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Capítulo 19 Fosforilação Oxidativa e Fotofosforila Fotofosforilação ção
A fosfo fosforil rilaç ação ão oxida oxidativ tivaa é o está estági gioo final final do meta metabo bolis lismo mo produ produto torr de ener energi giaa nos nos organismos aeróbicos. Todas as etapas oxidativas na degradação dos carboidratos, gorduras e aminoá aminoácido cidoss conve converge rgem m para para esse esse estág estágio io final final da respira respiraçã çãoo celular celular ond onde, e, a energia energia proveniente proveniente da da oxidação oxidação é respons responsável ável pela pela síntese síntese de ATP. ATP. A fotofosf fotofosforilaçã orilaçãoo é o meio pelo qual os organismos fotossintéticos capturam a energia da luz solar – a fonte fundamental de ener energi giaa na bios biosfe fera ra – e a usam usam para para prod produz uzir ir ATP. ATP. A fosf fosfor oril ilaç ação ão oxid oxidat ativ ivaa e a fotofosforilação em conjunto, são responsáveis pela maioria do ATP sintetizado por vários organismos aeróbicos na maior parte do tempo. Nos eucariot eucariotos, os, a fosforilação fosforilação oxidativa oxidativa ocorre ocorre nas mitocônd mitocôndrias rias e a fotofosforila fotofosforilação, ção, nos cloroplastos. A fosforilação oxidativa envolve a redução do O2 a H2O com elétrons doados pelo NADH e FADH 2, e ocorre igualmente na presença de luz ou na escuridão. A fotofosforilação envolve a oxidação da H2O a O2, onde o NADP + é o aceptor de elétrons e é absolutamente dependente da energia luminosa. Apesar das diferenças, estes dois processos conversores de energia, altamente eficientes, apresentam mecanismos fundamentalmente semelhantes. Nosso Nosso entendimento entendimento atual da síntese do ATP na mitocôndria mitocôndria e cloroplastos cloroplastos está baseado baseado na hipótese, hipótese, introduzida introduzida por Peter Mitchell Mitchell em 1961 1961,, de que as diferenças diferenças na concentração transmembrana de prótons são os reservatórios para a energia extraída das reações de oxidação biológicas. Esta teoria quimiosmótica tem sido aceita como um dos grandes princípios unificadores da biologia no século XX. Ela permite a compreensão dos processos processos de fosforilação fosforilação oxidativa oxidativa e fotofosforilaç fotofosforilação ão e para transduçõe transduçõess de energia energia aparentemente distintas tais como o transporte ativo através de membranas e o movimento dos flagelos das bactérias. A fosforilação oxidativa e a fotofosforilação são mecanisticamente similares em três aspectos: (1) Ambos os processos envolvem o fluxo de elétrons através de uma cadeia de transportadores ligados à membrana. (2) A energia livre disponível através deste fluxo de elétrons “montanha abaixo” (exergônico), está acoplada ao transporte de prótons “montanha acima”, através de uma membrana impermeável ao próton, conservando a energia livre da oxidação dos combustíveis como um potencial eletroquímico transmembrana (pág. xxx). (3) O fluxo transmembrana de prótons no no sentido do seu gradiente gradiente de concentração através através de canais protéicos específicos, fornece a energia livre para a síntese do ATP, que é catalisada por um comple complexo xo proteico proteico ligado ligado à membrana membrana (ATP (ATP sintase) sintase) e que que acopla acopla o fluxo fluxo de prótons prótons à fosforilação do ATP.
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Este capítulo começa com a fosforilação oxidativa. Inicialmente serão descritos os componentes da cadeia de transporte de elétrons, a sua organização em grandes complexos funcionais funcionais na membrana membrana interna da mitocôndria, mitocôndria, a seqüência seqüência do fluxo de elétrons através através deles e os movimentos de prótons que acompanham este fluxo. O próximo tópico é o notável complexo enzimático que, através da “catálise rotacional” captura a energia do fluxo de prótons prótons na forma de ATP. ATP. Então, Então, serão considerado consideradoss os mecanismo mecanismoss regulatórios regulatórios que coord coorden enam am a fosf fosfor orila ilaçã çãoo oxid oxidat ativa iva atra atravé véss das das vária váriass vias vias cata catabó bólic licas as que que oxida oxidam m combustíveis. Com este entendimento da fosforilação oxidativa mitocondrial, será abordada então a fotofosforilaçã fotofosforilação, o, começando começando com a absorção absorção da luz por pigmentos pigmentos fotossintéticos, fotossintéticos, seguido pelo fluxo de elétrons, direcionado pela luz, da H 2O para o NADP + e a base molecular para o acoplamento do fluxo de elétrons e prótons. Finalmente, serão abordadas as simil similar arida idade dess de estru estrutu tura ra e meca mecanis nismo mo entre entre as ATP ATP sinta sintase sess dos dos clor clorop opla last stos os e mitocôndrias bem como as bases evolutivas evolutivas para essa conservação do mecanismo. mecanismo.
Albert L. Lehninger 1917 – 1986
Fosforilação Oxidativa Reação de Transferência de Elétrons na Mitocôn Mitocôndria dria
A descoberta em 1948, por Eugene Kennedy e Albert Lehninger, de que as mitocôndrias são os sítios da fosforilação oxidativa nos eucariotos, marcou o início da fase moderna dos estudos das transduções de energia biológica. As mitocôndrias, tais como as bactérias gramnegativ neg ativas, as, possue possuem m dua duass membr membrana anass (Fig. (Fig. 19-1). 19-1). A membr membrana ana mitoco mitocondr ndrial ial exter externa na é facilmente permeável a pequenas moléculas (M r , 5000) e íons que se movem livremente atravé atravéss de canais canais transm transmemb embran ranaa formad formados os por uma família família de protei proteinas nas integra integrais is de membrana chamadas porinas. A membrana interna é impermeável à maioria das moléculas pequenas pequenas e íons, incluindo incluindo prótons prótons (H +). As únicas espécies que atravessam a membrana interna são aquelas para as quais existem transportadores específicos. A membrana interna contém os componentes da cadeia respiratória e a ATP sintase. A matriz matriz mitoco mitocondr ndrial ial cerca cercada da pela pela membr membrana ana interna interna,, con conté tém m o comple complexo xo da piruvato piruvato desidroge desidrogenase nase e as enzimas enzimas do ciclo ciclo do ácido ácido cítrico, cítrico, a via da β-oxidação dos ácidos graxos e as vias de oxidação dos aminoácidos. Em resumo, ela contém todas as vias da oxidação dos combustíveis, exceto a glicólise que ocorre no citosol. A membrana interna, seleti seletivam vament entee permeá permeável vel,, segreg segregaa os interme intermediár diários ios e as enzima enzimass das vias vias metabó metabólica licass
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Este capítulo começa com a fosforilação oxidativa. Inicialmente serão descritos os componentes da cadeia de transporte de elétrons, a sua organização em grandes complexos funcionais funcionais na membrana membrana interna da mitocôndria, mitocôndria, a seqüência seqüência do fluxo de elétrons através através deles e os movimentos de prótons que acompanham este fluxo. O próximo tópico é o notável complexo enzimático que, através da “catálise rotacional” captura a energia do fluxo de prótons prótons na forma de ATP. ATP. Então, Então, serão considerado consideradoss os mecanismo mecanismoss regulatórios regulatórios que coord coorden enam am a fosf fosfor orila ilaçã çãoo oxid oxidat ativa iva atra atravé véss das das vária váriass vias vias cata catabó bólic licas as que que oxida oxidam m combustíveis. Com este entendimento da fosforilação oxidativa mitocondrial, será abordada então a fotofosforilaçã fotofosforilação, o, começando começando com a absorção absorção da luz por pigmentos pigmentos fotossintéticos, fotossintéticos, seguido pelo fluxo de elétrons, direcionado pela luz, da H 2O para o NADP + e a base molecular para o acoplamento do fluxo de elétrons e prótons. Finalmente, serão abordadas as simil similar arida idade dess de estru estrutu tura ra e meca mecanis nismo mo entre entre as ATP ATP sinta sintase sess dos dos clor clorop opla last stos os e mitocôndrias bem como as bases evolutivas evolutivas para essa conservação do mecanismo. mecanismo.
Albert L. Lehninger 1917 – 1986
Fosforilação Oxidativa Reação de Transferência de Elétrons na Mitocôn Mitocôndria dria
A descoberta em 1948, por Eugene Kennedy e Albert Lehninger, de que as mitocôndrias são os sítios da fosforilação oxidativa nos eucariotos, marcou o início da fase moderna dos estudos das transduções de energia biológica. As mitocôndrias, tais como as bactérias gramnegativ neg ativas, as, possue possuem m dua duass membr membrana anass (Fig. (Fig. 19-1). 19-1). A membr membrana ana mitoco mitocondr ndrial ial exter externa na é facilmente permeável a pequenas moléculas (M r , 5000) e íons que se movem livremente atravé atravéss de canais canais transm transmemb embran ranaa formad formados os por uma família família de protei proteinas nas integra integrais is de membrana chamadas porinas. A membrana interna é impermeável à maioria das moléculas pequenas pequenas e íons, incluindo incluindo prótons prótons (H +). As únicas espécies que atravessam a membrana interna são aquelas para as quais existem transportadores específicos. A membrana interna contém os componentes da cadeia respiratória e a ATP sintase. A matriz matriz mitoco mitocondr ndrial ial cerca cercada da pela pela membr membrana ana interna interna,, con conté tém m o comple complexo xo da piruvato piruvato desidroge desidrogenase nase e as enzimas enzimas do ciclo ciclo do ácido ácido cítrico, cítrico, a via da β-oxidação dos ácidos graxos e as vias de oxidação dos aminoácidos. Em resumo, ela contém todas as vias da oxidação dos combustíveis, exceto a glicólise que ocorre no citosol. A membrana interna, seleti seletivam vament entee permeá permeável vel,, segreg segregaa os interme intermediár diários ios e as enzima enzimass das vias vias metabó metabólica licass
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citos citosóli ólica cass atra atravé véss de proc proces esso soss meta metabó bólic licos os que que ocor ocorre rem m na matri matriz. z. Entre Entreta tanto nto,, transpo transporta rtadore doress espec específic íficos os carreg carregam am piruvat piruvato, o, ácido ácidoss graxos graxos e aminoá aminoácid cidos os ou seus seus derivados α-ceto para o interior da matriz garantindo o acesso à maquinaria do ciclo do ácido cítrico. Semelhantemente, o ADP e o P i são transportados especificamente para o interior da matriz à medida que o ATP recém-sintetizado é transportado para fora.
figura 19-1 Anatomia bioquímica de uma mitocôndria . As circunvo circunvoluçõe luçõess (cristas) (cristas) da membran membranaa
interna proporcionam uma superfície muito grande. A membrana interna de uma única mitocôndria do fígado pode ter mais de 10.000 conjuntos de sistemas de transferência de elétron elétronss (cade (cadeias ias respira respiratór tórias) ias) e moléc molécula ulass de ATP ATP sintas sintase, e, distribu distribuída ídass sobre sobre toda toda a superfície da membrana. Mitocôndrias do coração, que apresentam cristas muito abundantes e portanto uma área de membrana interna muito maior, contêm cerca de três vezes mais conjunt con juntos os de sistem sistemas as de transfe transferên rência cia de elétron elétronss que as mitocô mitocôndr ndrias ias do fígado. fígado. O reservatório reservatório mitocondria mitocondriall das coenzimas e intermediár intermediários ios está funcionalme funcionalmente nte separado separado do reservatório citoplasmático. As mitocôndrias dos invertebrados, plantas e microrganismos eucariotos eucariotos são semelhante semelhantess às mostradas mostradas aqui, embora embora haja muita variação variação no tamanho, tamanho, na forma e no grau de enrolamento da membrana interna. Veja o Capítulo 2 para outros detalhes da estrutura mitocondrial.
Os elétrons são canalizados para transportadores universais de elétrons
A fosforilação oxidativa começa com a entrada de elétrons na cadeia respiratória. Muitos desses elétrons são provenientes da ação de desidrogenases que coletam elétrons das vias cata catabó bólic licas as e os cana canaliz lizam am para para acep acepto tore ress univ univer ersa sais is de elét elétron ronss – nucl nucleo eotíd tídeo eoss de nicotinamida (NAD+ ou NADP+) ou nucleotídeos de flavina ((FMN ou FAD). Desidrog Desidrogenas enases es associadas associadas a nucleotí nucleotídeo deo de nicotinam nicotinamida ida catalisam catalisam reações reações
reversíveis dos seguintes tipos gerais: Substrato reduzido + NAD+ ∆ substrato oxidado + NADH + H + Substrato reduzido + NADP + ∆ substrato oxidado + NADPH + H + A maioria das desidrogenases que atuam no catabolismo são específicas para o NAD + como receptor de elétrons (Tabela 19-1). Algumas estão no citosol, outras nas mitocôndrias e outras ainda apresentam isoenzimas citosólica e mitocondrial.
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As desidrogenases ligadas ao NAD removem dois átomos de hidrogênio dos seus substratos. Um deles é transferido como um íon hidreto (:H -) ao NAD+ e o outro é liberado como H+ no meio (veja Fig. 14-15). O NAD + também pode coletar equivalentes redutores de substratos trabalhados pelas desidrogenases ligadas ao NADP. Isto é possível devido à piridina nucleotídeo transidrogenase transidrogenase, que catalisa a reação:
NADPH NADPH + NAD NAD+ ∆ NADP+ + NADH O NADH e o NADPH são transportadores de elétrons hidrossolúveis que se associam reversivelmente com as desidrogenases. O NADH carrega os elétrons derivados das reações
catabó catabólica licass até o seu ponto de entrad entradaa na cadeia cadeia respiratóri respiratória, a, o comple complexo xo da NAD NADH H desidrogenase, descrito a seguir. O NADPH geralmente fornece elétrons para as reações anab anabóli ólica cas. s. Ne Nem m o NA NADH DH nem nem o NA NADP DPH H pode podem m atra atrave vess ssar ar a memb membra rana na inter interna na da mitocôndria, mas os elétrons que elas carregam podem ser lançados através dela, como será visto adiante.
tabela 19-1 Algumas reações importantes catalisadas por desidrogenases ligadas ao NAD(P)H Reação*
Localização†
Ligadas ao NAD
α-Cetoglutarato + CoA + NAD+ ∆ succinil-CoA + CO2 + NADH + H+
L-Malato + NAD+ ∆ oxaloacetato + NADH + H+
M MeC
Piruvato + CoA + NAD+ ∆ acetil-CoA + CO2 + NADH + H+
M
Gliceraldeido-3-fosfato + Pi + NAD+ ∆ 1,3-difosfoglicerato + NADH + H+
C
Lactato + NAD+ ∆ piruvato + NADH + H+
C
β-hydroxiacil-CoA + NAD+ ∆ β-cetoacil-CoA + CO2 + NADH + H+
M
Ligadas ao NADP
Glicose-6-fosfato + NADP+ ∆ 6-fosfogluconato + NADPH + H+
C
Ligadas ao NAD ou NADP
L-glutamato + H2O + NAD(P)+ ∆ α-cetoglutarato + NH4+ + NAD(P)H Isocitrato + NAD(P)+ ∆ α-cetoglutarato + CO2 + NAD(P)H + H+ * Estas reações e suas enzimas foram discutidas nos Capítulos 15 a 18.
M MeC †M designa
mitocôndria; C, citosol .
As flavoproteínas apresentam um nucleotídeo flavina, o FMN ou o FAD, fortemente ligado, às vezes até covalentemente (veja Fig. 14-16). O nucleotídeo de flavina oxidado pode
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aceitar um elétron (dando origem a uma forma semiquinona) ou dois (originando FADH 2 ou FMNH2). A transferência de elétrons ocorre porque a flavoproteína tem um potencial de redução maior que o do composto oxidado. O potencial de redução padrão de um nucleotídeo de flavina, diferente daquele do NAD ou NADP, depende da proteína à qual ele está associado. Interações locais com grupos funcionais na proteína distorcem os orbitais dos elétrons no anel da flavina, alterando as estabilidades relativas das formas oxidadas e reduzidas. Assim, o potencial de redução padrão relevante é o da flavoproteína específica e não o do FAD ou FMN isolado. O nucleotídeo de flavina deveria ser considerado parte do sítio ativo das flavoproteínas e não um reagente ou produto na reação de transferência de elétrons. Como as flavoproteínas podem participar tanto na transferência de um como de dois elétrons, elas podem funcionar como intermediários entre reações onde dois elétrons são doados (como nas desidrogenações) e aquelas onde um elétron é aceito (como na redução de uma quinona a hidroquinona, descrita a seguir).
Os elétrons passam através de uma série de transportadores ligados à membrana
A cadeia respiratória mitocondrial consiste de uma série de transportadores de elétrons que atuam seqüencialmente, a maioria dos quais são proteínas integrais de membrana que apresentam grupos prostéticos capazes de aceitar ou doar um ou dois elétrons. Na fosforilação oxidativa ocorrem três tipos de transferência de elétrons: (1) transferência direta de elétrons, tal como na redução do Fe 3+ a Fe2+; (2) transferência como um átomo de hidrogênio (H+ + e-) e (3) transferência como um íon hidreto (:H -), que possui dois elétrons. O termo equivalente redutor é usado para designar um único equivalente de elétron transferido na reação de oxidação-redução. Além do NAD e das flavoproteínas, três outros tipos de moléculas transportadores de elétrons funcionam na cadeia respiratória: uma quinona hidrofóbica (ubiquinona) e dois tipos diferentes de proteínas que contém ferro (citocromos e ferro-enxofre proteínas).
figura 19-2 Ubiquinona (Q ou coenzima Q). A redução completa da ubiquinona requer dois elétrons e
dois prótons e ocorre em duas etapas através de um intermediário radicalar semiquinona. A ubiquinona (também chamada de coenzima Q, ou simplesmente Q) é uma benzoquinona lipossolúvel que apresenta uma longa cadeia lateral isoprenóide (Fig. 19-2). A
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plastoquinona (encontrada nos cloroplastos das plantas) e a menaquinona (encontrada nas bactérias) são compostos muito parecidos e desempenham papéis análogos ao da ubiquinona, transportando elétrons através de cadeias de transferência de elétrons associadas à membrana. A ubiquinona pode aceitar um elétron, originando o radical semiquinona (QH), ou dois elétrons para formar ubiquinol (QH 2) (Fig. 19-2). Semelhantemente aos transportadores flavoproteínas, ela de atuar na junção entre um doador de dois elétrons e um receptor de um elétron. Como a ubiquinona é pequena e hidrofóbica, ela se difunde livremente na camada lipídica da membrana interna mitocondrial e pode transportar equivalentes redutores entre outros transportadores de elétrons menos móveis na membrana. Como ela carrega tanto prótons quanto elétrons, ela desempenha um papel central no acoplamento do fluxo de elétrons ao movimento de prótons. Os citocromos são proteínas que apresentam como característica uma intensa absorção da luz, devido aos seus grupos prostéticos heme, que contém ferro (Fig. 19-3). As mitocôndrias contém três classes de citocromos designados por a, b e c que podem ser distinguidos por diferenças nos seus espectros de absorção de luz. Cada tipo de citocromo no seu estado reduzido (Fe 2+) possui três bandas de absorção na região do visível (Fig. 19-4). A banda de maior comprimento de onda está próxima de 600 nm nos citocromos do tipo a, próxima de 560 nm no tipo b, e próxima de 550 nm no tipo c. Para se distinguir entre citocromos muito parecidos de um tipo, algumas vezes se usa o valor exato do máximo de absorção nos seus nomes, como no citocromo b562.
figura 19-3 Grupos prostéticos dos citocromos . Cada um deles consiste de quatro anéis de cinco
átomos, contendo nitrogênio numa estrutura cíclica chamada de porfirina. Os quatro átomos de nitrogênio estão coordenados com um íon Fe central que pode estar na forma Fe
2+
ou Fe3+.
A ferro protoporfirina IX é encontrada nos citocromos do tipo b, na hemoglobina e mioglobina (veja Fig. 6-17). O heme C está covalentemente ligado à proteína do citocromo c através de ligações tioésteres de dois resíduos de Cis. O heme A, encontrado nos citocromos do tipo a, possui uma longa cauda isoprenóide ligada a um dos anéis de cinco átomos. O sistema de dupla ligação conjugada (sombreada em vermelho) do anel da porfirina é responsável pela absorção da luz visível por estes hemes. Os cofatores heme dos citocromos a e b estão fortemente, mas não-covalentemente, ligados às suas proteínas associadas; os grupos heme dos citocromos do tipo c estão ligados covalentemente através de resíduos de Cis (Fig. 19-3). Similarmente às flavoproteínas, o potencial de redução padrão do átomo de ferro no heme de um citocromo depende da sua
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interação com as cadeias laterais da proteína e portanto, é diferente para cada citocromo. Os citocromos do tipo a e b e alguns do tipo c são proteínas integrais da membrana interna da mitocôndria. Uma notável exceção é o citocromo c da mitocôndria, uma proteína solúvel que se associa com a superfície externa da membrana interna da mitocôndria através de interações eletrostáticas. Nós abordamos o citocromo c nas discussões iniciais da evolução das proteínas (ver Adendo 5-2) e na estrutura de proteína (ver Fig. 6-18a).
figura 19-4
Espectro de absorção do citocromo c nas suas formas oxidada (vermelho) e reduzida (azul). Também estão marcadas as bandas α, β e γ características da forma reduzida.
Helmut Beinert Nas ferro-enxofre proteínas , inicialmente descobertas por Helmut Beinert, o ferro está presente não no heme, mas associado a átomos de enxofre inorgânico ou átomos de enxofre de resíduos de Cis na proteína, ou ambos. Esses centros de ferro-enxofre (Fe-S) variam desde estruturas simples com um único átomo de Fe coordenado a quatro grupos CisSH até centros Fe-S mais complexos com dois ou quatro átomos de Fe (Fig. 19-5). As proteínas ferro-enxofre Rieske (denominadas após sua descoberta) são uma variação neste
tema, onde um átomo de Fe está coordenado a dois resíduos de His ao invés de dois resíduos de Cis. Todas as proteínas ferro-enxofre participam de transferências de um elétron onde cada átomo de ferro do arranjo ferro-enxofre está oxidado ou reduzido. Pelo menos oito proteínas ferro-enxofre funcionam na transferência de elétrons da mitocôndria. O potencial de redução das proteínas ferro-enxofre varia de –0.65 V a +0.45 V, dependendo do microambiente do ferro na proteína.
figura 19-5 Centros Fe-S. Os centros Fe-S das proteínas ferro-enxofre podem ser simples como em ( a),
com um único Fe rodeado por átomos de S de quatro resíduos de Cis. Outros centros incluem tanto átomos inorgânicos e átomos de S de Cis, como nos centros 2Fe-2S ( b) ou 4Fe-4S (c). A ferredoxina da cianobactéria Anabaena 7120 (d) possui um centro 2Fe-2S. (Observe que apenas os átomos S inorgânicos estão contados nestas designações. Por exemplo, no centro 2Fe-2S (b), cada íon Fe está de fato rodeado por quatro átomos de S). O potencial de redução
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padrão exato do ferro nestes centros depende do tipo de centro e da sua interação com as proteínas associadas. Na reação completa catalisada pela cadeia respiratória mitocondrial, os elétrons se movem do NADH, succinato ou algum outro doador primário de elétrons através das flavoproteínas, ubiquinona, proteínas ferro-enxofre, citocromo e finalmente para o O 2. A análise dos métodos usados para determinar a seqüência onde esses carregadores atuam é instrutiva, uma vez que a mesma abordagem geral tem sido usada para estudar outras cadeias de transporte de elétrons, tais como as dos cloroplastos. Primeiro, o potencial de redução padrão de cada um dos carregadores de elétrons foi determinado experimentalmente (Tabela 19-2). Espera-se que os carregadores funcionem em ordem crescente do potencial de redução, uma vez que os elétrons fluem espontaneamente dos carregadores de menor E’ o para carregadores com E’ o maiores. A ordem dos carregadores deduzida por este método é NADH ∀ Q ∀ citocromo b ∀ citocromo c1 ∀ citocromo c ∀ citocromo a ∀ citocromo a3 ∀ O2. Note contudo que a
ordem dos potenciais de redução padrão não é necessariamente a mesma que a dos potenciais de redução verdadeiros em condições celulares, que dependem da concentração das formas reduzida e oxidada. Um segundo método para determinar a sequência dos carregadores de elétrons envolve a redução experimental da cadeia completa de carregadores quando se fornece uma fonte de elétrons, mas nenhum aceptor de elétrons (sem O 2). Quando o O 2 é introduzido
abruptamente no sistema, a velocidade com que cada transportador de
elétrons se oxida (medida espectroscopicamente) mostra a ordem na qual os transportadores funcionam. O transportador mais próximo do O 2 (na extremidade da cadeia) libera seu elétron primeiro, o segundo transportador a partir da extremidade é o próximo a ser oxidado e assim por diante. Tais experimentos confirmaram a seqüência deduzida a partir dos potenciais de redução padrão.
tabela 19-2 Potenciais de redução padrão da cadeia respiratória e dos transportadores de elétrons relacionados Reação redox (meia-reação)
E’ o (V)
2H+ + 2e- ∀ H2
-0,414
NAD+ + H+ + 2e- ∀ NADH
-0,320
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NADP+ + H+ + 2e- ∀ NADPH NADH desidrogenase (FMNH2) + 2 H+ + 2e- ∀ NADH desidrogenase
-0,324 -0,300
(FMNH2) Ubiquinona + 2H+ + 2e- ∀ ubiquinol
0,045
Citocromo b (Fe3+) + e- ∀ citocromo b (Fe2+)
0,077
Citocromo c1 (Fe3+) + e- ∀ citocromo c1 (Fe2+)
0,220
Citocromo c (Fe3+) + e- ∀ citocromo c (Fe2+)
0,254
Citocromo a (Fe3+) + e- ∀ citocromo a (Fe2+) Citocromo a3 (Fe3+) + e- ∀ citocromo a3 (Fe2+)
0,290
½ O2 + 2H+ + 2e- ∀ H2O
0,816
0,550
Para uma confirmação final, agentes que inibem o fluxo de elétrons através da cadeia têm sido usados combinados com medidas do grau de oxidação de cada transportador. Na presença de O2 e um doador de elétrons os transportadores que atuam antes da etapa inibida ficam totalmente reduzidos e, aqueles que atuam depois do bloqueio, ficam completamente oxidados (Fig. 19-6). Usando-se vários inibidores que bloqueiam a cadeia em diferentes locais, a seqüência completa foi deduzida e, ela é a mesma prevista pelas duas abordagens anteriores.
figura 19-6 Método para determinar a sequência dos transportadores de elétrons . Este método
mede os efeitos de inibidores da transferência de elétrons sobre o estado de oxidação de cada transportador. Na presença de um doador de elétrons e de O 2, cada inibidor produz um padrão característico de transportadores oxidados/reduzidos: aqueles que estão antes do bloqueio ficam reduzidos (azul) e aqueles que estão depois do bloqueio ficam oxidados (vermelho).
