TEMA 2. CULTIVOS POR LOTE Y CONTINUO OBJETIVOS DEL TEMA. El alumno conocerá y aplicará relaciones matemáticas para describir y predecir el crecimiento bacteriano. El alumno conocerá, distinguirá y aplicará los principios de los diferentes sistemas de cultivo: por lote, continuo y lote alimentado o semi-continuo.
1. Introducción. En un proceso biotecnológico, existen tres formas de hacer crecer a los microorganismos en un biorreactor de acuerdo a la operación del fermentador que son: - Cultivo por lote - Cultivo por lote alimentado - Cultivo continuo En el sistema de cultivo por lote, el biorreactor se carga con el medio de cultivo apropiado para después ser inoculado con el organismo de interés, a medida que procede la fermentación, cambian las condiciones en el reactor al consumirse los sustratos y formarse los productos. Terminada la fermentación, se vacía el biorreactor, se limpia y el proceso se repite. Este tipo de sistema no se encuentra en estado estacionario. El ambiente nutricional dentro del biorreactor cambia en forma continua y, por lo tanto, fuerza cambios en el metabolismo celular. Eventualmente, la multiplicación celular cesa por desaparición o limitación de nutrientes y acumulación de productos tóxicos de excreción. La naturaleza compleja del crecimiento de microorganismos por lotes da lugar a las diferentes fases de una cinética de crecimiento (fase de adaptación o lag, fase de crecimiento o log, fase estacionaria y fase de declinación o muerte). En el sistema de cultivo por lote alimentado, parte de un cultivo por lote, dejando que transcurra la cinética de crecimiento para llevar al microorganismo hasta una fase de interés, en la cual se inicia la alimentación de medio de cultivo fresco para largar la fase de crecimiento de interés. Este cultivo se caracteriza porque el volumen en el biorreactor irá aumentando al transcurrir el tiempo. En el cultivo continuo, también parte del cultivo por lote y se deja que llega a un punto de interés donde el microorganismo tiene la fisiología deseada, en ese momento se inicia la alimentación de medio de cultivo y a la vez se retira medio fermentado, de tal manera que el volumen permanece constante así como las condiciones de cultivo, esto es se busca un estado estacionario.
2. Sistemas de cultivo. Considere la figura 1, en base a la cual, para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el biorreactor: Velocidad de acumulación = velocidad de entrada – velocidad de salida + velocidad de formación - velocidad de consumo (1) donde V es el volumen del cultivo, F1 es el flujo de alimentación, F2 es el flujo de salida, Ci1 la concentración del componente "i" en la alimentación y Ci la concentración a la salida, en un
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cultivo bien mezclado, se puede asumir idéntica a la que hay dentro del biorreactor. Los restantes términos, r fi y r ci se refieren a la velocidad de formación y consumo del componente "i" respectivamente. Por otra parte, el volumen de cultivo variará en el tiempo según sean F1 y F2 .
Figura 1. Representación de entradas y salidas de un biorreactor. Cuando la densidad del cultivo y de la alimentación son iguales resulta:
(2) Ahora bien, dependiendo de como sean F1 y F2 surgen, básicamente, tres sistemas de cultivo: a) Cultivo continuo. Ambos flujos son iguales, por lo que el volumen es constante en (2), por lo tanto (1) se reduce a: (3) b) Cultivo por lote alimentado El flujo de salida, F2, es nulo, por lo que V aumentará en el tiempo en función del flujo de entrada.
(4) y en el balance de materia se anula el término F2Ci resultando: (5) Debe destacarse que en este caso V permanece dentro del operador diferencial pues varia con el tiempo según (4). Por tal motivo, el lote alimentado, a diferencia del caso anterior, tiene una duración limitada de tiempo, ya que el volumen no puede incrementarse más allá del volumen útil que posee el biorreactor. c) Cultivo por lote. Ambos flujos son nulos, por lo que V es constante y en (1) se anulan los términos FlCi1,
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F2Ci (6) La duración del cultivo por lote es, por supuesto, también limitada en el tiempo y depende esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo. Una vez inoculado el medio, la concentración de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes y cuando el sustrato que limita el crecimiento se agota, finaliza el lote.
