İçindekiler BĠYOTEKNOLOJĠ .............................................................. .......................................................................................................................................... ..................................................................................... ......... 3 BĠTKĠ BĠYOTEKNOLOJĠSĠ BĠYOTEKNOLOJĠSĠ ............................................................. .................................................................................................................................... ....................................................................... 3 KLONLAMA KLONLAMA ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ 5
KLONLAMANIN TARĠHÇESĠ ...................................................................... ............................................................................................................................... ......................................................... 6 KLONLAMA TEKNOLOJĠSĠNĠN GELĠġĠMĠ ...................................................................... ........................................................................................................ .................................. 7 REKOMBĠNANT DNA TEKNOLOJĠSĠ ............................................................... ............................................................................................................... ................................................ 9 VEKTÖRLER VEKTÖRLER KLONLANACAK KLONLANACAK DNA PARÇALARI PARÇALARI ..................................................................... ........................................................................................ ................... 13
PROKARYOTĠK PROKARYOTĠK VEKTÖRLER ............................................................................................................................ ............................................................................................................................ 13 RESTRĠKSĠYON ENZĠMLERĠ ĠLE KLONLAMA ............................................................... ............................................................................................... ................................ 16 HĠBRĠT VEKTÖRLERĠ ĠÇĠN SEÇĠM ....................................................................... ................................................................................................................... ............................................ 18 KÖR UÇLU EKLENME...................................................... EKLENME.................................................................................................................................. ................................................................................... ....... 19
BELĠRLĠ BĠR GENĠN KLONLANMASI .................................................................. .............................................................................................................. ............................................ 21 GENOM KÜTÜPHANESĠ OLUġTURMA .............................................................. ............................................................................................................ .............................................. 24 KLONLANMIġ GEN ĠÇĠN SONDA ......................................................................... ..................................................................................................................... ............................................ 28 WESTERN BLOTTING BLOTTING ......................................................................................................... ......................................................................................................................................... ................................ 29
KROMOZOM YÜRÜYÜġÜ, KOMUġU GENLERĠN TANIM LANMASI.......................................................... 31 HETERODUPLEX ANALĠZ............................................................. .................................................................................................................................. ..................................................................... 32 EUKARYOTĠK VEKTÖRLER ....................................................................... .............................................................................................................................. ....................................................... 34 MAYA VEKTÖRÜ.............................................................. .......................................................................................................................................... ................................................................................... ....... 34 ...................................................................................................................................... ..................................................................... 35 HAYVAN VEKTÖRLERĠ.................................................................
BĠTKĠ VEKTÖRLERĠ ....................................................................... ............................................................................................................................................ ..................................................................... 37 YABANCI DNA‟NIN EUKARYOTĠK HÜCREDE FAALĠYETĠNĠN SAĞLANMASI SAĞLANMASI ...................................... 38 NAKAUT (KNOCKOUT) (KNOCKOUT) FARE .................................................................... ........................................................................................................................... ....................................................... 39
BĠLDĠRĠCĠ SĠSTEMLE R....................................................... R............................................................................................................................... ................................................................................. ......... 40 RESTRĠKSĠYON HARĠTALAMA .............................................................. ........................................................................................................................ .......................................................... 41 RESTRĠKSĠYON HARĠTALARININ YAPIMI .................................................................... .................................................................................................... ................................ 43 ÇĠFT KESĠNTĠ ....................................................................... ................................................................................................................................................. ................................................................................. ....... 47 .......................................................................... ....... 47 RESTRĠKSĠYON PARÇACIK UZUNLUĞU POLĠMORFĠZMĠ ...................................................................
POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU ..................................................................... ................................................................................................................. ............................................ 49 DNA DĠZĠLĠġ SIRASI BELĠRLENMESĠ BEL ĠRLENMESĠ .................................................................. .............................................................................................................. ............................................ 52 DĠ DEOKSĠ METODU ĠLE DĠZĠLĠġ SIRASI BELĠRLEME ......................................................................... ................................................................................ ....... 52 DĠZĠLĠġ SIRASI ANALĠZĠNDE GEREKLĠ OLAN PRĠMER (BASLAMA YERĠ) ............................................. 58 KONFIGURASYONU KONFIGURASYONU OLUġUMUNUN MEYDANA GETĠRĠLMESĠ ............................................................... 58 GEN KLONLAMANIN PRATĠK SONUÇLARI ................................................................... ................................................................................................... ................................ 60 1
2- ÜREME AMAÇLI KLONLAMA KLONLAMA ............................................................................................................... ...................................................................................................................... ....... 62 3- ĠYĠLEġTĠRME AMAÇLI KLONLAMA ............................................................. ........................................................................................................... .............................................. 63
KLONLAMANIN SÜPER STARI DOLLY‟NĠN KOPYALANMA AġAMALARI VE SONRASI .................... 64 KLON CANLILARIN SAĞLIĞI .................................................................... ........................................................................................................................... ....................................................... 68 BEDEN HÜCRELERĠNĠNKROMOZOMLARI HÜCRELERĠNĠNKROMOZOMLARI NASIL OLUYOR DA AKTARILDIĞI YUMURTA HÜCRESĠNĠN KROMOZOMLARI GĠBĠ DAVRANMAYA BAġLIYOR? ......................................................... 69 KLONLANMIġ KLONLANMIġ CANLILAR VERĠCĠ HÜCRENĠN ALDIĞI CANLININ TAM BĠR KOPYASI MI ? ............... 69 ĠNSAN KLONLAMA .......................................................... ...................................................................................................................................... ................................................................................... ....... 70 ...................................................................................................................... .......................................................... 72 KENDĠ ORGANINI KENDĠN YAP ............................................................
ĠNSAN KLONLANMASINDA BĠR ADIM DAHA .............................................................. .............................................................................................. ................................ 73 KLONLAMANIN KLONLAMANIN TEHLĠKELERĠ .............................................................. ........................................................................................................................ .......................................................... 73 KLONLAMA ĠLE ĠLGĠLĠ YAPILMIġ ÖNEMLĠ ÇALIġMALAR .............................................................. ....................................................................... ......... 74 DONMUġ FAREDEN KOPYA ...................................................................... ............................................................................................................................. ....................................................... 74 KLONLANMIġ 3 BEBEK YAġIYOR ....................................................................... ................................................................................................................... ............................................ 75 KAYNAKLAR: KAYNAKLAR: ..................................................................... ............................................................................................................................................... ................................................................................. ....... 76
2
BĠYOTEKNOLOJĠ Biyoteknoloji; Hücre, doku ve organ kültürü, moleküler biyoloji, fizyoloji, biyokimya, mikrobiyoloji, moleküler genetik gibi doğa bilimleri ile temel mühendislik ve bilgisayar bilimlerinden yararlanarak, yararlanarak, genetik ve moleküler DNA teknikleriyle bitki, canlıların genetik haritalarını çıkartmak, çoğaltmak, ıslah etmek, değiĢtirmek, geliĢtirmek, yeni ve az bulunan ürünleri yine canlılara (organizma, hücre ve dokulara) ürettirmek veya bunların daha fazla elde etmek için kullanılan teknolojilerin tümüdür. Doku kültürü ve Genetik mühendisliği olmak üzere 2 ana kola ayrılır.