Os transportadores de elétrons funcionam em complexos multienzimáticos
Os transportadores de elétrons da cadeia respiratória estão organizados em complexos supramoleculares embebidos na membrana que podem ser fisicamente separados. O tratamento brando da membrana mitocondrial interna com detergentes permite a resolução de quatro únicos complexos transportadores de elétrons, cada um capaz de catalisar a transferência de elétrons através de uma parte da cadeia (Fig. 19-7; Tabela 19-3). Os
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complexos I e II catalisam a transferência de elétrons para a ubiquinona a partir de dois doadores de elétrons diferentes: o NADH (complexo I) e o succinato (complexo II). O complexo III transporta elétrons da ubiquinona até o citocromo c e, o complexo IV completa a seqüência transferindo elétrons do citocromo c para o O2. Vamos agora analisar com mais detalhes a estrutura e a função de cada complexo da cadeia respiratória mitocondrial.
figura 19-7 Separação dos complexos funcionais da cadeia respiratória. A membrana mitocondrial
externa é inicialmente removida através de tratamento com o detergente digitonina. Fragmentos da membrana interna são então obtidos por ruptura osmótica da mitocôndria e, os fragmentos são cuidadosamente dissolvidos em um segundo detergente. A mistura resultante das proteínas da membrana interna é resolvida, através de cromatografia de troca iônica, nos diferentes complexos (I até IV) da cadeia respiratória, cada um com sua composição protéica única (ver Tabela 19-3) e, a enzima ATP sintase (algumas vezes chamada de complexo V). Os complexos (I a IV) isolados catalisam as transferências entre doadores (NADH e succinato), transportadores intermediários (Q e citocromo c) e O2, conforme mostrado. In vitro, a ATP sintase apresenta apenas a atividade de hidrólise do ATP (ATPase) mas não a de síntese do ATP.
tabela 19-3 Componentes protéicos da cadeia de transferência de elétrons da mitocôndria
Complexo enzimático
Massa (kDa)
I NADH desidrogenase
subunidades*
Grupo prostético
42 (14)
FMN, Fe-S
140 c 250
5 1
FAD, Fe-S Heme, Fe-S
oxidorredutase
13
1
Heme
Citocromo c† IV Citocromo oxidase
160
13 (3-4)
Hemes,
II Succinato desidrogenase III Ubiquinona: citocromo
850
Número de
CuA, CuB
11
*Número de subunidades em bactéria entre parênteses. †
Citocromo c não é parte de um complexo enzimático, mas se move livremente entre os
complexos III e IV como uma proteína solúvel.
Complexo I: NADH até ubiquinona – A Figura 19-8 ilustra a relação entre os complexos I,
II e a ubiquinona. O complexo I, também chamado de NADH: ubiquinona oxidorredutase, é uma grande molécula de enzima composta por 42 cadeias polipeptídicas diferentes, incluindo uma flavoproteina ligada a FMN e pelo menos seis centros Fe-S (Tabela 19-3). A microscopia eletrônica de alta resolução mostra que o complexo I tem a forma de L, com um braço do L na membrana e o outro prolongando-se em direção da matriz. Conforme mostrado na Figura 19-9, o complexo I catalisa simultânea e obrigatoriamente dois processos acoplados: (1) a transferência exergônica de um íon hidreto do NADH para a ubiquinona e um próton da matriz: NADH + H+ + Q ∀ NAD+ + QH2
(19-1)
e (2) a transferência endergônica de quatro prótons da matriz para o espaço intermembranoso. Entretanto, o complexo I é uma bomba de próton movida pela energia da transferência de elétrons e, a reação que ela catalisa é vetorial : ela movimenta os prótons em uma direção específica de um local (a matriz, que se torna negativamente carregada com a saída de prótons) para outro (o espaço intermembranoso, que se torna positivamente carregado). Para enfatizar natureza vetorial do processo, a reação global geralmente é escrita com subscritos que indicam a localização dos prótons: P para o lado positivo da membrana interna (o espaço intermembranoso), N para o lado negativo (a matriz). NADH + 5H+ N + Q ∀ NAD+ + QH2 + 4 H+P
(19-2)
O amital (uma droga barbitúrica), a rotenona (um produto vegetal comumente usado como inseticida) e a piericidina (um antibiótico) inibem o fluxo de elétrons dos centros Fe-S do complexo I para a ubiquinona (Tabela 19-4) e por isso bloqueia todo o processo de fosforilação oxidativa. O ubiquinol (QH2, a forma completamente reduzida, Figura 19-2) difunde-se na membrana interna, do complexo I até o complexo III, onde é oxidado a Q em um processo que envolve o movimento de prótons para o lado externo (da matriz para o citosol).
Complexo II: succinato até ubiquinona – No Capítulo 15 encontramos o complexo II com
o nome de succinato desidrogenase; a única enzima do ciclo de Krebs que é ligada à
12
membrana. Embora menor e mais simples que o complexo I, ele contém dois tipos de grupos prostéticos e pelo menos quatro proteínas diferentes (Tabela 19-3). Uma proteína possui um FAD ligado covalentemente e um centro Fe-S com quatro átomos de Fe; uma segunda proteína ferro-enxofre também está presente (ver frontispício). Os elétrons passam do succinato para o FAD e então, através dos centros Fe-S, para a ubiquinona (Fig. 19-8).
figura 19-8 Via dos elétrons do NADH, succinato, acil-CoA graxo e glicerol-3-fosfato até a ubiquinona. Elétrons do NADH passam por uma flavoproteína e uma série de proteínas
ferro-enxofre (no complexo I) e depois vão para Q. Os elétrons do succinato passam por uma flavoproteína e vários centros Fe-S (no complexo II) em seu caminho para Q. O glicerol-3fosfato doa elétrons para uma flavoproteína (glicerol-3-fosfato desidrogenase) na superfície externa da membrana mitocondrial interna, da qual eles passam para Q. A acil-CoA desidrogenase (a primeira enzima na β-oxidação) transfere os elétrons para a flavoproteína transferidora de elétrons (ETF). A partir daí, os elétrons passam para Q via ETF-ubiquinona oxidorredutase.
figura 19-9 NADH:ubiquinona oxidorredutase (complexo I) . O complexo I catalisa a transferência de
um íon hidreto do NADH para o FMN, do qual dois elétrons passam através de uma série de centros Fe-S para a proteína ferro-enxofre N-2 no braço da matriz do complexo. A transferência de elétrons da N-2 para a ubiquinona no braço da membrana forma QH 2, que difunde para a bicamada lipídica. Ela também dirige a expulsão de quatro prótons por par de elétrons, da matriz. O mecanismo detalhado que acopla a transferência de elétrons e prótons no complexo I ainda não é conhecida mas, provavelmente envolve um ciclo Q similar àquele no complexo III onde QH 2 participa duas vezes por par de elétron (ver Fig. 19-11). Este fluxo de prótons produz um potencial eletroquímico através da membrana mitocondrial interna (lado N negativo, lado P positivo), que conserva alguma energia liberada pelas reações de transferência de prótons. Este potencial eletroquímico dirige a síntese de ATP.
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Outros substratos para as desidrogenases mitocondriais também passam elétrons para a cadeia respiratória ao nível da ubiquinona, mas não através do complexo II. A primeira etapa na β-oxidação dos acil-CoA graxo, catalisada pela flavoproteína acil-CoA desidrogenase, envolve a transferência de elétrons do substrato para o FAD da
desidrogenase, depois para uma flavoproteína transferidora de elétrons (FTE) que, por sua vez passa seus elétrons para a FTE-ubiquinona oxidorredutase (Fig. 19-8). Esta enzima, passa os elétrons para a cadeia respiratória reduzindo a ubiquinona. O glicerol-3-fosfato, formado através da liberação do glicerol devido à degradação dos triacilglicerois ou através da redução da diidroxiacetona formada na via glicolítica, é oxidado pela glicerol-3-fosfato desidrogenase (veja Fig. 17-4). Esta enzima é uma flavoproteína localizada na superfície
externa da membrana mitocondrial interna e, tal como a succinato desidrogenase e a acilCoA desidrogenase, ela canaliza elétrons para a cadeia respiratória reduzindo a ubiquinona (Fig. 19-8). O importante papel da glicerol-3-fosfato desidrogenase em transportar equivalentes redutores do NADH citosólico para a matriz mitocondrial será descrito posteriormente (ver Fig. 19-27). O efeito de cada uma destas enzimas transferidoras de elétrons é contribuir para o reservatório de ubiquinona reduzida. A QH 2 de todas estas reações é reoxidada pelo complexo III, o componente seguinte da cadeia de transferência de elétrons da mitocôndria.
tabela 19-4 Alguns agentes que interferem com a fosforilação oxidativa e a fotofosforilação Tipo de interferência
Inibição elétrons
da
transferência
Composto
de Cianeto Monóxido de carbono Antimicina A
Alvo/modo de ação
Inibe a citocromo oxidase Bloqueia a transferência de
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elétrons do citocromo b para o citocromo c Mixotiazol
Impede a transferência de
Rotenona
elétrons do centro Fe-S para a
Amital
Inibição da ATP sintase
ubiquinona
Piericidina A DCMU
Compete com QB pelo sítio de
Aurovertina
ligação em FSIII Inibe F1
Oligomicina
Inibe Fo e CFo
Venturicidina DCCD
Bloqueia o fluxo de prótons
Desacoplamento da fosforilação da FCCP
através de Fo e CFo Carregadores hidrofóbicos de
transferência de elétrons
DNP Valinomicina
prótons
Termogenina
Forma poros condutores de
Ionóforo para K+ prótons na membrana interna nas mitocôndrias de tecido gorduroso marron
Inibição da troca ATP-ADP
Atractilosídeo
Inibe a adenina nucleotídeo translocase
Complexo III: ubiquinona até citocromo c – O complexo III, o próximo
complexo
respiratório e também chamado de complexo dos citocromos bc1 ou ubiquinona-citocromo c oxidorredutase,
acopla a transferência de elétrons do ubiquinol (QH 2) para o citocromo c
com o transporte vetorial de prótons da matriz para o espaço intermembranoso. A determinação das estruturas desse enorme complexo (Fig. 19-10) e do complexo IV (abaixo) através de cristalografia de raios X em 1995-1998 foram marcos no estudo da transferência de elétrons mitocondriais, propiciando a armação estrutural para integrar as inúmeras observações bioquímicas sobre a função dos complexos.
figura 19-10
15
Complexo do citocromo bc1 (complexo III) . O complexo é um dímero de monômeros
idênticos, cada um deles com 11 subunidades diferentes. (a) Estrutura do monômero. O centro funcional é formado por três subunidades: o citocromo b (verde) com seus dois hemes (bH e bL; vermelho claro), a proteína ferro-enxofre Rieske (púrpura) com seu centro 2Fe-2S (amarelo) e o citocromo c1 (azul) com seu heme (vermelho). (b) A unidade funcional dimérica. O citocromo c1 e a proteina ferro-enxofre Rieske se projetam a partir da superfície P e podem interagir com o citocromo c (mostrado aqui, mas não como parte do complexo funcional) no espaço intermembranoso. O complexo apresenta dois sítios de ligação distintos para a ubiquinona, Q N e QP, que correspondem aos sítios de inibição por duas drogas que bloqueiam a fosforilação oxidativa. A antimicina A, que bloqueia o fluxo de elétrons do heme bH para Q, se liga a Q N, próximo ao heme bH no lado N (matriz) da membrana. O mixotiazol, que impede o fluxo de elétrons de QH 2 para a proteína ferro-enxofre Rieske, se liga a QP, próximo ao centro 2Fe-2S e ao heme bL no lado P da membrana. A estrutura dimérica é essencial para o funcionamento do complexo III. A interface entre os monômeros forma duas cavidades, cada uma contendo um sítio Q P de um monômero e um sítio Q N do outro. O movimento dos intermediários da ubiquinona ocorre dentro dessas cavidades protegidas. O complexo III se cristaliza em duas conformações distintas (não mostradas). Em uma delas, o centro ferro-enxofre Rieske está próximo do seu aceptor de elétrons, o heme do citocromo c1, mas relativamente distante do citocromo b e do sítio de ligação QH 2, através do qual ele recebe os elétrons. Na outra configuração, o centro Fe-S se afastou do citocromo c1 em direção ao citocromo b. Acredita-se que a proteína Rieske oscila entre estas duas conformações onde ela é primeiramente reduzida e depois oxidada. Baseado na estrutura do complexo III e nos estudos bioquímicos detalhados da reações redox, foi proposto um modelo razoável para a passagem dos elétrons e prótons através deste complexo. A equação global para as reações redox deste ciclo Q (Fig. 19-11) é: QH2 + 2 cit c1(oxidado) + 2H+ N ∀ Q + 2 cit c1(reduzido) + 4H+P
(19-3)
O ciclo Q acomoda o comutador entre o carregador de elétrons (ubiquinona) e os carregadores de um elétron (citocromos b562, b566 e c1) e explica a estequiometria de quatro prótons translocados por par de elétrons que passa através do complexo, para o citocromo c. Embora o caminho dos elétrons através deste segmento da cadeia respiratória é complicado, o efeito global da transferência é simples: QH 2 é oxidado a Q e duas moléculas de citocromo c são reduzidas.
16
O citocromo c (Fig. 6-18) é uma proteína solúvel do espaço intermembranoso. Após o seu único heme aceitar um elétron do complexo III , o citocromo c se move em direção do complexo IV para doar o elétron para um centro de cobre binuclear nesta enzima.
figura 19-11 O ciclo Q. O caminho dos elétrons através do complexo III é mostrado pelas setas azuis. No
lado P da membrana, duas moléculas de QH 2 são oxidadas até Q no sítio Q P, liberando quatro prótons no espaço intermembranoso. Cada QH 2 doa um elétron (via centro Fe-S Rieske) ao citocromo c1 e um elétron (via citocromo b) para a molécula de Q no sítio Q N, reduzindo-o em duas etapas a QH 2. Esta redução também utiliza dois prótons captados da matriz.
Complexo IV: Citocromo c até O2 – No passo final da cadeia respiratória, o complexo IV,
também chamado citocromo oxidase, transporta dois elétrons do citocromo c para o oxigênio molecular, reduzindo-o a H 2O. O complexo IV é uma proteína grande (13 subunidades; Mr 204.000) da membrana mitocondrial interna. As bactérias apresentam uma forma mais simples, com somente três ou quatro subunidades, mas ainda capaz de catalisar tanto a transferência de elétrons como o bombeamento de prótons. A comparação dos complexos da mitocôndria e da bactéria sugere que três subunidades são críticas para a função (Fig. 19-12). A subunidade II mitocondrial contém dois íons cobre complexados aos grupos –SH de dois resíduos de Cis em um centro binuclear (Cu A) (Fig. 19-12b) que lembram as proteínas de centros 2Fe-2S. A subunidade I contém dois grupos heme designados a e a3 e um outro íons cobre (Cu B). O heme a 3 e o CuB formam um segundo centro binuclear que aceita elétrons do heme a e então os transfere para o O 2 ligado ao heme a3. A transferência de elétrons através do complexo IV ocorre do citocromo c para o centro CuA, do heme a para o heme a3-centro CuB e, finalmente para o O 2 (Fig. 19-13). Para cada quatro elétrons que passam através deste complexo, a enzima consome quatro “substratos” H+ da matriz (lado N) convertendo o O 2 em 2 H2O. Ela também usa a energia desta reação redox para bombear um próton para o espaço intermembranoso (lado P) para cada elétron transportado, aumentando o potencial eletroquímico produzido pelo transporte de prótons, induzido pelas reações redox, através dos complexos I e III. A reação global catalisada pelo complexo IV é: 4 cit c(reduzido) + 8H+ N + O2 ∀ 4 cit c(oxidado) + 4H+P + 2H2O
(19-4)
17
Esta redução de quatro elétrons do O 2 envolve centros redox que transportam apenas um elétron de cada vez e, ela deve ocorrer sem gerar intermediários incompletamente reduzidos, tais como o peróxido de hidrogênio ou radicais hidroxila livres, que são espécies muito reativas que podem danificar os componentes celulares. Os intermediários permanecem fortemente ligados ao complexo até serem completamente convertidos em água.
figura 19-12 Subunidades críticas da citocromo oxidase (complexo IV). É mostrado o complexo
bovino. (a) O centro do complexo IV apresenta três subunidades. A subunidade I (amarela) tem dois grupos heme, a e a3 (vermelho) e um íon cobre, Cu B (esfera verde). O heme a3 e o CuB formam um centro Fe-Cu binuclear. A subunidade II (azul) contém dois íons Cu (esferas verdes) complexadas com os grupos –SH de dois resíduos de Cis em um centro binuclear, CuA, que se assemelha aos centros 2Fe-2S das proteínas ferro-enxofre. Este centro binuclear e o sítio de ligação do citocromo c estão localizados em um domínio da subunidade II que se projeta do lado P da membrana interna para o espaço intermembranoso. A subunidade III (verde claro) aparentemente é essencial para o funcionamento do complexo IV, mas o seu papel não é bem conhecido. (b) O centro binuclear do Cu A. Os íons Cu (esferas verdes) compartilham igualmente os elétrons. Quando o centro é reduzido, eles apresentam cargas formais Cu1+Cu1+ e quando oxidados, Cu 1,5+Cu1,5+. Os ligante ao redor dos íons Cu incluem duas His (azul escuro), duas Cis (amarelo), um Asp (vermelho) e uma Met (alaranjado).
figura 19-13 O caminho dos elétrons através do complexo IV . As três proteínas críticas para o fluxo
dos elétrons são I, II e III. O contorno mais claro inclui as outras dez proteínas do complexo. A transferência de elétrons através do complexo IV começa quando cada uma das duas moléculas de citocromo c reduzido doam um elétron para o centro binuclear Cu A. Os elétrons então passam, através do heme a, para o centro Fe-Cu (citocromo a3 e CuB). O oxigênio então se liga ao heme a3 e é reduzido até seu derivado peróxido (O 22-) por dois elétrons do centro Fe-Cu. A liberação de mais dois elétrons do citocromo c converte o O22- em duas moléculas de água, consumindo quatro “substratos” prótons da matriz. Simultaneamente, quatro outros prótons são bombeados da matriz através de um mecanismo ainda desconhecido.
figura 19-14
18
Resumo do fluxo de elétrons e prótons através dos quatro complexos da cadeia respiratória. Os elétrons alcançam Q através dos complexos I e II. QH 2 funciona como um
transportador móvel de elétrons e prótons. Ela transfere elétrons para o complexo III, que os transfere para uma outra conexão móvel, o citocromo c. O complexo IV transfere então os elétrons do citocromo c reduzido para o O 2. O fluxo de elétrons através dos complexos I, III e IV é acompanhado por um fluxo de prótons da matriz para o espaço intermembranoso. Lembrar que os elétrons da β-oxidação dos ácidos graxos também podem entrar na cadeia respiratória através de Q (ver Fig. 19-8).
A energia da transferência dos elétrons é conservada eficientemente em um gradiente de prótons
A transferência de dois elétrons do NADH, através da cadeia respiratória, para o oxigênio molecular pode ser escrita como: NADH + H+ + ½ O2 ∀ NAD+ + H2O
(19-5)
Esta reação global é altamente exergônica. Para o par redox NAD +/NADH, E’o é –0,320V e, para o par O2/H2O, E’o é 0,816V. Portanto, o ∆E’o para esta reação é +1,14V e, a variação de energia livre padrão (Eq.14-5) é: ∆ Go’ = –nF∆E’o
= (–2)(96,5kJ/V.mol)(1,14V)
(19-6)
= – 220 kJ/mol (de NADH) Essa mudança de energia livre padrão é baseada na consideração de que as concentrações de NADH e NAD+ são iguais (1 M). Na mitocôndria que respira ativamente, a ação de várias desidrogenases mantém a relação NADH/NAD + acima da unidade e, a verdadeira mudança de energia livre para a reação mostrada na Eq. 19-5 é de fato, substancialmente maior (mais negativa) que –220 kJ/mol. Um cálculo semelhante para a oxidação do succinato mostra que a transferência de elétrons do succinato ( E ’o do fumarato/succinato = 0,031V) para o O 2 tem uma variação de energia livre padrão menor, mas ainda negativa, da ordem de –150 kJ/mol. A maior parte dessa energia é usada para bombear os prótons para fora da matriz. Para cada par de elétrons transferidos para o O 2, quatro prótons são bombeados para fora pelo complexo I, quatro pelo complexo III e dois pelo complexo IV (Fig. 19-14). Portanto, a equação vetorial para o processo é: NADH + 11 H+ N + ½ O2 ∀ NAD+ + 10 H+P + H2O (19-7)
19
A energia eletroquímica inerente a essa diferença na concentração de prótons e separação de cargas representa uma conservação temporária da maior parte da energia da transferência dos elétrons. A energia armazenada nesse gradiente, denominada força próton motriz , apresenta dois componentes: (1) a energia potencial química devido a diferença na
concentração de uma espécie química (H +) em duas regiões separadas pela membrana e, (2) a energia potencial elétrica que resulta da separação de carga quando um próton se move através da membrana sem um contra íon (Fig. 19-15).
figure 19-15 Força próton motriz . A membrana interna da mitocôndria separa dois compartimentos de
diferente [H+], resultando em diferenças na concentração química ( ∆ pH) e distribuição de carga (∆ψ ) através da membrana. O efeito global é a força próton motriz ( ∆G) que pode ser calculada como mostrado. Isto é explicado com mais detalhes no texto.
Conforme mostrado no Capítulo 12, a mudança de energia livre para a criação de um gradiente eletroquímico por uma bomba de íons é: ∆G= -RT ln (C2/C1) + ZF∆ψ
(19-8)
onde C2/C1 é a razão entre as concentrações para o íon que se desloca; Z é o valor absoluto da sua carga (1 para o próton) e ∆ψ é a diferença de potencial elétrico transmembrana, dada em volts. Para prótons a 25oC, ln (C2/C1)= 2,3(log [H+]P - log [H+] N)= 2,3(pH N - pHP)= 2,3 ∆ pH e a Eq, 19-8 se reduz a: ∆G= - 2,3 RT ∆ pH + F∆ψ
(19-9)
=(5,70 kJ/mol) ∆ pH + (96,5 kJ/mol) ∆ψ Em uma mitocôndria que respira ativamente, o ∆ψ medido é 0,15-0,2 V e o pH da matriz é cerca de 0,75 unidades mais alcalino que o do espaço intermembranoso, de tal modo que a mudança de energia livre calculada para bombear prótons para fora é da ordem de + 20 kJ/mol (de H+), a maior parte da qual é proveniente da porção elétrica do potencial eletroquímico. Uma vez que a transferência de dois elétrons do NADH para o O 2 é acompanhada pelo bombeamento para fora de 10 H + (Eq. 19-7) aproximadamente 200 kJ
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dos 220 kJ liberados pela oxidação de um mol de NADH, são conservados no gradiente de prótons. Quando os prótons se deslocam espontaneamente a favor do seu gradiente eletroquímico, a energia é disponibilizada para produzir trabalho. Nas mitocôndrias, cloroplastos e bactérias aeróbicas, a energia eletroquímica no gradiente de prótons direciona a síntese de ATP a partir de ADP e Pi. Nós voltaremos à energética e à estequiometria da síntese de ATP direcionada pelo potencial eletroquímico no gradiente de prótons, posteriormente neste capítulo.