3. Cinética de crecimiento microbiano. Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado, donde se mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, número de células, ADN, ARN, proteínas, etc., es un valor constante y similar en cada caso (ver figura 3, fase log). ΔM/M = Δ N/N = Δ[ADN]/[ADN] = Δ[proteínas]/[proteínas] = ... = K Así pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logarítmico, el cultivo se comporta como una reacción autocatalítica de primer orden: velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente} También se puede decir que el número de células, la masa celular u otros componentes se duplican cada determinado lapso de tiempo. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado . Se caracteriza, porque todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es la velocidad específica de crecimiento ( ), que es característica para cada cepa bacteriana creciendo en un medio determinado y condiciones ambientales específicas. La curva típica de crecimiento se presenta en la siguiente figura.
Figura 2. Curva típica de crecimiento para una población bacteriana.
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Como se puede apreciar, la curva de crecimiento presenta diferentes fases perfectamente definidas, las cuales se explican a continuación : Fase lag: También conocida como "fase de retardo", es una consecuencia del "choque" que sufren las células al encontrarse en ambiente nuevo. Los microorganismos reorganizan sus constituyentes moleculares y dependiendo de la composición de los nutrientes, sintetizan nuevas enzimas; la síntesis de algunas otras enzimas es reprimida, etc. Múltiples fases lag pueden observarse cuando el medio contiene más de una fuente de carbono. Fase log o de crecimiento exponencial : En esta fase, las células se multiplican rápidamente, y la masa celular y el número de microorganismos se incrementa exponencialmente con el tiempo. Este es un período de "crecimiento balanceado", esto es, todos los componentes de la célula crecen con la misma velocidad, esto es la composición promedio de la célula permanece aproximadamente constante. La velocidad de crecimiento bacteriano durante la fase exponencial es de primer orden, y se puede representar por: dX = μ X X = X 0 a t = 0 (7) dt la cual al integrarse origina X = μ t ln o X = X 0 e μ t (8) X0
donde: X = concentración celular a tiempo t (g/L) X0 = concentración celular a tiempo t (g/L) μ = velocidad específica de crecimiento (t-1) Fase de desaceleración: En esta fase, el crecimiento desacelera debido a la disminución de uno o más nutrientes esenciales o a la acumulación de productos tóxicos al crecimiento. El rápido cambio del ambiente se traduce en un "crecimiento no balanceado" . Fase Estacionaria: En esta fase, la velocidad neta de crecimiento es cero (no existe división celular) o cuando la velocidad de crecimiento es igual a la velocidad de muerte. La producción de ciertos metabolitos es realizada durante la fase estacionaria, por ejemplo; antibióticos, hormonas, vitaminas, etc. Durante el desarrollo de la fase estacionaria uno o más de los siguientes fenómenos tiene lugar: i) La concentración total de masa celular permanece constante, pero el número de células viables puede decrecer ii) Lisis celular puede ocurrir y la masa celular viable descender. Una segunda fase de crecimiento puede presentarse y las células crecer sobre los productos de la lisis (crecimiento típico) iii) Las células pueden no estar creciendo pero pueden tener un metabolismo activo para producir metabolitos secundarios
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Durante la fase estacionaria, la célula cataboliza reservas celulares para generar nuevos bloques de construcción y monómeros para producir energía, a este fenómeno se denomina "metabolismo endógeno". La célula también puede gastar energía para mantener una membrana energizada y transportar nutrientes y para funciones metabólicas esenciales tales como su movilidad y reparación del daño a estructuras celulares, este gasto es llamado "energía de mantenimiento". Fase Declinación o Muerte : También conocida como "fase muerte", se da debido al agotamiento del medio o presencia de un veneno, la velocidad de muerte sigue una cinética de primer orden: dN - k' t = - k' d X o N = N s e d ( 9 ) dt donde: Ns = concentración de células al final de la fase estacionaria k'd = constante de velocidad de muerte
3.1 Tiempo de duplicación (t d). Es el tiempo que se requiere para que el microorganismo incremente su población al doble,esto es, el tiempo necesario para que se duplique una bacteria. A partir de la ecuación (7): dX = μ X dt al integrar la ecuación: X 2 dX td μ dt = X1 0 dt Si X2 = 2 X1, td= tiempo de duplicación
∫
∫
Así : t d =
ln 2
μ
=
0.693
μ
( 10)
3.2 Tiempo de generación (t g). Para muchos propósitos en microbiología es útil conocer el tiempo de generación de una población durante el crecimiento exponencial, durante esta etapa de la curva de crecimiento, se deduce que el aumento de bacterias es una progresión geométrica, existiendo una relación directa entre el número de células presente en el momento inical y el habido en un momento determinado del crecimiento exponencial, de donde: N =N0 2
n
(11)
siendo: n = número de generaciones que ha ocurido durante el período de la fase exponencial. N = número de células al tiempo t. N0 = número de células al inicio de la fase exponencial.
