Croissance industrielle des microorganismes
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Raisons : Obtention d·une biomasse servant - soit d·aliment d·aliment (levures (levures comme comme complément complément nutritionnel) - soit à la fabric fabrication ation d·aliment d·aliment (levures (levures pour la fabrication de pain, de bière, de brioches, de vin«, moisissures pour fabrication de fromages, saké«, bactéries pour fabrication de yaourt, de choucroute«.)
Synthèse de molécules d·intérêt alimentaire, médical ou industriel acide citrique, pénicilline, cyclosporine«..
Raisons : Obtention d·une biomasse servant - soit d·aliment d·aliment (levures (levures comme comme complément complément nutritionnel) - soit à la fabric fabrication ation d·aliment d·aliment (levures (levures pour la fabrication de pain, de bière, de brioches, de vin«, moisissures pour fabrication de fromages, saké«, bactéries pour fabrication de yaourt, de choucroute«.)
Synthèse de molécules d·intérêt alimentaire, médical ou industriel acide citrique, pénicilline, cyclosporine«..
Plan
1- Les dive diverses rses techn techniqu iques es de cult culture ure 2- Caractér Caractérist istiqu iques es des souches souches utilis utilisées ées 3- Des exemple exempless de cultures cultures indu industr striel ielles les
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1- Les diver s es t echniqu es d e cultu re 4
Deux grandes techniques de culture : - Culture en discontinu = culture en batch - Culture en continu = culture en milieu renouvelé Remarque : existence d·un autre type de culture avec immobilisation des microorganismes
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1-1- Culture en discontinu = culture en batch = culture en milieu non renouvelé
1-1-1- Matériel de culture : bioréacteur (fermenteur)
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1-1-1- Matériel de culture : bioréacteur
1- entrée d·air muni d·un filtre (ou tuyau d·échantillonnage) 2- enveloppe de refroidissement 3- entrée d·eau de refroidissement 4- moteur pour agitation 5- manomètre (pour vérifier la pression interne) 6- sortie de l·eau de refroidissement 7- pales pour agitation 8 ² tuyau de vidange 8
1-1-1- Matériel de culture : bioréacteur
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Un bioréacteur de laboratoire est une cuve accueillant de 1 à 5 L en général, Un bioréacteur de production industrielle est un cuve accueillant de quelques centaines de L à plusieurs m3
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1-1-2- Principe de la culture en batch
Culture en milieu clos dans une cuve de taille variable - stérilisée - remplie d·un milieu de culture stérile - ensemencée avec le microorganisme voulu - permettant la croissance du microorganisme jusqu·à épuisement des substances nutritives 11
1-1-3- Caractéristiques du milieu de culture
Doit apporter au minimum une source d'énergie, de carbone, d'azote, d·ions minéraux . Est souvent riche en glucose, en peptones, en phosphates, en sulfates, en magnésium, en vitamines, et en oligoéléments. Eléments divers pouvant être utilisés en industrie, seuls ou associés (voir cours sur la nutrition): ² des mélasses, résidus visqueux du raffinage de la betterave ou de la canne à sucre, riches en glucides, ² des liquides biologiques : du plasma, du lactosérum (protéines) ² des farines : végétales (maïs riche en amidon ; riz riche en amidon et en protéines ; soja : riche en protéines), de viande (protéines, lipides), de poisson (méthionine, phosphore). 12
1-1-3- Conditions d¶une bonne culture en bioréacteur
Nécessité - d·une bonne agitation de la culture - d· une régulation de la température par refroidissement car les réactions métaboliques lors de la croissance sont généralement exothermiques - d· une régulation du pH car les réactions métaboliques microbiennes peuvent acidifier ou alcaliniser le milieu - d·une régulation de la pression partielle en O2 par insufflation d·air stérile 13
- - batch
vantages et nconv n ents e a cu ture en
Avantages - Pas de perte de microorganismes durant la culture - Possibilité de recueil des produits synthétisés à tout moment, y compris durant la phase d e déclin - Peu de risques de contamination de la culture
-
-
Inconvénients Existence d·une phase de latence impropre à la production Pas de maintien de la phase exponentielle : donc biomasse et produits recueillis en quantités faibles : rendement limité Difficulté de stériliser de grands volumes de milieu Préparation longue 14
1-2- Culture en discontinu = culture en milieu renouvelé
1-2-1- Principe de la culture en milieu renouvelé
Culture du microorganisme en vase non clos de façon à maintenir en permanence en phase exponentielle grâce à - une addition régulière de milieu neuf stérile pour réapprovisionner en nutriments et maintenir le pH - un soutirage d·une quantité équivalente de milieu de culture permettant ainsi l·élimination régulière des déchets. 16
1-2-2- Matériels de culture T urbidostat
Chemostat ou bactogène
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1-2-2-1- Le turbidostat
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1-2-2-1- Le turbidostat
1- Réservoir de milieu stérile 2 Valve de contrôle du flux de milieu neuf 3- sortie de milieu de culture 4 ² cellule photoélectrique reliée à la vanne d·entrée de milieu neuf ce qui permet via un système électronique une autorégulation du débit en fonction de la concentration de la biomasse mesurée en sortie.
