Caracterizare Si Identificare Flavonoide

CONTRACT 52-117/2008

CERCETARI COMPLEXE PRIVIND STABILIREA DE MARKERI BIOCHIMICI SPECIFICI PENTRU PRODUSE LACTATE REGIONALE IN VEDEREA IMBUNATATIRII TRASABILITATII ACESTORA PE LANTUL ALIMENTAR TOTAL (TRASAREG)

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA II – 15.12.2009

CONTRACT 52-117/2008 CERCETARI COMPLEXE PRIVIND STABILIREA DE MARKERI BIOCHIMICI SPECIFICI PENTRU PRODUSE LACTATE REGIONALE IN VEDEREA IMBUNATATIRII TRASABILITATII ACESTORA PE LANTUL ALIMENTAR TOTAL (TRASAREG)

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC ETAPA II – 15.12.2009 Cercetari preliminare privind elaborarea modelelor experimentale in vederea identificarii markerilor biochimici regionali care determina specificitatea regionala a laptelui.

Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG

Faza de execu Ńie nr. 2/15.12.2009/ PNII

CUPRINS Cuprins................................................................................................................................................... Obiective generale ale proiectului si obiectivele etapei …........................................... ........................ Rezumatul etapei de execu Ńie.................................................................................... ............................ Descrierea ştiinŃifică şi tehnică.............................................................................................................. A. Activitate II.1.1. – USAMV Bucuresti Model conceptual privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici de tip carotenoide, carotenoide, flavonoide sau terpene în plante………………………………………………………… 1. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip carotenoide…….......... carotenoide……................................ ................................ .......... 2. Metode de determinare a carotenoidelor…………………………………………………………… 2.1 Etapa de extracŃie.................................................................................................................... 2.2. Saponificarea……………………………………………………………………………….. 2.3. Analiza cromatografică …………………………………………………………………….. 2.4. Alte metode…………………………………………………………………………………. 3. Caracterizare generala a compusilor compusilor biochimici de tip flavonoide………………………………… flavonoide………………………………… 4. Metode de determinare a flavonoidelor……………………………………………………………. flavonoidelor……………………………………………………………. 4.1. Pregătirea probei……………………………………………………………………………. 4.2. Spectrometria de masă în analiza flavonoidelor……………………………………………. 4.3. Cromatografia de înaltă performanŃă pentru analiza flavonoidelor………………………… 4.4. Alte metode…………………………………………………………………………………. 5. Caracterizare generala a compusilor compusilor biochimici de tip terpene……………………………………. 6. Metode de determinare a terpenelor………………………………………………………………... 6.1. ExtracŃia probei şi concentrarea…………………………………………………………….. 6.2. Separarea cromatografică a constituienŃilor………………………………………………... 6.3. Detectarea şi caracterizarea constituien constituienŃilor………………………………………………... 7. Concluzii……………………………………………………………………………………. B. Activitate II.1.2. – ICDP Braş Braşov Stabilirea arealelor pastorale şi a tehnicilor de valorificare a paji ştilor; prelevarea şi condiŃionarea probelor de nutreŃuri şi de lapte din zona Blana Bucegi……………………………………………... 1. Rezumatul etapei…………………………………………………………………………………… 2. Prezentarea parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……………………………... 2.1. Faza I de utilizare a parcelelor parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……………... 2.2. Faza a II-a de utilizare a parcelelor parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi………… 2.3. Faza a III-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi………. 2.4. Faza a IV-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi……….. 3. Rezultate obtinute in cadrul experimentarilor realizate la Baza de Cercet ări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi……………………………………………………………………………... 3.1. Productia de substanta uscata……………………................................ uscata……………………......................................................... ................................. ........ 3.2. Productia de lapte …………………...................................... …………………................ .............................................. .............................................. .......................... C. Activitate II.1.3. – ICDCB Baloteş Baloteşti Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, preg pr egătirea cadrului experimental…………... 1. Rezumatul etapei…………………………………………………………………………………… 2. Descrierea Descrierea ştiinŃifică şi tehnică…………………………………………………………………….. 3. Evaluarea stării de sănătate a animalelor din loturi experimentale………………………………… 3.1. Materiale si metode…………………………………………………………………………. 3.2. Rezultate şi discuŃii…………………………………………………………………………. 4. Concluzii…………………………………………………………………………………………… Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

2

2 4 6 11 12 12 13 14 17 19 24 24 26 26 27 30 31 32 33 33 33 34 35 43 43 44 44 46 47 48 51 51 51 53 53 54 54 54 56 63



D. Activitate II.1.4. –IBA Bucuresti Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizat ă pentru selectarea şi determinarea markerilor biochimici - Cercetări preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) în produsele lactate…………………………………………………………………………………………………. Rezumatul etapei de execuŃie.................................................................................... ............................ 1. Caracterizarea generală a markerilor biochimici de tip carotenoizi .................................................. 1.1 Introducere.............................................................................................................................. 1.2 NoŃiuni generale despre markerii biochimici de tip carotenoizi............................................. 1.3 Efectele procesării asupra carotenoizilor................................................................................ 2. Identificarea markerilor biochimici in diverse tipuri de furaje......................................................... 2.1 ExistenŃa carotenoizilor în diverse tipuri de furaje................................................................ 3. Digestia, absorbŃia şi metabolizarea carotenoizilor........................................................................... 3.1 Digestia, absorbŃia şi metabolizarea carotenoizilor................................................................ 3.2 InfluenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra varia Ńiei concentraŃiei de markeri biochimici de tip carotenoizi în lapte...................................................................................... 3.3 Transferul carotenoizilor şi retinolului din laptele materie prim ă în produsele lactate.......... 3.4 InfluenŃa dintre carotenoizii din lapte şi proprietăŃile senzoriale ale produselor lactate........ 4. Metode experimentale de determinare a markerilor biochimici........................................................ 4.1 Proceduri generale de analiză a carotenoizilor....................................................................... 4.2 Separarea cromatografică....................................................................................................... 4.3 Identificarea carotenoizilor..................................... ............................................................... Concluzii ............................................................................................................................................... Bibliografie............................................................................................................................................ E. Activitate II.1.5. – IBNA Estimarea valorii nutritive a nutre Ńurilor şi elaborarea ra Ńiilor pentru vacile de lapte………………... 1. Rezumatul etapei…………………………………………………………………………. 2. ImportanŃa structurii ra Ńiei asupra digestiei ruminale şi a producŃiei…………………….. 3. Necesarul vacilor de lapte………………………………………………………………… 3.1. Necesarul de energie............................................................................................................ 3.2. Necesarul de proteină. ………………………… ………………........................................ 3.3. Exprimarea valorii proteice a nutreŃurilor în PDI………………………………………… 3.4. Etapele de determinare a valorii nutritive energetice a silozului de porumb……………... 4. Concluzii…………………………………………………………………………………………… Bibliografie……………………………………………………………………………………………

CONCLUZII………………………………………………………………………………...

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

3

66 66 69 69 71 77 81 81 84 84 86 88 89 89 89 90 94 106 108 109 109 111 111 111 112 112 114 119 119 120



OBIECTIVE GENERALE ALE PROIECTULUI Etapa 1: Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, pregatirea cadrului experimental. Etapa 2: Cercetari preliminare privind elaborarea modelelor experimentale in vederea identificarii markerilor biochimici regionali care determina specificitatea regionala a laptelui. Etapa 3: Studierea comparativa a influentei markerilor biochimici din plante asupra caracteristicilor fizico-chimice si senzoriale a produselor lactate din diferite zone geografice Etapa 4: Integrarea şi interpretarea rezultatelor. Transferul tehnologic al soluŃiilor propuse, promovarea rezultatelor. Identificarea si atribuirea drepturilor de proprietate intelectuala asupra rezultatelor. Intocmirea documentatiei pentru dobandirea protectiei unei indicatii geografice sau denumirea de origine a produselor lactate din regiunile luate in studiu.

OBIECTIVELE ETAPEI DE EXECUTIE Obiectiv general al etapei 2/ 15.12.2009 Cercetări preliminare privind elaborarea modelelor experimentale în vederea identificării markerilor biochimici regionali care determină specificitatea regională a laptelui. Activitate II.1

Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizată pentru selectarea şi determinarea markerilor biochimici. Activitate II.1.1. – USAMV Bucuresti

Cercetari preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) în plante.

Activitate II.1.2. – ICDP Brasov Stabilirea arealelor pastorale şi a tehnicilor de valorificare a pajiştilor; Prelevarea şi condiŃionarea probelor de nutreŃuri şi de lapte din zona Blana Bucegi. Activitate II.1.3. – ICDB Balotesti Evaluarea starii de sanatate a animalelor din loturi experimentale prin examene de profil metabolic in functie de modul de furajare (stabulatie/pasunat) Activitate II.1.4. –IBA Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

4



Cercetări preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) în produsele lactate.

Activitate II.1.5. – IBNA Estimarea valorii nutritive a nutreŃurilor şi elaborarea raŃiilor pentru vacile de lapte.


5



REZUMATUL ETAPEI DE EXECUTIE Prezentul raport stiintific si tehnic prezinta rezultatele obtinute in cadrul etapei 2/termen de predare 15.12.2009 , al carui obiectiv general are titlul „Cercetări preliminare privind elaborarea modelelor experimentale în vederea identific ării markerilor biochimici regionali care determin ă specificitatea regională a laptelui.” Rezultatele prezentate se refera la activitatile prezentate mai sus si realizate de catre partenerii consortiului din proiectul finantat prin contractul de finantare 52-117/ 1.10.2008. Prezentul raport este organizat in 5 parti (A,B,C,D,E) care corespund activitatilor prezentate in conformitate cu planul de realizare conform AA 2/2009 de catre partenerii din consortiul de realizare a proiectului. Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea referinŃelor bibliografice, legate de modele experimentale utilizate în identificarea markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate, de la furaje la lapte şi produse lactate, obŃinute din lapte de vacă. In acest sens, s-a realizat un studiu de documentare privind caracterizarea, din punct de vedere biochimic, a markerilor biochimici de tip carotenoizi, analiza criteriilor de clasificare a tipurilor de carotenoizi şi, nu în ultimul rând, importanŃa carotenoizilor în sănătatea oamenilor. Aceste studii au fost realizate in cadrul parteneriatului, de catre USAMV Bucuresti pentru markerii biochimici din plante si IBA Bucuresti pentru markerii biochimici din produsele lactate. Datele bibliografice menŃionează că au fost identificaŃi peste 600 de carotenoizi naturali şi se poate estima că natura produce anual peste 100 de milioane de astfel de pigmenŃi. Cei mai răspândiŃi pigmenŃi cu această structură sunt: fucoxantina (alge marine), luteina (plante ierboase), β-carotenul, licopina, violaxantina şi apocarotenoidele (compuşi cu mai puŃin de 40 de atomi de carbon în moleculă). In plus, au fost analizate implicaŃiile carotenoizilor asupra produselor lactate, din punct de vedere nutriŃional şi senzorial şi faptul că pot fi consideraŃi potenŃiali biomarkeri pentru managementului trasabilităŃii creşterii animalelor, de la care se colectează laptele materie primă (ex. lapte de vacă, lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliŃă). Carotenoizii din laptele de vacă sunt, în special, toŃi β-carotenii trans, şi la o concentraŃie mai mică, luteina. Carotenoizii determină culoarea portocalie la fructe şi legume (exemplu: morcov, cartofi dulci şi pepenele galben), la frunzele uscate şi, în concentraŃie redusă, determină nuanŃele de galben la alimente de origine animala precum smântână, unt şi gălbenuş de ou. Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de măsurare a trasabilităŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte permite un control eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate. Carotenoizii din plante sunt transferaŃi în produsele animale, uneori în concentraŃie mai mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai scăzută, cum ar fi în produsele rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

6



lactate şi a stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune. O culoare galbenă a laptelui este asociat ă cu păşunatul care, în multe Ńă ri europene, are conota Ń ii de hrană „naturală ”. Astfel, carotenoizii pot fi percepu Ń i ca indicatori ai păşunatului verde. Din punct de vedere al factorilor care afectează compoziŃia carotenoizilor în alimente, studiile arată că alimentele variază, atât calitativ cât şi cantitativ, din punct de vedere al conŃinutului de carotenoizi. ProporŃiile relative ale acestor carotenoizi sunt destul de constante, dar concentraŃiile absolute variază considerabil. Pot fi deosebite opt

modele principale privind nivelele de carotenoizi în diferite resurse alimentare. S-a analizat in cadrul acestei etape stadiul cercetărilor privind existenŃa carotenoizilor în diverse tipuri de furaje proaspete şi conservate/ concentrate; diversitatea carotenoizilor în furaje şi metodele de determinare disponibile si adecvate. În ciuda faptului că există o mare varietate de carotenoizi în plante, în furaje nu se găsesc mai mult de 10, dintre care cei mai importanŃi, din punct de vedere cantitativ, sunt β-carotenii şi luteina. Ca urmare a interesului limitat pentru conŃinutul de carotenoizi în dieta rumegătoarelor, analizele chimice sunt, de obicei, nespecifice şi privesc „carotenul”, care este un amestec de mai multe molecule şi izomeri. Au fost realizate o serie de experimente, în care s-a determinat concentraŃia de luteină sau xantofilii totali. Nu au fost determinate experimental alte molecule deoarece metodele de analiză nu au fost optimizate, fiind dezvoltate pentru alte matrici (cum ar fi laptele sau sângele) sau pentru alimentele oamenilor. Până acum, metodele adecvate pentru furaje au inclus metode care necesitau un consum foarte mare de timp (folosind TLC [Thin Layer Chromatography- Cromatografie în strat subŃire]). In ultima perioadă au fost puse la punct metode mult mai rapide, folosind HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). Studiul a fost concentrat si pe aspecte legate de digestia, absorbŃia şi metabolizarea carotenoizilor, procese deosebit de importante în stabilirea modelului conceptual de determinare a markerilor biochimici specifici pentru caracteristicile regionale a produselor lactate. Numeroase date arată faptul că există o dependenŃă a concentraŃiei de carotenoizi din laptele de vacă faŃă de natura şi cantitatea de suplimente dietetice, furnizate prin intermediul raŃiei de furaj, precum şi prin transferul acestora din matricea vegetalelor către glandele mamare. Recuperarea scăzută a carotenoizilor din lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a acestui transfer şi se estimează că etapele diferite de transfer ale carotenoizilor, din hrană în lapte, pot influenŃa disponibilitatea acestora în glandele mamare. Prima etapă în procesul de digestie al carotenoizilor îl reprezintă degradarea matricei vegetale, care eliberează aceste substanŃe în faza lichidă a rumenului. Gradul de degradare al carotenoizilor în rumen, de către microorganisme, variază în funcŃie de diferite rezultate obŃinute în modele experimentale in vitro sau in vivo, majoritatea în ceea ce priveşte β-carotenul. Chiar dacă unii autori nu au raportat nici o degradare a acestora, alŃii au raportat o degradare moderată sau o dispariŃie totală a β-carotenului. Starea suplimentelor de carotenoizi poate explica discrepanŃele dintre experimente, deoarece gradele de degradare au fost mai mari în situaŃiile în care carotenoizii au fost furnizaŃi ca produse purificate faŃă de furnizarea lor sub formă de furaje. In acest capitol a fost analizată şi influenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra variaŃiei concentraŃiei de markeri biochimici de tip carotenoizi în lapte. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

7



Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în componente de interes nutriŃional din brânză, este necesar să se cunoască nivelul care determină variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui. Mul Ń i cercet ăt ori au demonstrat că , în afar ă de aspectele legate de con Ń inutul de substan Ńă uscat ă din brânză , variabilitatea compozi Ń ională a acesteia în acizi gra şi, β caroten, xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compozi Ń ia „laptelui original”. CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele şi carotenoizi, este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compoziŃia biologică, stadiul de maturitate, modul de conservare etc.), de specia animalului, de rasă, de modul de recoltare a laptelui şi, bineînŃeles, de stagiul de lactaŃie în care se află animalul.

Un alt obiectiv al acestei etape a fost studiul metodlore experimentale de determinare a markerilor biochimici (carotenoide sau flavonoide sau terpene). In acest sens au fost analizate o serie de metode de analiz ă şi proceduri generale utilizate în identificarea calitativ ă şi cantitativă a acestor tipuri de markeri biochimic. Pentru analiza lor pot fi utilizate diferite metode. Alegerea celei mai adecvate metode este, de obicei, determinat ă de tipul de informaŃii necesare a fi obtinute. În general, pentru determinare, acesti markeri biochimici trebuie extrasi înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte complexă. Cu toate acestea, este absolut necesară extracŃia eficientă şi respectarea tuturor protocoalelor analitice. In conformitate cu activitatile prevazute a se realize in cadrul acestei etape s-a urmarit aprecierii stării de sănătate a vacilor de lapte, în strânsă legătură cu modul de furajare (stabulaŃie/păşunat). In aceste sens au fost efectuate teste hematologice şi teste biochimice serice. Astfel, în perioada de stabulaŃie au fost prelevate şi analizate 13 probe, iar în perioada de păşunatv14 probe. Probele au provenit de la vacile de lapte din lotul experimental din Biobaza ICDCB Baloteşti. Screeningul hematologic a scos în evidenŃă evoluŃia anemiei. Valorile scăzute ale hematocritului pe toată durata anului au fost atribuite deficitului de aport al unor microelemente în materiile prime furajere folosite în fermă, de regulă carenŃate în cupru, cobalt, seleniu. Acest lucru a fost susŃinut şi prin rezultatul examenelor biochimice serice, care au evidenŃiat nivele scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru. Testele biochimice serice au indicat, de asemenea, creşterea valorilor ureei serice în ambele perioade, fapt care a fost pus pe seama unui aport proteic ridicat în raŃie, în special pe baza furajelor concentrate. Totodată, aceasta a putut fi cauzată şi de disfuncŃii renale f ără exprimare clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop energetic sau plastic, catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a ureogenezei. Valorile scăzute ale glicemiei în perioada de stabulaŃie au indicat deficit energetic în raŃie. Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar şi hipomagneziemie destul de serioasă. Valorile macroelementelor serice analizate se corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii. Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană. Obiectivul principal al proiectului ”Cercetari complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale in vederea imbunatatirii trasabilitatii acestora pe lantul alimentar total ” esta acela de a găsii metodologii de Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

8



analiză care să servească la diferenŃierea produselor lactate regionale de alte produse similare. În cadrul acestui obiectiv generos, partenerul 2 al consortiului acestui proiect, ICDP BRASOV, î şi propune să participe la scoaterea in evidenŃă a acelor caracteristici tehnologice şi fizico-chimice care să conducă la ideea că laptele şi produsele lactate obŃinute pe Platoul MunŃilor Bucegi pot fi considerate ca produse regionale (lapte de Bucegi, brânză de Bucegi, etc.), de o calitate şi savoare deosebită. S-a ales ca areal de studiu platoul munŃilor Bucegi deoarece ICDP Braşov deŃine aici o Baza pentru Cercetări Pajişti Montane situată între Vârfurile Blana (1875 m) şi Nucet (1863 m). Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi este situată la 1800 m altitudine, pe un teren uşor înclinat cu expoziŃie estică. VegetaŃia primară a fost dominată de jneapăn (Pinus mugo) şi rarişte de molid (Picea abies) după a c ăror defrişare s-a instalat o vegetaŃie ierboasă dominată de Festuca nigrescens, F. ovina şi Agrostis rupestris, care la rândul lor au fost invadate de specia nevaloroasă Nardus stricta. Substratul litologic este format de conglomerate tipice de Bucegi. Solurile sunt brune acide şi podzoluri, puternic debazificate, foarte sărace în elemente fertilizante. CondiŃiile climatice sunt cele specifice etajului alpin inferior în care temperatura medie anuala a aerului este de 4,9°C. Vântul bate cu viteze medii anuale de peste 6 metri/secundă. Cantitatea de precipitaŃii căzute în perioada de vegetaŃie (iunie – septembrie) este în jur de 400 mm, iar cea anuală este de aproximativ 1200 mm. La BCPM Blana Bucegi s-au iniŃiat iniŃiat cercetări privind valorificarea cu vaci de lapte a păşunilor subalpine în anul 1995 sub coordonarea domnului dr. ing. Teodor Maruşca. Atunci au fost înfiinŃate si 5 parcele experimentale care au fost utilizate în mai multe ”faze” de cercetare . De asemenea partenerul IBNA a estimat valoarea nutritiva a nutreŃurilor şi a elaborat raŃii pentru vacile de lapte care sa asigure indeplinirea obiectivelor propuse. In urma studiului realizat s-au stabilit cateva criterii care vor fi luate in considerare la stabilirea acestor ratii. Pentru satisfacerea cerinŃelor nutriŃionale ale vacilor de lapte se impun următoarele: - cunoaşterea normelor de hrană: - norma de substanŃă uscată (kg); - norma de energie netă lapte (UNL); - norma de proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g); - normele de macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g); - normele de microelemente şi vitamine (mg; UI); - capacitatea de ingerare a hranei (USV); - raportul dintre PDIE/UNL. - cunoaşterea valorii nutritive a nutreŃurilor: - conŃinutul în substanŃă uscată (g/kg SN); - conŃinutul în energie netă lapte (UNL/kg SU); - conŃinutul în proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g/kg SU); - conŃinutul în macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g/kg SU); - conŃinutul în microelemente şi vitamine (mg/kg SU sau UI/kg SU); - ingestibilitatea nutreŃului (USV/kg SU). Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

9



- date despre animal: - greutatea potenŃială a vacii, G (kg); - producŃia potenŃială maximă zilnică de lapte PlM (kg/zi); - conŃinutul în grăsime al laptelui GrL (%); - săptămâna de lactaŃie “n”; - luna de gestaŃie ( se iau în consideraŃie numai lunile 8 şi 9). Adresa de site a proiectului: http://www.monapopa.usamv.ro/TRASAREG.html


10



DESCRIEREA ŞTIINłIFICĂ ŞI TEHNICĂ


11



A. Activitate II.1.1. – USAMV Bucuresti Model conceptual privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici de tip carotenoide, flavonoide sau terpene în plante. MetaboliŃii plantelor sunt întâlniŃi de obicei sub forma unui amestec complex de mai multe substanŃe cu polaritate şi hidrofobicitate diferite. Cele mai importante grupe de substanŃe în materialul plantelor sunt împărŃite în: substanŃe cu polaritate scăzută (terpene), semi-polare (flavonoide, lipide) şi polare (unele carotenoide, glicozide polare, proteine).

1. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip carotenoide Carotenoidele reprezintă un grup de pigmenŃi naturali prezenŃi în fructe şi legume, având culori de la galben la roşu. Din punct de vedere chimic, carotenoidele sunt compuşi poliizoprenici şi pot fi clasificate în două clase principale [1]: a) carotene sau carotenoide care conŃin în structura lor doar atomi de carbon ş i hidrogen b) xantofile care sunt derivaŃi hidrocarbonaŃi oxigenaŃi ce conŃin cel puŃin un atom de oxigen, precum grupări hidroxi, ceto, epoxi, metoxi sau carboxil. Caracteristica lor structurală este sistemul de duble legături conjugate, care influenŃează proprietăŃile lor chimice, biochimice şi fizice. În figura 1 sunt prezentate structurile unor carotenoide. Această clasă de compuşi naturali este foarte răspândit ă în natură. Carotenoidele sunt sintetizate de către plante şi multe microorganisme, deci animalele trebuie să le obŃină din alimente. ConŃinutul de carotenoide în fructe şi vegetale depinde de mai mulŃ i factori precum, varietatea genetică, maturitate, depozitare, prelucrare şi preparare. Interesul pentru studiul acestor compuşi este datorat funcŃiilor lor fiziologice ş i biologice care au fost intens studiate şi prezentate în detaliu de către van Berg şi colab.[2]. Pe lângă activitatea provitaminei A a unor carotenoide, acestea prezintă şi alte funcŃii, precum antioxidanŃi şi de intensificare a răspunsului imun. Studiile epidemiologice au indicat o asociere între consumul ridicat de vegetale şi o reducere a riscului unor boli cronice degenerative, precum anumite tipuri de cancer, boli cardiovasculare [3, 4].


12



β- caroten

OH luteina

HO OH zeaxantina HO

O OH astaxantina

HO O

licopen

Figura 1. – Structura chimică a unor carotenoide. 2. Metode de determinare a carotenoidelor În ceea ce priveşte analiza carotenoidelor, iniŃial, a fost folosită cromatografia cu coloană deschisă la presiune atmosferică [5], dar această metodă a necesitat cantităŃi mari de probă. Totuşi, Rodriguez-Amaya [6] a subliniat că utilizând această tehnică, în ciuda dezavantajelor ei, o bună separare poate fi realizată pentru probele alimentare cu compoziŃie complexă de carotenoide. Almeida-Muradin şi colab. [7] au găsit rezultate similare când metodologia HPLC a fost comparată cu cea a cromatografiei cu coloană deschisă pentru determinarea carotenoidelor cu activitatea provitaminei A din frunzele de sfeclă, precum şi din frunzele verzi ale unor plante. Odată cu dezvoltarea cromatografiei de lichide de înaltă performanŃă (HighPerformance Liquid-Chromatography HPLC), multe metode atât cu fază normală, cât şi cu fază inversă au fost descrise pentru a separa xantofilele şi carotenoidele. În analiza HPLC a carotenoidelor, cel mai utilizat detector este cel ultraviolet – vizibil (UV-Vis) şi, recent detectorul fotodiodă (photodiode array detector DAD), care permite o colectare continuă de date spectrofotometrice în timpul analizei [8]. Când este necesară o sensibilitate ridicată, detecŃia electrochimică reprezintă o alternativă bună [9]. În matrici complexe, când DAD nu este suficient pentru identificare din cauza interferenŃelor spectrale, cromatografia de lichide cuplată cu spectrometria de masă reprezintă o alternativă bună. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbunătăŃirii trasabilităŃii acestora pe lanŃul alimentar total

13



2.1. Etapa de extracŃie 2.1.1. ExtracŃia lichid –lichid a carotenoidelor Datorită structurii complexe a carotenoidelor şi a varietăŃii mari a acestor compuşi prezenŃi în vegetale şi fructe, nu există o metodă de referinŃă pentru analiza lor. Numeroşi solvenŃi organici precum acetona [10, 11], tetrahidrofuran (THF) [12], n-hexan [13], pentan [14], etanol (EtOH) [15], metanol (MeOH) [16], cloroform [9], precum şi amestecuri de solvenŃi, precum diclormetan (DCM) : MeOH (6:1, v/v) [17], acetonă : eter de petrol (50:50, v/v) [18], THF : MeOH (1:1, v/v) [8], [19], [20], n-hexan : toluen (5:4, v/v) [21], n-hexan : acetonă (6:4, v/v) [22], 2-propanol : DCM (2 :1, v/v) [23], n-hexan : acetat de etil (85 : 15, v/v) [24] au fost mult utilizaŃi. Astfel, Taungbodhitham şi colab. [25] au evaluat 6 combinaŃii diferite de solvent: acetonă : hexan (4:6, v/v), EtOH : hexane (4:3, v/v), cloroform : MeOH (2:1, v/v), DCM : MeOH (2:1, v/v), hexan : izopropanol (3:2, v/v) şi acetonă : eter de petrol (50:50, v/v) pentru a extrage licopen şi α- şi β-caroten din sucul de roşii conservat, şi cele mai bune recuperări au fost obŃinute cu amestecul EtOH : hexan. Rezultate similare au fost găsite de către Lin şi Chen [26] care au utilizat 5 sisteme de solvenŃi, EtOH : hexan (4:3, v/v), acetonă : hexan (3:5, v/v), EtOH : acetonă : hexan (2:1:3, v/v/v), acetat de etil : hexan (1:1, v/v) şi acetat de etil (100%), pentru a compara eficienŃa extracŃiei carotenoidelor din sucul de roşii. Ei au concluzionat că extracŃia cu eficienŃa cea mai bună a fost realizată cu amestecul EtOH : hexan (4:3, v/v). Deli şi colab. [27] au folosit MeOH urmat de dietil eter pentru a extrage carotenoidele din ardei (Capsicum annuum var. lycopersiciforme rubrum). Gandul-Rojas şi colab. [13] au extras clorofilele şi xantofilele libere şi monoesterificate cu dimetilformamidă şi carotenoidele cu hexan din măsline. O metodă pentru determinarea izomerilor luteină şi zeaxantină din crăiŃă (Tagetes erecta) utilizând ca solvent de extracŃie hexan şi eter de etil fost raportată de Hadden şi colab. [28]. AlŃi autori [29], au utilizat un amestec mai complex, hexan : acetonă : EtOH pentru a extrage majoritatea carotenoidelor din sucul de portocale. Un amestec de THF : MeOH a fost ales de Murkovic şi colab. [19] pentru a izola α- şi β-caroten şi luteina din dovleac (Cucurbita pepo, C. maxima şi C. moschata). Rozzi şi colab. [9] au raportat o metodă pentru a determina licopen, α- şi β-caroten, α-, γ- şi δtocoferol din coaja şi seminŃele de roşii folosind cloroform ca solvent de extracŃie. În ciuda faptului că THF şi eterul de etil au fost larg utiliza Ńi datorită solubilităŃii ridicate pe care carotenoidele o prezintă în acestea, unii cercetători [14Error! Bookmark not defined. ] au atras atenŃia asupra faptului că aceşti solvenŃi pot forma peroxizi care pot degrada rapid β-carotenul, contribuind la formarea de compuşi secundari. De aceea este recomandată adăugarea de antioxidanŃi, precum butilatul de hidroxitoluen (BHT) în solvent. Trebuie evitată utilizarea antioxidanŃilor puternici care pot contribui la autooxidarea β-carotenulului. ExtracŃia β-carotenoidelor trebuie realizată foarte rapid, evitând expunerea la lumină, oxigen, temperaturi ridicate şi la metale prooxidante (precum fier, cupru) pentru a minimiza autooxidarea şi izomerizarea cis-trans [2]. Mai mult, pentru a preveni pierderile de carotenoide în timpul procedurii de extracŃie, adăugarea de antioxidanŃi, precum acid ascorbic, pirogalol este recomandată [30]. Următoarea etapă din cadrul procedurii de extracŃie este omogenizarea amestecului şi separarea extractului de carotenoide rezultat. Acest proces trebuie repetat Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

14



până ce filtartul este incolor. Filtratul este concentrat, şi carotenoidele sunt separate întrun solvent organic corespunzător şi apă. Faza organică este îndepărtată şi evaporată; în timpul evaporării nu este recomandată atingerea unor temperaturi de peste 400C, pentru a evita degradarea, şi în final reziduul este dizolvat într-o cantitate corespunzătoare de solvent [26], [30].

2.1.2. ExtracŃia cu fluide supercritice (SFE) SFE este folosită ca o metodă alternativă la extracŃia tradiŃională lichid – lichid pentru izolarea carotenoidelor din probe alimentare, deoarece această metodă prezintă câteva avantaje. De exemplu, viteza mai mare în extracŃie, etapa de evaporare nu este necesară, şi dioxidul de carbon nu este toxic, costul lui este scăzut, este neinflamabil şi acceptabil din punct de vedere al mediului [31]. În plus, CO2 prezintă o temperatură critică joasă (310C), fiind astfel ideal pentru extracŃia compuşilor instabili termic. Totuşi, CO2 prezintă o polaritate scăzută, ceea ce determină ca extracŃia compuşilor polari să fie foarte greu de realizat. Această limitare poate fi rezolvată prin adăugarea unui modificator organic, precum MeOH sau EtOH, în scopul creşterii puterii lui de solvatare [32]. În ceea ce priveşte prelucrarea probei, unii cercetători au raportat că îndepărtarea apei din materialele vegetale facilitează SFE şi probele omogenizate sunt extrase mult mai rapid datorită micşorării dimensiunii particulelor [14]. Gomez-Prieto şi colab. [33] au extras all-trans-licopen din roşii folosind CO2 f ără modificator. Ei au studiat efectul densităŃii CO2 fluid asupra randamentului de extracŃie, realizând mai multe extracŃii la diferite densităŃi (0,25, 0,35, 0,45, 0,55, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85 şi 0.90 g/mL). Rezultatele cele mai bune au fost obŃinute pentru 0,9 g/mL. O comparaŃie între extracŃia Soxhlet utilizând n-hexan şi EtOH ca solvenŃi şi SFE pentru determinarea clorofilelor şi carotenoidelor din maghiran (Origanum marojana L.) a fost prezentată de Vagi şi colab. [31]. Trei temperaturi diferite (40, 50 şi 600C) şi trei presiuni diferite (100, 250 şi 400 bar) au fost testate; condiŃiile optime pentru extracŃie observate fiind 500C şi 450 bar. În plus, cantitatea de β-caroten extrasă cu EtOH a fost jumătate din cantitatea obŃinută cu fluide supercritice. Ferreira de Franca şi colab. [34] au aplicat SFE pentru a determina lipidele şi carotenoidele din fructele unei specii de palmier ce creşte în zonele tropicale ( Mauritia flexuosa). A fost studiat efectul presiunii şi temperaturii, condiŃiile optime finnd 200 bar şi 39,90C. Intr-un alt studiu, realizat de Baysal şi colab. [35] câteva condiŃii de extracŃie, precum temperatura extractorului (35, 45, 55 şi 650C) presiunea fluidului de extracŃie (200, 250 şi 300 bar), adăugarea de cosolvent (5%, 10% şi 15% EtOH), timpul de extracŃie (1, 2 şi 3 ore) şi debitul CO2 (2, 4 şi 8 kg/h) au fost optimizate pentru determinarea licopenului şi β-carotenului din reziduul rezultat la fabricarea pastei de roşii. Rezultatele au demonstrat că temperatura cea mai mare folosită pentru extracŃie a condus la un randament de extracŃie maxim; totuşi, autorii au atras atenŃia asupra faptului că, temperaturi mai mari de 650C ar determina un randament de extracŃie mai bun, dar aceasta ar putea cauza degradarea carotenului. Nu au fost observate diferenŃe semnificative în ceea ce priveşte randamentul de extracŃie al licopenului şi β-carotenului, atunci când presiunea a fost modificată de la 200 la 300 bar. AlŃi autori [31] au arătat că presiuni de extracŃie mai mari de 400 bar pot determina randamente mai mari. În ceea ce priveşte timpul de extracŃie şi debitul, randamentul cel mai bun a fost obŃinut pentru un timp de extracŃie de 2 ore. S-a observat Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

15



că o oră nu este suficient pentru extracŃia carotenoidelor, iar la 3 ore procesul de degradare creşte. Debitul optim atât pentru licopen, cât şi pentru β-caroten a fost 4 kg/h. Adăugarea de 5% EtOH drept cosolvent a îmbunătăŃit recuperările celor două carotenoide. Recent, diferite temperaturi şi presiuni de extracŃie au fost testate de Rozzi şi colab. [9] pentru a determina licopenul din produsele secundare rezultate în urma procesării tomatelor. Rezultatele au indicat că recuperarea maximă este realizată la 860C şi 345 bar. Barth şi colab. [22] au comparat extracŃia clasică cu solvent şi SFE pentru determinarea carotenoidelor din morcov ( Daucus carota L.). Ei au observat că activitatea provitaminei A a fost cu 7% mai mare cu SFE decât în probele extrase cu solvenŃi. O metodă pentru separarea selectivă a izomerilor β-carotenului din alga Dunaliella bardawil a fost cercetată de Gamlieli-Bonshtein şi colab. [36]. Separarea izomerilor a fost posibilă datorită vitezei lor de dizolvare diferită în CO2 supercritic. CâŃiva modificatori ai CO2 (apă, EtOH, clorură de metilen, hexan) au fost testaŃi pentru a îmbunătăŃii eficienŃa extracŃiei α- şi β-carotenului din diferite vegetale [14Error! Bookmark not defined. ]. Adăugarea de hexan nu a contribuit semnificativ la creşterea solubilit ăŃii β-carotenului în CO2 supercritic. În cazul clorurii de metilen, solubilitatea βcarotenului creşte, dar ea provoacă degradarea β-carotenului. În final, deşi β-carotenul a fost mai puŃin solubil în EtOH decât în hexan, când EtOH a fost adăugat drept modificator, solubilitatea β-carotenului în CO2 a crescut semnificativ [14]. Mendes şi colab. [37] au raportat metoda extracŃiei supercritice cu CO2 a compuşilor cu importanŃă farmaceutică din microalge. Cantaxantina şi astaxantina au fost extrase din Chlorella vulgaris. Mai multe condiŃii de presiune şi temperatură au fost comparate şi rezultatele cele mai bune au fost obŃinute la 275 şi 350 bar şi 550C. β-carotenul produs de Dunaliella salina a fost un amestec de izomeri cis şi trans, izomerul cis fiind mult mai solubil decât izomerul trans în CO2 supercritic. CondiŃiile optime pentru extracŃia celor doi izomeri au fost îndeplinite la 300 bar şi 400C. În tabelul 1 sunt prezentate câteva exemple de condiŃii ale extracŃiei cu fluide supercritice în analiza carotenoidelor.

Tabelul 1 – Exemple de condiŃii ale extracŃiei cu fluide supercritice utilizate în analiza carotenoidelor. Proba

Analit

Fluid supercritic

Roşii [33]

All-trans-licopen

SeminŃe de roşii [9]

Licopen, β-caroten, α- CO2 f ără tocoferol, γ-tocoferol, δ- modificator tocoferol Izomeri geometrici ai β- CO2 f ără carotenului modificator

Alga Dunaliella bardawil [36] Reziduuri de la pasta de roşii [35]

CO2 f ără modificator

Licopen, β-caroten

CO2 şi 5% EtOH ca modificator

CondiŃii SFE (temperatură, presiune, debit) 0 T=40 C p=281 bar D=4 mL/min T=86 0C p=345 bar D=2.5 mL/min T=40 0C p=448 bar D=0.5-1 mL/min T=55 0C (licopen) T=65 0C (, β-caroten) p=300 bar D=4 kg/h

Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

16


Proba


Analit

Fluid supercritic

Vegetale(morcovi, α-caroten, β-caroten rapiŃă,varză, broccoli, muştar, dovlecel) [14Error! Bookmark not defined. ] β-caroten, β-criptoxantina, Alga Spirulina Pacifica [32Error! β-zeaxantina Bookmark not defined. ]

CO2 şi EtOH ca modificator

Morcovi ( Daucus carota L.) [38]

CO2 şi 5% cloroform ca modificator

α-caroten, β-caroten,

CO2 şi 15% EtOH ca modificator

CondiŃii SFE (temperatură, presiune, debit) 0 T=40 C p=342 bar D=1.5 mL/min

T=80 0C (zeaxantina) T=760C (β-criptoxantina) T=60 0C (β-caroten) p=350 bar D=2 mL/min T=40 0C p=606 bar D=1 mL/min

2.2. Saponificarea Înaintea analizei HPLC, procedura de saponificarea este de obicei utilizată ca etapă în simplificarea separării prin îndepărtarea substanŃelor, precum clorofile şi lipide, care ar putea interfera cu detecŃia cromatografică. Mai mult, prin procesul de saponificare, pot fi obŃinute informaŃii utile despre natura şi distribuŃia carotenelor prezente în probă prin evaluarea profilului lor cromatografic înainte şi după tratamentul alcalin [39]. Totuşi, o pierdere a conŃinutului total de carotenoide a fost prezentată în literatură [40]. Fernandez şi colab. [41] au comparat efectele saponificării alcaline şi hidrolizei enzimatice asupra concentraŃiei totale de carotenoide din uleiul de palmier din Costa Rica. Rezultatele au arătat o concentraŃie mai mare a carotenoidelor utilizând hidroliza enzimatică. Compuşii cei mai sensibili la tratamentele alcaline sunt xantofilele, în special epoxicarotenoidele. De aceea, daca proba ce urmează a fi analizată conŃine aceşti pigmenŃi în compoziŃie, această etapă de purificare ar trebui să fie evitată. Ca o regulă generală, pentru probele cu conŃinut scăzut de grăsime, trebuie să fie aplicate condiŃii mai blânde în etapa de saponificare, şi pentru probele cu conŃinut ridicat de grăsimi trebuie utilizate condiŃii mai severe [39]. Totuşi, saponificarea ar trebui utilizată pentru a estima prezenŃa esterilor carotenoidici care altfel pot fi nedetectaŃi. În tabelul 2 sunt prezentate diferite condiŃii de saponificare aplicate pentru diverse probe.