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Para calcular el tiempo de generación se emplea la ecuación tg = t/n (12) donde: tg = tiempo de generación t = tiempo de crecimiento transcurrido hasta el momento de la toma de muestra durante la fase exponencial. Para calcular el número de generaciones se puede emplear la expresión que se muestra a continuación: log N = log N0 + n log 2 (13) n =(log N – log N0)/log2
(14)
n=(log N – log N0)/0.301
(15)
4. Sistema de cultivo por lote Aplicando la ecuación (6) a la biomasa, al producto y al sustrato resulta: dx = r x = μ x (16) dt dS x = r S = = qS x (17) dt Y x / S dp
= r p = q p x (18) dt donde: dx/dt = r x = velocidad de crecimiento celular μ = velocidad específica de crecimiento (h-1) x = concentración de biomasa (g masa celular seca/L) dS/dt = r S = velocidad de consumo de sustrato limitante Yx/S = Rendimiento de biomasa en base a sustrato (g biomasa/g sustrato) qS = Velocidad específica de consumo de sustrato (g sustrato/g biomasa h) dp/dt = r p =velocidad de formación de producto q p = Velocidad específica de formación de producto (g producto/g biomasa h) Por otro lado, el aumento de la biomasa se puede relacionar con el consumo de sustrato para la fase exponencial de crecimiento a través de diferentes modelos cinéticos.
4.1 Ecuación de Monod. El modelo de Monod es uno de los empleados, y está desarrollado considerando que el estado interno del microorganismo es "constante" (crecimiento balanceado ). La ecuación de Monod es una expresión empírica establecida por analogía con la ecuación de Michaelis - Menten, la cual se basa en las siguientes hipótesis: a) Solamente se tiene una velocidad y un sustrato limitante.
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b) Una cantidad de sustrato limitante es consumida; una velocidad fija se presenta en la producción de una unidad de biomasa ( Yx/s ≈ constante ) c) μ = f (S) De la ecuación (16), el valor de μ se considera constante en la "fase log o exponencial". Monod propuso: S μ = max (19) K S + S donde: μmax = velocidad específica máxima de crecimiento Ks = constante de saturación o de velocidad media (g sustrato/L) S = concentración de sustrato limitante (g sustrato/L) La ecuación 19 es válida para S >> Ks. La figura 3 muestra el comportamiento de la velocidad de crecimiento al variar la concentración de sustrato.
Figura 3. Comportamiento de
contra concentración de sustrato (Ecuación de Monod)
En la figura 4 se presenta una relación entre 1/S y 1/µ, que proviene de la ecuación de Monod, para determinar µmax y Ks, donde la ecuación resultante representa una línea recta.
Figura 4. Gráfica de 1/ con tra 1/S.