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Source lumineuse 6- Schéma d·un turbidostat. 19
1-2-2- 1- Principe de fonctionnement du turbidostat Un turbidostat est un dispositif de culture en continu. La concentration du milieu de culture est maintenue constante par un contrôle turbidimétrique. Si le trouble tend à trop augmenter il y a une augmentation d·apport de milieu neuf qui dilue et ramène le trouble à sa valeur initiale. Si le trouble tend à trop diminuer il y a diminution d·apport de milieu neuf jusqu·à ce que la croissance ait permis de retrouver la valeur initiale 20
1-2-2-2- Le chémostat
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1-2-2 12-2-2-2- Le chémo chémost stat at
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1-2-21-2 -2- 2- Pri Princip ncipee de fonctionn fonctionneme ement nt du chemos chemostat tat
Introduction de milieu neuf stérile dans la chambre de culture à la même vitesse vitesse que le milieu contenant les micro-organismes est éliminé (c·est le volume de milieu frais qui chasse par trop plein le volume de culture microbienne). Conséquences : ² stabilité stabilité de concentrat concentration ion en substances substances nutritives nutritives limitantes ² mic microo roorga rganis nismes mes soum soumis is à une bonne bonne aérat aération ion,, à une vigoureuse agitation et ayant toujours à leur disposition les éléments nutritifs dont ils ils ont besoin
Multiplication maintenue exponentielle à une vitesse spécifique de croissance rigoureusement contrôlée par l·apport de milieu neuf.
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- - - vantages et nc nconv n ents e a cu ture en continu Inconvénients
Avantages - Diff Diffic icul ulté té du cont contrô rôle le du - Ma Main inti tieen de la ph phas asee système de régulation exponentielle : - Diff Diffic icul ulté té du ma main inti tien en rendement optimal d·une culture pure - Stér Stéril ilis isat atio ionn fa faci cile le du - Pas de possibilité de milieu fabrication de produits - Réc Récupératio tion de des libérés uniquement durant produits au fur et à la phase de déclin. mesure de leur production
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2-
Caractérist iqu es d es souches ut ilisées 25
2-1- Démarche historique
Découverte de la pénicilline Découverte«
Staphylococcus aureus
Penicillium
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Découverte de la pénicilline Staphylococcus aureus
Fleming recherchait des molécules inhibant les contaminants des cultures. Un jour il ensemence une boîte avec du S. aureus et oublie la boite sur la paillasse.
Quelques jours plus tard, il constate l·apparition d·un champignon (Penicillium notatum). Il remarque une zone d·inhibition autour du Staphylococcus. Il en déduit que le champignon produit une molécule inhibant (à distance) le Staphylocoque. Penicillium 28
Penicillium notatum espèce historique de la découverte de la pénicilline produisait de faible quantité de pénicilline. Une souche de P enicillium c hrysogenum fut i sol é en 1943 et utili sée à la place ca r da vantage product rice
b
2006
C ll l
t
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- Recherche de la meilleure souche productrice à partir de constituants naturels (aliments, sols««) - Sélection, suite à diverses mutations des clones ayant e meilleur rendement sans perte de leurs qualités - Amélioration des souches grâce au progrès de la biologie moléculaire - Fusion de cellules - Introduction d·un DNA extérieur (ADN recombinant) 30
2-2- Caractéristiques des souches utilisées en production industrielle
Production
industrielle nécessite une souche ayant les caractéristiques suivantes :
- Innocuité (non pathogène) - Bonne productivité (fort rendement = capacité à synthétiser des quantités appréciables de produit attendu) - Stabilité génétique (ne perdant pas ses caractéristiques après de nombreuses multiplications en bioréacteur et lors de sa conservation) - Croissance rapide (de façon à donner très vite beaucoup de produit ou une biomasse importante) - Améliorabilité (idéalement la souche doit pouvoir être capable d'évoluer sous la pression de l'industriel, dans le but d'améliorer ou de d'adapter la production) 32
3-
Exemples d e cu ltu res et product ions indust rielles 33
3-1- Intérêt des cultures industrielles
Intérêt dans le domaine
agroalimentaire
industriel autre
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3-1-1- Cultures industrielles en agroalimentaire
