CONVERSIÓN DE LÍPIDOS EN CARBOHIDRATOS Durante la etapa de heterótrofo ocurre la movilización de moléculas de reserva. En el caso de la mayoría de las semillas que contienen lípidos se induce el CICLO DEL GLIOXILATO Las células vegetales y las de algunos microorganismos pueden realizar la síntesis neta de carbohidratos a partir de grasas a través del ciclo del glioxilato. •
Es la vía metabolica por la cual 2 moléculas de acetil-CoA se convierten en 1 molécula de succinato, teniendo como un intermediario al glioxilato.
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El succinato se convierte en oxalacetato y es usado durante la gluconeogenesis para generar glucosa y de ahí sacarosa .
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Los animales no pueden convertir los ácidos grasos en glucosa ya que no tienen las enz imas necesarias para sintetizar oxaloacetato desde el acetil CoA.
En la oscuridad se induce la transcripción del gen de la malato sintasa, Durante la senescencia también se induce la malato sintasa, Sacarosa reprime re prime la inducción de las enzimas del ciclo del glioxilato En las plantas y en las bacterias, pero en los animales, la acetil-CoA puede servir como material inicial para la biosíntesis biosíntesis de carbohidratos. carbohidratos. El objetivo objetivo primordial del ciclo es el de permitir a las las plantas y a los microorganismos la utilización de los ácidos grasos o del acetato en forma de acetil-CoA como única fuente carbonada, sobre todo para la biosíntesis de glúcidos a partir de loa ácidos grasos. El ciclo del glioxilato elude mediante un rodeo, las etapas de desprendimiento de CO2 del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Sin embargo, la escisión del isocitrato se produce a través de una r uta en la que se eluden tres de las reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. El isocitrato es escindido por la isocitrato liasa para formar succinato y glioxilato. La malato sintasa cataliza a continuación la condensación c ondensación del glioxilato con otra molécula de acetilCoA para formar malato. El malato se oxida entonces a oxalacetato, que puede condensarse de nuevo con el acetil-CoA e iniciar otra vuelta del ciclo del glioxilato. A cada vuelta del ciclo se incorporan dos moléculas de acetil-CoA y se forma una molécula de succinato (Campbell y Farrell, 2010; Lehnninger 1995). Las plantas y algunas bacterias pueden usar la Acetil-ScoA derivada del catabolismo catabolismo de los lípidos (o de cualquiera otra sustancia) no sólo como fuente de energía, sino también como fuente de carbono para la formación de casi todas las otras otras clases de compuestos. Los animales tienen casi la misma versatilidad, aunque son particularmente ineficaces al usar el carbono lipídico para la formación de carbohidratos. Esto se debe a que las plantas y las bacterias sintetizan dos enzimas auxiliares, isocitritasa (o liasa del isocitrato) y cintaza del malato, pero ninguna de ellas se forma en los animales. Junto con otras enzimas del ciclo de ácido cítrico, estas enzimas auxiliares participan en una vía llamada ciclo del glioxilato. En las semillas oleaginosas, el ciclo del glioxilato ocurre en un organelo aparte, el glioxisoma. El resultado del ciclo del glioxilato es:
2 acetil-ScoA + fp + 2 NAD+ + 3 H2O oxaloacetato + 2 CoASH + fpH2 + 2 NADH La vía del glioxilato facilita el consumo de dos moléculas de acetil-ScoA; una por condensación con oxaloacetato y otra por condensación con glioxilato. Esta entrada no sólo genera intermediarios utilizables en la biosíntesis de aminoácidos, sino que además da por resultado la producción neta de oxaloacetato (OAA). De este modo, si se elimina uno de los intermediarios previos al OAA, el ciclo del glioxilato tiene una reacción anapletórica intrínseca. Además, el propio OAA puede convertirse ya sea en aminoácidos o en carbohidratos. --------------------------------------------------Se basan en: a. Propiedad de las proteínas de absorber luz en el UV absorción A=280nm a. Capacidad de unirse a ciertos colorantes Biuret
Lowry
Acido Bicinconínico
BCA Bradford
a. Formación de derivados químicos La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm, la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano • Tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante
la
determinación.