As mitocôndrias das plantas têm mecanismos alternativos para oxidar o NADH
A mitocôndrias das plantas fornecem ATP durante os períodos de baixa iluminação ou escuridão através de mecanismos inteiramente análogos aqueles usados pelos organismos não fotossintéticos. Na luz, a principal fonte de NADH mitocondrial é a reação onde a glicina produzida pela fotorespiração é convertida em serina (Fig. 20-39): 2 Glicina + NAD+ ∀ serina + NADH + H+ + CO2 + NH+4 Por razões discutidas no Capítulo 20, as plantas devem efetuar esta reação mesmo quando não têm necessidade de usar NADH para produzir ATP. Para regenerar o NAD + a partir de NADH desnecessário, a mitocôndria das plantas transfere elétrons do NADH diretamente para a ubiquinona e da ubiquinona diretamente para o O 2, desviando-os dos complexos III e IV e suas bombas de prótons. A energia em NADH é dissipada na forma de calor, que algumas vezes pode ser de valor para a planta (Adendo 19-1). Contrariamente à citocromo oxidase (complexo IV), a QH 2 oxidase alternativa não é inibida por cianeto. A oxidação do NADH resistente ao cianeto, é de fato uma marca característica dessa via de transporte de elétrons em plantas.
Adendo 19-1 Vias Respiratórias Alternativas e Calor, Plantas mal cheirosas
Muitas plantas floridas atraem insetos polinizadores liberando moléculas odoríferas que mimetizam uma fonte de alimento natural de insetos ou locais potenciais de postura de ovos. As plantas polinizadas por moscas ou escaravelhos que normalmente ali se alimentam ou põem seus ovos em esterco ou carne podre, algumas vezes usam compostos com mau cheiro para atrair esses insetos. Uma família de plantas malcheirosas é a Araceae, que inclui os filodendros, os copos-de-lírio e de uma espécie de couve mau cheirosa. Essas plantas apresentam folhas
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delgadas densamente empacotadas em uma estrutura ereta chamada espádice, rodeada por uma folha modificada chamada espata. A espádice libera odores de carne putrefata ou esterco. Antes da polinização a espádice também se aquece, em muitas espécies de 20 até 40°C acima da temperatura ambiente. A produção de calor (termogênese) ajuda a evaporação das moléculas odoríferas para uma melhor dispersão. Como a carne putrefata e o esterco são geralmente quentes devido ao metabolismo hiperativo dos micróbios carniceiros, o próprio calor também pode atrair insetos. No caso da couve mau cheirosa (Fig.1), que floresce no final do inverno ou no começo da primavera quando a neve ainda cobre o solo, a termogênese permite que a espádice cresça através da neve. Como esta espécie de couve aquece sua espádice ? Embora as mitocôndrias das plantas, fungos e eucariotos unicelulares apresentam sistemas de transporte de elétrons que são essencialmente os mesmos que os dos animais, elas apresentam uma via respiratória alternativa. Nesta via, a QH 2 que é resistente ao cianeto, transfere os elétrons do reservatório de ubiquinona diretamente para o oxigênio, desviando-os das duas vias de translocação de prótons dos complexos III e IV (Fig. 2). A energia que poderia ser conservada como ATP é liberada como calor. A mitocôndria das plantas também apresenta uma NADH desidrogenase alternativa que é insensível à rotenona, um inibidor do complexo I (ver Tabela 19-4), que transfere elétrons do NADH na matriz diretamente para a ubiquinona, desviandoos do complexo I e seu associado bombeamento de prótons. As mitocôndria das plantas apresentam ainda uma outra NADH desidrogenase, na face externa da membrana interna, que fica defronte ao espaço intermembranoso e transfere os elétrons do NADPH ou NADH para a ubiquinona, desviando-os novamente do complexo I. Assim, quando os elétrons entram na via respiratória alternativa através da NADH desidrogenase insensível a rotenona, a NADH desidrogenase externa, ou succinato desidrogenase (complexo II) e passam para o O2 via oxidase alternativa resistente ao cianeto, a energia não é conservada como ATP, mas liberada como calor. A couve mau cheirosa pode usar o calor para derreter a neve, produzir um fedor podre ou atrair escaravelhos ou moscas. figura 1
Espécie de couve oriental mau cheirosa figura 2
Carregadores de elétrons da membrana interna da mitocôndria das plantas. Os elétrons podem fluir através dos complexos I, III e IV, como na mitocôndria dos animais ou através de carregadores alternativos específicos de plantas pelas vias mostradas com setas azuis.
A Síntese de ATP
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Como o gradiente de concentração de prótons é transformado em ATP ? Vimos que a transferência de elétrons libera e, a força próton motriz conserva energia livre mais que suficiente (cerca de 200 kJ) por ‘mol’ de pares de elétrons para formar um mol de ATP que requer 50 kJ (veja Adendo 14-2). Portanto, a fosforilação oxidativa mitocondrial não representa nenhum problema termodinâmico. Vamos agora considerar o mecanismo químico que acopla o fluxo de elétrons com a fosforilação. O modelo quimiosmótico proposto por Peter Mitchell é o paradigma para este mecanismo. De acordo com o modelo (Fig. 19-6), a energia eletroquímica inerente da diferença na concentração de prótons e da separação de cargas através da membrana mitocondrial interna, a força próton motriz, dirige a síntese de ATP à medida que os prótons fluem passivamente de volta para a matriz através de um poro de prótons associado à ATP sintase. Para enfatizar esse papel crucial da força próton motriz, a equação da síntese do ATP é dada por: ADP + Pi + nH+P ∀ ATP + H2O + nH+ N
(19-10)
Peter Mitchel 1920-1992
A definição operacional de “acoplamento” é mostrada na Figura 19-17. Quando mitocôndrias isoladas são suspensas em uma solução tampão contendo ADP, Pi e um substrato oxidável como o succinato, ocorrem três processos facilmente mensuráveis: (1) o substrato é oxidado (succinato produz fumarato), o O 2 é consumido e (3) o ATP é sintetizado. O consumo de oxigênio e a síntese de ATP dependem da presença de um substrato oxidável (neste caso, o succinato) bem como de ADP e Pi.
figura 19-16 O modelo quimiosmótico. Nesta representação simples da teoria quimiosmótica aplicada à
mitocôndria, os elétrons do NADH e outros substratos oxidáveis passam através de uma cadeia de carregadores arranjados simetricamente na membrana interna. O fluxo de elétrons é acompanhado por uma transferência de prótons através da membrana produzindo um gradiente químico ( ∆ pH) e um gradiente elétrico ( ∆ψ ). A membrana interna da mitocôndria é impermeável aos prótons e eles podem voltar para a matriz somente através de canais específicos para prótons (F o). A força próton motriz que direciona os prótons de volta para a matriz propicia a energia para a síntese de ATP que é catalisada pelo complexo F 1 associado a Fo.
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figura 19-17 Acoplamento da transferência de elétrons e síntese de ATP na mitocôndria . Em
experimentos para demonstrar o acoplamento, as mitocôndria são suspensas em um meio tamponado e um eletrodo de O 2 é usado para monitorar o consumo de O 2. Em intervalos de tempo determinados, são removidas amostras que são analisadas para se verificar a presença de ATP. (a) A adição de apenas ADP e Pi resulta em um pequeno ou nenhum aumento tanto da respiração (consumo de O 2, preto) como da síntese de ATP (vermelho). Quando o succinato é adicionado, a respiração começa imediatamente e o ATP é sintetizado. A adição de cianeto (CN – ), que bloqueia a transferência de elétrons entre a citocromo oxidase e o O 2, inibe tanto a respiração quanto a síntese de ATP. ( b) Mitocôndrias supridas com succinato respiram e sintetizam ATP apenas quando o ADP e o P i forem adicionados. A adição subseqüente de venturicidina ou oligomicina, inibidores da ATP sintase, bloqueia tanto a síntese de ATP quanto a respiração. O dinitrofenol (DNP) é um desacoplador e permite que a respiração continue sem a síntese de ATP. Como a energia da oxidação do substrato dirige a síntese do ATP na mitocôndria, não é inesperado que inibidores do transporte de elétrons para o O 2 (cianeto, monóxido de carbono, antimicina A) bloqueiem a síntese de ATP (Fig. 19-17a). Mais surpreendente é o achado de que o inverso também é verdade: inibição da síntese de ATP bloqueia a transferência de elétrons na mitocôndria intacta. Este acoplamento obrigatório pode ser demonstrado em mitocôndrias isoladas suprindo-as de O 2 e substratos oxidáveis, mas não ADP (Fig. 19-17b). Nestas condições não ocorre nenhuma síntese de ATP e a transferência de elétrons para o O 2 não acontece. O acoplamento da oxidação e fosforilação também pode ser demonstrado usando-se oligomicina ou veturicidina, antibióticos tóxicos, que se ligam à ATP sintase na mitocôndria. Estes compostos são potentes inibidores da síntese de ATP e da transferência de elétrons através da cadeia de carregadores para o O 2 (Fig. 19-17b). Como já é conhecido que a oligomicina não interage diretamente com os carregadores de elétrons, mas somente com a ATP sintase, a transferência de elétrons e a síntese de ATP são obrigatoriamente acopladas, isto é, uma não ocorre sem a outra. A teoria quimiosmótica explica prontamente a dependência da síntese de ATP na mitocôndria do transporte de elétrons. Quando o fluxo de prótons para o interior da matriz, através do canal de prótons da ATP sintase é bloqueado (com oligomicina por exemplo), não existe nenhum caminho para o retorno dos prótons para a matriz e, a contínua extrusão de prótons provocada pela atividade da cadeia respiratória gera um grande gradiente de prótons. A força próton motriz aumenta até que o custo (energia livre) do bombeamento de prótons
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para fora da matriz contra esse gradiente se iguale ou exceda a energia liberada pela transferência dos elétrons do NADH para o O 2. Neste ponto, o fluxo de elétrons cessa, a energia livre do processo de fluxo de elétrons acoplado ao bombeamento de prótons torna-se zero e o equilíbrio é estabelecido. Entretanto, certas condições e reagentes podem desacoplar a oxidação da fosforilação. Quando mitocôndrias intactas são rompidas com detergentes ou cisalhamento físico, os fragmentos de membrana resultantes ainda podem catalisar a transferência de elétrons do succinato ou NADH para o O 2 mas nenhuma síntese de ATP é acoplada a esta respiração. Certos compostos químicos causam o desacoplamento sem romper a estrutura mitocondrial. Entre os desacopladores químicos estão incluídos o 2,4-dinitrofenol (DNP) e a carbonilcianeto-p-trifluormetoxi fenilhidrazina (FCCP) (Tabela 19-4; Fig. 19-18), ambos ácidos fracos com propriedades hidrofóbicas. A hidrofobicidade destes compostos permite que eles se difundam rapidamente através da membrana da mitocôndria. Após entrarem na matriz mitocondrial na forma protonada, eles podem liberar um próton, dissipando assim o gradiente de prótons. Ionóforos tais como a valinomicina (ver Fig. 12-37; tabela 19-4) permitem que íons inorgânicos passem facilmente através das membranas. Os ionóforos desacoplam a transferência de elétrons da fosforilação oxidativa dissipando a contribuição elétrica do gradiente eletroquímico através da membrana da mitocôndria.
figura 19-18 Dois desacopladores químicos da fosforilação oxidativa . Tanto o DNP como o FCCP
possuem um próton dissociável e são muito hidrofóbicos. Eles carregam prótons através da membrana mitocondrial interna, dissipando o gradiente de prótons. Eles também desacoplam a fotofosforilação (pág. xxx). Se o papel da transferência de elétrons na síntese de ATP mitocondrial é apenas bombear prótons para criar o potencial da força próton motriz, um gradiente de prótons criado artificialmente deveria ser capaz de substituir a transferência de elétrons para dirigir a síntese de ATP. Essa predição do modelo quimiosmótico foi testada e confirmada experimentalmente (Fig. 19-19). Mitocôndria manipuladas de modo a se impor uma diferença de concentração de prótons e uma separação de cargas através da membrana interna sintetizam ATP na ausência de um substrato oxidável . A força próton motriz sozinha é suficiente para conduzir a síntese de ATP.
figura 19-19
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Evidência do papel do gradiente de próton na síntese
de ATP. Um gradiente
eletroquímico imposto artificialmente comanda a síntese de ATP na ausência de um substrato oxidável como um doador de elétrons. Neste experimento de duas etapas, mitocôndrias isoladas são inicialmente incubadas em um tampão de pH 9 contendo KCl 0,1 M. (a) Um lento vazamento do tampão e do KCl para o interior da mitocôndria eventualmente provoca um equilíbrio da matriz com o meio circunvizinho. Não estão presentes quaisquer substratos oxidáveis. (b) As mitocôndrias são agora separadas do tampão de pH 9 e ressuspensas em um tampão de pH 7 contendo valinomicina mas não KCl. A mudança de tampão cria uma diferença de duas unidades de pH através da membrana interna da mitocôndria. O fluxo de K + para fora, sem o seu contraíon e contra o seu gradiente de concentração, promovido pela valinomicina cria um desbalanceamento de cargas através da membrana (matriz negativa). A soma do potencial químico, devido à diferença de pH, com o potencial elétrico, devido à separação de cargas, é uma força próton motriz suficientemente grande para suportar a síntese de ATP na ausência de um substrato oxidável.
Efraim Racker 1913-1991
A ATP sintase tem dois domínios funcionais, F o e F1
A ATP sintase mitocondrial é uma ATPase do tipo F (veja Fig. 12-31c; Tabela 12-4), similar na estrutura e mecanismo às ATP sintases de cloroplastos e bactérias. Esse grande complexo enzimático da membrana mitocondrial interna catalisa a formação de ATP a partir de ADP e Pi acompanhado do fluxo de prótons do lado P para o N da membrana (Eq. 19-10). A ATP sintase, também chamada complexo V, apresenta dois componentes distintos: F 1, uma proteína periférica de membrana e F o que é uma proteína integral de membrana. A letra o
subscrita em Fo significa sensível à oligomicina. F 1 foi o primeiro fator identificado como
essencial para a fosforilação oxidativa. Ele foi identificado e purificado a partir da membrana mitocondrial interna por Efraim Racker e seus colegas no início dos anos 60. In vitro, pequenas vesículas formadas a partir da membrana mitocondrial interna promovem a síntese de ATP acoplada à transferência de elétrons. Quando F 1 é extraído cuidadosamente dessas vesículas, as vesículas “despojadas” ainda contém as cadeias respiratórias intactas e a porção Fo da ATP sintase. Estas vesículas podem catalisar a transferência de elétrons do NADH para o O2 mas não podem produzir um gradiente de prótons: F o apresenta um poro de prótons através do qual esses prótons vazam tão rapidamente quanto são bombeados pela transferência de elétrons e, sem um gradiente de prótons as vesículas desprovidas do
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componente F1 não podem fazer ATP. Isoladamente, o componente F 1 catalisa a hidrólise do ATP (o reverso da síntese) e por isso foi originalmente chamado F1ATPase. Quando purificado e adicionado às vesículas “despojadas” ele se reassocia com o componente F o fechando seu poro de prótons e restaurando a capacidade da membrana de acoplar a transferência de elétrons e a síntese de ATP.
O ATP é estabilizado em relação ao ADP, na superfície de F 1
Experimentos de troca isotópica usando F 1 purificado revela um fato notável sobre o mecanismo catalítico da enzima: na sua superfície, a reação ADP + P i ∆ ATP + H2O é rapidamente reversível, isto é, a variação da energia livre para a síntese de ATP é próxima de zero ! Quando o ATP é hidrolisado por F 1 (o reverso da síntese de ATP) em água marcada com 18O, o Pi que é formado apresenta o átomo 18O. Medidas cuidadosas do teor de 18O no Pi formado in vitro pela hidrólise enzimática do ATP catalisada pela F 1 revelam que o P i contém não um mas três ou quatro átomos de
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O (Fig. 19-20). Isto indica que a ligação
pirofosfato terminal do ATP é quebrada e refeita repetidamente antes que o P i deixe a superfície da enzima. Com o P i livre para se movimentar em seu sítio de ligação, cada hidrólise insere ao acaso o 18O em cada uma das quatro posições no P i. Esta reação de troca ocorre nos complexos F oF1 não energizados (sem nenhum gradiente de prótons) e com o complexo F1 isolado pois não requer aplicação de energia.
figura 19-20 Mecanismo catalítico de F 1: experimento de troca com 18O. F1 solubilizado de membrana
mitocondrial é incubado com ATP na presença de água marcada com 18O. Em intervalos de tempo definidos uma mostra é retirada da solução e analisada para a incorporação do
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O no
Pi produzido pela hidrólise do ATP. Em minutos, o P i apresenta três ou quatro 18O indicando que tanto a hidrólise quanto a síntese do ATP ocorreram várias vezes durante o período de incubação. Estudos cinéticos das velocidades de síntese e hidrólise do ATP confirmam a conclusão de que o ∆Go’ para síntese do ATP na enzima é próxima de zero. Através de medidas de velocidade de hidrólise (k 1= 10 s-1) e síntese (k -1= 24 s-1), a constante de equilíbrio calculada para a reação: k 1 Enz-ATP ∆ Enz-(ADP + Pi) k -1
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é: K eq= k -1/ k 1= 24 s-1/10 s-1= 2,4 A partir desta K eq, o ∆Go’ é próximo de zero. Isto contrasta com a K eq da ordem de 105 (∆Go’= - 30,5 kJ/mol) para o ATP livre em solução (não na superfície da enzima). O que explica essa enorme diferença ? A ATP sintase estabiliza o ATP em relação ao ADP + Pi ligando mais fortemente o ATP e liberando energia suficiente para contrabalançar o custo de fazer ATP. Medidas cuidadosas das constantes de ligação mostram que a F oF1 liga o ATP com uma afinidade muito grande (K d ≤ 10-12 M) e o ADP com uma afinidade muito menor (K d ≈ 10-8). Esta diferença no K d corresponde a uma diferença de cerca de 40 kJ/mol na energia de ligação e, essa energia de ligação desloca o equilíbrio na direção da formação do produto ATP.
O gradiente de prótons comanda a liberação de ATP da superfície da enzima
Embora a ATP sintase equilibra o ATP com o ADP + P i sintetizado de novo, o ATP não pode deixar a superfície da enzima na ausência de um gradiente de prótons. É este gradiente de prótons que ajuda a enzima a liberar o ATP formado em sua superfície. O diagrama de coordenadas de reação do processo (Fig. 19-21) ilustra a diferença entre o mecanismo da síntese do ATP e aquele de várias outras enzimas que catalisam reações endergônicas. Para a síntese contínua de ATP, a enzima deve oscilar entre a forma que liga o ATP muito fortemente e a forma que libera o ATP. Estudos químicos e cristalográficos da ATP sintase mostraram a base estrutural para essa alternância de função.
figura 19-21 Diagrama de coordenadas da reação para a ATP sintase e uma enzima típica . Em uma
reação catalisada por uma enzima típica (esquerda) alcançar o estado de transição (‡) entre o substrato e o produto é a maior barreira de energia a ser sobrepujada. Na reação catalisada pela ATP sintase (direita), a liberação do ATP da enzima e não a formação do ATP, é a maior barreira de energia. Embora a mudança de energia livre para a formação do ATP a partir do ADP + P i em solução aquosa, é grande e positiva, a forte ligação do ATP à enzima garante energia de ligação suficiente para levar a energia do ATP ligado à enzima próxima aquela do ADP + P i. Na superfície da enzima, a reação é portanto rapidamente reversível e a constante de equilíbrio é aproximadamente 1. A energia livre requerida para a liberação do ATP é garantida pela força próton motriz.
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John E. Walker
Cada subunidade
da ATP sintase pode assumir três configurações diferentes
A F 1 mitocondrial apresenta nove subunidades de cinco tipos diferentes, com a composição α3β3γδε . Cada uma das três subunidades β apresenta um sítio catalítico para a síntese do
ATP. A determinação cristalográfica da estrutura de F 1 por John E. Walker e colegas, revelou detalhes estruturais muito úteis para explicar o mecanismo catalítico da enzima. A parte de F1 em forma de maçaneta, é uma esfera achatada de 8 mm de altura e 10 mm de espessura, consistindo de subunidades α e β alternadas arranjadas semelhantemente aos gomos de uma laranja (Fig. 19-22a, b, c). Os polipeptídeos que formam o caule na estrutura cristalina de F 1 estão arranjados assimetricamente, com um domínio de uma única subunidade γ que caracteriza uma haste que atravessa F 1 e um outro domínio de γ primariamente associado a uma das três subunidades β, designada β-vazia (Fig. 19-22c). Embora a sequência de aminoácidos das três subunidades β sejam idênticas, as suas conformações são diferentes, em parte devido à associação da subunidade γ com apenas um das três. As estruturas das subunidades δ e ε não foram reveladas nesses estudos cristalográficos. As diferenças conformacionais entre as subunidades β se ampliam para diferenças nos sítios de ligação do ATP/ADP. Quando os pesquisadores cristalizaram a proteína na presença de ADP e App(NH)p, um análogo estrutural muito parecido com o ATP que não pode ser hidrolisado pela atividade ATPase de F 1, o sítio de ligação de uma das três subunidades β foi ocupado pelo App(NH)p, o segundo foi ocupado pelo ADP e o terceiro ficou vazio (Fig. 19-22c). As correspondentes conformações da subunidade β foram designadas β-ATP, β-ADP e β-vazia. Essa diferença na ligação do nucleotídeo entre as três subunidades é crítica para o mecanismo desse complexo. App(NH)p (βγ -imidoadenosina-5’Ligação β-γ não hidrolizável
figura 19-22
trifosfato)
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Complexo da ATP sintase mitocondrial . (a) Estrutura do complexo F 1 deduzida a partir
de estudos cristalográficos e bioquímicos. Na F 1, três subunidades α e três β estão arranjadas como os gomos de uma laranja, com alternância das subunidades α (sombreado cinza) e β (sombreado púrpura) ao redor de uma haste central, a subunidade γ (verde). (b) Estrutura cristalina de F1 vista de lado. Duas subunidades α e uma β foram removidas para mostrar a haste central (subunidade γ ) e os sítios de ligação para o ATP (vermelho) e ADP (amarelo) nas subunidades β. As subunidade δ e ε não estão mostradas aqui. (c) F1 vista por cima (isto é, do lado N da membrana), mostrando as três subunidades α, as três β e a haste central (subunidade γ ). Em cada subunidade β, perto da sua interface com a subunidade α vizinha existe um sítio de ligação para o nucleotídeo que é crítico para a atividade catalítica. A única subunidade γ se associa fundamentalmente com um dos três pares αβ, forçando cada uma das três subunidades β a assumirem conformações ligeiramente diferentes, com diferentes sítios de ligação para nucleotídeos. Na enzima cristalina, uma subunidade ( β-ADP) apresenta o ADP (amarelo) em seu sítio de ligação, a próxima ( β-ATP) contém o ATP (vermelho) e, a terceira (β-vazia) não contém nenhum nucleotídeo ligado. O complexo Fo que constitui o poro de prótons é composta de três subunidades a, b e c em uma proporção ab 2c10-12. A subunidade c é um polipeptídio pequeno (M r 8.000) muito
hidrofóbico, constituído fundamentalmente por duas hélices transmembrana, com uma pequena volta se projetando do lado da matriz na membrana. A estrutura cristalina da F oF1 de levedura, deduzida em 1999, mostra o arranjo das subunidades c. Existem 10 subunidades c nas leveduras, cada uma com duas hélices transmembrana quase perpendiculares ao plano da membrana e arranjadas em dois círculos concêntricos (Fig. 19-22d, e). O círculo interior é composto das hélices amino-terminal de cada subunidade c. O círculo exterior, de cerca de 55 Å de diâmetro, é formado pelas hélices caboxila-terminais. As subunidades ε e γ de F 1 formam uma perna-e-pé que se projeta do fundo (membrana) da F 1 e se apoia firmemente no anel das subunidades c. Um desenho esquemático (Fig. 19-22f) combina a informação estrutural dos estudos da F oF1 bovina e de levedura.
figura 19-22 (continuação) (d) Vista lateral da estrutura da F oF1. Trata-se de uma composição, onde as coordenadas
cristalográficas da F 1 mitocondrial bovina (sombras púrpuras e cinzas) foram combinadas com as da F o mitocondrial de levedura (sombras amarelo e laranja). As subunidades a, b, γ e ε não fazem parte da estrutura cristalina mostrada aqui. (e) Estrutura da FoF1 de levedura
vista a partir do fim na direção do lado P para o lado N. As estruturas maiores visíveis nesta
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seção transversal são as duas hélices transmembranas de cada uma das dez subunidades c arranjadas em círculos concêntricos. (f) Estrutura do complexo F oF1 deduzida a partir de estudos bioquímicos e cristalográficos. As duas subunidades b de F o se associam firmemente às subunidades α e β de F1, mantendo-as fixas em relação à membrana. Em F o, o cilindro de subunidades c, enterrado na membrana, está ligado à haste constituída pelas subunidades γ e ε de F1. À medida que os prótons fluem através da membrana do lado P para o lado N via F o,
o cilindro e a haste rodam e as subunidades β de F1 mudam de conformação à medida que a subunidade γ se associa a cada uma delas.
