Carbohidratos totales de acuerdo a la técnica de Dubois

Facultad de Ingeniería Química Química de Alimentos Práctica 1:

“Carbohidratos Totales de acuerdo a la Técnica de Dubois”

Profesor: D en C. Santiago Gallegos Tintoré Equipo 2: Benitez Samantha I.Q.I. Castaldi Molina Erika Q.I. Guillén Alejandra I.Q.I. Luis Ferraez Q.I. Obed Navarrete I.Q.I.

Séptimo semestre

Fecha de realización:

Fecha de entrega:

23 de septiembre de 2013

30 de septiembre de 2013

Práctica 1

30 de septiembre del 2013

“CARBOHIDRATOS TOTALES DE ACUERDO A LA TÉCNICA DE DUBOIS” Benitez, S.; Cataldi, E.; Guillén, A.; Ferraez, L. y Navarrete, O. I.

Resumen:

En el presente trabajo se llevó a cabo la determinación de glucosa en miel natural proporcionada por el laboratorio de análisis sensorial de la Facultad de Ingeniería Química, con el propósito de identificar y cuantificar carbohidratos utilizando la técnica de Dubois. Esta técnica consiste en realizar a la muestra de carbohidratos una deshidrogenación seguida de una catálisis ácida utilizando como reactivos fenol y ácido sulfúrico concentrado para formar compuestos heterocíclicos coloridos que son derivados del furano, por lo que al presentar color se pueden analizar mediante espectrofotometría UV a una longitud de onda de 492 nm. Para el tratamiento de la muestra se realizó una solución madre y posteriormente una dilución debido a que las concentraciones de glucosa podrían ser elevadas. Previamente se realizó una curva de calibración con un stock de glucosa y a partir de la ecuación de la recta y las absorbancias obtenidas para las muestras, se procedió a la cuantificación de glucosa presente en la muestra de miel. Los resultados obtenidos mostraron que la miel presenta una concentración de 10.309 g de glucosa por cada 100 g de muestra lo que se encuentra dentro de los límites permisibles de la Norma Mexicana para Miel. II.

Introducción:

La miel es un alimento energético elaborado por las abejas que se conoce desde hace mucho tiempo. Es energético por su contenido en azúcares simples, que son asimilados rápidamente por el organismo, contribuyendo al mantenimiento del esqueleto (calcio) y a la regeneración de la sangre (hierro). Su valor energético y su fácil digestión son vitales para la actividad física y mental, por su fácil asimilación (Quintáns Riveiro, 2008). Se entiende como miel "la sustancia natural dulce producida por la abeja Apis mellifera a partir del néctar de plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores presentes en las partes vivas de plantas, que las abejas recolectan, transforman, combinándolas con sustancias específicas propias, depositan, deshidratan, almacenan y dejan en colmenas para que maduren, Este proceso alimenticio puede ser fluido, espeso o cristalino" (Quintáns Riveiro, 2008). ¿Qué tipo de carbohidratos contiene la miel de abeja? Como se puede percibir de la tabla1, los tipos de carbohidratos contenidos en la miel de abeja, se encuentra compuesta mayormente de azúcares (75.1g%). Son estos azúcares los que imparten a la miel las características físico-químicas principales como; viscosidad, higroscopicidad, granulación, valor energético (White, et al., 1962) . Carbohidratos Azúcar

Química de Alimentos

Cantidad

Carbohidratos

Cantidad

75,10 g.

Lactosa

0 g.

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Práctica 1

30 de septiembre del 2013 Fructosa

38,80 g.

Maltosa

0 g.

Galactosa

0 g.

Oligosacaridos

0 g.

Glucosa

33,90 g.

Sacarosa

2,37 g.

Tabla 1. Contenido promedio de carbohidratos que contiene la miel.