Método de Biuret • Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el ion Cu+2 y los grupos NH4 de los enlaces
pépticos en medio básico (NaOH o KOH) Consideraciones del método de Biuret • Reacción específica • Color violeta se lee a 540nm contra curva estándar BSA • La intensidad del color es proporcional a la cantidad de proteína • Baja sensibilidad alta concentración de proteína
Los carbohidratos se logran destruir por calor y por adición de ácido y son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simples, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos obscuros o compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol y es un método fácil, eficaz y rápido. Se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simple, si se continúa El calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir
compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol. Este método es fácil, eficaz y rápido. Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que éstos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. Los lípidos se definen como un grupo heterogéneo de compuestos que son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgánicos tales como éter, cloroformo, benceno o acetona. Todos los lípidos contienen carbón, hidrógeno y oxigeno, y algunos también contienen fósforo y nitrógeno. El contenido total de lípidos se determina comúnmente por métodos de extracción con disolventes orgánicos (por ejemplo Soxhlet, Goldfish, Mojonnier), sin embargo también puede cuantificarse por métodos de extracción que no incluyen disolventes (por ejemplo, Babcock, Gerber) y por métodos instrumentales que se basan en propiedades físicas o químicas de los lípidos (por ejemplo, infrarrojo, densidad y absorción es rayos X) Peso específico Se define como la relación de la velocidad de la luz en el aire (técnicamente un vacío) con respecto a la velocidad de la luz en el aceite. Se obtiene midiendo directamente en un refractómetro a 20-25ºC para los aceites y a 40ºC para las grasas. Índice de refracción El método químico de Liebermann-Burchard para la determinación de colesterol en una muestra lipídica se basa en el desarrollo de una coloración verde en presencia de anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado con temperatura, después de 30 min de reacción. La intensidad de la coloración es medida por absorción en el espectrofotómetro a 620 nm. La intensidad tiene una relación lineal con la concentración de colesterol entre 100 y 600μg, se debe realizar una solución control de
colesterol de diferentes concentraciones para realizar una comparación. El ciclo del glioxilato, una variación del ciclo del ácido tricarboxílico, es una vía anabólica que ocurren en plantas, bacterias, protistas, y hongos. Los centros del ciclo de glioxilato en la conversión de acetil-CoA en succinato para la síntesis de hidratos de carbono. En los microorganismos, el ciclo del glioxilato permite que las células utilicen compuestos de carbono simples como fuente de carbono cuando las fuentes complejas, tales como la glucosa no están disponibles. El ciclo se asume generalmente para estar ausente en los animales, con la excepción de los nematodos en las primeras etapas de la embriogénesis. En los últimos años, sin embargo, la detección de la malato sintasa y la isocitrato liasa, enzimas clave implicadas en el ciclo gyloxylate, en algunos tejidos animales ha planteado preguntas respecto a la relación evolutiva de las enzimas en bacterias y animales, y sugiere que los animales codifican enzimas alternativas del ciclo que difieren en función del conocido MS y ICL en especies no metazoos. Son tres las enzimas del ciclo que sustentan la regulación de la velocidad del mismo: 1 - Citrato sintasa: ésta como primera enzima de la ruta es un punto importante de control. Soporta retroinhibición por succinil-CoA y NADH 2 - Isocitrato deshidrogenasa (alostérica): estimulada por baja carga energética celular, ADP. 3 − α -cetoglutarato deshidrogenasa (alostérica): complejo enzimático de estructura y mecanismo análogos a los de la piruvato deshidrogenasa y actúa con idénticas coenzimas y el mismo mecanismo. Inhibida por NADH y succinil-CoA. El flujo de metabolitos a través del ciclo del ácido cítrico puede estar limitado por la disponibilidad de sustratos: - oxalacetato y acetil-CoA - por niveles bajos de NAD+, que enlentecen los tres pasos oxidativos en
los que interviene como cofactor. - La velocidad de oxidación de fragmentos dicarbonados (acetilCoA) por el ciclo también se reduce cuando la célula tiene una alta carga energética, es decir alta concentración de ATP, y cuando hay baja concentración o ausencia de O2.