Tabelul 2 – Diferite condiŃii de saponificare utilizate în analiza carotenoidelor Proba Suc de portocale [29]

Legume crude şi preparate (lăptuca, fasole verde, sparanghel, sfeclă, ardei, spanac, roşii, morcovi, varză, castravete, dovlecel, cartof, ceapă, conopidă) [40]

Analit CondiŃii de saponificare Neoxantina, violaxantina, 10% sol. metanolic ă de luteoxantina, anteraxantina, KOH (peste noapte, mutatoxantina, luteina, temperatura camerei, izoluteina, zeaxantina, α- şi β- întuneric) criptoxantina, licopen, α-, β- şi γ-caroten Luteina, zeaxantina, licopen, β- sol. saturată de KOH (sub criptoxantina, α-β- şi γ-caroten atmosferă de azot, 30 min, întuneric)


17


Proba Vegetale săbatice comestibile ( Urtica dioica L.) [42] Ulei de măsline [24


Analit Luteina şi izomeri, β-caroten şi izomeri, neoxantina, violaxantina, licopen, α-tocoferol, β-caroten

Cereale [15]

Luteina, zeaxantina, βcriptoxantina

Legume proaspete şi prelucrate (broccoli, morcovi, fasole verde) [43] Cartofi dulci ( Ipomoea batatas L.) [44]

Trans-β-caroten

Alimente fortificate (cereale pentru micul dejun, unt de arahide, margarină) [45]

Acetat de α-tocoferol, palmitat de retinil, β-caroten

Varză ( Brassica oleracea var. Acephala cv. Vates) [21]

Luteina, β-caroten, retinol, filochinona

α-caroten, β-caroten

CondiŃii de saponificare sol. metanolică de KOH (temperatura camerei) sol. etanolică de KOH (sub atmosferă de azot, 30 min, 700C) 80% sol. etanolică de KOH (în baie de apă la punctul de fierbere, 10 min) 100% sol. etanolic ă de KOH (30 min, 700C) 10% etanol:apă (50:50, v/v) 1 oră, 800C 60% sol. apoasă de KOH conŃinând pirogalol ca antioxidant (sub atmosferă de azot, 30 min, 70 0C) 80% sol. apoasă de KOH (15 min, 700C)

După etapa de saponificare, carotenoidele sunt extrase cu eter de etil, dietil eter [46], n-hexan [43], clorură de metilen [16], eter de petrol [47] sau amestecuri, precum nhexan : eter de etil (70:30, v/v) [48], dietil eter : eter de petrol (1:1, v/v) [30], n-hexan : acetat de etil (85:15, v/v) [24], n-hexan : toluen [21] şi apoi, extractul este spălat până când KOH este îndepărtat. Khachik şi colab. [49] au observat o pierdere importantă în conŃinutul de xantofile din broccoli după aplicarea unui tratament cu 30% hidroxid de potasiu metanolic sub atmosferă de azot la temperatura camerei timp de 3 ore. Contrar, pierderea de carotene nu a fost semnificativă. Ye şi colab. [45] au raportat că metoda extracŃiei directe cu solvent reprezintă o tehnică alternativă saponificării în analiza vitaminelor şi β-carotenului din diferite alimente fortifiate. Hart şi Scoot [47] au determinat conŃinutul de carotenoide din legumele şi fructele consumate în mod obişnuit în Marea Britanie. Următoarea procedură de saponificare a extractului de carotenoide a fost aplicată pentru fructe şi unele legume, precum ardei: 10% hidroxid de potasiu metanolic sub atmosferă de azot, la întuneric timp de o oră la temperatura camerei. Unii cercetători au observat o extracŃie mai bună a carotenoidelor când sunt utilizate temperaturi ridicate în etapa de saponificare, dar în ceea ce priveşte conŃinutul de xantofile [50]. Procedurile de extracŃie lichidă descrise în literatură necesită timp îndelungat şi implică utilizarea de cantităŃi mari de solvenŃi organici volatili, care au impact negativ asupra mediului şi asupra sănătăŃii umane. De aceea, interesul în dezvoltarea de noi metode pentru extracŃia carotenoidelor este în continuă creştere. Fish şi colab. au dezvoltat [51] o metodă pentru determinarea cantitativă a licopenului care utilizează cantităŃi reduse de solvenŃi organici. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

18



2.3. Analiza cromatografică Numeroase metode pentru determinarea carotenoidelor din probe vegetale şi nu numai au fost prezentate în literatură. Unele exemple recent publicate sunt prezentate în continuare. Lin şi Chen [26] au dezvoltat o metodă pentru a determina diferite carotenoide prezente în sucul de roşii, incluzând all-trans-luteina, all-trans-β-caroten, all-translicopen şi cei 13 cis-izomeri ai lor. Separarea a fost realizată utilizând o coloană C30 (250 mm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm dimensiunea particulelor) şi un gradient a doi eluenŃi, (A) acetonitril (ACN) : 1-butanol (70:30, v/v) şi (B) clorură de metilen. Analiza a fost completă în 55 de minute la un debit de 2 mL/min şi lungimea de undă a fost setată la 476 nm. Metoda HPLC pentru determinarea clorofilelor, carotenoidelor şi derivaŃilor lor în unele legume proaspete şi prelucrate a fost descrisă de Gokmen şi colab. [52]. O coloană C8 MikroPak din oŃel inoxidabil (150 mm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm dimensiunea particulelor) şi un amestec de MeOH : apă ca fază mobilă la un debit de 0,75 mL/min a fost folosită. Cromatogramele au fost înregistrate simultan la 432, 450, 470, 652 şi 666 nm folosind DAD. Un amestec cuaternar de MeOH : ACN : clorură de metilen : apă (50:30:15:5, v/v/v/v) conŃinând 0,1% BHT ca antioxidant şi 0,1% TEA ca modificator, şi o coloană C18 Kromasil (250 mm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm dimensiunea particulelor) a fost folosită de Melendez şi colab. [16] pentru a analiza profilul carotenoidelor din sucul de portocale congelat. O lungime de undă mai specifică de 486 nm a fost selectată şi un debit de 2,5 mL/min. Carotenoidele au fost identificate prin comparaŃie cu spectrele standardelor obŃinute cu un DAD de la 350 la 800 nm. O altă metodă pentru determinarea pigmenŃilor clorofilici şi carotenoidici din mazărea prelucrată (Pisum sativum L.) a fost propusă de Edelenbos şi colab. [10]. Un gradient de solvent binar constând din (A) MeOH : apă (80:20, v/v) şi (B) 100% acetat de etil la un debit de 1 mL/min a fost folosit ca fază mobilă. Separările au fost realizate pe o coloană LiChrospher 100 RP-18 (244 mm x 4 mm diametru interior, 5 µm dimensiunea particulelor) şi temperatura a fost menŃinută la 300C. Cromatogramele au fost înregistrate la 440 nm cu un detector DAD şi spectrele de absorbŃie ale carotenoidelor şi clorofilelor au fost înregistrate între 300 şi 600 nm. Recent, Gomez-Prieto şi colab. [33] au realizat o separare optimă a următoarelor carotenoide: fitoen, fitofluen, β-caroten şi licopen, precum şi a izomerilor all-translicopen din probele de roşii. Un gradient liniar din eluenŃii (A) MeOH : apă (96:4, v/v) şi (B) metil-ter Ń -butil eter (MTBE) a fost folosit şi debitul a fost setat la 1 mL/min. O coloană C30 Develosil UG (250 mm x 4,6 mm diametru interior) menŃinut ă la 200C a fost utilizată şi β-apocarotenal a fost folosit ca standard intern. Pentru a determina diferite carotenoide, în aceeaşi injectare, au fost selectate 4 lungimi de undă (285, 347, 450 şi 472 nm). Vagi şi colab. [31] au dezvoltat o metodă HPLC izocrată şi cu fază inversă pentru a detrmina clorofilele şi carotenoidele din maghiran (Origanum majorana L.). În acest sudiu, s-a utilizat o coloană C18 Nucleosil 5 din oŃel inoxidabil (250 mm x 4 mm diametru interior) şi ca fază mobilă amestecul ACN : MeOH : alcoolizopropilic (39:43:18, v/v/v) la un debit de 0,9 mL/min. Cromatogramele au fost înregistrate la lungimea de undă de 430 nm. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

19



Analiza xantofilelor din cereale utilizând un sistem de gradient din doi eluenŃi (A) MeOH : MTBE : apă (81:15:4, v/v/v) şi (B) MeOH : MTBE (9:91, v/v) şi o coloană C30 (250 mm x 4,6 mm) a fost descriză de Moros şi colab. [Error! Bookmark not defined. ]. Debitul a fost 1 mL/min şi cromatogramele au fost monitorizate la 450 şi 445 nm utilizând detectorul DAD. Două coloane cu fază normală şi una cu fază inversă au fost folosite pentru a analiza carotenoidele din extractul de obŃinut de la florile de crăiŃă (Tagetes erecta) [28]. O coloană Zorbax SIL 5 µm (250 mm x 4,6 mm diametru interior) şi n-hexan : acetat de etil (75:25, v/v) ca fază mobilă la un debit de 2 mL/min a fost utilizată pentru a separa all-trans-luteina, izomerii cis ai luteinei, precum şi all-trans-zeaxantina. Celălalt sistem cu fază normală a inclus o coloană β Cyclobond 5 µm (250 mm x 4,6 mm diametru interior) cu n-hexan : acetat de etil (87:13, v/v) ca fază mobilă şi un debit de 2 mL/min a fost utilizat pentru a identifica all-trans şi cis izomerii luteinei şi all-trans-zeaxantina. Cu ajutorul cromatografiei cu fază inversă, o separare mai completă a cis izomerilor luteinei a fost realizată. A fost utilizată o coloană silica C30 YMC S3-SIL200 3 µm cu o fază mobilă constând din 3% MTBE în MeOH la un debit de 1 mL/min. All- trans-luteina, izomerii 9- şi 9 -cis-luteina, izomerii 13- şi 13 -cis-luteina şi all-trans-zeaxantina au fost identificaŃi. În toate cazurile, carotenoidele au fost detectate la 450 nm. Într-un studiu realizat de Lee şi colab. [29], mai mult de 25 de carotenoide dintr-o probă de portocală dulce (Earlygold) au fost separate în 40 minute utilizând un gradient de eluŃie ternar constând din: eluent (A) ACN : MeOH (75:25, v/v), eluent (B) 100% MTBE şi eluent (C) apă conŃinând 0,01% BHT şi 0.05% TEA la un debit de 1 mL/min. Separarea a fost realizată pe o coloană C30 (150 mm x 4,6 mm diametru interior) menŃinut ă la 250C. Într-un alt experiment descris de Lee, aceleaşi condiŃii au fost aplicate pentru identificarea a 29 de carotenoide în sucul obŃinut dintr-un alt tip de portocală (Red Navel orange Cara Cara). Carotenoidele au fost detectate la 450 nm. A fost dezvoltată o metodă pentru a difernŃia citricele din portocală, mandarină şi amestec pe baza profilului lor carotenoidic. Un sistem de eluŃie compus din MeOH, apă şi MTBE şi o coloană C30 (25 cm x 4,6 mm diametru interior, 5 µm) a fost utilizată pentru separare. Analiza a fost completă în 50 minute, la un debit de 1 mL/min. Pentru a maximiza absorbanŃa în domeniul roşu/portocaliu din spectrul vizibil, a fost selectată o lungime de undă de 486 nm [46].

2.3.1. Cromatografia de lichide de înalt ă performanŃă Analiza carotenoidelor din alimente este în principal realizată prin HPLC. Separările cu fază inversă [9], [11], [15], [20], [27], [32], [33], [53], au fost des utilizate în determinarea acestor compuşi, deşi câteva metode cu fază normală [54] au fost de asemenea prezentate în literatură. Ambele sisteme izocratic [36], [55] şi gradient de eluŃie au fost utilizate. În general, prin utilizarea metodelor cu gradient de solvent rezoluŃia obŃinută este mai bună decât în cazul sistemelor izocratice. Totuşi, prima metodă prezintă unele dezavantaje, precum timpul de analiză mai mare deoarece este necesară reechilibrarea coloanei după fiecare injectare, ceea ce reprezintă o problemă seroasă pentru analiza de rutină [16].


20



2.3.1.1. Faza mobilă ACN, MeOH sau amestecurile din aceşti solvenŃi sunt constituenŃii majoritari ai fazei mobile utilizate în analiza carotenoidelor. Pentru a optimiza separarea unor carotenoide (de exemplu izomerii geometrici), faza mobilă este de obicei modificată prin adăugarea unor cantităŃi mici din alt solvent organic [2]; de exemplu: DCM [19], [56], apă [52], [55], n-hexan [57], [58], acetonă [54], cloroform [8], THF [12], [35], [59], propanol [9], [20], [31], acetat de etil [10], [28], clorură de metilen [16], [22] sau diferiŃ i eteri [15], [33], [60]. MeOH a fost recomandat în diferite lucrări [61] deoarece furnizează o recuperare mai bună decât ACN sau solvenŃii pe bază de ACN. În acelaşi mod, THF a asigurat o recuperare uşor mai mare decât acetatul de etil [62]. Utilizarea cloroformului trebuie evitată pe cât de mult posibil din cauza toxicităŃii ridicate; în plus, solvenŃii cloruraŃi sunt asociaŃi cu pierderile de carotenoide. AntioxidanŃii, precum acidul ascorbic sau BHT [8], [16], [47], sunt de obicei adăugaŃi în faza mobilă pentru a o stabiliza. Gueguen şi colab. [63] au observat o scădere a conŃinutului de carotenoide în timp când acidul ascorbic a fost adăugat fazei mobile. Contrar, în soluŃii standard, BHT a protejat eficient carotenoidele de procesele de degradare. Carotenoidele sunt susceptibile la oxidare şi pot suferi degradări în coloană. Diferite studii [8], [47], au demonstrat că adăugarea de solvenŃi modificatori, de exemplu TEA sau acetat de amoniu, în faza mobilă reduce pierderile sau degradarea. TEA acŃionează ca un modificator puternic, şi micşorează timpul de retenŃie. Totuşi, a fot testat că la concentraŃii în jur de 0,05% nu modifică semnificativ timpul de eluŃie, şi o separare bună poate fi realizată [47]. Huck şi colab. [8] au investigat factorii de selectivitate pentru luteină /zeaxantină şi zeaxantină / β-caroten pentru evaluarea unor sisteme diferite de fază mobilă. O fază mobuilă cuaternară ACN : MeOH (conŃinând 0,05% TEA şi 0,05 M acetat de amoniu) : cloroform : n-heptan a fost dezvoltată pentru a îmbunătăŃii recuperarea şi separarea carotenoidelor.

2.3.1.2. Tipurile de coloane HPLC cu fază inversă este larg utilizată pentru a separa carotenoidele din diverse probe. Coloanele C8 [52] şi mai ales C18 [8], [11], [12], [19], [27], [48], [64], [65], [66], [67], au fost deseori selectate de cercetători pentru a efectua analize. Epler şi colab. [61] au comparat 65 de coloane cromatografice cu fază inversă pentru a determina selectivitatea şi recuperarea unui amestec din următoarele carotenoide: luteina, zeaxantina, β-criptoxantina, licopen, α- şi β-caroten utilizând ACN şi MeOH modificat cu THF sau acetat de etil ca fază mobilă. Fazele staŃionare au fost în general C18 şi au fost clasificate ca monomerice, intermediare sau polimerice. S-a demonstrat că separarea luteinei şi zeaxantinei este realizată doar prin utilizarea coloanei C18 polimerice şi unele coloane intermediare, dar aceste coloane au furnizat recuperări mai mici decât coloanele C18 monomerice. Autorii au observat, de asemenea că, dimensiunea porilor coloanei poate afecta selectivitatea carotenoidelor cu dimensiuni diferite, precum zeaxantina şi β-caroten, dar nu afectează dacă dimensiunea este asemănătoare (de exemplu, α- şi β-caroten). Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

21



A fost raportat în literatură [39] că, coloanele C18 prezintă o rezoluŃie slabă în separarea izomerilor geometrici (cis – trans) ai carotenoidelor. Sander şi colab. [68] au dezvoltat o coloană C30 polimerică, special proiectată pentru separarea izomerilor carotenoidici. De atunci, numeroase metode analitice au utilizat coloanele C30 polimerice [15], [20], [21], [33], [60], [69]. Separări satisf ăcătoare pentru all-trans-licopen din roşii utilizând o coloană C30 au fost obŃinute de Gomez-Prieto şi colab [33]. Marsili şi Callahan [14] au testat 3 coloane C18 comerciale cu fază inversă: coloana Waters Novo-Pak (4 µm dimensiunea particulelor, 3,9 mm x 150 mm), coloana Supelcosil (5 µm dimensiunea particulelor, 4,6 mm x 250 mm) şi coloana Vydac 201TP (5 µm dimensiunea particulelor, 4,6 mm x 250 mm) pentru a investiga care este cea mai potrivit ă coloană pentru a separa α- caroten de β-caroten. Rezultatele au indicat că rezoluŃia cea mai bună a fost realizată utilizând coloana Vydac 201TP şi a fost selectată pentru determinarea β-carotenului din vegetale. Principalele xantofile din cereale (luteina, zeaxantina şi β-criptoxantina) au fost determinate în mai puŃin de 25 minure utilizând o coloană C30 [15]. Un număr important de carotenoide a fost identificat în uleiul vegetal de palmier [70], precum: fitoen, ε-caroten, neurosporen, α-zeacaroten, β-zeacaroten, licopen, δcaroten, α-caroten, β-caroten şi γ-caroten, din care α- şi β-carotenul reprezintă mai mult de 90%. Înainte de presarea fructelor în scopul obŃinerii uleiului, acestea sunt supuse unui tratament termic utilizând abur presurizat. Încălzirea cauzează izomerizare cis/trans a carotenoidelor. Astfel, un amestec complex de carotenoide apolare şi cis-izomerii lor este obŃinut, ceea ce determină ca separarea să fie dificil de realizat. Acest amestec este analizat prin HPLC utilizând o coloană C30. Această coloană, pe lângă faptul că produce o separare foarte bună a carotenoidelor asemănătoare, precum α- şi β-caroten, contribuie şi la separarea cis-izomerilor, ceea ce nu este posibil utilizând o coloană C18.

2.3.1.3. Temperatura coloanei Un alt factor important care trebuie luat în considerare pentru a realiza o separare satisf ăcătoare a carotenoidelor este temperatura coloanei. Diverşi autori [8], [71] au afirmat că modificări ale temperaturii cauzează schimbări semnificative în răspunsul cromatografic al carotenoidelor; deci, este important a lucra la temperaturi constante. Scott şi Hart [71] au studiat efectul temperaturii coloaei în separarea unui amestec de carotenoide dintr-o soluŃie de referinŃă standard şi dintr-un extract al unui aliment uscat. Au fost testate 4 temperaturi diferite (15, 20, 22,5, 25 şi 300C) şi rezultatele au indicat că schimbările de temperatură afectează timpul de eluŃie şi profilul. Cea mai bună separare a fost realizată la 20 – 22,50C. Asemănător, Huck şi colab. [8] au optimizat temperatura coloanei pentru a realiza o separare eficientă a luteinei, zeaxantinei, β-criptoxantinei şi β-carotenului. Temperatura a fost variată în intervalul 21 – 800C. Cea mai bună selectivitate a fost realizată la 210C şI la temperaturi mai mari de 600C degradarea carotenoidelor a fost semnificativă.

2.3.2. Cromatografia de lichide – spectrometria de mas ă (LC – MS) LC – MS poate fi folosită în identificarea carotenoidelor deoarece furnizează informaŃii despre structură şi în plus, este o metodă foarte sensibilă. Metodele LC – MS Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

22



dezvoltate pentru analiza carotenoidelor include în principal ionizarea la presiune atmosferică (APCI – atmospheric pressure chemical ionization) [8], [19], [21], [72], [73], [74] sau ionizare electrospray (ESI – electrospray ionization) [28]. Lacker şi colab. [60] au dezvoltat o metodă pentru identificarea unui amestec de carotenoide, incluzând astaxantina, cantaxantina, zeaxantina şi β-caroten, precum şi cistrans izomerii β-carotenului utilizând LC – MS în modul APCI. Analiza a fost realizată pe o coloană 25 cm x 4,6 mm, umplută cu ProntoSil silicagel 3 µm, modificată cu triacontiltriclorosilan C30, iar ca fază mobilă a fost utilizat amestecul MeOH : MTBE (70:30, v/v). Spectrele de masă au fost realizate în intervalul m/z 200 – 700. O metodă HPLC – MS – MS (APCI) pentru identificarea carotenoidelor din diferite vegetale a fost descrisă de Huck şi colab. [Error! Bookmark not defined. ]. O coloană C18 Phenomenex Luna (25 cm x 2 mm, 5 µm) a fost utilizată ca fază staŃionară şi sistemul de faze mobile a constat din ACN (0,1% BHT) : MeOH (conŃinând 0,05 M acetat de amoniu şi 0,05% TEA) : CHCl3 (conŃinând 0,1% BHT) : n-heptan (conŃinând 0,1% BHT) (50:40:5:5, v/v/v/v) la un debit de 0,2 mL/min. Spctrele de masă au fost înregistrate în domeniul m/z 300 – 2000. Limita de detecŃie a fost la nivel de nanograme. Unii autori au utilizat spectrometria de masă pentru a asigura identificarea corectă a peak-ului şi puritatea în matricea complexă. Murkovic şi colab. [19] au utilizat LC – MS – APCI pentru a confirma prezenŃa carotenoidelor în diferite varietăŃi de dovleac. HPLC – MS (ESI) a fost utilizată de Hadden şi colab. [28] pentru a confirma prezenŃa carotenoidelor în extractul de crăiŃă. Careri şi colab. [32] au utilizat cromatografia de lichide cu fază inversă – spectrometria de masă (electrospray) pentru separarea β-carotenului şi xantofilelor. Separarea a fost realizată pe două coloane ODS Hypersil conectate în serie (200 x 2,1 mm, 5 µm şi 100 x 2,1 mm, 5 µm) şi faza mobilă ACN : MeOH (0,1 M acetat de amoniu) : DCM. Determinările au fost realizate prin operarea spectrometrului de masă în domeniul m/z 500 – 650. Breithaupt şi colab. [74] au utilizat LC – APCI – MS pentru identificarea a 8 monoesteri ai luteinei produşi de diesterii luteinei din crăiŃă (Tagetes erecta L.) după o saponificare enzimatică incompletă a diesterilor luteinei. Separarea a fost realizată pe o coloană C30 (250 x 4,6 mm diametru interior) şi faza mobilă constituită din doi eluenŃi (A) MeOH : MTBE : apă (81:15:4, v/v/v) şi (B) MeOH : MTBE : apă (6:90:4, v/v/v). Spectrele de masă au fost înregistrate în domeniul m/z 80 – 1200. A fost descrisă o metodă pentru separarea şi identificarea esterilor zeaxantinei din anumite extracte de plante utilizând LC – APCI – MS [73]. Pentru separare, o coloană C30 (250 x 4,6 mm diametru interior, 5 µm) menŃinut ă la 300C a fost utilizată. Spectrele de masă ale esterilor zeaxantinei au fost înregistrate în domeniul m/z 400 – 1200. Limita de detecŃie a diesterilor zeaxantinei a fost 0,4 µg/mL. Carotenoidele prezente în mango, all-trans-β-caroten, all-trans- şi cis-βcriptoxantina, all-trans-zeaxantina, all-trans- şi cis-violaxantina, all-trans şi cisneoxantina au fost identificate utilizând spectrometru de masă cuplat la un cromatograf de lichide într-un experiment realizat de Mercadante şi colab. [75]. În tabelul 3 au fost selectate câteva metode HPLC recent utilizate în analiza carotenoidelor.


23



Tabelul 3 – Câteva metode HPLC recente utilizate pentru analiza carotenoidelor din diverse surse Proba Fructe şi legume tradiŃionale din Portugalia [76]

ExtracŃie Eter de petrol

Cartof dulce ( Ipomoea batatas) [77] Caise, dovleac [78]

Hexan:acetonă:EtOH, 2:1:1

Vegetale [79]

Acetonă rece

Planta ierbacee Potamogeton crispus [80] Cartofi (Solanum phureja) [81] Diferite fructe, legume [82]

Eter de petrol:acetonă, 1:1

Acetonă:hexan, 1:1

acetonă MeOH

Coloana 100 x 4,6 mm, 5 µm cuplată cu C18-RP (250 x 4,6 mm, 5 µm) C30 250 x 4,6mm, 5µm C30-RP 150 x 3 mm 3 µm C18 250 x 4,6 mm, 5 µm 150 x 4,6 mm C30 250 x 4,6 mm 3 µm C30 150 x 4,6 mm 3 µm

Faza mobilă ACN:MeOH:DCM, 75:20:5

DetecŃia UV-Vis DAD

A: MeOH:ACN:apă, 84:12:2 B: DCM A: ACN:MTBE:apă, 81:15:4 B:MeOH:MTBE:apă, 4:92:4 ACN:DCM:MeOH, 6:2:2 A: MeOH:ap ă, 90:10 B: acetat de etil

DAD

MeOH:MTBE (diferite procente)

UV-Vis

A:MeOH:MTBE:apă, 95:3:2 B:MeOH:MTBE:apă, 8:90:2

DAD

DAD – MS UV-Vis – DAD LC – MS

2.4. Alte metode O altă metodă de analiză folosită în determinarea conŃinutului de carotenoide este spectroscopia cu reflexie în infraroşu apropiat (NIRS – Near Infrared Reflectance Spectroscopy), considerată a fi o metodă rapidă, precisă şi nepoluantă pentru analiza calitativă şi cantitativă în domeniul alimentar [83]. A fost utilizat ă la determinarea conŃinutului total de carotenoide din morcovi [84] şi boabe de grâu [85], şi în special unele carotenoide, precum licopen şi luteina din produsele pe bază de roşii [86], zeaxantina şi luteina în boabele de porumb [87]. Studiul realizat de X. Chen şi colab. [88] a folosit NIRS pentru a determina conŃinutul de luteină şi β-caroten din varza furajeră ( Brassica oleracea).

3. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip flavonoide Flavonoidele sunt în mare parte molecule plane şi variaŃia lor structurală derivă de la modelul de substituŃie: hidroxilare, metoxilare, prenilare sau glicozilare. Flavonoidele sunt împărŃite în: flavone, flavonoli, flavanone şi flavanoli în funcŃie de prezenŃa grupării carbonil în poziŃia C-4, grupării OH în poziŃia C-3, legăturii simple saturate între C-2 şi C-3, şi o combinaŃie între absenŃa grupării carbonil din C-4 cu o grupare OH în poziŃia C-3 (figura 2 ). Deşi câteodată se găsesc în formă agliconă, majoritatea flavonoidelor din plante sunt prezente ca O-glicozide, în care una sau mai multe grupări hidroxil ale agliconei sunt Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

24



legate la un zahar, formând o legătură O – C glicozidică. Există anumite grupări hidroxil în flavonoide care sunt de obicei glicozilate, acestea fiind: gruparea 7-hidroxil din flavone, flavanone şi izoflavone şi grupările 3- şi 7- hidroxil din flavonoli şi flavanoli. Izoflavonoidele sunt flavonoide cu inelul B ataşat în poziŃia C-3 a inelului C. Aceasta exclude posibilitatea existenŃei unei legături de hidrogen în poziŃia 3, ceea ce determină ca activitatea antioxidantă a izoflavonei să fie redusă [89]. Toate au ca structura de bază flavona (2-fenil benzopirona). În tabelul 4 sunt prezentate câteva exemple de flavonoide şi surse ale acestora. HO 7 A

O C

5 OH

4 O

HO

2

O

2' B 4'

O OH

OH Daidzeina (Izoflavona)

Genisteina (Izoflavona)

OH

OH HO

OH

O

OH

HO

O

O OH

OH

Apigenina (Flavona)

Catechina (Flavanol) OH

OH HO

HO

O

OH

O

OH

O

Narigenina (Flavanona)

OH OH

O Quercetina (Flavonol)

Figura 2 – Structura chimică a unor flavonoide


25



Această clasă de compuşi influenŃează sănătatea umană şi a animalelor, datorită importanŃei lor în dietă, care este atribuită proprietăŃilor lor antioxidante. Un număr mare de publicaŃii referitoare la efectele benefice ale flavonoidelor asupra sănătăŃii, precum cancer, boli de inimă au fost prezentate [90].

Tabelul 4 – Câteva exemple de flavonoide şi surse ale acestora Tipul de flavonoide Flavonoli quercitina caempferol Flavone rutina luteolina apigenina Flavanoli (Epi)catechina Flavanone naringenina hesperidina Antocianidine cianidina delfinidina Izoflavone

Surse

ceapă, măr, struguri negrii, ceai, broccoli andivă, praz, broccoli, grapefrui, ceai ceapă, măr, struguri negrii, ceai, broccoli lă mâie, măsline, Ńelină, gogoşar Ńelină, pătrunjel struguri negrii, mere citrice suc de portocale struguri, căpşuni, zmeură vinete boabe de soia, legume

4. Metode de determinare a flavonoidelor 4.1. Pregătirea probei Pregătirea probei în cazul plantelor şi alimentelor începe cu etapa de mărunŃire, înaintea extracŃiei cu etanol apos sau metanol. Câteva studii au urmat procedura descrisă de Coward şi colab. [91]. O probă alimentară congelată-uscată (0,5 g) şi 5 µg de daidzein deuterat (standard intern) au fost dispersate prin sonicare şi extrase cu 80% metanol apos (5 mL) prin agitare timp de o oră la 600C. Amestecul a fost răcit şi centrifugat timp de 5 minute, extractul de solvent a fost îndepărtat şi reziduurile redizolvate în etanol apos (2 x 2,5 mL). Extractul rezultat a fost concentrat şi lipidele îndepărtate prin extracŃie în mai multe părŃi cu hexan. După uscarea fazei apoase alcoolice sub azot, reziduul a fost redizolvat în 50% metanol apos (10%) înaintea analizei LC. Recent, flavonoidele glicozilate acilate au fost caracterizate din conopidă [92]. Utilizând această metodă această metodă, conopida congelată-uscată (70 g) a fost extrasă prin fiebere cu 3 L de apă distilată timp de o oră. Extractul a fost mai departe amestecat cu particule de Amberlite XAD-2 şi agitat pentru a reŃine compuşii fenolici pe suprafaŃa particulelor neionice de Amberlite. Particulele de Amberlite au fost introduse în coloana cromatografică, spălate cu apă distilată (5 L), şi eluate cu metanol. Extractul metanolic a fost uscat şi redizolvat în 50% metanol apos pentru a fi analizat mai departe. Trebuie notat că extracŃia glicozidelor flavonoidelor în solvenŃi încălziŃi poate conduce la modificări de compoziŃie. Aceasta este o problemă mai ales pentru esterii malonil ai glicozidelor flavonoidelor. Aceştia suferă hidroliză puternică la gruparea malonil chiar şi la temperatura camerei. Acest lucru se poate întâmpla şi în autosampler Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

26



în timpul analizei. Esterii malonil pot de asemenea suferi decarboxilări generate de căldură (pentru a forma acetilglicozide) în stare uscată. Pentru câteva alimente care conŃin flavonoide, aceasta poate avea loc în timpul prelucrării, deci înaintea analizei lor în experiment [91]. Pentru a depăşi aceste probleme, alte metode noi de pregătire a probei precum extracŃia cu fluide supercritice în contracurent şi extracŃia cu lichide presurizate au fost utilizate în analiza flavonoidelor din plante [93], [94]. În tehnica în contracurent, o probă lichidă este introdusă în mijlocul coloanei umplute, printr-un orificiu care este localizat peste orificiul de intrare a CO2, creând un contracurent între debitul de probă (descendent) şi debitul de CO2 (ascendent). CO2 supercritic a fost des utilizat în metodele de prelucrare a citricelor [95]. Această metodă este potrivită pentru extracŃia componenŃilor volatili. Un avantaj particular al cromatografiei de lichide – spectrometriei de masă (LC – MS) constă în capacitatea acestei metode de a determina atât formele libere, cât şi cele conjugate ale flavonoidelor. Spre deosebire de GC – MS, când se utilizează LC – MS etapa de extracŃie nu este de obicei necesară. Printre metodele analitice folosite în analiza flavonoidelor sunt prezentate în literatură: HPLC [96] , HPLC – MS [97], GC – MS [98], LC multidimensional ă [99].

4.2. Spectrometria de masă în analiza flavonoidelor Datorită importanŃei flavonoidelor şi glicozidelor lor în organismele vii, identificarea şi/sau determinarea structurală a acestor compuşi în Ńesutul plantelor joacă un rol important. Spectrometria de masă este una din metodele fizico-chimice aplicată în determinarea structurală a compuşilor organici. Caracteristica MS este utilizarea unor diferite principii fizice, atât pentru ionizarea probei, cât şi pentru separarea ionilor, produşi conform raportului m/z (m – masă, z – sarcină). Aplicarea MS în analiza glicozidelor flavonoidelor s-a dezvoltat odată cu apariŃia aşa numitelor tehnici de ionizare “blânde”. Compuşii acestei clase sunt polari, nevolatili şi instabili termic. Efectul electronului (EI – electron impact), cu energii ale electronului cuprinse între 10 – 100 eV, şi ionizarea chimică (CI – chemical ionization) nu sunt potrivite pentru analiza MS a glicozidelor flavonoidelor. Ambele metode necesită ca analitul să fie în fază gazoasă pentru ionizare, şi derivatizarea grupărilor hidroxil (metilare, trimetilsilare şi acetilare) este necesară. Prin introducerea tehnicii de ionizare prin desorbŃie, analiza glicozidelor flavonoidelor f ără derivatizare este posibilă. Dealungul timpului au fost introduse şi alte tehnici: FAB (fast atom bombardment), LSIMS (liquid secondary ions mass spectrometry). Cele mai interesante şi utilizate metode din punct de vedere al studiilor structurale ale glicozidelor flavonoidelor sunt: ESI şi APCI [100]. Din spectrele de masă pot fi obŃinute următoarele informaŃii cu privire la glicozidele flavonoidelor: a) masa moleculară b) strucrura agliconei (modelul de hidroxilare, poziŃia inelului B în inelul C) c) informaŃii despre acilarea grupărilor hidroxil ale zaharului şi posibila metilare a hidroxidului agliconic Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

27



d) numărul de inele de zaharuri şi configuraŃia lor. Aşa cum a fost prezentat mai sus, flavonoidele sunt diferite din punct de vedere structural şi în general fac parte dintr-un amestec complex izolat din extractul de plante. Deşi, GC –MS a fost principala metodă folosită în analiza moleculelor mici în ultimii 20 de ani, în prezent nu este a şa de des folosită în analiza flavonoidelor datorită volatilităŃii limitate a glicozidelor flavonoidelor care se găsesc în fructe şi vegetale. Odată cu apariŃia surselor API, LC – MS a devenit cea mai utilizat ă metodă pentru analiza flavonoidelor în amestecuri complexe. Deoarece LC –MS furnizează masa moleculară a fiecărui component cu timpul lui de retenŃie, este folosită pentru identificarea compuşilor cunoscuŃi. O caracterizare adiŃională a componentelor cunoscute sau necunoscute poate fi realizată prin cuplarea LC cu spectrometria de masă. Este utilizată, de asemenea, şi pentru analiza cantitativă. EficienŃa ionizării unor diferite surse API, de exemplu ESI şi APCI, a fost revizuită anterior de Rauha şi colab. [101]. ESI – MS în modul ion-negativ cu tampon acetat de amoniu acid ca fază mobilă a furnizat cea mai bună sensibilitate. De Rijke şi colab. [102] au prezentat un studiu comparativ în ceea ce priveşte performanŃele analitice ale tehnicilor APCI şi ESI, atât în modul ion-pozitiv, cât şi în cel negativ. Cele mai bune răspunsuri MS au fost în modurile ion-negativ, în general tehnica APCI mai bună decât ESI. Rezultatele obŃinute cu APCI şi ESI negativ au fost similare pentru toate flavonoidele aglicone. Claeys şi colab. au publicat o serie de lucrări despre utilizarea spectrometriei de masă în determinarea structurii glicozidelor flavonoidelor din plante [103], [104], [105]. Recent, ei au raportat aplicaŃia LC – ESI –MS şi disocierea prin ciocnire indusă (CID) în caracterizarea structurală a O-glicozidelor flavonolilor acilaŃi din semintele de + Carrichtera annua [104]. Grupările acil produc ioni caracteristici în spectrele [M + H] şi [M + Na]+. Cuplarea cu spectrometria de masă a fost utilizată pentru caracterizarea tipului legăturii interglicozidice a izomerilor O-diglicozidici ai flavonoidelor. Scindarea legăturii O-glicozidice concomitent cu o aranjare a hidrogenilor conduce la eliminarea reziduurilor de monozaharide dehidratate, de exemplu: pierderea a 162 u (hexoză), 146 u (deoxihexoză), 132 u (pentoză). Flavonoidele metilate sunt caracterizate de o pierdere de 15 u, având drept rezultat [M – H – CH 3]- [106]. Metoda ESI – MS/MS este destul de bună pentru a deosebi câŃiva izomeri ai flavonoidelor metilate pe baza spectrelor de ioni. Cuyckens şi Claeys [103] au studiat optimizarea cromatografiei de lichide pe baza detecŃiei ESI –MS şi a detectorului DAD pentru analiza glicozidelor flavonoidelor. În modul ion-pozitiv, analiza ESI –MS în metanol conŃinând 1% acid acetic a fost pe departe cea mai sensibilă, în timp ce faza mobilă ACN / apă conŃinând 0,5% acid formic a prezentat cea mai bună sensibilitate în analiza LC/ESIMS/UV – DAD. În modul ion-negativ, cea mai bună sensibilitate a fost obŃinută cu o fază mobilă ce conŃine 0,1% acid formic, în timp ce ad ăugarea de baze a redus sensibilitatea. S-a observat de asemenea că prezenŃa acidului acetic în faza mobilă determină creşterea sensibilităŃii, reducând timpul de retenŃie în coloana LC. Hvattum [107] a raportat identificarea în extractul de măceş a unui antocian şi a câtorva glicozide ale quercetinei. Determinarea stereochimică a resturilor de hexoză şi pentoză în flavonoidele acetilate a fost realizată utilizând spectrometria de masă [108]. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

28



Pe lângă O-glicozidele flavonoidelor, în multe plante medicinale şi vegetale se găsesc şi C -glicozidele flavonoidelor [109]. În cazul C -glicozidelor, zaharul este direct legat de partea flavonoidică prin intermediul unei legături C – C rezistent ă la acid. Tehnica MS –MS cu CID permite caracterizarea C glicozidelor atât în modul ion-pozitiv, cât şi în cel negativ. Wang şi Sporns [110], [111] au fost primii care au utilizat tehnica MALDI –TOF (matrix-assisted laser desorption – time-of-flight) în analiza izoflavonelor în produsele din soia. Izoflavonele au fost predominant ionizate în forma protonat ă cu cantităŃi foarte mici de ioni de sodiu şi potasiu. În analiza, a fost observat ă pierderea restului glicozidic. Aceeaşi tehnică a fost folosită în analiza cantitativă a glicozidelor flavonolilor din migdale [112]. Yang şi Chien [113] au demonstrat detecŃia oligomerilor: catechină, epicatechină şi derivaŃii lor galoilaŃi în seminŃele de struguri utilizând MALDI – TOF. În tabelul 5 sunt prezentate câteva comparaŃii în cea ce priveşte tehnicile de ionizare în spectrometria de masă în cazul analizei flavonoidelor.