¿Qué medidas de seguridad deben tomarse en consideración para la realización de este análisis de laboratorio? Hay que tomar en cuenta el manejo de la muestra para evitar que esta se infecte, mantener calibrado los instrumentos para obtener medias lo más precisas posible y tener un equipo adecuado para el manejo del H2SO4 (Nielsen, 2003). III. Antecedentes En alimentos para determinar carbohidratos totales, como azucares, carbohidratos complejos y fibra, usa el método colorimétrico del fenol-sulfúrico, que produce un color naranja muy estable cuando reacciona con fenol y en presencia de ácido sulfúrico concentrado. Este método propuesto por Michel Dubois en 1956 se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas (Dubois, et al., 1956). Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol. Este método es fácil, eficaz y rápido. Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que éstos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos (Fennema, 1993). Es posible evidenciarlo en un fotómetro, donde se utiliza un haz de luz enfocando para penetrar el elemento del procesado. La alteración de la intensidad de la luz, causada por la absorción y/o difusión está explicada en la Ley Lambert-Beer. Es un medio matemático de expresar cómo la materia absorbe la luz. Sólo sirve para variaciones monocromáticas, y dice que la absorbancia que se produce en un determinado medio es proporcional a la concentración del mismo. Cuando se quiere calcular la concentración de una muestra midiendo la absorbancia de la misma se realiza una recta de calibrado a una determinada. Esta relación puede ser expresada como: A = εdc, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente molar de extinción, d distancia en cm, y c concentración molar. La intensidad del color en la aplicabilidad de la ley es proporcional a la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra. Esta absorbancia puede ser medida a 492 nm y la concentración total de carbohidratos de la solución problema puede ser medida con respecto a una curva estándar preparada (curva de calibrado) (Harvey, 2002). Esta curva estándar se obtiene al diluir sucesivamente la muestra de glucosa que se quiere, graficando la concentración conocida (eje x) contra el valor de la absorbancia medido (eje Química de Alimentos

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Práctica 1


y), si la curva de calibrado es correcta, el coeficiente de correlación dará un valor aproximado de 1, debido a que este mide la fortaleza relativa de una relación lineal entre dos variables (Quesada Mora, 2007) (Berenson, et al., 2006). IV.

Objetivo.

AL finalizar la práctica, el alumno cuantificará el contenido total de carbohidratos en una muestra de alimentos. V.

Materiales, Equipos y Reactivos.

Reactivos  Estándar de Glucosa 0.4mg/ml  Fenol 5%  Muestra de miel 1mg/ml  H2So4 concentrado

Equipo 1 Baño de agua caliente 1 Espectrofotómetro

Materiales 2 Gradilla para tubo de ensaye 4 Matraz de 250ml 1 Micropipeta 20-100 1 Micropipeta 100-1000 1 Pizeta

1 Pipeta 5ml 1 Pipeta 1ml 1 Pipetor 20 Tubos de ensayo 1 Vaso Precipitado 250ml

VI.

Metodología.  Preparación de la muestra. 1. Realizar la disolución de la muestra, pesar y agregar 0.250 g de miel de abeja al vaso de precipitado y agitar para homogenizar, luego verter en l matraz volumétrico de 250ml y aforar con agua destilada. 2. Tomar una muestra de 25ml de matraz aforado y agregarlo en otro matraz de 250ml y aforar con agua destilada.  Preparación de la curva de calibración 1. Preparar la curva de calibración como se muestra a continuación.


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Práctica 1


N° Dilución

1 (blanco)

2

3

4

5

6

7

8

9

Stock de glucosa (µl)

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Agua Destilada (µl)

1000

975

950

925

900

875

850

825

800

Concentración de glucosa (µl/ml)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Tabla 2. Cantidades necesarias para preparar los estándares a las concentraciones indicadas.

2. Realizar la curva de calibración por duplicado. 3. A dos tubos de ensayo añadir 1 ml de la muestra. 4. En otros tubos de ensayo añadir la cantidad de stock de glucosa y agua destilada mostradas en la Tabla 2. 5. A cada tubo de ensayo añadirle 0.5ml de fenol 5% y de forma rápida y con precaución 2.5ml de ácido sulfúrico concentrado, mezclar y dejar reposar durante 15minutos a temperatura ambiente. 6. Colocar los tubos de ensayo a baño María a 30°C por 15min. 7. Determinar las absorbancias a una longitud de onda de 492nm. 8. Determinar la concentración de glucosa en la muestra (eje x) empleando la ecuación de la recta y =a+bx obtenida a partir de la curva de estándar. VII.

Resultados y Discusiones.

La muestra de miel fue proporcionada por el laboratorio de sensorial de la Facultad de Ingeniería Química. En la tabla 3 se presentan las absorbancias correspondientes que se obtuvieron para cada uno de los estándares de ambas curvas, y el valor promedio de cada una de las absorbancias de los estándares. Posteriormente se muestra la curva de calibración corregida, que se obtuvo evaluando únicamente los primeros cuatro puntos de la curva debido a que a partir del estándar 5 las concentraciones son muy elevadas y afectan la correlación de la curva de calibración. Estándar 1 2 3 4 5 6

Concentración (μg/mL) 0 10 20 30 40 50


Curva 1 Absorbancia (nm) 0 1.366 2.276 3.064 3.08 3.181

Curva 2 Absorbancia (nm) 0 1.529 2.644 3.133 3.103 3.218

Absorbancias promedio 0 1.4475 2.46 3.0985 3.0915 3.1995

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Práctica 1

30 de septiembre del 2013 7 8 9

60 70 80

3.153 3.486 3.312

3.266 3.262 3.262

3.2095 3.374 3.287

Tabla 3 Concentraciones, absorbancias y absorbancias promedio para cada estándar.