La germinación de la semilla y el establecimiento de plántula son fases críticas en el ciclo de vida de las plantas y son influenciadas por la cantidad de reservas acumuladas y la eficiencia para usarlas. Las semillas varían en su capacidad para movilizar las reservas. La germinación involucra división, expansión y diferenciación celular; se activan diversas vías metabólicas y de transducción de señales (Bethke et al., 1998; Tnani et al., 2012). Los niveles de azúcar y almidón en la semilla durante la germinación deben estar regulados para asegurar un buen aporte de materiales y energía al embrión y controlar la distribución de agua en los tejidos en expansión (Melo et al., 2009). Se ha reportado que los micronutrientes que escapan de la semilla durante la imbibición son reabsorbidos y su movilización depende de la tasa de crecimiento de la plántula, solubilidad de los mismos y concentración de estos en la solución que rodea a la semilla (Bityutskii et al., 2001; Melo et al., 2009). La presencia de compuestos en la cubierta de la semilla, como los flavonoides, disminuyen la pérdida de solutos, además de ser una barrera contra hongos y tener efecto antimicrobiano (Angelovici et al., 2010). Las semillas ricas en lípidos tienen, generalmente, altas tasas de movilización de reservas; la degradación de estas ocurre generalmente después de protruir la radícula y son convertidas en almidón o carbohidratos solubles; las proteínas asociadas a los cuerpos lipídicos también son degradadas (Tnani et al., 2012). Además, el catabolismo de los lípidos promueve mayor rendimiento de ATP. Los lípidos neutros que se degradan pueden usarse para la síntesis de lípidos polares, utilizados en la formación de membranas celulares (Melo et al., 2009). Algunas especies de árboles con semillas ricas en aceite, generan plántulas con baja tasa de crecimiento; en cambio, otras especies ricas en carbohidratos, como las Acacias, tienen altas tasas de crecimiento (Soriano et al., 2011). La mayor tasa de germinación correlaciona con las semillas que muestran mayor actividad de la enzima glutamina sintetasa (GS). El tamaño de semilla puede ser uno de los factores que controla la eficiencia de la germinación. Las líneas de maíz con menor tamaño de semilla tienen mayor eficiencia de germinación (Limami et al., 2002). La temperatura ambiental afecta el tamaño del grano de maíz: altas temperaturas disminuyen el período de llenado de grano y peso individual (Vázquez Carrillo et al., 2012) Las semillas de mayor tamaño producen plántulas más grandes, capaces de emerger a mayor profundidad de siembra y tienen una tasa mayor de crecimiento de la radícula. Las semillas que contienen más nitrógeno les permite, aparentemente, una movilización más rápida de las re servas (Soriano et al., 2011). La síntesis de novo de proteasas e hidrolasas de pared celular, es requerida para la protrusión de la radícula (Dogra et al., 2013); otros eventos, como la oxidación de puentes disulfuro de enzimas, ya presentes en la semilla, pueden ser importantes para la regulación metabólica durante la germinación; se han reportado modificaciones postraduccionales en las proteínas durante la germinación, como oxidación, desaminación, acetilación e isoformas truncas (Angelovici et al., 2010; Tnani et al., 2012). En trigo, se han detectado dos proteasas, WAP1 y WAP2, que se expresan en la capa de aleurona y se propone que algunas de las enzimas sintetizadas allí, podrían ser enviadas al endospermo para degradar las proteínas de almacenamiento. También se propone que estarían involucradas en el crecimiento de la radícula y la plántula durante la germinación (Tamura et al., 2007). En un análisis proteómico se encontraron 113 proteínas expresadas de manera diferencial entre semillas no germinadas y germinadas; muchas de ellas están involucradas en el metabolismo de carbohidratos y aminoácidos, señalización ABA/AG y respuesta al estrés (Dogra et al., 2013). Otros investigadores han observado que las semillas de maíz que tardan más en germinar tienden a