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1 μ
1 μ
=
=
K S + S
(20)
μ max S 1
μ max
+
K S
(21 )
μ max S
El cuadro 1 presenta valores de la constante de saturación para diferentes sustratos y diferentes microorganismos. Cuadro 1. Constantes de saturación para diferentes sus tratos y mic roorganismo s Organismo Sustrato Ks Ks (M) (limitante) (mg/L) Glucosa Escherichia coli 6.8 × 10-2 3.8 × 10-2 Glucosa E. coli 4 2.2 Manitol E. coli 2 1.1 Glicerol Candida utilis 4.5 4.9 -1 Oxígeno C. utilis 1.4 4.5 × 10 -2 Oxígeno C. utilis 1.3 × 10-1 4.5 × 10 Glucosa Sacch. cerevisiae 14 25 Glucosa Aspergillus 2.8 5 -1 Mg++ Klebsiella 2.3 5.6 × 10 + K Klebsiella 1.0 3.9 × 10-1
4.2 Modelos para la inhibición del crecimiento. 4.2.1 Inhibición por sustrato. A altas concentraciones de sustrato, el crecimiento microbiano puede inhibirse por el sustrato. Como en la cinética enzimática, la inhibición por sustrato puede ser competitiva o no competitiva. Los principales patrones de inhibición por sustrato y sus expresiones son los siguientes: Inhibición por sustrato no competitiva μ max μ = ( 22 ) S ⎞ ⎛ 1 + K S ⎞ ⎛ ⎜ ⎟ ⎜⎜ 1 + ⎟⎟ S ⎝ ⎠ ⎝ K i ⎠ Si Ki >> Ks: μ =
max
S 2
K S + S +
S
( 23 )
K i
Inhibición por sustrato competitiva μ max S μ = ⎛ S ⎞ ⎟⎟ + S K S ⎜⎜ 1 + K i ⎠ ⎝
( 24 )
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3.2.2 Inhibición por producto Altas concentraciones de producto pueden ser inhibitorias del crecimiento microbiano. La inhibición por producto puede ser competitiva o no competitiva, la velocidad de crecimiento inhibida puede aproximarse a expresiones de decaimiento exponencial o lineal. Algunas expresiones son: Inhibición por producto no competitiva μ max μ = P ⎞ ⎛ 1 + K S ⎞ ⎛ ⎜ ⎟ ⎜⎜ 1 + ⎟⎟ ⎝ S ⎠ ⎝ K P ⎠ Inhibición por producto competitiva μ max S μ = ⎛ P ⎞ ⎟⎟ + S K S ⎜⎜ 1 + K P ⎠ ⎝
( 25 )
( 26 )
3.3 Requerimientos de mantenimiento en cultivo por lote. La relación expresada como rendimiento celular Yx/s, se define como: dX x - x0 Y X/S = = ( 27) dS S 0 − S donde x es la cantidad final de biomasa, x0 es la cantidad inicial de biomasa, S es la cantidad final de sustrato, S0 es la cantidad inicial de sustrato. La suposición más simple es que Yx/s es constante. Esto esencialmente es cierto solamente a altas velocidades de crecimiento. A partir de las ecuaciones 17, 19 y 27, se puede obtener una relación para la utilización de sustrato como: dS X S = μ max ( 28 ) dt Y X/S K S + S Marr, Pirt y otros demostraron que el rendimiento celular Y x/s "no es constante". Así, la respiración endógena de sustratos productores de energía para funciones de mantenimiento; de aquí que la utilización de sustrato por las células puede ser expresado más correctamente por: dS 1 dX = + m X ( 29 ) dt Y G dt o 1 dS X dt
=
1 Y G
μ + m
( 30 )
donde: m = constante de mantenimiento de sustrato por unidad de biomasa por unidad de tiempo YG = factor de productividad verdadero representando el sustrato utilizado solamente para crecimiento. Estas relaciones están representadas en la figura 5.
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Figura 5. Relaciones entre la utilización d e sustrato y crecimiento.
4.4 Relaciones sustrato – producto. Gran cantidad de modelos han sido propuestos para la producción de diferentes metabolitos comunes. Tres de estos modelos pueden ser razonablemente útiles al expresar el comportamiento de sistemas simples. Estos se muestran en la figura 6, donde: a) Modelo asociado al crecimiento. La producción del metabolito de interés se sintetiza durante el crecimiento del microorganismo. Matemáticamente la velocidad específica de producción está dada por: 1 dp = Y p / x μ q p = (31) x dt b) Modelo no asociado al crecimiento. La producción del metabolito de interés se empieza a sintetizar una vez que se alcanza cierta concentración de biomasa, y después tiene un comportamiento que sigue la curva de crecimiento microbiano. Matemáticamente la velocidad específica de producción está dada por: q p = α + β (32)
Figura 6. Diferentes tipos d e relación entre crecimiento y formación de produc to.