Biyoteknoloji ve genetik mühendisliği, biyoteknoloji ve moleküler biyoloji, biyoteknoloji ve doku kültürü gibi ifadeler bu nedenle doğru ifadeler olmayıp biyoteknoloji hem doku kültürü hem de genetik mühendisliğini kapsamaktadır. Üniversitelerde çeĢitli lisans programları veya derslerin benzer isimlerde olması da yanlıĢtır. Biyoteknoloji geleneksel ve modern olmak üzere grupta değerlendirilir. Mikroorganizmalarca sütün yoğurt ve peynir,e dönüĢtürülmesi, sirke yapımı geleneksel gıda biyoteknolojisi konusu, yine genetik mühendisliği iĢlemeleriyle özellikleri geliĢtirilmiĢ mikroorganizmalarca daha nitelikli (örnek: Enzimler, proteinler vb.) ile çeĢitli etken maddeler (ilaç hammaddesi, aĢılar vb.) veya ürünler (biyoetanol vb.) geliĢtirmek modern gıda, tıbbi tı bbi veya mikrobiyal biyoteknoloji konularıdır. Bu nedenle biyoteknolojinin bitki, hayvan, gıda, tıbbi, tıbbi, mikrobiyal, endüstriyel (beyaz biyoteknoloji) ve çevre Biyoteknolojisi biyoteknolojileri olarak uygulama dalları geliĢmiĢtir. Bu sitede ağırlıklı olarak Bitki Biyoteknolojisi üzerinde durulmaktadır. Aslında sistem tüm dallarda benzer çalıĢmaktadır. Doku kültürüne hücre doku ve organlar, genetik mühendisliğinde ise DNA temel hedeftir. Tüm canlıların DNA'nın iĢleyiĢi ve temel mekanizmaları bakımından birbirine hemen hemen benzer olduğu düĢünülürse temel genetik mühendisliği tekniklerini iyi bilmek her türlü biyolojik materyal ile çalıĢabilmeye imkan verirken doku kültürü uzmanlığı daha geniĢ bir alan istemektedir. Çünkü insan, hayvan, bitki ve mikroorganizmalarda hücre, doku ve organ iĢleyiĢi ve mekanizmaları bakımından derin farklar olabilmektedir. Oysaki bu canlıların herhangi birisinin DNA'sı bir diğerine uyum gösterebilmektedir. Dolayısıyla, canlılar hatta bir türün bireyleri arasında bile doku, hücre, organ vb. uyumazlıklar görüldüğü halde canlılar arasında DNA bakımından uyuĢmazlık görülmemektedir. Bu da DNA'nın temel molekül olduğunu göstermektedir.
BĠTKĠ BĠYOTEKNOLOJĠSĠ Biyoteknolojik tekniklerin bitkilere uygulanmasına bitki biyoteknolojisi denir. Bitkilerin ve hücrelerin çoğaltımı doku kültürüyle, bunların genetik özelli klerinin araĢtırılması genetik mühendisliği, özelliklerin değiĢtirilmesi veya geliĢtirilmesi de her iki tekniğin birlikte uygulanması ve/veya bitki ıslahı teknikleriyle yapılmaktadır.
Klonlama (kopyalama) terimi insan ve hayvanlar (Dolly) için iç in daha 10 yıl önce kullanılmaya baĢlanmasına karĢın bitkiler (Örnek: (Örnek: Havuç, tütün) 1950'li yıllardan itibaren klonal klonal olarak çoğaltılmaya yani kopyalanmaya baĢlanmıĢtır. Buna rejenerasyon (organogenesis, somatik 3
embriyogenesis, meristemlerden sürgün) veya klonal çoğaltım denilmektedir. Bir çok bitki türü hiç bir eĢeysel üreme hücresi içermeyen vücut (somatik) hücrelerinden (örnek: y aprak, sap vb. doku ve organlar) çok rahatlıkla çoğaltılabilmektedir. Rejenerasyon bir hücreden baĢlayabileceği gibi (somatik bitki), birden fazla hücrenin birlikte oluĢturduğu bir faaliyet sonucu sonucu embriyogenesis, embriyogenesis, protoplast-callusprotoplast-callus- bitki), (organogenesis) (organogenesis) veya bir çok hücrenin organize olarak bir doku ve organları ve sonuçta bitkiyi oluĢturmasıyla da ortaya çıkabilmektedir. Bitkilerin bir çoğunda uygun doku kültürü Ģartlarında (besin, büyüme düzenleyicileri, sıcaklık, ıĢık vb.) rejenerasyon ortaya çıkabilmektedir. Tek bir vücut hücrenin kendisinin alındığı ana bitkiye benzer bitkiler üretebilme yeteneğine totipotensi denilmektedir. Genetik mühendisliği teknikleriyle bir çok bitki türünün t ürünün genom haritası çıkarılmıĢ ve genleri tespit edilmeye baĢlanmıĢtır. Arabidopsis adlı ilkel bir ot olan bitkinin hemen hemen tüm genetik özellikleri halen ortaya konulmuĢtur. Bir çok önemli bitki t ürünün genom haritası çıkarılmak üzeredir.