Tabelul 5 – ComparaŃii privind tehnicile de ionizare în spectrometria de masă pentru analiza flavonoidelor Tehnica de Aplica Ńia principală ionizare EI În principal analiza agliconelor (calitativă şi cantitativă) FAB

Glicozidele flavonoidelor

MALDITOF

Glicozidele flavonoidelor, proantocianidine

APCI

Agliconele flavonoidelor

ESI

Diferite flavonoide (calitativă şi cantitativă)

Avantaje

Dezavantaje

Poate fi cuplată uşor cu GC Sensibilitate ridicat ă Identificarea compuşilor necunoscuŃi Domeniu de masă extins până la 7000 Da Metodă de ionizare blândă

Necesită derivatizare Domeniu de masă limitat Posibilă descompunere termică Fragmentări mari Sensibilitate redusă Necesită solubilitatea probei în matrice Picuri ale matricei de bază mari Limite mari de masă RezoluŃie scăzută Suportă concentraŃii la nivel Semnalele de bază ale matricei mM ale sărurilor sunt mari, puŃin folosită pentru molecule mici Domeniu de masă până la Sensibilitatea poate varia cu 2000 Da tipul compusului Foarte sensibilă (femtomoli) Posibilitatea unei Susceptibilă pentru descompuneri termice HPLC/MS Domeniu mare de masă ToleranŃă relativ scăzută la Susceptibilă pentru săruri HPLC/MS Analiza poate fi dificilă pentru RezoluŃia sarcinii ~ 2000 compuşii neionizabili Sensibilitate de la femtomol ToleranŃă mică sau chiar la picomol absentă pentru amestecurile neomogene

EI – electron impact; FAB – fast-atom bombardment; MALDI-TOF – Matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight; APCI – atmospheric pressure chemical ionization ESI – electrospray ionization Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

29



4.3. Cromatografia de înaltă performanŃă pentru analiza flavonoidelor Pentru separarea flavonoidelor, condiŃiile cromatografice ale metodei HPLC includ utilizarea unei coloane C18 cu fază inversă; detector diodă UV-Vis şi un sistem de solvent binar conŃinând apă acidifiată (solvent A) şi un solvent organic polar (solvent B). Separarea necesită un timp de 1 oră la un debit de 1.0 – 1.5 mL/min. De obicei, solventul A este un acid sau un aditiv, precum fosfatul. Solventul B este pur sau metanol sau acetonitril acidifiat. Separarea şi determinarea cantitativă a flavonoidelor din trestia de zahăr a fost realizată folosind HPLC – UV [114]. O metodă cu separare bună a flavonoidelor a fost descoperita de R. Tsao şi colab. [115] care au utilizat o fază mobilă binară constând din 6% acid acetic în 2mM soluŃie apoasă de acetat de sodiu (v/v, pH final 2,55) (solvent A) şi acetonitril (solvent B) şi coloana C18 cu fază inversă. Utilizarea acetatului de sodiu a reprezentat cheia pentru separarea a 25 de flavonoizi din fructe. LC – MS a fost utilizată pentru a demonstra prezenŃa glicozidelor flavonoidelor în miere şi posibila utilizare a acestora ca markeri florali [116]. LC – UV –MS a fost folosită pentru identificarea flavonoidelor din fructele arborelui de papaya Vasconcellea pubescens [117]. În tabelele 6 şi 7 sunt prezentate câteva publicaŃii recente referitoare la analiza GC şi LC a flavonoidelor.

Tabel 6 – PublicaŃii recente privind analiza GC a flavonoidelor Metoda GC – MS [118] GC – MS [119] HT – HRGC – MS [120] GC – MS [121] GC – MS [122] HT – HRGC – MS şi FID[123]

Derivatizare TMS TMS none TBDMS

Proba Diferite extracte de ierburi Ginkgo biloba Vellozia graminifolia Fructe şi alune

Propolis

Lonchocarpus urucu

TMS: trimetilsilil; HT: high-temperature; HR: high-resolution; TBDMS: N-(terŃbutildimetilsilil)-N-metiltrifluoroacetamid ă;

Tabel 7 – PublicaŃii recente privind analiza LC a flavonoidelor Coloane 25 x 2,0 mm, 5µm coloană C18 [124]

150 x 3,9 mm, 5µm coloană C18 [125] 150 x 3,0 mm, 5µm coloană C18 [126]

SolvenŃi MeOH : acid formic apos 0,01% Izocratic 0,5 mL/min Apă : ACN, acidifiat cu acid acetic (0,1%), 1 mL/min A: apă : acid formic, 95:5 B: MeOH : acid formic, 95:5

250 x 4,6 mm, 5µm coloană C18 [127]

A: apă, 1% acid formic B: ACN

DetecŃie HPLC – ESI

Proba Boabe de soia

HPLC

Soia, trifoi roşu

HPLCDAD-MS (ESI+) HPLCDAD-MS (ESI+)

struguri Mure, afine

căpşuni,


30



Coloane 150 x 3,9 mm, Novapack C18 [128]

SolvenŃi A: apă : acid formic, 90:10 B: apă : MeOH : acid formic, 45:45:10 A: apă : acid trifluoracetic 0,1% B: acetonitril : apă, 50:50 A: apă : acid formic, 99:1 B: ACN : acid formic, 99:1 A: apă : acid formic, 99:1 B: ACN : acid formic, 99:1 A: apă : acid formic, 99:1 B: ACN : acid formic, 99:1

DetecŃie HPLC-DAD MS (ESI+)

Proba Cojile de struguri

LC–DAD MS (ESI +) HPLC-DAD -MS (ESI±) UPLC(ESI±)-TOF HPLC–ESI (±) –ITMS

afine

A: apă : acid acetic, 99:1 B: ACN : acid acetic, 90:10

HPLC – ESI Linte – MS

150 x 4,6 mm, 5µm Capcell Pak C18 [129] 250 x 4,6 mm, 5µm coloană C18 [130] 100 x 1 mm, 1,7 µm UPLC BEH C18 [131] 125 x 3 mm, 5µm LichroCart Purospher RP-18 [132] 125 x 3 mm, 5µm Lichrospher 100 RP-18 [133]

Ceai verde Ceai verde Afine

4.4. Alte metode Electroforeza capilară este o tehnică economică şi printre avantaje menŃionăm: volumul de injectare al probei redus, randament ridicat, timp redus al analizei, care pot fi folositoare în determinarea rapidă şi eficientă a flavonoidelor din sisteme complexe. Metoda electroforezei capilare a fost aplicată pentru determinarea a nouă flavonoide (inclusiv două rare) în planta medicinală Anaphalis margaritacea [134]. De asemenea, metoda electroforezei capilare cuplată cu detecŃia electrochimică (CE – ED) a fost dezvoltată pentru identificarea şi determinarea a cinci flavonoide din planta chinezească Portulaca oleracea L. [135]. DetecŃia electrochimică, bazată pe reacŃia electrochimică a analiŃilor la suprafaŃa electrodului, furnizează una dintre cele mai selective şi sensibile metode de detecŃie pentru CE. Majoritatea flavonoidelor sunt compuşi electroactivi, deci CE – ED a fost de asemenea utilizat ă pentru determinarea unor flavonoide din plante [136]. Studiul realizat de Y. Peng şi colab. [137] a utilizat CE – ED pentru analiza cantitativă şi calitativă a markerilor flavonoidici din Frucus aurantii din diferire zone geografice. Autorii au concluzionat că metoda CE – ED reprezintă o tehnică importantă pentru markerii chimici, fiind o metodă alternativă, competitivă şi suplimentară metodei HPLC. O altă metodă descrisă în literatură [138] este detecŃia amperometrică a flavonoidelor din plante utilizând un electrod modificat cu lacază (o oxidoreductază ce conŃine cupru şi care se găseşte în multe plante şi microorganisme). Lacaza catalizează îndepărtarea atomului de hidrogen din gruparea hidroxil din poziŃia orto- şi para- a substratului fenolic. Principiul metodei constă în imobilizarea enzimei prin adsorbŃie pe suprafaŃa unui electrod de grafit. În acest studiu electrodul a fost testat pentru măsurători electrochimice a unor flavonoide, precum catechina, epicatechina, prodelfinidina. Metoda HPLC reprezintă cea mai potrivită alegere pentru identificarea flavonoidelor, deoarece metodele de separare sunt deja bine stabiliate şi cuplarea cu MS este uşor de realizat. Recent, dezvoltarea de noi tehnici, precum UPLC contribuie la reducerea timpului de analiză f ără a compromite rezoluŃia [139]. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

31



5. Caracterizare generala a compusilor biochimici de tip terpene Terpenele reprezintă o clasă de compuşi organici produse de un număr variat de specii de plante. Din punct de vedere al scheletului hidrocarbonat, pot fi împărŃite în monoterpene (C10) ce conŃin două unităŃi izoprenice, diterpene (C20) şi triterpene (C30) [140]. În figura 3 sunt prezentate structurile chimice a unor terpene. OH OH

geraniol

mircen

linalool

β-ocimen

O OH

α-pinen

mentol

camfor

limonen

Figura 3 – Structura chimică a unor terpene. Cromatografia de gaze a fost folosită încă de la început pentru separarea diferitelor terpene din produse naturale [141], cât şi în caracterizarea de noi uleiuri esenŃiale. Datorită volatilităŃii terpenelor, informaŃia cea mai utilă este obŃinută utilizând tehnici succesive, care implică în prealabil metode cromatografice sau spectroscopice. În unele cazuri poate fi aleasă metoda HPLC fiind potrivită pentru analiza glicozidelor terpenelor care nu sunt volatile. Au fost folosite o serie de metode pentru extracŃia şi concentrarea probei, separarea cromatografică a constituienŃilor şi caracterizarea acestora.


32



6. Metode de determinare a terpenelor 6.1. ExtracŃia probei şi concentrarea ExtracŃia terpenoidelor volatile din plante este de obicei realizată utilizând distilarea cu abur. Au fost recent raportate posibile probleme referitoare la aceast ă metodă, deoarece poate avea loc degradarea unor monoterpene din cauza hidratării catalitice acide [142]. O modificarea a acestei metode implică extracŃia cu apă supraîncălzită [143], şi în acest caz substanŃele dizolvate pot fi extrase cu hexan. De asemenea a fost folosită simultan distilarea cu abur şi extracŃia cu diclormetan [144]. MicroextracŃia în fază solidă [145], [146] a fost utilizat ă, dar recuperările monoterpenelor nu au fost aşa de mari precum în cazul celorlalte metode. ExtracŃia cu microunde a fost folosit ă pentru extracŃia volatilă a terpenelor din diverse plante [147]. Comparând recuperările relative a distilării cu abur, distilării şi extracŃia cu diclormetan, extracŃia cu microunde şi extracŃia cu fluide supercritice folosind CO2, cel mai mare număr de compuşi identificaŃi, 79, a fost în cazul metodei SFE, comparativ cu 67 pentru extracŃia cu microunde , 61 pentru distilarea şi extracŃia cu DCM, şi doar 43 utilizând distilarea cu abur. CantităŃi mici de constituienŃi din materialul plantelor au fost colectate utilizând metoda headspace-ului, care implică volatilizarea terpenoidelor din probă într-un spaŃiu închis, şi apoi analizarea constituienŃilor în această fază gazoasă. Headspace-ul oferă anumite avantaje: este o metodă nedistructivă a probei, concentrează compuşii volatili permiŃând detecŃia acestora chiar şi la nivel de urme şi deci, necesită cantităŃi mici de probă, compuşii nevolatili (grăsimi, polizaharide, parafine) nu sunt extraşi printr-o astfel de metodă, evitând astfel o procedură dificilă de pregătire a probei necesară analizei GC – MS. Mono- şi sescviterpenele sunt compuşi foarte volatili, putând fi uşor captate în headspace, diterpenele prezintă volatilitate redusă, iar triterpenele foarte scăzută. Terpenoidele volatile pot exista şi în formă glicozidică în majoritatea plantelor, şi această formă nevolatilă reprezintă precursorul biosintetic al terpenelor libere. Pentru extracŃie, se efectuează hidroliza glicozidei fie enzimatic cu β-glucozidază, fie o hidroliz ă acidă [148]. Agliconele libere rezultate (terpenele volatile) pot fi analizate prin GC. Pentru separarea terpenelor hidrocarbonate de compuşii oxigenaŃi este folosită extracŃia în fază solidă cu silicagel ca fază staŃionară şi hexan şi dietil eter ca fază mobilă. O altă posibilitate ar fi utilizarea detectorului ionizare în flacără cu oxigen (O-FID) pentru determinarea selectivă a compuşilor oxigenaŃi [149].

6.2. Separarea cromatografică a constituienŃilor GC este cea mai eficientă metodă cromatografică pentru separarea terpenelor. Coloanele capilare cu dimetil polisiloxan (fază nepolară) şi Carbowax 20M (fază polară) sunt folosite. Faza Carbowax 20M include DB-Wax, BP-20, PEG 20M, HP 20, în timp ce faza dimetil polisiloxan, SE-30, SF-96, OV-1, OV-101, CPSil 5, BP 1, DB1, DB 5, HP 1 [149]. Lungimea coloanei poate fi cuprinsă între 25 şi 100 m, şi grosimea filmului din faza staŃionară între 0,2 – 0,7 µm. Temperaturile de operare sunt de obicei între 500 (700) Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

33



– 2800, la 50 /min. Odată cu descoperirea fazelor chirale a fost posibilă identificarea enantiomerilor terpenelor volatile. Câteodată selectivitatea unei singure coloane nu este suficientă, în special când amestecul este foarte complex. Au fost folosite un număr de tehnici cuplate, precum GC – GC şi HPLC – GC, care furnizează o rezoluŃie mai bună. Ambele permit utilizarea de tehnici cu diferite capacităŃi de separare, combinând coloane chirale şi achirale, polare şi nepolare, sau HPLC cu fază inversă cu GC cu temperatura programată. Analiza GC-GC a fost folosită pentru a separa amestecul complex de enantiomeri din lămâie [150]. Faza staŃionară butildietilsilil- β-ciclodextrina a fost capabilă de a evalua enantiomerii: limonen, linalool, β-pinen, sabinen, α-terpineol. Comparativ cu separarea cu o singură coloană numărul de constituieŃi identificaŃi este mai mare [151]. RezoluŃia crescută în cazul HPLC – GC permite deosebirea între uleiuri provenite de la acelaşi material, dar preparate diferit. Deci, analiza enantiomerilor este realizată cu coloane ce conŃin ca fază staŃionară ciclodextrine modificate, care sunt foarte eficiente şi stabile la temperatura comparativ cu cele nemodificate. Mecanismul separării chirale implică interacŃii ale analiŃilor în cavitatea chirală a ciclodextrinelor modificate. În prezent există trei ciclodextrine disponibile comercial, α-, β-, γ- în funcŃie de dimensiunea cavităŃii [152].

6.3. Detectarea şi caracterizarea constituienŃilor Detectorul ionizare în flacără (flame ionization detector – FID) este cel mai utilizat pentru detecŃia şi cuantificarea terpenelor. Un alt detector este detectorul fotoionizare. ConstituienŃii separaŃi pot fi identificaŃi prin cromatografie utilizând standarde dacă ei sunt bine separaŃi şi caracterizaŃi, sau identificarea este realizat ă prin compararea cu indicii de retenŃie Kovats (Kovats retention indices RI). Utilizarea acestor date de retenŃie obŃinute de la două coloane GC cu polarităŃi diferite, permite identificarea sigură a unui număr mai mare de terpene dintr-o anumită probă. Cel mai utilizat sistem pentru caracterizarea terpenelor eluate este GC cuplată cu MS. GC – MS poate implica folosirea unui detector MS cvadrupol sau a unui detector obişnuit cu trapă ionică [153]. Combinarea metodei GC cu diferite tehnici MS (EI-MS, CI-MS, MS-MS) oferă rezultatele cele mai bune în rezoluŃia unui amestec complex. Câteodată poate fi folositor a confirma printr-o metodă analitică suplimentară rezultatele obŃinute prin GC şi GC – MS. Acest lucru se poate face prin 13C-RMN care urmează analizei GC pentru a confirma determinarea structurii propusă prin intermediul spectrelor de masă şi a datelor de retenŃie. Pentru deosebirea izomerilor, ceea ce se întâmplă des în grupul terpenelor, metoda GC – FTIR oferă completări utile [149]. Avantajul spectroscopiei FTIR îl constituie rezoluŃia şi sensibilitatea mare. Interpretarea destul de lungă şi absenŃa unei baze de date a spectrelor fazei de vapori determină ca această metodă să nu fie general acceptată în analiza compuşilor volatili. HPLC poate fi folosită atunci când analiza GC a compuşilor termolabili şi/sau a compuşilor polari este dificilă de realizat. Cuplarea cu detectorul DAD este folosit ă. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

34



Studiul realizat de Hamm şi colab. [154] a avut ca scop stabilirea conŃinutului de terpene (în special biomarkeri diterpenici) caracteristici unor specii diferite de tămâie ( Boswellia) utilizând SPME şi GC – MS.

7. Concluzii Majoritatea procedurilor de preparare a probelor pentru determinarea compuşilor din plante sunt dezvoltate în aşa fel încât extractul final introdus în coloanle GC şi HPLC sau capilarele CE să conŃină numai analitul cu toate interferenŃele eliminate. O comparaŃie a tehnicilor de extracŃie descrise anterior pentru izolarea componenŃilor din materialul plantelor este prezentata în tabelul 8 [155].

Tabelul 8 – ComparaŃie între diferite tehnici de extracŃie lichid – lichid utilizate în analiza metaboliŃilor plantelor. ExtracŃie Soxhlet USE ASE MAE SFE Cost scăzut scăzut ridicat mediu ridicat Timp de 6 – 48 h < 30 min < 30 min < 30 min < 60 min extracŃie Solvent 200 – 600 < 50 < 100 < 40 <10 utilizat (mL) USE – ultrasonic extraction; ASE – accelerated solvent extraction; MAE – microwaveassisted extraction; SFE – supercritical fluid extraction În lucrarea realizată de G. Romanik şi colab. [156] sunt prezentate tehnicile de pregătire a materialului plantelor în vederea separării şi analizei cromatografice, printre acestea: extracŃia Soxhlet, extracŃia cu ultrasunete (sonicare), extracŃia accelerată cu solvent, distilare cu abur, procese de membrană, extracŃia cu fluide supercritice, microextracŃia în fază solidă. În figura 4 sunt reprezentate schematic etapele pentru determinarea compuşilor din plante.


35



PLANTE

Pregătirea probei • congelare - uscare • omogenizare

Extractie • MSPD • SE • Soxhlet • SPME

ANALIZA INSTRUMENTAL Ă

Altele • FID • ECD

Altele

LC

GC

GC - MS • Q-MS • IT-MS

Altele • UV • NMR

LC-UV-MS/MS • IT-MS • TOF-MS

CE • UV • ED • MS

TLC • UV • chemical

Figura 4 – Rerezentarea schematică a etapelor în determinarea compuşilor din plante SE: solvent extraction; MSPD: matrix solid-phase extraction; SPME: solid-phase microextraction; MS/MS: tandem mass spectrometry; TLC: thin layer chromatography; FID: flame ionization detection; ECD: electron capture detection; Q: quadrupole; IT: ion-trap, NMR, nuclear magnetic resonance; TOF, time-of-flight.


36


Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII

Legendă generală APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization BHT: butilat de hidroxi toluen CE: Capillary Electrophoresis CI: Chemical ionization mode DAD: Photodiode array detector DCM: diclometan EI: Electron Impact ED: Electrochemical Detection ESI – Electrospray Ionization EtOH: etanol GC: Gas Chromatography LC: Liquid Chromatography THF: tetrahidrofuran MeOH: metanol MS: Mass Spectrometry MTBE: metil-ter Ń -butil eter RP: Reversed Phase SFE: Supercritical Fluid Extraction TEA: trietilamina


37



Bibliografie 1. F. Mattea, A. Martín, M.J. Cocero, J. Food Eng., 2009, 93, 255 2. H. van den Berg, R. Faulks, H.F. Granado, J. Hirschberg, B. Olmedilla, G. Sandmann, S. Southon, W. Stahl, J. Sci. Food Agric., 2000, 80, 880 3. R.A. Bone, J.T. Landrum, Z. Dixon, Y. Chen, C.M Llerena, Experimental Eye Research, 2000, 71, 239 4. N.I. Krinsky, E.J. Johnson, Molecular Aspects of Medicine, 2005, 26, 459 5. L.B. Almeida, M.V.C. Penteado, J. Food Comp. Anal., 1988, 1, 341–352 6. D.B. Rodriguez-Amaya, J. Food Comp. Anal., 1996, 9, 196 7. L.B. Almeida-Muradian, M.D.G. Rios, R. Sasaki, R., Bolletino Chimico Farmaceutico, 1998, 137, 290 8. C.W. Huck, M. Popp, H. Scherz, G.K. Bonn, J. Chromatogr. Sci., 2000, 38, 441 9. N.L. Rozzi, R.K. Singh, R.A. Vierling, B.A. Watkins, J. Agric. Food Chem., 202, 50, 2638 10. M. Edelenbos, L.P. Christensen, K. Grevsen, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 4768 11. C.H. Azevedo-Meleiro, D.B. Rodriguez-Amaya, J. Food Comp. Anal., 2004, 17, 385 12. P.J.M. Hulshof, C. Xu, P. van de Bovenkamp, C.E. West, J. Agric. Food Chem., 1997, 45, 1174 13. B. Gandul-Rojas, M.R.L. Cepero, M.I. Minguez-Mosquera, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 2207 14. R. Marsili, D. Callahan, J. Chromatogr. Sci., 1993, 31, 422 15. E.E. Moros, D. Darnoko, M. Cheryan, E.G. Perkins, J. Jerrell, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 5787 16. A.J. Melendez-Martinez, I.M. Vicario, F.J. Heredia, J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 4219 17. F. Markus, H.G. Daood, J. Kapitany, P.A. Biacs, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 100 18. Y.P.C. Hsieh, M. Karel, J. Chromatogr., 1983, 259, 515 19. M. Murkovic, U. Mulleder, H. Neunteufl, Analysis, 2002, 15, 633 20. V. Hentschel, K. Kranl, J. Hollmann, M.G. Lindhauer, V. Bohm, R. Bitsch, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 6663 21. A.C. Kurilich, S.J. Britz, B.A. Clevidence, J.A. Novotny, J J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 4877 22. M.M. Barth, C. Zhou, K.M. Kute, G.A. Rosenthal, J. Agric. Food Chem., 1995, 43, 2876 23. A.B. Barua, J.A. Olson, J. of Chromatogr.B, 1998, 707, 69 24. E. Gimeno, E. Calero, A.I. Castellote, R.M. Lamuela-Raventos, M.C. de la Torre, M.C. Lopez-Sabater, J.Chromatogr. A., 2000, 881, 255 25. A.K. Taungbodhitham, G.P. Jones, M.L. Wahlqvist, D.R. Briggs, Food Chem., 1998, 63, 577 26. C.H. Lin, B.H. Chen, J. Chromatogr. A, 2003, 1012, 103 27. J. Deli, P. Molnar, Z. Matus, G. Toth, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 1517 28. W.L. Hadden, R.H. Watkins, L.W. Levy, E. Regalado, D.M. Rivadeneira, R.B. van Breemen, S.J. Schwartz, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 4189 29. H.S. Lee, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 2563 30. K.E. Sharpless, M. Arce-Osuna, J.B. Thomas, L.M. Gill, J. AOAC Internat., 1999, 82, 288 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

38



31. E. Vagi, B. Simandi, H.G. Daood, A. Deak, J. Sawinsky, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 2297 32. M. Careri, L. Furlattini, A. Mangia, M. Musci, E. Anklam, A. Theobald, C. von Holst, J. Chromatogr.A, 2001, 912, 61 33. M.S. Gomez-Prieto, M.M. Caja, M. Herraiz, G. Santa-Maria, J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 3 34. L. Ferreira de Franca, G. Reber, M.A.A. Meireles, N.T. Machado, G. Brunner, J. Supercrit. Fluids, 1999, 14, 247 35. T. Baysal, S. Ersus, D.A.J. Starmans, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 5507 36. I. Gamlieli-Bonshtein, E. Korin, S. Cohen, Biotechnol. Bioeng., 2002, 80, 169 37. R.L. Mendes, B.P. Nobre, M.T. Cardoso, A.P. Pereira, A.F. Palavra, Inorg. Chim. Acta, 2003, 356, 328 38. A. Chandra, M.G. Nair, Phytochem. Analysis, 1997, 8, 244 39. F. Khachik, G.R. Beecher, M.B. Goli, W.R. Lusby, Methods in Enzymology, 1992, 213, 347 40. F. Granado, B. Olmedilla, I. Blanco, E. Rojas-Hidalgo, J. Agric. Food Chem., 1992. 40, 2135 41. R.X.E. Fernandez, N.W. Shier, B.A. Watkins, J. Food Compo. Anal., 2001, 13, 179– 187 42. J.L. Guil-Guerrero, M.M. Rebolloso-Fuentes, M.E.T. Isasa, J. Food Comp.Anal., 2003, 16, 111 43. L.A. Howard, A.D. Wong, A.K. Perry, B.P. Klein, J. Food Sci., 1999, 64, 929 44. A.S. Huang, L. Tanudjaja, D. Lum, J. Food Comp. Anal., 1999, 12, 147 45. L. Ye, W.O. Landen, R.R. Eitenmiller, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 4003 46. K.L. Goodner, R.L. Rouseff, H.J. Hofsommer, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 1146 47. D.J. Hart, K.J. Scott, Food Chem., 1995, 54, 101 48. S. Otles, Y. Atli, American Laboratory, 2000, 32, 22 49. F. Khachik, G.R. Beecher, N.F. Whittaker, J. Agric. Food Chem., 1986, 34, 603 50. K.J. Scott, Food Chem., 1992, 45, 357 51. W.W. Fish, P. Perkins-Veazie, J.K. Collins, J. Food Comp. Anal., 2002, 15, 309 52. V. Gokmen, S. Bahceci, J. Acar, J. Liquid Chromatography and Related Technologies, 2002, 25, 1201 53. C.H. Lin, B.H. Chen, J. Chromatogr. A, 2003, 1012, 103 54. L. Englberger, J. Schierle, G.C. Marks, M.H. Fitzgerald, J. Food Comp. Anal., 2003, 16, 3 55. L. Mathiasson, C. Turner, H. Berg, L. Dahlberg, A. Theobald, E. Anklam, R. Ginn, M. Sharman, F. Ulberth, R. Gabernig, Food Additives Contaminants, 2002, 19, 632 56. E. Bako, J. Deli, G. Toth, J. Biochem. Biophysical Methods, 2002, 53, 241 57. F. Khachik, M.B. Goli, G.R. Beecher, J. Holden, W.R. Lusby, M.D. Tenorio, M.R. Barrera, J. Agric. Food Chem., 1992, 40, 390 58. U.G. Chandrika, E.R. Jansz, S.M.D.N. Wickramasinghe, N.D. Warnasuriya, J. Sci. Food Agric., 2003, 83, 1279 59. L. Englberger, W. Aalbersberg, P. Ravi, E. Bonnin, G.C. Marks, M.H. Fitzgerald, J. Elymore, J. Food Comp.Anal., 2003, 16, 219 60. T. Lacker, S. Strohschein, K. Albert, J. Chromatogr.,A, 1999, 854, 37 61. K.S. Epler, L.C. Sander, R.G. Ziegler, S.A. Wise, N.E. Craft, J. Chromatogr., 1992, 595, 89 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

39



62. K.S. Epler, R.G. Ziegler, N.E. Craft, J. Chromatogr., 1993, 619, 37 63. S. Gueguen, B. Herbeth, G. Siest, P. Leroy, J. Chromatogr. Sci., 2002, 40, 69 64. L.R. Howard, S.T. Talcott, C.H. Brenes, B. Villalon, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 1713 65. G.A.G. Kiss, E. Forgacs, T. Cserhati, T. Mota, H. Morais, A. Ramos, J. Chromatogr. A, 2000, 889, 41 66. E. Darko, B. Schoefs, Y. Lemoine, J.Chromatogr. A, 2000, 876, 111 67. R.B. Assuncao, A.Z. Mercadante, J. Food Comp. Anal., 2003, 16, 647 68. L.C. Sander, K.E. Sharpless, N.E. Craft, S.A. Wise, Anal. Chem., 1994, 66, 1667 69. P.P. Mouly, E.M. Gaydou, J. Corsetti, J. Chromatogr. A, 1999, 844, 149 70. A. Mortensen, Food Research International, 2005, 38, 847 71. K.J. Scott, D.J. Hart, Food Chem., 1993, 47, 403 72. A. Lienau, T. Glaser, G. Tang, G.G. Dolnikowski, M.A. Grusak, K. Albert, J. Nutrit. Biochem., 2003, 14, 663 73. P. Weller, D.E. Breithaupt, J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 7044 74. D.E. Breithaupt, U. Wirt, A. Bamedi, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 66 75. A.Z. Mercadante, D.B. Rodriguez-Amaya, G. Britton, J. Agric. Food Chem., 1997, 45, 120 76. M.G. Dias, M.F.G.F.C. Camoes, L. Oliveira, Food Chem., 2009, 113, 808 77. S.C. Liu, J.T. Lin, D.J. Yang, Food Chem., 2009, 116, 605 78. C. Kurz, R. Carle, A. Schieber, Food Chem., 110, 2008, 522 79. G. Aruna, B.S. Mamatha, V. Baskaran, J. Food Comp. Anal., 2009, 22, 632 80. D. Ren, S. Zhang, Food Chem., 2008, 106, 410 81. G. Burgos, E. Salas, W. Amoros, M. Auqui, L. Munoa, M. Kimura, M. Bonierbale, J. Food Comp. Anal., 2009, 22, 503 82. A. Perry, H. Rasmussen, E.J. Johnson, J. Food Comp. Anal., 2009, 22, 9 83. H. Cen, Y. He, Trends Food Sci. Technol., 2007, 18, 72 84. H. Schulz, H.H. Drews, R. Quilitzsch, H. Kruger, J. Near Infrared Spectrosc., 1998, 6, 125 85. S.G. Atienza, C.M Avila, M.C. Ramirez, A. Martin, Aust. J. Agric. Res.. 2005, 56, 85 86. A.M.K. Pedro, M.M.C. Ferreira, Anal. Chem., 2005, 77, 2505 87. O.V. Brenna, N. Berardo, J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 5577 88. X. Chen, J. Wu, S. Zhou, Y. Yang, X. Ni, J. Yang, Z. Zhu, C. Shi, J. Food Comp.Anal., 2009, 22, 148 89. R.A. Larson, Phenolic and enolic antioxidants. Naturally Occurring Antioxidants. Boca Raton: CRC press LLC; 1997, 100 90. J.B. Harborne, C.A. Williams, Phytochemistry, 2000, 55, 481 91. L. Coward, M. Smith, M. Kirk, S. Barnes, Am. J. Clin. Nutr., 1998, 68, 1486S 92. R. Llorach, A. Gil-Izquierdo, F. Ferreres, F. Tomas-Barberan, J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 3895 93. C. Yang, Y.R. Xu, W.X Yao, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 846 94. F.J. Senorans, A. Ruiz-Rodriguez, S. Cavero, A. Cifuentes, E. Ibanez, G. Reglero, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 6039 95. A.N. Giannuzzo, H.J. Boggetti, M.A. Nazareno, H.T. Mishima, Phytochem. Anal., 2003, 14, 221 96. K. Ishii, T. Furuta, Y. Kasuya, J. Chromatogr. B, 2003, 794, 49 97. W.Wu, C.Y. Yan, L. Li, Z.Q. Liu, S.Y. Liu, J. Chromatogr. A, 2004, 1047, 213 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

40



98. Y.C. Fiamegos, C.G.Nanos, J. Vervoort, C.D. Stalikas, J. Chromatogr. A, 2004, 1041, 11 99. P. Dugo, F. Cacciola, M. Herrero, P. Donato, L. Mondello, J. Sep. Sci., 2008, 31, 3297 100. M. Stobiecki, Phytochemistry, 2000, 54, 237 101. J.P. Rauha, H. Vuorela, R. Kostiainen, J. Mass Spectrom., 2001, 36, 1269 102. E. De Rijke, H. Zappey, F. Ariese, C. Gooijer, U.A. Brinkman, J. Chromatogr., A, 2003, 984, 45 103. F. Cuyckens, M. Claeys, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2002, 16, 2341 104. F. Cuyckens, A.A. Shahat, H. Van den Heuvel, K.A. Abdel-Shafeek, M.M. ElMessiry, M.M. Seif-El Nasr, L. Pieters, A.J. Vlietinck, M. Claeys, Eur.J. Mass Spectrom, 2003, 9, 409 105. Y.L. Ma, F. Cuyckens, H. Van den Heuvel, M. Claeys, Phytochem. Anal., 2001, 12, 159 106. U.J. Justesen, Mass Spectrom., 2001, 36, 169 107. E. Hvattum, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2002, 16, 655 108. F. Cuyckens, A.A. Shahat, L. Pieters, M. Claeys, J. Mass Spectrom., 2002, 37, 1272 109. B.S. Yu, X. Yan, G.B. Zhen, Y.P. Rao, J. Pharm. Biomed. Anal., 2002, 30, 843 110. J. Wang, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 5887 111. J. Wang, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 1657 112. S. Frison-Norrie, P. Sporns, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 2782 113. Y. Yang, M. Chien, J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 3990 114. R. Colombo, F.M. Lancas, J.H. Yariwake, J. Chromatogr A, 2006, 1103, 118 115. R. Tsao, R. Yang, J. Chromatogr. A, 2003, 1018, 29 116. P. Truchado, F. Ferreres, F.A. Tomas-Barberan, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 7241 117. M.J. Simirgiotis, P.D.S. Caligari, G. Schmeda-Hirschmann, Food Chem., 2009, 115, 775 118. Y.C. Fiamegos, C.G. Nanos, J. Vervoort, C.D. Stalikas, J. Chromatogr. A, 2004, 1041, 11 119. F. Deng, S.W. Zito, J. Chromatogr. A, 2003, 986, 121 120. A. Branco, A.D. Pereira, J.N. Cardoso, F.R.D. Neto, A.C. Pinto, R.Braz, Phytochem. Anal., 2001, 12, 266 121. J. Liggins, L.J.C. Bluck, S. Runswick, C. Atkinson, W.A. Coward, S.A. Bingham, J. Nutr. Biochem., 2000, 11, 326 122. M. Medic-Saric, I. Jasprica, A. Mornar, A. Smolcic-Bubalo, P. Golja, J. Planar Chromatogr., 2004, 17, 459 123. A.D.S. Pereira, M.C. Padilha, F.R.D.A. Neto, Microchem. J., 2004, 77, 141 124. M. Careri, C. Corradini, L. Elviri, A. Mangia, J. Chromatogr. A, 2007, 1152, 274 125. P. Delmonte, J. Perry, J.I. Rader, J. Chromatogr. A, 2006, 1107, 59 126. Z. Huang, B. Wang, P. Williams, R.D. Pace, Food Sci. Technol, 2009, 42, 819 127. N.P. Seeram, L.S. Adams, Y. Zhang, R. Lee, D. Sand, H.S. Scheuller, D. Heber, J.Agric. Food Chem, 2006, 54, 9329 128. V. Nunez, M. Monagas, M.C. Gomez-Cordoves, B. Bartolome, Postharvest Biol. Technol., 2004, 31, 69 129. J.-I. Nakajima, I. Tanaka, S. Seo, M. Yamazaki, K. Saito, J. Biomed. Biotechnol., 2004, 5, 241 130. L.-Z. Lin, P. Chen, J.M. Harnly, J. Agric. Food Chem, 2008, 56, 8130 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

41



131. W. Pongsuwan, T. Bamba, K. Harada, T. Yonetani, A. Kobayashi, E. Fukusaki, J.Agric. Food Chem., 2008, 56, 10705 132. K.R. Maeaettae-Riihinen, M.P. Kaehkoenen, A.R. Toerroenen, I.M. Heinonen, J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 8485 133. M. Duenas, B. Sun, T. Hernandez, I. Estrella, M.I. Spranger, J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 7999 134. Z.Y. Ren, Y. Zhang, Y.P. Shi, Talanta, 2009, 78, 959 135. X. Xu, L. Yu, G. Chen, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 41, 493 136. X.J. Li, Y.P. Zhang, Z.B. Yuan, Chromatographia, 2002, 55, 243 137. Y. Peng, F. Liu, J. Ye, J. Chromatogr. B, 2006, 830, 224 138. A. Jarosz-Wilkołazka, T. Ruzgas, L. Gorton, Enzyme and Microbial Technology, 2004, 35, 238 139. J. Valls, S. Millan, M. P. Marti, E. Borras, L. Arola, J.Chromatography A, 2009, 1216, 7143 140. J. Degenhardt, T.G. Kollner, J. Gershenzon, Phytochemistry, 2009, 70, 1621 141. A.M. Committee, Analyst, 1993, 118, 1089 142. H.S. Song, M. Sawamura, K. Ito, K. Kawaskimo, H. Ukeda, Flavour Fragrance J., 2000, 15, 245 143. A. Basile, M.M. JimenezCarmona, A.A. Clifford, J. Agric. Food Chem., 1998, 46, 5205 144. E.E. Stashenko, M.A. Puertas, M.Y. Combariza, J. Chromatogr. A, 1996, 752, 223 145. F. Angusto, A.L.P. Valente, E. dos Santos Tada, S.R. Rivellino, J. Chromatogr. A, 2000, 873, 117 146. F. de Angelis, A. Di Tullio, G. Mellerio, R. Quaresima, R. Volpe, Rap. Commun. Mass Spectrom., 1999, 13, 895 147. E.E. Stashenko, M. Cervantes, Y. Combariza, H. Fuentes, J.R. Martinez, J. High Resolut. Chromatogr., 1999, 22, 343 148. J.J. Mateo, M. Jimenez, J. Chromatogr. A, 2000, 881, 557 149. I. Merfort, Journal of Chromatography A, 2002, 967, 115 150. L. Mondello, M. Catalfamo, A. Cotroneo, G. Dugo, G. Dugo, H. McNair, J. High Resolut. Chromatogr., 1999, 22, 350 151. J.D. Dimandja, S.B. Stanfill, J. Grainger, D.G. Patterson, J. High Resolut. Chromatogr., 2000, 23, 208 152. N. Yassaa, J. Williams, Atmospheric Environment, 2005, 39, 4875 153. G.B. Lockwood , Journal of Chromatography A, 2001, 936, 23 154. S. Hamm, J. Bleton, J. Connan, A Tchapla, Phytochemistry, 2005, 66, 1499 155. M.J. Leach, Complement Ther Nurs, 2004, 10 156. G. Romanik, E. Gilgenast, A. Przyjazny, M. Kamiński, J. Biochem. Biophys. Methods, 2007, 70, 253


42



B. Activitate II.1.2. – ICDP Bra şov Stabilirea arealelor pastorale şi a tehnicilor de valorificare a paji ştilor; prelevarea şi condiŃionarea probelor de nutre Ńuri şi de lapte din zona Blana Bucegi.