Absorbancias (nm)

Curva de Calibración de Glucosa Corregida y = 0.1031x + 0.2053 R² = 0.9701

4 3

4 primeros estándares

2 1

Linear (4 primeros estándares)

0 0

10

20

30

40

Concentración de glucosa en ppm Tabla 4 Curva de Calibración para los primeros cuatro estándares.

Muestra

Absorbancia (nm)

Concentración

M1 M2 Promedio

1.332 1.485 1.4085

10.928 12.4122 11.6701

Tabla 5. Absorbancias y concentraciones de cada muestra

En la Tabla 5 se encuentran registradas las absorbancias que se obtuvieron para cada muestra. Por método de mínimos cuadrados se determinó la ecuación de la recta de regresión como: y=0.1031x + 0.2053 Con y=Absorbancia y x=Concentración.  Muestra 1 Despejando X, para interpolar la concentración de la muestra se obtiene el valor de:


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Práctica 1


 Muestra 2 Despejando X, para interpolar la concentración de la muestra se obtiene el valor de:



Promedio de la muestra 1 y 2: (

)

La concentración promedio de glucosa que se obtuvo para las muestras fue de 11.6701

;

tomando en cuenta que la muestra se encontraba diluida se realizarán los cálculos necesarios para saber la concentración de glucosa en la muestra original. Primero se determina la concentración de glucosa que hay en la solución de 250 ml a partir de 1 ml de muestra que se analizó. 11.6701 μg en 1 ml de muestra tomada de la muestra diluida a 250 ml. 1ml se solución → 11.6701 μg de glucosa 250 ml de solución → x x = 2917.525 μg glucosa en los 250 ml de la disolución. Ahora determinamos la cantidad de glucosa en la muestra aforada a 250 ml. Como se tomaron 25 ml de la solución madre de miel y se diluyeron a 250, se considera que la cantidad de glucosa que hay en los 250 ml de disolución es igual a la cantidad que hay en los 25 ml tomados de la solución madre, por lo tanto: 25 ml de solución madre → 2917.525 μg de Glucosa 250 ml de solución madre → x x= 29175.25 μg de glucosa en la muestra de miel. Por lo tanto la solución madre preparada contenía 29175.25 μg de glucosa. Para poder comparar con la norma se realizaron las conversiones pertinentes para obtener la concentración de glucosa en gramos. Química de Alimentos

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Práctica 1

30 de septiembre del 2013 1000 μg → 1 mg 29175.25 μg →x X= 29.17525 mg de glucosa

0.283 g de muestra hay → 27.17525 mg de glucosa 100 g de muestra → x x= 10309.25795 mg de glucosa x= 10.309 g de glucosa por cada 100 gramos de muestra. Así se obtiene finalmente que la concentración de glucosa en la muestra de miel es de 10.309g de glucosa por cada 100 gramos de miel. . De acuerdo a los valores de la Tabla 3, para la recta de regresión se obtuvo una correlación de 0.9701, lo cual nos indica que los estándares no están lo suficientemente relacionados entre sí y no poseen un ajuste a la tendencia lineal aceptable. Concentración promedio de glucosa en la muestra de miel (g/100 g) 10.309

Máximo establecido (g/ 100 g)

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Tabla 6. Comparación de la concentración obtenida para la muestra con la cantidad máxima establecida en la NMX-F-036-981.

El análisis demostró que la cantidad de glucosa que posee la muestra de miel analizada fue de 10.309 g/100 g, es decir un 10.309 %, lo cual al compararlo con la norma mexicana (NMX-F-036-981) la cual establece que la cantidad máxima permitida de glucosa en una miel natural es de 38 g/100 g, se determina que la miel analizada cumple con dicho parámetro. VIII. Observaciones  La muestra era desconocida por lo que no se sabe si es una muestra representativa o si se contamino y/o degrado durante su almacenamiento.  La diferencia de concentraciones obtenidas entre las muestras se pudo deber a que los materiales se encontraban sucios y a pesar de ser lavados no se logró deshacerse de la suciedad.  Debido a que los estándares presentaban concentraciones muy altas, se debió de proceder a realizar diluciones en la curva, pero debido a la falta de tiempo no se llevó a cabo.


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Práctica 1 IX.

30 de septiembre del 2013 Conclusiones.

Al término de la práctica se determinó que la concentración de glucosa (expresado como g/ 100 g) de la Miel proporcionada por el Laboratorio de Análisis Sensorial. Comparando los resultados obtenidos con el valor establecido como máximo permisible de glucosa en las Norma Mexicana NMX-F-036-981 se concluye que la miel cumple con lo establecido en dicha norma para el consumo humano.

