1 Ag
C
T
C 2 1
3. Invalid
: Tidak terbentuk garis pada C dan T. Terbentuknya garis hanya pada T saja. NS1 Ag
C
T
C 2 1
NS1 Ag
C
T
C 2 1
10
7.2 Pemeriksaan Anti Dengue IgG dan IgM
7.3
11
7.3 KESIMPULAN HASIL PEMERIKSAAN (NS1 DAN IgG/IgM)
NO
NS-1
IgM
IgG
1
+
-
-
Infeksi Dengue Primer
2
+
+
-
Infeksi dengue primer
3
-
+
+
Infeksi Dengue Sekunder
4
-
-
+
Ulangi hari ke 5 demam
5
-
-
-
Infeksi Lainnya
6
+
+
+
Ulangi Pemeriksaan
12
Keterangan