Paul Boyer A catálise rotacional é a chave para o mecanismo de mudança de ligação para a síntese do ATP
Baseado em detalhados estudos cinéticos e de associação de ligantes, da reação catalisada pela FoF1, Paul Boyer propôs um mecanismo onde os três sítios ativos de F 1 giram catalisando a síntese de ATP (Fig. 19-23). Uma subunidade β começa na conformação βADP, que liga ADP + Pi do meio circunvizinho. A subunidade muda então de conformação, assumindo a forma β-ATP, que liga fortemente e estabiliza o ATP, efetuando um equilíbrio imediato do ADP + Pi com o ATP na superfície da enzima. Finalmente, a subunidade muda para a conformação β-vazia, que tem baixa afinidade pelo ATP e, o recém sintetizado ATP deixa a superfície da enzima. Uma nova rodada da catálise começa quando esta subunidade assume a forma β-ADP e liga ADP + Pi. As mudanças conformacionais fundamentais para este mecanismo são dirigidas pela passagem dos prótons através da porção F o da ATP sintase. A corrente de prótons através do “poro” Fo provoca a rotação do cilindro de subunidades c e da subunidade γ a ele ligada, ao redor do eixo da subunidade γ , que é perpendicular ao plano da membrana. A subunidade γ atravessa o centro do esferóide α3β3 que é mantido estacionário em relação à superfície da membrana pelas subunidade b2 e δ (Fig. 19-22f). A cada 120° de rotação, γ entra em contato com uma subunidade β diferente e esse contato força esta subunidade β a assumir a conformação β-vazia. As três subunidades β interagem de tal modo que quando uma assume a conformação β-vazia, a sua vizinha de um lado deve assumir a forma β-ADP e a outra vizinha, a forma β-
ATP. Desse modo, uma rotação completa da subunidade γ provoca uma mudança da
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subunidade β nas três conformações possíveis e, a cada rotação completa, três ATP são sintetizados e liberados na superfície da enzima. Uma forte predição deste modelo de mudança de ligação é que a subunidade γ deve rodar em uma direção quando F oF1 está sintetizando ATP e na direção oposta quando a enzima está hidrolisando ATP. Esta predição foi confirmada através de experimentos elegantes nos laboratórios de Masamitsu Yoshida e Kazuhiko Kinoshita Jr. A rotação de γ em uma única molécula de F 1 foi detectada microscopicamente ligando-se um longo, fino e fluorescente polímero de actina à γ e aguardando ela se mover em relação a α3β3 imobilizada em uma lâmina de microscópio, à medida que o ATP era hidrolisado. Quando todo o complexo FoF1 (e não apenas F 1) foi usado em um experimento similar, o anel de subunidade c girou com γ (Fig. 19-24). A ‘haste” girou na direção prevista de 360°. A rotação não foi tão regular, mas ocorreu em três discretos passos de 120°. Conforme já calculado a partir da velocidade de hidrólise do ATP por uma molécula de F 1 e o arraste friccional no longo polímero de actina, a eficiência deste mecanismo em converter energia química em movimento é quase 100%. Segundo Boyer, ela é “uma esplêndida máquina molecular”.
figura 19-23 Modelo da mudança de ligação para a ATP sintase .
O complexo F1 tem três sítios não equivalentes para a ligação dos nucleotídeos de adenina, um para cada par de subunidades α e β. Em um dado momento, um destes sítios está na conformação β-ATP (que liga ATP fortemente), um segundo está na conformação β-ADP (ligação frouxa) e um terceiro está na conformação β-vazia (ligação muito frouxa). A força próton motriz provoca a rotação da haste central (a subunidade γ , mostrada como uma ponta de flecha verde) que entra em contato com cada um dos pares de subunidades αβ sucessivamente. Isto acarreta uma mudança conformacional cooperativa onde o sítio β-ATP é convertido na conformação
β-vazia e o ATP é liberado. O sítio β-ADP é convertido
na conformação β-ATP que promove a condensação de ADP + P i, ligados a ela, para formar ATP. A conformação β-vazia se transforma em um sítio β-ADP, que liga frouxamente ADP + Pi provenientes do solvente. O modelo, baseado em resultados experimentais, requer que
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pelo menos dois dos três sítios catalíticos se alternem em atividade. O ATP não pode ser liberado de um sítio se e até que o ADP + P i estejam ligados ao outro.
figura 19-24 Demonstração experimental da rotação de F 1 e
F1 geneticamente construída contendo um certo número de resíduos de His adere fortemente a uma lâmina de microscópio coberta com um complexo de Ni. A biotina é ligada covalentemente à subunidade c. A proteina avidina, que se liga fortemente à biotina, é ligada covalentemente a longos filamentos de actina marcados com uma sonda fluorescente. A ligação da biotina à avidina, une os filamentos de actina com a subunidade c. Quando o ATP é adicionado para estimular a atividade ATPase da F 1, observa-se o filamento marcado girar continuamente em uma direção demonstrando que o cilindro de subunidades c de F o gira. Em outro experimento (não mostrado), a ligação do filamento de actina diretamente na subunidade γ mostrou que ela também gira. Provavelmente o cilindro e a haste se movem como uma unidade.
O acoplamento quimiosmótico acarreta uma estequiometria não inteira de consumo de O2 e síntese de ATP
Antes da aceitação geral do modelo quimiosmótico para a fosforilação oxidativa, assumia-se que a equação da reação global teria a seguinte forma: ADP + Pi + x(½)O2 + xH+ + x NADH ∀ ATP + xH2O + x NAD+
(19-11)
onde o valor de x, às vezes chamado razão P/O ou razão P/2e, sempre era um número inteiro. Quando mitocôndrias intactas são suspensas em uma solução contendo um substrato oxidável tal como o succinato ou NADH e é fornecido O 2, a síntese de ATP bem como a diminuição do O2 podem ser medidas rapidamente. Entretanto, a medida de P/O é complicada pelo fato de que a mitocôndria intacta consome ATP em muitas reações que ocorrem na matriz e consome O 2 para propósitos outros que não a fosforilação oxidativa. A maioria dos experimentos produzem razões P/O (ATP para ½ O 2) maiores que 2 quando o NADH é o doador de elétrons e maiores que 1 quando o succinato é o doador. Consideradose que P/O deve ser um valor inteiro, a maioria dos pesquisadores concordaram que a razão P/O deveria ser 3 para o NADH e 2 para o succinato. Durante anos estes valores foram encontrados em artigos de pesquisas e livros textos. Com a introdução do paradigma quimiosmótico para o acoplamento da síntese do ATP à transferência de elétrons, não existe nenhum requisito teórico para a razão P/O ser
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inteira. As questões relevantes sobre a estequiometria tornam-se: quantos prótons são bombeados para fora através da transferência de elétrons de um NADH para o O 2 e quantos prótons devem entrar através do complexo F oF1 para proporcionar a síntese de uma molécula de ATP ? A medida do fluxo de prótons é tecnicamente complicada. Deve-se levar em consideração a capacidade tamponante da mitocôndria, o vazamento não produtivo de prótons através da membrana interna e o uso do gradiente de prótons para funções diferentes da síntese de ATP, como por exemplo o transporte de substratos através da membrana mitocondrial (descrito a seguir). O valor de consenso para os prótons bombeados para fora por par de elétrons é 10 para o NADH e 6 para o succinato. O valor experimental mais aceito para o número de prótons requeridos para proporcionar a síntese de uma molécula de ATP é 4, dos quais 1 é usado para transportar P i, ATP e ADP através da membrana mitocondrial (veja a seguir). Se 10 prótons são bombeados para fora por molécula de NADH e 4 devem entrar para produzir um ATP, a razão P/O baseada em prótons é 2,5 para o NADH como doador de elétrons e 1,5 (6/4) para o succinato. Serão usados os valores de P/O de 2,5 e 1,5 ao longo deste livro, mas os valores 3,0 e 2,0 ainda são encontrados na literatura bioquímica. A palavra final acerca da estequiometria de prótons provavelmente não será escrita até que os detalhes completos do mecanismo de reação da F oF1 sejam conhecidos.
A força próton motriz energiza o transporte ativo
Embora o papel primário do gradiente de prótons na mitocôndria é fornecer energia para a síntese do ATP, a força próton motriz também comanda vários processos de transporte essenciais à fosforilação oxidativa. A membrana mitocondrial interna
geralmente é
impermeável a espécies carregadas, exceto para dois sistemas específicos da membrana, o transporte de ADP e Pi para dentro da matriz e o do ATP para fora, no citosol (Fig. 19-25). A adenina nucleotídeo translocase , embebida na membrana interna, liga o ADP 3- no espaço intermembranoso e o transporta para a matriz, trocando-o com uma molécula de ATP4-, que é transportada simultaneamente para fora (veja Fig. 14-1 para as formas iônicas do ATP e ADP). Como esse contra transporte desloca quatro cargas negativas para fora, para cada três transportadas para dentro, sua atividade é favorecida pelo gradiente eletroquímico transmembrana, que acarreta uma carga negativa líquida à matriz. A força próton motriz direciona a troca ATP-ADP. A adenina nucleotídeo translocase é especificamente inibida pelo atractilosídio, um glicosídio tóxico formado por uma espécie de cardo. Se o transporte de ADP para dentro da mitocôndria e o do ATP para fora é inibido, o ATP citosólico não pode ser regenerado a partir do ADP, explicando a toxicidade do atractilosídio (Tabela 19-4). Um segundo sistema de transporte de membrana essencial para a fosforilação oxidativa é a fosfato translocase , que promove o co-transporte de um H 2PO-4 e um H+ para dentro da
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matriz. Este processo de transporte também é favorecido pelo gradiente de prótons transmembrana (Fig. 19-25). Observe que ele requer um próton para se mover do lado P para o lado N da membrana interna, consumindo uma parte da energia do transporte de elétrons.
figura 19-25 Adenina nucleotídeo e fosfato translocases. Os sistemas de transporte da membrana
mitocondrial interna transportam ADP e P i para dentro da matriz e o ATP recém-sintetizado para o citosol. A adenina nucleotídeo translocase é uma contra transportadora, isto é, a mesma proteína desloca o ADP para dentro da matriz e o ATP para fora. O efeito de substituir o ATP4- pelo ADP3- é o efluxo líquido de uma carga negativa, que é favorecida pela diferença de carga através da membrana interna (lado externo positivo). Em pH 7, o P i está presente como HPO 42- e H2PO4- e, a fosfato translocase é específica para o H 2PO4-. Não há fluxo líquido de carga durante o co-transporte do HPO 42- e H+, mas a concentração relativamente baixa de prótons na matriz favorece o movimento dos íons H + para dentro. Assim, a força próton motriz é responsável por fornecer energia tanto para a síntese do ATP bem como para transportar substratos (ADP e P i) para dentro e o produto (ATP) para fora da matriz mitocondrial.
Sistemas de lançadeiras são requeridos para a oxidação mitocondrial do NADH citosólico
A NADH desidrogenase da membrana mitocondrial interna das células animais pode aceitar elétrons apenas do NADH na matriz. Sabendo que a membrana interna não é permeável ao NADH, como o NADH gerado pela glicólise, no citoplasma, pode ser reoxidado a NAD + pelo O2 via cadeia respiratória ? Sistemas especiais de lançadeiras transportam os equivalentes redutores do NADH citosólico para dentro da mitocôndria por uma rota indireta. A lançadeira de NADH mais ativa, que funciona nas mitocôndrias do fígado, rim e coração, é a lançadeira malato-aspartato (Fig. 19-26). Os equivalentes redutores do NADH citosólico são inicialmente transferidos ao oxaloacetato citosólico produzindo malato, pela ação da malato desidrogenase citosólica. O malato formado passa através da membrana interna para a matriz, através do transportador malato- α-cetoglutarato. Na matriz, os equivalentes redutores são passados para o NAD +, pela ação da malato desidrogenase matricial,
formando o NADH. Este NADH pode então transferir os seus elétrons
diretamente para a cadeia respiratória. Cerca de 2,5 moléculas de ATP são geradas à medida que este par de elétrons é transferido para o O 2. O oxaloacetato citosólico deve ser
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regenerado através de reações de transaminação para a atividade dos transportadores de membrana começar um outro ciclo. O músculo esquelético e o cérebro utilizam uma lançadeira de NADH diferente, lançadeira do glicerol-3-fosfato (Fig. 19-27). Ela difere da lançadeira malato-aspartato pelo
fato de ceder os equivalentes redutores do NADH (via ubiquinona) para o complexo III e não o I (Fig. 19-8), fornecendo assim energia suficiente para sintetizar apenas 1,5 moléculas de ATP para cada par de elétrons. As mitocôndrias das plantas superiores possuem uma NADH desidrogenase orientada externamente, que pode transferir os elétrons diretamente do NADH citosólico para a cadeia respiratória, ao nível da ubiquinona. Uma vez que essa via desvia esses elétrons da NADH desidrogenase e do movimento de prótons a ela associado, a produção de ATP a partir do NADH citosólico é menor que a do NADH gerado na matriz (Adendo 19-1).
figura 19-26 A lançadeira malato-aspartato . Esta lançadeira para transportar equivalentes redutores do
NADH citosólico para a matriz mitocondrial é usada no fígado, rins e coração.
O NADH
citosólico (espaço intermembranoso) cede dois equivalentes redutores para o oxaloacetato, produzindo malato.
O malato é transportado através da membrana interna pelo
transportador malato-α-cetoglutarato.
Na matriz, o malato cede dois equivalentes
redutores ao NAD+ e o NADH resultante é oxidado pela cadeia respiratória. O oxaloacetato formado a partir do malato não pode passar diretamente para o citosol. Ele primeiramente é transaminado a aspartato
,
que passa para o citosol através do transportador glutamato-
aspartato . O oxaloacetato é regenerado no citosol
, completando
o ciclo.
figura 19-27 A lançadeira glicerol-3-fosfato . Este meio alternativo de deslocar equivalentes redutores do
citosol para a matriz mitocondrial opera no músculo esquelético e no cérebro. No citosol, a diidroxiacetona fosfato aceita dois equivalentes redutores do NADH numa reação catalisada pela glicerol-3-fosfato desidrogenase citosólica. Uma isoenzima da glicerol-3-fosfato desidrogenase ligada à superfície externa da membrana interna, transfere dois equivalentes redutores do glicerol-3-fosfato localizado no espaço intermembranoso até a ubiquinona. Observe que esta lançadeira não envolve sistema de transporte através da membrana.
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Regulação da Fosforilação Oxidativa
A fosforilação oxidativa produz a maioria do ATP produzido nas células aeróbicas. A oxidação completa de uma molécula de glicose até CO 2 produz trinta ou trinta e dois ATP (Tabela 19-5). Por comparação, em condições anaeróbicas (fermentação láctica) a glicólise produz apenas dois ATP por glicose. Assim, o surgimento da fosforilação oxidativa acarretou um tremendo aumento na eficiência energética do catabolismo. A oxidação completa do palmitoil-CoA, até CO2, que também ocorre na matriz mitocondrial, produz 108 ATP (veja Tabela 17-1). Um cálculo similar pode ser feito para o ATP produzido pela oxidação de cada um dos aminoácidos (Capítulo 18). As vias de oxidação aeróbicas que resultam na transferência de elétrons para o O 2 são responsáveis pela maior parte do ATP sintetizado no catabolismo. Desse modo, a regulação da produção de ATP pela fosforilação oxidativa para garantir as necessidades flutuantes da célula por ATP é absolutamente essencial.
tabela 19-5 Produção de ATP a partir da oxidação completa da glicose Processo
Produto direto
Glicólise
2 NADH (citosólico)
ATP final
3 ou 5*
2 ATP
2
Oxidação do piruvato (2 por glicose)
2 NADH (matriz mitocondrial)
5
Oxidação do Acetil-CoA no ciclo do ácido
6 NADH (matriz mitocondrial)
15
cítrico (2 por glicose)
2 FADH2 2 ATP ou 2 GTP
Produção total por glicose
30 ou 32
* O número depende do tipo do sistema de lançadeira que transfere equivalente redutores na mitocôndria.
A fosforilação oxidativa é regulada pelas necessidades energéticas celulares
A velocidade da respiração (consumo de O 2) na mitocôndria é fortemente regulada. Ela geralmente é limitada pela disponibilidade do ADP como substrato para a fosforilação. A dependência da velocidade de consumo de O 2 em relação à disponibilidade do aceptor de P i, o ADP (veja Fig.19-17b), chamada controle aceptor da respiração pode ser dramática. Em
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alguns tecidos animais, o quociente do controle aceptor , a razão entre a velocidade máxima do consumo de O 2 induzida pelo ADP e a velocidade basal na ausência do ADP, é pelo menos menos 10. A concentração intracelular do ADP é uma medida do estado energético das células. Uma outra medida relacionada é o quociente da ação das massas do sistema ATP-ADP: [ATP]/([ADP][Pi]). Normalmente este quociente é muito alto, de tal modo que o sistema ATP-ADP está quase totalmente fosforilado. Quando a velocidade de algum processo que requer energia (síntese de proteínas, por exemplo) aumenta, a velocidade de transformação do ATP em ADP e P i aumenta, diminuindo o quociente da ação das massas. Com mais ADP disponível para a fosforilação oxidativa, a velocidade da respiração aumenta, provocando a regeneração do ATP. Isto continua até que o quociente da ação das massas retorna ao seu alto alto nível nível normal normal,, instant instantee em que que a respira respiração ção diminu diminuii nov novame amente nte.. A veloci velocidad dadee da oxidação dos combustíveis celulares é regulada com tal sensibilidade e precisão de tal modo que o quociente [ATP]/([ADP][Pi]) varia apenas ligeiramente na maioria dos tecidos, mesmo durante variações extremas na demanda energética. Em resumo, o ATP é formado tão rápido quanto é usado na velocidade em que é usado nas atividades celulares que requerem energia.
As mitocôndrias desacopladas no tecido adiposo marrom produzem calor
Há uma extraordinária e instrutiva exceção à regra geral de que a respiração diminui quando o suprimento de ATP for adequado. A maioria dos mamíferos recém nascidos, incluindo o homem, apresenta um tipo de tecido chamado tecido adiposo marrom, onde a oxidação dos combustíveis ao invés de produzir ATP serve para gerar calor para manter o recém nascido aquecido. Este tecido adiposo especializado é marrom devido a presença de um grande número de mitocôndrias e, portanto de grandes quantidades de citocromos, cujos grupos heme absorvem intensamente a luz visível. As mitocôndrias do tecido adiposo marrom são similares àquelas de outras células dos mamíferos em todos os aspectos, exceto que elas apresentam uma notável proteína em suas membranas internas. A termogenina , também chamada de proteína desacopladora (Tabela 19-4) proporciona uma via para os prótons retornarem à matriz sem passar através do complexo F oF1 (Fig. 19-28). Como resultado deste desvio de prótons, a energia da oxidação não é conservada pela formação do ATP mas é dissipada como calor, que contribui para manter manter a temperatura temperatura corporal corporal do recém recém nascido. nascido. Os animais animais que hibernam hibernam também também dependem das mitocôndrias desacopladas do tecido adiposo marrom para gerar o calor durante o longo período de dormência (veja Adendo 17-1).
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figura 19-28 Geração de calor pela mitocôndria desacoplada. A proteína desacopladora (termogenina)
das mitocôndrias do tecido adiposo marrom, fornecendo uma via alternativa para os prótons reentrarem na matriz mitocondrial, faz com que a energia conservada pelo bombeamento dos prótons prótons seja dissipada dissipada como como calor. calor.
As vias de produção do ATP são reguladas de uma maneira coordenada coordenada
As principais vias catabólicas possuem mecanismos reguladores coordenados e ajustados, que lhes permitem funcionar conjuntamente de uma maneira econômica e auto-reguladora para produz produzir ir ATP e os precur precursores sores biossintético biossintéticos. s. As concentraç concentrações ões relativa relativass de ATP ATP e ADP ADP controlam não apenas as velocidades da transferência de elétrons e a fosforilação oxidativa, mas também as velocidades do ciclo do ácido cítrico, a oxidação do piruvato e a glicólise (Fig. 19-29). Toda vez que o consumo de ATP aumenta, a velocidade da transferência de elétrons e da fosforilação oxidativa aumenta. Simultaneamente, a velocidade da oxidação do piruvato piruvato via ciclo do ácido cítrico aumenta, aumenta, aumentando aumentando desta forma o fluxo de elétrons na cadeia respiratória. Esses eventos podem, por sua vez, provocar um aumento na velocidade da glicólise, aumentando a velocidade da formação do piruvato. Quando a conversão do ADP em ATP diminui a concentração do ADP, o controle aceptor diminui a transferência de elétrons e, portanto a fosforilação oxidativa. A glicólise e o ciclo do ácido cítrico também diminuem, uma vez que o ATP é um inibidor alostérico da fosfofrutoquinase-1 (veja Fig. 1518) e da piruvato desidrogenase (veja Fig. 16-15). A fosfofrutoquinase-1 é inibida não apenas pelo ATP, mas pelo citrato, o primeiro intermediário do ciclo do ácido cítrico. Quando o ciclo está “ocioso”, o citrato se acumula dentro da mitocôndria e então extravasa para o citoplasma. Quando as concentrações do ATP e do citra citrato to estão estão elev elevad adas as,, eles eles prod produz uzem em uma uma inibi inibiçã çãoo alos alosté téric ricaa comb combina inada da da fosfofrutoquinase-1, que é maior que a soma dos seus efeitos individuais, desacelerando a glicólise.
figura 19-29 Regulação das vias produtoras de ATP . Este diagrama mostra a regulação coordenada da
glicólise, da oxidação do piruvato, do ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa pelas concentrações relativas do ATP, ADP e AMP e pelo NADH. Altas [ATP] (ou baixas [ADP] e [AMP]) produzem baixas taxas da glicólise, oxidação do piruvato, oxidação do acetato via ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa. Todas estas quatro vias são aceleradas quando
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a utilização do ATP e a formação do ADP, AMP e P i, aumentam. A coordenação da glicólise e do ciclo do ácido cítrico pelo citrato que inibe a glicólise, suplementa a ação do sistema da adenina nucleotídeo. Além disso, níveis elevados de NADH e de acetil-CoA também inibem a oxidação do piruvato a acetil-CoA. Quocientes [NADH]/[NAD +] elevados inibem as reações das desidrogenases do ciclo do ácido cítrico (veja Fig. 16-15).
Mutações nos genes mitocondriais causam doença humana
As mitocôndrias possuem o seu próprio genoma, uma molécula circular de DNA de fita dupla. O cromossomo mitocondrial humano (Fig.19-30) contém 37 genes (16.569 pares de bases), bases), incluindo 13 que codificam proteínas proteínas da cadeia respiratória respiratória (Tabela 19-6). Os genes restantes codificam moléculas de RNA ribossômico e de transferência, essenciais para a maquinaria sintetizadora de proteínas da mitocôndria. Muitas das proteínas mitocondriais estão codificadas por genes nucleares, sintetizadas nos ribossomos citoplasmáticos e, então importadas pos-translacionalmente e montados dentro da mitocôndria (veja Fig.27-39). Um crescente número de doenças humanas pode ser atribuído a mutações nos genes mitocondriais. Estas doenças são invariavelmente herdadas da mãe, uma vez que todas as mitocôndrias de um embrião em desenvolvimento são derivadas do óvulo da mãe. Uma doença rara chamada neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON) afeta o sistema nervoso central, incluindo os nervos ópticos, causando a perda bilateral da visão no início da maioridade. Uma única base alterada no gene mitocondrial ND4 (Fig. 19-30a) provoca a troca de um resíduo de Arg por um de His na cadeia polipeptídica do complexo I e o resultado é uma mitocôndria parcialmente deficiente na transferência de elétrons do NADH para a ubiquinona. ubiquinona. Embora Embora essas essas mitocôndrias mitocôndrias pode podem m produzir produzir algum algum ATP através através da transferência de elétrons do succinato, elas aparentemente não podem suprir ATP suficiente para suportar suportar o metabolismo metabolismo muito muito ativo dos dos neurônios. neurônios. Como Como conseqüênc conseqüência, ia, o nervo óptico óptico é lesado, levando à cegueira. Uma única mudança de base no gene mitocondrial para citocromo b, um componente do complexo III, também produz LHON demonstrando que a patologia patologia resulta resulta de uma redução redução geral da função mitocond mitocondrial rial e não especificame especificamente nte de um defeito no transporte de elétrons através do complexo I.
figura 19-30
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Genes mitocondriais e mutações . (a) Mapa do DNA mitocondrial humano, mostrando
os genes que codificam as proteínas do complexo I, a NADH desidrogenase ( ND1 a ND6 ); ); o citocromo b do complexo III ( Cit b); as subunidades da citocromo oxidase (complexo IV) ATPase 6 e ATPase ATPase 8). As cores dos (COI a COIII ) e duas subunidades da ATP sintase ( ATPase
genes correspondem àquelas dos complexos mostrados na Figura 19-7. Também estão incluídos os genes para os RNAs ribossômicos ( rRNA) e para vários RNAs de transferência específicos para mitocôndria. A especificidade dos RNAs de transferência ( tRNA) está indicada pelos códigos de uma letra para os aminoácidos. As setas indicam as posições das mutaçõ mutações es causad causadora orass da neu neurop ropatia atia óptica óptica heredi hereditári táriaa de Leber Leber (LHON) (LHON) e a epilep epilepsia sia mioclônica e a doença da fibra vermelha rasgada (MERRF). Os números em parênteses indicam a posição nos nucleotídeos alterados (o nucleotídeo número 1 está no topo do círculo). (b) Microg Micrografi rafiaa eletrônica eletrônica de uma mitocônd mitocôndria ria anormal anormal do músculo músculo de um indivíduo com MERRF, mostrando as inclusões de proteínas paracristalinas algumas vezes presentes presentes na mitocôndria mitocôndria mutante. mutante.