Genetiği/Genetik olarak DeğiĢtirilmiĢ Organizmalar (GDO veya GMO) (bitki, hayvan, insan veya mikroorganizmalar) çeĢitli biyoteknolojik metotlarla genetik yapıları bir veya daha fazla özellik (gen) bakımından değiĢtirilmiĢ organizmalar, bunlardan elde edilen ürünlere ise Genetiği DeğiĢtirilmiĢ (GD) ürünler veya gıdalar, içerisinde belirli sınırın üzerinde GD içeren ürünlere ise GD‟li ürünler adı verilmektedir. Genetiği değiĢtirilmiĢ bir canlıya „gen transferi yapılmıĢ‟ anlamında 'transgenik' de denilir. Biyoteknoloji sadece GD veya GM demek değildir. deği ldir. GDO, GD‟li ürünler çeĢitli soru iĢaretleri olmasına karĢın Türkiye‟de çeĢitli kampanyalar nedeniyle çok tehlikeli ürünler gibi anlaĢılmaktadır. Benzer bir tartıĢma hormonlar konusunda da mevcuttur. Bu konuda detaylı tartıĢma ve bilgilere sitenin GDO-GMO tartıĢması kısmından ulaĢılabilir. Sunularda biyoteknoloji ve GDO'lar bakımından Türkiye ve Ġç Anadolu Bölgesi için öneriler ve değerlendirmeler de bulunmaktadır. Ġnsanlarda etik konular nedeniyle büyük tartıĢmaların yaĢandığı genetik mühendisliği alanında bitkilerde oldukça baĢarılı sonuçlar üretilmiĢtir. Doku kültürü ve genetik mühendisliği teknikleri tek baĢına veya birlikte uygulanabilmektedir. Tüm dünya ülkelerinde biyoteknolojik çalıĢmalar öncelikli desteklenmektedir. ABD bu alanda dünyada öncü konumdadır. AĢağıda bitki biyoteknolojisinin faydaları ve bazı ve bazı uygulamaları verilmiĢtir. Biyoteknolojinin faydaları ve uygulama alanları
Biyoteknoloji ile yüksek besin içeriği, hasat sonrası dayanıklılık, hastalık, zararlı, kuraklık ve ot ilacına genetik dayanıklılığın artırılması, yenilebilir aĢılar (elma, muz), bitkilerce biyolojik olarak ayrıĢabilir plastik üretimi vb. gibi transgenik (GDO) üretimi yanında; Hücre, doku ve organ kültürü ile tohum (sentetik), fide, fidan, yumru, miniyumru, soğan üretimi (klonal çoğaltım veya mikroçoğaltım)
* Sentetik tohum üretimi
* Somaklonal varyasyonların oluĢturulması * In vitro tozlanma * Protoplast izolasyonu ve somatik melezlemeler * Hücre seleksiyonu 4
* Apomiktik bitkilerin oluĢturulması * Haploit bitkilerin oluĢturulması ve embriyo kültürü ve kurtarması * Biyoteknolojik germplazm muhafazası (özelikle Türkiye endemik bitki t ürlerinin korunması amacıyla çok gereklidir) * Tıbbi amaçlı protein ve sekonder metabolit üretimi * Moleküler markörlerin geliĢtirilmesi yoluyla seleksiyon ve ıslahta klasik ıslaha destek sağlanması * Yabani ve kültür bitkilerinde genom sekanslaması ve genetik -moleküler -moleküler özelliklerinin ortaya konulması * Sinyal iletim mekanizmalarının belirlenmesi * Endüstriyel ürünlerin (proteinler, yağ, vitaminler, enzimler vb.) üretilmesi * Biyoyakıtların üretilmesi * Moleküler test, tanı ve tedavilerin yapılması gibi bir çok iĢlem yapılabilmektedir.
KLONLAMA Bir memeli hayvan yumurtasından, vücut hücresinin çekirdeğinin yeniden programlanabileceği ve onu bütün bir birey oluĢturabilme oluĢturabilme potansiyeline sahip kılabileceği gerçeğine dayanan bir süreç olduğu belirtilmektedir. Yani Klonlama (kopyalama), tek bir hücre hücre çekirdeğindeki genetik malzemeden, birbirinin özdeĢi çok hücreli canlıların üretilmesidir. üretilmesidir. Klonlama terimi, biyolojide birçok farklı anlamda kullanılabiliyor. Bedenimizdeki her hücre, tek bir hücrenin, baĢlangıçtaki döllenmiĢ bir yumurta hücresinin klonudur. Bazı bit kiler ve az sayıda hay van türü, partenogenez yoluyla kendilerini klonlayarak üreyebilirler. Moleküler klonlamaysa, bir DNA parçasından daha fazla genetik malzeme elde etmek etmek üzere kullanılan laboratuar yöntemlerine verilen ad; DNA‟nın protein kodlayan bölümlerinin yalıtılarak çoğaltılmasıdır. Tek yumurta ikizleri de birbirlerinin, tek bir embriyonun ikiye ikiye bölünmesiyle oluĢmuĢ klonlarıdır. klonlarıdır. Bir yetiĢkin hücresinden yeni bir canlı oluĢturmak için kullanılan yöntemse, “bedensel hücre çekirdeği aktarımı” dır.
5
KLONLAMANIN TARİHÇESİ Ġlk defa, Leipzig Üniversitesinden Hans Adolph Eduard Dreisch deniz kirpikleriyle yaptığı deneylerde erken dönemdeki bir deniz kirpisi embriyosunun blastomerlerini bir biri nden ayırarak “Blastomere Separation” yöntemini buldu. Blastomere Seperation yönteminde döllenmiĢ yumurtanın besi ortamında 4 -8 hücreli blastomer aĢamasına kadar bölünmesine bölünmesine izin verilmektedir. Daha sonraları, blastomer blastomer aĢamasına gelen bu 8 hücreli yapıdaki her bir hücre alınarak bir blastosit oluĢturulmakta ve sanki yeni döllenmiĢ zigot gibi taĢıyıcı anneye aktarılarak genetik olarak birbirinin aynısı klonlar meydana getirilmektedir.
*1902 de Hans Speamann aynı yöntemi kullanarak semender blastomerlerini ayırdı ve her blastomerden yeni bir semender oluĢtu. oluĢtu. Bu yöntemin keĢfiyle klonlamanın temeli atılmıĢ oldu. oldu. *1938- Hans Speamann, fantastik bir deney olarak tanımladığı halbuki klonlama diyebileceğimiz bir deneyde geç evredeki bir embriyonun çekirdeği çıkarılarak çekirdeği ol mayan bir yumurtaya aktarıyordu. Speamann 1938 yılında yayınladığı “Embrionic Development and Induction” adlı kitabında bu deneyi fantastik olarak nitelendiriyordu. ni telendiriyordu. Halbuki bu deney 1952 yılında gerçekleĢtirilmiĢtir. *1952- Robert Briggs ve T. J. King ilk klonlama deneyini gerçekleĢtirdiler. Ġleri aĢamadaki bir kurbağa yumurtasının çekirdeği çıkarıldı ve baĢka bir kurbağa yumurtası içine aktarıldı. Ancak deney sonunda yumurta geliĢmedi. Briggs ve King bu yönteme “Nüklear Transfer” i smini verdiler. *1970- Aynı deney yine kurbağalar üzerinde John Gordon tarafında n denendi. Daha iyi bir sonuç alındı. Kurbağa yumurtaları, iribaĢ olana kadar geliĢti ama daha sonra öldüler. *1984- Steen Willadsen, Nüklear Transfer yöntemini kullanarak olgunlaĢmamıĢ koyun embriyo hücrelerinden yaĢayan bir kuzu klonladığını açıkladı. Daha sonra Willadsen, inek, domuz, keçi, tavĢan t avĢan ve rhesus maymunu da klonladı. Bu deneylerde çok hücreli koyun embriyosundan çekirdek alınıp yumurta hücresine aktarılıyordu. Daha sonra hücre bölünmesi baĢlıyor, fetus oluĢuyor ve geliĢme devam ediyordu. *1994- Daha geliĢkin embriyo hücrelerinin ilk klonlamasını Neal First gerçekleĢtirdi. En az 120 hücrelik buzağı embriyosu klonlandı. Bu çok hücreli inek embriyosunun çekirdeği çıkarıldı ve çekirdek yumurta hücresine aktarıldı. *1996- Ian Wilmut, Neal First"in deneyini koyunlar üzerinde yaptı. Ancak embriyo hücrelerinin çekirdeğini almak için hücrelerin duraklama dönemine gelmesini bekledi. Sonra çekirdekleri çıkarıp yumurta hücresine aktardı. *1997- Dr. Wilmut, 6 yaĢındaki bir koyunun meme hücresinden klon üretti. Bu defa çekirdek eriĢkin bir hücreden yani meme hücresinden hücresinden alınıp yumurta hücresine aktarılmıĢtı. Bu olaya “Somatik Nüklear Transfer” adı verilmiĢtir. verilmiĢtir. Dolly 277 yumurta içinde tek hayatta kalan kuzuydu. kuzuydu. Dolly"nin oluĢtuğu hücre Ocak 1996"da birleĢtirilmiĢti. *1998- Tıp doktoru G. Richard Seed, o günlerde anne rahminden aldığı insan embriyosunu baĢka bir annenin rahmine aktarıyordu. Ġnsan klonlamaya karĢı duyduğu ilgiyi ilan etti. Bu konudaki hassas denge, ahlakî tartıĢmalara yol açtı. TartıĢmalar sonucu Amerika BirleĢik Devletlerinde insan klonlamaya karĢı yasalar konuldu.