1. Rezumatul etapei Obiectivul principal al proiectului ”Cercetari complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale in vederea imbunatatirii trasabilitatii acestora pe lantul alimentar total ” esta acela de a găsii metodologii de analiză care să servească la diferenŃierea produselor lactate regionale de alte produse

similare. În cadrul acestui obiectiv generos, partenerul 2 al consortiului acestui proiect, ICDP BRASOV, î şi propune să participe la scoaterea in evidenŃă a acelor caracteristici tehnologice şi fizico-chimice care să conducă la ideea că laptele şi produsele lactate obŃinute pe Platoul MunŃilor Bucegi pot fi considerate ca produse regionale (lapte de Bucegi, brânză de Bucegi, etc.), de o calitate şi savoare deosebită. S-a ales ca areal de studiu platoul munŃilor Bucegi deoarece ICDP Braşov deŃine aici o Baza pentru Cercetări Pajişti Montane situată între Vârfurile Blana (1875 m) şi Nucet (1863 m). Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi este situată la 1800 m altitudine, pe un teren uşor înclinat cu expoziŃie estică. VegetaŃia primară a fost dominată de jneapăn (Pinus mugo) şi rarişte de molid (Picea abies) după a căror defrişare s-a instalat o vegetaŃie ierboasă dominată de Festuca nigrescens, F. ovina şi Agrostis rupestris, care la rândul lor au fost invadate de specia nevaloroasă Nardus stricta. Substratul litologic este format de conglomerate tipice de Bucegi. Solurile sunt brune acide şi podzoluri, puternic debazificate, foarte sărace în elemente fertilizante. CondiŃiile climatice sunt cele specifice etajului alpin inferior în care temperatura medie anuala a aerului este de 4,9°C. Vântul bate cu viteze medii anuale de peste 6 metri/secundă. Cantitatea de precipitaŃii căzute în perioada de vegetaŃie (iunie – septembrie) este în jur de 400 mm, iar cea anuală este de aproximativ 1200 mm. La BCPM Blana Bucegi s-au iniŃiat iniŃiat cercetări privind valorificarea cu vaci de lapte a păşunilor subalpine în anul 1995 sub coordonarea domnului dr. ing. Teodor Maruşca. Atunci au fost înfiinŃate si 5 parcele experimentale care au fost utilizate în mai multe ”faze” de cercetare . Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

43



2. Prezentarea parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi 2.1. Faza I de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi Variantele experienŃei din 1995 au fost: 1. Parcela (lotul) A: Păşune naturală (nardet) fertilizat chimic (3 ani) cu 50 kg/ha P2O5 şi 50 kg/ha K2O anual 2. Parcela (lotul) B: Păşune naturală (nardet) fertilizat chimic (3 ani) cu 150 (100+50) kg/ha N + 50 kg/ha P 2O5 şi 50 kg/ha K2O anual 3. Parcela (lotul) C: Păşune naturală (nardet) amendată la 2/3 din Ah, fertilizată (3 ani) cu 150 (100+50) kg/ha N + 50 kg/ha P 2O5 şi 50 kg/ha K2O anual 4. Parcela (lotul) D: Păşune semănată după erbicidare totală cu Roundup (5 l/ha), amendare 2/3 din Ah şi fertilizare (3 ani) cu 150 (100+50) kg/ha N + 50 kg/ha P2O5 şi 50 kg/ha K2O anual 5. Păşune naturală (lotul) T din afara câmpului experimental, nardete nefertilizate (varianta martor cca. 0,4 UVM / ha). Animale (vaci cu lapte) la păşunat: - rasa: Bruna de Maramureş, adaptată la munte - data f ătării: martie – aprilie - încărcare medie: 4 vaci în lot, respectiv 2 UMV / ha în parcela A şi 5,3 în restul parcelelor (B, C şi D) - producŃie iniŃială cât mai uniformă pe o vacă: ( 12 – 14 l/cap lapte 3,5 % grăsime) - stare de sănătate corespunzătoare - au fost excluse primiparele şi vacile prea avansate în vârstă (peste 8 ani). Detalii tehnice ale experienŃei: suprafaŃa unei parcele: 0,75 ha pentru fiecare din loturile B, C, D şi 2,00 ha pentru lotul A; suprafaŃa totală îngrădită cu gard fix: 42.500 m2 ( 7.500 m2 x 3 parcele + 20.000 m2). -

-

Mod de folosire: Păşunat liber (continuu) extensiv (lot T), semiintensiv (lot A) şi intensiv (loturile B, C şi D); Prelevare probe pentru determinat producŃia de iarbă, sub cuşti metalice, pe 2 m2 în trei repetiŃii pe fiecare parcelă; Cosire resturi neconsumate, toamna, dacă este cazul. -

-

-


44



Fig.1. Aspect general Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi


45



Fig. 2. Aspect al pasunatului liber in cadrul experimentelor realizate la Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi ObservaŃii şi determinări: compoziŃia floristică a covorului ierbos; producŃia de substanŃă uscată a păşunii; analize de calitate a furajelor şi analize agrochimice de sol; producŃia pe cap de vacă determinată săptămânal; analiza calităŃii laptelui, grăsime şi proteină din 2 în 2 săptămâni; comportamentul alimentar al vacilor pe păşune; stabilirea efectului remanent alo îmbunătăŃirii după anul al-III-lea; -

-

-

-

-

-

-

2.2. Faza a II-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi (2000 – 2002) ExistenŃa unei experienŃei cu vaci de lapte, înfiinŃată în anul 1995 a permis alăturarea a unor variante noi după care să se cerceteze în paralel productivitatea păşunilor îmbunătăŃite prin târlire (fertilizare organică) sau prin fertilizare chimică, faŃă de o păşune îmbunătăŃită în urmă cu 2 ani, considerat ă ca martor. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

46



Variantele experienŃei: 1. Parcela (lotul) AT: Păşune naturală (nardet) târlită cu taurine 1 vacă (6 m2 /6 zile în 1999) 2. Parcela (lotul) AC: Păşune naturală (nardet) fertilizată cu îngrăşăminte chimice - Anul I (2000)

- N200 P100 K100 kg/ha

- Anul II (2001) - N150 P75 K75 kg/ha - Anul III (2002) - N100 P50 K50 kg/ha 3. Parcela (lotul) B: (martor): Păşune naturală (nardet) fertilizată în perioada 1996-1998, respectiv 3 ani consecutivi cu N150 P75 K75 kg/ha, diminuarea Ńăpoşicii şi dominarea păiuşului roşu,

după care s-a încetat fertilizarea (1999 şi în

continuare), urmărindu-se efectul remanent. Men Ń iune: -

Parcela B a fost martor şi pentru experienŃa 3 unde se urmăreşte efectul remanent al fertilizării chimice + amendare (parcela C) şi al înfiinŃării de pajişti semânate + fertilizare chimică + amendare (parcela D).

-

Pe locul foste parcele martor A (fertilizare PK) s-au instalat cele dou ă variante (parcelele) AT şi AC, prezentate mai sus.

Detalii tehnice ale experienŃei: -

suprafaŃa unei parcele: 7.500 m2

-

suprafaŃa totală a experienŃei: 22.500 m2

Animale (vaci cu lapte) la păşunat: au caracterele identice cu cea anterioară Modul de folosinŃă: - păşunat liber intensiv (continuu) în toate parcelele: AT, AC şi B ObservaŃii şi determinări: aceleaşi ca la experienŃa anterioară

2.3. Faza a III-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi (2003-2008) Profitând de baza materială bună existent ă la experienŃele anterioare cu vaci de lapte, după 2002 s-au continuat experimentările pe acelaşi amplasament urmărindu-se efectul remanent după târlire. Variantele experienŃei privind folosirea păşunilor subalpine cu vaci de lapte au fost: Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

47



1. Parcela (lotul) M (Martor), păşune naturală,( fost AC, după 2 ani de la încetarea fertilizării chimice cu NPK). 2. Parcela AT, păşune naturală târlită în 1999 şi repetare târlire cu vacile în 2005. 3. Parcela B, păşune naturală fertilizată chimic cu NPK în perioada 1996 – 1998, târlită cu vacile în anul 2004. 4. Parcela C, păşune naturală, amendată la 2/3 din Ah în 1995, fertilizată chimic cu NPK între 1996-1998, târlită cu vacile în 2003. 5. Parcela D, păşune semănată şi amendată în 1995, fertilizată chimic cu NPK între 1996-1998, târlită cu vacile în 2003 şi 2006. Înainte sau imediat după târlire cu vacile au fost aplicate îngr ăşăminte chimice – superfosfat, în doză de 100 kg/ha P2O5. ObservaŃiile şi determinările la noua experienŃă cu vaci de lapte sunt identice cu cele existente la experimentările precedente.

2.4. Faza a IV-a de utilizare a parcelelor experimentale din zona BCPM Blana Bucegi (2009 – 2012) În continuare pe acelaşi amplasament al experienŃei de lungă durată se va urmării efectul metodelor principale de îmbunătăŃire aplicate până în prezent constând din fertilizare chimică (NPK) şi organică şi organică pe fond neamendat sau amendat pe pajiştea cu covor ierbos natural sau pajişte reînsămânŃată cu specii din afară. Variantele târlite cu vacile de lapte au fost următoarele: Parcela D în anul 2008 Parcela C în anul 2009 În anul viitor (2010) se va târlii cu vacile parcela B. Tot în anul urm ător se va fertiliza cu îngrăşăminte chimice parcela AC cu doze de 150 kg/ha N, 150 kg /ha P2O5 şi 100 kg/ha K2O. În anii 2010-2012 vor fi disponibile pentru cercet ări complexe în relaŃia sol – plantă – animal –produs animalier, parcelele: AC - fertilizare chimică pajişte permanentă B – fertilizare organică pajişte permanentă C – fertilizare organică pajişte permanentă pe fond amendat D - fertilizare organică pajişte semănată pe fond amendat Amplasarea dispozitivului experimental este prezentată în fotografia şi schiŃa alăturate. o o


48



Fig. 3. Amplasarea dispozitivului experimental la Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi


49




50



3. Rezultate obtinute in cadrul experimentarilor realizate la Baza de Cercetări Pajişti Montane (B.C.P.M.) Blana Bucegi În continuare se prezintă câteva rezultate privind producŃia de substanŃă uscată a pajiştii şi producŃia de lapte.

3.1. ProducŃia de substanŃă uscată În anul 2009 au fost obŃinute următoarele rezultate de producŃie de substanŃă uscată pe variantele îmbunătăŃite:

Tabel 1. Productia de substanta uscata obtinuta pe diferite parcele ale B.C.P.M. Blana Bucegi Varianta RepetiŃia Media t/ha I II III IV AC (fertilizare NPK – 2002) 3,42 4,96 2,84 6,82 4,51 B târlire 2004 3,80 4,96 2,24 4,88 3,97 D târlire 2008 4,94 6,08 4,62 9,70 6,34 Media * * * * 4,94 Din datele prezentate se remarcă varianta D – pajiştea semănată, amendată în anul înfiinŃării târlită cu vacile anul trecut (2008) pe care se obŃin 6,34 t/ha SU, cu 28% mai mult decât producŃia medie. Rezultate mai slabe s-au obŃinut în varianta B ce urmează a fi târlită în anul viitor şi AC care de asemenea va fi fertilizat ă cu îngrăşăminte chimice.

3.2. ProducŃia de lapte Păşunatul a început în data de 14 iunie şi s-a încheiat în data de 6 septembrie, respectiv 85 de zile. ProducŃia medie pe cap de vacă la începutul păşunatului a fost de 14,6 litri scăzând până la 7,9 litri la sfâr şitul sezonului, cu o produc ie medie de aproape 11,5 l /cap/zi (tabel).

Tabel 2. ProducŃia medie de lapte de vacă (3,5 % grăsime) realizată de rasa Brună (Schwyz) pe păşunile subalpine din MunŃii Bucegi - l / cap /zi GRUPA Nr. Media Luna Decada zile AC B T Iunie II (14-20) 7 14,5 14,6 15,0 14,3 14,6 III (21-30) 10 13,8 13,8 15,8 13,5 14,2 Media 17 14,2 14,2 15,4 13,9 14,4 Iulie I (1-10) 10 12,9 12,3 15,7 13,1 13,5 II (11-20) 10 12,6 12,4 14,2 13,2 13,1 III (21-31) 11 12,3 12,0 12,6 10,2 11,8 Media 31 12,6 12,2 14,2 12,2 12,8 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

51

% 91 80 128 100


August

I (1-10)

Sept.

II (11-20) III (21-31) Media I (1-6)

Medie (Total) Incarcatura UVM /ha ProducŃia de lapte pe 85 zile

10 10 11 31 6 85


9,7 8,4 8,3 8,8 7,4 11,10 4 3774

10,2 9,1 8,5 9,3 7,6 11,17 4 3798

11,6 11,1 10,4 11,0 9,3 12,86 4 4372

9,0 8,8 8,3 87 7,3 10,86 1,5 1629

10,1 9,4 8,9 9,5 7,9 11,49 * *

ProducŃia cea mai ridicată s-a înregistrat în varianta D şi anume 4372 l /ha urmată de celelalte două variante AC şi B. FaŃă de animalele care au păscut în turmă vacile din variantele îmbunătătite au dat cu 230-268% mai mult lapte, cea ce confirmă eficienŃa măsurilor de îmbunătăŃire. În ce priveşte conversia furajelor de pajişti în productie de lapte se constată un consum ridicat de SU şi anume 1,20 kg SU la varianta AC, 1,00 kg SU la var B şi 1,45 kg US la var D , fiind destul de mari faŃă de alte condiŃii cu climat mai blând. Aceste experimentări urmează a fi aprofundate pe viitor cu analize mai amănunŃite asupra calităŃii laptelui în funcŃie de calitatea furajului. În prezent se fac analize chimice la probele de plant ă şi sinteza altor date care se vor prezenta în etapa următoare a proiectului.


52



C. Activitate II.1.3. – ICDCB Balote şti Elaborare model conceptual, adaptare metode de lucru, preg ătirea cadrului experimental.

1. Rezumatul etapei În vederea aprecierii stării de sănătate a vacilor de lapte, în strânsă legătură cu modul de furajare (stabulaŃie/păşunat), au fost efectuate teste hematologice şi teste biochimice serice. Astfel, în perioada de stabulaŃie au fost prelevate şi analizate 13 probe, iar în perioada de păşunatv14 probe. Probele au provenit de la vacile de lapte din lotul experimental din Biobaza ICDCB Baloteşti. Screeningul hematologic a scos în evidenŃă evoluŃia anemiei. Valorile scăzute ale hematocritului pe toată durata anului au fost atribuite deficitului de aport al unor microelemente în materiile prime furajere folosite în fermă, de regulă carenŃate în cupru, cobalt, seleniu. Acest lucru a fost susŃinut şi prin rezultatul examenelor biochimice serice, care au evidenŃiat nivele scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru. Testele biochimice serice au indicat, de asemenea, creşterea valorilor ureei serice în ambele perioade, fapt care a fost pus pe seama unui aport proteic ridicat în raŃie, în special pe baza furajelor concentrate. Totodată, aceasta a putut fi cauzată şi de disfuncŃii renale f ără exprimare clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop energetic sau plastic, catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a ureogenezei. Valorile scăzute ale glicemiei în perioada de stabulaŃie au indicat deficit energetic în raŃie. Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar şi hipomagneziemie destul de serioasă. Valorile macroelementelor serice analizate se corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii. Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană.


53



2. Descrierea ştiinŃifică şi tehnică Păşunatul este o formă superioară şi economică de utilizare a nutreŃurilor verzi de pe pajiştile naturale şi cultivate. După o perioadă de stabulaŃie prelungită (oct-aprilie), se are în vedere, pe de o parte, preg ătirea animalelor pentru păşunat ca mijloc biologic al producŃiei, iar pe de alt ă parte pregătirea şi organizarea păşunilor ca sursă de nutrienŃ i pentru animale. Dat fiind faptul că este consumată direct, iarba de pe păşune reprezintă unul din cele mai economice nutreŃuri, f ără cheltuieli de recoltare, transport, depozitare şi administrare. Păşunatul, ca mod de furajare, prezint ă numeroase avantaje si anume: •

Animalele consumă un furaj de calitate superioară complet (sub aspectul principiilor nutritive, în funcŃie de compoziŃia botanică şi de raportul dintre graminee şi leguminoase) şi uşor de asimilat.

•

Prin păşunat se asigură mişcarea în aer liber, iar expunerea la acŃiunea directă a razelor solare duce la o fortificare a organismului, la o consolidare a scheletului şi un metabolism mai activ.

•

Prin mişcarea la păşune se realizează aşa numitul mecanism al copitei, producându-se uzura (tocirea) fiziologică a ongloanelor.

•

FuncŃia de reproducŃie este stimulată, căldurile sunt evidente, ciclul sexual şi gestaŃia se desf ăşoară normal. Odată cu scăderea temperaturii mediului şi epuizarea surselor de masă verde de pe

păşune este necesară protejarea, pe o perioadă de câteva luni, a vacilor în ad ăposturi. În perioada de

stabulaŃie,

taurinele sunt întreŃinute în adăposturi închise, cu acces

permanent la furaj, la apă, sare, loc de odihnă şi loc de mişcare, asigurându-se toŃi parametrii determinanŃi ai st ării de bine a animalelor.

3. Evaluarea stării de sănătate a animalelor din loturi experimentale 3.1. Materiale si metode Pentru aprecierea stării de sănătate a animalelor din loturile experimentale din Biobaza ICDCB Baloteşti au fost efectuate teste hematologice şi teste biochimice serice, în raport cu modul de furajare (stabulaŃie/păşunat). Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

54



3.1.1. EXAMENE HEMATOLOGICE Pentru efectuarea examenelelor hematologice, animalele au fost supuse prelevărilor de probe de sânge, prin puncŃia venei jugulare, la 2 - 4 ore după furajarea de dimineaŃă. Cantitatea de sânge recoltată pentru examenul hematologic a fost de 1 - 2 ml pentru fiecare probă. Probele au fost recoltate în tuburi conŃinând anticoagulant Na2EDTA. După recoltare acestea au fost imediat refrigerate la + 40C. Parametrii hematologici urmăriŃi în timpul analizelor au fost următorii: numărul de eritrocite (mil/mm3), numărul de leucocite (mii/mm3), concentraŃia de hemoglobină (g/dl), concentraŃia de hematocrit (%), precum şi formula leucocitară – conŃinutul procentual de limfocite, monocite şi neutrofile totale. Ca tehnică analitică s-a folosit analizorul automat ABACUS JUNIOR VET 5, destinat diagnosticului in vitro.

3.1.2. EXAMENE BIOCHIMICE SERICE Recoltarea probelor pentru examenul biochimic seric s-a f ăcut în eprubete obişnuite, în condiŃii de sterilitate. Pentru efectuarea examenului biochimic a fost prelevată o cantitate de sânge de aproximativ 12 ml. Dup ă recoltare, probele de sânge au fost Ńinute la temperatura camerei (aproximativ 22 - 240C), până la exprimarea serului, după care s-au decolat. Serul a fost separat de coagul, a fost centrifugat şi păstrat la temperatura de refrigerare (+40C) sau la congelator cel mult 48 de ore, până la examinare. Parametri biochimici serici urmăriŃi pe timpul analizelor, au fost: proteina totală, albumina, ureea, glucoza, colesterolul total, alanin amino transferaza (TGO), glutamat piruvat transaminaza (TGP), gama-glutamil transferaza (GGT), fosfataza alcalină, calciul (Ca), fosforul (P), magneziul (Mg), fierul (Fe), cuprul (Cu), seleniul (Se). Marea majotitate a parametrilor biochimici (exceptând fier, cupru şi selsniu) au fost determinaŃi cu analizorul STARDUST MC 15, un spectrofotometru echipat cu microprocesor, destinat testelor specifice de biochimie clinică. Aceştia au fost analizaŃ i cu ajutorul kit-urilor dedicate, truse de reactivi produse de firma DiaSys. Controlul preciziei analizelor s-a f ăcut prin control intern, folosindu-se în acest scop, ca material de referinŃă, sânge de control furnizat de firma DiaSys. ConŃinutul seric de fier şi cupru a fost determinat prin spectrofotometrie de absorbŃie atomică cu flacără, iar cel de seleniu prin metoda fluorimetrică cu 2,3 diaminonaftalină. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

55



3.1.3. Prelucrarea şi interpretarea analizelor După efectuarea analizelor s-au calculat principalele mărimi caracteristice : valoarea medie (X), deviaŃia standard (ds), coeficientul de variabilitate (CV). Aceste mărimi statistice au fost folosite pentru evaluarea şi compararea rezultatelor analitice obŃinute.

3.2. Rezultate şi discuŃii În vederea aprecierii stării de sănătate a vacilor de lapte în perioada de stabulaŃie, în luna februarie au fost recoltate 6 probe de sânge pe anticoagulant şi 6 probe de sânge pentru prelevarea de ser sanguin. În urma efectuării examenului hematologic s-au obŃinut valorile redate în tabelul nr.1. Se observă că hematocritul a avut concentraŃii sub limitele de referinŃă la 5 probe din 6, ceea ce reprezint ă un procent de 83,33%. În ceea ce priveşte examenele biochimice serice, valorile individuale ale profilului proteic şi energetic sunt prezentate în tabelul nr. 2. Din datele astfel prezentate, se poate constata că proteina serică totală s-a situat sub limitele de referinŃă la 2 din cele 6 probe analizate, ureea a fost crescută la 4 probe, glicemia s-a situat sub valorile normale la 3 probe, o singură probă fiind peste limitele de referinŃă, iar colesterolul a fost scăzut în raport cu lumitele de referinŃă la o singură probă. Albumina serică s-a situat în limite normale.

Tabelul 1. Rezultatul examenului hematologic efectuat la 6 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (1) – valori individuale. Nr crt Nr Hemoglobi Hematocr Nr. Formula leucocitară (%) eritrocite nă it Leucocite Limfoci Monocit Neutrofile 3 (mil/mm ) (g/dL) (%) (mii/mm3) te e totale 1 6.56 11.60 29.08 14.47 31.8 0.6 67.6 2 6.40 11.30 32.41 8.65 55.1 0.8 44.1 3 6.05 11.50 28.99 8.73 58.3 0.6 41.1 4 6.67 10.40 25.11 9.34 53.7 0.6 45.7 5 6.27 10.70 27.44 5.52 69.4 1.2 29.4 6 5.37 9.8 23.16 9.84 53.7 9.4 36.9 X 6.22 10.88 27.70 9.43 53.67 2.20 44.13 ds 0.47 0.71 3.26 2.90 12.24 3.53 12.90 CV, % 7.56 6.51 11.77 30.74 22.81 160.68 29.22 Valori de referin Ńă

5.0-8.0

9.0-11.0

32-38

6.5-9.5

45-61


56

0-1

15-41



Tabelul 2. Rezultatul examenului biochimic seric (profil proteic şi energetic) efectuat la 6 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (1) – valori individuale

Nr. crt 1. 2. 3. 4. 5. 6 X ds CV, % Valori de referin Ńă

Proteine totale (g/dl) 7.76 6.44 7.10 7.47 8.19 6.24 7.20 0.76 10.53

Albumină (g/dl)

Uree (mg/dl )

Glicemie (mg/dl)

3.3 3.7 3.4 3.4 3.2 3.7 3.45 0.21 6.01

50 35 37 59 55 47 47.17 9.60 20.35

69.87 42.03 28.17 72.39 40.08 82.41 55.83 21.82 39.09

Colesterol total (mg/dl) 88 117 130 137 141 125 123.00 19.15 15.57

7 - 8,2

3,04-3,84

20-40

48-72

124-224

În ceea ce priveşte profilul enzimatic, valorile individuale obŃinute sunt prezentate în tabelul 3. Valorile enzimelor serice în perioada de stabulaŃie s-au prezentat astfel: TGO şi fosfataza alcalină au fost crescute la toate cele 6 probe analizate; GGT a înregistrat valori crescute la 50% din cazuri; TGP a fost în limitele de referinŃă la toate cele şase probe analizate. Valorile individuale ale macro şi microelementelor în serul sanguin sunt trecute în tabelul 4. Din datele experimentale astfel obŃinute se constată urmatoarele: calciul ş i fosforul s-au situat în limitele de referinŃă la toate probele; magneziul a fost scăzut la două probe; fierul a fost crescut peste valorile de referinŃă la două probe; cuprul s-a situat sub limita minimă de referinŃă la 3 probe din 6; seleniul s-a situat sub valoarea minimă de referinŃă la toate probele.


57



Tabelul 3. Rezultatul examenului biochimic seric (profil enzimatic) efectuat la 6 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (1) – valori individuale Nr. crt TGO TGP Fosfataza GGT (U/L) (U/L) alcalină (U/L) (U/L) 1. 45.5 19.2 81.1 21 2. 52.3 33.3 80.3 22 3. 70.9 32.6 116.4 19 4. 56.7 38.9 103.5 28 5. 68.1 37.3 51.3 27 6. 55.3 55.1 140.4 24 X 58.13 36.07 95.50 23.50 ds 9.65 11.63 31.33 3.51 CV, % 16.61 32.24 32.81 14.92 Valori de referinŃă 19-39 < 60 10-36 13-23 Tabelul 4. Rezultatul examenului biochimic seric (profil mineral) efectuat la 6 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (1) – valori individuale Nr. crt Calciu Fosfor Magneziu Fier Cupru Seleniu (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (µg/dl) (µg/dl) (ppm) 1. 9.3 6.76 2.22 137.58 81.01 0.01 2. 9.6 6.05 1.79 207.73 80.45 0.02 3. 8.8 5.29 1.98 122.19 72.86 0.03 4. 9.3 6.28 2.12 158.25 75.12 0.009 5. 9.0 6.60 2.66 140.72 68.78 0.03 6. 10.0 5.70 2.51 115.23 73.63 0.01 X 9.33 6.11 2.21 146.95 75.31 0.02 ds 0.43 0.55 0.33 33.37 4.70 0.01 CV, % 4.58 9.06 14.71 22.71 6.24 55.09 Valori de 8-11 5-7,2 2,1-2,8 100-164 75-97 0.04-0.10 referinŃă La sfârşitul perioadei de stabulaŃie a fost efectuat un nou test privind starea de sănătate a animalelor din lotul experimental. Astfel, la începutul lunii aprilie au fost recoltate 7 probe de sânge integral. Rezultatele obŃinute in urma examenului hematologic sunt prezentate in tabelul nr. 5. Se observă că şi în acest caz hematocritul s-a situat sub limitele de referinŃă la toate probele analizate, iar formula leucocitară a evidenŃiat valori crescute ale limfocitelor şi monocitelor la 4 din cele 7 probe testate. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

58



Examenul biochimic de profil proteic şi energetic efectuat la sfârşitul perioadei de stabulaŃie a condus la valorile prezentate în tabelul 6. Se observă că albumina a înregistrat valori depăşite în raport cu limita maximă admisă la marea majoritate a probelor, în timp ce glicemia a fost scăzută la 5 din cele 7 probe analizate. Proteinele totale, ureea serică (cu o singură excepŃie când s-a depăşit valoarea maximă admisă) şi colesterolul total (exceptând o depăşire a valorii maxime admise), s-au situat în limitele de referinŃă.

Tabelul 5. Rezultatul examenului hematologic efectuat la 7 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (2) – valori individuale. Nr crt

Nr eritrocite (mil/mm3)

1 2 3 4 5 6 7 X ds CV, % Valori de referinŃă

6.86 6.50 6.29 5.86 5.96 5.56 5.72 6.11 0.46 7.58 5.0-8.0

Hemoglobin ă (g/dL) 11.3 10.6 10.3 9.3 8.2 9.1 9.5 9.76 1.04 10.68 9.0-11.0

Hematocri t (%) 29.98 28.06 26.45 23.75 22.23 23.94 26.93 25.91 2.73 10.53 32-38

Nr. Leucocite (mii/mm3) 11.72 8.01 7.15 10.14 8.06 7.04 6.67 8.40 1.86 22.13 6.5-9.5

Formula leucocitară (%) Limfocit Monocit Neutrofil e e totale 44.8 9.9 45.4 71.1 1.0 27.9 38.6 10.4 51.0 76.2 0.8 22.9 68.3 1.2 30.5 58.6 1.2 40.2 72.6 0.8 26.6 61.46 3.61 34.93 14.66 4.47 10.64 23.85 123.68 30.45 45-61 0-1 15-41

Tabelul 6. Rezultatul examenului biochimic seric (profil proteic şi energetic) efectuat la 7 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (2) – valori individuale Nr. crt

Proteine totale (g/dl)

Albumină (g/dl)

Uree (mg/dl )

Glicemie (mg/dl)

1. 2. 3. 4. 5. 6 7 X ds CV, %

7.20 7.37 7.48 7.25 7.83 7.25 7.20 7.37 0.23 3.09

4.46 3.97 4.61 4.12 4.25 3.81 4.39 4.23 0.28 6.68

27.35 44.38 30.72 27.06 27.76 28.64 32.16 31.15 6.13 19.67

61.77 68.43 22.82 24.16 34.62 33.42 29.62 39.26 18.28 46.55

Colesterol total (mg/dl) 150.0 259.0 203.2 221.9 192.2 191.0 144.5 194.54 39.76 20.44

Valori de referin Ńă

7 - 8,2

3,04-3,84

20-40

48-72

124-224

În ceea ce priveşte profilul enzimatic, valorile individuale obŃinute sunt prezentate în

tabelul 7. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

59



Valorile enzimelor serice la sfârşitul perioadei de stabulaŃie se prezintă astfel: TGO şi fosfataza alcalină au fost crescute la toate probele analizate; GGT a depăşit limita maximă admisă la 4 probe; TGP a fost în limitele de referinŃă la toate cele 7 probe analizate. Valorile individuale ale macro şi microelementelor în serul sanguin sunt trecute în tabelul 8. Valorile unor minerale serice au evidenŃiat uşoară hipofosforemie, hipocuproză la 4 din 7 cazuri investigate, precum şi hipomagneziemie şi hiposelenoză în proporŃie de 100%.

Tabelul 7. Rezultatul examenului biochimic seric (profil enzimatic) efectuat la 7 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (2) – valori individuale Nr. crt 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7 X ds CV, % Valori de referinŃă

TGO (U/L)

TGP (U/L)

69.0 62.0 60.0 52.0 56.0 42.0 49.0 55.71 8.96 16.08 19-39

20 17 24 25 24 23 21 22.00 2.83 12.86 < 60

Fosfataza alcalină (U/L) 69.7 193.5 92.1 114.3 83.2 110.60 111.0 110.63 43.94 39.71 10-36

GGT (U/L) 24 23 20 25 21 24 24 23.00 1.83 7.94 13-23

Tabelul 8. Rezultatul examenului biochimic seric (profil mineral) efectuat la 7 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de stabulaŃie (2) – valori individuale Nr. crt 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. X ds CV, % Valori de referinŃă

Calciu (mg/dl) 8.9 9.0 9.0 8.9 8.5 9.2 9.0 8.93 0.21 2.39 8-11

Fosfor (mg/dl) 3.8 5.5 5.8 6.1 4.9 4.9 5.3 5.19 0.75 14.53 5-7,2

Magneziu (mg/dl) 1.69 1.77 1.60 1.49 1.49 1.95 1.68 1.67 0.16 9.75 2,1-2,8

Fier (µg/dl) 160.13 181.12 147.63 133.44 192.59 146.49 108.83 152.89 28.32 18.53 100-164

Cupru (µg/dl) 80.29 79.9 69.23 59.84 68.07 60.73 78.02 70.87 8.72 12.31 75-97

Seleniu (ppm) 0.013 0.016 0.016 0.010 0.014 0.013 0.016 0.01 0.00 15.97 0.04-0.10


60



În perioada de hrănire cu furaje de pe păşune s-au recoltat probe de sânge integral de la un număr de 14 vaci de lapte. Testele de laborator au eviden Ńiat, ca şi la celelalte investigaŃii, valori sc ă zute ale concentraŃ iei de hematocrit în proporŃ ie de 90,61%, dar ş i cre şteri ale conŃinutului de leucocite în proporŃie destul de mare – 71,43%. Formula leucocitară a scos în evidenŃă cazuri de creşteri ale neutrofilelor (9 din 14 cazuri), ale monocitelor (3 din 14 cazuri) şi ale limfocitelor (3 din 14 cazuri), dar şi valori scăzute ale limfocitelor (4 din 14 cazuri). Datele examenelor de profil proteic şi energetic obŃinute la acelaşi grup de vaci lactante sunt prezentate în tabelul nr. 10. Din examinarea valorilor experimentale astfel obŃinute se observă creşterea valorilor proteinelor serice totale într-o proporŃie destul de mare – 85,72%.

Tabelul 9. Rezultatul examenului hematologic efectuat la 14 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de pasunat – valori individuale. Nr crt Nr Hemoglobi Hemato Nr. Formula leucocitară (%) eritrocite nă crit Leucocite Limfo Mono Neutrofile 3 (mil/mm ) (g/dL) (%) (mii/mm3) cite cite segmentate 1 5,56 9,1 24,61 13,45 35,8 1,1 63,1 2 5,71 9,5 25,98 13,81 42,9 0,9 56,1 3 5,86 9,1 24,65 6,36 66,5 1,0 32,6 4 5,46 9,5 24,95 10,36 55,5 1,0 43,6 5 6,64 9,8 26,80 11,12 57,3 1,0 41,6 6 6,23 8,9 25,01 10,34 68,8 0,9 30,3 7 7,31 12,7 33,83 5,89 52,2 8,9 38,9 8 5,78 8,3 23,64 12,79 38,8 9,4 51,8 9 5,69 8,5 23,01 16,60 46,4 0,6 52,9 10 5,69 8,5 23,01 16,60 46,4 0,6 52,9 11 6,85 10,5 28,60 11,68 47,4 1,0 51,6 12 5,92 9,5 28,03 7,73 71,7 1,1 27,3 13 5,03 7,8 21,91 9,68 43,2 9,6 47,3 14 6,84 10,9 29,23 10,72 63,8 1,0 35,2 X 5.97 9.14 25.35 12.26 51.10 3.33 45.57 ds 0.66 1.18 3.12 3.36 11.95 4.22 10.22 CV, % 11.05 12.94 12.32 27.43 23.39 126.81 22.43 Valori de 5.0-8.0 9.0-11.0 32-38 6.5-9.5 45-61 0-1 15-41 referinŃă


61



Tabelul 10. Rezultatul examenului biochimic seric (profil proteic şi energetic) efectuat la 14 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de păşunat – valori individuale Nr. crt Proteine totale Albumină Uree Glicemie Colesterol (g/dl) (g/dl) (mg/dl ) (mg/dl) total (mg/dl) 1. 4.1 3.4 40 60.2 244.7 2. 9.3 3.0 27 74.23 344.7 3. 4.3 2.9 32 53.22 297.9 4. 10.5 2.9 44 50.80 224.3 5. 8.8 3.7 37 51.62 294.8 6. 8.4 3.5 142 46.81 316.8 7. 9.9 3.4 34 60.80 225.8 8. 9.9 3.1 45 82.70 389.5 9. 9.4 3.8 61 74.60 240.1 10. 9.3 3.5 53 43.71 246.8 11. 9.6 3.5 44 79.82 238.3 12. 10.2 2.8 32 64.54 262.2 13. 8.5 4.2 51 60.21 249.9 14. 10.3 4.3 70 58.74 223.4 X 9.60 3.60 50.86 66.33 264.31 ds 0.62 0.55 12.32 13.71 56.46 CV, % 6.42 15.21 24.23 20.67 21.36 Valori de referin Ńă

7 - 8,2

3,04-3,84

20-40

48-72

124-224

De asemenea, ureea serică a depăşit maxima admisă la 57,14% din probe, iar colesterolul total a excedat valoarea maximă admisă în proporŃie de 100%. ConŃinutul seric de albumină şi glucoză a oscilat, înregistrându-se atât cazuri cu deficit de biocomponente (3, respectiv 2 cazuri din 14), cât şi cazuri de depăşiri ale pagului maxim admis (2, respectiv 3 cazuri din 14 investigate). Profilul enzimatic a fost caracterizat prin valorile individuale prezentate în tabelul 11 şi care au evidenŃiat valori crescute ale activităŃii TGO la toate probele analizate, dar şi ale fosfatazei alcaline în proporŃie de 50%. Activitatea TGP a fost în limite normale.


62



Tabelul 11. Rezultatul examenului biochimic seric (profil enzimatic) efectuat la 14 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de păşunat – valori individuale Nr. crt TGO TGP Fosfataza (U/L) (U/L) alcalină (U/L) 1. 70 24 46 2. 107 25 46 3. 88 17 46 4. 90 31 44 5. 71 31 32 6. 44 31 24 7. 95 31 47 8. 79 25 33 9. 85 32 26 10. 78 29 24 11. 114 35 18 12. 92 27 37 13. 106 29 35 14. 99 34 84 X 93.29 30.14 36.71 ds 13.73 3.67 21.91 CV, % 14.72 12.18 59.67 Valori de referinŃă 19-39 < 60 10-36 Valorile individuale ale macro şi microelementelor în serul sanguin sunt trecute în tabelul 12. În acest caz s-au obŃinut frecvente deficienŃe de calciu (42,86% din probe), magneziu (64,29% din probe), cupru (57,14% din probe), si în mod special seleniu, unde deficitul a fost de 100%.

4. Concluzii InvestigaŃiile de laborator astfel efectuate au permis ca pe baza screeningului hematologic să poată fi diagnosticate o serie de tulburări metabolice (subclinice) între care amintim îndeosebi anemia. Valorile semnificativ scăzute ale hematocritului (tabel 1, 5 şi 9) pot fi atribuite deficienŃei de aport al unor microelemente în materiile prime furajere folosite, de regulă carenŃate în fier, cupru, cobalt, seleniu. Acest lucru a fost


63



demonstrat şi prin rezultatul examenelor biochimice serice, care au evidenŃiat nivele scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru. Creşterea valorilor ureei serice indică aport proteic ridicat în raŃie, în special pe seama furajelor concentrate. Aceasta a putut fi cauzată şi de disfuncŃii renale f ără exprimare clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop energetic sau plastic, catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a ureogenezei.