Obtention de levains servant à la fabrication d·aliments
Obtention de levains servant d·aliments
Obtention de molécules participant à la fabrication d·aliments 36
3-1-1- 1- Obtention de levains servant à la fabrication d¶aliments S accharomyces cerevisiae po ur la pa ni fica tio n e t l·oe no lo gie S accharomyces cerevisiae e t car lber ge nsis po ur la fabrica tio n de la bi ère Lac tobaci llus po ur les pro dui ts lai tiers (yao ur ts «) car nés (sa ucisso ns ) o u v égéta ux (cho ucro ute «.) B aci llus na tto po ur le na tto P en ici lli um roq ue for tii, P en ici lli um camember tii « po ur la froma gerie As per gi llus flav us po ur cer tai ns pro dui ts asia tiq ues (sa ké) 37
Cas du vin : Levures oenologiques - Présence naturelle sur la peau des raisins avec des espèces variant selon l·environnement et les cépages - Peuvent également être ajoutées au moût S acch aromy ces : S . ellipsoideus, S . oviformis, S . cerevisiae T orulospora rosei Kloeckera apiculata - Evolution de la flore au cours de la vinification : S . ellipsoideus et S . oviformis sont les espèces les plus alcoologènes
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Principale réaction de fermentation : Fructose et glucose éthanol + CO2 100 à 250 g/L 60 à 170 g/L (6 à 17%)
Réactions additionnelles donnent des produits composants essentiels du bouquet » du vin - Sucres, acides organiques dont acide malique glycérol, acides organiques (lactique, succinique), autres alcools, aldéhydes Puis combinaison de ces produits esters b
2006
C ll l
t
39
Intérêt de la fermentation malolactique : réduire l·acidité du vin Acide malique acide lactique 2 à 5g/L < 1g/L COOH-CHOH-CH2-COOH
COOH-CHOH-CH3
Réaction assurée par des bactéries après la fermentation alcoolique: - Lactobacillus - Leuconostoc
40
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Cas du cidre - Jus
de pomme cidre - Mêmes types de réactions que pour le vin - Degré d·alcool plus faible : 2 à 5% - Principaux micro-organismes fermentation alcoolique
Kloeckera de diverses espèces S acch aromyces uvarum et S . ellipsoideus
fermentation malolactique
Lactobacillus de diverses espèce s 42
Cas de la bière
- Grain d·orge germés bière - Aromatisation par le houblon - 2 différences avec le vin et le cidre ² amidon (sucre complexe) au lieu de sucres simples dans la matière première ² 2 étapes
hydrolyse enzymatique de l·amidon jus sucré : le brassage fermentation alcoolique du jus sucré A jout nécessaire des micro-organismes après le brassage S accharomyces cerevisiae : levure de bière S accharomyces carlsbergensis
- Production très importante de CO2 : mousse abondante Processus comparable pour l·obtention du saké : alcool de riz 43
Cas du pain
Fermentation alcoolique également Levain ajouté à la pâte pendant le pétrissage : - S acch aromy ces cerevisiae ² d·autres levures ou des bactéries peuvent être ajoutées (pains
spéciaux) alcool + Amidon sucres simples CO2 Levée de la pâte grâce au CO2 Modification également du gluten et ainsi de latexture de la pâte Cuisson : ² l·alcool s·évapore ² les bulles de CO2 persistent 44
Cas du yaourt Les réactions chimiques : la fermentation
homolactique lactique Lactose du lait acide lactique Aliment sucré » aliment acide De plus modification des protéines (caséine) par les mêmes microorganismes aliment solide Aliment liquide
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Cas des fromages T ransformations
complexes du lait de vache, de chèvre, de brebis par les microorganismes
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Les 3 étapes de la fabrication des fromages
Prod uction d u caillé ² Fermentation lacti que par les bactéries lacti ques (cf yao urts ) + prés ure d ·origine animale o u f ungi que
Le lait coag ule à p H < 4,6 : caséine gel + li quide (lactosér um = petit lait )
E go uttage d u
caillé
- Lent :
fromages frais (e x: fr .blanc ) fromages à p âte molle (e x: camembert , Munster , ro quefort ) - Accéléré par pression p âtes pressées (e x: St Nectaire ) ; fr à p âte ferme (e x: Cantal ) - Accéléré par pression + c uisson p âtes fermes c uites (e x: gr uyère , Comté )
Salage et affinage (d urée 1 à 8 mois ) ² A jo ut d ·une flore spécifi que à c ha que fromage . Dé veloppement de la flore . - T ransformations microbiennes : Protéol yse , lipol yse , métabolisme des acides aminés , des composés so ufrés «prod uction d ·ar ômes , de ga z, d ·aldé hydes , d ·alcools , d ·ammoniac , dimin ution de l ·acidité « 47
