Genética Bacteriana
Gloria Levicán 2009
Desarrollo de mutantes resistentes a antibióticos dentro de la zona de inhibición.
Mutantes
MUTACIONES • Cambios heredables en la secuencia nucleotídica del DNA • Dan cuenta de la evolución
TIPOS DE MUTACIONES Y SUS EFECTOS • Genotipo • Fenotipo • Las mutaciones cambian el genotipo y no necesariamente se reflejan en el fenotipo
Los cambios heredables del DNA se pueden originar por: - Mutaciones (cambios puntuales) - Pérdida / adquisición de genes
MUTACIÓN PUNTUAL • cambio de una base • cambia un codón en el mRNA • puede o no cambiar el aminoácido en la proteína
Mutaciones puntuales: Posibilidades Tyrosine
Inserciones o deleciones generan un cambio de fase en el gen (Desfase).
Dos tipos de mutaciones • No seleccionable: Ej. pérdida de color en una cepa pigmentada – no tienen ventajas ni desventajas frente a la cepa silvestre – estas cepas se deben detectar analizando grandes poblaciones (screening)
• Seleccionable: Ej. resistencia a un antibiótico – la mutación le confiere cierta ventaja bajo condiciones específicas, de modo que el crecimiento de la mutante en esas condiciones es mejor que el de la cepa silvestre – estas cepas se detectan por selección
Mutantes nutricionales • Mutantes que requieren aminoácidos o factores de crecimiento: se enriquecen mediante el método de selección con penicilina, es un método de selección negativa o contra-selección • se detectan por réplica en placa • auxótrofo • protótrofo
Selección de mutantes auxótrofos
Mutantes nutricionales
+ leucina
- leucina
Las mutaciones pueden revertir y el fenotipo silvestre puede restaurarse
Revertiente: cepa en la que se restaura el fenotipo silvestre 1. Revertiente verdaderas:
2. Revertientes supresoras: Ej. Recuperación del marco de lectura en el gen
MUTACIONES ESPONTÁNEAS • Son eventos al azar, no se puede predecir cuándo ocurrirán ni qué genes afectará • Ocurren con una frecuencia de 10-7 a 10-11, por par de bases durante un ciclo replicativo • Un gen típico de 1000 bases tiene una frecuencia de mutación de 10-4 a 10-8 por generación • En un cultivo con 108 células por mL habrá un número de mutantes por cada mL de cultivo • Mutaciones sin sentido: 10-6 a 10-8
MUTACIONES INDUCIDAS • Producidas por agentes mutágenos que aumentan la velocidad de mutación • Los mutágenos químicos actúan a nivel molecular y pueden ser: – – – –
análogos de bases: agentes alquilantes: agentes deaminantes derivados de acridina
Sustituciones AT a GC
Complementa con G
Sustituciones AT a GC
Complementa con C
Radiación como mutágeno • Ultravioleta: – Afecta sólo la piel por su baja energía de penetración, pero tiene un gran efecto sobre los microorganismos. – Produce dímeros de 2 pirimidinas adyacentes, 2T, 2C 1T1C. Se produce un espacio que no se aparea con la hebra complementaria, deteniéndose la transcripción
• Rayos X y γ : – tienen más energía, rompen fácilmente enlaces químicos, produciendo radicales libres que pueden atacar el DNA
Generación de dímeros de timina por la radiación UV
El efecto de la luz UV puede ser aprovechado para la obtención de mutantes en el laboratorio.
Reparación del DNA dañado • Fotoreactivación: – se reparan los dímeros. La enzima se activa con la luz.
• Reparación en la oscuridad: – – – –
una endonucleasa corta el DNA dañado la DNA pol sintetiza el DNA nuevo una exonucleasa remueve el segmento dañado una ligasa los une
Mecanismos de respuesta SOS
Estudio de las mutaciones
• Espontáneo o inducido por un compuesto?