producir un mayor número de plántulas anormales. El deterioro de la semilla provoca un retraso en la germinación en diferentes procesos, desde la imbibición y primeros signos de germinación, hasta el estadio de la cuarta hoja (Khajeh-Hosseini et al., 2009). Las que tienen mayor vigor producen plántulas con mayor peso seco y altura, el vigor es afectado por factores como nutrición de la planta madre, daños mecánicos e infección por patógenos como Fusarium verticillioides. La permeabilidad alterada de las membranas celulares y la producción de ácidos grasos libres, impiden la reactivación eficiente del crecimiento del embrión. El envejecimiento natural de las semillas de maíz disminuye progresivamente la capacidad germinativa, la velocidad de crecimiento de la plántula y tolerancia a condiciones adversas (GutiérrezHernández et al., 2007). La composición de los materiales de reserva de la semilla varían en relación a las condiciones ambientales experimentadas por la planta madre; éstas son capaces de proveer selectivamente de recursos a su descendencia, abortar semillas o producir semillas más pequeñas. El origen del polen también influye sobre el tamaño del embrión, es decir, hay un efecto paterno. La sequía afecta el llenado del grano y su efecto se muestra desde la antesis. El programa epigenético es sensible a influencias ambientales y las modificaciones sufridas a este nivel pueden pasar a través de múltiples generaciones (Diggle et al., 2010; Dolferus et al., 2011; Soriano et al., 2011). La absorción y pérdida de agua por la semilla son importante para el desarrollo de ésta e influye en el peso final de la misma. Durante la fase de desecación de la semilla se acumulan azúcares como sacarosa, rafinosa, galactinol, trehalosa, intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, algunos aminoácidos y ácidos grasos libres (Borrás et al., 2003; Harrigan et al., 2007; Angelovici et al., 2010). Tradicionalmente, se han seleccionado materiales precoces para regiones donde la escases de la lluvia demanda plantas de ciclo corto; las de ciclo largo se siembran donde las lluvias son abundantes y duraderas, aunque un mismo productor puede sembrar dos o tres materiales distintos para tener elotes y maíz en diferentes tiempos o asegurar algo de cosecha si el temporal es escaso. En ésta investigación se cuantificó la cantidad de lípidos, carbohidratos y proteínas que se extraen de la semilla de maíz antes de la imbibición, cuando la radícula protruye y en el momento de aparición del epicótilo; se usaron para esto tres genotipos de maíz nativo: un precoz, uno de ciclo intermedio y otro de ciclo tardío. METODOS DE EXTRACCION DIRECTA CON DISOLVENTES: El contenido en lípidos libres, los cuales consisten fundamentalmente de grasas neutras (triglicéridos) y de ácidos grasos libres, se puede determinar en forma conveniente en los alimentos por extracción del material seco y reducido a polvo con una fracción ligera del petróleo o con éter dietílico en un aparato de extracción continua. Se dispone de éstos en numerosos diseños, pero básicamente son de dos tipos. El tipo Bolton o Bailey-Walker dá una extracción continua debido al goteo del disolvente que se condensa sobre la muestra contenida en un dedal que es un filtro poroso, alrededor del cual pasa el vapor caliente del disolvente. El t ipo Soxhlet dá una extracción intermitente con un exceso de disolvente reciente condensado. La eficiencia de estos métodos depende tanto del pre-tratamiento de la muestra como de la selección del disolvente. Harrison (1939) investigó el uso de varios disolventes sobre la harina de pescado. Encontró que el material extraído aumenta con la polaridad del disolvente de 9 % usando éter de petróleo cambiando a hexano, heptano, éter dietílico, disulfuro de carbono, ciclohexano, benceno, cloruro de metileno, tricloroetileno, cloroformo y acetona hasta casi el 16 % con dioxano. La extracción completa de la grasa neutra es estorbada por la presencia de cantidades elevadas de sustancias solubles en agua como carbohidratos, glicerol y ácido láctico. El analizador de grasas de Foss-Let es un instrumento diseñado para extraer la grasa de las semillas oleaginosas