6
*1999- 19 Avrupa ülkesi insanın genetik olarak kopyalanmasını yasaklayan sözleĢmeyi Paris"te imzaladı.
KLONLAMA TEKNOLOJĠSĠNĠN GELĠġĠMĠ Bu teknolojinin geliĢim aĢamalarını Ģöyle özetleyebiliriz;
1. Transgenik Teknolojisi Gen veya gen parçalarının bir fertten alınıp bir baĢka ferdin DNA‟sına transferi Ģeklinde düĢünülebilir. Bu teknolojide gen veya genler döllenmiĢ yumurtaya aktarılır. Mesela kanser oluĢturan insan genleri fare embriyolarına aktarılarak ilaç sanayinde tedavilerin testinde t estinde kullanılabilmektedir. Bu teknoloji ile insandan koyuna, domuza, sığıra ve keçiye gen aktarımı yapılmakta, sütlerinde insan proteini üretilmesi yanı sıra organ, doku ve kan üretme imkânı da bulunmaktadır. Bu protein ile emphysema ve cystic fibrosis gibi hastalıklar tedavi edilebilmektedir.
2. Çekirdek Transfer Teknolojisi Bu teknoloji bir hücredeki bütün genomu yani somatik kromozomların bir hücreden diğerine naklini ifade eder. Çekirdek, döllenmiĢ yumurta hücresinden alınmakta ve çekirdeği alınmıĢ fakat döllenmemiĢ yumurta hücresine yerleĢtirilmektedir. Bu sistemle uygulanan böyle bir teknik t eknik klonlama olarak değerlendirilmemektedir. Zira bir duplikasyon iĢlemi bulunmamaktadır. Ancak burada sitoplâzmada bulunan mitokondri DNA‟ları farklıdır.
Çekirdek Teknolojisini Kullanarak Yapılan Klonlama Ġki Ģekilde yapılmaktadır;
a) Embriyo Klonlama: Alınan örnek, döllenmiĢ bir embriyodan alınıp yine aynı annenin yumurtasında çekirdek transferi yapılırsa bu durumda mitokondri DNA‟ları aynı olacaktır. Bu teknoloji benzer ikizlerin oluĢturulmasında kullanılmakta ve embriyo klonlama olarak bilinmektedir. Sığır, kurbağa ve farede de baĢarılı Ģekilde denenmiĢtir. Ġnsanlarda da bu tip klonlama yapılmıĢ ancak bu ikizler yaĢatılamamıĢtır. Bununla beraber beraber basında klonlama olarak isimlendirilmesine isimlendirilmesine rağmen bu uygulamada farklı çekirdekler kullanıldığı için bunlar gerçek klonlar değillerdir. 7
b) Normal Canlı Klonlama (Somatik Nükleer Transfer): Dolly doğuncaya kadar, normal bir canlıyı klonlamak mümkün değildi. Organizma döllenmiĢ bir yumurtadan meydana gelmekte ve her bir hücre döllenme sonucunda oluĢan tüm bir genomu içermektedir. Her bir hücre birbirinin tamamen aynısıdır. Ancak, büyüme ve geliĢme olayları hücrelerde farklılaĢma f arklılaĢma meydana getirmekte ve beyin dokusu, kalp dokusu, deri, kemik vs oluĢmaktadır. Bazı genler somatik hücrelerde bu Ģekilde özel görevlere ayrıldığı zaman çalıĢmasını durdurmakta ve sadece ilgili deri, kemik gibi genleri çalıĢmaktadır. Embriyonik klonlamada farklılaĢmaya baĢlamamıĢ döllenmiĢ yumurta hücresinin çekirdeği (genom) kullanılmaktadır. Dolly‟nin oluĢumunda ise somatik bir dokudan alınan hücreyle bu iĢlem baĢarılmıĢtır. Bu transfer sonunda, sonunda, somatik dokudaki dokudaki çalıĢmayan genler tekrar çalıĢmaya baĢlamıĢ ve genlerin çalıĢması organların oluĢmasıyla oluĢmasıyla durmuĢtur. Genlerin Genlerin gerektiği zamanda çalıĢması veya çalıĢmasını durdurması klonlamanın esasını oluĢturmaktadır. Bu uygulamada döllenmemiĢ yumurtanın çekirdeği çıkarılarak, somatik hücre çekirdeği bu yumurtanın içine yerleĢtirilmiĢtir. OluĢan zigot, herhangi bir koyuna nakledilerek geliĢmeye bırakılmıĢtır. Bu uygulamanın embriyonik klonlamadan farkı, mitokondriyal DNA‟nın farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Burada ilginç olan diğer nokta, Dolly bir babaya sahip değildir, fakat 3 anneye sahip olabilir. Mesela, annesi; - Genomu kullanılan bir diĢi olabilir - Yumurta hücresini veren diĢi olabilir - Gameti taĢıyan bir diĢi olabilir
Genetik İkizlik
Ġkizlik kavramı iki veya daha fazla benzer kardeĢlerin oluĢması anlamındadır. Ġkizlik, seksüel bir üretim sonucudur. Hücredeki bütün DNA iki farklı ferdin DNA‟larının yarısını taĢımaktadır. DöllenmiĢ yumurta iki ya da daha fazla parçaya tekrar bölünecek ve aynı cinsiyette fertler meydana getirecektir. Bu olayın çekirdek transferi ile ilgisi yoktur. Klonlama ise aseksüel bir üretimle ilgilidir. Klonlamada mitokondri DNA‟ları farlı olabilir ancak ikizlikte hepsi aynı olmak zorundadır.