Epilepsia mioclônica mioclônica e doença da fibra vermelha rasgada
A epilepsia mioclônica, MERRF, é causada por uma mutação no gene mitocondrial que codifica um tRNA específico para leucina (leucina-tRNA). Esta doença, caracterizada por um espasmo muscular incontrolável, aparentemente resulta da produção defeituosa de várias proteínas proteínas sintetizadas sintetizadas usando usando os tRNA mitocondriais mitocondriais.. As fibras musculare muscularess esquelétic esqueléticas as de indivíduos com MERRF possuem mitocôndrias de forma f orma anormal que algumas vezes contêm estruturas paracristalinas (Fig. 19-30b). Mutações no gene do leucina-tRNA mitocondrial são uma das causas do desencadeamento do diabetes mellitus em adultos. Outras mutações nos genes mitocondriais são consideradas responsáveis pela progressiva fraqueza muscular que caracteriza a miopatia mitocondrial bem como o crescimento e deterioração do músculo cardíaco (cardiomiopatia hipertrófica). De acordo com a hipótese das mudanças progressivas que acompanham o envelhecimento, o acúmulo de mutações no DNA mitocondrial durante uma vida de exposição a agentes que danificam esse DNA, resulta em uma mitocôndria que não pode produzir ATP eficientemente para uma função celular normal.
tabela 19-6 Proteínas respiratórias codificadas pelo cromossomo cromossomo mitocondrial mitocondrial humano Complexo
Número total de
Número de subunidades
subunidades
codificadas pelo DNA
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mitocondrial
I NADH desidrogenase II Succinato desidrogenase
> 25 4
7 0
9
1
oxidorredutase IV Citocromo oxidase
13
3
V ATP sintase
12
2
III
Ubiquinona-citocromo
C
figura 19-31 Cadeia respiratória das bactérias. Estão mostrados os carregadores da membrana interna
da E. coli. A Eubactéria apresenta uma forma mínima do complexo I, contendo todos os grupos prostéticos normalmente associados ao complexo mitocondrial, mas apenas 14 polipeptídios. Esse complexo da membrana plasmática transporta o NADH para a ubiquinona ou menaquinona, o equivalente da ubiquinona na bactéria, enquanto bombeia prótons para fora, criando assim um potencial eletroquímico que governa a síntese do ATP.
As mitocôndrias provavelmente surgiram de bactérias endossimbióticas
O fato de a mitocôndria conter o seu próprio DNA, ribossomos e tRNA suporta a teoria da origem endossimbiótica da mitocôndria (veja Fig. 2-15). Esta teoria supõe que os primeiros organismos capazes de realizar o metabolismo aeróbico, incluindo a produção de ATP ligada à respiração, seriam procariotos. Os eucariotos primitivos que viviam anaerobicamente (por fermentação) adquiriram a habilidade de realizar a fosforilação oxidativa quando estabeleceram uma relação simbiótica com bactérias que viviam no seu citosol. Depois de muita evolução e da movimentação de muitos genes bacterianos para o núcleo do eucarioto “hospedeiro”, a bactéria endossimbionte eventualmente tornou-se mitocôndria. Esta teoria pressupõe que os primeiros procariotos de vida livre iniciais tinham a maquinaria enzimática para a fosforilação oxidativa. Ela prediz que os descendentes procariotos modernos apresentam cadeias respiratórias muito parecidas com as dos eucariotos modernos. De fato, elas apresentam. As bactérias aeróbicas realizam a transferência de elétrons ligados ao NAD dos substratos até o O 2, acoplada à fosforilação do ADP citosólico. As desidrogenases estão localizadas no citosol das bactérias e a cadeia respiratória está na membrana plasmática. Os transportadores de elétrons são semelhantes a alguns carregadores de elétrons da mitocôndria (Fig. 19-31). Eles translocam prótons para fora através da membrana plasmática à medida que os elétrons são transferidos para o O 2.
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Bactérias como a E. coli, possuem complexos F oF1 na membrana plasmática: a parte F 1 estende-se para o citosol e catalisa a síntese de ATP a partir do ADP e P i, à medida que os prótons retornam para dentro da célula através do canal de prótons da F o. A extrusão de prótons ligada à respiração, através da membrana plasmática da bactéria, proporciona a força motriz para outros processos. Certos sistemas de transporte em bactérias realizam a captação de nutrientes extracelulares (lactose, por exemplo) contra um gradiente de concentração, em um co-transporte com os prótons (veja Fig. 12-35). O movimento rotatório dos flagelos das bactérias, é dotado de “turbinas de prótons”, motores rotatórios moleculares impulsionados não pelo ATP, mas diretamente pelo potencial eletroquímico transmembrana gerado pelo bombeamento de prótons ligados à respiração (Fig. 19-32). É muito provável que o mecanismo quimiosmótico surgiu antes do aparecimento dos eucariotos.
figura 19-32 Rotação do flagelo da bactéria pela força próton motriz . A haste e os anéis na base do
flagelo constituem um motor rotatório que tem sido chamado de “turbina de prótons”. Os prótons ejetados pela transferência de elétrons fluem de volta para a célula através da “turbina”, provocando rotação da haste do flagelo. Este movimento difere fundamentalmente do movimento do músculo ou do flagelo e cílio dos eucariotos, onde a fonte de energia é a hidrólise do ATP.
Fotossíntese: Captando a Energia Luminosa
Passamos agora para uma outra seqüência de reações onde o fluxo de elétrons está acoplado à síntese do ATP: a fosforilação comandada pela luz. A captação da energia solar pelos organismos fotossintetizadores e a sua conversão em energia química de compostos orgânicos reduzidos é a fonte fundamental de quase toda energia biológica. Os organismos fotossintetizadores e os heterotróficos vivem em um estado estacionário balanceado na biosfera (Fig. 19-33). Os organismos fotossintetizadores captam a energia solar e sintetizam ATP e NADPH, que usam como fonte de energia para sintetizar carboidratos e outros compostos orgânicos a partir de CO 2 e H2O. Simultaneamente, eles liberam O 2 na atmosfera. Os heterotróficos aeróbicos (os humanos, por exemplo) usam o O 2 assim formado para degradar os produtos orgânicos energeticamente ricos da fotossíntese até CO 2 e H2O, gerando ATP para as suas próprias atividades. O CO 2 formado pela respiração nos heterotróficos retorna à atmosfera, para ser usado novamente pelos organismos fotossintetizadores. Desta forma, a energia solar fornece a força impulsionadora para a
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reciclagem contínua do CO 2 e O2 atmosférico através da biosfera e fornece os substratos reduzidos (combustíveis), como a glicose, da qual dependem os organismos que não fazem fotossíntese. A fotossíntese ocorre em uma grande variedade de bactérias e eucariotos unicelulares (algas) bem como em plantas superiores. Embora nestes organismos o processo difere em detalhes, o mecanismos básicos são extraordinariamente simples e, muito do nosso conhecimento acerca da fotossíntese nas plantas superiores é derivado de estudos dos organismos mais simples. A equação geral para a fotossíntese nas plantas superiores descreve uma reação de oxidação-redução onde a H 2O doa elétrons (como hidrogênio) para a redução do CO 2 até o carboidrato (CH2O): luz CO2 + H2O ∀ O2 + (CH2O)
figura 19-33
A energia solar é a fonte fundamental de toda energia biológica. Os organismos fotossintetizadores usam a energia do sol para produzir glicose e outros produtos orgânicos que as células heterotróficas usam como fontes de carbono e energia.
Características Gerais da Fotofosforilação
Ao contrário do NADH (o principal doador de hidrogênio na fosforilação oxidativa), a H 2O é um doador de elétrons pobre. Seu potencial de redução padrão é de +0,82V, comparado com –0,32V para o NADH. A fotofosforilação difere da fosforilação oxidativa por requerer energia na forma de luz para criar um bom doador de elétrons. Na fotofosforilação, os elétrons fluem através de uma série de transportadores ligados à membrana, incluindo citocromos, quinonas e proteínas ferro-enxofre, enquanto prótons são bombeados através de uma membrana para criar um potencial eletroquímico. A transferência dos elétrons e o bombeamento dos prótons são catalisados por complexos de membrana homólogos, em estrutura e função, ao complexo III da mitocôndria. O potencial eletroquímico que eles produzem é a força motriz para a síntese de ATP a partir de ADP e P i pelo complexo da ATP sintase associado à membrana, muito semelhante àquele da fosforilação oxidativa. Nas plantas superiores, a fotossíntese abrange dois processos: as reações dependentes da luz ou reações luminosas , que ocorrem apenas quando as plantas são
iluminadas, e as reações de assimilação ou de fixação do carbono, algumas vezes erroneamente chamadas de reações escuras, que são governadas por produtos das reações
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luminosas (Fig. 19-34). Nas reações luminosas, a clorofila e outros pigmentos das células fotossintetizadoras absorvem a energia luminosa e a conservam na forma de ATP e NADPH. Simultaneamente, o O2 é produzido. Nas reações de fixação do carbono, o ATP e o NADPH são usados para reduzir o CO 2 para formar triose fosfatos, amido, sacarose e outros produtos derivados deles. Neste capítulo estamos preocupados apenas com as reações luminosas que levam à síntese de ATP e NADPH. A redução do CO 2 é descrita no Capítulo 20 juntamente com outras vias de síntese de carboidratos.
figura 19-34
As reações luminosas geram NADPH e ATP, ricos de energia, às custas da energia solar. Esses produtos são usados nas reações fixadoras de carbono, que ocorrem na luz ou na escuridão, para reduzir o CO 2 e formar trioses e compostos mais complexos (como a glicose) derivados das trioses.
Nas plantas superiores a fotossíntese ocorre nos cloroplastos
Nas células eucarióticas fotossintetizadoras, tanto as reações de fixação do carbono quanto as luminosas, ocorrem nos cloroplastos (Fig. 19-35), organelas intracelulares associadas à membrana e geralmente de alguns microns de diâmetro (Fig. 2-7b). Similarmente às mitocôndrias, eles são envolvidos por duas membranas, uma externa que é permeável a pequenas moléculas e íons e uma interna, que encerra o compartimento interno. Esse compartimento contém muitas vesículas ou sacos achatados e envoltos por membranas, ddenominados de tilacóides, usualmente arranjados em pilhas chamadas grana (Fig. 1935b). Embebidos nas membranas dos tilacóides estão os pigmentos fotossintetizadores e os complexos enzimáticos que promovem as reações luminosas e a síntese do ATP. O estroma (fase aquosa encerrada pela membrana interna) contém a maioria das enzimas requeridas para as reações de assimilação do carbono.
figura 19-35 Cloroplasto. (a) Diagrama esquemático. (b) Micrografia eletrônica com grande aumento,
mostrando a grana, pilhas de membrana tilacóides.
A luz comanda o fluxo de elétrons nos cloroplastos
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Em 1937, Robert Hill descobriu que quando extratos de folhas contendo cloroplastos eram iluminados, eles (1) produziam O 2 e (2) reduziam um aceptor não biológico de elétrons adicionado ao meio, de acordo com a reação de Hill : luz 2 H2O + 2A ∀ 2 AH2 + O2 onde A é o aceptor artificial de hidrogênio ou reagente de Hill . Um dos reagentes de Hill, o corante 2,6-diclorofenolindofenol, é azul quando oxidado (A) e incolor quando reduzido (AH2). Quando o extrato de folha, suplementado com o corante foi iluminado, o corante azul tornou-se incolor e o O 2 foi produzido. No escuro, ‘não ocorreu nem a produção de O 2 nem a redução do corante. Esta foi a primeira evidência de que a energia luminosa absorvida provoca um fluxo de elétrons da H 2O para um aceptor de elétrons. Além disso, Hill observou que o CO2 não era requerido nem reduzido a uma forma estável nestas condições. A produção do O 2 pode ser dissociada da redução do CO 2. Vários anos depois, Severo Ochoa mostrou que o NADP+ é o receptor biológico de elétrons nos cloroplastos, de acordo com a equação:
luz 2H2O + 2NADP+ ∀ 2NADPH + 2H+ + O2 Para compreender este processo fotoquímico, devemos inicialmente considerar os efeitos da absorção luminosa na estrutura molecular.
Absorção da Luz
A luz visível é uma radiação eletromagnética de comprimentos de onda de 400 até 700 nm, uma pequena parte do espectro eletromagnético (Fig. 19-36), indo do violeta até o vermelho. A energia de um único fóton (um quantum de luz) é maior na extremidade violeta do espectro que na extremidade vermelha. Comprimentos de onda menores (e freqüências elevadas) correspondem a energias maiores. A energia de um “mol” de fótons (um einstein; 6 × 1023 fótons) de luz visível é da ordem de 170 a 300 kJ, quase uma ordem de grandeza maior que os 30 a 50 kJ requeridos para sintetizar um mol de ATP a partir do ADP e P i. Quando um fóton é absorvido, um elétron da molécula que o absorveu (cromóforo) é deslocado para um nível superior de energia. Isto é um evento tudo-ou-nada. Para ser absorvido, o fóton deve conter uma quantidade de energia (um quantum) que iguale exatamente a energia da transição eletrônica. Uma molécula que absorveu um fóton está em
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um estado excitado, que é geralmente instável. Um elétron deslocado para um orbital superior de energia usualmente retorna rapidamente ao seu orbital de menor energia. A molécula excitada decai para o estável estado fundamental, fornecendo o quantum absorvido como luz ou calor ou usando-o para realizar um trabalho químico. A emissão de luz que acompanha o decaimento das moléculas excitadas (chamada fluorescência) é sempre de um comprimento de onda maior (energia menor) que o da luz absorvida. Um modo alternativo de decaimento, importante na fotossíntese, envolve a transferência direta da energia de excitação de uma molécula excitada para uma molécula vizinha.
figura 19-36
O espectro da radiação eletromagnética e a energia dos fótons no intervalo visível do espectro. Um einstein equivale a 6 × 1023 fótons.
A clorofila absorve energia luminosa para a fotossíntese
Os mais importantes pigmentos que absorvem luz nas membranas tilacóides são as clorofilas, pigmentos verdes com estruturas policíclicas planas, que se assemelham à
protoporfirina da hemoglobina (veja Fig. 7-1), exceto que o Mg 2+ e não o Fe 2+, ocupa a posição central (Fig. 19-37). Todas as clorofilas apresentam uma longa cadeia lateral fitol, esterificada com um grupo carboxílico substituinte no anel IV. Os quatro átomos de nitrogênio da clorofila, orientados para dentro, são coordenados com o Mg 2+. O sistema heterocíclico de anéis de cinco átomos que envolve o Mg 2+ apresenta um prolongamento com estrutura poliênica, com alternância de ligações simples e duplas. Esses polienos apresentam caracteristicamente uma forte absorção na região visível do espectro (Fig. 19-38). Usualmente os cloroplastos apresentam coeficientes de extinção molar altos (veja Adendo 51) e por isso são muito apropriados para absorver a luz visível durante a fotossíntese.
figura 19-37 Fotopigmentos primários e secundários. (a) As clorofilas a e b e a bacterioclorofila são os
coletores primários da energia luminosa. (b) a ficoeritrobilina e a ficocianobilina (ficobilinas) são os pigmentos antena na cianobactéria e nas algas vermelhas. (c) o βcaroteno (um carotenóide) e a (d) luteina (também chamada xantofila) são pigmentos acessórios nas plantas. As áreas que apresentam um sombreamento róseo são os sistemas conjugados (alternância de simples e duplas ligações) que fundamentalmente são responsáveis pela absorção da luz visível.
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Os cloroplastos das plantas superiores contém tanto a clorofila a como b (Fig. 1937a), Embora ambas sejam verdes, os seus espectros de absorção são suficientemente diferentes (Fig. 19-38) permitindo que elas complementem o intervalo de absorção da luz na região do visível. A maioria das plantas superiores contém duas vezes mais clorofila a que clorofila b. Os pigmentos nas algas e bactérias fotossintetizadoras incluem clorofilas que diferem apenas ligeiramente dos pigmentos das plantas. A clorofila geralmente está associada a proteínas específicas, formando os complexos coletores de luz (CCL) , onde as moléculas de clorofila estão fixas umas em
relação às outras, a outros complexos proteicos e à membrana. A estrutura detalhada de um complexo coletor de luz foi determinada a partir de cristalografia de raios X (Fig. 19-39). Ele contém sete moléculas da clorofila a, cinco da clorofila b e duas do pigmento acessório luteina (veja a seguir). Figura 19-38 Absorção da luz visível pelos fotopigmentos. As plantas são verdes porque os seus
pigmentos absorvem luz das regiões vermelha e azul do espectro, deixando fundamentalmente que a luz verde seja refletida ou transmitida. Compare os espectros de absorção dos pigmentos com o espectro da luz solar que atinge a superfície da terra. A combinação das clorofilas ( a e b) e dos pigmentos acessórios capacita as plantas a captarem a maior parte da energia disponível da luz solar. As quantidades relativas de clorofila e pigmentos acessórios são características para as diferentes espécies de plantas. A variação na proporção desses pigmentos é responsável pela diversidade das cores dos organismos fotossintetizadores, desde o azul esverdeado escuro das agulhas dos abetos até o verde esverdeado das folhas da acerácea ou então às cores vermelha, marron ou púrpura de algumas espécies de algas multicelulares e folhas certas de plantas decorativas. As cianobactérias e as algas vermelhas, utilizam as ficobilinas, tal como a ficoeritrobilina e a ficocianobilina (Fig. 19-37b), como pigmentos coletores de luz. Estes tetrapirróis lineares apresentam o prolongamento poliênico encontrado nas clorofilas, mas não a estrutura cíclica nem o Mg 2+ central. As ficobilinas estão ligadas covalentemente à proteínas específicas formando as ficobiliproteínas, que se associam em complexos altamente ordenados chamados ficobilisomos (Fig. 19-40) que constituem as estruturas coletoras primárias de energia nestes microrganismos.
figura 19-39 Um complexo coletor de luz, CCLII . A unidade funcional é um CCL trímero contendo 36
moléculas de clorofila e 6 de luteina. A figura mostra um monômero visto no plano da
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membrana. Existem três segmentos em α-hélice transmembrana, sete moléculas de clorofila a (verde), cinco moléculas de clorofila b (vermelho) e duas moléculas do pigmento acessório luteina (amarelo) que formam um braço cruzado interno.
figura 19-40 Um ficobilisomo . Nestas montagens altamente estruturadas, encontradas nas cianobactérias
e algas vermelhas, os pigmentos ficobilinas ligados à proteínas específicas formam complexos denominados ficoeritrina (FE), ficocianina (FC) e aloficocianina (AF). A energia dos fótons absorvidos pela FE e FC é transmitida através da AF (proteína ligadora de ficocianobilina) para a clorofila a do centro de reação através de um processo chamado transferência de excitom, que será discutido a seguir.
Os pigmentos acessórios ampliam o intervalo de absorção da luz
Além das clorofilas, as membranas tilacóides contêm pigmentos secundários que absorvem luz (pigmentos acessórios), os carotenóides. Os carotenóides podem ser amarelos, vermelhos ou púrpuros. Os mais importantes são o β-caroteno (Fig. 19-37c), um composto isoprenóide vermelho-alaranjado, e o carotenóide amarelo luteina (Fig. 19-37d). Os pigmentos carotenóides absorvem luz em comprimentos de onda não absorvidos pelas clorofilas (Fig. 19-38) e desse modo, são receptores suplementares de luz. A determinação experimental da eficácia da luz de diferentes cores em promover a fotossíntese produz um espectro de ação (Fig. 19-41), geralmente útil na identificação do pigmento primariamente responsável por um efeito biológico da luz. Ao captar a luz em uma região do espectro não utilizada por outros organismos, o fotossintetizador pode reivindicar um nicho ecológico ímpar. Por exemplo, as ficobilinas das algas vermelhas e cianobactérias, absorvem na região de 520 a 630 nm, permitindo que esses organismos ocupem nichos onde a luz de maiores e menores comprimentos de onda foi filtrada pelos pigmentos de outros organismos que vivem na água acima deles ou então pela própria água.
figura 19-41 Duas maneiras de se determinar o espectro de ação na fotossíntese . (a) Os resultados de
um experimento clássico feito por T.W. Englemann, em 1822, para determinar qual comprimento de onda da luz era mais eficaz para a fotossíntese. Englemann colocou uma alga filamentosa fotossintetizadora em um microscópio e a iluminou com a luz de um prisma, de forma que as células numa parte do filamento receberam principalmente luz azul,
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uma outra parte, a amarela e uma outra, a vermelha. Para determinar quais células realizavam a fotossíntese mais ativamente, também foram colocadas na lâmina do microscópio bactérias que migram para regiões com maior concentração de O 2. Após um período de iluminação, a distribuição das bactérias mostrou que os maiores níveis de O 2 (produzidos pela fotossíntese) estavam nas regiões iluminadas com luz violeta e vermelha. (b) Um experimento semelhante, usando técnicas modernas (um eletrodo seletivo de oxigênio) para medir a produção de O 2, deu o mesmo resultado. Um espectro de ação descreve a velocidade relativa de fotossíntese para a iluminação com um número constante de fótons de diferentes comprimentos de onda. O espectro de ação é útil uma vez que, através da comparação com o espectro de absorção (como aqueles na figura 19-38), sugere quais são os pigmentos capazes de canalizar a energia para a fotossíntese. A clorofila canaliza a luz absorvida para os centros de reação através da transferência de excitons
Os pigmentos que absorvem a luz das membranas tilacóides ou das bactérias, estão arranjados em conjuntos funcionais chamados fotossistemas . Nos cloroplastos do espinafre, por exemplo, cada fotossistema contém cerca de 200 moléculas de clorofilas e cerca de 50 moléculas de carotenóides. Todas as moléculas dos pigmentos em um fotossistema podem absorver fótons, mas apenas algumas poucas moléculas de clorofila associadas ao centro de reação fotoquímico são especializadas para transformar a luz em energia química. As
moléculas dos outros pigmentos num fotossistema são chamadas de moléculas coletoras de luz ou moléculas antenas. Elas absorvem a energia luminosa e a transmite rápida e
eficientemente para o centro de reação (Fig. 19-42).
figura 19-42 Organização dos fotossistemas nas membranas tilacóides . Os fotossistemas são
empacotados compactamente na membrana tilacóide, com várias centenas de clorofilas antenas e pigmentos acessórios rodeando um centro de fotorreação. A absorção de um fóton por qualquer clorofila antena provoca a excitação do centro de reação através da transferência de excitons. Também estão embebidas na membrana tilacóide o complexo do citocromo b6f e a ATP sintase (veja Fig. 19-47). As moléculas de clorofila nos complexos coletores de energia apresentam propriedades de absorção de luz que são ligeiramente diferentes daquelas da clorofila livre. Quando as moléculas de clorofila isoladas são excitadas pela luz, in vitro, a energia absorvida é rapidamente liberada como fluorescência e calor. Entretanto, quando a clorofila nas folhas intactas é excitada pela luz visível (Fig. 19-3, etapa
),
uma pequena
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fluorescência é observada. Ao invés disto, a molécula de clorofila antena excitada transfere a energia diretamente para uma molécula de clorofila vizinha, que se torna excitada enquanto a primeira molécula retorna ao seu estado fundamental (etapa
).
Esta
transferência de energia, também chamada transferência de exciton , se estende para uma terceira, quarta ou subseqüente molécula vizinha, até que um par especial de moléculas de clorofila a no centro de reação fotoquímico seja excitada (etapa
).
Nesta molécula de
clorofila excitada, um elétron é promovido para um orbital de energia superior. Este elétron então passa para um receptor de elétrons vizinho, que é parte da cadeia de transferência de elétrons, deixando o centro de reação da clorofila com um orbital vazio (uma “cela do elétron”) (etapa ). O aceptor de elétrons adquire uma carga negativa nesta transação. O elétron perdido pelo centro de reação da clorofila é substituído por um elétron de uma molécula doadora de elétrons vizinha (etapa
),
que se torna positivamente carregada. Desta
forma, a excitação pela luz provoca separação de carga elétrica e inicia uma cadeia de oxidação-redução.
figura 19-43 A transferência de exciton . Este esquema generalizado mostra a conversão da energia de
um fóton absorvido na separação das cargas no centro de reação. As etapas são descritas com mais detalhes no texto. Observe que a etapa
pode ser repetida várias vezes entre
sucessivas moléculas antenas até que um centro de reação da clorofila seja alcançado. O asterisco (*) representa o estado de excitação de uma molécula antena.