Test de fluctuación • Diseñado por Salvador Luria y Max Delbruck en 1943 (Luria and Delbruck. 1943. Genetics 28: 491-511)
Usaron E. coli que se hacía resistente al fago T1
Test de fluctuación • Hipótesis primaria: si las mutaciones que confieren resistencia ocurren espontáneamente y al azar, se esperaría encontrar una gran fluctuación en el número de m.o. resistentes por cultivo entre un gran número de cultivos. Esto debería ocurrir sin importar la presencia de la sustancia a la cual se hacen resistentes
Test de fluctuación • Hipótesis secundaria: Mutaciones que confieren resistencia ocurren solo en la presencia de la sustancia. De modo que los cultivos con la sustancia tendrían un número igual de m.o. resistentes, mientras los cultivos sin la sustancia no tendrían m.o. resistentes
TÉCNICA DE PLAQUEO EN RÉPLICA • Diseñado por Joshua y Esther Lederberg en 1952 • el m.o. se crece en un tubo en medio líquido • se siembra en muchas placas, se incuban 4 a 5 h • se realizan réplicas en una placa que contiene penicilina • aparecen colonias resistentes sin haber estado expuestas previamente al antibiótico
Test de Ames: Para evaluar la mutagenicidad de un compuesto
Filtro sin el compuesto (control -)
Filtro con el compuesto
Diseño típico del Test de Ames
Usualmente se usan cepas de Salmonella auxótrofas de histinas o E. coli auxótrofa de triptófano.
Otras fuentes de variabilidad genética: Transferencia lateral de genes
1. Transformación 2. Transducción 3. Conjugación
TRANSFORMACIÓN El DNA libre se incorpora en una célula receptora, lo que lleva a un cambio genético
Transformación genética: es la adquisición de un trozo de DNA desde el ambiente
Captación del DNA durante la transformación en una bacteria Gram positiva
• La recombinación homóloga ocurre después de la transferencia, es decir, cuando el DNA de la célula dadora está dentro de la célula receptora • Si no se produce recombinación, se pierde el fragmento, porque no puede replicarse independientemente • La detección del intercambio físico de segmentos de DNA se puede hacer sólo si las células tienen fenotipos distintos.
La transformación genética puede ser demostrada experimentalmente.
• Muchas bacterias son transformables en forma natural, tanto Gram + como Gram – e incluso Archae. Pero sólo algunas cepas dentro de esos grupos. • Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Thermus • El DNA cuando se libera se fragmenta en trozos de 15 kb • Un gen tiene aprox. 1000 bases, por lo que teóricamente un fragmento tendría 15 genes • Para que una célula acepte un DNA debe estar en un estado de competencia
• Células que son naturalmente transformables tienen una regulación del estado de competencia • Proteínas de membrana de unión de DNA, autolisinas de pared, nucleasas
Bacillus subtilis • las proteínas relacionadas con la competencia son parte de un sistema de “quorum sensing”, sistema que responde al número de células presente • las células producen y excretan un pequeño péptido durante el crecimiento y se hacen competentes a altas concentraciones del péptido • actúa ComP, una kinasa sensora, y ComA, una proteína reguladora de la respuesta • ComA es una proteína activadora que regula varios genes que afectan la transformación • cerca del 20% de las células se hacen competentes y permanecen en ese estado por varias horas • Bacillus acepta DNA de una hebra
Streptococcus pneumoniae • Streptococcus se hacen competentes el 100% de las células • Streptococcus acepta DNA de una hebra • cada célula de Streptococcus une 10 moléculas de DNA bacteriano de 15.000 – 20.000 pb c/u. A medida que van entrando se convierten en moléculas de una hebra de 8.000 bases • El DNA transformante es unido en la superficie celular por una proteína de unión al DNA y el fragmento de 2 hebras es captado por la célula por una nucleasa la que degrada una cadena y la otra es incorporada • Una vez dentro, el DNA se asocia a proteínas específicas de competencia que lo protegen de las nucleasas. Cuando llega al cromosoma, estas proteínas son sustituidas por la proteína RecA • El DNA se integra al cromosoma mediante procesos de recombinación
Haemophilus influenzae • sólo acepta DNA de doble hebra • el DNA debe tener una secuencia de 11 pb que se encuentra con una alta frecuencia en el cromosoma de Haemophilus, por lo tanto acepta DNA homólogo
Transformación artificial
Transformación artificial • E. coli • consiste en tratar las células con altas concentraciones de iones Ca y mantenerla en frío • bajo rendimiento para DNA cromosómico lineal • alto rendimiento para DNA plasmidial • el tratamiento con Ca también funciona con otras bacterias G-
Electroporación • se exponen las membranas a campos eléctricos pulsantes formando pequeños poros • el DNA presente puede entrar por los poros • pulsos de milisegundos (fuente de energía sofisticada = electroporador) • permite la entrada como también la salida de DNA
Características de la transformación • el DNA se encuentra en solución • los fragmentos compiten entre sí, por lo que es saturable • la frecuencia máxima de transformación es de un 20% de la población • los valores normales van desde 0,1 a 1,0% • concentración mínima de DNA es 0,00001 g/mL ó 1x10-5 g/mL ó 1x10-2 µ g/mL ó 10 ng/mL