Klonlamayla IVF (In Vitro Vitro Fertilizasyon) Arasındaki Arasındaki Farkı
IVF, yumurta hücresinin (Ģansı artırmak için birkaç tanesi) sperm tarafından tüpte döllendirilmesi ve daha sonra rahi me implante edilmesi olayıdır. Klonlamada ise yumurta hücresinin çekirdeği tüpte çıkarılıyor ve klonlanacak canlının çekirdeği bu hücreye veriliyor. Dolayısıyla, yumurta hücresi artık büyüyeceğini sağlayan çekirdeğe sahip sahip oluyor. Bundan sonra sonra bu yeni hücre rahime implante ediliyor ve normal embriyolar gibi büyümeye devam ediyor. Klon embriyolar, normal ve IVF (in vitro fertilizasyon) embriyoları birbirlerine çok fazla benzemezler. Roslin Enstitüsündeki araĢtırmacılar, klon embriyolarının normal embriyolardan daha büyük olduğunu ve hamileliklerin baĢarısızlığının ve fetüs ölümüyle sonuçlanmasının daha çok rastlandığını veya sezeryan ameliyatlara i htiyaç duyulduğunu saptamıĢlar. 8
REKOMBINANT REKOMBINANT DNA TEKNOLOJĠSĠ
1970 ortalarında moleküler genetik alanı sadece genetikçiler için değil tıpçılar bitkisel üretimciler; hayvansal üretimciler yatırımcılar genel olarak kamu için oldukça önemli geliĢmelere maruz kalmıĢtır. Tıpçılar bakımından yeni hastalık tedavi stratejıleri hizmete sunulmuĢtur. Bitkisel üretimciler için verimi arttırılmıĢ bitkiler üretilmiĢtir. Hayvansal üretimciler için evcil hayvanlarda verim arttırılması söz konusu olmuĢtur. Genetikçiler ve Moleküler biyologlar gen faaliyetleri ve kontrolü için yeni görüĢler oluĢturmuĢlardır. DNA ile ilgili iĢlemler onun izolasyonu, çoğaltılması diziliĢ sırasının analizi belli yabancı DNA nın plazmid ya da faj gibi taĢıyıcı (=vektör) aracılığı ile prokoryot ya da eukoryot konukçu hücreye sokulması ve faaliyetinin temini (yani transkripsiyon ve translasyon sürecinden sonra proteine dönüĢme Ģeklinde gruplanabilir. Yaygın kullanılan konukçu hücre E.coli‟dir Yabancı DNA çoğaltılıp saflaĢtırılır ve DNA diziliĢ sırası belirlenir. Yabancı DNA‟nın gen ürünü büyük ölçülerde protein olarak üretilmek suretiyle sağladığında iĢlem tamamlanmıĢ olur. Bu yeni teknoloji Gen klonlama, Rekombinant DNA teknolojisi, Genetik Mühendisliği gibi çeĢitli adlarda ifade edilir.
Bu bakımdan rekombınant DNA teknolojısı dogal olarak bır a rada bulunması mumkun olmayan DNA molekullerının yapay yolla bır araya getırılmesı(kombıne edılmesıdir).bu teknolojı 7 temel safayı içerir
1. Doku yada hucrelerden DNA ızole edılmesı 2. Bu DNA molekullerının RE (Restriksyon Endonükleozlar) denılen ozel enzımlerle eklenıp aktarılabılecek içerikde kesilmesi 3. RE ıle iĢlem görmüĢ DNA molekullerının vektor adı verılen taĢıyıcı molekuller yüklenmesi 4. Vektor ve tasıdıgı molekul(Bu bırlıktelık artı rekombınant DNA molekuludur) un faalıyet gosterecegı konakçı hücreye naklı 5. Konakçı hucre ve kendı genomu çogalırken ç ogalırken bu arada aktarılan DNA da çogalacagından DNA molekulunun klonlanmasının saglanısı. 6. Klonlanmıs DNA nın konakçı hucreden ızole edılıp ıncelenmesı 7. Klonlanmıs DNA nın gen ürününün elde edilmesi yani klonlanmıĢ DNA transripsiyona ugrayabiilir mRNA‟sı translasyona yönlendirilebilir gen ürünü izole edebilir ve araĢtırma, ticari maksat için kullanılır. Bu basmakların her biri ayrı baĢlık altında altı nda bundan sonraki kısımlar da sunulacaktır.
9
ġekil 1. Rekombinant DNA tekniğinin özeti. Önce bir hibrit vektör oluĢturulur. Bu vektöriçerisindekalan yabancı DNA‟yı da içerir. Vektör konukçu organizmaya sokulur.Konukçunun replikasyonu ile yabancı DNA da çoğalır. Eğer gen faaliyeti sağlanırsa, bu genin ürünü çok miktarda elde edilmiĢ olur. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
REKOMBĠNANT DNA TEKNOLOJISININ ARAÇLARI Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri 1978‟de Fızyoloji Tıp Nobel ödülü W.Arben ,H.Sımıth ,D.Nathan‟nın Restiriksıyon endonükleaz enzimleri hakkındaki çalıĢmalarından dolayı verilmiĢtir. Bu oluĢumlar bakterinin sahip olduğu yabancı DNA‟ları yok eden enzimlerdir. Normaldeki iĢlevi bakteri hücresini hücresini iĢgal eden iĢgalci virüslerin DNA‟sını DNA‟sını nükleotıd zincirini sadece belli bazı özel yerlerden tanıyarak kesmektedir. Bu özel tanıma yerlerine Restriksiyon (sınırlama=kesme)bölgeleri adı verilir.Bu yerler DNA molekülü üzerinde
10
bulunan ve genellikle 4-8 baz çifti uzunlukta yerlerdir. Bu enzimlerin faaliyeti sonucu DNA bu yerlerden kopar.
BaĢlangıçta bu enzimlere „‟Restriksiyon enzim adı verilmesinin‟‟ ana sebebi Ģudur. Fajlar bazı bakterilerde yaĢayabilirlerken farklı restırıksıyon enzimlere sahip baĢka bakterilerde de yaĢayabilememektedir. Bu yüzden yüzden bakteri soyları arasında faj infeksiyonu i nfeksiyonu bakımından sınırlılık vardır. Üç tip Restrıksıyon Restrıksıyon enzimi bilinmektedir. Bu gruplama gruplama enzimi (DNA) daki kestiği bölgenin yapısına ve enzim yapısına göredir. 1.ve 3.tip Restriksiyon enzimleri gen klonlamada kullanılmaz. Çünkü bunlar DNA‟yı tanıma bölgeleri dıĢında keser ve kesim yeri tesadüf olup önceden tahmin edilmeyen bir yerde kesim yapar, oysa 2. Tip Restırıksıyon enzimi ise belli özel yerlerden keser.Ayrıca kesim yerleri belli bir simetri gösterir. Mesela (Bam I )isimli ikinci tip enzim [5‟ -GGA/TTC3‟] [3‟-CCT/AGG-5‟] bölgesinde kesim yapar.Eğer okuma düĢey yapılırsa merkezden alttaki zincirin AGG‟sı ile (soldan sağa okunur) ve üstteki zincirin GGA‟sı sağdan sola okununca (AGG) aynıdır. Böyle bir tersinir eĢlenik yapıya POLINDROM ( polındrom yunanca polındrom =geriye kesmek demektir) denir. Her iki i ki yönde okunuĢu aynı olan yapıları tanımlar.Mesala (1238321) her iki yönde de aynıdır. AĢağıdaki Ģekilde böyle iki tip Restırıksıyon Enzimi (RE) verilmiĢtir. Hemen hemen (100) u aĢkın 2. Tip R.E.bilinir. Konukçu hücreler kendi DNA larını bu enzim yerlerine sahip olmamaları yanısıra kendı (DNA) sını bu bölgelerde metilleĢtirme nedeniyle korurlar.