O Evento Fotoquímico Central: o Fluxo de Elétrons Impulsionado pela Luz
A transferência de elétrons impulsionada pela luz nos cloroplastos das plantas é realizada por sistemas multienzimáticos na membrana tilacóide. A atual concepção dos mecanismos fotossintetizadores é uma composição baseada em estudos de cloroplastos de plantas e de uma variedade de bactérias e algas. A determinação das estruturas moleculares dos complexos fotossintetizadores das bactérias (por cristalografia de raios X) tem proporcionado uma melhoria do conhecimento dos eventos moleculares da fotossíntese.
As bactérias apresentam um ou dois tipos de centros de reação fotoquímicos simples
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Uma observação importante apareceu em 1952 a partir dos estudos de bactérias fotossintetizadoras, quando Louis Duysens observou que a iluminação das membranas fotossintetizadoras da bactéria púrpura Rhodospirillum rubrum com pulsos de luz de comprimento de onda específico (870 nm) causou uma diminuição temporária da luz naquele comprimento de onda. O pigmento foi descorado pela luz de 870 nm. Estudos posteriores de Bessel Kok e Horst Witt mostraram um branqueamento similar de pigmentos de cloroplastos de plantas por luz de 680 e 700 nm. Além disso, a adição do aceptor (não biológico) de elétrons [Fe(CN)6]3- causou o descoramento nesses comprimentos de onda sem iluminação. O descoramento dos pigmentos foi devido a perda de um elétron de um centro de reação fotoquímico . Esses pigmentos foram nomeados a partir do comprimento de onda do máximo
descoramento: P870, P680 e P700. As bactérias fotossintetizadoras apresentam uma maquinaria de fototransdução relativamente simples, com um ou dois tipos gerais de centro de reação. Um deles (encontrado na bactéria púrpura) passa os elétrons para uma quinona através da feofitina (clorofila sem o íon Mg2+ central). O outro (nas bactérias sulfurosas verdes) passa os elétrons para um sistema ferro-enxofre através de uma quinona. As cianobactérias e as plantas superiores apresentam dois fotossistemas (FSII e FSIII), um de cada tipo, que atuam em série. Estudos bioquímicos e biofísicos da maquinaria fototransdutora da bactéria, tem revelado muitos detalhes moleculares dos centros de reação. Estes sistemas das bactérias servem contudo como protótipos para os sistemas de fototransdução mais complexos das plantas superiores.
O centro de reação feofitina-quinona (centro de reação tipo II) A maquinaria
fotossintetizadora na bactéria púrpura consiste de três módulos básicos (Fig. 19-44a): um único centro de reação (P870), um complexo de transferência de elétrons, citocromo bc1, similar ao complexo III da cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria e uma ATP sintase, também similar à da mitocôndria. A iluminação impulsiona os elétrons através da feofitina e quinona para o complexo do citocromo bc1. Após passar através do complexo, os elétrons fluem através do citocromo c2 de volta para o centro de reação, restabelecendo seu estado de pré iluminação. Este fluxo cíclico de elétrons impulsionados pela luz propicia a energia para o bombeamento de prótons pelo complexo do citocromo bc1. Com a energia resultante do gradiente de prótons, o módulo ATP sintase produz ATP exatamente como na mitocôndria. As estruturas tridimensionais dos centros de reação da bactéria púrpura ( Rhodopseudomonas viridis e Rhodobacter sphaeroides) deduzidas a partir de cristalografia de raios X, elucidam como a fototransdução ocorre no centro de reação feofitina-quinona. O
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centro de reação da R. viridis (Fig. 19-45a) é um grande complexo proteico contendo quatro subunidades polipeptídicas e 13 cofatores: dois pares de clorofilas da bactéria, um par de feofitina, duas quinonas, um ferro não heme e quatro hemes no citocromo tipo c associado. A sequência extremamente rápida de transferência de elétrons mostrada na Figura 1945b, foi deduzida a partir de estudos físicos dos centros feofitina-quinona da bactéria, usando pulsos curtos de luz para disparar a fototransdução e uma variedade de técnicas espectroscópicas para seguir o fluxo dos elétrons através dos vários carregadores. Um par de bactérioclorofilas – “o par especial”, designado (Clo) 2 – é o sítio da fotoquímica inicial no centro de reação. A energia do fóton absorvido por uma das muitas moléculas de clorofila antena que rodeiam o centro de reação atingem o centro de reação (Clo) 2 por transferência de excitons. Quando estas duas moléculas de clorofila, tão próximas que seus orbitais de ligação se superpõem, absorvem um exciton, uma delas abandona um elétron fracamente ligado, que passa através do monômero de clorofila vizinha para a feofitina (Feo). Isto produz dois radicais, um possivelmente carregado positivamente (o par especial de clorofilas) e um carregado negativamente (a feofitina). (Clo)2 + 1 exciton ∀ (Clo)2* (Clo)2* + Feo ∀ (Clo)2•+
+ Feo•+
(excitação) (separação de carga)
O radical feofitina transfere seu elétron para uma molécula de quinona fortemente ligada à membrana (QA), convertendo-a em um radical semiquinona que imediatamente doa esse elétron extra à uma segunda quinona (Q B) fracamente ligada à membrana. Estas duas transferências de elétrons convertem Q B em sua forma completamente reduzida Q BH2, que difunde livremente na bicamada da membrana para longe do centro de reação: 2 Feo•+ + 2H+ + QB ∀ 2 Feo + QBH2
(redução da quinona)
A hidroquinona (QBH2), que carrega em suas ligações químicas alguma energia dos fótons que originalmente excitaram o P870, entra em um reservatório de quinona reduzida (QH2), dissolvido na membrana e se move através da fase lipídica da bicamada até o complexo do citocromo bc1. Similarmente ao homólogo complexo III na mitocôndria, o complexo do citocromo bc1
da bactéria púrpura transporta os elétrons de um doador quinol (QH 2) até um aceptor de
elétrons, usando a energia da transferência de elétrons para bombear os prótons através da membrana e produzir uma força próton motriz. Acredita-se que o caminho do fluxo dos elétrons através deste complexo é muito similar ao que ocorre através do complexo III
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mitocondrial, envolvendo o ciclo Q (Fig. 19-11), onde os prótons são consumidos em um dos lados da membrana e liberados no outro. O aceptor de elétrons final na bactéria púrpura é uma forma do P870 desprovida de elétrons (Clo 2•+) (Fig. 19-44a). Os elétrons se movem do complexo do citocromo bc1 para o P870 através de um citocromo tipo c solúvel, o citocromo c2.
O processo de transferência de elétrons completa o ciclo e o centro de reação retorna ao
seu estado não descorado que, absorve rapidamente um outro exciton de uma clorofila antena.
figura 19-44 Módulos funcionais da maquinaria fotossintetizadora nas bactérias púrpura e sulfurosa verde. (a) na bactéria púrpura, a energia luminosa impulsiona os elétrons do centro de
reação P870 através da feofitina (Feo), uma quinona (Q) e o complexo do citocromo bc1 e então, através do citocromo c2, de volta para o centro de reação. O fluxo de elétrons através do complexo do citocromo bc1 provoca o bombeamento de prótons, criando um potencial eletroquímico que promove a síntese de ATP. (b) a bactéria sulfurosa verde apresenta duas vias para os elétrons impulsionados pela excitação do P840. Uma rota cíclica passa através de uma quinona para o complexo do citocromo bc1 e, de volta para o centro de reação, através do citocromo c. Uma rota não cíclica passa do centro de reação, através da ferredoxina (Fd), uma proteína do tipo ferro-enxofre, e então para o NAD + em uma reação catalisada pela NAD-ferredoxina redutase.
figura 19-45 Centro de fotorreação da bactéria púrpura Rhodopseudomonas viridis. (a)
o sistema tem quatro componentes: três subunidades H. M e L (marron, azul e
cinza, respectivamente), com um total de 11 segmentos de hélice transmembrana e, uma quarta proteína, o citocromo c (amarelo) associado ao complexo na superfície da membrana. As subunidades L e M são proteínas transmembranas emparelhadas que juntas formam uma estrutura cilíndrica com uma simetria bilateral ao redor do seu eixo longitudinal. Os grupos prostéticos que participam dos eventos fotoquímicos são mostrados como estruturas bolas-e bastões. Dois pares de moléculas de bactérioclorofila (verde) estão ligados às cadeias L e M. Um dos pares (o “par especial”, verde escuro) é o sítio das primeiras mudanças fotoquímicas após a absorção da luz. Também está incorporado um par de moléculas de feofitina a (Feo a, azul claro); duas quinonas, a menaquinona (Q A) e a ubiquinona (Q B) (amarelo), também arranjadas com simetria bilateral e, um único Fe não heme (vermelho) localizado aproximadamente no eixo de simetria entre as quinonas. No topo da figura estão mostrados
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quatro grupos heme (vermelho) associados ao citocromo tipo c do centro de reação. O centro de reação de uma outra bactéria púrpura, Rhodobacter sphaeroides, é muito similar exceto que o citocromo c não é parte do complexo cristalino. (b) sequência de eventos após a excitação do par especial de bactérioclorofilas e a escala de tempo da transferência de elétrons (entre parênteses, ps= picosegundos). O par especial excitado transfere um elétron para a feofitina , da qual o elétron se move rapidamente para a menaquinona Q A que está fortemente ligada à membrana . Esta quinona passa os elétrons muito mais vagarosamente para a difusível ubiquinona, QB, através do Fe não heme
.
Enquanto isso, a “cela de
elétrons” no par especial é preenchida por um elétrons do grupo heme do citocromo c .
O centro de reação Fe-S (centro de reação tipo I) A fotossíntese nas bactérias sulfurosas
verdes envolve os mesmos três módulos como na bactéria púrpura, mas o processo difere em vários aspectos e envolve reações enzimáticas adicionais (Fig. 19-44b). A excitação provoca um movimento dos elétrons do centro de reação para o complexo do citocromo bc 1. A excitação provoca o movimento dos elétrons do complexo do citocromo bc1 via transportador quinona. A transferência de elétrons através deste complexo, acarreta o transporte de prótons e cria a força próton motriz usada na síntese de ATP, tal como na bactéria púrpura e na mitocôndria. Entretanto, em contraste com o fluxo cíclico de elétrons na bactéria púrpura, alguns elétrons fluem do centro de reação para uma proteína não heme, ferredoxina, que então passa os elétrons via ferredoxina-NAD redutase produzindo NADH.
Os elétrons retirados do centro de reação para reduzir o NAD + são substituídos pela oxidação do H2S a HSO4- (Fig. 19-44b), na reação que define a bactéria sulfurosa verde. Esta oxidação do H2S pela bactéria é quimicamente análoga à oxidação da água pelas plantas superiores.
Fatores cinéticos e termodinâmicos previnem a dissipação de energia pela conversão interna
A construção complexa dos centros de reação é o produto da seleção evolutiva para a eficiência do processo fotossintético. O estado excitado (Clo) 2* em princípio pode decair para o estado fundamental através de conversão interna, um processo muito rápido (10 ps; ps= 10-12 s) onde a energia absorvida do fóton é convertida em calor (movimento molecular). Os centros de reação são construídos para prevenir a ineficiência que poderia resultar no caso de conversão interna. As proteínas do centro de reação mantém as bactérioclorofilas, as bactériofeofitinas e as quinonas em uma orientação fixa em relação às demais. Todavia, as reações fotoquímicas entre estes componentes ocorre em um estado virtualmente sólido. Isto contribui para a alta eficiência e rapidez das reações, pois não
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dependem das colisões ao acaso ou difusão randômica. A transferência do exciton da clorofila antena para o par especial do centro de reação ocorre em menos de 100 ps com uma eficiência maior que 90%. Trinta picosegundos após a excitação do P870, a feofitina já recebeu um elétron, tornando-se um radical negativamente carregado. Menos de 200 ps após, o elétron já atingiu a quinona QB (Fig. 19-45b). As reações de transferência de elétrons não são apenas rápidas mas termodinamicamente “morro abaixo”. O par especial excitado (Clo)2* é um doador de elétron muito bom (E’ o≈ -1 V) e cada transferência de elétrons sucessiva é sempre para um aceptor com E’ o substancialmente mais negativo. A mudança de energia livre padrão para o processo é portanto negativa e grande. Lembrar do Capítulo 14 que ∆G’o= - nF∆E’o, onde ∆E’o é a diferença entre os potenciais de redução padrão das duas semi-reações: (1) (Clo)2* ∀ (Clo)2•+ + e-
∆E’o= -1 V
(2) Q + 2H+ + 2 e- ∀ QH2
∆E’o= - 0,045 V
Assim, ∆E’o= -0,045 V – (-1V) ≈ 0,95 V e, ∆G’o= -2(96,5 kJ/V.mol)(0,95V)= -180 kJ/mol
A combinação de uma cinética rápida com uma termodinâmica favorável, torna o processo virtualmente irreversível e altamente eficiente. A energia total produzida pelo processo (a porcentagem da energia do fóton conservada em QH 2) é maior que 30%, sendo que o restante da energia é dissipado como calor.
Nas plantas superiores, dois centros de reação atuam em sequência
O aparelho fotossintetizador das cianobactérias modernas, algas e plantas superiores é mais complexo que o sistema bacteriano de um centro e, parece que ele se desenvolveu a partir da combinação de dois fotocentros bacterianos mais simples. As membranas tilacóides dos cloroplastos apresentam dois tipos diferentes de fotosistemas, cada um com seu próprio centro de reação fotoquímico e um conjunto de moléculas antena. Os dois sistemas possuem funções distintas e complementares (Fig. 19-46). O fotossistema II (FSII) é um sistema feofitina-quinona (semelhante ao único fotossistema da bactéria púrpura) que contém quantidades aproximadamente iguais de clorofila a e b. A excitação do centro de reação P680 impulsiona os elétrons através do complexo do citocromo b6 f com o movimento concomitante dos prótons através da membrana tilacóide. O fotossistema I (FSI) , é do tipo ferredoxina, estrutural e funcionalmente relacionado com o centro de reação da bactéria sulfurosa verde. Ele apresenta um centro de reação denominado P700 e uma proporção elevada de clorofila a em relação à b. Quando excitado, o P700 passa os elétrons para a
56 +
proteína ferredoxina Fe-S e então para o NADP , produzindo NADPH. As membranas tilacóides de um único cloroplasto de espinafre possuem muitas centenas de cada tipo de fotossistema. Nas plantas, estes dois centros de reação atuam em sequência para catalisar o movimento dos elétrons da H 2O para o NADP+, impulsionados pela luz (Fig. 19-46). Os elétrons são transportados entre os dois fotossistemas pela proteína solúvel plastocianina, um carregador de um elétron funcionalmente similar ao citocromo c da mitocôndria. Para substituir os elétrons que se movem de FSII através de FSI para o NADP +, as cianobactérias e as plantas oxidam a H 2O (como a bactéria sulfurosa verde oxida o H 2S), produzindo O2 (Fig. 19-46, esquerda inferior). O processo é chamado fotossíntese oxigênica para diferencia-la da fotossíntese não oxigênica das bactérias purpura e sulfurosa verde. Toda célula fotossintetizadora produtora
de O2 – aquelas das plantas superiores, algas e
cianobactéria – contém tanto o FSI como o FSII. Organismos com apenas um fotossistema não produzem O2. O diagrama na Figura 19-46, geralmente chamado esquema Z devido à sua forma geral, esboça a via do fluxo dos elétrons entre os dois fotossistemas e as relações de energia nas reações luminosas. Portanto, o esquema Z descreve a rota completa através da qual os elétrons fluem da H2O para o NADP+ de acordo com a equação: 2H2O + 2NADP+ + 8 fótons ∀ O2 + NADPH + 2H+ Para cada dois fótons absorvidos (um para cada fotossistema), um elétron é transferido da H2O para o NADP +. Para forma uma molécula de O 2, que requer a transferência de quatro elétrons de duas H2O para dois NADP+, um total de oito fótons devem ser absorvidos, quatro para cada fotossistema. Os detalhes mecanísticos das reações fotoquímicas em FSI e FSII são essencialmente similares àqueles dos dois fotossistemas bacterianos. A excitação do P680 (em FSII) produz P680*, um excelente doador de elétrons que, em picosegundos transfere um elétron à feofitina, fornecendo-lhe uma carga negativa (Feo -) (Fig. 19-46, lado esquerdo). Com a
perda do seu elétron, o P680* é transformado num radical catiônico, designado P680 +. A Feo- transfere rapidamente seu elétron extra para a plastoquinona, PQA, uma proteina de membrana que, por sua vez transfere o elétron para outra plastoquinona, PQ B, mais fracamente ligada à membrana. Quando PQ B adquire dois elétrons, através de duas transferências de PQ A e dois prótons da água, ela passa para a sua forma quinol totalmente reduzida, PQBH2. A reação global iniciada pela luz em FSII é: 4 P680 + 4H+ + 2PQB + 4 fótons ∀ 4 P680+ + 2PQBH2
(19-12)
Eventualmente, os elétrons em PQ BH2 passam através do complexo do citocromo b6 f . O sítio de ligação para a plastoquinona é o local de ação de muitos herbicidas comerciais que matam
57
as plantam bloqueando a transferência de elétrons através do complexo do citocromo b6 f e impedindo a produção de ATP através da fotossíntese.
figura 19-46 Integração dos fotossistemas I e II nos cloroplastos . Este “esquema Z” mostra a via da
transferência de elétrons da H 2O (esquerda inferior) para o NADP + (direita) na fotossíntese não cíclica. A posição de cada carregador de elétron na escala vertical reflete o seu potencial de redução padrão. Para aumentar a energia dos elétrons derivados da H 2O ao nível requerido para reduzir o NADP + a NADPH, cada elétron deve ser “erguido” duas vezes (flechas grossas) pelos fótons absorvidos em FSI e FSII. Cada elétron requer um fóton em cada fotossistema. Após a excitação, os elétrons de alta energia fluem “morro abaixo” através da cadeia de carregadores mostrada na figura. Os prótons se movem através da membrana tilacóide durante a reação de quebra da água bem como durante a transferência de elétrons através do complexo do citocromo b6 f produzindo um gradiente de prótons que é fundamental para a formação de ATP. A seta tracejada é a via da transferência cíclica do elétron (discutida posteriormente no texto) onde somente FSI está envolvido. Os elétrons retornam a FSI através da via cíclica ao invés de reduzir o NADP + a NADPH. Os eventos fotoquímicos que ocorrem após a excitação de FSI (no centro de reação P700) são exatamente similares aos de FSII. O centro de reação P700* excitado perde um elétron para um aceptor Ao (acredita-se que é uma forma especial de clorofila, funcionalmente análoga à feofitina de FSII), originando A o- e P700+ (Fig. 19-46, lado direito). Novamente a excitação resulta em uma separação de carga no centro fotoquímico de reação. O P700 + é um forte agente oxidante, que rapidamente adquire um elétron da plastocianina, uma proteína de transferência de elétrons, solúvel e que contém cobre. A o- é
um agente redutor excepcionalmente forte que passa seu elétron através de uma cadeia de transportadores que leva ao NADP +. Inicialmente, a filoquinona (A1) aceita um elétron e o transfere para uma proteína ferro-enxofre (através de três centros Fe-S em FSI). A partir daí, o elétron se move para a ferredoxina (Fd), uma outra ferro-enxofre proteína fracamente associada à membrana tilacóide. A ferredoxina do espinafre (Mr 10700) contém um centro 2Fe-2S (Fig. 19-5) que sofre oxidação de um elétron e reações de redução. O quarto carregador de elétrons na cadeia é a flavoproteína ferredoxina-NADP+ oxidoredutase, que transfere os elétrons da ferredoxina reduzida (Fd red) para o NADP+: 2Fdred + 2H+ + NADP+ ∀ 2Fdox + NADPH + H+ Essa enzima é homóloga à ferredoxina-NAD redutase da bactéria sulfurosa verde (Fig. 1944b).
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Filoquinona
figura 19-47 Localização de FSI e FSII nas membranas tilacóides . O complexo coletor de luz CCLII e
a ATP sintase estão localizados tanto na região empacotada (lamela granal) como na região não empacotada (lamela estromal) da membrana tilacóide e têm rápido acesso ao ADP e NADP+ no estroma. O fotossistema II (FSII) é encontrado quase que exclusivamente nas regiões empacotadas e o fotossistema I (FSI) quase que exclusivamente nas regiões não empacotadas expostas ao estroma. O CCLII é o “adesivo” que mantém as lamelas empacotadas juntas (veja fig. 19-48).
A separação espacial dos fotossistemas I e II impede a fuga de excitons
A energia requerida para excitar FSI (P700) é menor que a requerida para excitar FSII (P680) (comprimento de onda menor corresponde a energia maior). Se FSI e FSII estivessem fisicamente contíguos, os excitons originários do sistema antena de FSII migrariam para o centro de reação de FSI, deixando FSII cronicamente sub-excitado e interferindo com a operação do sistema de dois centros. Essa fuga é impedida pela separação de FSI e FSII na membrana tilacóide (Fig. 19-47). FSII fica localizado quase que exclusivamente no conjunto de membranas firmemente justapostas da grana tilacóide (lamela granal) e o seu associado complexo coletor de luz (CCLII) medeia a forte associação das membranas adjacentes na grana. FSI e a ATP sintase estão localizados quase que exclusivamente nas membranas tilacóides não empacotadas (a lamela estromal), onde ambos têm acesso ao conteúdo do estroma, incluindo ADP e NADP +. O complexo do citocromo b6 f está presente em todas as partes da membrana tilacóide. A associação do CCLII com o FSII é regulada pela intensidade e comprimento de onda da luz. Na luz do sol brilhante (com grande componente de luz azul), FSII absorve mais luz que FSI e produz plastoquinona reduzida (plastoquinol, PQH 2) mais rápido que FSI consegue oxidá-lo. O resultante acúmulo de PQH 2 ativa uma proteína quinase que fosforila um resíduo de Tre do CCLII (Fig. 19-48). A fosforilação diminui a interação entre CCLII e FSII e, uma parte do CCLII se dissocia e se move para a lamela estromal. Ali ela captura prótons para FSI, aumenta a velocidade de oxidação de PQH 2 e reverte o desequilíbrio entre o fluxo de elétrons em FSI e FSII. Na presença de luz menos intensa, com mais vermelho (na sombra), FSI oxida PQH2 mais rápido que FSII possa sintetiza-lo e, o aumento resultante da concentração de PQ dispara a desfosforilação de CCLII, revertendo o efeito da fosforilação.
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figura 19-48 A modulação do empacotamento granal iguala o fluxo de elétrons em FSI e FSII . Um
domínio hidrofóbico do complexo coletor de luz CCLII em uma lamela tilacóide se insere em uma lamela vizinha e mantém as duas membranas firmemente justapostas (lamela granal). O acúmulo de plastoquinol estimula uma proteína quinase que fosforila um resíduo de Tre no domínio hidrofóbico de CCLII que por sua vez, reduz a sua afinidade pela membrana tilacóide vizinha, convertendo a lamela granal em lamela estromal. Uma proteína fosfatase específica reverte essa fosforilação reguladora quando a concentração de PQ aumenta.
O complexo do citocromo b6 f une os fotossistemas I e II
Os elétrons temporariamente armazenados no plastoquinol resultantes da excitação do P680 em FSII, são transportados para o P700 de FSI através do complexo do citocromo b6 f e da proteina solúvel plastocianina (Fig. 19-46, centro). Similarmente ao complexo III da mitocôndria, o complexo do citocromo b6 f (Fig. 19-49) contém um citocromo tipo b com dois grupos heme (denominados b H e bL), uma proteína ferro-enxofre Rieske (M r 20000) e o citocromo tipo c, c552, comumente chamada citocromo f (do Latin frons, significando “folha”). Os elétrons fluem através do complexo do citocromo b6 f , do PQBH2 para o citocromo f e então para a plastocianina. Finalmente atingem o P700, reduzindo-o. Tal como o complexo II da mitocôndria, o citocromo b6 f transporta elétrons da quinona reduzida – um carregador móvel de dois elétrons, solúvel em lipídeo (Q na mitocôndria e PQB nos cloroplastos) – para uma proteína solúvel que transporta um elétron (citocromo c na mitocôndria, plastocianina nos cloroplastos). Tal como na mitocôndria, a função desse complexo envolve um ciclo Q (Fig. 19-11), onde os elétrons passam, um de cada vez, do PQ BH2 para o citocromo b6. Este ciclo resulta no bombeamento de prótons através da membrana. Nos cloroplastos, a direção do movimento de prótons é do compartimento estromal para o lúmem tilacóide e, cerca de quatro prótons se movem para cada par de elétrons. O resultado é a produção de um gradiente de prótons através da membrana tilacóide à medida que os elétrons passam de FSII para FSI. Uma vez que o lúmem das membranas tilacóides achatadas é pequeno, o influxo de um pequeno número de prótons tem um efeito significativo no pH lumenal. A diferença de pH medida entre o estroma (pH 8) e o lúmem tilacóide (pH 5,0) representa uma variação de 1000 vezes na concentração dos prótons – uma poderosa força motriz para a síntese de ATP.