c) Modelo combinado asociado y no asociado al crecimiento. La producción del metabolito de interés se llevará a cabo después del crecimiento del microorganismo. Matemáticamente la velocidad específica de producción está dada por: q p = β (33)
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5. Sistema de Cultivo Continuo. Las operaciones de crecimiento celular en lote, son procesos que terminan después de un cierto tiempo, la alteración de estos procesos por el suministro continuo de medio fresco permite que el crecimiento se mantenga por períodos prolongados. Después de un cierto período de tiempo, el sistema usualmente alcanza un estado estacionario donde las concentraciones celulares, de producto y substrato permanecen constantes. El cultivo continuo brinda un conjunto de condiciones ambientales constantes para crecimiento y formación de producto y proporciona un producto de calidad uniforme. El cultivo continuo es una herramienta importante para la determinación de la respuesta de los microorganismos a su ambiente y el generar productos deseables bajo condiciones de operación y ambientales óptimas. La figura 7 muestra un diagrama típico de la configuración de un quimiostato en donde el ambiente químico se mantiene constante lo cual es característico de un estado estacionario. En ocasiones se tiene control de temperatura, flujo de aire, etc. Un turbidiostato es otro sistema de cultivo contínuo, similar al quimiostato pero donde la concentración celular en el recipiente es mantenida constante por el monitoreo de la densidad óptica del cultivo. Cuando en el cultivo se experimenta una desviación del "set-point" , una bomba es activada y medio fresco es alimentado al medio.
Figura 7. Sistema de Cultivo Contínuo de laboratorio (Quimiostato)
5.1 Teoría del cultivo contínuo. Un cultivo continuo se puede representar esquemáticamente de acuerdo a: F (L/h), S0 (g/L), x0 (g/L)
x (g/L), S(g/L)
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Cuyo balance de masa es:
{Células entrada} - {Células salida}+{Crecimiento celular}-{Muerte celular} = {Acumulación mat. celular} Que de acuerdo al esquema del biorreactor operando en cultivo continuo se puede expresar matemáticamente por:
F V
Xo −
F V
X+μ X− α X=
dX
( 34 )
dt
donde: xo = masa celular (g/L) en la alimentación x = masa celular (g/L) en el fermentador F = Flujo (L/h) V = volumen del fermentador (L) -1 µ = velocidad específica de crecimiento celular (h ) -1 α = velocidad específica de muerte celular (h ) t = tiempo (h) Si el medio de cultivo alimentado es estéril, entonces xo = 0 y en la fase log la velocidad de muerte es despreciable respecto a velocidad de crecimiento , µ >> α, entonces F dX − X+ μ X= ( 35 ) V dt En el estado estacionario, no hay cambio con respecto al tiempo, d x/dt = 0, de donde F μ = ( 36 ) V Definiendo D como la velocidad de dilución que es igual a D=F/V entonces =D ( 37 )
5.1.1 Nutriente limitante: Realizando el balance de masa para el nutriente limitante, se tiene: {Nutriente entrada}
-
{Requerimiento de mtto.}
{Nutriente salida}
− {Nutriente consumido} −
− {Formación de producto}
Expresado matemáticamente: q X dS F F μ X −mX− p = S o − S+ V V YX / S YP / S dt
=
{Acumulación d e nutriente }
( 38 )
donde: So = Concentración de sustrato en la alimentación (g/L) S = concentración de sustrato a la salida del fermentador (g/L) m = energía de mantenimiento Yx/s = rendimiento de biomasa en función del sustrato (g células/g sustrato)
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Y p/s = rendimiento de producto en base a sustrato (g producto/g sustrato) q p = velocidad específica de formación de producto (g producto/g células-h) Normalmente, la energía de mantenimiento es despreciable respecto al crecimiento x mx << Y x / s En estado estacionario: dS
=
dt por lo tanto, simplificando (5) se llega a: X D( S o −S )= YX / S
0
( 39 )
Substituyendo (4) en (6) :
X=YX / S ( S o −S )
( 40 )
5.1.2 Modelo de crecimiento Se pueden utilizar diferentes modelos para µ en las ecuaciones (34) a (40), normalmente se utiliza la ecuación de Monod S μ =μ max ( 41 ) K s +S Si la ecuación (41) se aplica al cultivo continuo, se tiene: S ( 42 ) D=D C K s +S Donde, Dc es la velocidad de dilución crítica. De la ecuación (42) se deduce la expresión para calcular la concentración, en estado estacionario, del nutriente limitante: D K S S = (43) DC − D Al sustituir la ecuación (43) en la ecuación (40), se obtiene una expresión que relaciona la concentración, en estado estacionario, con la velocidad de dilución:
⎡
X=YX / S ⎢S o −
⎣
⎤ ⎥ D C −D ⎦ DK S
( 44 )
5.2 Productividad En cultivo continuo, la Productividad P para biomasa (g/L.h) se define como: P=DX ( 45 ) Sustituyendo la ecuación (44) en (45) se obtiene:
⎡
⎡ D ⎤⎤ ⎥⎥ ⎣ Dc − D ⎦ ⎦
P=DYX / S ⎢S o −K s ⎢
⎣
( 46 )
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La velocidad de dilución a la cual se obtiene la máxima productividad, se puede calcular al derivar la ecuación (46), cuya expresión final es:
⎡ ⎡ K ⎤1 / 2 ⎤ s Dm =Dc ⎢1−⎢ ⎥ ⎥ K S + ⎢⎣ ⎣ s 0 ⎦ ⎦⎥
( 47 )
La máxima productividad no necesariamente se presenta a la velocidad de dilución correspondiente a la máxima conversión de substrato a células. Utilizando las ecuaciones (43), (44) y (46), se puede predecir el comportamiento teórico de un quimiostato(Fig. 8).