ġekil 2. DeğiĢik Restriksiyon Endonükleaz ile yapılan diziliĢ sıraları. Pu Purinleri, Py purimidinleri göstersin. Okların yerleri yerleri Endonükleazların DNA kesim yerlerini gösterir. 1971 yılında K.Danna ve D.Nathan „Restriksiyon Endonükleazların DNA‟yı hemen hemen aynı boyutlarda parçalara böldükleri,Enzim aksiyonunun tekrarlanabilirliği ve kesinliği bunları ilerde yapılacak araĢtırmalar için faydalı kılacagı gorusu ifade edilmiĢtir..Aslında Bütün resriksiyon endonükleazlar 3‟ ve 5‟ uçları üretmez, bazıları bazıl arı kör uçlar üretir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
11
ġekil 3. Sitozine Metilaz enzimi yardımı ile Metil grubu katılması sonucunda 5-Metilsitozine dönüĢür. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw -Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
ġekil 4. Konukçu DNA (Hpa II ) Restriksiyon Restr iksiyon yerinde metilleme ile kendi DNA sını R.E. den korur . Yıldızlar sitozindeki Metil grubunu gösterirler. (DNA) Replikasyonundan Replikasyonundan sonra DNA yarım metillenir. Yeni kol metile sahip değildir. Yarım metillenmiĢ DNA, daha sonra hücre enzimlerle metillenir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGr aw-Hill), aw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
12
Endonükleazların hücumuna maruz kalan aynı diziliĢ sırası metillemiĢ durumda ise metillenmemiĢe nazaran korunmuĢ haldedir. Yani enzim etki yapamaz. Konukçu (DNA) çoğalmasından sonra yeni çift sarmal hemimetil (yarım metilli) konumdadır. Yani eski kol metilli yeni kol metilsizdir. Böyle bir durumda yeni kol kolayca metillenebilir. Hangi kolda olursa olsun metil içermeyen yabancı DNA lar .RE lerce parcalanabılır, Restriksiyon enzimleri enzimleri izole edildiği canlıya göre isimlendirilir. Mesela Bam HI isimli enzim Bacillius amlio Liqufeciens (H) soyundan elde edilmiĢtir. Eco R1 ise E.colı (RY-13) soyundan elde edilmiĢtir. Hind II ise Haemophylus influence (Rd) soyundan Bgl 1 ise bacillus grobigi‟den elde edilir. Bunların genel adları Restırıksıyon enzimleridir. (R.E)‟ler DNA‟yı iki biçimde keser.Mesela Hınd II ve tanıma bölgeleri iki zincirde aynı hizada olup kesimden sonra (DNA)‟nın iki küt uç oluĢur. Bu durum Ģekildede gösterilmiĢtir.
Aynı Ģekilde mesela Bam HI‟ın kesikleri yapıĢkan uç olarak adlandırılır(5‟uç asılı durur.)Bu durumda kendiliğinden komplementer bazlarla hidrojen bağları ile yeniden eklenebilir. Böyle yapıĢkan uçların böyle yeniden eklenme (Reanneaal) yeteneği S.Cohen,L.. Boyer ve ark.‟ca 1971‟de ortaya konmuĢtur.
VEKTÖRLER KLONLANACAK DNA PARÇALARI TaĢıma Sürecinde Kullanılan TaĢıyıcılardır Vektör moleküllerin kunukçudan kolay izole edilebilen kendi ve taĢıdığı DNA (RE) ile kırılma (kesilme) bölgesi molekülünü bağımsız replike edebilen, sadece bir (RE) oluĢturabilen bu surette taĢınacak (DNA) parçasında aynı enzimle kesilerek ekleme sağlanabilecek nitelikte olmalıdır. Vektör molekülleri üzerinde antibiyotik direnç gen gibi bir iĢaretleyici taĢımalıdır. Bu surette vektör taĢıyan ve taĢımayan hücrelerin ayrımı mümkün olur. Mevcut teknolojilerde in vitro olarak çeĢitli kaynaklardan gelen DNA‟ların birbirine eklenmesi mümkündür. ġekilde bu durum gösterilmiĢtir. Halka DNA molekülü özel(R.E.)‟lerle kesilir. Böylece yeniden halkalar bağlanır. Eğer farklı moleküller aynı serbest uçlara sahipse bunlar kaynaĢarak hibrit molekül oluĢur.Burada DNA ligaz enzimi moleküllerin eklenmesinde kullanılır.Onemlı bır prokaryotık vektor plazmıddır.Bir konakçı hucreye bır plazmıd gırmesıne karsın kendını bır hucrede bınlerce kez bulunacak sekılde çogaltır
PROKARYOTĠK VEKTÖRLER Prokaryotlarda Plazmid vektor yanısıra LAMBDA ve M 13 BAKTERYOFAJ VEKTORLER, COZMIT COZMIT ve MEKIK vektorler. Bakterı yapay kromozomları, bulunur . EUKARYOTLARDA ıse MAYA PLAZMITLERI ILE olusturulan vektorler, MAYA YAPAY KROMOZOMLARI kullanılabılır. Prokaryotlarda konukcu hucre olarak E.Colı hucrelerı Eukaryotlarda ıse bitkiler için A.Tumofacıens ıle ınfekte olmus bıtkı hucrelerı, hayvanlar ıcın ıse Esey yada yumurta hucrelerı kullanılır. Sözü edilen vektörler aktarılacak materyalin mat eryalin büyüklüğüne göre seçilir.