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figura 19-49 Fluxo de elétrons e prótons através do complexo do citocromo b6 f . O plastoquinol
(PQH2) formado em FSII é oxidado pelo citocromo b6 f em várias etapas similares às do ciclo Q no complexo do citocromo bc1 (complexo III) da mitocôndria (veja Fig. 19-11). Um elétron passa para centro Fe-S da proteína Rieske (púrpura) enquanto os outros, para os hemes do citocromo b6 (verde). O efeito global é a passagem de elétrons de PQH 2 para a plastocianina, uma proteína solúvel, que então os transporta para FSI.
A cianobactéria utiliza o complexo do citocromo b6 f e o citocromo c tanto na fosforilação oxidativa e como na fotofosforilação
A cianobactéria pode sintetizar ATP pela fosforilação oxidativa ou fotofosforilação, embora ela não tenha nem mitocôndria nem cloroplastos. A maquinaria enzimática para ambos os processo está em uma membrana plasmática altamente retorcida (veja Fig. 2-5). Dois componentes proteicos funcionam em ambos os processos (Fig. 19-50). O complexo do citocromo b6 f bombeador de prótons transporta elétrons da plastoquinona para o citocromo c na fotossíntese. Ele também transporta elétrons da ubiquinona para o citocromo c na fosforilação oxidativa, papel esse desempenhado pelo complexo do citocromo bc1 nas plantas superiores. O citocromo c, que na mitocôndria transporta elétrons do complexo III para o complexo IV, realiza a mesma função na cianobactéria. Entretanto, ele também transporta elétrons do complexo do citocromo b6 f para FSI, um papel desempenhado pela plastocianina nas plantas superiores. Desse modo, pode-se notar a homologia funcional entre o complexo do citocromo b6 f da cianobactéria e o complexo do citocromo bc1 das plantas bem como entre o citocromo c da cianobactéria e a plastocianina das plantas.
figura 19-50 O duplo papel do citocromo b6 f e citocromo c na cianobactéria. Estes organismos
utilizam citocromo b6 f , citocromo c e plastoquinona na fosforilação oxidativa e na fotofosforilação. (a) na fotofosforilação os elétrons fluem da água para o NADP +. (b) na fosforilação oxidativa, os elétrons fluem do NADH para o O 2. Ambos os processos são acompanhados pelo movimento de prótons através da membrana, terminando por um ciclo Q.
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A água é quebrada pelo complexo produtor de oxigênio
A principal fonte de elétrons que passam para o NADPH na fotossíntese das plantas (oxigênico) é a água. Tendo doado um elétron para a feofitina, o P680 + (de FSII) precisa adquirir um elétron para voltar ao seu estado fundamental preparando-se para capturar um outro fóton. Em princípio, o elétron requerido deve ser proveniente de compostos orgânicos ou inorgânicos. A bactéria fotossintetizadora utiliza uma variedade de doadores de elétrons para este propósito – acetato, succinato, malato ou sulfito – dependendo qual deles está disponível em um dado nicho ecológico. Há cerca de três milhões de anos, a evolução da bactéria fotossintetizadora primitiva (progenitores da cianobactéria moderna) produziu um fotossistema capaz de tomar elétrons de um doador sempre disponível, a água. Neste processo, duas moléculas de água são quebradas produzindo quatro elétrons, quatro prótons e oxigênio molecular: 2H2O ∀ 4H+ + 4e + O2 Um único fóton de luz visível não tem energia suficiente para quebrar as ligações da água. Quatro fótons são requeridos nesta reação de quebra fotolítica. Os quatro elétrons subtraídos da água não são transferidos diretamente para o P680 +, que pode aceitar apenas um elétron de cada vez. Por outro lado, um extraordinário mecanismo molecular, o complexo produtor de oxigênio (também chamado complexo de cisão da água ), transfere quatro elétrons, um de cada vez , para o P680 + (Fig. 19-51). O
doador de elétrons imediato ao P680 + é um resíduo de Tir (geralmente designado, Z ou Tir Z) em uma subunidade protéica do centro de reação de FSII. O resíduo de Tir perde um próton e um elétron, gerando um radical livre Tir eletricamente neutro, Tir •. 4 P680+ + 4 Tir ∀ 4 P680 + 4 Tir •
(19-13)
O radical Tir recupera seu elétron e próton oxidando um arranjo de quatro íons manganês no complexo de cisão da água. Através de cada transferência de um único elétron, o arranjo Mn se torna mais oxidado e, as quatro transferências de um único elétron, cada uma correspondendo à absorção de um fóton, produzem uma carga de +4 no complexo Mn (Fig. 19-51): 4 Tir • + [complexo Mn]o ∀ 4 Tir + [complexo Mn] 4+
(19-14)
Neste estado, o complexo Mn pode receber quatro elétrons de um par de moléculas de água, liberando 4 H+ e O2: [complexo Mn]4+ + 2H2O ∀ [complexo Mn]o + 4H+ + O2 (19-15)
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Uma vez que os quatro prótons produzidos na reação são liberados no lúmem tilacóide, o complexo produtor de oxigênio atua como uma bomba de prótons, impulsionada pela transferência de elétrons. A somatória das Equações 19-12 e 19-15 é: 2H2O + 2PQB + 4 fótons ∀ O2 + 2 PQBH2
(1916)
Tem sido excepcionalmente difícil purificar esta atividade de cisão da água que está associada ao centro de reação de FSII. Acredita-se que uma proteína periférica de membrana (Mr 33000) do lado lumenal da membrana tilacóide, estabiliza o complexo Mn. A estrutura detalhada do arranjo Mn ainda não é conhecida. Como o manganês pode existir nos estados de oxidação estáveis desde +2 até +7, esse arranjo de quatro íons certamente pode doar ou aceitar 4 elétrons. O mecanismo mostrado na Fig. 19-51 é consistente com fatos experimentais. Entretanto, até que as estruturas químicas exatas de todos os intermediários do arranjo de Mn sejam conhecidas, o mecanismo permanece elusivo.
figura 19-51 Atividade de cisão da água do complexo produtor de oxigênio . É mostrado o processo
que produz um agente oxidante de quatro elétrons, considerado um centro multinuclear com vários íons Mn, no complexo de quebra da água de FSII. A absorção sequencial de quatro fótons, cada um provocando a perda de um elétron do centro Mn, produz um agente oxidante que pode aceitar quatro elétrons de duas moléculas de água, produzindo O 2. Os elétrons perdidos pelo centro Mn são transferidos, um de cada vez, para um resíduo oxidado de Tir na proteína FSII.
A Síntese de ATP pela Fotofosforilação
A atividade combinada dos dois fotossistemas das plantas move os elétrons da água para o NADP+, conservando alguma energia da luz absorvida como NADPH (Fig. 19-46). Simultaneamente, prótons são bombeados através da membrana tilacóide e a energia é conservada como um potencial eletroquímico. Nós veremos agora o processo pelo qual esse gradiente de prótons dirige a síntese de ATP, o outro produto que conserva a energia das reações dependentes da luz.
Daniel Arnon Em 1954, Daniel Arnon e seus colegas descobriram que o ATP é gerado a partir de ADP e Pi durante a transferência de elétrons fotossintetizadora em cloroplastos de espinafre iluminados. O suporte para esses achados veio do trabalho de Albert Frenkel, onde foi
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detectado que a produção de ATP dependente da luz em estruturas membranosas contendo pigmentos chamadas cromatóforos , era proveniente de bactéria fotossintetizadora. Os investigadores concluíram que alguma energia luminosa capturada pelos sistemas fotossintetizadores destes organismos é transformada na energia da ligação fosfato do ATP. Este processo é chamado fotofosforilação, para diferencia-lo da fosforilação oxidativa na mitocôndria que respira.
Um gradiente de prótons acopla o fluxo de energia e a fosforilação
Várias propriedades da transferência de elétrons fotossintetizadores e da fotofosforilação nos cloroplastos indicam que o gradiente de prótons tem o mesmo papel que na fosforilação oxidativa da mitocôndria. (1) os centros de reação, os transportadores de elétrons e as enzimas formadoras de ATP estão localizados em uma membrana impermeável a prótons, a membrana tilacóide, que deve permanecer intacta para suportar a fotofosforilação. (2) a fotofosforilação pode ser desacoplada do fluxo de elétrons por reagentes que promovem a passagem dos prótons através da membrana tilacóide. (3) a fotofosforilação pode ser bloqueada pela venturicidina e compostos similares que inibem a formação do ATP, pela ATP sintase mitocondrial, a partir do ADP e P i (Tabela 19-4). (4) a síntese de ATP é catalisada pelos complexos F oF1, localizados na superfície externa das membranas tilacóides, que são muito semelhantes em estrutura e função aos complexos F oF1 da mitocôndria. As moléculas que transferem elétrons na cadeia dos transportadores conectando FSII e FSI estão orientadas assimetricamente na membrana tilacóide, de forma que o fluxo de elétrons fotoinduzido resulta em uma movimento líquido de prótons através da membrana, do lado estromal para lúmem tilacóide (Fig. 19-52). Em 1966, André Jagendorf mostrou que um gradiente de pH através da membrana tilacóide (alcalino do lado externo) poderia fornecer a força motriz para gerar ATP. As observações iniciais de Jagendorf forneceram algumas das mais importantes evidências experimentais em apoio à hipótese quimiosmótica de Mitchell. Ele incubou cloroplastos no escuro e em tampão de pH 4. O tampão penetrou lentamente no compartimento interno dos tilacóides, diminuindo o seu pH interno. Ele adicionou ADP e P i à suspensão escura de cloroplastos e, subitamente, elevou o pH do meio externo até 8, criando momentaneamente um grande gradiente de pH através da membrana. À medida que os prótons se movimentavam para fora dos tilacóides até o meio externo, o ATP era gerado a partir do ADP e Pi. Como a formação do ATP ocorreu no escuro (sem nenhuma entrada de energia luminosa), este experimento mostrou que um gradiente de pH através da membrana é um
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estado de alta energia que pode, como na fosforilação oxidativa mitocondrial, mediar a transdução de energia da transferência de elétrons para a energia química do ATP.
figura 19-52 Circuitos dos prótons e dos elétrons nos tilacóides. Os elétrons (setas azuis) se movem da
H2O através de FSII, a cadeia intermediária de transportadores FSI e finalmente para o NADP+. Os prótons (setas vermelhas) são bombeados para o lúmem tilacóide pelo fluxo de elétrons através da cadeia de transportadores entre FSII e FSI e entram novamente no estroma através dos canais de prótons formados pela porção F o da ATP sintase, designada CFo na enzima do cloroplasto. A subunidade F 1, CF1, catalisa a síntese do ATP.
André Jagendorf
A estequiometria aproximada da fotofosforilação já foi estabelecida
À medida que os elétrons se movem da água para o NADP +, cerca de 12 H + se movem do estroma para o lúmem tilacóide, para cada quatro elétrons que passam (isto é, para cada dois O2 formados). Quatro desses prótons são transportados pelo complexo produtor de oxigênio e cerca de oito, pelo complexo do citocromo b6 f . O resultado mensurável é uma diferença de 1000 vezes na concentração dos prótons através da membrana tilacóide ( ∆ pH= 3). Lembrese que a energia armazenada no gradiente de prótons (o potencial eletroquímico) apresenta dois componentes: uma diferença de concentração de prótons ( ∆ pH) e um potencial elétrico (∆ψ ) devido a separação de carga. Nos cloroplastos, o ∆ pH é o componente dominante. O movimento dos contra íons aparentemente dissipa a maior parte do potencial elétrico. Nos cloroplastos iluminados, a energia armazenada no gradiente de prótons por mol de prótons é: ∆G = RT ln ∆ pH + Z F ∆ψ = - 17 kJ/mol
Assim, o movimento de 12 mols de prótons através da membrana tilacóide representa a conservação de cerca de 200 kJ de energia, energia suficiente para dirigir a síntese de vários mols de ATP (∆G’o= 30,5 kJ/mol). Medidas experimentais produziram valores de ATP por O2 de cerca de 3. Pelo menos oito fótons devem ser absorvidos para impulsionar quatro elétrons da H2O para o NADP + (um fóton por elétron em cada centro de reação). A energia nos oito fótons da luz visível é mais que suficiente para a síntese de três moléculas de ATP.
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A síntese de ATP não é somente uma reação de conservação de energia da fotossíntese. O NADPH formado no final da transferência de elétrons também é energeticamente rico, similarmente ao seu análogo NADH. A equação global para a fotofosforilação não cíclica (veja a seguir) é: 2H2O + 8 fótons + 2NADP + + 3ADP + 3Pi ∀ O2 + ~3ATP + 2NADPH
(19-17)
O fluxo cíclico de elétrons produz ATP mas não NADPH ou O 2
Uma via alternativa do fluxo de elétrons induzido pela luz permite aos cloroplastos variarem a razão NADPH e ATP formados na presença da luz. Ela é chamada fluxo cíclico de elétrons para se diferenciar do ciclo normalmente unidirecional ou fluxo não cíclico de elétrons da H2O para o NADP +. O fluxo cíclico de elétrons (Fig. 19-46) envolve somente
FSI. Os elétrons transportados do P700 para a ferredoxina não continuam para o NADP +, mas voltam através do complexo do citocromo b6 f para a plastocianina. O caminho dos elétrons se equipara ao da bactéria sulfurosa verde (Fig. 19-44b). A plastocianina doa os elétrons para o P700, que os transfere para a ferredoxina quando iluminada. Desse modo, na luz, FSI pode causar um movimento cíclico dos elétrons para fora do centro de reação de FSI e depois voltando para ele. Cada elétron é impelido ao redor do ciclo pela energia produzida pela absorção de um fóton. O fluxo cíclico dos elétrons não é acompanhado pela formação real de NADPH ou evolução de O 2. Entretanto, ele é acompanhado pelo bombeamento de prótons pelo complexo do citocromo b6 f e pela fosforilação do ADP em ATP, que é denominada fotofosforilação cíclica . A equação geral para o fluxo cíclico de elétrons e fotofosforilação é simplesmente: luz ADP + Pi ∀ ATP + H2O Regulando a partição de elétrons entre o NADP + e a fotofosforilação cíclica, a planta ajusta a relação de ATP e NADPH produzidos nas reações dependentes de luz igualar as suas necessidades em relação a esses produtos nas reações de assimilação de carbono. Conforme será visto no Capítulo 20, as reações de assimilação de carbono requerem ATP e NADPH em uma relação de 3:2.
A ATP sintase dos cloroplastos é similar à da mitocôndria
A enzima responsável pela síntese do ATP nos cloroplastos é um grande complexo com dois componentes funcionais, CF o e CF1 (o C denota a sua origem nos cloroplastos). CF o é um poro de prótons transmembrana composto de várias proteínas integrais de membrana e é
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homólogo à Fo mitocondrial. CF1 é um complexo protéico periférico de membrana muito semelhante à F1 mitocondrial em relação à composição em subunidades, estrutura e função. A microscopia eletrônica de cloroplastos secionados mostra complexos da ATP sintase como projeções semelhantes a maçanetas na superfície externa (estromal) das membranas tilacóides. Estes complexos correspondem ao complexo da ATP sintase vistos projetando-se na superfície interna (matriz ou N) da membrana mitocondrial interna. Desta forma, tanto a orientação da ATP sintase como a direção do bombeamento dos prótons nos cloroplastos, são opostas àquelas na mitocôndria. Em ambos os casos, a porção F 1 da ATP sintase está localizada no lado mais alcalino (N) da membrana, através do qual os prótons fluem na direção do seu gradiente de concentração. A direção do fluxo de prótons relativo a F1 é a mesma nos dois casos: P e N (Fig. 19-53). Acredita-se que o mecanismo da ATP sintase do cloroplasto também seja essencialmente idêntico àquele da sua análoga mitocondrial. O ADP e o P i se condensam rapidamente para formar o ATP na superfície da enzima e, a liberação deste ATP ligado à enzima requer uma força próton motriz. A catálise rotacional emprega seqüencialmente cada uma das três subunidades β da ATP sintase na síntese e liberação do ATP e na ligação do ADP + Pi (Fig. 19-23, 19-24).
figura 19-53
Comparação da topologia do movimento dos prótons e da orientação da ATP sintase nas membranas da mitocôndria, cloroplastos e bactéria E. coli. Em cada caso, a orientação do gradiente de prótons em relação à ATP sintase é a mesma.
Os cloroplastos provavelmente surgiram de cianobactérias endossimbióticas
Da mesma forma que as mitocôndrias, os cloroplastos contêm o seu próprio DNA e a sua maquinaria sintetizadora de proteínas. Algumas proteínas do cloroplasto são codificadas pelos genes dos cloroplastos e sintetizadas nos cloroplastos, enquanto outras são codificadas por genes nucleares, sintetizadas fora dos cloroplastos e importadas (veja Fig. 27-39b). Quando as células das plantas crescem e se dividem, os cloroplastos dão origem a novos cloroplastos por divisão, durante a qual o seu DNA é replicado e dividido entre cloroplastos filhos. A maquinaria e o mecanismo para a captura de luz, fluxo de elétrons e síntese de ATP nas bactérias fotossintetizadoras são similares em muitos aspectos àqueles dos cloroplastos das plantas superiores. Estas observações levam à hipótese, agora largamente aceita, de que os progenitores evolutivos das modernas células das plantas foram eucariotos primitivos que
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engolfaram as bactérias fotossintetizadoras e estabeleceram relações endossimbióticas estáveis com elas (Fig. 2-15). Através de vários critérios, o FSII das plantas pode ter derivado do centro de reação da bactéria púrpura enquanto o FSI pode ter derivado da bactéria verde. Os proclorofitos, bactérias fotossintetizadoras que contém a clorofila a e a b, mas não ficobilinas, são os prováveis progenitores dos cloroplastos das atuais plantas superiores. Comparações das seqüências de DNA em genes que codificam proteínas do fotossistema nas plantas superiores e nos proclorofitos, suportam essa relação evolutiva. A cianobactéria utiliza a clorofila a e ficobilinas para coletar luz e provavelmente são os progenitores dos cloroplastos das atuais algas vermelhas, que também usam a clorofila a e ficobilinas.
Diversos organismos fotossintetizadores usam doadores de hidrogênio diferentes da H2O
Pelo menos metade da atividade fotossintetizadora na Terra ocorre em microrganismos tais como algas, outros eucariotos fotossintetizadores e bactérias fotossintetizadoras. A cianobactéria apresenta os sistemas FSII e FSI em sequência e o sistema FSII apresenta uma atividade de cisão da água, muito parecida com aquela das plantas. Entretanto, os outros grupos de bactérias fotossintetizadoras apresentam um único centro de reação e não quebram a água ou produzem O 2. Muitas são anaeróbicos restritos e não toleram O 2. Elas devem usar como doador de elétron, algum composto diferente da água. Algumas bactérias fotossintetizadoras usam compostos inorgânicos como doadores de elétrons (e hidrogênio). Por exemplo, a bactéria sulfurosa verde utiliza H 2S: luz 2 H2S + CO2 ∀ (CH2O) + H2O + 2 S Estas bactérias, ao invés de produzir O 2 molecular, produzem enxofre elementar como produto de oxidação do H 2S. Outras bactérias fotossintetizadoras usam compostos orgânicos tal como o lactato como doadores de elétrons. luz 2 Lactato + CO2 ∀ (CH2O) + H2O + 2 piruvato A similaridade fundamental entre fotossíntese das plantas e a das bactérias, apesar das diferenças nos doadores de elétrons que elas empregam, torna-se mais obvia quando a equação da fotossíntese é escrita em uma forma mais geral: luz
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2 H2D + CO2 ∀ (CH2O) + H2O + 2 D onde H2D é um doador de elétrons (hidrogênio) e D é a sua forma oxidada. H 2D pode ser água, sulfeto de hidrogênio, lactato ou algum outro composto orgânico, dependendo das espécies. É muito provável que a bactéria que primeiro desenvolveu habilidade fotossintetizadora utilizou H2S como fonte de elétrons e que, somente após o desenvolvimento posterior da fotossíntese oxigênica (há cerca de 2,3 bilhões de anos) que o oxigênio tornou-se uma significativa proporção da atmosfera terrestre. Com esse desenvolvimento, a evolução do sistema de transferência de elétrons que usa O 2 como seu principal aceptor de elétrons tornou-se possível, culminando com a extração de energia altamente eficiente da fosforilação oxidativa.
Na bactéria halofílica, uma única proteína absorve luz e bombeia prótons para dirigir a síntese de ATP
A bactéria halofílica (“que gosta de sal”) Halobacterium salinarum, uma arquebactéria derivada de um progenitor evolutivo muito antigo, capta a energia da luz solar através de um processo muito diferente do mecanismo fotossintetizador já descrito. Essa bactéria vive somente em lagoas de salmoura e lagos salgados (Grande Lago Salgado ou Mar Morto, por exemplo), onde a alta concentração salina, que pode exceder 4M, resulta da perda de água por evaporação. De fato, a holobactéria não consegue viver em concentrações de NaCl menores que 3M. Estes organismos são aeróbicos e normalmente usam o O 2 para oxidar as moléculas orgânicas combustíveis. Entretanto, a solubilidade do O 2 é tão baixa nas lagoas de salmoura, que algumas vezes o metabolismo oxidativo deve ser suplementado pela luz solar como uma fonte alternativa de energia. A membrana plasmática da H. salinarum contém regiões de pigmentos que absorvem luz, bacteriorrodopsina, que contém o retinal (aldeído derivado da vitamina A, veja Fig. 11-19) como grupo prostético. Quando as células são iluminadas, o trans-retinal (retinal com todas as suas duplas ligações na forma trans) ligado a bacteriorrodopsina absorve um fóton e sofre fotoisomerização para 13-cis-retinal. A restauração do trans-retinal é acompanhada pela liberação de prótons para fora da célula através da membrana plasmática. A bacteriorrodopsina, com apenas 247 resíduos de aminoácidos é a mais simples bomba de prótons impulsionada pela luz. A diferença na estrutura tridimensional da bacteriorrodopsina no escuro e após iluminação (Fig. 19-54a) sugere uma via através da qual uma série ajustada de “saltos” de prótons pode mover efetivamente um próton através da membrana à medida que a modificação conformacional ocorre. O cromóforo retinal fica ligado ao grupo ε-amino
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da lisina através de uma ligação do tipo base de Schiff. No escuro, o N desta base de Schiff é protonado mas, a fotoisomerização do retinal diminui o pK a deste grupo e ele libera seu próton para um resíduo Asp nas proximidades, iniciando uma série de saltos de prótons que fundamentalmente resultam na liberação de um próton na superfície externa da membrana (Fig. 19-54b). O potencial eletroquímico resultante impulsiona os prótons de volta para a célula através do complexo ATP sintase ligado à membrana que é muito similar ao da mitocôndria e do cloroplasto. Assim, a holobactéria pode usar a luz como fonte para suplementar o ATP sintetizado pela fosforilação oxidativa quando o O 2 é limitado. Entretanto, a holobactéria não produz O2 nem efetua a fotorredução do NADP +. Sua maquinaria fototransdutora é contudo mais simples que a da cianobactéria e plantas superiores. Todavia, o mecanismo de bombeamento de prótons usado por esta única proteína representa o protótipo de muitas outras, mais complexas, bombas de íons.
figura 19-54 Bombeamento de prótons dirigido pela luz pela bacteriorrodopsina (a) A bacteriorrodopsina (Mr 26000) tem sete α hélices que atravessam a membrana. O
cromóforo trans retinal (púrpura) está ligado covalentemente via base de Schiff a um grupo ε-amino de um resíduo de Lis mergulhado no interior da membrana. Espalhados ao longo da
proteina estão vários resíduos de Asp e Glu e várias moléculas de água intimamente associadas que, juntas proporcionam a via transmembrana de prótons (setas vermelhas). As etapas a indicam os movimentos de prótons descritos a seguir. (b) no escuro (painel a esquerdo), a base de Schiff é protonada. A iluminação (painel a direita) fotoisomerisa o retinal forçando mudanças conformacionais súbitas na proteína que altera a distância entre a base de Schiff e seus resíduos de aminoácidos vizinhos. A interação com estes vizinhos, diminui o pK a da base de Schiff e, ela doa seu próton para o grupo carboxílico de um Asp 85 próximo (passo
em
(a)). Isto inicia uma série ajustada de saltos de prótons entre as
moléculas de água (veja Fig. 4-12) no interior da proteína, que termina com o passo
,
a
liberação de um próton que foi compartilhado pelo Glu 194 e Glu204 próximo à superfície extracelular. A base de Schiff readquire o próton do Asp 96 () que por sua vez toma um próton do citosol (). Finalmente, o Asp85 doa o seu próton, acarretando a protonação do par Glu204-Glu194 (). O sistema agora está preparado para um outro ciclo de bombeamento de prótons.