Exemples
de micro-organismes participant à la formation des fromages 1- Des bactéries Bactéries lactiques : groupe prédominant: S treptococcus, Lactobacillus Leuconostoc, Lactococcus Propionibacterium (gruyères beaucoup de gaz) 2- Des levures S acch aromyces lactis 3- Des moisissures Penicillium : brie, camembert roquefort, bleus« Geotrich um : camembert 48
Cas des produits végétaux
Fabrication de choucroute + NaCl 2 à 3% pour freiner le développement des Gram ² Fermentation lactique du chou par Leuconostoc et Lactobacillus (flore naturelle du chou) pH<2 Fabrication d·olives, pickles (concombres, cornichons) Augmentation progressive du salage jusqu·à 1 6% (saumure) Fermentation lactique par Lactobacillus plantarum principalement Fabrication de sauce soja Fermentation d·un mélange salé de graines de soja et de blé par Aspergillus oryz ae 49
Fabrication de la choucroute
Incision dans la fabrique
Choucroute après le processus de fermentation Contrôle qualité après le conditionnement 50
Cas des produits végétaux (suite) Fabrication de vinaigre Fermentation acétique par Jus de raisin vin vinaigre Sucres éthanol acide acétique B actéries responsablers Acetobacter, Gluconobacter
Fabrication de divers végétaux fermentés T hé noir (feuilles fermentées) , café (grains), cacao (fèves), manioc, igname, maïs, soja 51
Cas des produits animaux
Fabrication de saucissons, jambons fumés Fermentation lactique par Pediococcus cere v isiae ; Lactobacillus plantarum
Fabrication de préparations asiatiques de poisson Fermentations lactiques ou fermentations complexes par bactéries et moisissures
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Conclusion : intérêt des fermentations lors de la fabrication d·un aliment
Fermentation lactique : acidification du milieu empêchant ainsi la multiplication d·autres microorganismes (conservateur). Autres fermentations : responsables des arômes et des goûts propres à chaque aliment
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3-1-1- 2- Obtention de levains servant d¶aliments
Levures
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3-1-1- 3- Obtention de molécules utiles à la fabrication d¶aliments : quelques exemples Production
- d·acides organiques * acide citrique (conservateur) * acide lactique (conservateur) abondamment utilisé en industrie alimentaire (laitière notamment) produit par Lactobacillus delbrueckii à partir de lactosérum (plusieurs dizaines de milliers de tonnes par an) * acide glutamine (exhausteur de goût) - d·enzymes (ex : chymosine (présure), amylases, invertase, pectinase«) par des moisissures ou des bactéries - de dextrane, xanthane ou alginate, utilisés comme gélifiants alimentaires produits à partir de Leuconostoc, Xanthomonas par exemple cultivés sur amidons. 55
3-1-2- Cultures industrielles utiles pour un domaine autre qu¶agroalimentaire Production
² de bioéthanol par des levures (S accharomy ces et / ou des bactéries) à partir de m élasses de canne ou de betterave à sucre ou de lactosérum utilisé dans l·industrie chim ique ou pour les voitures ² de lipides utiles dans le dom aine de la cosm étologie
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3-1-2- Cultures industrielles utiles pour un domaine autre qu¶agroalimentaire Production
² de protéines d·importance médicale (hormones, anticorps, molécules antitumorales, enzymes«) ² d·antibiotiques
Soit par des moisissures (pénicilline par Penicillium, céphalosporines par Cephalosporium) Soit par des bactéries (streptomycine par Streptomyces«..)
² de molécules immunosuppressives
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3-2- Origine des molécules produites
Molécules produites pouvant être
Des métabolites primaires
Des métabolites secondaires
Des métabolites issus d·une bioconversion
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3-2-1- Molécules produites : métabolites primaires
Définition : molécules fabriquées par le microorganisme pour ses besoins nutritifs et la croissance cellulaire. Moment du recueil : période de production = de la phase exponentielle de croissance. Exemples : ² enzymes, acides aminés« ² Alcools, acides organiques«. 60
3-2-2- Molécules produites : métabolites secondaires
Définition : molécules fabriquées après la phase de multiplication active, sans doute suite à un stress microbien lors de la phase stationnaire. Moment du recueil : fin de la croissance : phases exponentielle et de déclin. Exemples : antibiotiques, protéines«. 61
