CINÉTICA ENZIMÁTICA >>>>>> Variables que influyen en la velocidad de una reacción enzimática 1.- Concentración enzimática 2.- Concentración de sustrato 3.- Activadores e inhibidores 4.- pH 5.- Temperatura
1.- CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y VELOCIDAD ENZIMÁTICA . Vo y Vmax Uno de los factores clave que afectan a la velocidad de una reacción catalizada por un enzima es la concentración de sustrato presente, [S]. Sin embargo, el estudio de los efectos de la concentración de sustrato es complicado debido al hecho de que [S] cambia durante el transcurso de una reacción a medida que el sustrato se convierte en producto.
- Una aproximación simplificadora en los ex perimentos cinéticos consiste en medir la vel ocidad inicial, llamada Vo, cuando [S] es mucho mayor que la concentración de enzima, [E]. * En una reacción típica, el enzima puede estar presente en concentraciones del orden nan omolar, mientras que [S] puede ser cinco o seis órdenes de magnitud mayor. - A mayores concentraciones ele sustrato , Vo aumenta a incrementos cada vez menores en respuesta a incr ementos de [S]. - Finalmente, se alcanza un punto más allá del cual se dan incrementos pequeñísimos de Vo con el incremento de
[S]. **Esta meseta se denomina velocidad máxima, Vmáx·
2.- CINÉTICA ENZIMÁTICA. Es el método principal para estudiar el mecanismo de una reacción catalizada enzimáticamente mediante la determinación de la velocidad de la reacción y del modo en que ésta cambia en respuesta a cambios en los parámetros experimentales. - Muchos enzimas comparten algunas propiedades cinéticas: 1. Cuando se añade sustrato a un enzima, la reacción enseguida llega a un estado estacionario en el que la velocidad a la que se forma el complejo ES se equilibra con la velocidad a la que reacciona. 2. Al aumentar [S] la actividad de un enzima (a concentración fija) en el estado estacionario aumenta siguiendo una curva hiperbólica que tiende a su máximo valor de velocidad (Vmax) en el cual casi todo el enzima ha formado complejo con su sustrato. - La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos productos o la desaparición de los reactivos. - Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción , o simplemente, la cinética de la reacción. - A medida que la reacción transcurre, la velocidad de de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. * Se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v 0 ). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero .De esta forma, la medida de V 0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato. - Si representamos v 0 frente a [S] 0 obtenemos una gráfica como la de la Figura. - Cuando [S] 0 es pequeña , la velocidad inicial es directamente proporcional a la
d e primer orden. concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de - A altas [S] 0 , el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S] 0 . *En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (V max ).
A.) ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN. ETAPA 1. Formación del complejo enzima-sustrato ETAPA 2. El complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto , liberando el enzima libre: -
En este esquema, k 1 , k 2 y k 3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:
K1=constante de velocidad de formación ES. K2=constante de velocidad de disociación de ES K3=constante de formación de P. - Cuando el enzima se mezcla inicialmente con un gran exceso de sustrato, existe e1 periodo inicial, denominado estado pre-estacionario, durante el cual aumenta la co ncentración del complejo ES. * Normalmenle el estado pre-estacionario es demasiado corto para que sea observado fácilmente y dura tan solo unos microsegundos. - La reacción alcanza rápidamente un estado estacionario en el que [ES] (y la concentración de otros intermediarios) permanece aproximadamente constante con el tiempo. Cinética del estado estacionario : análisis de las Vo. - Cuanto menor sea la Km mejor catalizador será la enzima para el sustrato, puesto que necesita menos concentración de mismo para alcanzar la velocidad máxima. La concentración de sustrato a la que la velocidad de la reacción es la mitad de Vmáx es la constante de Michaelis, Km, que es característica de cada enzima que actúa sobre un sustrato determinado.
B.) ECUACIÓN DE LINEWEAVER-BURK - Es una modificación de la ecuación Michaelis-Menten. * Tomando los inversos en ambos números de l a ecuación.
- En esta gráfica se obtiene una línea recta con: * Una pendiente de
*La Intersección con el eje * Intersección con el eje
es
en
[]
−
3.- ACCIÓN ENZIMÁTICA SOBRE VARIOS SUSTRATOS - Las reacciones enzimáticas en las que hay dos sustratos implican normalmente la transferencia de un átomo o un grupo funcional de un sustrato al otro. - Tales reacciones transcurren por una o vari as rutas diferentes: 1- Ambos sustratos están fijados al enzima al mismo tiempo, formando en algún momento de la reacción un complejo ternario no covalente . 2- Los sustratos pueden fijarse en una secuencia al azar o en un orden específico. 3- El primer sustrato se convierte en producto y se disocia antes de que se una el segundo sustrato. Un ejemplo de esto es el mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento .
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA Inhibidor: Compuesto que disminuye la actividad enzimática. 1.- INHIBICIÓN REVERSIBLE
❶ COMPETITIVA - Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo del enzima. Mientras el inhibidor ocupa el sitio activo, impide la fijación del sustrato. - Muchos inhibidores competitivos son compuestos que se parecen al sustrato, y que se combinan con el enzima formando complejos EI, pero sin llevarlo a la catálisis En presencia de un inhibidor, aumenta la km aparente ([S] necesaria para alcanzar la mitad de la Vmax). La velocidad máxima no se modifica
>>> La inhibición competitiva se utiliza en terapia médica para tratar pacientes que han ingerido metanol. Mediante la difusión lenta intravenosa de etanol que actuará como inhibidor competitivo.
❷ACOMPETITIVA - El inhibidor se fija en un sitio distinto al que se fija el sustrato en el sitio activo. - A diferencia de la competitiva, solo se une al complejo ES Un inhibidor acompetitivo disminuye la Vmax.
La km aparente también disminuye, debido a que la [S] necesaria para alcanzar la Vmax es menor.
❸MIXTA - Se fija a un sitio distinto al del sustrato, pero se fija tanto a E como a ES. Afecta tanto a Km como a Vmax.
>>> El caso especial en el que α = α’ se define clásicamente como inhibición no competitiva.
2.- INHIBICIÓN IRREVERSIBLE Inhibidor Irreversible : se combinan con, o destruyen, un grupo de la enzima que es esencial para su actividad. - Es frecuente la formación de un enlace covalente entre un inhibidor irreversible y un enzima. - Muchos fármacos y venenos actúan como inhi bidores irreversibles.
Ej.: la penicilina inhibe de forma irreversible una enzima clave para l a síntesis de la pared de muchas bacterias, de ahí su efecto antibiótico.
Ej.: La aspirina o ASS inhibe irreversiblemente a la ciclooxigenass que es una enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de la prostaglandinas, que son mediadores fundamentales de l a inflamación >> Son muy útiles para estudiar los mecanismos de reacción.
3.- EFECTO DE LA TEMPERATURA Y EL PH - La mayoría de las enzimas poseen un pH optimo a la cual su actividad es máxima ,por encima o por debajo de ese valor la actividad disminuye ,debido a la desnaturalización de las enzimas. -Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas. La velocidad de la reacción catalizada por enzimas aumenta con la temperatura dentro del intervalo en el que la enzima es estable y permanece totalmente activa.
i. Inactivación por desnaturalización ii. Cambios en el estado de ionización del sustrato iii. Alteración del equilibrio en caso de que [H+] esté involucrada en la reacción. iv. Cambios en el estado de ionización de los aminoácidos del centro catalítico. REGULACIÓN ENZIMÁTICA - Las enzimas llevan a cabo una serie de reacciones secuenciales que constituyen las rutas metabólicas. Dichas rutas están perfectamente coordinadas entre sí y cada una está regulada de forma muy precisa. - La velocidad de cada ruta está controlada para que refleje las necesidades generales de la célula. - La primera enzima de la ruta suele ser limitante de la velocidad (enzima regulador)
1.- CONTROL A NIVEL DE SUSTRATO - Mediante la interacción de los sustratos y productos de cada reacción con la enzima.
CONTROL POR RETROALIMENTACIÓN - El producto final de una ruta inhibe al primer enzima de la misma. - De este modo se equilibra la velocidad de formación del producto final con las necesidades de la célula
2.- REGULACIÓN ALOSTÉRICA - Cambio de conformación entre diversas formas de ac tividad inducida por la unión de moduladores. - No tienen comportamiento Michaelis-Menten. >>> Homotrópicos (homoalostérico )----> Sustrato = Modulador - Control a nivel de sustrato >>> Heterotrópicos (heteroalostérico ) ---> Sustrato ≠ Modulador - Retroinhibición * Inhibidores: Aumento de Km, disminución de Vmax * Activadores: Disminución de la Km, aumento de Vmax
3.- MODULACIÓN COVALENTE - Se modula la actividad por modificación covalente de la molécula enzimática mediante un grupo químico a la cadena lateral de algún aminoácido de la proteína.
EJEMPLOS: i. Fosforilación - Mayoritaria
ii. Adición de grupos * Acetilos
* ADP-Ribosa
* Lípidos
4.- ACTIVACIÓN MEDIANTE RUPTURA. - Algunas enzimas y otras proteínas son regul ados mediante la rotura proteolítica de un precursor enzimático.
CONCEPTO DE ZIMÓGENO - Proteínas precursoras sin actividad enzimática. >> También pueden ser llamados como proproteínas o proenzimas. Ej. El colágeno del tejido conjuntivo se sintetiza inicialmente en modo de precursor soluble denominado procolágeno.
CASCADA DE ACTIVACIÓN - Un ejemplo de una cascada de activación proteolítica es la coagulación sanguínea. * La fibrina, se origina por proteólisis de su proproteína inactiva, el fibrinógeno. La proteasa, responsable de esta activación es la trombina, la cual a su vez se origina por proteólisis de una proproteína, la protrombina.
5.- MODULACIÓN POR OTRAS PROTEÍNAS >> Interacción proteína-proteína i- Proteínas G ii- Calmodulina