Tabelul 12. Rezultatul examenului biochimic seric (profil mineral) efectuat la 14 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de p ăşunat – valori individuale Nr. crt Calciu Fosfor Magneziu Fier Cupru Seleniu (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (µg/dl) (µg/dl) (ppm) 1. 7.2 5.9 2.17 211.46 80.60 0.010 2. 8.9 5.1 1.68 176.56 79.10 0.008 3. 8.1 5.5 1.84 137.50 71.14 0.010 4. 7.8 6.7 1.57 133.11 68.66 0.012 5. 7.9 8.3 1.60 200.17 66.17 0.008 6. 7.9 5.0 2.0 116.21 63.18 0.013 7. 8.5 4.8 1.95 126.96 76.62 0.009 8. 8.2 6.0 1.87 129.31 81.09 0.016 9. 6.5 6.8 1.87 165.52 61.43 0.013 10. 9.2 5.0 2.07 117.55 61.90 0.022 11. 8.1 6.0 2.34 106.74 57.62 0.020 12. 9.5 7.3 2.41 107.91 61.76 0.015 13. 8.8 5.4 2.29 211.46 80.60 0.021 14. 7.5 3.7 1.88 176.56 79.10 0.024 X 8.26 5.74 2.10 145.01 69.07 0.02 ds 1.03 1.19 0.24 40.15 10.59 0.00 CV, % 12.52 20.75 11.39 27.69 15.33 21.75 Valori de referinŃă 8-11 5-7,2 2,1-2,8 100-164 75-97 0.04-0.10 Valorile scăzute ale glicemiei indică deficit energetic, în special la vacile aflate în perioada de stabulaŃie. În timpul lactaŃiei, vacile au nevoie cu 40-60% mai mult ă energie decât în perioada de repaus mamar. Dacă lactaŃia se realizează în timpul sezonului rece, capacitatea vacii de a-şi menŃine condiŃia corporală şi de continua să producă lapte va fi serios compromisă dacă nivelul de energie din raŃie nu este suficient. Ca regulă generală, pentru fiecare scădere a temperaturii cu 10°C sub pragul de -20°C, vacile vor avea nevoie, în plus, de 4-6 Mcal energie digestibilă pe zi. Vara, consumul nutreŃului verde Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

64



prin păşunat are o influenŃă favorabilă asupra rezistenŃei organice, asupra sănătăŃii şi productivităŃii, datorită acŃiunii favorabile a mişcării, razelor solare şi a aerului curat. Creşterea colesterolemiei indică stări de suprasolicitare. Modificările activităŃii unor enzime serice TGO, Pal, GGT indică evoluŃia la vaci a unor organopatii, cum ar fi hepatopatii (creşterea activităŃii TGO), osteoartropatii evolutive (creşterea activităŃii Pal) (tabel 3, 7 şi 11). Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar şi hipomagneziemie destul de serioasă (tabel 4, 8 şi 12). Valorile macroelementelor serice analizate se corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii. Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană. Erorile de alimentaŃie determină afecŃiuni metabolice şi funcŃionale. Acestea se înregistrează cu precădere in perioada de repaus mamar, cit şi in perioada de început de lactaŃie. Pe ansamblu, erorile alimentare provoacă nu numai stare de boala, determinând şi scăderea

producŃiei de lapte.

CarenŃele alimentare prelungite duc la modificări metabolice importante ale proteinelor, lipidelor şi în dinamica hormonală, ducând în cele din urmă la sindrom de infecunditate şi sterilitate, boli ale oaselor. Toate aceste tulbur ări nutriŃionale pot fi prevenite prin adoptarea unei strategii raŃionale în hrănirea bovinelor, respectiv respectarea cerinŃelor nutriŃionale în funcŃie de starea fiziologică a animalului, de anotimp (furajele de sezon), vârsta animalului şi zona geografică.


65



D. Activitate II.1.4. – IBA Bucuresti Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizată pentru selectarea şi determinarea markerilor biochimici - Cercetări preliminare documentare privind dezvoltarea metodelor de determinare a markerilor biochimici (de tip flavonoizi sau carotenoizi sau terpene) în produsele lactate.

REZUMATUL ETAPEI DE EXECU łIE Prezentul referat prezintă rezultatele obŃinute în cadrul etapei nr. 2/ termen de predare 15.12.2009, al cărui obiectiv general are titlul ” Cercet ări preliminare privind elaborarea modelelor experimentale în vederea identific ării markerilor biochimici regionali care determin ă specificitatea regională a laptelui.” Rezultatele prezentate se refer ă strict la activitatea II.1 realizată de partenerul P4 (Institutul de Bioresurse Alimentare), din consor Ńiul proiectului finanŃat prin contractul de finanŃare 52-117/ 1.10.2008.

Titlul activităŃii II.1/ P4: Cercetări preliminare documentare privind metodica utilizat ă pentru selectarea şi determinarea markerilor biochimici. Prezentul raport este organizat în 4 capitole, dup ă cum urmează: Capitolul 1 - Caracterizarea generală a markerilor biochimici de tip carotenoizi Studiul efectuat pentru aceast ă etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea referinŃelor bibliografice, legate de modele experimentale utilizate în identificarea markerilor biochimici regionali, care determin ă specificitatea produselor lactate, de la furaje la lapte şi produse lactate, ob Ńinute din lapte de vac ă. In acest sens, în capitolul 1 s-a realizat un studiu de

documentare privind caracterizarea, din punct de vedere biochimic, a markerilor biochimici de tip carotenoizi, analiza criteriilor de clasificare a tipurilor de carotenoizi şi, nu în ultimul rând, importanŃa carotenoizilor în s ănătatea oamenilor. Datele bibliografice menŃionează că au fost identifica Ńi peste 600 de carotenoizi naturali şi se poate estima că natura produce anual peste 100 de milioane de astfel de pigmen Ń i. Cei mai răspândiŃi pigmenŃi cu această structur ă sunt: fucoxantina (alge marine), luteina (plante ierboase), β-carotenul, licopina, violaxantina şi apocarotenoidele (compu şi cu mai puŃin de 40 de atomi de carbon în moleculă). In plus, au fost analizate implica Ńiile carotenoizilor asupra produselor lactate, din punct de vedere nutriŃional şi senzorial şi faptul că pot fi considera Ńi potenŃiali biomarkeri pentru managementului trasabilităŃii creşterii animalelor, de la care se colecteaz ă laptele materie primă (ex. lapte de vacă, lapte de oaie, lapte de capr ă, lapte de bivoliŃă). Carotenoizii din laptele de vacă sunt, în special, toŃi β-carotenii trans, şi la o concentra Ńie mai mică, luteina. Carotenoizii determină culoarea portocalie la fructe şi legume (exemplu: morcov, cartofi dulci şi pepenele galben), la frunzele uscate şi, în concentra Ńie redusă, determină nuanŃele de galben la alimente de origine animala precum smântână , unt şi gălbenuş de ou. Culoarea produselor lactate depinde, în mare m ăsură, de concentraŃia lor de carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de măsurare a trasabilit ăŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hr ănirii vacilor de lapte permite un control eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate. Carotenoizii din plante sunt transfera Ńi în produsele animale, uneori în concentra Ńie mai mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentra Ńie mai scăzută, cum ar fi în produsele rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor lactate şi a stratului adipos. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

66



Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, de şi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune. O culoare galbenă a laptelui este asociat ă cu păşunatul care, în multe Ńă ri europene, are conota Ń ii de hrană „naturală ”. Astfel, carotenoizii pot fi percepu Ń i ca indicatori ai păşunatului verde. Din punct de vedere al factorilor care afectează compoziŃia carotenoizilor în alimente, studiile arată că alimentele variază, atât calitativ cât şi cantitativ, din punct de vedere al conŃinutului de carotenoizi. Propor Ńiile relative ale acestor carotenoizi sunt destul de constante, dar concentraŃiile absolute variază considerabil. Pot fi deosebite opt modele principale privind

nivelele de carotenoizi în diferite resurse alimentare. Capitol 2 - Identificarea markerilor biochimici în diverse tipuri de furaje In acest capitol s-a analizat stadiul cercet ărilor privind existenŃa carotenoizilor în diverse tipuri de furaje proaspete şi conservate/ concentrate; diversitatea carotenoizilor în furaje şi metodele de determinare disponibile si adecvate. În ciuda faptului c ă există o mare varietate de carotenoizi în plante, în furaje nu se găsesc mai mult de 10, dintre care cei mai importanŃi, din punct de vedere cantitativ, sunt β-carotenii şi luteina. Ca urmare a interesului limitat pentru conŃinutul de carotenoizi în dieta rumeg ătoarelor, analizele chimice sunt, de obicei, nespecifice şi privesc „carotenul”, care este un amestec de mai multe molecule şi izomeri. Au fost realizate o serie de experimente, în care s-a determinat concentraŃia de luteină sau xantofilii totali. Nu au fost determinate experimental alte molecule deoarece metodele de analiză nu au fost optimizate, fiind

dezvoltate pentru alte matrici (cum ar fi laptele sau sângele) sau pentru alimentele oamenilor. Până acum, metodele adecvate pentru furaje au inclus metode care necesitau un consum foarte mare de timp (folosind TLC [Thin Layer Chromatography- Cromatografie în strat sub Ńire]). In ultima perioadă au fost puse la punct metode mult mai rapide, folosind HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). Capitol 3 - Digestia, absorb Ń ia şi metabolizarea carotenoizilor

Capitolul 3 a fost concentrat pe aspecte legate de digestia, absorbŃia şi metabolizarea carotenoizilor, procese deosebit de importante în stabilirea modelului conceptual de determinare a markerilor biochimici specifici pentru caracteristicile regionale a produselor lactate. Numeroase date arată faptul că există o dependenŃă a concentraŃiei de carotenoizi din laptele de vacă faŃă de natura şi cantitatea de suplimente dietetice, furnizate prin intermediul raŃiei de furaj, precum şi prin transferul acestora din matricea vegetalelor către glandele mamare. Recuperarea scăzută a carotenoizilor din lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a acestui transfer şi se estimează că etapele diferite de transfer ale carotenoizilor, din hrană în lapte, pot influenŃa disponibilitatea acestora în glandele mamare. Prima etapă în procesul de digestie al carotenoizilor îl reprezint ă degradarea matricei vegetale, care eliberează aceste substanŃe în faza lichidă a rumenului. Gradul de degradare al carotenoizilor în rumen, de către microorganisme, variază în funcŃie de diferite rezultate ob Ńinute în modele experimentale in vitro sau in vivo, majoritatea în ceea ce priveşte β-carotenul. Chiar dacă unii autori nu au raportat nici o degradare a acestora, al Ńii au raportat o degradare moderată sau o dispariŃie totală a β-carotenului. Starea suplimentelor de carotenoizi poate explica discrepanŃele dintre experimente, deoarece gradele de degradare au fost mai mari în situa Ńiile în care carotenoizii au fost furniza Ńi ca produse purificate faŃă de furnizarea lor sub formă de furaje. In acest capitol a fost analizat ă şi influenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra varia Ńiei concentraŃiei de markeri biochimici de tip carotenoizi în lapte. Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în componente de interes nutri Ńional din brânz ă, este necesar să se cunoască nivelul care determină variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

67



Mul Ń i cercet ăt ori au demonstrat că , în afar ă de aspectele legate de con Ń inutul de substan Ńă uscat ă din brânză , variabilitatea compozi Ń ională a acesteia în acizi gra şi, β -caroten, xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compozi Ń ia „laptelui original”. CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele şi carotenoizi, este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compozi Ńia biologică, stadiul de maturitate, modul de conservare etc.), de specia animalului, de ras ă, de modul de recoltare a laptelui şi, bineînŃeles, de stagiul de lacta Ńie în care se află animalul. Capitol 4 - Metode experimentale de determinare a markerilor biochimici

In acest capitol au fost analizate o serie de metode de analiză şi proceduri generale utilizate în identificarea calitativă şi cantitativă a carotenoizilor. Pentru analiza carotenoizilor pot fi utilizate diferite metode. Alegerea celei mai adecvate metode este, de obicei, determinată de tipul de informaŃii necesare a fi obtinuŃe. În general, pigmentul carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte complexă. Cu toate acestea, este absolut necesară extracŃia eficientă şi respectarea tuturor protocoalelor analitice.


68



CAPITOL 1 1. CARACTERIZAREA GENERAL Ă A MARKERILOR BIOCHIMICI DE TIP CAROTENOIZI 1. 1 Introducere Termenul „ carotenoide” este utilizat pentru o grup ă de substanŃe asemă nătoare, care au formula C40H56, şi care sunt sintetizate doar de plante. Carotenul este un pigment fitosintetic, de culoare portocalie, cu rol extrem de important pentru fotosinteză. Carotenoizii determină culoarea portocalie la fructe şi legume (exemplu: morcov, cartofi dulci şi pepenele galben), la frunzele uscate şi, în concentra Ńie redusă, determină nuanŃele de galben la alimente de origine animala precum smântână, unt şi gălbenuş de ou. Carotenoizii sunt implica Ńi în caracterizarea nutriŃională şi senzorială a produselor lactate şi pot fi considera Ńi potenŃiali biomarkeri pentru managementului trasabilit ăŃii creşterii animalelor, de la care se colectează laptele materie primă (ex. lapte de vacă, lapte de oaie, lapte de capr ă, lapte de bivoliŃă). Studiul efectuat pentru aceast ă etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea referinŃelor bibliografice legate de modele experimentale utilizate în identificarea markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate, de la furaje la lapte şi produse lactate, obŃinute din lapte de vac ă. Din studiul efectuat s-a constatat c ă s-au identificat aproape 10 carotenoizi (ex. xantofile, caroten) în furaje, concentra Ńia lor variind foarte mult în func Ńie de stadiul de dezvoltare şi durata conservării acestora. Sensibilitatea β-carotenului în timpul rumegării variază foarte mult în funcŃie de sursa de hrană. Dintre rumegătoare, doar bovinele acumulează concentraŃii ridicate de carotenoizi, mai ales β-caroten, cel mai probabil datorit ă eficienŃei reduse de sintetiză a vitaminei A în enterocite. Plutirea carotenoizilor în plasm ă şi în Ńesuturile vacilor de lapte, în special abilitatea Ń esutului adipos de a elibera β-caroten, în cazul

animalelor epuizate sau subnutrite, reprezintă aspecte la care cercetarea trebuie să dea un răspuns. Carotenoizii din laptele de vac ă sunt, în special, toŃi β-carotenii trans, şi la o concentraŃie mai mică, luteina. În lapte concentra Ńia variază mai mult în cazul β-carotenului decât pentru retinol, a cărui concentraŃie plasmatică este bine reglată / adaptată. ConcentraŃia β-carotenului în lapte depinde de suplimentele dietetice consumate. Animalul şi factorii care Ńin de Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

69



hrănirea/alimentaŃia sa, afectează producŃia de lapte (ex. rasă). In general, controlul concentra Ńiei de β-caroten din lapte se efectuează prin mecanisme de concentrare/ diluare şi prin eficienŃa extracŃiei din plasmă. ConcentraŃia de β-caroten din brânză este în strâns ă legătură cu concentraŃia de β-caroten din lapte, având în vedere că în timpul producerii brânzei au loc pierderi importante de retinol. Culoarea produselor lactate depinde, în mare m ăsură, de concentraŃia lor de carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de măsurare a trasabilităŃii condiŃiilor de hr ănire. Managementul hr ănirii vacilor de lapte permite un control eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate [3]. Carotenoizii din plante sunt transfera şi în produsele animale, uneori în concentra Ńie mai mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentra Ńie mai scăzută, cum ar fi în produsele rumegătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor lactate şi a stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, de şi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune . O culoare galbenă a laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńă ri europene, are conota Ń ii de hrană „natural ă”. Astfel, carotenoizii pot fi percepu Ń i ca indicatori ai păşunatului verde.

La rumegătoare, ca şi la alte animale, carotenoizii (mai ales β-carotenul), sunt precursori ai retinolului (vitamina A). Printre rolurile retinolului la rumeg ătoare, ca şi la alte mamifere, s-a studiat intens influen Ńa sa asupra reproducerii/ înmul Ńirii. O deficienŃă în retinol poate reduce eficienŃa reproducerii la vacile de lapte, în special prin func Ńionarea defectuoasă a ovarelor şi frecvenŃa producerii avorturilor. Retinolul este, de asemenea, implicat în mai multe func Ńii vitale, cum ar fi vederea, creşterea şi fertilitatea masculină . Alături de vitamina E şi de polifenoli, carotenoizii sunt antioxidan Ńi naturali în dietele rumeg ătoarelor. Aceştia joacă un rol important în comunicarea celulelor şi funcŃia imunologică, prin protejarea celulelor faŃă de radicalii liberi. S-a demonstrat capacitatea carotenoizilor şi a retinolului de a reduce mastita/mamita la vacile de lapte, chiar dacă efectul β-carotenului nu a fost sistematic. Carotenoizii au, de asemenea, un rol pozitiv asupra fertilit ăŃii, independent de rolul retinolului. În plus, pe lâng ă rolul pe care îl au în sănătatea vacilor, concentraŃii ridicate de carotenoizi în lapte contribuie la o îmbun ătăŃire a valorii nutriŃionale a produselor lactate. Chiar dacă este evident că, în multe Ńări, aportul de carotenoizi în dieta oamenilor provine, în mare măsură, din morcovi, precum şi din alte fructe şi vegetale, se estimează că o concentraŃie mai ridicată este disponibilă în produsele lactate, conferindu-i laptelui o imagine mai bună în acceptabilitatea consumatorilor. În plus, carotenoizii pot juca un rol şi în stabilirea componentelor oxidabile din lapte. De asemenea, o concentra Ńie mai ridicată de retinol în lapte poate avea efecte benefice în îmbunătăŃirea aportului de vitamina A la oameni, în zone în care Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

70



această deficienŃă este des întâlnit ă. În ciuda diferitelor roluri benefice ale carotenoizilor, trebuie acordată atenŃie transferului lor, de la diet ă până la laptele de vacă [3].

1. 2 NoŃiuni generale despre markerii biochimici de tip carotenoizi Carotenoizii reprezintă una din cele mai importante clase de pigmen Ńi vegetali, care prezint ă efecte protectoare atât la nivelul Ńesuturilor vegetale cât şi a celor animale. Carotenoizii reprezintă un grup de coloranŃi naturali, galbeni, portocalii sau ro şii, răspândiŃi, în principal, în regnul vegetal (în morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya, mango) şi în regnul animal (în g ălbenuşul de ou, creveŃi, somon). Sunt compu şi care au 40 de atomi de carbon (8 resturi de izopren), cu structur ă de izoprenoide, rezulta Ńi prin unirea “capcoadă” a unor unităŃi de izopren. O caracteristică principală este localizarea centrală a sistemului de duble legături conjugate, care constituie grup ările cromofore. Acestea conferă carotenoizilor proprietatea de a absorbi radiaŃia luminoasă în domeniul vizibil, fiind baza identific ării şi cuantificării lor. Scheletul de bază poate fi modificat în multe feluri, incluzând ciclizarea, hidrogenarea, dehidrogenarea, introducerea oxigenului, rearanjarea, micşorarea catenei sau combinarea acesteia, rezultând o multitudine de structuri. Din punct de vedere chimic, carotenul este o terpenă, sintetizată biochimic din 8 unit ăŃi izopren. Ca hidrocarburi care nu contin oxygen, carotenoizii sunt liposolubili, insolubili în ap ă, în contrast cu alŃi carotenoizi, precum xantofilele (care sunt mai pu Ńin hidrofobe). β-carotenul este compus din dou ă grupări retinyl, care sunt scindate în mucoasa

intestinului sub Ńire de β-carotene-dioxigenază, în retinal (o formă de vitamina A). Carotenul se poate acumula în ficat şi Ńesutul adipos şi poate fi convertit în retinal când este nevoie, care este o forma de vitamina A pentru oameni şi alte specii de mamifere. Au fost identificate peste 600 de carotenoizi naturali şi se poate estima că natura produce anual peste 100 de milioane de astfel de pigmen Ńi. Cei mai răspândiŃi pigmenŃi cu această structură sunt: fucoxantina (alge marine), luteina (plante ierboase), β-carotenul, licopina, violaxantina şi apocarotenoidele (compu şi cu mai puŃin de 40 de atomi de carbon în molecul ă). Carotenoizii de culoare galbenă şi portocalie sunt cunoscu Ńi sub numele de caroten iar cei de culoare roşie sub numele de licopină. Carotenoizii se comportă ca şi antioxidanŃi, şi unii sunt precursori ai vitaminei A (din ele se sintetizeaz ă vitamina A), de aceea sunt numite provitamine. Carotenoizii sunt folositi în alimenta Ńie pentru colorarea untului, margarinei, cremelor lactate etc. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

71



Au utilizări numeroase în industria farmaceutic ă, cosmetică, industria alimentar ă (ca antioxidanŃi şi coloranŃi naturali), zootehnie (furajarea animalelor) etc. [7].

Datorită proprietăŃilor lor puternic antioxidante, unii carotenoizi au poten Ńial anticancerigen iar alŃii ajută la protejarea împotriva bolilor cardiovasculare şi a afecŃiunilor oculare. Privarea organismului animal de hrana care con Ńine aceşti pigmenŃi poate duce la dispariŃia culorii caracteristice. Func Ńia fiziologică a carotenoizilor în plante nu este înc ă bine cunoscut ă dar în organismul animal ace şti pigmenŃi au rol esenŃial prin rela Ńiile lor cu vitamina A şi cu substanŃele de pe retină, importante în procesul vederii.

PigmenŃii carotenoizi intervin în procesul de fotosintez ă, având un rol important atât în absorbŃia energiei luminoase cât şi în protejarea faŃă de autofotodistrugerea moleculelor de clorofilă sau a altor substanŃe active (citocromi, peroxidaze, catalaze, pigmen Ńi flavonoidici, vitamina B12, vitaminele E, vitaminele K etc.). Deoarece pot fixa oxigenul, formând compuşi oxigenaŃi puŃin stabili, pigmenŃii carotenoizi intervin în procesele de oxidoreducere. Pot forma metaboliŃi intermediari care să stimuleze sau să inhibe dezvoltarea plantelor. În organismul animal, aceşti pigmenŃi îndeplinesc rolul de provitamine A. Sunt importan Ńi, de asemenea, pentru acŃiunea ce o pot avea în fototropii şi fotoaxii [8]. 1.2.1 Tipuri de carotenoide

Cei mai mulŃi carotenoizi au structuri compuse din 40 atomi de carbon şi se împart în: Hidrocarburi carotenoidice

Cel mai cunoscut este α-carotenul, care se găseşte alături de clorofilă în plantele verzi, utilizat drept colorant alimentar, sub numele de Natural Yellow sau licopin ă. Se găseşte în tomate şi în ficat.

α-caroten α-carotenul este o substanŃă cristalină de culoarea cuprului, solubil ă în solvenŃ ii organici.

Prin încălzire, α-carotenul este posibil s ă se transforme în β-caroten. În plante se găseşte în cantităŃi mai mici decât β-carotenul.

β-carotenul se prezintă sub formă de cristale violete, de asemenea solubile în solven Ńii organici. Este foarte r ăspândit în tot regnul vegetal, înso Ńind permanent clorofila. Prin hidroliz ă enzimatică oxidativă, β-carotenul se transformă în două molecule de vitamină A1. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

72



γ-carotenul se prezintă sub formă de cristale roşii cu reflexe albastre, solubile în solven Ńi organici. γ-carotenul este pu Ńin răspândit în regnul vegetal, îns ă, în morcov se găseşte în cantitatea cea mai ridicat ă. Licopina (E160d) este o substan Ńă cristalină, de culoare roşu-violet, insolubilă în apă, solubilă în solvenŃi organici.

licopina Deriva Ń i oxigena Ń i ai hidrocarburilor carotenoidice (alcooli, epoxizi, cetone)

Sunt cunoscuŃi sub numele de xantofile. Acest termen, introdus de Berzelius, define şte grupa alcoolilor cu schelet carotenoidic. Se cunosc mai multe xantofile, dintre care cele mai importante sunt luteina şi zeaxantina. Luteina este o substanŃă cristalizată de culoare galbenă cu luciu violet, însoŃeşte β-carotenul şi clorofila în toate plantele verzi. Este colorantul galben al florilor. Se găseşte, de asemenea, în gălbenuşul de ou şi în Ńesuturile animale. Zeaxantina se prezint ă sub formă de cristale portocalii. Structural se deosebe şte de luteină prin poziŃia unei duble legături (2 cicluri β-ionice). Dintre cetonele carotenoidice se pot men Ńiona rodoxantina, cantaxantina şi astaxantina. Rodoxantina - dicetonă carotenoidică, este o substanŃă de culoare roşie-albăstruie, răspândit ă în plantele acvatice şi în conifere. Produşii reprezentativi utiliza Ńi drept coloranŃi alimentari sunt luteina şi citraurina, principiul colorat din coaja de portocale.

luteina

citraurina


73



Acizi carboxilici cu mai pu Ń in de 40 de atomi de carbon în moleculă

Cei mai utiliza Ńi din această categorie sunt norbixina, extrasă din planta tropical ă Bixa Orellana, şi crocina, care se găseşte în stigmatele florilor plantei orientale Crocus Sativus ( şofran).

norbixina

crocina

Din 1971, majoritatea Ńărilor permit folosirea pigmen Ńilor carotenoidici ca pigmen Ńi alimentari pentru colorarea unor produse ca unt, margarin ă, brânză, îngheŃată, macaroane, frişcă, gelatină, supe, sucuri de fructe. Compu şii sunt stabili la lumin ă şi în medii reducătoare şi prezintă avantajul că sunt compatibili cu alte tipuri de coloran Ńi, ceea ce permite nuanŃarea lor. Datorită solubilit ăŃii scăzute în gr ăsimi, pentru mărirea caracterului lipofil, aceştia se supun esterificării cu acizi graşi. Metodele de realizare a extractelor nu difer ă foarte mult, chiar Ńinând cont de varietatea şi de aria de răspândire în regnul vegetal şi animal. Spre exemplu,

pigmentul galben din cojile de portocale se poate extrage la cald cu eter de petrol. Extractul se concentrează iar apoi se antrenează carotenoizii cu abur supraînc ălzit. FracŃiunea uleioasă rezultată se extrage din nou cu eter de petrol şi se concentrează rezultând prin r ăcire pigmentul care se filtrează şi se usucă [9]. 1.2.2 Importan Ń a carotenoizilor în să nă tatea oamenilor

Principalii carotenoizi întâlni Ńi în alimente sunt: β-carotenul, α-carotenul, β-criptoxantina,

luteina şi licopenul, aceştia fiind şi carotenoizii cel mai des întâlni Ńi în plasma umană. S-a demonstrat că aceşti carotenoizi, împreună cu zeaxantina, au efecte benefice asupra sănătăŃii. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

74



β-carotenul, α-carotenul şi β-criptoxantina sunt provitamine A. Din punct de vedere

structural, vitamina A (retinolul) reprezint ă o jumătate din molecula de β-caroten. În consecinŃă, β-carotenul este cea mai puternic ă provitamină A, fiind şi cel mai răspândit. CondiŃia obligatorie

pentru ca un carotenoid să aibă activitate vitaminic ă A, este existenŃa unui inel β nesubstituit cu o catenă polienă de 11 carboni. Astfel, α-carotenul şi β-criptoxantina manifest ă aproximativ 50% din activitatea vitaminei A din β-caroten. Carotenoizii, provitamine A sau nu, au fost considera Ńi a avea efecte benefice asupra sănătăŃii oamenilor, şi anume sporesc imunitatea şi reduc riscul progres ării bolilor degenerescente, cum ar fi cancerul, bolile cardiovasculare, cataracta şi degenerările maculei. AcŃiunea carotenoizilor împotriva bolilor a fost atribuit ă unei proprietăŃi antioxidante, mai precis, abilit ăŃii lor de a anihila oxigenul liber şi de a interacŃiona cu radicalii liberi. Au mai fost declarate/raportate şi alte mecanisme, cum ar fi: modula Ńia metabolismului carcinogen, inhibarea înmulŃirii celulelor, sporirea/intensificarea diferenŃierii celulelor, stimularea comunicării celulă - celulă (cell - to - cell) şi filtrarea luminii albastre. Capacitatea carotenoizilor de a anihila oxigenul liber a fost rela Ńionată de sistemul de legături duble conjugate, eficienŃa maximă fiind dovedit ă de carotenoide cu 9 sau mai multe legături duble. Carotenoidul aciclic (licopenul) s-a dovedit a fi mult mai eficient decât β-carotenul biciclic, în ciuda faptului c ă ambii compuşi au 11 legături duble conjugate. Efectele licopenului asupra sănătăŃii oamenilor au stârnit un interes considerabil în ultimii ani, prin efectele puternic protective impotriva cancerului de pl ă mâni, stomac şi prostată. Luteina şi zeaxantina realizează pigmentul galben în macula retinei umane. S-a demonstrat că aportul dietetic sau nivelul plasmatic al acestor carotenoizi au un efect s emnificatv în reducerea riscului de degenerare a maculei, cauza principală a orbirii ireversibile a b ătrânilor. Acesti carotenoizi au fost, de asemenea, asociaŃi cu reducerea riscului de apariŃie a cataractei [5]. 1.2.3 Factorii care afectează compozi Ń ia carotenoizilor

Alimentele variază, atât calitativ cât şi cantitativ, din punct de vedere al con Ńinutului de carotenoizi. Legumele verzi, cu sau f ără frunze, au un model/ tipar calitativ de lutein ă definit, cu β-caroten, violaxantină şi neoxantină, ca şi carotenoizi principali. Propor Ńiile relative ale acestor

carotenoizi sunt destul de constante, dar concentra Ńiile absolute variază considerabil. În plus, legumele verzi conŃin şi carotenoizi mai puŃin importanŃi cum sunt: α-carotenul, α sau βcriptoxantina, zeaxantina, antheraxantina şi 5, 6-epoxiluteina. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

75



CompoziŃia carotenoizilor în fructe şi legume este mult mai complex ă şi variabilă, cu variaŃii chiar şi la carotenoizii principali. În general, fructele con Ńin mai puŃini carotenoizi principali, împreună cu o serie de carotenoizi mai pu Ńin importanŃi, la nivele foarte scăzute. Pot fi deosebite opt modele principale: 1) nivele nesemnificative de carotenoizi (de ex. în pere); 2) cantit ăŃi mici, în general, de carotenoizi de tip cloroplaste (de ex. în struguri); 3) cantit ăŃi considerabile de licopen (de ex. în roşii, pepene verde, guave cu pulp ă roşie, papaya); 4) predominanŃa β-carotenului şi/sau β-criptoxantinei (de ex. în caise, piersici); 5) cantit ăŃi mari de epoxide (de ex. în mango, carambola); 6) preponderenŃa unor specii de carotenoizi rari (de ex. în ardei iute roşu); 7) cantit ăŃi substanŃiale de poli-cis-carotenoide (de ex. în roşii cherry); 8) nivele semnificative de apocarotenoide (carotenoizi cu mai pu Ńin de 40 de atomi de carbon în moleculă; de ex. în speciile de citrice). Câteva îmbinări ale acestor modele/structuri sunt întâlnite în câteva fructe. În fructele coapte, carotenoizii se întâlnesc în cromoplaste, hidroxicarotenoizii fiind esterificati în special cu acizi graşi. Carotenoizii predomină în câteva culturi de r ădăcinoase carotenogenice (de ex. morcovi, cartofi dulci) iar xantofilele predomin ă în porumb (boabe). Pentru o calitate dat ă alimentelor, există în special, diferenŃe cantitative, datorit ă unor factori, ca: modul de cultivare, varietatea, stadiul de maturitate, clima, aşezarea geografică a producŃiei, partea utilizată din plantă, condiŃiile din timpul produc Ńiei agricole, manipularea post-recoltare, procesarea şi condiŃiile de depozitare. Există referinŃe cu privire la diferenŃele, calitative şi cantitative sau numai cantitative, în ceea ce priveşte carotenoizii în acela şi tip de alimente (exemplu: conŃinutul mediu de β-caroten din cartofii dulci cultiva Ńi, variază de exemplu de la 10 la 26,6 µg/100g). Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

76



Stadiul de maturitate este un factor care afecteaz ă în mod decisiv compoziŃia carotenoizilor. Maturizarea legumelor şi coacerea fructelor sunt, în general, procese înso Ńite de intensificarea carotenogenezei (producere de caroteni). Frunzele tinere sau mature au, în general, modele calitative similare de carotenoizi, dar au concentra Ńii diferite (exemplu: nivelele concentraŃiilor de carotenoizi în frunzele de l ăptucă şi andive cresc de 3 până la 4 ori în timpul maturizării). În fructe, continutul in carotenoizi creste considerabil, atât ca num ăr cât şi cantitativ, pe parcursul procesului de coacere. Temperatura ridicată şi expunerea îndelungat ă la soare sporeşte formarea carotenoizilor în fructe. Astfel, în zonele de clim ă tropicală este favorizată biosinteza carotenoizilor iar fructele obŃinute în asemenea zone prezintă concentraŃii superioare distincte de carotenoizi. În mod similar, legumele frunzoase obŃinute în sere sau în parcele acoperite cu folii de plastic prezint ă concentraŃii mai mari de carotenoizi în timpul verii. În schimb, nivelele carotenoizilor din legumele frunzoase cultivate în câmp deschis sunt semnificativ mai ridicate iarna decât vara, sugerând astfel, că fotodegradarea este superioar ă carotenogenezei. Multe fructe şi legume prezint ă cantităŃi mai ridicate de carotenoiyi în coaj ă decât în pulp ă, excepŃie f ăcând fructe ca guavele cu pulpă roz, unde licopenul este mai concentrat în pulp ă. Practicile agricole reprezint ă un factor important în influenŃa asupra compoziŃiei carotenoizilor. Comparând varză recoltată la acelaşi grad de maturitate, produs ă la ferme învecinate, una fiind o fermă naturală iar cealaltă convenŃională, care foloseşte substante chimice de sinteză agricole, s-au obŃinut concentra Ńii semnificativ mai mari pentru to Ńi constituenŃii carotenoizilor în probele de la ferma natural ă. În schimb, comparând lăptuca frunzoasă produsă convenŃional şi lăptuca frunzoasă produs ă hidroponic (creşterea plantelor în soluŃii minerale, f ără sol), nu au fost identificate diferen Ńe semnificative ale constituen Ńilor carotenoizilor [5]. CompoziŃia biologică, stadiul de maturitate şi modul de conservare a furajelor destinate hrănirii vacilor sunt factori ce influen Ńează compoziŃia laptelui în acizi gra şi, vitamine şi carotenoizi. În afară de factorii biologici, compozi Ńia nutriŃională a laptelui depinde de specie, rasă, cantitatea de lapte recoltat ă şi de stadiul de lacta Ńie al animalelor [1]. 1.3 Efectele procesă rii asupra carotenoizilor

Multe alimente carotenogenice sunt sezoniere iar procesarea materiei prime este necesară pentru a minimiza pierderile, pentru a face ca produsele s ă fie disponibile pe tot parcursul anului, şi pentru a permite transportarea în alte locuri decât zona de produc Ńie. Modificarea, reducerea

conŃinutului sau pierderea carotenoizilor în timpul proces ării şi depozitării alimentelor poate avea loc şi prin transportul fizic (ex. decojire neinten Ńionată), izomerizarea geometrică sau prin Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

77



oxidarea enzimatică sau ne-enzimatică. Deşi atenŃia este, adeseori, îndreptat ă spre procesarea industrială, prepararea în casă poate cauza pierderi mult mai importante de carotenoizi. Procentul reŃinut sau pierderea carotenoizilor în timpul proces ării şi depozitării alimentelor au fost studiate în numeroase articole. Oricum, datele ob Ńinute, sunt adesea contradictorii şi dificil de interpretat, din următoarele motive: a) condiŃiile de procesare şi depozitare nu sunt/ sunt doar par Ńial descrise; b) alimente diferite sunt procesate în mod diferit, f ăcând compararea metodelor de procesare dificilă; c) condiŃii diferite (ex. timp şi temperatură) sunt folosite pentru aceea şi metodă de procesare; d) procedura urmată pentru calcularea pierderilor de carotenoizi nu este specific ă sau calculul este greşit. În plus, trebuie avut ă o grijă deosebit ă pentru a asigura că orice izomerizare sau oxidare a carotenoizilor din timpul analizei şi/sau din timpul depozit ării probei, anterior analizei, nu este atribuit ă eronat procesării sau depozit ării alimentelor. Chiar dacă astfel de date experimentale sunt pu Ńine, insuficiente şi discrepante, pot fi conturate unele concluzii: a) Biosinteza carotenoizilor poate avea loc în fructe, legume, şi în culturile de r ădăcinoase, chiar după recoltare, cu condiŃia ca plantele s ă fie păstrate intacte, conservând enzimele responsabile de carotenogeneză. În frunze şi alte legume, degradarea carotenoizilor postrecoltare poate predomina, în special la temperaturi ridicate de depozitare şi în condiŃii de favorizare a veştejirii. b) Carotenoizii sunt proteja Ńi în mod natural în Ńesuturile plantei dar procese ca tăierea, ruperea, lovirea şi decorticarea fructelor şi legumelor sporesc, prin expunerea la ac Ńiunea oxigenului, reacŃia de oxidare dintre carotenoizi şi enzime. c) Stabilitatea carotenoizilor difer ă în diferite alimente, chiar şi când sunt folosite acelea şi condiŃii de procesare şi depozitare. Astfel, condiŃiile optime pentru reŃinerea carotenoizilor în timpul procesului de procesare variaz ă de la un aliment la altul. Carotenoizii ca atare prezintă susceptibilitate diferit ă la degradare. d) Principala cauză a distrugerii carotenoizilor în timpul proces ării şi depozitării este oxidarea enzimatică şi ne-enzimatică. Izomerizarea trans-carotenoizilor în ciscarotenoizi, în special în timpul tratamentului termic, altereaz ă activitatea şi modifică culoarea alimentelor, dar nu în aceeaşi măsură ca oxidarea. În multe alimente, degradarea enzimatică a carotenoizilor poate fi mai accentuat ă decât descompunerea termică. e) La prepararea alimentelor în cas ă, pierderea carotenoizilor are loc în felul următor: microunde
78



preparatelor şi metodelor diferite de gătit, coacerea şi murarea, toate au ca rezultat pierderea substanŃială a carotenoizilor. f) Indiferent de metoda de procesare, conŃinutul în carotenoizi descreşte proporŃional cu timpul de procesare (exemplu: temperatura mare de procesare, t ăierea şi transformarea în pastă a alimentelor). In scopul evit ării pierderii carotenoizilor se pot ajusta parametrii de procesare în sensul sc ăderii timpului de procesare, temperaturii de preparare, timpului dintre decojire, tăiere sau transformare în pastă şi procesare. Procesarea rapidă la o temperatură mare poate fi considerata o alternativă bună în acest scop. g) Opărirea poate determina pierderi de carotenoizi, iar inactivarea enzimelor oxidative, care are loc în acest tip de tratament termic, previne pierderea lor viitoare, în timpul folosirii după procesarea termică, procesarea lentă şi/sau depozitarea. h) Răcirea (în special răcirea rapidă) şi congelarea sunt procese care, în general, conservă carotenoizii. In schimb dezgheŃarea lentă poate reduce continutul in carotenoizi.[5].

1.3.1 Efectele tratamentelor termice asupra carotenoizilor din produse lactate Diferitele referinŃe arată că tratamentele termice din timpul prelucr ării laptelui nu au efecte negative sau determină doar pierderi mici ale carotenoizilor şi retinolului din lapte. S-a observat că pasteurizarea laptelui (72ºC/30’’) determină pierderea retinolului din gr ăsimea laptelui cu de 6%, dar nu se pierd β-carotenul şi luteina. În schimb, în urma pasteuriz ării are loc izomerizarea totală a retinolului, care trece din forma trans în forma cis, direct dependentă de intensitatea tratamentului termic. Panfili şi co., nu au detectat 13-cis-retinol în laptele brut de vacă, chiar dacă reprezintă 25g/kg din retinolul total din laptele de vac ă pasteurizat la temperatură moderată, şi 57g/kg în laptele pasteurizat timp de 72º-76º/C15’’. In concluzie, laptele supus unui tratament termic mai sever are un grad de izomerizare mai mare. β-carotenul pare să fie mai puŃin sensibil decât retinolul la inducerea izomeriz ării prin temperatură. După o procesarea termică la 80-90ºC/10’, 13-cis-β-carotenul este detectabil cantitativ şi reprezintă doar 10 g/kg din β-carotenii totali.