13
ġekil 5. Halka plazmid DNA‟sı EcoRI aracılığı ile tanınır. DNA endonükleaz ile kesildikten sonra ayni iĢleme maruz kalmıĢ olan ve halkalanarak yada aynı restriksiyon enzimleri ile kesilen iki yada daha fazla,daha doğrusal molekülleri birleĢtirir. Bunun sonucunda elde edilen açıklıklar DNA ligaz ile kapatılır.S.Cohen, H.Boyer ve arkadaĢları bu teknik ile 1971‟de ilk kez plazmidleri eklemiĢlerdir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
ġekil 5.a. Rekombinant DNA çalıĢmalarının iĢlem basamakları(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGrawEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.) 14
ġekil 6. Rekombinant plazmidin Ģekillenmesi. Aynı restriksiyon enzimleri kullanılarak bu örnek de olduğu gibi EcoRI kullanılarak hem konukçu hemde yerleĢik DNA kesılır. Aynı anda kesilen uclar biraraya getirilerek yabancı DNA araya sokulmuĢ plazmid oluĢturulur. Ligaz DNA‟yı klonlayan ilk bilim adamıdır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
15
Ekleme iĢleminde yer alan bir DNA parçası plazmid olabilir. Plazmidler bakteri hücresinde yer alan bağımsız çoğalabilen DNA D NA parçasıdır. Rekombinant plazmid molekülü oluĢturulup hücreye eklenebilir. Rekombinant plazmid plazmid de Hibrit plazmid,hibrit taĢıyıcı (vektör) yada Kimerik plazmid adıda verilebilir Rekombinant plazmidin konukçuya konukçuya konulması için çeĢitli metodlar vardır. Mesela bakteri hücresi bu yapı için geçirgen (permeable) kılınır. Bu iĢlem Kalsiyum kloritin seyreltilmiĢ solüsyonu katılarak sağlanır. Bu iĢlem sağlandığında hücre içi plazmid DNA çoğalırken aktarılan DNA‟dada çoğalma gerçekleĢir.
Konukçu hücre içine yabancı DNA katılma iĢleminde,kesme(ekleme) yerlerinde kovalent baglar oluĢmadığından bu iĢlem Ligaz enzımı enzı mı ıle saglanır.Ayrıca plazmıdın aktarıldıgı hucredekı varlıgının saptanabılmesı ıcın antıbıyotık dırenc genlerı gıbı ozel tanıma unsurlarıda plazmıde eklenır. M 13 faj ları da tek kollu DNA içeren faj lar olup vektor ıslevi görebilirler
RESTRĠKSĠYON ENZĠMLERĠ ĠLE KLONLAMA Prokaryotlarda vektor olarak aktarılacak molekulun buyuklugune gore plazmıd ,cozmıt,faj.bakterı yapay kromozomu kromozomu mekık vektor gıbı tasiyici unsurlar kullanılabılır. kullanılabılır. Farklı kaynaklardan gelen DNA‟ların klonlanmasında çeĢitli koĢullar vardır.Önce plazmid aygıtı (R.E)‟lerle bir noktadan kesilir. Eğer birden fazla yerde kesim olursa deneme sırasında molekül parçalanır. Lamda fajlarından türeyen Charon fajlarında genomlarının orta üçde birlik kısmı faj için cok gereklı bolge degıldır Eco R I yardımı ıle aktarılacak yabancı DNA bu üçde birlik kısma konulabılır. Bu yüzden Lamda önemli bir taĢıyıcı aygıttır.15000 baz çifti (15 kilo baz 15kb) büyüklüğünde faj görevleri için hayati olmayan ol mayan kısmını yabancı DNA ile değiĢtirilmiĢ olan lamda fajı iyi bir hibrit taĢıyıcı aygıt olarak iĢlev görebilir. Çünkü fajın bu kısmı E.Coli kromozomuna eklenmek için gereklidir. Bu kısım faj bakteriyi enfekte ettiğinde bakteri içinde çoğalır ve sonuçta sonuçta ekleme bölgesi olmaksızın hücre lisise olur (patlar). Genetik mühendisleri Lamda zorunlu olmayan bölgesi eksik ve Eco R1 kesme bölgesi içeren DNA molekülü oluĢturmuĢlardır. Olusturulan recombınant molekuller ya yuksek verımlı transfectıon meteodu ile konakçı bakteriye transfer edilir yada ınfektif faj bıcımınde infeksıiyon ile aktarım saglanır.
Normal E.Coli plazmiti ile klonlamada yabancı yabancı DNA (15kb) dan daha büyük büyük bir Ģekilde çok büyük olduğunda durağan yapı kaybolmaktadır. Bu dezavantaj yanı buyuk molekullerle çalısma gerektıgınde olusan zorluk lamda fajları ile gıdereılır Yani büyük kromozomal segmentler klonlandığında plazmid çoğaldıkça plazmid klonu bazı kısımlarını kaybetme eğilimde olmaktadır. BaĢlıca bu nedenle genetikçiler Lamda fajını taĢıyıcı olarak kullanmıĢlardır. Bu fajlar (24 kb)lık büyüklükleride baĢarıyla taĢırlar.Faj kromozomları yaklaĢık (50kb) DNA içerir. Faj baĢ kısmı içinde içi nde Lineer biçimde hücre içinde halka formundadır. Faj baĢını dolduran DNA infeksiyon esnasında tanınır.
16
Çünkü her iki ucunda bir kollu küçük bir segment vardır. Bu uçlar Cos yeri olarak anılır. Cos terimi cohesive uç (Co hesive Ends) kavramını içerir. Cos yeri (12) bazlık uzunluktadır. Cos yerinin yeniden eklenmesi Lamda kromozomlarının konukçuya girdiğinde halka yapı almasına neden olur. DNA‟yı (Cos) yerinden kesince halka açılır,Lineer molekül oluĢur.Genetikçiler (Cos) yerinin bu avantajını kullanarak (24 kb) dan daha uzun segmentleri bile klonlayabilir. Birçok Eukaryotik genler intronlar ve transkripsiyon kontrol segmentleri nedeniyle daha uzundur. Eğer (CoS) segmentleri her iki ucu plazmid orijinli (DNA)‟ya eklenmiĢ ise çoğalma iĢlemi seçiçi antibiyotik genlerle sağlanarak (50 kb) kadar DNA‟yla klonlaĢabilir.
Bu cos yeri içeren plazmidlere cosmid c osmid adı verilir. Bu nedenle bu moleküller lambda kromozomunun cos kısmı ıle bakteryel plazmıdın melezı hıbrıt molekullerdır. Bu cosmidler büyük DNA‟ları klonlamak yanısıra yanısıra DNA‟sı büyük segmentlerin segmentlerin seçiminde kullanılır. Kosmidler lambda fajının faj protein kılıfına paketlenmesi için gerekli (cos) yeri ile plazmid replikasyonu için gerekli dizileri ve antibiyotik direnç genleri içerir. Çünkü küçük cosmidler faj baĢına birleĢemez. Böylece 2.5 -50 kb uzunluğa kadar yabancı (DNA)‟lar plazmidleri choron fajları yada cosmidler kullanarak klonlanır. Bi ra mayasında milyon baz uzunluğa kadar yabancı DNA‟yı klonlamakta mümkün olmuĢtur.