X. Cuestionario. 1. ¿Cuál es el principio del método para la determinación del contenido de carbohidratos totales en un alimento? Este método propuesto por Dubois et al en 1956 se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensible a ácidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol. Este método es fácil, eficaz y rápido. Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que éstos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. La forma en que procede la reacción no es estequiométrica y depende de la estructura del azúcar, por lo tanto se realiza una curva patrón (White, et al., 1962). 2. Según con el resultado obtenido en el laboratorio para la muestra analizada, ¿éste difiere con respecto a la literatura? Si es así ¡Por qué? Debido a que no se conoce el lugar de origen de la muestra no se puede realizar una comparación verdadera con la literatura, sin embargo, basándose en la Norma Mexicana para la Miel de determina que la miel se encuentra dentro de los límites permitidos para el consumo humano (NMX-F-036-981, 2007).

3. ¿Qué medidas de seguridad deben tomarse en consideración para la realización de este análisis de laboratorio? Hay que tomar en cuenta el manejo de la muestra para evitar que esta se infecte, mantener calibrado los instrumentos para obtener medias lo más precisas posible y tener un equipo adecuado para el manejo del H2SO4 (Nielsen, 2003). 4. ¿Qué tipo de carbohidratos contiene la miel de abeja? Como se puede percibir de la tabla1, los tipos de carbohidratos contenidos en la


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Práctica 1


miel de abeja, se encuentra compuesta mayormente de azúcares (75.1g%). Son estos azúcares los que imparten a la miel las características físico-químicas principales como; viscosidad, higroscopicidad, granulación, valor energético (Dubois, et al., 1956)

Carbohidratos

Cantidad

Carbohidratos

Cantidad

Azúcar

75,10 g.

Lactosa

0 g.

Fructosa

38,80 g.

Maltosa

0 g.

Galactosa

0 g.

Oligosacaridos

0 g.

Glucosa

33,90 g.

Sacarosa

2,37 g.

5. ¿A qué se refiere el coeficiente de correlación y determinación de la curva estándar de glucosa? El coeficiente de correlación se utiliza para expresar la extensión o grado en el cual pares de variables o conjuntos de variables varían de modo concomitante. El coeficiente de correlación indica la fuerza (magnitud) y la dirección de la relación entre las variables. Generalmente, el valor del coeficiente de correlación varía en el rango de -1 hasta +1, pasando por 0. El valor r= -1 indica una perfecta relación inversa entre las variables; el valor r=+1 indica una perfecta relación directa entre las variables; y finalmente, r=0, indica que no existe una relación discernible entre las variables (Moncada Jiménez, 2005). Por lo tanto al obtener un coeficiente de correlación de 0.9701 se determina que la linearidad de los estándares no es apta para realizar un análisis certero, es decir que los estándares no se encuentran lo suficientemente relacionados entre sí como para poder utilizar la ecuación de la recta y determinar la concentración de la muestra problema. XI.

Referencias



Berenson, M. L., Levine, D. M. & Krehbiel, T. C., 2006. Estadística para administración. Miami: Pearson Education.



Dubois, M. y otros, 1956. Colorimetroc Method for Determination of Sugars and Related Substances. University of Minnesota, 28(3), pp. 350-356.



Fennema, O., 1993. Quimica de Alimentos. Segunda ed. España: Acribia.



Harvey, D., 2002. Química Analítica Moderna. Madrid, España.: McGraw Hill.



Moncada Jiménez, J., 2005. Estadística para ciencias del movimiento humano.


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Práctica 1


Primera ed. Costa Rica: Editorial de la Universidad de Costa Rica. 

Nielsen, S., 2003. Food Analysis Laboratory Manual. Nueva York: Kluwer Academic/Plenum Publishers.



NMX-F-036-981, 2007. MIEL DE ABEJA. ESPECIFICACIONES. NORMA MEXICANA. DIRECCION GENERAL DE NORMAS.. [En línea] Available at: http://www.economia-nmx.gob.mx/normasmx/consulta.nmx [Último acceso: 29 septiembre 2013].



Quesada Mora, S., 2007. Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica. Primera ed. Costa Rica: Universidad Estatal a Distancia.



Quintáns Riveiro, L. C., 2008. REOLOGÍA DE PRODUCTOS ALIMENTARIOS. Primera ed. Galicia, España: Universidad de Santiago de Compostela.



White, Riethof, Subers & Kushnir, 1962. Composición de la Miel de Abeja. s.l.:s.n.


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Carbohidratos totales de acuerdo a la técnica de Dubois

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