1.3.2 Efectul procesului de fabricare a brânzei asupra conŃinutului de carotenoizi O serie de studii au relevat c ă în timpul matur ării sau păstrării brânzei pe parcursul anului nu apar modificări sau apar doar modific ări minore în ceea ce priveşte concentraŃia de retinol şi carotenoizi, aşa cum este prezentat în figura 1.1 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

79


β-caroten


Xantofile Xantofil

Retinol

Brânză µg/g grăsime Figura 1.1 Legătura dintre compoziŃia în β-caroten, xantofile şi retinol a laptelui şi brânzei Legenda:

∆ Tomme de Savoaie ■ Abondance ▲ Rocamadour

x Cantal

În schimb, la fabricarea brânzei Gruyere s-a observat că apare o pierdere mare a retinolului în timpul fierberii laptelui şi a maturării. S-a evaluat rata de transfer a retinolului, βcarotenului şi xantofilelor din gr ăsimea din lapte în gr ăsimea din brânză, Ńinând cont de patru tehnologii de fabricare a brânzei şi laptelui autentic. Din figura de mai sus s-a concluzionat c ă există o valoare medie de 950 g/kg de βcaroten, dar numai 660 g/kg de retinol şi 640 g/kg de xantofile, prezente ini Ńial în grăsimea din lapte pot fi determinate din gr ăsimea brânzei. În plus, în ciuda varia Ńiei dintre tehnologiile de fabricare a tipului de brânza studiat (de exemplu temperatura de înc ălzire, nivelul de acidifiere şi timpul de maturare), s-a constatat că proporŃiile de retinol şi carotenoizi care se pierd nu variază în funcŃie de procedeul tehnologic de fabricare al brânzei. Aceste rezultate sugereaz ă că βcarotenul este foarte stabil, în timp ce retinolul şi xantofilele sunt par Ńial degradate şi/sau pierdute în zer în timpul fabricării brânzei. Kon şi co., au raportat că grăsimea din zer este mai bogat ă în carotenoide decât gr ăsimea din laptele iniŃial (+50%), ceea ce poate fi explicat prin dimensiunea mică a globulelor de gr ăsime din zer faŃă de lapte. Sensibilitatea mare a retinolului la fotoizomerizare urmată de expunerea laptelui la lumină, poate explica pierderea acestei vitamine în timpul procesului de fabricare a brânzei. Procedeul de fabricare a brânzei, nu duce îns ă, la o creştere a proporŃiei de 13-cis-β-caroten, care are o medie de 150 g/kg atât în lapte cât şi în grăsimea din brânză.[1]


80



CAPITOL 2 IDENTIFICAREA MARKERILOR BIOCHIMICI IN DIVERSE TIPURI DE FURAJE 2.1 ExistenŃa carotenoizilor în diverse tipuri de furaje În ciuda faptului c ă există o mare varietate de carotenoizi în plante, în furaje nu se g ăsesc mai mult de 10, dintre care cei mai importan Ńi, din punct de vedere cantitativ, sunt β-carotenii şi luteina. Ca urmare a interesului limitat pentru con Ńinutul de carotenoizi în dieta rumeg ătoarelor, analizele chimice sunt, de obicei, nespecifice şi privesc „carotenul”, care este un amestec de mai multe molecule şi izomeri. Au fost realizate o serie de experimente, în care s-a determinat concentraŃia de luteină sau xantofilii totali. Nu au fost determinate experimental alte molecule deoarece metodele de analiză nu au fost optimizate, fiind dezvoltate pentru alte matrici (cum ar fi laptele sau sângele) sau pentru alimentele oamenilor. In aceast ă situaŃie este dificilă evitarea contaminării probei de clorofilă. Până acum, metodele aecvate pentru furaje au inclus metode care necesitau un consum foarte mare de timp (folosind TLC [Thin Layer ChromatographyCromatografie în strat sub Ńire]). In ultima perioadă au fost puse la punct metode mult mai rapide, folosind HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). Este important s ă se pună accentul pe faptul că cele mai multe metode de depozitare a probelor (ex. liofilizarea, îngheŃarea-dezgheŃarea, refrigerarea), precum şi depozitarea pe termen lung, înaintea analiz ării, au efect de degradare a acestor molecule [3].

2.1.1 Diversitatea carotenoizilor ConcentraŃia de carotenoizi în furaje depinde de sinteza şi de gradul de degradare al acestora. Sinteza se realizează din unităŃile de izopren din plastide şi are loc, în special, în frunze. În funcŃie de tipul lor, frunzele conŃin de 5-10 ori mai mulŃi carotenoizi decât tulpina. Degradarea are loc rapid prin oxidare, în special datorit ă expunerii la lumină şi la radiaŃia solar ă. Cu metode de analiză potrivite, s-a demonstrat c ă furajele cultivate conŃin patru categorii majore de carotenoide: luteină, zeaxantină, epiluteină şi toŃi β-carotenii trans. În piciorul cocoşului ( Dactylis glomerata),

iarba perenă ( Lolium perene) şi trifoiul roşu (Trifolium pratense), proporŃiile de

luteină, zeaxantină, epiluteină şi β-caroten sunt 630, 120, 80 şi respectiv 170 g/kg, propor Ńiile variind foarte puŃin în diferitele specii de furaje. În lucern ă au fost detectate neoxantin ă şi Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

81



violaxantină, în timp ce în nutreŃul natural verde au fost detectate violaxantin ă, anteraxantină şi 13 cis-β caroten. S-au găsit cantităŃi foarte mici de α-caroten în nutreŃul natural verde.

2.1.2 Carotenoizii în furaje proaspete DiferenŃele concentraŃiilor de carotenoizi din speciile de furaje verzi sunt mai pu Ńin semnificative faŃă de diferenŃele acestora din speciile de furaje uscate. Park şi co., au găsit cu 50% mai mulŃi carotenoizi în Bromus ( Bromus inermis ) şi trestie ( Phalaris arundinacea) decât în Agropyron ( Agropyron repens), în timp ce Chauveau-Duriot şi co. au demonstrat că trifoiul roşu conŃine cu 25% mai multi carotenoizi decât piciorul coco şului sau iarba perenă. În ierburile tropicale, Reynoso şi co. nu au găsit nici o diferenŃă în ce priveşte concentraŃiile de β-caroten şi luteină din iarba de gazon ( Cynodom dactylon) şi iarba Pangola ( Digitaria decumbens). Pe baza datelor din literatur ă şi pe baza datelor nepublicate, este dificil s ă se tragă o concluzie în ce priveşte diferenŃele sistematice dintre speciile de iarb ă cultivat ă şi cele de iarbă naturală, sau dintre iarbă şi legume. Mai mult, fertilizarea cu N creşte concentraŃia de carotenoizi din ierburi şi legume. Aceasta se poate datora activării biosintezei carotenoizilor de c ătre proteine. Efectul stadiului de maturitate şi/sau anotimpului asupra con Ńinutului de carotenoizi în furaje rămâne încă un subiect controversat. Prache şi co. au raportat că pe o păşune din FranŃa concentraŃia totală de carotenoizi a variat foarte pu Ńin între luna mai şi sfârşitul lunii iunie (650700 mg/kg DM), apoi a scăzut la 430 mg/kg DM la începutul lunii august. În Fran Ńa, în timpul unei veri foarte secetoase, Calderon şi co. nu au observat o influen Ńă a gradului de maturitate în concentraŃia de carotenoizi din iarba verde natural ă pe parcursul lunii iunie. În urma studiilor efectuate s-a observat că, concentraŃia de carotenoizi scade cu vârsta furajului, indiferent de sezon, de numărul cositorilor sau de numărul regenerărilor. ConcentaŃiile de luteină şi β-caroten în furajele verzi sunt de 2-3 ori mai mari pentru aceeaşi specie de iarbă umedă tropicală, comparativ cu cea uscată. Unii autori au pus acest rezultat pe seama propor Ńiei ridicate de frunze la tropicele umede, dar este foarte probabil ca al Ńi factori, cum ar fi de exemplu temperatura sau radiaŃia solară, să modifice gradul de sinteză al carotenoizilor.

2.1.3 Carotenoizii în furajele conservate Uscarea furajelor la soare scade puternic concentra Ńia de carotenoizi, în special când plouă în timpul întoarcerii şi stângerii/adunării fânului cosit. Studiile realizate de ChauveauCercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

82



Duriot şi co. au arătat că din momentul cosirii fânului şi până în momentul însiloz ării fânului uscat se înregistrează o pierdere medie a carotenoizilor de pân ă la 83%, aşa cum este reprezentat în figura 2.1.

Figura 2.1 Efectele metodelor de conservare a furajelor cultivate, asupra concentra Ńiilor de xantofile şi βcaroten Legenda:

(□) xantofile (■) β-caroten C - piciorul cocoşului ( Dactilys glomerata) PR - iarbă perenă ( Lolium perenne) RC - trifoi roşu (Trifolium pratense)]

Pierderile de luteină şi epiluteină au loc mai lent decât cele de zeaxantină şi caroten. Această pierdere a carotenoizilor se datoreaz ă, în special, radiaŃiilor solare, deoarece prin expunerea la razele UV pe întuneric poate fi distrus ă întreaga cantitate de carotenoizi. Oricum, pierderi moderate de carotenoizi apar şi în timpul depozit ării în interiorul şopronului, probabil datorit ă prezenŃei oxigenului. Independent de veştejire, procesul de însilozare determin ă scăderea concentraŃiei de carotenoizi. Pierderile de carotenoizi depind de pH şi sunt favorizate de condi Ńiile aerobe. Aceste pierderi sunt mai mari în cazul legumelor decât în cazul ierbii, când pH-ul este mare (~ 5) şi când sigilarea silozului este întârziat ă, crescând proporŃional cu timpul de depozitare. Pierderile maxime pot ajunge până la 80% din concentra Ńia iniŃială, dar în silozurile bine construite pierderile sunt, în general, mai mici de 20%. În cazul deshidratării lucernei, rezultă o pierdere a carotenilor şi a xantofilelor, extinderea pierderii depinzând de proces. Aceast ă pierdere este mai mare pentru procesele în care se foloseşte temperatură mare, în special pentru xantofile, când produsul finit are o concenta Ńie mare a umidităŃii. La o temperatură de 120ºC, şi o umiditate a produsului final de 8%, deshidratarea are Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

83



un efect limitat asupra carotenoizilor, cu toate c ă în condiŃii mai drastice (mai mult de 150ºC, şi mai puŃin decât 3% umiditate finală) pot rezulta pierderi mai mari de 33% caroteni şi 73% xantofile. În oricare din cele dou ă cazuri, deshidratarea are un efect negativ mai redus decât însilozarea sau întoarcerea şi strângerea/adunarea fânului cosit.

2.1.4 Carotenoizii în concentrate Majoritatea nutreŃurilor concentrate folosite în hrana vacilor au un con Ńinut foarte scăzut de carotenoizi. Porumbul conŃine luteină şi zeaxantină, şi cantităŃi scăzute de multe alte xantofile, cum sunt de exemplu criptoxantin ă şi zeinoxantină, care sunt concentrate în masa de gluten din cereale. Procesarea nutreŃurilor pentru obŃinerea de concentrate implic ă, adesea,încălzirea care, probabil, distruge cea mai mare parte din conŃinutul de carotenoizi. Produsele secundare rezultate din tomate (prezente în unele zone ca siloz de past ă de tomate), produsele pe bază de grapefruit roşu (care este consumat proaspăt sau sub formă de pastă citric ă însilozat ă), conŃin licopen, cu toate că, prin procesare concentra Ńia acestuia în pastă de citrice uscată, este redusă. În aceste tipuri de nutreŃuri sub formă de pastă, concentaŃiile de β-caroten sunt scăzute [3].

CAPITOL 3 DIGESTIA, ABSORBłIA ŞI METABOLIZAREA CAROTENOIZILOR 3.1 Digestia, absorb Ńia şi metabolizarea carotenoizilor ConcentraŃia de carotenoizi din laptele de vacă este determinată de natura şi de cantitatea de suplimente dietetice, furnizate prin intermediul ra Ńiei de furaj, precum şi prin transferul acestora din matricea vegetalelor către glandele mamare. Recuperarea scăzută a carotenoizilor din lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a acestui transfer şi se estimează că etapele diferite de transfer ale carotenoizilor, din hran ă în lapte, pot influenŃa disponibilitatea acestora în glandele mamare. Prima etapă în procesul de digestie al carotenoizilor îl reprezint ă degradarea matricei vegetale, care eliberează aceste substanŃe în faza lichidă a rumenului. Gradul de degradare al carotenoizilor în rumen, de către microorganisme, variază în funcŃie de diferite rezultate ob Ńinute în modele experimentale in vitro sau in vivo, majoritatea în ceea ce priveşte β-carotenul. Chiar dacă unii autori nu au raportat nici o degradare a acestora, al Ńii au raportat o degradare moderată Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

84

Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG TRASAREG


sau o dispariŃie totală a β-carotenului. Starea suplimentelor de carotenoizi poate explica discrepanŃele dintre experimente, deoarece gradele de degradare au fost mai mari în situa Ńiile în care carotenoizii au fost furniza Ńi ca produse purificate fa Ńă de furnizarea lor sub formă de furaje. Această ipoteză a fost confirmat ă recent de INRA, într-un studiu in vitro unde, aparent, nu a fost detectată nici o degradare a luteinei din furaj, chiar dac ă 50% din conŃinutul iniŃial a disp ărut în momentul în care, aceeaşi cantitate de luteină a fost adăugată ca sursă comercială disponibil ă in stare pură. Nu au fost raportate efecte ale compozi Ńiei dietei, deşi raŃiile care conŃineau soia, cereale şi seminŃe de bumbac (care sunt bogate în lipo-oxigenaze) pot stimula degradarea în rumen a carotenoizilor. Carotenoizii din laptele de vac ă sunt reprezenta Ńi, în principal, din to Ńi βcarotenii trans şi în propor Ńii mai mici luteină, zeaxantină, β-criptoxantină. În laptele de vac ă au fost detectate urme 13- cis-β caroten, dar originea lor (naturală sau rezultată în urma izomerizării pe parcursul conservării sau extracŃiei) a rămas neclară. ProporŃia de β-caroten din totalul de carotenoizi din lapte este cuprins ă între 750 şi 850 g/kg. ConcentraŃiile de carotenoizi şi retinol în laptele de vac ă, raportate în literatur ă, variază foarte mult între diferite studii, de la 1



17 pentru carotenoizi şi, respectiv, de la 1



12 µg/g

grăsime, pentru retinol, a şa cum sunt reprezentate datele, atât în tabelul 1 cât şi în figura 3.1.

Figura 3.1 Studierea relaŃ rela Ńiei dintre β-carotenul dietetic şi concentraŃ concentraŃia β-carotenului din gră gr ăsimea laptelui la lactaŃ lactaŃia medie a vacilor Legenda: 1

Carotenoizi β-caroten 3 Grăsimea din unt estimat ă la 40 g/kg 4 Date nepublicate de la INRA, Theix, France 2


85



InfluenŃ InfluenŃa rasei vacilor asupra carotenoizilor ReferinŃ ReferinŃe Morris şi col. (2002)1 Martin şi co. (2004)2,3,4 Noziere şi col. (2006)2 Coulon şi Grolier (nepublicat)2,3 Coulon şi Grolier (nepublicat)2,3,4

Rasa 100% Jersey 62% Jersey 62% Friesian 100% Friesian Montbeliarde Terentaise Holstein Montbeliarde Holstein Montbeliarde Terentaise Montbeliarde Terentaise

Numă Numărul de vaci 720 (lapte) 3501(plasmă) 28 28 12 20 14 24 4 20 12

1,2

şi retinolului din lapte şi produse lactate

Carotenoizi Lapte µg/g gră grăsime 7.5 8.1 7.3 5.2 2.9 3.1 2.8 2.6 2.3 2.3 2.8 2.8 2.5

Plasmă Plasmă µg/ml 16.1 14.5 13.0 12.4 2.4 2.7 3.6 3.4 2.0 1.9 1.7 3.8 3.0

Retinol Lapte µg/g gră grăsime

3.5 3.5 4.2 4.2

Tabel 3.1

Plasmă Plasmă µg/ml

0.49 0.46 0.68 0.46

O variaŃie mare apare şi în cazul β-carotenului din plasmă (de la 1 la 16 µg/ml), în timp ce concentraŃiile de retinol sunt mai pu Ńin variabile (de la 0.1 la 0.6 µg/ml). Au fost identificati câŃiva factori atât dietetici cât şi nedietetici care influenŃează această variabilitate. variabilitate. In aceste studii s-au utilizat numeroase tehnici pentru extrac Ńie şi/sau cuantificare prin spectrofotometrie sau cromatografie. In studii mai vechi, rezultatele sunt exprimate diferit (de exemplu: carotin ă, carotenoizi, carotene sau caroten), în timp ce importan Ńa biochimică pentru fiecare termen nu a fost specificat ă. Aceasta se datorează, probabil, varia Ńiilor mari ale valorilor absolute raportate, în diferite publica Ńii [1].

3.2 InfluenŃa factorilor endogeni şi exogeni asupra varia Ńiei concentra Ńiei de markeri biochimici de tip carotenoizi în lapte ConcentraŃia de carotenoizi din lapte difer ă în funcŃie de:

Specie Laptele de capr ă şi de oaie, în contrast cu laptele de vac ă, conŃine numai retinol şi xantofile şi nu conŃine β-caroten, explicându-se, astfel, diferenŃele majore care apar între produsele lactate obŃinute din lapte de la bovine şi de la rumegătoare mici.

Rasă Rasă ConcentraŃia de β-caroten în laptele de vacă diferă, în mare măsură în funcŃie de rasa vacii. Faza de lactaŃ lactaŃie ConcentraŃiile de β-caroten şi retinol sunt mult mai mari în colostru decât în lapte, acestea scăzând rapid pe parcursul primei săptămâni după f ătare. La lactaŃia mijlocie, s-a observat o creştere în timp a concentra Ńiei de β-caroten în lapte şi mai puŃin în plasmă.

Starea de să sănătate Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

86



ConcentraŃiile scăzute de β-caroten sau retinol din plasm ă au fost asociate cu o cre ştere a incidenŃei infecŃiei la uger. Vacile care sufereau de mastit ă severă aveau tendinŃa de a produce lapte care conŃinea mai puŃin β-caroten şi mai mult retinol decât vacile s ănătoase, dar diferenŃele au fost neînsemnate la lacta Ńiile medie şi timpurie.

ProducŃ ProducŃia de lapte şi gră grăsimea din lapte Efectul nivelului produc Ńiei de lapte asupra concentra Ńiilor de carotenoizi şi retinol din lapte a fost evaluat indirect prin intermediul factorilor care o afecteaz ă, de exemplu rasa, stadiul de lacta Ńie sau nivelul de alimentare. Mai exact, prin comparare, o singur ă mulgere pe zi induce o sc ădere a producŃiei de lapte şi o creştere a a conŃinutului de gr ăsime din lapte, în timp ce două mulgeri pe zi, determină producerea unei brânze mult mai galbene.

Variabilitatea individuală individuală ConcentraŃia de carotenoizi din plasmă şi din lapte este variabil ă între indivizi. Factorii din diet ă care influenŃează concentraŃiile de carotenoizi şi retinol din lapte sunt:

Natura furajelor ConentraŃia de β-caroten din lapte este direct dependent ă de concentra Ńia de β-caroten din dietă. ConcentraŃia de β-caroten variază în funcŃie de maturitatea ierbii şi scade pe parcursul uscării şi conservării acesteia, propor Ńional cu gradul de expunere la lumin ă, deoarece β-carotenul este foarte sensibil la radia Ńiile UV.

Gradul de maturitate şi managementul nutreŃ nutreŃului verde Hrănirea cu nutreŃ verde a fost asociată pentru mult timp cu concentara Ńii mari de β-caroten în lapte, cu varia Ńii mari funcŃie de sezon, când gradul de maturitate şi perioada de lacta Ńie sunt confundate.

β-carotenul şi suplimentarea cu vitamine Unele studii au demonstrat că β-carotenul are un rol specific în eficien Ńa reproducerii la bovine, pe lângă activitatea sa de provitamin ă A. La vaci, prin suplimentarea dietei cu vitamina A, are loc o creştere a concentraŃiei de retinol în plasm ă, colostru şi lapte, dar se reduce concentra Ńia de carotenoizi, atât în lapte cât şi în plasmă. Când se suplimentează cu vitamina E furajele pentru vaci, are loc o scădere a concentraŃiei de β-caroten în plasmă şi în Ńesutul celular.

Durabilitatea şi întârzierea stă stării de latenŃă latenŃă În timpul lacta Ńiei medii, schimbarea alimenta Ńiei de la iarbă verde la o diet ă pe bază de fân, induce rapid o scădere a concentraŃiei de β-caroten şi a culorii, atât în plasm ă cât şi în lapte. Schimbările apar din prima zi, iar diferen Ńa maximă în concentraŃia de β-caroten din lapte, între dieta pe bază de iarbă verde şi dieta pe bază de fân apare dup ă 10-15 zile de la transferul acestora din furaje în lapte şi în plasmă. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

87



BilanŃ BilanŃul energetic Cu o cantitate fixă de β-caroten şi retinol ingerat ă, limitarea energiei consumate pe parcursul lactaŃiei medii, induce o creştere a concentraŃiei de β-caroten şi retinol din lapte, de şi concentraŃia din plasmă rămâne neschimbată. Deoarece concentraŃia din plasmă rămâne neschimbată, creşterea secreŃiei de retinol în lapte, poate fi raportat ă mai exact la o transmitere a β-carotenului din rezervele de Ńesut adipos.

3.3 Transferul carotenoizilor şi retinolului din laptele materie prim ă în produsele lactate Carotenoizii şi retinolul sunt sensibili la diferi Ńii factori fizico-chimici, cum ar fi: aerul, agenŃii de oxidare şi razele UV. Degradarea lor este accelerată de temperatură ridicată şi este catalizată de ionii anorganici. Retinolul poate fi instabil la valori ale pH-ului mai mici de 4. Un pH scăzut cauzează izomerizarea parŃială a retinolului de la toate formele trans la mai puŃin eficientele forme cis, iar prin hidroliza esterilor retinolului rezult ă un retinol mult mai instabil. Prin urmare, tratamentele tehnologice, cum sunt înc ălzirea sau acidifierea aplicate la procesarea laptelui (pentru ob Ńinerea de produse lactate) ca si procesarea imediat ă (f ără repaus după recoltare) şi mediul de depozitare (lumină, temperatură), sunt factori care degradează /permit degradarea acestor micronutrienŃi şi influenŃează carenŃa vitaminică a produselor lactate rezultate. r ezultate. În plus, procesarea unor produse lactate (brânz ă, unt) implică transferul selectiv al constituen Ńilor din lapte în produse lactate. Oricum, o propor Ńie scăzută de retinol şi carotenoizi este asociat ă cu proteinele din zer sau este concentrat ă în membrana globulelor laptelui gras. Ca rezultat, o anumit ă cantitate a acestor micronutrienŃi, poate fi pierdut ă prin zer, în timpul producerii brânzei şi untului [3].

Pentru evaluarea rela Ńiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în componente de interes nutri Ńional din brânz ă, este necesar să se cunoască nivelul care determină variabilitatea variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui. Mul Ń i cercetă tori au demonstrat că , în afară de aspectele legate de con Ń inutul inutul de substan Ńă uscată din brânză , variabilitatea compozi Ń ional ă a acesteia în acizi gra şi, β -caroten, -caroten, Ń ional

Ń ia xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, principal, de compozi Ń ia „laptelui original”.

CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele şi carotenoizi, este puternic influen Ńată de natura dietei animalului (compozi Ńia biologică, stadiul de maturitate, modul de conservare etc.), de specia animalului, de ras ă, de modul de recoltare a laptelui şi, bineînŃeles, de stagiul de lacta Ńie în care se află animalul [1]. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

88



3.4 InfluenŃa dintre carotenoizii din lapte şi proprietăŃile senzoriale ale produselor lactate Carotenoizii din lapte influenŃează propriet ăŃile senzoriale ale produselor din lapte fie indirect, prin intermediul propriet ăŃilor antioxidante, fie direct, prin propriet ăŃile lor de îngălbenire. a) ProprietăŃile antioxidante Lipidele din produsele lactate pot suferi procese de oxidare, determinând schimb ări ale calităŃii produselor finite lactate şi, uneori, un impact negativ asupra calit ăŃii acceptabile apreciată de consumatori. Autooxidarea lipidelor, similar cu oxidarea indus ă de lumină, este afectată de un complex de pro- şi antioxidanŃi. Principalii compuşi antioxidanŃi din lapte sunt enzimele (adică superoxid-dismutaza, catalaza, glutation-peroxidaza), lactoferina, vitaminele C şi E, şi carotenoizii. Vitamina E şi carotenoizii acŃionează ca antioxidanŃi solubili în gr ăsime (de exemplu, β-carotenul este implicat în prevenirea foto-oxidării). b) Culoarea produselor lactate Evaluarea culorii în produsele lactate este realizat ă, în majoritatea studiilor, cu ajutorul instrumentelor de măsurare a culorii tricromatice, care dau rezultate exprimate în sistemul Hunter L, a, b, unde “L” defineşte poziŃia probei pe axa luminii întunecate, “ a” pe axa luminii verderoşie şi “ b” pe axa luminii albastr ă-galbenă. În lipsa unor probe etalon, procedurile de preparare şi condiŃiile de iluminare ridic ă probleme majore relatate în studiile din literatur ă [1].

CAPITOL 4 METODE EXPERIMENTALE DE DETERMINARE A MARKERILOR BIOCHIMICI 4.1 Proceduri generale de analiz ă a carotenoizilor Pentru analiza carotenoizilor pot fi utilizate diferite metode. Alegerea celei mai adecvate metode este, de obicei, determinată de tipul de informa Ńii necesare a fi obtinu Ńe. În general, pigmentul carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte complexă. Cu toate acestea, este absolut necesar ă extracŃia eficientă şi respectarea tuturor protocoalelor analitice [5]. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

89



łinând cont de faptul că moleculele carotenoidice prezint ă un lung lanŃ de legături duble

conjugate, acestea reacŃionează foarte uşor cu acizii, bazele, oxigenul şi lumina, motiv pentru care trebuie avută o grijă deosebit ă când se analizează produse cu un conŃinut scăzut de carotenoizi (de exemplu uleiul din seminŃe de dovleac) [6]. În general, analiza carotenoizilor const ă în urmatoarele etape: a) selecŃia şi prepararea probei, b) extracŃia, c) separarea cu un solvent compatibil, imediat dup ă pasul cromatografic, d) saponificarea şi spălarea, e) concentrarea sau evaporarea solventului, f) separarea cromatografică, g) identificarea şi h) cuantificarea.

4.2 Separarea cromatografic ă łinând cont de regulile pe care le impune separarea cromatografic ă, probele trebuie

introduse în sistemul cromatografic în volum cât mai mic, iar solu Ńia de carotenoizi, dup ă divizare (pentru a realiza saponificarea probei), este uscată cu sulfat de sodiu anhidru şi apoi concentrată sau evaporată la sec. Probele caracteristice de alimente conŃin substanŃe de tip carotenoizi, conjugate, nepolare, dar şi multe xantofile polare. Oricare ar fi metoda utilizat ă, procesarea cromatografică trebuie să fie capabilă să facă faŃă tipurilor de polaritate. a)

În esenŃă, coloana cromatografică deschis ă, de „scurgere gravitaŃională”, cunoscut ă ca OCC (open column chromatography - coloană cromatografică deschis ă), reprezintă metoda clasică de separare a carotenoizilor, pentru analiza cantitativă. Este, de asemenea, utilizată pentru izolarea şi purificarea carotenoizilor, şi apoi ca standarde pentru HPLC. Separarea pigmenŃilor carotenoidici este urmărită vizual. De asemenea, trebuie aplicată o presiune mică în vârful coloanei (ex. cu N2 gaz). Această tehnică este denumită coloană cromatografică în curent de apă.

b)

Cromatografia în strat sub Ńire (TLC), deşi este eficientă în monitorizarea testelor chimice în vederea identificării rezultatelor, nu este adecvat ă pentru analizele cantitative, din cauza pericolului de degradare şi izomerizare la expunerea îndelungată pe masa de lucru.


90


c)


Cromatografia cu gaze este, de asemenea, neadecvată, datorită instabilit ăŃii termice şi a volatilit ăŃii reduse pe care o prezintă marea majoritate a carotenoizilor.

În ceea ce priveşte separarea şi/sau analiza cu ajutorul unei OCC, aceasta trebuie realizat ă pentru fiecare analiză în parte. Avantajul major al metodei HPLC fa Ńă de OCC constă în faptul că pot fi realizate separ ări reproductibile prin simpla folosire a unei coloane reutilizabile, în condiŃii controlate, f ără expunerea excesivă la aer sau lumină. Faza inversă a HPLC pe coloane C18 poate fi modul preferat pentru separarea carotenoizilor pentru analizele cantitative. Preferin Ńa pentru coloana C18 derivă din interacŃiunile hidrofobice slabe pe care le exercit ă cu analiŃii (acest aspect face această coloană mai puŃin distructivă decât forŃa polară exercitată în faza normală a OCC), compatibilitatea cu majoritatea solvenŃilor carotenoidici şi cu catena polar ă a carotenoizilor precum şi disponibilitatea comercială. Majoritatea separ ărilor de carotenoizi au fost realizate cu particule sferice C 18 de 5µm, în coloane de 250x4,6 mm. Cu toate acestea, sunt utilizate din ce în ce mai mult coloane, mai scurte şi mai înguste, cu particule mai mici şi cu faze staŃionare C30. Fazele monomerice sunt mai uşor de utilizat şi sunt mult mai reproductibile. S-a dovedit că fazele polimerice, ca C18, au selectivitate excelentă pentru carotenoizi cu structuri similare, cum ar fi izomerii geometrici ai β-carotenului, luteinei şi zeaxantinei. Carbonul total reŃinut este redus în fazele polimerice cu pori mari, având ca efect un timp de retenŃie foarte scurt, pentru carotenoizi. În plus, comparând rezultatele ob Ńinute pe acest tip de coloane cu cele obŃinute pe coloanele monomerice, se observă că picurile tind s ă fie largi. Coloanele de reŃinere, care trebuie schimbate frecvent, sunt utilizate pentru a preveni pătrunderea particulelor fizice şi a impurităŃilor în coloana analitică, prelungindu-se, astfel, viaŃa întregii coloane. Coloanele de reŃinere pot, totuşi, determina mărirea benzii şi astfel, reŃinerea carotenoizilor. Cele mai importante propriet ăŃi care trebuie luate în considerare pentru selectarea fazei mobile sunt polaritatea, vâscozitatea, volatilitatea şi toxicitatea. În plus, faza mobilă trebuie să fie inertă faŃă de carotenoizi. Multe sisteme de solven Ńi sunt propuse ca faze mobile pentru carotenoizi iar cele mai multe dintre acestea sunt u şor modificate de câteva combina Ńii bazice, dar ca solvenŃi principali sunt acetonitrilul şi metanolul. Acetonitrilul este utilizat pe o scar ă foarte largă, datorită vâscozităŃii reduse şi selectivităŃii mult mai bune pentru xantofile, când se utilizează o coloană C18. S-a demonstrat că sistemele de solvenŃi pe bază de metanol oferă o recuperare mai bună a carotenoizilor fa Ńă de sistemele pe bază de acetonitril. Metanolul este, de asemenea, mult mai accesibil, mai ieftin şi mai puŃin toxic decât acetonitrilul. Prin adăugarea de trietilamină la solvenŃii pe bază de acetonitril s-a ob Ńinut o mai bună recuperare a carotenoizilor. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

91



Din cauza variaŃiilor cantitative şi calitative a carotenoizilor din compozi Ńia alimentelor, este discutabil dacă poate fi stabilit un singur sistem cromatografic care s ă poată fi aplicat mai multor tipuri de alimente. Pentru separarea carotenoizilor s-au utilizat diferite tipuri de faze, cum ar fi: zaharoz ă pudră, sefaroză DEAE, celuloză sau MgO/Hyfluosupercel. ToŃi β-caroteni trans pot fi separa Ńi de izomerii 9-cis şi 13-cis, utilizând o coloană deschidă umplută cu hidroxid de calciu.

Cromatografia în strat subŃire (Thin Layer Chromatography - TLC) TLC şi HPTLC (High Performance TLC) sunt utilizate pentru separarea şi izolarea claselor de molecule individuale, deoarece TLC este o metodă rapidă, eficientă şi relativ ieftină. AtenŃie deosebită trebuie acordată când separarea se face pe silica-gel. Atunci este necesar ă neutralizarea prealabilă a acidităŃii siliciului, pentru a se evita rearanjarea epoxid-furanoxid, în moleculele de carotenoizi. Din p ăcate, separarea compuşilor cu structuri similare este foarte dificilă. Acest fapt este ilustrat foarte bine în figura 4.1, prin compararea cromatogramelor obŃinute prin metodele TLC şi HPLC, pentru uleiul din semin Ńe de dovleac.

Figura 4.1 Cromatograma pigmenŃilor din uleiul din seminŃe de dovleac

Legenda:

TLC - eter de petrol/acetonă (80/20 % vol.) HPLC - metanol, acetonitril, clorur ă de metilen

Metoda TLC permite separarea a 4 benzi, în timp ce prin metoda HPLC s-au ob Ńinut 14 picuri. Metodologia TLC poate fi completat ă de tehnici de separare mult mai eficiente, cum este de exemplu metoda HPLC cuplată cu UV-Vis şi/sau detecŃie fluorometrică. Cromatografia lichidă de înaltă performanŃă (High-performance liquid chromatography - HPLC) Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

92



Având un caracter clar hidrofob, pentru analiza carotenoizilor se prefer ă o coloană C18 cu inversie de fază (RP - reversed phase). De curând, a apărut pe pia Ńă coloana C30-RP, care este, în mod special, foarte potrivit ă pentru separarea carotenoizilor, Ńinând cont de faptul că interacŃiile dintre pigmenŃi şi faza staŃionar ă sunt maximizate datorit ă mărimii lor, similare. EficienŃa unei asemenea coloane este foarte ridicat ă, permiŃând diferenŃierea mai multor izomeri cis ai aceluiaşi carotenoid. Această metodă a fost aplicată, cu succes, pentru determinarea carotenoizilor saponifica Ńi din sucul de portocale. Cu toate acestea, când se analizează un amestec foarte complex, co-eluŃiile devin limitate foarte repede. O faz ă staŃionară mai puŃin selectivă, cum este C18-RP, este utilizată, de preferat, pentru analize mai puŃin detaliate. Faza mobilă este alcătuită de obicei din solvenŃi organici, cu excepŃia cazului în care trebuie separate molecule foarte polare de carotenoizi, cum sunt glicozil esterii. În acest caz este recomandat un amestec dintre un solvent organic polar cu o cantitate mic ă de apă. În vederea îmbunătăŃirii separării pigmenŃilor, câteodată este utilă încălzirea coloanei. Această procedur ă nu este, însă, recomandată, deoarece poate declanşa izomerizarea carotenoizilor, modificare care nu este detectat ă foarte exact de metodele HPLC. AtenŃie deosebit ă trebuie acordată pentru asigurarea condiŃiilor cromatografice potrivite, pentru ca pigmenŃii să nu treacă prin coloană neseparaŃi. Suplimentarea HPLC cu un detector cu diode înseriate, împreun ă cu nişte computere puternice, contribuie enorm la îmbunătăŃirea puterii analitice a HPLC. Utilizând asemenea detectori este posibilă urmărirea simultană a eluŃiei pe întreaga zonă UV-Vis (190-800 nm), ceea ce garantează că fiecare pigment poate fi urmărit la absorbŃia sa maximă (cu maximă sensibilitate). HPLC supercritic şi subcritic ExtracŃia supercritică a fluidelor a fost sugerată ca metodă alternativă pentru izolarea selectivă a carotenoizilor într-o singur ă etapă, situaŃie în care degradarea pigmenŃilor este evitată. Favati, King, Friedrich şi Eskins (1988) au fost cei care au izolat, pentru prima dat ă, β-carotenul şi luteina din concentrate de frunze, la 40°C şi un interval de presiune între 29 şi 70 MPa. Din

punct de vedere analitic, extrac Ńia supercritică a fluidelor este compatibilă cu cromatografia supercritică a fluidelor, din moment ce, cele dou ă tehnici pot împ ărŃi aceeaşi fază mobilă şi aceleaşi aparate, favorizând, astfel, dezvoltarea metodologiilor de extrac Ńie şi separare. Deoarece puterea de eluŃie a CO2 este relativ scăzută, în ceea ce priveşte carotenoizii, este necesară adăugarea unor co-solvenŃi care să mărească solubilitatea carotenoizilor în CO 2. Teoria parametrilor de solubilitate prevede c ă solubilitatea maximă a unui compus este atinsă când parametrul de solubilitate al solventului este egal cu cel al solutului. De exemplu, β-carotenul Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

93



poate fi extras la 43°C şi la aproximativ 70 MPa. Cu toate acestea, unele tipuri de echipamente nu permit eluŃia la o asemenea presiune. Trebuie g ăsite noi condiŃii de temperatur ă şi presiune, folosind o diagramă care să reprezinte variaŃiile de presiune vs. densitate pentru diferite temperaturi. Prin intermediul unei temperaturi mai sc ăzute, densităŃile similare celor atinse la temperaturi înalte pot fi ob Ńinute pentru presiuni mai scăzute, acestea fiind, de fapt, densit ăŃile corespunzătoare condiŃiilor subcritice. Utilizând aceast ă tehnică, Ibanez, Lopez-Sebastian, Tabera şi Reglero (1998) au separat cu succes β-carotenul din licopen în mai pu Ńin de 10 minute. Cea mai

bună separare a fost obŃinută la 10°C, sub o presiune de aproximativ 35 MPa, cu o coloan ă capilară ce conŃinea grupe de siloxan dezactivat cu reactiv ciclo-octametil-tetrasiloxan. Structura este „spartă” la o temperatură înaltă, formându-se legături O-Si-CH3 cu fază de silicaŃi. Nici una din metodele descrise mai sus nu este în întregime potrivit ă pentru o separare completă a unui amestec complex de pigmen Ńi. Amprenta tetrapirolului, de exemplu, este adeseori suficientă pentru identificarea cromoforului s ău, dar nu conŃine informaŃii destule pentru identificarea structurii complete a pigmentului. Aceast ă observa Ńie poate fi parŃial dedusă din comportamentul cromatografic şi din compararea datelor de retenŃie obŃinute cu cele din literatură. Alte metode, cum ar fi spectrometria de mas ă (Mass Spectrometry - MS), se aplică pentru caracterizarea completă a structurii moleculei. Progresele recente f ăcute în domeniul MS permit analiza unor cantităŃi de genul sub-nanogramelor şi au f ăcut această tehnică atractivă pentru cercetarea din domeniul alimentar [6].