Figura 8. Comportamiento en un cultivo continuo al variar la tasa de dilución (D).
5.3 Uso del cultivo continuo. Las ventajas del cultivo continuo se basan principalmente en: a) La velocidad específica de crecimiento (μ), puede establecerse (dentro del los límites del organismo), de acuerdo a las necesidades del experimento. Se puede seleccionar un estado de actividad metabólico particular y el control de éste b) Se pueden obtener células en un estado definido, independientemente del tiempo. Tal es caso de los cultivos sincrónicos, donde todas las células microbianas están en el mismo estado fisiológico. c) Con equipo de laboratorio se pueden producir, comparativamente grandes cantidades de material celular definido En el cuadro 2 se listan algunos de los productos obtenidos por fermentación continua. Entre ellos destaca por su escala e importancia industrial la obtención de proteína celular. Los demás productos presentan problemas técnicos o tienen limitaciones de mercado, lo que los hace económicamente inaceptables por el momento, pero que en el futuro se podrán producir probablemente mediante cultivo continuo.
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Cuadro 2. Ejemplos de productos obtenidos por fermentación continua Acetona Butanol Glucosa Isomerasa Acido acético Butanodiol Glicógeno Acido cítrico Celulasa Penicilina Acido glucónico Cloranfenicol Penicilinasa Acido Itacónico Etanol Proteína unicelular Acido láctico Estreptomicina Vitamina B12
6. Sistema de Cultivo por Lote Alimentado. En un sistema de cultivo por lote alimentado, los nutrientes son continuamente o semicontinuamente adicionados al sistema, aumentando el volumen de medio de cultivo, ya que no hay flujo de salida. Este tipo de sistema se utiliza para resolver problemas de inhibición por sustrato o represión catabólica. En la figura 9 se muestra esquemáticamente la operación de este tipo de sistema.
Figura 9. Representación de un sistema de cultivo por lote alimentado. En un cultivo por lote, la concentración de biomasa a un cierto tiempo está dada por: x = x0
+ Y X / S (S 0 − S )
(48)
En un cultivo por lote alimentado, cuando la biomasa alcanza su máxima concentración (xm), la concentración de sustrato es muy baja (S<>x0, por lo que: xm
= Y X / S S 0
(49)
Si, para un biorreactor por lote alimentado conteniendo algunas células (inóculo), se inicia a alimentar un medio con un flujo F, con una concentración de sustrato S0, la cantidad total de biomasa en el sistema es: X t = Vx (50) t donde V es el volumen de medio y X es la biomasa al tiempo t. La velocidad de incremento del volumen de medio en el cultivo por lote alimentado es:
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dV
= F
dt Que integrando resulta en V = V 0
(51)
+ Ft
(52)
La concentración de biomasa a cualquier tiempo es: T x = X / V (53) La velocidad de cambio en la concentración de biomasa es: t t dx V (dX / dt ) − X (dV / dt ) = (54) dt V 2 t t Ya que, dX /dt=μnetX , dV/dt=F, y F/V=D, la ecuación (54) se convierte en: dx = (μ net − D ) x (55) dt Cuando el sustrato es totalmente consumido, S≈0, y x=xm, en este punto se tiene un estado cuasi-estacionario donde la velocidad de consumo de nutriente es aproximadamente igual a la velocidad de alimentación de nutriente (dx/dt=0), se tiene que. (56) net = D Si la energía de mantenimiento se desprecia, S μ net = μ m K s + S S ≅
K s D
μ m − D
(57) (58)
El balance para el sustrato limitante de la velocidad sin considerar la energía de mantenimiento es: t μ net X t dS = FS 0 − (59) dt Y x / s t