70
Resumo
A teoria quimiosmótica fornece o arcabouço intelectual para o entendimento de muitas transduções de energia biológicas, incluindo os processos de fosforilação oxidativa e a fotofosforilação. O mecanismo de acoplamento da energia é semelhante em ambos os casos: a energia do fluxo de elétrons é conservada pelo bombeamento concomitante de prótons através da membrana, produzindo um gradiente eletroquímico, a força próton motriz. Na mitocôndria, os átomos de H removidos dos substratos pelas desidrogenases ligadas ao NAD doam elétrons para a cadeia respiratória (transferência de elétrons), que os transferem ao O2 molecular, reduzindo-o a H 2O. Sistemas de lançadeiras transferem os equivalentes redutores do NADH citosólico ao NADH mitocondrial. Os equivalentes redutores de todas as desidrogenações ligadas ao NAD são transferidos à NADH desidrogenase mitocondrial (complexo I). Eles então passam através de uma série de centros Fe-S para a ubiquinona que, transfere os elétrons ao citocromo b, o primeiro transportador no complexo III. Neste complexo, os elétrons passam através de dois citocromos do tipo b e do citocromo c1 antes de atingir um centro Fe-S. O centro Fe-S passa os elétrons, um de cada vez, através do citocromo c para o complexo IV, citocromo oxidase. Esta enzima que contém cobre e que também contém os citocromos a e a3, acumula elétrons, passando-os então para o O2 que é reduzido a H 2O. Alguns elétrons entram nesta cadeia de carregadores através de vias alternativas. O succinato, por exemplo, é oxidado pela succinato desidrogenase (complexo II), que contém uma flavoproteína (com FAD), que passa os elétrons para a ubiquinona, através de vários centros Fe-S. Os elétrons derivados da oxidação dos ácidos graxos passam para a ubiquinona através da flavoproteína de transferência de elétrons (FTE). O fluxo de elétrons através dos complexos I, III e IV resulta no bombeamento de prótons através da membrana mitocondrial interna, tornando a matriz alcalina em relação ao espaço intermembranoso. Este gradiente de prótons fornece a energia (força próton motriz) para a síntese do ATP a partir do ADP e P i pela ATP sintase da membrana interna (complexo FoF1). Esta enzima promove a “catálise rotacional” onde o fluxo de prótons através de F o faz com que cada um dos sítios de ligação dos nucleotídeos em F 1 oscilem entre as configurações (ADP+Pi) ligado, ATP ligado e vazia. A formação de ATP na enzima requer pouca energia e, o papel da força próton motriz é empurrar o ATP do seu sítio de ligação na sintase. As bactérias realizam a fosforilação oxidativa por mecanismos essencialmente semelhantes, usando os transportadores de elétrons e uma ATP sintase, na membrana plasmática. A fosforilação oxidativa, que produz a maioria do ATP requerido pelas células aeróbicas, é regulada pelas demandas de energia celular. No tecido adiposo marrom, que é
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especializado para a produção do calor metabólico, a transferência de elétrons está desacoplada da síntese de ATP e, a energia da oxidação de ácidos graxos é, portanto, dissipada como calor. A fotofosforilação nos cloroplastos das plantas verdes e nas cianobactérias também envolve o fluxo de elétrons através de uma série de transportadores ligados à membrana. Nas reações luminosas das plantas, a absorção de um fóton excita as moléculas de clorofila e outros pigmentos (acessórios) que canalizam a energia para os centros de reação nas membranas tilacóides. Nos centros de reação, a fotoexcitação resulta em uma separação de carga que produz um bom doador de elétrons (agente redutor) e um bom aceptor de elétrons. As bactérias apresentam um único centro de reação; nas bactérias púrpuras ele é do tipo feofitina–quinona e, na bactéria sulfurosa verde, do tipo Fe-S. Estudos estruturais do centro de reação da bactéria púrpura proporcionaram informações sobre o fluxo de elétrons impulcionados pela luz de um par especial excitado de moléculas de clorofila, através da feofitina para as quinonas. Os elétrons então passam das quinonas através do complexo do citocromo bc1 de volta para o centro de reação. Uma via alternativa, na bactéria sulfurosa verde, envia elétrons das quinonas reduzidas para o NAD +. O fluxo de elétrons através do complexo do citocromo bc1 impulsiona os prótons através da membrana plasmática criando uma força próton motriz que fornece a energia para a síntese do ATP por uma ATP sintase similar à da mitocôndria. A cianobactéria e as plantas apresentam dois centros de reações diferentes que funcionam juntos. O fotossistema I das plantas, passa elétrons do seu centro de reação excitado, P700, através de uma série de transportadores até a ferredoxina que então reduz o NADP+ a NADPH. O centro de reação, P680, do fotossistema II passa elétrons para a plastoquinona e, os elétrons perdidos pelo P680 são substituídos por elétrons retirados da H2O (outros doadores de hidrogênio, diferentes da H 2O, são usados em outros organismos). Esta cisão da H 2O provocada pela luz é catalisada por um complexo protéico contendo Mn, com produção de O 2. A plastoquinona reduzida transporta elétrons para o complexo do citocromo b6 f. Daí eles passam para a plastocianina e então para o P700 para substituir os elétrons perdidos durante a fotoexcitação. A cisão da água e o fluxo de elétrons através do complexo do citocromo b6 f são acompanhados pelo bombeamento de prótons através da membrana tilacóide e, a força próton motriz assim criada. dirige a síntese de ATP por um complexo CFoCF1, muito semelhante ao complexo F oF1 da mitocôndria. Desta forma, este fluxo de elétrons através dos fotossistemas II e I produz NADPH e ATP em uma razão de 2:3. Um segundo tipo de fluxo de elétrons (fluxo cíclico) produz apenas ATP e permite uma variabilidade nas proporções de NADPH e ATP formados. A localização de FSI e FSII entre as lamelas granal e estromal é variável e é controlada indiretamente pela intensidade
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luminosa, otimizando a distribuição de excitons entre FSI e FSII para uma captura eficiente de energia. Tanto a mitocôndria quanto os cloroplastos contêm os seus próprios genomas, e acredita-se que eles tenham se originado de procariotos endossimbiontes das células eucariotas primitivas. A fosforilação oxidativa nas bactérias aeróbicas e a fotofosforilação nas bactérias fotossintetizadoras são muito semelhantes, na maquinaria e no mecanismo, aos processos homólogos nas mitocôndrias e nos cloroplastos. A cianobactéria utiliza vários complexos enzimáticos tanto na fosforilação oxidativa quanto na fotofosforilação, ilustrando a similaridade entre os dois processos. A bacteriorrodopsina é a bomba de prótons impulsionada pela luz e o sistema fotossintetizador mais simples e melhor compreendida.
leitura adicional
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Um curto sumário bem escrito e bem ilustrado das transduções de energia na mitocôndria, cloroplastos e bactéria.
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A conferência Nobel de Mitchell, resumindo a evolução da hipótese quimiosmótica . Ort DR, Yocum CF, & Heichel IF (eds) (1996) Oxygenic Photosynthesis: The Ligth Reactions, Advances in Photosynthesis, Vol 4, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The
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Um relato claro e crítico da evolução do modelo quimiosmótico.
Fosforilação oxidativa
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Um artigo de pesquisa que traz detalhes estruturais importantes que suportam o mecanismo catalítico. Boyer PD (1997) The ATP synthase – a splendid molecular machine. Ann. Rev. Biochem. 66, 717-749.
Uma narrativa sobre o desenvolvimento histórico e o estado atual do modelo da troca de ligação, escrita pelo seu principal arquiteto. Hinkle PC, Kumar MA, Resetar A, & Harris DL (1991) Mechanistic stoichiometry of
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O experimento clássico que estabeleceu a capacidade do gradiente de próton de comandar a síntese de ATP no escuro. Kerfeld CA & Krogmann DW (1998) Photosynthetic cytochromes c in cyanobacteria,
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problemas 1. Reações de oxidação-redução – O complexo da NADH desidrogenase da cadeia
respiratória mitocondrial promove as seguintes séries de reações de oxidação-redução, onde o Fe3+ e o Fe2+ representam o Fe nos centros ferro-enxofre, Q é a ubiquinona, QH 2 é o ubiquinol e E é a enzima: 1)
NADH + H+ + E-FMN ∀ NAD+ + E-FMNH2
2)
E-FMNH2 + 2Fe3+ ∀ E-FMN + 2Fe2+ + 2H+
3)
2Fe2+ + 2H+ + Q ∀ 2Fe3+ + QH2
______________________________________________ Soma: NADH + H+ + Q ∀ NAD+ + QH2 Para cada uma das três reações catalisadas pelo complexo da NADH desidrogenase identifique: a) o doador de elétrons; b) o aceptor de elétrons; c) o par redox conjugado; d) o agente redutor; e) o agente oxidante. 2. Todas as partes da ubiquinona têm uma função – Na transferência de elétrons, somente
a porção quinona da ubiquinona sofre oxidação-redução enquanto a porção isoprenóide permanece inalterada. Qual é a função desta cadeia ? 3. O uso do FAD ao invés do NAD + na oxidação do succinato – Todos as desidrogenases
da glicólise e do ciclo do ácido cítrico usam NAD + (E’o para o NAD+/NADH é -0,32 V) como aceptor de elétrons, exceto a succinato desidrogenase, que usa o FAD covalentemente ligado (E’o para o FAD/FADH 2 nesta enzima é 0,05V). Porque o FAD é um aceptor de elétrons mais apropriado que o NAD+ na desidrogenação do succinato baseado na comparação dos valores de E’ o para o par fumarato/succinato (E’ o = 0,03), NAD+/NADH e o FAD/FADH2 da succinato desidrogenase. 4. O grau de redução dos transportadores de elétrons na cadeia respiratória – O grau de
redução de cada transportador de elétrons na cadeia respiratória é determinado pelas condições existentes na mitocôndria. Por exemplo, quando o NADH e O 2 forem abundantes, o grau de redução de estado estacionário dos transportadores diminui à medida que os elétrons passam do substrato para o O 2. Quando a transferência de elétrons é bloqueada, os transportadores antes do bloqueio tornam-se mais reduzidos enquanto aqueles além do bloqueio tornam-se mais oxidados (veja Fig. 19-6). Para cada uma das condições abaixo, preveja o estado de oxidação da ubiquinona e dos citocromos b, c1, c e a + a3. a) NADH e O2 abundantes, mas na presença de cianeto.
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b) NADH abundante, mas com falta de O 2. c) O2 abundante, mas com falta de NADH. d) NADH e O2 abundantes. 5. Efeito da rotenona e da antimicina A na transferência de elétrons – A rotenona, um
produto natural tóxico de plantas, inibe fortemente a NADH desidrogenase mitocondrial de insetos e peixes. A antimicina A, um antibiótico tóxico, inibe fortemente a oxidação do ubiquinol. a) Explique porque a ingestão de rotenona é letal para algumas espécies de insetos e peixes. b) Explique porque a antimicina A é um veneno. c) Assumindo que a rotenona e a antimicina A são igualmente efetivas no bloqueio dos seus respectivos sítios na cadeia de transferência de elétrons, qual seria o veneno mais potente? Explique. 6. Desacopladores da fosforilação oxidativa – Na mitocôndria normal a velocidade da
transferência de elétrons é fortemente acoplada à demanda de ATP. Quando a velocidade de utilização do ATP for relativamente baixa, a velocidade da transferência de elétrons é baixa. Quando a demanda de ATP aumenta, a velocidade de transferência de elétrons também aumenta. Nestas condições de forte acoplamento, o número de moléculas de ATP produzidas por átomo de oxigênio consumido, quando o NADH é o doador de elétrons – o quociente P/O – é cerca de 2,5. a) Preveja os efeitos de uma concentração relativamente baixa e outra relativamente alta de um agente desacoplador na velocidade da transferência de elétrons e no quociente P/O. b) A ingestão dos desacopladores provoca profunda sudorese e um aumento na temperatura corporal. Explique este fenômeno em termos moleculares. O que acontece com o quociente P/O na presença dos desacopladores? c) O desacoplador 2,4-dinitrofenol certa vez foi prescrito como droga redutora do peso corporal. Em princípio, como esta droga poderia funcionar na ajuda da redução do peso corporal ? Tais agentes desacopladores não são mais prescritos devido a algumas mortes ocorridas após o seu uso. Como a ingestão de desacopladores pode levar à morte ? 7. Efeitos da valinomicina na fosforilação oxidativa – Quando o antibiótico valinomicina é
adicionado à uma suspensão de mitocôndrias que respiram ativamente, várias coisas acontecem: o rendimento de ATP diminui, a velocidade de consumo de O 2 aumenta, calor é liberado e o gradiente de pH através da membrana mitocondrial interna aumenta. A
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valinomicina atua como um desacoplador ou um inibidor da fosforilação oxidativa ? Explique as observações experimentais em termos da capacidade do antibiótico transferir íons K + através da membrana interna da mitocôndria. 8. Modo de ação da diciclohexilcarbodiimida (DCCD) – Quando a DCCD é adicionada a
uma suspensão de mitocôndrias fortemente acopladas e que respiram ativamente, a velocidade da transferência de elétrons (medida pelo consumo do O 2) e a velocidade da produção de ATP diminuem drasticamente. Se uma solução de 2,4-dinitrofenol é adicionada à preparação mitocondrial inibida, o consumo de O 2 retorna ao normal mas a produção de ATP permanece inibida. a) Que processo na transferência de elétrons ou na fosforilação oxidativa é afetado pela DCCD ? b) Porque a DCCD afeta o consumo de O 2 da mitocôndria ? Explique o efeito do 2,4dinitrofenol na preparação mitocondrial inibida. c) Com quais dos seguintes inibidores a DCCD mais se assemelha na ação: a antimicina A, rotenona ou oligomicina ? 9. Compartimentação dos componentes do ciclo do ácido cítrico – A isocitrato
desidrogenase é encontrada somente na mitocôndria, mas a malato desidrogenase é encontrada tanto no citosol como na mitocôndria. Qual é o papel da malato desidrogenase citosólica ? 10. O sistema de transporte malato- -cetoglutarato – O
transporte de malato e α-
cetoglutarato através da membrana interna da mitocôndria (Fig. 19-26) é inibido pelo n butilmalonato. Suponha que o n-butilmalonato seja adicionado a uma suspensão aeróbica de células renais que usam a glicose como combustível exclusivo. Preveja o efeito deste inibidor: a) na glicólise; b) no consumo de oxigênio; c) na formação do lactato; d) na síntese do ATP. 11. A concentração celular do ADP controla a formação do ATP – Embora o ADP e o P i
são requeridos para a síntese do ATP, a velocidade de síntese depende principalmente da concentração do ADP e não do P i, porque ? 12 . O efeito Pasteur – Quando O2 é adicionado a uma suspensão aeróbica de células que
consomem glicose em uma alta taxa, a velocidade de consumo da glicose declina dramaticamente à medida que o O 2 é consumido e, o acúmulo de lactato cessa. Este efeito, inicialmente observado por Louis Pasteur em 1860, é característico da maioria das células capazes de utilizar tanto o catabolismo aeróbico como anaeróbico da glicose. a) Porque o acúmulo de lactato cessa após a adição de O 2 ?
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b) Porque a presença de O 2 diminui a velocidade do consumo da glicose ? c) Como o início do consumo do O 2 diminui a velocidade do consumo da glicose ? Explique em termos de enzimas específicas. 13. Mutantes de levedura com respiração deficiente e produção de etanol – Mutantes de
levedura com respiração deficiente (p-, “petites”) podem ser produzidos através de progenitores selvagens através de tratamento com agentes mutagênicos. Os mutantes perdem a citocromo oxidase, uma deficiência que afeta marcantemente seu comportamento metabólico. Um efeito extraordinário é que a fermentação não é suprimida pelo O 2, isto é, os mutantes perdem o efeito Pasteur (ver problema 14). Algumas companhias estão muito interessadas em usar estes mutantes para fermentar cavacos de madeira em etanol para uso energético. Explique as vantagens de se usar estes mutantes ao invés da levedura selvagem, na produção em larga escala de etanol. Porque a ausência da citocromo oxidase elimina a efeito Pasteur ? 14. Quantos prótons em uma mitocôndria ? – A transferência de elétrons transloca
prótons da matriz mitocondrial para o meio externo, estabelecendo um gradiente de pH através da membrana interna (lado externo mais ácido que o interno). A tendência dos prótons em difundir de volta para o interior da matriz, é a força impulsora da síntese do ATP pela ATP sintase. Durante a fosforilação oxidativa por uma suspensão de mitocôndria em um meio de pH 7,4, o pH interno da matriz medido foi 7,7. a) Calcule a [H+] no meio externo e na matriz nestas condições. b) Qual é o relação da [H+] exterior: interior ? Comente sobre a energia inerente nesta concentração. (Indicação: veja Eq. 12-3). c) Calcule o número de prótons em uma mitocôndria de fígado respirando, assumindo que o seu compartimento matricial interno é uma esfera de 1,5 µm de diâmetro. d) Considerando estes dados você pensaria que o gradiente de pH sozinho seria suficiente para gerar o ATP ? e) Se não, você pode sugerir como a energia necessária para a síntese do ATP se origina ? 15. Velocidade da renovação do ATP no músculo cardíaco de rato – O músculo cardíaco
de rato operando aerobicamente preenche mais que 90% das suas necessidades de ATP pela fosforilação oxidativa. Cada grama do tecido consome O 2 em uma velocidade de 10 µmol/min, usando a glicose fonte de energia.
a) Calcule a velocidade com que o músculo cardíaco consome glicose e produz ATP.
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b) Para uma concentração estacionária de ATP de 5 µmol/g de tecido muscular cardíaco, calcule o tempo requerido (em segundos) para renovar completamente a concentração celular de ATP. O que este resultado indica sobre a necessidade de uma forte regulação da produção de ATP ? (Observe: concentrações são expressas em micromols por grama de tecido muscular porque o tecido é constituído principalmente de água.) 16. Velocidade da degradação do ATP no músculo de voar – A produção de ATP nos
músculos voadores do mosquito Lucilia sericata provém quase exclusivamente da fosforilação oxidativa. Durante o vôo, 187 ml de O 2/h.g de peso corporal são necessários para manter uma concentração de ATP em 7 µmol/g do músculo de voar. Assumindo que o músculo de voar representa 20% do peso da mosquito calcule a velocidade na qual o ATP desse músculo se renova. Quanto tempo duraria o reservatório do ATP na ausência da fosforilação oxidativa ? Assuma que os equivalentes redutores são transferidos pela lançadeira do glicerol-3-fosfato e que o O 2 esteja a 25°C e 101,3 kPa (1atm). (Observe: as concentrações são expressas em micromols por grama de músculo de voar.) 17. Movimentação transmembrana dos equivalentes redutores – Em condições
aeróbicas, o NADH extramitocondrial deve ser oxidado pela cadeia de transferência de elétrons mitocondrial. Considere uma preparação de hepatócitos de ratos, contendo mitocôndria e todas as enzimas do citosol. Se o [4- 3H] NADH for adicionado, a radioatividade aparece rapidamente na matriz mitocondrial. Entretanto, se o [7- 14C] NADH for adicionado, nenhuma radioatividade aparece na matriz. O que estas observações revelam sobre a oxidação do NADH extramitocondrial pela cadeia de transferência de elétrons ? 18. Reservatórios de NAD e atividades desidrogenases – Embora a piruvato desidrogenase
e a gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase usam NAD + como aceptor de elétrons, as duas enzimas não competem pelo mesmo reservatório celular de NAD. Porque ? 19. Eficiência fotoquímica da luz em diferentes comprimentos de onda – A velocidade
da fotossíntese, medida pela produção de O 2, é maior quando uma planta verde é iluminada com luz de comprimento de onda de 680 nm que com a luz de 700 nm. Entretanto, a iluminação com uma combinação de luz de 680 nm e 700 nm resulta em uma velocidade de fotossíntese maior que a obtida com a luz de um dos comprimentos de onda isoladamente. Explique. 20. Balanço de massa para a fotossíntese – Em 1804, Theodore de Saussure observou que
a massa total de oxigênio e matéria orgânica seca produzida pelas plantas é maior que a massa de dióxido de carbono consumida durante a fotossíntese. De onde provém essa massa extra ?
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21. Papel do H2S em algumas bactérias fotossintetizadoras – Quando iluminada, a
bactéria sulfurosa púrpura desenvolve a fotossíntese na presença de H 2O e 14CO2, mas apenas se o H 2S for adicionado e o O 2 estiver ausente. Durante a fotossíntese, medida pela formação do [ 14C] carboidrato, o H2S é convertido em enxofre elementar, mas nenhum O 2 é produzido. Qual é o papel da conversão do H 2S em enxofre ? Porque o O 2 não é produzido ? 22. Reforçando o poder redutor do fotossistema I pela absorção de luz – Quando o
fotossistema I absorve a luz vermelha em 700 nm, o potencial de redução padrão do P700 muda de 0,4 para cerca de –1,2 V. Que fração da luz absorvida é captada na forma de poder redutor ? 23. Síntese limitada de ATP no escuro – Os cloroplastos do espinafre são iluminados na
ausência de ADP e P i. Em seguida a luz é desligada e ADP e P i são adicionados. Nessas condições, o ATP é sintetizado durante um curto intervalo de tempo no escuro. Explique este resultado. 24. Modo de ação do herbicida DCMU – Quando os cloroplastos são tratados com o 3-
(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetiluréia (DCMU ou Diuron), um potente herbicida, a produção de O2 e a fotofosforilação cessam. A produção de oxigênio, mas não a fotofosforilação, pode ser restaurada pela adição de um aceptor de elétrons externo, ou reagente de Hill. Como o DCMU age como matador de erva daninha? Sugira uma localização para a ação inibitória deste herbicida no esquema mostrado na Figura 19-46. Explique. 25. Bioenergética da fotofosforilação – As concentrações de estado estacionário do ATP,
ADP e Pi nos cloroplastos isolados de espinafre, sob iluminação total em pH 7,0, são 120, 6 e 700 µM, respectivamente. a) Qual é energia livre requerida para a síntese de 1 mol de ATP nestas condições ? b) A energia para a síntese de ATP é fornecida pela transferência dos elétrons induzidos pela luz nos cloroplastos. Qual é a queda mínima de voltagem necessária (durante a transferência de um par de elétrons) para sintetizar ATP nestas condições ? (Você pode precisar se reportar à Eq 11-6.) 26. Energia luminosa para uma reação redox – Suponha que você isolou um novo
microrganismo fotossintetizador que oxida H 2S e transfere os elétrons para o NAD +. Que comprimento de onda da luz garantirá energia suficiente para o H 2S reduzir o NAD+ em condições padrões ? Considere que a eficiência do evento fotoquímico é 100% e use E’ o de –230 mV para o H2S e –320 mV para o NAD +. Veja a Figura 19-36 para os equivalentes de energia dos comprimentos de onda da luz.
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27. Constante de equilíbrio para as reações de cisão da água – A coenzima NADP é o
aceptor terminal de elétrons nos cloroplastos, de acordo com a reação 2H2O + 2NADP+ ∀ 2NADPH + 2H+ + O2 Use a informação na Tabela 19-2 para calcular a constante de equilíbrio a 25°C para esta reação (a relação entre K’ eq e ∆G°’ está discutida na pág. xxx). Como o cloroplasto contorna este equilíbrio desfavorável ? 28. Energética da fototransdução – Durante a fotossíntese, oito fótons devem ser
absorvidos (quatro em cada fotossistema) para cada molécula de O 2 produzida: 2H2O + 2NADP+ + 8 fótons ∀ 2NADPH + 2H+ + O2 Assumindo que esses fótons apresentam um comprimento de onda de 700 nm (vermelho) e que a absorção e a utilização da energia luminosa tenham uma eficiência de 100%, calcule a variação de energia livre para o processo. 29. Transferência de elétrons para o reagente de Hill – Os cloroplastos isolados de
espinafre produzem O2 quando iluminados na presença de ferricianeto de potássio (reagente de Hill), de acordo com a equação 2H2O + 4Fe3+ ∀ O2 + 4H+ + 4Fe2+ onde o Fe3+ representa o ferricianeto e o Fe 2+, o ferrocianeto. O NADPH é produzido neste processo ? Explique. 30. Quão freqüentemente uma molécula de clorofila absorve um fóton ? – A quantidade
de clorofila a ( M r 892) em uma folha de espinafre é cerca de 20 µg/cm2 de folha. Na luz solar do meio dia (energia média de 5,4 J/cm 2. min), a folha absorve cerca de 50% da radiação. Quão freqüentemente uma única molécula de clorofila absorve um fóton ? Se a vida média de uma molécula de clorofila excitada in vivo é de 1 ns, que fração das moléculas de clorofila é excitada em qualquer tempo ? 31. Efeito da luz monocromática no fluxo de elétrons – A extensão que um transportador
de elétrons é oxidado ou reduzido durante a transferência de elétrons fotossintetizadores pode ser observada diretamente com um espectrofotômetro. Quando cloroplastos são iluminados com luz de 700 nm, o citocromo f, a plastocianina, e a plastoquinona são oxidados. Entretanto, quando os cloroplastos são iluminados com luz de 680 nm, estes transportadores de elétrons são reduzidos. Explique. 32. Função da fotofosforilação cíclica – Quando o quociente [NADPH]/[NADP +] nos
cloroplastos é alto, a fotofosforilação é predominantemente cíclica (veja Fig. 19-46). O O 2 é