4.3 Identificare carotenoizilor Comportamentul cromatografic şi spectrul de absorb Ńie în UV-Vis furnizează primele indicii pentru identificarea carotenoizilor. Atât lungimile de undă ale absorbŃiei maxime (λ max) cât şi forma spectrului (structura spectrală fină) sunt caracteristici ale cromoforului. In tabelul 4.1

sunt menŃionate valorile λ max ale carotenoizilor, care au fost determinate frecvent în alimente. Tabel 4.1

AbsorbŃia UV-Vis pentru carotenoizii găsiŃi frecvent în alimente Carotenoidul α - caroten

β - caroten

α-

riptoxantină /zeinoxantină

Solventul

acetonă, cloroform, etanol, hexan, eter de petrol acetonă, cloroform, etanol, hexan, eter de petrol cloroform, etanol, hexan

λ max (nm) 424 448 433 457 423 444 422 445 (429) 452 (435) 461 (425) 450 (425) 445 435 459 423 446 421 445

476 484 473 473 478 485 478 477 487 473 475


94

Contract de finanŃare nr. 52-117/2008 TRASAREG β - criptoxantină

luteină licopen

zeaxantină


cloroform, etanol, eter de petrol cloroform, etanol, eter de petrol acetonă, cloroform, etanol, eter de petrol acetonă, cloroform, etanol, eter de petrol

(435) (428) (425) 435 422 421 448 458 446 444 (430) (433) (428) (424)

459 450 449 458 445 445 474 484 472 470 452 462 450 449

485 478 476 485 474 474 505 518 503 502 479 493 478 476

Cei mai mulŃi carotenoizi absorb maxim 3 lungimi de und ă, rezultând, astfel, un spectru în 3 picuri. Pe măsură ce numărul legăturilor duble conjugate creşte, λ max se schimbă /modifică la lungimi de undă mai mari. Cei mai mulŃi carotenoizi sunt nesatura Ńi, aciclici, precum licopenul, care are 11 legături duble conjugate, este de culoare ro şie şi absoarbe la lungimi de und ă foarte mari (λ max = 444, 470 sau 502 nm), a şa cum este reprezentat în figura 4.2.

Figura 4.2 Spectrul de absorbŃie în vizibil al licopenului (___ ), β-carotenului (-.-.-), γ-carotenului (----) şi αcarotenului în eter de petrol ζ-carotenul (galben deschis) care este, de asemenea, aciclic, prezint ă 3 picuri bine

definite, dar la lungimi de und ă mult mai mici (λ max = 378, 400 sau 425 nm), propor Ńional cu cele 7 legături duble conjugate. Cei doi carotenoizi mai pu Ńin coloraŃi, care îi preced ζ-carotenului în etapa de desaturare a căii biosintetice, phytoenul (cu 3 leg ături duble conjugate) şi phytofluenul (cu 5 legături duble conjugate) prezint ă o absorbŃie maximă în regiunea UV (la 276, 286, 297 şi, respectiv, la 331, 348 şi 367), cum este reprezentat în figura 4.3. [5]


95



Figura 4.3 Spectrul de absorbŃie în vizibil al ζ-carotenului (__), phytoenului (….) şi phytofluenului(--). Faza mobilă: acetonitril/acetat de etil/metanol (85:10:5)

4.3.1 Criteriile pentru identificarea carotenoizilor Schiedt şi co. au definit criteriile minime necesare pentru identificarea carotenoizilor: a) spectrul de absorbŃie în regiunea UV, obŃinut în cel puŃin 2 solvenŃi diferiŃi, trebuie să fie compatibil cu cromoforul sugerat; b) propriet ăŃile cromatografice obŃinute trebuie s ă fie identice, atât prin metoda TLC cât şi prin HPLC; co-eluŃiile trebuie f ăcute cu probe autentice; c) trebuie obŃinut un spectru de mas ă care să permită cel puŃin confirmarea masei moleculare. Spectrul de absorbŃie reflectă organizarea sistemului de leg ături duble conjugate şi constituie „amprenta” pigmenŃilor. Spectroscopia de absorb Ńie pare a fi cea mai simplă metodă de identificare a componenŃilor majori prezenŃi într-un amestec. Odat ă identifica Ńi, pentru a estima concentraŃia acestora este posibilă utilizarea unui set de ecua Ńii. În figura 4.4, reprezentată în continuare, se poate observa acest lucru în spectrul de absorb Ńie al uleiului de măsline.

Figura 4.4 Spectrul de absorbŃie al uleiului de măsline, la temperatura camerei


96



Compararea acestui spectru cu cel al unor pigmen Ńi puri, permite identificarea familiilor de pigmenŃi care compun, în cazul de faŃă, uleiul (carotenoizi şi pheophytină). Deoarece mediul înconjurător în care se găseşte pigmentul (solvent, temperatur ă etc.) influenŃează puternic poziŃia şi forma spectrului, un spectru de absorb Ńie brut este total inutil pentru m ăsurarea directă a

concentraŃiei pigmentului. M ăsurătorile necesită extracŃia pigmentului cu un solvent potrivit, pentru care a fost stabilit, în prealabil, setul de ecua Ńii sau pentru care au fost determina Ńi, cel puŃin, coeficienŃii de absorbŃie. Cu aceste date, este întotdeauna posibilă stabilirea unui nou set de ecuaŃii, adaptat la o situa Ńie particular ă. Precizia metodei depinde de tipul de aparat utilizat, de capacitatea acestuia de a determina cu precizie absorbanŃa maximă şi, bineînŃeles, de acurateŃea coeficientului de absorb Ńie utilizat pentru calcule. Este recomandat ă, oricum, verificarea cu regularitate a literaturii de specialitate pentru valori şi seturi de ecua Ńii noi. Suprapunerea parŃială a benzilor de absorb Ńie a pigmenŃilor prezenŃi în amestec complică estimarea concentraŃiei unui pigment individual, aceasta fiind şi mai puŃin eficientă dacă numărul de pigmenŃi este mai mare ca 3. Se mai poate adăuga că, izomerii cis-carotenoidici, pot fi recunoscu Ńi deoarece spectrul lor de absorbŃie prezintă o bandă adiŃională în regiunea UV. PoziŃia legăturii duble din forma cis, este redată prin raportul Acis /AMAX. În concluzie, metodele spectroscopice permit identificarea brut ă a pigmenŃilor prezenŃi într-un extract dar compoziŃia specifică rămâne neclară. Pentru identificarea mai exactă a pigmenŃilor dintr-un amestec trebuie utilizate metodele cromatografice. Identificarea şi cuantificarea definitivă a pigmenŃilor necesită de obicei realizarea unor standarde, care sunt decisive în analiza pigmenŃilor din produsele alimentare. [6] 4.3.2 Metode de determinare a carotenoizilor

Unii cercetători au determinat varia Ńia carotenoizilor, a micronutrienŃilor graşi solubili şi culoarea lor în plasmă şi în laptele de vacă. Au urmărit şi schimbările care apar în funcŃie de furajele cu care au fost hrănite vacile şi nivelul de alimentare. Studiul experimental 1

Referitor la un astfel de studiu, în timpul perioadei pre-experimentale, 32 de vaci aflate la lactaŃie medie au fost hr ănite cu furaje şi apoi au fost împ ărŃite în 4 grupe; la 2 grupe s-a menŃinut dieta cu furaje iar 2 grupe au fost trecute pe o diet ă cu fân uscat. Din grupele hrănite cu furaje, un grup a fost hr ănit în funcŃie de energia net ă pentru lactaŃie şi necesarul de azot, iar Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

97



celălalt grup a fost supus unei subnutri Ńii energetice, cu furaje similare şi un aport de carotenoizi între cele două grupuri. S-a monitorizat, timp de 8 s ă ptămâni, variaŃia carotenoizilor şi indexul de culoare din plasmă şi din lapte. Carotenoizii şi retinolul din lapte au fost identifica Ńi prin metoda HPLC. Pentru aceasta a fost necesar ă o prelucrare iniŃială a probelor de lapte, a şa cum este prezentată în continuare. Realizarea probelor de lapte •

1 ml de lapte a fost amestecat cu 1 ml de etanol, care con Ńinea ca standard intern echinenonă, şi cu 1 ml de hexan.

•

Probele au fost centrifugate (1,200*g, 2 min) iar faza organic ă superioară a fost colectată. AcŃiunea a fost repetată de două ori.

•

Stratul etanolic a fost evaporat încet la sec, sub azot pur.

•

S-au combinat extractele organice, şi s-a adăugat încă 1 ml de etanol şi apă (90/10 %vol.).

•

Fiolele au fost agitate (5 min) şi centrifugate (1,200*g, 2 min).

•

Faza de hexan a fost evaporată la sec cu azot pur.

•

După ce s-au adăugat peste reziduu 2 ml KOH 10% amestecul a fost mixat 1 min. şi incubat la 37°C timp de 120 de minute.

•

Saponificarea a fost oprit ă prin adăugarea 1 ml de apă.

•

Carotenoizii şi retinolul au fost extra şi de două ori cu 1 ml hexan.

•

Faza organică a fost spălată de două ori cu 1 ml de ap ă, colectată şi, în final, a fost adăugată în fiola care conŃinea reziduul uscat de la faza fenolică iniŃială.

•

Amestecul a fost mixat, centrifugat şi evaporat la sec sub azot pur.

•

Reziduurile au fost dizolvate în 200 µl diclormetan şi acetonitril (50/50 %vol.) iar 80 µl au fost injecta Ńi pentru analiza HPLC.

Echipamente, materiale si metode •

Echipamentul HPLC care a fost utilizat în experiment era compus din: un sistem Waters echipat cu o pompă, un regulator, un autosampler care r ăceşte probele, şi o serie de fotodiode folosite ca detectori (care prezint ă o capacitate de înregistrare între 280 şi 600 nm).

•

A fost folosit softul Millenium 32 pe post de instrument de control, la înregistrarea şi procesarea datelor.

•

Carotenoizii şi vitamina A au fost detecta Ńi la 450 şi 325 nm şi fiecare în parte a fost identificat prin compara Ńie cu timpul lor de reten Ńie şi analizele spectrale ale standardelor pure (>95%).


98


•


ConcentraŃiile carotenoizilor şi ale vitaminei A, au fost calculate folosind curba unui standard extern şi apoi au fost ajustate prin transformarea în procent, ad ăugat la standardele interne.

Rezultate Carotenoizii din lapte au constat în to Ńi β-carotenii trans. S-au detectat urme de lutein ă, dar nu sau putut cuantifica. Concentra Ńia de β-caroten din lapte [0.133 vs. 0.062 µg/ml (3.64 vs 1.77 µg/g de gr ăsime)] la fel ş i cantitatea secretat ă în lapte (2.45 vs. 1.33mg/d), a fost mai mare la

vacile care au fost hr ănite cu furaje decât la cele hr ănite cu fân. În timpul hr ănirii animalelor cu furaje, a avut loc o creştere a concentraŃiei de carotenoide între 1 şi 50 de la 0.081 la 0.168 µg/ml (2.17 la 4.53 µg/g de gr ăsime), la fel şi cantitatea secretată în lapte de la 1.68 la 2.95 mg/d, cum este reprezentat în figura 4.5.

Figura 4.5 EvoluŃia concentraŃiei de β-caroten, şi indexul de culoare, în plasma şi în lapte, în hrănirea vacilor cu nutreŃuri diferite şi la nivele diferite de alimentare (sursa: [4]) Legenda:

■ iarbă intens conservată iarbă conservată puŃin ▲fân superior  fân inferior.

La animalele hrănite cu fân, concentra Ńia din lapte şi cantitatea secretată în lapte a variat puŃin, între zilele 1 şi 50. DiferenŃele concentraŃiilor de β-caroten din lapte, dintre dieta cu fân şi dieta cu furaje, au fost semnificative dup ă ziua 10. [4].


99



ConcentraŃiile de carotenoizi, vitamina A şi vitamina E din lapte

trans β-caroten, µg/ml trans β-caroten, µg/g de grăsime trans β-caroten secretat, mg/zi

indexul de culoare vitamina E, µg/ml vitamina E, µg/g de grăsime vitamina E secretată, mg/zi vitamina A, µg/ml vitamina A, µg/g de grăsime vitamina A secretat ă, mg/zi

Fân uscat Ridicat Scăzut 0.056 0.068 1.64 1.90 1.20 1.42 428 433 0.555 0.650 14.2 17.4 12.6 14.0 0.130 0.162 2.97 4.17 2.86 3.53

Tabel 4.2

Furaj verde Ridicat Scăzut 0.123 0.008 3.21 0.20 2.44 0.14 540 9 0.887 0.045 21.4 1.3 18.8 1.2 0.170 0.016 4.08 0.37 3.60 0.36

Studiul experimental 2

AlŃi cercetători au realizat dozarea spectofotometric ă a carotenoizilor şi a retinolului, bazându-se pe proprietatea carotenoizilor de a absorbi radia Ńia luminoasă în domeniul vizibil, cu un maxim de absorb Ńie situat în jurul valorii de 450 nm. Studiul a fost realizat pe lapte recoltat de la vaci de lapte apar Ńinând rasei Bruna austriaca, exploatate în regim ecologic. Laptele a fost prelevat de la o exploata Ńie ecologică din depresiunea Dornelor. Prepararea probelor a fost realizată astfel •

Un volum de 20 ml de lapte a fost tratat cu 5 ml solu Ńie de amoniac 25% şi 20 ml de etanol 96%.

•

Pentru extracŃia carotenoizilor şi a retinolului s-a adăugat un amestec de 40 ml eter etilic (ce conŃinea 0.0025% BHT) şi s-a agitat timp de 5 min.

•

Faza superioară eterică a fost reluată într-un balon şi evaporată la un rotavapor, la temperatura de 35°C.

•

Saponificarea probelor s-a realizat prin adăugarea la reziduul ob Ńinut a unui volum de 30 ml hidroxid de potasiu 5% în etanol 96%.

•

Probele au fost agitate folosind un agitator magnetic timp de 3 h la întuneric.

•

Probele au fost transferate într-o pâlnie de separare de 30 ml de ap ă şi 30 ml hexan.

•

Hexanul a fost îndep ărtat şi faza re-extrasă cu hexan.

•

Fazele hexanice au fost reunite, spălate în pâlnia de separare cu apă, apoi evaporate la sec.

•

Probele au fost păstrate la congelator până la analiza ulterioar ă.

•

Un volum măsurat de hexan s-a adăugat reziduului ob Ńinut după saponificare şi se citeşte absorbanŃa la 450 nm.


100


•


Înregistrarea spectrului de absorb Ńie şi citirea absorbanŃei s-a realizat cu un Spectrofotometru Jasco. S-a înregistrat spectrul de absorb Ńie şi s-a citit absorbanŃa la 450 nm. În figura 4.6 este exemplificat ă diagrama obŃinută.

Figura 4.6 Spectru de absorbŃie în cazul unei probe de lapte de vacă

Echipamente, materiale si metode SoluŃiile standard şi probele au fost injectate într-un sistem HPLC prev ăzut cu sistem de pompe Shimadzu LC-20 AT, detector Waters 990 cu softul de prelucrare a datelor, injector Rheodyne cu buclă de 20 µl şi coloană Sherisorb RP-18 cu lungime de 25 cm, diametrul interior 4,6 nm şi dimensiunea particulelor de 5 µm. Faza mobilă a constat în acetonitril: metanol 85:15, în sistem izocratic. Astfel s-a obŃinut separarea HPLC a carotenoizilor din laptele de vac ă (aşa cum este reprezentat în figura 4.7).


101



Figura 4.75 Separarea HPLC a carotenoizilor din lapte de vac ă Legenda:

luteină-zeaxantină (tr= 6.8-7.5 min) β-criptoxantină (tr= 13.7 min) licopina (tr= 17.4 min) β- carotenă (tr= 22.8 min)

Rezultate În urma injectării probelor de lapte de vacă s-au constatat unele diferenŃe în ceea ce priveşte cantitatea de carotenoizi în sezoanele de iarnă şi de vară supuse investiga Ńiei [10], aşa cum este prezentat în tabelul 4.3 Tabel 1.3

ConŃinutul în carotenoizi al laptelui de vac ă Produsul

Data recoltării Februarie

N 15

Carotenoide (mg/100ml) Media DeviaŃia standard 18.84 4.96

Lapte de vacă

Iunie

15

22.35

Studiul experimental 3 Altă determinare a carotenoizilor a fost f ăcută de Lucas şi

4.23

co.,

care au realizat un studiu

corelaŃional în vederea: •

caracterizării compoziŃiei brânzeturilor de vac ă, din punct de vedere al conŃinutului şi variabilităŃii acizilor gra şi, retinolului, α-tocoferolului, folatului,


102



β-carotenului, calciului, fosforului, magneziului, potasiului, zincului, clorurii de

sodiu şi a capacităŃii antioxidante totale; •

identificării caracteristicilor cirezii şi a practicilor de alimentare a vacilor, asociate diferenŃelor obŃinute în compoziŃia brânzeturilor.

În urma studiului efectuat, brânza obŃinută de la vacile alimentate cu fân proasp ăt (la păşunat) sau furaje conservate, s-a dovedit a fi mai bogat ă în C4:0, C18:0, cis-9 C18:1, trans-11 C18:1, cis-9 trans-11 C18:2 (CLA), β-caroten, xantofile, retinol, α-tocoferol şi TAC şi mai săracă în C10:0, C14:0 şi C16:0. În perioada de păşunat la şes, comparativ cu păşunatul montan, brânza obŃinută a fost mult mai săracă în C6:0 - C14:0, β-caroten şi retinol, şi mai bogată în cis-9 C18:1, C18:2 n-6 şi C18:3 n-3. În perioada alimentării interne (în interiorul grajdului), cu ra Ńii bazate pe porumb, grăsimea brânzei prezenta o cantitate mai s ăracă de trans-11 C18:1, CLA, β-caroten şi xantofile, în timp ce cantităŃile mai ridicate ale vitaminelor A şi E au fost asociate cu un conŃinut foarte ridicat de retinol şi α-tocoferol. Probele de brânză s-au recoltat direct de la produc ătorii individuali (fermieri). Pentru fiecare varietate de brânză, probele colectate au fost produse în 6 perioade ale anului: 2 în timpul alimentării interne când vacile au avut o diet ă bazată pe furaje conservate şi 4 în timpul perioadei de păşunat. In total s-au colectat 306 brânzeturi. Probele de brânză colectate au fost îngheŃate imediat după colectare. ConŃinutul de retinol (vitamina A), α-tocoferol (vitamina E), β-caroten şi xantofile (luteină şi zeaxantină) au fost măsurate simultan prin HPLC, cu un detector fotodiodic UV-Vis, imediat dup ă saponificarea şi extracŃia fiecărei probe cu hexan.

Studiul experimental 4 În alt studiu, Lucas şi co. au analizat 5 varietăŃi de brânzeturi franŃuzeşti: Abondance, Tomme de Savoie, Cantalet, Salers şi Rocamadour, care se obŃin prin 4 tehnologii de procesare. În vederea analizării substanŃei uscate, acizilor graşi, vitaminelor, carotenoizilor, mineralelor şi capacităŃii antioxidante totale, probele de lapte recoltate în tuburi de plastic învelite în folie de aluminiu pentru a fi protejate de lumin ă, au fost depozitate la o temperatură de -20°C. Liofilizarea probelor de lapte şi de brânză . Probele de lapte şi de brânză au fost liofilizate

cu ajutorul unui liofilizator TS-12, pentru a favoriza stabilitatea pe termen lung a micronutrienŃilor. Câte 3 ml (părŃi alicote) din fiecare prob ă de lapte au fost liofilizate, timp de 48 h, direct în tuburile de plastic şi apoi depozitate la -20°C. Apoximativ 200 g din fiecare prob ă de brânză, ăn stare îngheŃată (corespunz ător la 2-3 felii de brânz ă Abondance, Tomme de Savoie, Cantalet şi Salers, şi 5 felii din varietatea Rocamadour), au fost t ăiate în bucăŃi foarte mici şi Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

103



liofilizate timp de 72 h. Probele au fost apoi mixate şi depozitate în tuburi de plastic învelite în aluminiu la -20°C. Determinarea compozi Ń iei iei probelor de lapte şi brânză .

Profilul acizilor gra şi din probele

de lapte şi brânză liofilizate, a fost determinat prin gaz-cromatografie, imediat dup ă transesterificarea acestora în metil ester, cu ajutorul a jutorul metoxidului metoxidului de sodiu. Carotenoizii (β-caroten, luteină, zeaxantină), vitamina A (toŃi retinolii trans) şi vitamina E (α-tocoferol) au fost analizaŃi prin HPLC. Carotenoizii şi vitaminele liposolubile au fost extrase din probe, imediat dup ă adăugarea standardului intern de echinenon ă, cu 2x2 volume de hexan. Xantofilele au fost separate din faza hexanică prin adăugarea a 2x2 volume de solu Ńie de etanol în ap ă (90/10 % vol). Dup ă evaporarea hexanului, reziduul a fost saponificat timp de 2 h la 37°C, cu o solu Ńie de KOH (10% în etanol) şi pirogalol. FracŃia nesaponificabilă a fost apoi extrasă cu hexan, adăugat reziduului cu xantofile, rămas după evaporarea evaporarea etanolului. etanolului. După evaporare, reziduul uscat a fost în final redizolvat într-un amestec de acetonitril şi dicloretan (50/50 % vol.) şi supus analizei HPLC.[2] Rezultatele obŃinute sunt prezentate în tabelele 4.4, 4.5 si 4.6. Caracteristicile nutriŃ nutri Ńionale ale probelor de lapte

β-caroten (µg/L) xantofile (µg/L) vitamina A (µg/L) vitamina E (µg/L)

Min. 34.0 5.16 128 169

Lapte de vacă vacă Mean ± SD 118 ± 77 14.2 1 4.2 ± 8.2 323 ± 138 642 ± 396

Tabel 4.4

Max. 290 41.0 764 1437

Tabel 4.5 Efectele procesului tehnologic asupra caracteristicilor nutri Ńionale

β-caroten (mg/kg grăsime) xantofile (mg/kg grăsime) vitamina A (mg/kg grăsime) vitamina E (mg/kg grăsime)

Procesul tehnologic de obŃ ob Ńinere a tipului de brânză brânz ă Abondance Tomme de Cantalet/ Rocamadour Savoie Salers 1.97 1.98 2.17 nestimabilă 0.16 0.26 0.23 0.19 5.09 5.29 4.96 5.82 5.67 5.67 5.07 5.71 (Sursa: [2])


104


Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII Tabel 4.6

ConŃ ConŃinutul de vitamine şi carotenoizi al brânzeturilor analizate (rezultatele sunt exprimate per kg de materie proaspă proasp ătă) Categoria 1

Media ± SD1,2

% RDA1,3

A

T

C

A

T

C

A

T

C

β-caroten

0.23 -

0.22 -

0.32 -

0.97 ±

1.10 ±

1.41 ±

-

-

-

(µg/kg)

2.14

2.55

3.01

0.5

0.6

0.6

xantofile (µg/kg)

22.8 208

28.0 189

23.8 196

72.1 ± 34

91.6 ± 39

93.2 ± 36

-

-

-

retinol

0.88 -

0.78 -

1.04 -

1.70 ±

1.60 ±

1.63 ±

-

-

-

(µg/kg)

4.92

4.64

2.30

0.6

0.5

0.3

vitamina A

0.94 -

0.84 -

1.10 -

1.86 ±

1.79 ±

1.86 ±

9.3

8.9

9.3

totală

4.95

4.70

2.64

0.6

0.6

0.3

0.25 4.10

0.31 4.83

1.73 ± 0.9

1.87 ± 0.9

2.06 ± 0.9

0.6

0.6

0.7

(µg/kg)

0.47 3.62

folat

62.8 -

137 - 380

75.2 -

176 ±

269 ± 83

178 ±

2.1

3.3

2.2

(µg/kg)

388

291

85

(*103RE/kg) α-tocoferol

60

(Sursa: [1]) Legenda:

A - Abondance cheese T - Tomme de Savoie cheese C - Cantal-type cheese SD - Standard Deviation RDA - Recommended Dietary Allowances.


105



CONCLUZII 1) Această etapă de raportare a avut ca obiectiv realizarea unei analize critice, documentară, a referintelor bibliografice, cu privire la metodica utilizat ă pentru selectarea şi determinarea markerilor de tip carotenoizi şi importanŃa acestora pentru organism. 2) Studiul efectuat pentru aceast ă etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea referinŃelor bibliografice legate de modele experimentale utilizate în identificarea markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea specificitatea produselor produselor lactate, lactate, de la furaje la lapte şi produse lactate, ob Ńinute din lapte de vac ă. 3) Carotenoizii reprezint ă una din cele mai importante clase de pigmen Ńi vegetali naturali, galbeni, portocalii sau ro şii, răspândiŃi, în principal, în regnul vegetal (în morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya, mango) şi în regnul animal (în gălbenuşul de ou, creveŃi, somon). 4) Privarea organismului animal de hrana care con Ńine aceşti pigmenŃi poate duce la dispariŃia culorii caracteristice. FuncŃia fiziologică a carotenoizilor în plante nu este încă bine cunoscut ă dar în organismul animal aceşti pigmenŃi au rol esenŃial prin relaŃiile lor cu vitamina A şi cu substanŃele de pe retină, importante în procesul vederii. 5) Deoarece pot fixa oxigenul, formând compu şi oxigena Ńi puŃin stabili, pigmenŃii carotenoizi intervin în procesele de oxidoreducere. oxidoreducere. 6) Carotenoizii sunt implica Ńi în caracterizarea nutriŃională şi senzorială a produselor lactate şi pot fi considera Ńi potenŃiali biomarkeri pentru managementului managementului trasabili tra sabilitt ăŃii creşterii animalelor, de la care se colectează laptele materie primă. 7) Din studiul efectuat s-a constatat că s-au identificat aproape 10 carotenoizi (ex. xantofile, carotenoizi) în furaje, concentra Ńia lor variind foarte mult în funcŃie de stadiul de dezvoltare şi durata conservării acestora. 8) Diferitele studii realizate au relevat faptul c ă animalul şi factorii care Ńin de hrănirea/alimenta Ńia sa, afectează producŃia de lapte (ex. rasă), atât din punct de vedere cantitativ cât şi din punct de vedere calitativ, prin varia Ńia concentraŃiei în carotenoizi. 9) Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de carotenoizi, sugerând astfel c ă, culoarea poate fi o metod ă rapidă şi promiŃătoare de măsurare a trasabilităŃii condiŃiilor de hr ănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte permite un control eficient al concentra Ńiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate. 10) Carotenoizii din plante sunt transfera Ńi în produsele animale, uneori în concentra Ńie mai mare (exemplu în gălbenuşul de ou) sau în concentra Ńie mai scăzută, cum ar fi în produsele rumegătoarelor, unde modific ă culoarea laptelui, a produselor lactate şi a stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, de şi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune . O culoare galbenă a laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńă ri europene, are conota ii de hrană Ń Ń ii „natural ă”. Astfel, carotenoizii pot fi percepu Ń i ca indicatori ai p ăşunatului verde. 11) CompoziŃia carotenoizilor în fructe şi legume este mult mai complexă şi variabilă, cu variaŃii chiar şi la carotenoizii principali si pot fi identificate opt modele principale.

12) Multe alimente carotenogenice sunt sezoniere iar procesarea materiei prime este necesară pentru a minimiza pierderile. Modificarea, reducerea con Ńinutului sau pierderea carotenoizilor în timpul proces ării şi depozit ării alimentelor poate avea loc şi prin prin transportul transportul fizic, fizic, izomerizarea geometric geometrică sau prin oxidarea enzimatic ă sau ne-enzimatică. Deşi atenŃia este, adeseori, îndreptat ă spre procesarea industrial ă, prepararea în casă poate cauza pierderi mult mai importante de carotenoizi. La Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

106



prepararea alimentelor în casă, pierderea carotenoizilor are loc în felul următor: microunde
107



şi carotenoizi, este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compozi Ńia biologic ă, stadiul de maturitate, modul de conservare etc.), de specia animalului, de rasă, de modul de recoltare a laptelui şi, bineînŃeles, de stagiul de lacta Ńie în care se află animalul. 23) Carotenoizii din lapte influen Ńează proprietăŃile senzoriale ale produselor din lapte fie indirect, prin intermediul propriet ăŃilor antioxidante, fie direct, prin propriet ăŃile lor de îngălbenire.

24) Alegerea celei mai adecvate metode pentru analiza carotenoizilor este, de obicei, determinată de tipul de informa Ńii necesare a fi obtinu Ńe. În general, pigmentul carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte complexă. 25) Principiul metodelor de determinare se bazeaza pe s epararea cromatografica si pot fi: separarea cu coloană cromatografică în curent de ap ă – metoda clasica de separare a carotenoizilor, pentru analiza cantitativ ă; cromatografia în strat subŃire (TLC), deşi este eficientă în monitorizarea testelor chimice în vederea identificării rezultatelor, nu este adecvată pentru analizele cantitative, din cauza pericolului de degradare şi izomerizare la expunerea îndelungat ă pe masa de lucru; cromatografia cu gaze este, de asemenea, neadecvată, datorită instabilit ăŃii termice şi a volatilităŃii reduse pe care o prezintă marea majoritate a carotenoizilor; determinarea prin HPLC pe coloane C 18 poate fi modul preferat pentru separarea carotenoizilor pentru analizele cantitative. 26) Din cauza variaŃiilor cantitative şi calitative a carotenoizilor din compoziŃia alimentelor, este discutabil dac ă poate fi stabilit un singur sistem cromatografic care să poată fi aplicat mai multor tipuri de alimente. 27) Schiedt şi co. au definit criteriile minime necesare pentru identificarea carotenoizilor: spectrul de absorb Ńie în regiunea UV, obŃinut în cel pu Ńin 2 solvenŃi diferiŃi, o trebuie să fie compatibil cu cromoforul sugerat; propriet ăŃile cromatografice obŃinute trebuie să fie identice, atât prin metoda TLC o cât şi prin HPLC; co-eluŃiile trebuie f ăcute cu probe autentice; trebuie obŃinut un spectru de mas ă care să permită cel puŃin confirmarea masei o moleculare. În concluzie, metodele spectroscopice permit identificarea brut ă a pigmenŃilor prezenŃi într-un extract dar compoziŃia specifică rămâne neclară. Pentru identificarea mai exact ă a pigmenŃilor dintr-un amestec trebuie utilizate metodele cromatografice. Identificarea şi cuantificarea definitivă a pigmenŃilor necesită, de obicei, realizarea unor standarde, care sunt decisive în analiza pigmenŃilor din produsele alimentare. BIBLIOGRAFIE

[1] Lucas, A. si colab., 2006a. Relationship between thw conditions of cow’s milk production and the contents of components of nutritional interest in raw milk farmhouse cheese, INRA, 86, p. 177 – 202 [2] Lucas, A. si colab., 2006b. Respective effects of milk composition and the cheese-making process on cheese compositional variability in components of nutritional interest, INRA, 86, p. 21-41 [3] Noziere, P. si colab., 2006a. Carotenoids for ruminants: From forages to dairy products, Animal Feed Sc. and Tech., vol 131 (3-4), p. 418-450 [4] Noziere, P. si colab., 2006b. Variation in fat-soluble micronutrients in milk, Journal of Dairy Science, vol. 89, 7, p.2634-2648 [5] Rodriguez-Amaya, B., Delia, Kimura, Mieko, 2004. HarvestPlus Handbook for Carotenoid Analysis, HarvestPlus Technical Monograph 2, IFPRI si CIAT, SUA Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

108


[6] [7] [8] [9] [10]


Schoefs, B., 2002. Chlorophyll and carotenoid analysis in food products. Properties of the pigments and methods of analysis, Trends in F. Sc. & Tech., 13 , p. 361-371 Stan R., 2007. Aditivi alimentari - Produsi naturali si de sinteza, Ed. Printech, Bucuresti *** ebooks.unibuc.ro/biologie/ProgreseVolumul2/Articolul9a.doc *** http://cabcab.home.ro/carte.html 6.10.08 9:45 *** http://www.usamvcluj.ro/html/doctorat/data/Pentelescu_Ovidiu_ro.pdf (accesat 1.02.2009)

E. Activitate II.1.5. – IBNA Estimarea valorii nutritive a nutre Ńurilor şi elaborarea ra Ńiilor pentru vacile de lapte. 1. Rezumatul etapei Vaca de lapte este o „masinarie animala” din ce in ce mai performanta a carei eficacitate si productivitate este dependenta de fondul genetic pe care-l are de modul de alimentatie si de management. Genetica a facut, in ultimul timp, progrese rapide chiar spectaculoase, obitnanduse animale de mare potential. Crescatorii de vaci trebuie sa beneficieze de animale cat mai bune, dar sa nu creada ca pot obtine performante numai cu vaci de valoare, subestimand conditiile de mediu. Alimentatia incearca sa raspunda, dar din ce in ce mai dificil, dificultatilor legate de cresterea performantelor genetice ale vacilor de lapte. Vacile de mare potential au exigente nutritionale foarte ridicate si sunt din ce in ce mai putin tolerante la orice eroare de alimentatie. Cunoasterea caracteristicilor nutreturilor utilizate in hrana acestora are o insemnatate speciala. Se considera astfel ca aprecierea valorii energetice şi proteice a nutreŃurilor la rumegătoare are un caracter dinamic, care Ńine atât de procesul continuu de ameliorare a capacităŃii acestora de a ingera şi valorifica nutreŃurile, cât şi de factorii exogeni, ce au în vedere natura furajelor, tehnologia de preparare şi conservare a lor, în general tehnologiile de exploatare. Valoarea nutritivă a nutreŃurilor reprezintă capacitatea acestora de a satisface cerinŃele de substanŃe nutritive ale animalelor, fie pentru întreŃinere, fie pentru sinteza diferitelor produse zootehnice, care se măsoară prin experienŃe de bilanŃ energetic şi al azotului. NutreŃurile diferă între ele prin compoziŃia lor chimică şi conŃinutul în calorii şi sunt utilizate de către animale în funcŃie de specie, iar în cadrul speciei de categoria de producŃie, starea fiziologică etc. Ca urmare a acestor diferenŃe, care Ńin atât de natura furajului, cât şi de natura animalelor care le utilizează, s-a ivit încă de la început dificultatea comparării valorii nutritive a nutreŃurilor atunci când s-a pus problema substituirii unui furaj cu altul în raŃiile de hrană. S-a constatat ca element comun de legătură conŃinutul nutreŃurilor în energie, care ca energie brută, raportat la kg substanŃă uscată este asemănător la cea mai mare parte din furajele utilizate în mod obişnuit şi s-a considerat că exprimarea valorii nutritive prin acest parametru rezolvă problema, cu atât mai mult cu cât gradul de conversie a furajului Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

109



în produse animaliere se poate face cu mai mare uşurinŃă şi precizie tot prin etalonul energetic. Compararea energetică a nutreŃurilor s-a f ăcut, la început, ca energie digestibilă, corespunzătoare măsurării digestibilităŃii furajelor; apoi, ca energie metabolizabilă, când a fost posibilă şi măsurarea energiei urinei şi a gazelor de fermentaŃie (metanul) şi în sfârşit, ca energie netă, fie pentru întreŃinerea vieŃii, fie pentru sinteza diferitelor produse animaliere, când a fost posibilă şi măsurarea energiei calorice corespunzătoare metabolismului energetic de întreŃinere şi a extracaloriilor proceselor de asimilaŃie şi dezasimilaŃie din organismele animale. În prezent, în sistemele moderne de apreciere a valorii nutritive a nutreŃurilor, acestea se compară sub aspectul efectului lor productiv, iar unitatea de măsură, diferită de la sistem la sistem, are comună energia netă, fie pentru îngrăşare, fie pentru producŃia de lapte, fie pentru întreŃinere + îngrăşare sau pentru toate acestea la un loc, pentru moment fiind soluŃia cea mai bună. Ultimele cercetări de fiziologie a nutriŃiei, relevă rolul important pe care îl are echilibrarea raŃiilor de hrană în energie şi în substanŃe azotate. Astfel, la rumegătoare, la care după cum se cunoaşte, 60-70% din necesarul proteic este asigurat de masa microbiană, care se dezvolt ă în rumen, acesta se apreciază nu numai în funcŃie de cantitatea de proteină brută a nutreŃului ingerat, ci şi de cantitatea de substanŃă organică fermentescibilă (SOF), utilizată de către microorganisme pentru dezvoltarea lor, în aşa fel încât, proteina real digestibilă la nivel intestinal este reprezentată de două valori şi anume: proteina digestibilă intestinală de origine alimentară (PDIA) şi proteina digestibilă intestinală de origine microbiană (PDIM), care la rândul ei este potenŃial permisă de conŃinutul de azot (PDIN), dar şi de cel în energie al raŃiei (PDIE). Aşadar, în acest mod, fiecare nutreŃ este caracterizat prin două valori potenŃiale ca proteină digestibilă, modalitate care asigură posibilitatea echilibrării raŃiei cu substanŃe azotate, în situaŃia în care la unul din furaje prevalează cantitativ substanŃele organice fermentescibile. Calculul raŃiilor furajere la vacile de lapte este o opera Ńiune complexă care necesită mai multe etape dată fiind variabilitatea mare a producŃiilor fiecarui animal în parte. De aceea, numai prin alcătuirea grupelor de producŃie în cadrul unei cirezi sau, mai bine, prin dozarea individuală a nutreŃurilor concentrate pentru fiecare animal, adăugate la raŃia de bază de nutreŃuri de volum, se poate asigura hrănirea acestora în condiŃii optime de exploatare. Mai întâi, trebuie să se parcurgă mai multe etape şi anume: - calculul normelor de hrană; - estimarea valorii nutritive a nutreŃurilor; - aprecierea raŃiei de bază – nutreŃuri de volum; - completarea raŃiei de bază cu nutreŃuri concentrate. Pentru formularea raŃiilor care să asigure nivelul producŃiilor planificate inclusiv a funcŃiei de reproducere şi a stării de sănătate sunt necesare următoarele elemente: InformaŃii despre animal: - greutatea vacii; - producŃia posibilă maximă zilnică; - conŃinutul în grăsime al laptelui; - saptamâna / luna de lactaŃie; - luna de gestaŃie (ultimele 3 luni). Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

110



InformaŃii despre nutreŃuri: - tipul şi stocurile de nutreŃuri din depozit sau din culturi (masa verde); - potenŃialul productiv energetic, proteic, vitaminic şi mineral al nutreŃurilor; La aprecierea normelor de hrana pentru vacile de lapte se iau în calcul : - normele de întreŃinere; - normele pentru gestaŃie; - normele pentru producŃia de lapte; - normele pentru sporul (creşterea, respectiv pierderea ) de greutate; - normele pentru activitate fizică suplimentară. 2. ImportanŃa structurii raŃiei asupra digestiei ruminale şi a producŃiei. Un rol important asupra mersului normal al digestiei ruminale îl are tipul alimentaŃiei. Atât structura raŃiei, echilibrarea ei cît şi modul de preparare şi programul de furajare pot influenŃa procesele ruminale şi prin aceasta funcŃia de reproducŃie şi producŃia animalelor. Un indiciu al mersului proceselor digestiei îl constituie pH-ul rumunal. Valorile normale ale lui, cuprinse între 6,3 şi 6,9 sunt realizate la o raŃie pe bază de fibroase strucrurate (fân, paie, porumb siloz recoltat în faza de lapte, lapte – ceară) în care celuloza să reprezinte minimum 14% din substanŃa uscată la vaci şi 12% la juninci şi tauri. La o raŃie pe bază de fibroase se realizează o secreŃie salivară abundentă care prin proprietatea tampon, menŃine pH-ul ruminal la valori ridicate. NutreŃurile concentrate, rădăcinoasele şi chiar nutreŃul murat, bogat în apă reduc secreŃia salivară, astfel că, în funcŃie de proporŃia acestora în raŃie, pH-ul ruminal scade până la valori de 5,5. Trecerea rapidă de la raŃii cu cantităŃi mari de concentrate sau rădăcinoase (mai ales sfecla de zahăr) pot reduce pH-ul la valori sub 4,6 ca o consecin Ńă a transformării rapide a glucidelor uşor digestibile în acid lactic, ce se resoarbe mai slab la nivelul rumenului. O scădere a pH-ului ruminal până la limitele valorilor critice atrage după sine apariŃia acidozei cu consecinŃe asupra consumului, reducerea procentului de grăsime din lapte, modificarea calităŃii laptelui, tulburări de reproducŃie. Pe de alt ă parte, raŃiile sărace în glucide şi bogate în proteine reduc concentraŃia AGV în paralel cu creşterea valorii amoniacului în rumen. Apare în acest caz alcaloza ruminală care este de asemenea dăunătoare. Cunoaşterea factorilor care intervin în digestia ruminală se impune atât în scopul menŃinerii sănătăŃii animalelor cât şi în cel al dirijării metabolismului corespunzător tipului de producŃie urmărit.