triturando y extrayéndolas con tricloroetileno. El disolvente se filtra rápidamente a un dispositivo medidor que contiene un flotador controlado por un campo magnético ajustable, calibrado para el contenido en grasas. El ajuste del campo hasta que asciende el flotador dá una indicación sensible de la concentración en grasas. Pettinati y Swift (1977) han informado sobre un estudio colaborativo de la determinación de grasa en productos de carne por las técnicas de Foss-Let y de extracción continua. Encontraron que el método de Foss-Let muestra una exactitud y precisión equivalentes al método oficial de la AOAC y es muy rápido (7-10 minutos). Un procedimiento útil para la extracción de grasas de alimentos húmedos y semisólidos, que impiden el desecado inicial, es mezclar la muestra con sulfato de calcio, sulfato de sodio anhidro o con vermiculita. Cuando la muestra se hace pulverulenta y seca, se transfiere a un c artucho de Soxhlet en un aparato de extracción. METODOS DE EXTRACCION POR SOLUBILIZACION: Los lípidos asociados pueden ser liberados si la muestra del alimento se disuelve completamente antes de hacer la extracción con disolventes polares. La disolución del alimento se puede lograr por hidrólisis ácida o alcalina. En el método ácido (proceso de Werner-Schmidt) el material es calentado en baño de agua hirviente con ácido clorhídrico para romper las proteínas y separar la grasa como una capa que flota sobre el líquido ácido. La concentración del ácido durante la extracción debe ser aproximadamente 6M, por ejemplo, 10 gr de leche se tratan con 10 ml. de ácido concentrado ó 1 a 2 gr de alimento sólido se mezcla con 8 a 9 ml de agua y 10 ml de ácido. Las proteínas se disuelven en el ácido y la grasa que se separa puede ser extraída por agitación, cuando menos tres veces, con éter dietílico o con una mezcla de éter dietílico y petróleo ligero. En alimentos como la leche deshidratada y queso procesado es aconsejable el tratamiento del tratamiento original con amoníaco antes de adicionar el ácido. Si el material que se analiza contiene una elevada proporción de azúcares, el método de extracción ácida es menos aconsejable que el método alcalino. El éter dietílico tiende a coextraer algún material no-lípido, por lo que los lípidos extraídos y pesados en el extracto seco necesitan ser eliminados cuidadosamente con éter de petróleo y el residuo no-lípido se vuelve a secar y pesarse para dar por diferencia, el contenido de grasa total en la muestra. La hidrólisis ácida tiende a descomponer los fosfolípidos, por lo cual la correlación con la extracción con cloroformo/metanol puede ser pobre en algunos alimentos. En la disolución usando álcali (método de Rose-Gottlieb), el material se trata con amoníaco y alcohol en frío y la grasa se extrae con una mezcla de éter y petróleo ligero. El alcohol precipita las proteínas que se disuelven en el amoníaco; entonces las grasas pueden ser extraídas con éter. El petróleo ligero es entonces adicionado ya que reduce la proporción de agua y consecuentemente también las sustancias no grasas solubles, tales como la l actosa en el extracto. La extracción alcalina da resultados muy exactos, lo que hace que la técnica sea muy recomendable. METODOS VOLUMETRICOS Estos consisten en disolver la muestra en ácido sulfúrico y separar la grasa por centrifugación en tubos de vidrio calibrados especialmente. En los EUA se usa el método de Badcock (véase libro de métodos de la AOAC) y en los países europeos el método de Ge rber es el usado comúnmente en
las determinaciones de rutina de grasa en leche y en productos lácteos. Para ciertos alimentos, en particular los no lácteos, se obtiene una separación más limpia si se usa una mezcla de los ácidos acético y perclórico en lugar del ácido sulfúrico.
Referencias Robert K. 1988. Harper Bioquímica Ilustrada. Editorial: El manual moderno. México Df.
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