Donde S es la cantidad total de sustrato limitante en el cultivo, y S0 es la concentración del t sustrato en la corriente de alimentación. En el estado cuasi-estacionario, X =Vxm, y esencialmente todo el sustrato es consumido, de donde: t dX dV ⎞ = xm ⎛ (60) ⎜ ⎟ = xm F = FY x / s S 0 dt ⎝ dt ⎠ t Integrando la ecuación (60), con una concentración inicial de biomasa en el reactor de X 0: t t X = X 0 + FY x / s S 0t (61) Que indica que la cantidad total de células en el cultivo se incrementa linealmente con el tiempo. La tasa de dilución y μnet disminuye con el tiempo, así que μnet = D en el estado cuasi-estacionario, y la velocidad de crecimiento está controlada por el factor de dilución. Para la formación de producto en el cultivo por lote alimentado en el estado cuasiestacionario (S<
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dP
t
= q p X t
(63) dt Cuando la velocidad específica de formación de producto (q p) es constante: FP ≈ Y p / S S 0 F (64) t
Sustituyendo X = (V0+Ft) xm en la ecuación (63), se tiene: t dP = q p xm (V o + Ft ) dt Integrando Ft ⎞ ⎛ t t P = P0 + q p xm ⎜V 0 + ⎟t 2 ⎠ ⎝ Que puede ser expresada en términos del producto como: V ⎛ V Dt ⎞t P = P0 0 + q p xm ⎜ 0 + ⎟ V ⎝ V 2 ⎠
(65)
(66)
(67)
En la figura 10 del lado izquierdo se muestra la variación del volumen (V), la velocidad específica de crecimiento (μ), biomasa (x), sustrato (S) con el tiempo en el estado cuasi estacionario. Mientras en el lado derecho de la figura, la variación del producto.
Figura 10. Variaciones de parámetros en un cultivo por lote alimentado en el estado cuasi-estacionario.
6.1 Ventajas del cultivo por lote alimentado. a) Producción de altas concentraciones celulares debido a la extensión del tiempo de crecimiento, lo cual es importante en productos asociados al crecimiento. b) Condiciones controladas para la provisión de sustratos durante la fermentación. 17
c) Control sobre efectos de represión por productos o catabólica, debido a la limitación de la provisión de aquellos sustratos requeridos para la formación de producto. d) Permite el reemplazamiento de agua pérdida vía evaporación. e) Modo alternativo de operación para fermentadores involucrados en la biorremediación de sustratos tóxicos, o compuestos de baja solubilidad. f) No se requieren aditamentos especiales en el equipo para convertir una operación por lote en una por lote alimentado.
6.2 Desventajas del cultivo por lote alimentado. a) Requiere de un análisis previo del microorganismo, sus requerimientos, y un conocimiento de su fisiología respecto a la productividad. b) Requiere de un operador experto para la definición y desarrollo del proceso. 6.3 Aplicación del cultivo por lote alimentado. La aplicación de un sistema de cultivo por lote alimentado se sugiere cuando se tiene un proceso en dos fases, una de crecimiento y otra de producción de metabolito. Un ejemplo práctico es la producción de penicilina donde: la fermentación se divide en una fase de crecimiento rápido a la máxima velocidad específica de crecimiento y una fase de crecimiento lento en la cual se produce la penicilina. Durante la fase rápida de crecimiento, un exceso de glucosa causa una acumulación de ácidos, y una demanda de oxígeno por la biomasa mayor que la capacidad de aireación del fermentador. Una carencia de glucosa puede provocar que la fuente de nitrógeno orgánico en el medio de cultivo sea utilizada como fuente de carbono, resultando en un pH alto, que es inadecuado para la formación de biomasa. Durante la fase de producción, las velocidades de alimentación deben ser diseñadas para limitar la velocidad de crecimiento y el consumo de oxígeno, tal que una velocidad alta de síntesis de penicilina se logre, y el oxígeno disuelto sea el suficiente e el medio de cultivo.
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