3. Necesarul vacilor de lapte Pentru menŃinerea vieŃii, pentru producerea laptelui, pentru dezvoltarea fetuşilor şi pentru depunerea rezervelor corporale vacile solicită un anumit necesar (apă, energie, proteină, minerale, vitamine). Acest necesar este acoperit prin aporturile nutreŃurilor. Teoretic, aporturile nutreŃurilor ar trebui să fie egal cu necesarul de hrana, de aceea necesrul se ajustează cu un coeficient de siguranŃă variabil in funcŃie de natura necesarului. 3.1. Necesarul de energie. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

111



CerinŃele de energie ale animalelor corespund energiei fixate în producŃii şi energiei pierdute prin căldură, în urma activităŃilor organismului. Se pot distinge trei tipuri de cerinŃe energetice: -cerinŃe energetice pentru întretinere, pentru menŃinerea vieŃii animalelor si bunei funcŃionări a organismului; -cerinŃe energetice pentru producŃie (în cazul vacilor producŃia de lapte, fetuşii şi rezervele corporale); - cerinŃe energetice consecutive utilizării nutreŃurilor, care se manifestă prin producŃia de căldură denumit şi extracăldură. Deoarece necesarul energetic al vacilor nu poate fi asigurat numai prin furaje de volum, folosesc în raŃii şi concentrate, uneori în cantităŃi mari ce antrenează unele interacŃiuni digestive. Aceasta înseamna că, prin folosirea concentratelor se induce modificarea parametrilor de funcŃionare ai rumenului (limitarea florei celulozolitice, scăderea ph-ului, care perturbă digestia furajelor de volum şi scade digestibilitatea raŃiei totale. Aportul energetic total al raŃiei este, în aceste condiŃii, inferior sumei aporturilor energetice ale furajelor de volum şi ale concentratelor, care compun raŃia. Pentru a Ńine seama de aceste fenomene se face o corecŃie a necesarului de energie pe baza unor tabele care indică coeficienŃi crescând de la 0,1 până la 2,2 pentru producŃii de lapte de la 15 la 40 l lapte pe cap şi pe zi.

3.2. Necesarul de proteină. NutriŃia proteică a rumegătoarelor se bazează pe două aspecte: - celulele, Ńesuturile au acelaşi necesar în aminoacizi ca la monogastrice; - aminoacizii absorbiŃi la nivelul intestinului subŃire au o dublă origine: proteină alimentară nedegradată în rumen şi proteină microbienă formată în rumen-reŃea. Dacă la monogastrice este posibilă exprimarea necesarului în proteină brută şi aminoacizi esenŃiali, la rumegătoare sistemul proteinei brute şi chiar al proteinei brute digestibile nu mai este suficient. Un sistem care să coresundă exigenŃelor trebuie să ia în consideraŃie tot ce se poate şti în legătură cu utilizarea digestivă şi metabolică a proteinelor. Un asemenea sistem este sistemul proteinei digestibile la nivel intestinal (PDI) care exprimă aporturile nutreŃurilor şi necesarul animalelor la nivelul absorbŃiei aminoacizilor în intestinal subŃire – proteină real digestibilă. 3.3. Exprimarea valorii proteice a nutreŃurilor în PDI. Valoarea proteică a nutreŃurilor în sistemul PDI este suma a două fracŃiuni: - proteină real digestibilă în intestinal subŃire de origine alimentară sau PDIA; - proteina real digestibilă în intestinul subŃire de origine microbiană sau PDIM. PDI = PDIA + PDIM łinând cont de cei doi factori limitanŃi ai proteosintezei, energia fermentescibilă şi proteina degradabilă, se pot distinge două valori PDIM: - cantitatea de proteină microbienă care poate fi obŃinută pornind de la azotul degradabil disponibil este valoarea PDIMN ( proteină digestibilă la nivel intestinal, de origine microbienă permisă de azotul din raŃie);


112



-

cantitatea de proteină microbienă care poate fi obŃinută pornind de la energia fermentescibilă disponibilă este valoarea PDIME (proteină digestibilă la nivel intestinal, de origine microbienă permisă de energia din raŃie). Deci, fiecare nutreŃ are două valori PDI: PDIN= PDIA+ PDIMN PDIE = PDIA +PDIME Cea mai mică dintre aceste valori este valoarea proteică efectivă a unui nutreŃ atunci când el este distribuit singur animalelor. Valoarea cea mai mare poate fi considerată valoare potenŃială, valoare maximală, care nu poate fi atins ă decât dacă nutreŃul respectiv este asociat cu alte nutreŃuri. Pentru alcatuirea raŃiilor de hrana la orice specie de animale este necesar mai întâi cunoaşterea potenŃialului productiv al nutreŃurilor, mai precis conŃinutul în elemente nutritive, în energie, vitamine şi elemente minerale ce de altfel presupune estimarea valorii nutritive a acestora. În cazul nostru, constituirea raŃiilor pentru vacile de lapte care vor reprezenta loturile experimentale în cadrul protocolului din acest proiect se va face pe baza următoarelor nutreŃuri : - fân de lucernă - siloz de porumb - masă verde (lucernă + golomăŃ) - nutreŃ combinat V1 - nutreŃ combinat V2

Structura amestecului de nutreŃ combinat V1 (în procente): - porumb - 32,5 - grâu - 25,5 - şrot fl soarelui - 30 - şrot soia -8 - carbonat Ca -2 - sare -1 - premix -1 Structura amestecului de nutreŃ combinat V2 - porumb - 39 - srot f. soarelui - 20 - şrot soia -8 - tărâŃe grâu - 30 - cretă f. - 1,4 - fosfat dialc. - 0,6 - premix -1 Tabel 1. CompoziŃia chimică a nutreŃurilor Specificare SU PB GB Cel B

Cen

SEN

SO

EB


113



Fân lucernă

1000 194 29 306 104 372 896 18,22 865 168 21 265 90 321 775 15,76 Siloz porumb 1000 78 19 234 71 598 929 18,52 326 25 6 76 23 196 303 6,03 NC vaci 1 1000 193 34 96 69 608 931 18,55 880 170 30 84 61 535 819 16,32 NC vaci 2 1000 189 36 98 55 622 945 18,77 884 167 32 87 48 550 836 16,59 NV (golom + 1000 165 38 294 106 397 894 18,28 lucernă) 210 35 8 62 22 83 188 16,59 Pentru stabilirea valorii nutritive a nutreŃurilor s-a utilizat modelul matematic de simulare a metabolismului energetic şi proteic la rumegătoare parcurgându-se următoarele etape:

3.4. Etapele de determinare a valorii nutritive energetice a silozului de porumb. Pe baza compziŃiei chimice Weende s-a pus în evidenŃă un conŃinut de 269 g SU/kg furaj şi o concentraŃie în cenuşă de 71 g, în PB de 78 g şi în Cel.B de 234 g. Se calculează mai întâi cantitatea de PB şi de CB la 1 kg substanŃă organică (SO) după ce se determină cantitatea de SO la un kg SU:

1. g SO/kg SU = 1000 g SU – g cenuşă adică, 1000 g SU – 71 g cenu şă = 929 g SO, apoi se raportează cantităŃile de PB şi CB la cantitatea de substanŃa organică folosind regula de trei simple, astfel: g PB/kg SU x g SU 78 x 1000 2. g PB/kg SO = --------------------------- = ---------------- = 83,96 g g SO 929 g CB/kg SU x g SU 234 x 1000 3. g CB/kg SO = --------------------------- = ---------------- = 251,88 g g SO 929

4. Energia brută s-a determinat prin intermediul calorimetrului adiabatic (bomba calorimetrică) metodologie descrisă de Burlacu şi col., 1991. EB /1000 g SU = 18,52

5. SODv = 664 +1,007 PB – 0,00085 CB = 664 + 1,007 x 83,96 – 0,00085 x 251,88 = 664 + 84,55 – 0,214098 = 748,34 SOD = 0,920 SODv + 60 – h = 0,920 x 748,34 + 60 – 20 = 688,47+ 60 – 20 = 728,47 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

114



6. Calculul digestibilităŃii energiei brute (EB) a nutreŃurilor (dEB): - pentru silozuri: 0,10263 x SOD – 5,723 0,10263 x 728,47 – 5,723 74,76 – 5,723 = 69,04 7. Calculul energiei digestibile (ED) a unui kg SU nutreŃ: ED = EB x dEB = 18,52 x 0,690 = 12,78 MJ/kg SU

8. Calculul energiei metabolizabile (EM): EM ------ = 0,8417 – 0,000099 CB – 0,000196 PB + 0,0211 NPA ED = 0,8417 – 0,000099 x 251,88 – 0,000196 x 83,96 + 0,0211 x 1,5 = 0,8417 – 0,02493612 – 0,01645616 + 0,03165 = 0,83 9. Calculul energiei metabolizabile (EM) a unui kg SU nutreŃ: EM EM = ED x ------ = 12,78 x 0,83 = 10,61 MJ/kg SU ED

10.

EM 10,61 q = ------- = ---------- = 0,57 EB 18,52 Kl = 0,24 x q + 0,463 = 0,24 x 0,57 + 0,463 = 0,600 ENL = EM x Kl = 10,61 x 0,600 = 6,37 MJ/kg SU ENL nutreŃ 6,37 Valoarea UNL = ---------------- = --------- = 1,05 ENL ovăz 6,07

0,3358 x q2 + 0,6508 x q + 0,005 0,3358 x (0,57)2 +0,6508 x 0,57+0,005 Kmp= ------------------------------------------ = ------------------------------------------------0,9235 x q + 0,283 0,9235 x 0,57 + 0,283 0,10910142 + 0,370956 + 0,005 0,48505742 = ------------------------------------------- = ---------------- = 0,600 0,526395 + 0,283 0,809395 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

115



ENC = EM x Kmp = 10,61 x 0,600 = 6,37 Mj/kg SU ENC nutreŃ 6,37 Valoarea UNC = ---------------- = --------- = 1,03 ENC ovăz 6,16

Modalitatea de calcul pentru determinarea valorii nutritive proteice a silozului de porumb.

Pentru calculul valorii proteice s-a considerat: Dg reprezintă degradabilitatea substanŃelor azotate în rumen şi pentru porumbul siloz = 0,82; dr reprezintă digestibilitatea reală a proteinelor care pentru porumbul siloz = 0,70; PF reprezintă produşii de fermentaŃie, care pentru porumbul siloz cu 33,02% SU = 80.

SOF (g/kg SU) = SOD - [PB x (1 –Dg) + GB + PF] = 728,47 - [78 x (1 – 0,82) + 19 + 80] = 728,47 – 78 x 0,18 – 19 - 80 = 728,47 – 14,04 – 19 – 80 = 615,43 g/kg SU PDIA (g/kg SU) = PB (g/kg SU) x (1 – Dg) x dr = 78 x (1 – 0,82) x 0,70 = 14,04 x 0,70 = 9,83 g/kg SU PDIMN (g/kg SU) = PB (g/kg SU) x [1 – (1 - Dg)] x 0,9 x 0,8 x 0,8 = 78x [1 – (1- 0,82)] x 0,9 x 0,8 x 0,8 = 78x 0,82 x 0,9 x 0,8 x 0,8 = 36,84 g/kg SU PDIME (g/kg SU) = SOF x 0,145 x 0,8 x 0,8 = = 615,43 x 0,145 x 0,8 x 0,8 = 57,11 g/kg SU PDIN (g/kg SU) = PDIA + PDIMN = 9,83+ 36,84 = 46,67 g/kg SU PDIE (g/kg SU) = PDIA + PDIME = 9,83+ 57,11 = 66,94 g/kg SU


116



Tabel 2. Valoarea nutritivă (g/kg nutreŃ /kg SU) Specificare SU UNL PDIN Fân lucernă 1000 0,79 103 865 0,68 89 Siloz porumb 1000 1,05 47 326 0,34 16 NC vaci 1 1000 1,1 147 880 0,97 129 NC vaci 2 1000 1,09 139 884 0,96 123 NV 1000 0,88 91 (golom.+lucernă) 210 0,19 19

PDIE 83 72 67 21 127 112 122 108 92 19

Ca 15 13 2,5 0,8 7,0 6,0 7,4 6,5 9,5 2,1

P 2 1,7 3,3 1,0 8,8 7,7 8,2 7,2 2,8 0,6

Cunoscându-se valoarea nutritivă a nutreŃurilor s-au putut alcătui raŃii pentru vaci de lapte în plină lactaŃie, pe perioada de iarnă şi pentru perioada de vară.

Tabel 3. Exemplu de raŃie de hrană pentru vaci de lapte cu o greutate corporală de 550 kg , cu o producŃie medie zilnică de lapte cuprinsa intre 25 si 30 l, cu un procent de grăsime de 4%, pe perioadă de iarnă (R1) NutreŃul St. Nat SU UNL PDIN PDIE Ca P (kg) (kg) (g) (g) (g) (g) Norma 17,2-21,5 19,41 1700 1700 102 65 Fân lucernă 3,46 3 2,37 309 249 45 6 Siloz porumb 29,14 9,5 9,97 447 636 24 31 RB 12,5 12,34 756 885 69 37 Deficit 7,07 944 815 33 28 NC 7,32 6,45 7,09 948 819 45 57 TOTAL asigurat 18,95 19,43 1704 1704 114 94 În cazul exemplului de raŃie de mai sus s-au folosit ca nutreŃuri de bază fânul de lucernă şi silozul de porumb, repezentând principalele categorii de nureŃuri de volum din Ńara noastră cu precădere din Câmpia Română. Pentru acoperirea deficitului apreciat după raŃia de bază s-a adăugat o cantitate de nutreŃ combinat până la atigerea normei de energie, dictată de cumulul de unităŃi nutritive lapte (UNL), a celei de proteină prin (PDIN )şi (PDIE) respectiv pentru săruri. S-au asigurat astfel unităŃile nutritive şi cele două secvenŃe de proteină tocmai aşa cum se cere pentru a nu se face nici un fel de risip ă din aceste componente. De regulă este foarte greu de echilibrat cele două componente proteice după cum vom vedea în celelalte exemple. Tabel 4. Exemplu de raŃie de hrană pentru vaci de lapte cu o greutate corporală de 600-650 kg, cu o producŃie medie zilnică de lapte de 35 l, cu un procent de grăsime de 4%, pe perioadă de vara (R2) NutreŃul St. Nat SU UNL PDIN PDIE Ca P (kg) (kg) (g) (g) (g) (g) Norma 20-22 21 2175 2175 135 90 Fân lucernă 4,62 4,0 3,16 412 332 60 8 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

117


Masa verde (luc.-golomat) RB Deficit Porumb Srot soia Asigurat Fosfat dicalc.

43 4,06 3,57 0,130

9,03 13,03 3,5 3,21 19,74 0,130


7,95 11,1 9,9 5,07 4,46 20,63 -

822 1234 941 301 1053 2588 -

859 1191 984 406 578 2175 -

86 146 1,05 11,9 135+ -

25 33 57 10,15 24,32 67,47 22,53

În cazul acestei raŃii ( R2) deşi se asigură aproape perfect necesarul energetic (UNL) în corelaŃie strânsă cu proteina dictată de efectul substanŃelor fermentescibile din întreaga raŃie (PDIE), proteina digestibilă intestinală permisă de conŃinutul în azot (PDIN) depăşeşte valoarea dictată de normă, lucru care nu poate fi uşor evitat, cele câteva sute de grame de proteină consumându-se cu o eficienŃă scăzută. Deşi, asistăm la acumularea unui surplus al unei componente proteice, aceptăm această situaŃie tocmai pentru a nu înregistra minusuri la altele. Deci, se consider ă suficiente elementele constitutive ale unei raŃii atunci când fiecare dintre ele atinge cantitatea impusă de normă. Pentru această raŃie care propune şi o cantitate de lapte de cel puŃin 35 l zilnic pe lângă raŃia de bază care a solicitat şi un fân de leguminoase se cere adăugat şrot de soia (liznă şi metionină) într-o proporŃie aproape egală cu porumbul, care până la urmă să asigure proteina digestibilă intestinală tot printr-un surplus de PDIN.

Tabel 5. Specificare SU Porumb 1000 860 Srot soia 1000 900

UNL 1,45

PDIN 86

PDIE 116

Ca 0,3

P 2,9

1,37

328

180

3,7

7,6

Se observă astfel necesitatea asigurării unor nutreŃuri cu o concentraŃie sporită atât în energie cât şi în proteină mai ales când se au în vedere vaci cu productivităŃi deosebite.

Tabel 6. Exemplu de raŃie de hrană pentru vaci de lapte cu o greutate corporală de 550 kg, cu o producŃie medie zilnică de lapte de 15 l, cu un procent de grăsime de 4%, pe perioadă de iarnă (R3) NutreŃul St. Nat SU UNL PDIN PDIE Ca P (kg) (kg) (g) (g) (g) (g) Norma 13 12,3 1029 1029 70 50 Fân lucernă 3,42 3,0 2,37 309 249 45 6 Siloz porumb 21,93 6,58 6,9 309 440 16 22 RB 9,58 9,27 618 689 61 28 Deficit 3,03 411 340 9 22 N.C. V1 3,17 2,79 3,07 411 354 19 24 Asigurat 12,37 12,34 1029 1043 80 52 Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

118



În cazul vacilor cu producŃii modeste de lapte, partea energetică, proteina cât şi mineralele se pot asigura din mai puŃine ingrediente f ără să fie necesare cantităŃi importante de nutreŃuri concentrate. Din studii pe vaci hr ănite cu raŃii cu diferite rapoarte între nutreŃurile de volum şi cele concentrate s-a observat că dacă animalele primesc în hrană nutreŃuri de volum cum ar fi lucernă sau pormb plantă sub diferite forme de conservare, însă de foarte bună calitate, pentru o vacă cu o producŃie zilnică de numai 15 l lapte nu este necesară adăugarea de nutreŃuri concentrate.

4. Concluzii Pentru satisfacerea cerinŃelor nutriŃionale ale vacilor de lapte se impun următoarele: - cunoaşterea normelor de hrană: - norma de substanŃă uscată (kg); - norma de energie netă lapte (UNL); - norma de proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g); - normele de macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g); - normele de microelemente şi vitamine (mg; UI); - capacitatea de ingerare a hranei (USV); - raportul dintre PDIE/UNL. - cunoaşterea valorii nutritive a nutreŃurilor: - conŃinutul în substanŃă uscată (g/kg SN); - conŃinutul în energie netă lapte (UNL/kg SU); - conŃinutul în proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g/kg SU); - conŃinutul în macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g/kg SU); - conŃinutul în microelemente şi vitamine (mg/kg SU sau UI/kg SU); - ingestibilitatea nutreŃului (USV/kg SU). - date despre animal: - greutatea potenŃială a vacii, G (kg); - producŃia potenŃială maximă zilnică de lapte PlM (kg/zi); - conŃinutul în grăsime al laptelui GrL (%); - săptămâna de lactaŃie “n”; - luna de gestaŃie ( se iau în consideraŃie numai lunile 8 şi 9). Bibliografie

1. Alderman G. (1993) – Energy and protein requirements of ruminants, CAB International Wallingsford, UK. 2. Burlacu Gheorghe (1991) – Metode şi tehnici pentru masurarea valorii nutritive a nutre Ń urilor. Editura CERES, Bucureşti. 3. Burlacu Gh., Cavache A. şi Burlacu R. (2002) – Poten Ń ialul productiv al nutre Ń urilor şi utilizarea lor. Editura Ceres, Bucureşti. 4. Crista Nicolae (1985) – Digestia, metabolismul şi producŃiile la rumegătoare. Editura CERES, Bucureşti 5. R. Jarrige (1993) – Alimenta Ńia bovinelor, ovinelor şi caprinelor. Ed. INRA, Paris. 6. Nicolae Mircea, Petroman Ioan (1999) – Nutritia vacilor de lapte , Editura Mirton, Timisoara. 7. Stoica Ioan şi Liliana Stoica (2001) – Bazele nutri Ń iei şi alimenta Ń iei animalelor , Editura Coral Sanivet, Bucureşti. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

119



CONCLUZII A: 1. Majoritatea procedurilor de preparare a probelor pentru determinarea compuşilor din

plante sunt dezvoltate în aşa fel încât extractul final introdus în coloanle GC şi HPLC sau capilarele CE să conŃină numai analitul cu toate interferenŃele eliminate.

2. O comparaŃie a tehnicilor de extracŃie descrise anterior pentru izolarea componenŃilor din materialul plantelor este prezentata în tabelul 8.

Tabelul 8 – ComparaŃie între diferite tehnici de extracŃie lichid – lichid utilizate în analiza metaboliŃilor plantelor. ExtracŃie Soxhlet USE ASE MAE SFE Cost scăzut scăzut ridicat mediu ridicat Timp de 6 – 48 h < 30 min < 30 min < 30 min < 60 min extracŃie Solvent 200 – 600 < 50 < 100 < 40 <10 utilizat (mL) USE – ultrasonic extraction; ASE – accelerated solvent extraction; MAE – microwaveassisted extraction; SFE – supercritical fluid extraction În lucrarea realizată de G. Romanik şi colab. sunt prezentate tehnicile de pregătire a materialului plantelor în vederea separării şi analizei cromatografice, printre acestea: extracŃia Soxhlet, extracŃia cu ultrasunete (sonicare), extracŃia accelerată cu solvent, distilare cu abur, procese de membrană, extracŃia cu fluide supercritice, microextracŃia în fază solidă.

3. În figura 4 sunt reprezentate schematic etapele pentru determinarea compuşilor din plante.


120


Faza de execuŃie nr. 2/15.12.2009/ PNII PLANTE

Pregătirea probei • congelare - uscare • omogenizare

Extractie • MSPD • SE • Soxhlet • SPME

ANALIZA INSTRUMENTALĂ

Altele • FID • ECD

Altele

LC

GC

GC - MS • Q-MS • IT-MS

Altele • UV • NMR

LC-UV-MS/MS • IT-MS • TOF-MS

CE • UV • ED • MS

TLC • UV • chemical

Figura 4 – Rerezentarea schematică a etapelor deurmat în determinarea compuşilor din plante SE: solvent extraction; MSPD: matrix solid-phase extraction; SPME: solid-phase microextraction; MS/MS: tandem mass spectrometry; TLC: thin layer chromatography; FID: flame ionization detection; ECD: electron capture detection; Q: quadrupole; IT: ion-trap, NMR, nuclear magnetic resonance; TOF, time-of-flight.

B:

1. ProducŃia cea mai ridicată s-a înregistrat în varianta D şi anume 4372 l /ha urmată 2. 3.

4. 5.

de celelalte două variante AC şi B. FaŃă de animalele care au păscut în turmă vacile din variantele îmbunătătite au dat cu 230-268% mai mult lapte, cea ce confirmă eficienŃa măsurilor de îmbunătăŃire. În ce priveşte conversia furajelor de pajişti în productie de lapte se constat ă un consum ridicat de SU şi anume 1,20 kg SU la varianta AC, 1,00 kg SU la var B şi 1,45 kg US la var D , fiind destul de mari faŃă de alte condiŃii cu climat mai blând. Aceste experimentări urmează a fi aprofundate pe viitor cu analize mai amănunŃite asupra calităŃii laptelui în funcŃie de calitatea furajului. În prezent se fac analize chimice la probele de plant ă şi sinteza altor date care se vor prezenta în etapa următoare a proiectului.


121



C: 1. InvestigaŃiile de laborator astfel efectuate au permis ca pe baza screeningului hematologic să poată fi diagnosticate o serie de tulburări metabolice (subclinice) între care amintim îndeosebi anemia. Valorile semnificativ scăzute ale hematocritului (tabel 1, 5 şi 9) pot fi atribuite deficienŃei de aport al unor microelemente în materiile prime furajere folosite, de regulă carenŃate în fier, cupru, cobalt, seleniu. Acest lucru a fost demonstrat şi prin rezultatul examenelor biochimice serice, care au evidenŃiat nivele scăzute ale concentraŃiei de magneziu, seleniu şi cupru. 2. Creşterea valorilor ureei serice indică aport proteic ridicat în raŃie, în special pe seama furajelor concentrate. Aceasta a putut fi cauzat ă şi de disfuncŃii renale f ără exprimare clinică: excesul de proteină a fost utilizat pe cale metabolică în scop energetic sau plastic, catabolizarea proteinelor fiind legată de o intensificare a ureogenezei.

Tabelul 12. Rezultatul examenului biochimic seric (profil mineral) efectuat la 14 de probe de sânge prelevate de la vaci lactante în perioada de p ăşunat – valori individuale Nr. crt Calciu Fosfor Magneziu Fier Cupru Seleniu (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (µg/dl) (µg/dl) (ppm) 1. 7.2 5.9 2.17 211.46 80.60 0.010 2. 8.9 5.1 1.68 176.56 79.10 0.008 3. 8.1 5.5 1.84 137.50 71.14 0.010 4. 7.8 6.7 1.57 133.11 68.66 0.012 5. 7.9 8.3 1.60 200.17 66.17 0.008 6. 7.9 5.0 2.0 116.21 63.18 0.013 7. 8.5 4.8 1.95 126.96 76.62 0.009 8. 8.2 6.0 1.87 129.31 81.09 0.016 9. 6.5 6.8 1.87 165.52 61.43 0.013 10. 9.2 5.0 2.07 117.55 61.90 0.022 11. 8.1 6.0 2.34 106.74 57.62 0.020 12. 9.5 7.3 2.41 107.91 61.76 0.015 13. 8.8 5.4 2.29 211.46 80.60 0.021 14. 7.5 3.7 1.88 176.56 79.10 0.024 X 8.26 5.74 2.10 145.01 69.07 0.02 ds 1.03 1.19 0.24 40.15 10.59 0.00 CV, % 12.52 20.75 11.39 27.69 15.33 21.75 Valori de referinŃă 8-11 5-7,2 2,1-2,8 100-164 75-97 0.04-0.10

3. Valorile scăzute ale glicemiei indică deficit energetic, în special la vacile aflate în perioada de stabulaŃie. În timpul lactaŃiei, vacile au nevoie cu 40-60% mai mult ă energie decât în perioada de repaus mamar. Dacă lactaŃia se realizează în timpul sezonului rece, capacitatea vacii de a-şi menŃine condiŃia corporală şi de continua să producă lapte va fi serios compromisă dacă nivelul de energie din raŃie nu este suficient. Ca regulă generală, pentru fiecare scădere a temperaturii cu 10°C sub pragul de -20°C, vacile vor avea nevoie, în plus, de 4-6 Mcal energie digestibil ă


122



pe zi. Vara, consumul nutreŃului verde prin păşunat are o influenŃă favorabilă asupra rezistenŃei organice, asupra sănătăŃii şi productivităŃii, datorită acŃiunii favorabile a mişcării, razelor solare şi a aerului curat. Creşterea colesterolemiei indică stări de suprasolicitare. 4. Modificările activităŃii unor enzime serice TGO, Pal, GGT indic ă evoluŃia la vaci a unor organopatii, cum ar fi hepatopatii (creşterea activităŃii TGO), osteoartropatii evolutive (creşterea activităŃii Pal) (tabel 3, 7 şi 11). 5. Valorile unor macrominerale serice au evidenŃiat uşoară hipocalcemie, dar şi hipomagneziemie destul de serioasă (tabel 4, 8 şi 12). Valorile macroelementelor serice analizate se corelează de altfel cu evoluŃia unor osteoartropatii. 6. Deficitul de microelemente esenŃiale (seleniu şi cupru) a caracterizat testele pe toată perioada investigată şi sunt în strânsă legătură cu nivelul acestora în hrană. Erorile de alimentaŃie determină afecŃiuni metabolice şi funcŃionale. Acestea se înregistrează cu precădere in perioada de repaus mamar, cit şi in perioada de început de lactaŃie. Pe ansamblu, erorile alimentare provoacă nu numai stare de boala, determinând şi scăderea producŃiei de lapte.

7. CarenŃele alimentare prelungite duc la modificări metabolice importante ale

proteinelor, lipidelor şi în dinamica hormonală, ducând în cele din urmă la sindrom de infecunditate şi sterilitate, boli ale oaselor. Toate aceste tulburări nutriŃionale pot fi prevenite prin adoptarea unei strategii raŃionale în hrănirea bovinelor, respectiv respectarea cerinŃelor nutriŃionale în funcŃie de starea fiziologică a animalului, de anotimp (furajele de sezon), vârsta animalului şi zona geografică.

D: 1) Această etapă de raportare a avut ca obiectiv realizarea unei analize critice, documentară, a referintelor bibliografice, cu privire la metodica utilizat ă pentru selectarea şi determinarea markerilor de tip carotenoizi şi importanŃa acestora pentru organism. 2) Studiul efectuat pentru această etapă de raportare s-a concentrat pe identificarea referinŃelor bibliografice legate de modele experimentale utilizate în identificarea markerilor biochimici regionali, care determină specificitatea produselor lactate, de la furaje la lapte şi produse lactate, obŃinute din lapte de vacă. 3) Carotenoizii reprezintă una din cele mai importante clase de pigmenŃi vegetali naturali, galbeni, portocalii sau roşii, răspândiŃi, în principal, în regnul vegetal (în morcovi, tomate, dovleac, broccoli, spanac, ardei, portocale, caise, papaya, mango) şi în regnul animal (în gălbenuşul de ou, creveŃi, somon). 4) Privarea organismului animal de hrana care conŃine aceşti pigmenŃi poate duce la dispariŃia culorii caracteristice. FuncŃia fiziologică a carotenoizilor în plante nu este încă bine cunoscută dar în organismul animal aceşti pigmenŃi au rol esenŃial prin relaŃiile lor cu vitamina A şi cu substanŃele de pe retină, importante în procesul vederii. 5) Deoarece pot fixa oxigenul, formând compuşi oxigenaŃi puŃin stabili, pigmenŃii carotenoizi intervin în procesele de oxidoreducere. Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

123



6) Carotenoizii sunt implicaŃi în caracterizarea nutriŃională şi senzorială a produselor lactate şi pot fi consideraŃi potenŃiali biomarkeri pentru managementului trasabilităŃii creşterii animalelor, de la care se colectează laptele materie primă. 7) Din studiul efectuat s-a constatat că s-au identificat aproape 10 carotenoizi (ex. xantofile, carotenoizi) în furaje, concentraŃia lor variind foarte mult în funcŃie de stadiul de dezvoltare şi durata conservării acestora. 8) Diferitele studii realizate au relevat faptul că animalul şi factorii care Ńin de hrănirea/alimentaŃia sa, afectează producŃia de lapte (ex. rasă), atât din punct de vedere cantitativ cât şi din punct de vedere calitativ, prin variaŃia concentraŃiei în carotenoizi. 9) Culoarea produselor lactate depinde, în mare măsură, de concentraŃia lor de carotenoizi, sugerând astfel că, culoarea poate fi o metodă rapidă şi promiŃătoare de măsurare a trasabilităŃii condiŃiilor de hrănire. Managementul hrănirii vacilor de lapte permite un control eficient al concentraŃiei de carotenoizi şi a culorii produselor lactate. 10) Carotenoizii din plante sunt transferaŃi în produsele animale, uneori în concentraŃie mai mare (exemplu în g ălbenuşul de ou) sau în concentraŃie mai scăzută, cum ar fi în produsele rumeg ătoarelor, unde modifică culoarea laptelui, a produselor lactate şi a stratului adipos. Consumatorii sunt sensibili la culoarea produsului, deşi preferinŃele diferă de la Ńară la Ńară sau de la regiune la regiune . O culoare galbenă a laptelui este asociată cu păşunatul care, în multe Ńă ri europene, are conota Ń ii de hrană „natural ă”. Astfel, carotenoizii pot fi percepu Ń i ca indicatori ai păşunatului verde. 11) CompoziŃia carotenoizilor în fructe şi legume este mult mai complexă şi variabilă, cu variaŃii chiar şi la carotenoizii principali si pot fi identificate opt modele

principale. 12) Multe alimente carotenogenice sunt sezoniere iar procesarea materiei prime este necesară pentru a minimiza pierderile. Modificarea, reducerea conŃinutului sau pierderea carotenoizilor în timpul procesării şi depozitării alimentelor poate avea loc şi prin transportul fizic, izomerizarea geometrică sau prin oxidarea enzimatică sau ne-enzimatică. Deşi atenŃia este, adeseori, îndreptată spre procesarea industrială, prepararea în casă poate cauza pierderi mult mai importante de carotenoizi. La prepararea alimentelor în casă, pierderea carotenoizilor are loc în felul următor: microunde
124



refrigerarea), precum şi depozitarea pe termen lung, înaintea analizării, au efect de degradare a acestor substante. 16) DiferenŃele concentraŃiilor de carotenoizi din speciile de furaje verzi sunt mai puŃin semnificative faŃă de diferenŃele acestora din speciile de furaje uscate. 17) Uscarea furajelor la soare scade puternic concentraŃia de carotenoizi, în special când plouă în timpul întoarcerii şi strângerii/adunării fânului cosit. Studiile realizate de Chauveau-Duriot şi co. au arătat că din momentul cosirii fânului şi până în momentul însilozării fânului uscat se înregistrează o pierdere medie a carotenoizilor de până la 83%. 18) Independent de veştejire, procesul de însilozare determină scăderea concentraŃiei de carotenoizi. Pierderile de carotenoizi depind de pH şi sunt favorizate de condiŃiile aerobe. Aceste pierderi sunt mai mari în cazul legumelor decât în cazul ierbii, când pH-ul este mare (~ 5) şi când sigilarea silozului este întârziată, crescând proporŃional cu timpul de depozitare. Pierderile maxime pot ajunge până la 80% din concentraŃia iniŃială, dar în silozurile bine construite pierderile sunt, în general, mai mici de 20%. 19) Majoritatea nutreŃurilor concentrate folosite în hrana vacilor au un conŃinut foarte scăzut de carotenoizi. Procesarea nutreŃurilor pentru obŃinerea de concentrate implică, adesea, încălzirea care, probabil, distruge cea mai mare parte din conŃinutul de carotenoizi. 20) ConcentraŃia de carotenoizi din laptele de vacă este determinată de natura şi de cantitatea de suplimente dietetice, furnizate prin intermediul raŃiei de furaj, precum şi prin transferul acestora din matricea vegetalelor către glandele mamare. Recuperarea scăzută a carotenoizilor din lapte, relevă eficienŃa puternic limitată a acestui transfer şi se estimează că etapele diferite de transfer ale carotenoizilor, din hrană în lapte, pot influenŃa disponibilitatea acestora în glandele mamare. ConcentraŃiile de carotenoizi şi retinol în laptele de vacă, raportate în literatură, variază foarte mult între diferite studii, de la 1  17 pentru carotenoizi şi, respectiv, de la 1  12 µg/g grăsime, pentru retinol. 21) ConcentraŃia de carotenoizi din lapte diferă în funcŃie de: specie, rasă, faza de lactaŃie, starea de sănătate, producŃia de lapte şi grăsimea din lapte, variabilitatea individuală. 22) Pentru evaluarea relaŃiei dintre condiŃiile de producere a laptelui şi conŃinutul în componente de interes nutriŃional din brânză, este necesar să se cunoască nivelul care determină variabilitatea compoziŃională a brânzei faŃă de cea a laptelui. Mul Ń i cercetă tori au demonstrat că , în afară de aspectele legate de con Ń inutul de substan Ńă uscată din brânză , variabilitatea compozi Ń ional ă a acesteia în acizi gra şi, β -caroten, xantofile şi vitamina E, depinde, în principal, de compozi Ń ia „laptelui original”. CompoziŃia „laptelui original”, în ceea ce priveşte acizii graşi, vitaminele şi carotenoizi, este puternic influenŃată de natura dietei animalului (compoziŃia biologică, stadiul de maturitate, modul de conservare etc.), de specia animalului, de rasă, de modul de recoltare a laptelui şi, bineînŃeles, de stagiul de lactaŃie în care se află animalul. 23) Carotenoizii din lapte influenŃează proprietăŃile senzoriale ale produselor din lapte fie indirect, prin intermediul proprietăŃilor antioxidante, fie direct, prin proprietăŃile lor de îngălbenire Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

125



24) Alegerea celei mai adecvate metode pentru analiza carotenoizilor este, de obicei, determinată de tipul de informaŃii necesare a fi obtinuŃe. În general, pigmentul carotenoidic trebuie extras înaintea analizei, uneori chiar dintr-o matrice foarte complexă. 25) Principiul metodelor de determinare se bazeaza pe separarea cromatografica si pot fi: separarea cu coloană cromatografică în curent de apă – metoda clasica de separare a carotenoizilor, pentru analiza cantitativă; cromatografia în strat subŃire (TLC), deşi este eficientă în monitorizarea testelor chimice în vederea identificării rezultatelor, nu este adecvată pentru analizele cantitative, din cauza pericolului de degradare şi izomerizare la expunerea îndelungată pe masa de lucru; cromatografia cu gaze este, de asemenea, neadecvată, datorită instabilităŃii termice şi a volatilităŃii reduse pe care o prezintă marea majoritate a carotenoizilor; determinarea prin HPLC pe coloane C18 poate fi modul preferat pentru separarea carotenoizilor pentru analizele cantitative. 26) Din cauza variaŃiilor cantitative şi calitative a carotenoizilor din compoziŃia alimentelor, este discutabil dacă poate fi stabilit un singur sistem cromatografic care să poată fi aplicat mai multor tipuri de alimente. 27) Schiedt şi co. au definit criteriile minime necesare pentru identificarea carotenoizilor: o spectrul de absorbŃie în regiunea UV, obŃinut în cel puŃin 2 solvenŃ i diferiŃi, trebuie să fie compatibil cu cromoforul sugerat; o proprietăŃile cromatografice obŃinute trebuie să fie identice, atât prin metoda TLC cât şi prin HPLC; co-eluŃiile trebuie f ăcute cu probe autentice; o trebuie obŃinut un spectru de masă care să permită cel puŃin confirmarea masei moleculare. În concluzie, metodele spectroscopice permit identificarea brută a pigmenŃilor prezenŃ i într-un extract dar compoziŃia specifică rămâne neclară. Pentru identificarea mai exactă a pigmenŃilor dintr-un amestec trebuie utilizate metodele cromatografice. Identificarea ş i cuantificarea definitivă a pigmenŃilor necesită, de obicei, realizarea unor standarde, care sunt decisive în analiza pigmenŃilor din produsele alimentare.

E. Pentru satisfacerea cerinŃelor nutriŃionale ale vacilor de lapte se impun următoarele: - cunoaşterea normelor de hrană:

- norma de substanŃă uscată (kg); - norma de energie netă lapte (UNL); - norma de proteină digestibilă (PDIN şi PDIE în g); - normele de macroelemente Ca, P, Mg, etc. (g); - normele de microelemente şi vitamine (mg; UI); - capacitatea de ingerare a hranei (USV); - raportul dintre PDIE/UNL. - cunoaşterea valorii nutritive a nutreŃurilor: - conŃinutul în substanŃă uscată (g/kg SN); - conŃinutul în energie netă lapte (UNL/kg SU); Cercetări complexe privind stabilirea de markeri biochimici specifici pentru produse lactate regionale în vederea îmbun ătăŃirii trasabilit ăŃii acestora pe lan Ńul alimentar total

126

Caracterizare Si Identificare Flavonoide

Recommend Documents