ġekil 7. Bir kozmidin görünüĢü :Kosmıdler (cos) adı verilen bölgeler içeren plazmid olup lambda fajı baĢlarında bakteriye aktarılır.Ġnfeksiyon sürecinde etkili bir metoddur. (cos) yerleri tek kollu olup konukçu içinde kaynaĢarak halka formuna çevrilir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
17
HĠBRĠT VEKTÖRLER ĠÇĠN SEÇĠM Yukarıdaki açıklamalarda açıklanan metotda (R.E)‟lerin ayrı ayrı hem vektör hem yabancı (DNA)‟yı kesmesi söz konusudur. Daha sonra bu iki unsur ligazın mevcut olduğu ortamda karıĢtırılır. Neticede birçok ürün meydana meydana gelir. Bu ürünler üç guruba guruba ayrılır. Yabancı DNA‟lı vektörler, yabancı DNA‟sız vektörler ve parçacıklar. Daha sonraki bölümlerde vektördeki özel yabancı (DNA) parçalarının bulunması incelenecektir. Burada herhangi bir (DNA) parçası içeren vektörlerin seçilmesi açıklanacaktır. Choron fajları basit olarak E.coli hücrelerini infekte etme kabiliyetlerine göre seçilir. Bilindiği gibi Lamda virüsü baĢ kısmında paketlenme için gerekli büyüklük ihtiyacı yüzünden sadece Lamda fajı DNA‟sı ve yabancı DNA birlikte paketlenebilir. Bu yüzden yabancı DNA içeren plasmid antibiyotik dayanıklılık özelliğinin incelenmesi ile ayırt edilebilir. Mesela yaygın olarak kullanılan PBR 322 plasmid bu maksatla kullanılabilir. Plasmitler ilk inceleyenlerin isimlerini baĢ harfleri ile incelenir. Buna göre bu plasmid (P) F.Bolivar (B) ve R.Rodriges (R ) tarafından incelenmiĢ i ncelenmiĢ ve (1977)‟de bu konu ile ilgili yayın yapılmıĢtır.Bu plasmidin Tetrasikline ve Ampisiline dayanıklılık genleri bulunur. Ayrıca bu plasmid de çeĢitli enzim kesme yerleri bulunur. Mesela Tetrasiklin dayanıklılık geni içinde (Bam H) enzimi kesim yeride bulunur. Ligasyon iĢlemi sonucunda yabancı (DNA) bulunduran ve bulundurmayan pl asmidler oluĢacaktır. E.Coli hücrelerinin kalsiyum kloritli ortamda bu (DNA) ( DNA) karıĢımı ile birlikteliği sağlandığında antibiyotik içermeyen ortamda DNA yı içine almıĢ E.Coli hücreleri elde edilmiĢ olacaktır. Daha sonra bu ortama iliĢkin plakalardan Replika yöntemi ile bir veya iki antibiyotiğin ikisini yada birini içeren ortamlara nakil kopya alınır. Her iki antibiyotiğe dayanıklı kolonilerdeki hücreler yabancı DNA içermeyen plazmidli hücrelerden oluĢmuĢ olmalıdır. Sadece Ampiciline daya nıklı koloniler ise yabancı DNA içeren plazmidli hücrelere ait olacaktır. Her bir antibiyotiğe dayanıklı olmayanlar ise plazmid içermeyen hücreleri temsil eder.
18
ġekil 8. E.coli PBR 322 plazmidleri. Bu plazmidi (amp ) ve (tet ) sembolleri ile belırlenen amplisilin ve tetrasiline dayanıklılık, danda sorumlu iki gen yeri taĢır. (tet ) geni içinde (BamHI) kesici enzim yeri vardır.(tet ) geni içinde clonlanmıĢ parçalar tetrasiline dayanıklılığı ortadan kaldırır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGrawEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
KÖR UÇLU EKLENME Kör ya da küt uçlu ekleme (Blunt end ligasyon) adı verilen yöntem (R:E) ile muamelenin klonlamada uygun olmadığı hallerde kullanılır.(R:E) ile kesme iĢlemi ıle klonlamanın mumkun olamadıgı mesela kesim yerlerının istenen genin ortasında oldugu durumlarda gerek duyulan yontem ıse Kor uclu ekleme(blunt end lıgatıon) yontemıdır. Yabancı DNA nın fiziksel kırılma gibi metotlarda elde edildiği durumlarda da çeĢitli clonlama metotları bulunur. Bu metotlardan en populer olan kör uclu ekleme (blunt -end-ligasyon) -end-ligasyon) denir. Bu metotta da yabancı DNA nın taĢıyıcı aygıtla eklenmesinin sağlanması söz konusudur. Ancak birbirine bağlı olmak dolayısıyla gerçek uçlar (sticky ends) yada yapıĢkan uçları bulunmayan moleküllerin birbirine eklenmesi söz konusudur.Mesela faj enzimi olan T4 DNA ligaz isimli enzim kör uçlu DNA ları ekler. Kör uçlar DNA segmentleri klonlanacağı zaman fiziksel olarak DNA ların kırılması ile Hınd III gibi kör uç oluĢturan (R.E) ler ile sağlana bilir. Ligaz hangi kör ucun ekleneceğine göre özel olmadığından bunun iĢlemi sonucunda birçok istenmeyen ürün neticeleri oluĢabilir. oluĢabilir. 19
(R.E) leri kullanarak klonlama yapmada yapıĢkan uçlar metodu tercih edilir. Kör uçlu ligasyonun değiĢik halinde bağlayıcılar, eklemler (linker) kullanılmaktadır.Bunlar kısa yapay sentezlenmiĢ DNA parçaları olup (R:E) tanıma yerleri içerirler. Bu bağlayıcılar DNA kör uçlarına eklenir uygun (RE) lerle muamele edilirse yapıĢkan uçlar oluĢur. Bu durum Ģekil (9) da gösterilmiĢtir. ġekildeki bağlayıcılar ortasında Eco R1 yeri olan 12 Baz çifti (Base pair=bp) uzunluktadır.Bunlar klonlanacak DNA ya (T 4 DNA) ligazla beraber eklenir.Daha sonraki (EcoR 1) ile muamele (Eco 1) yapıĢkan uçları oluĢumuna oluĢumuna yol açar.
ġekil 9. Bağlayıcılar. Küçük iç Restriksiyon kesim yerlerine sahip kısa DNA segmentleridir. Bunlar T4 DNA Ligaz enzimi aracılığı ile kör uçlu DNA‟lara katılabilir. Restriksiyon enzimleri ile muamele sonucu, aynı restriksiyon enzimi ile kesilmiĢ her hangi bir (DNA) ile rekabet edebilen (DNA)‟ ların oluĢmasına yol açar. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
KLONLANACAK (DNA) LAR ĠKĠ ġEKĠLDE ELDE EDĠLĠR. 1. Arzu edilen gen ya da (DNA) sentezlenir veya direk yada (mRNA) dan tersinir kopyalama ile izole edilir. 2. Organizmanın genomu Ģansa bağlı küçük parçalara bölünür
Bu ikinci usule tüfek saçması benzeri anlamına (shot gun) rastgele atıĢ klonlama denir. Sonra istenen (DNA) segmenti oluĢturulan çeĢitli klonlar arasından yakalanır(seçilir). ġimdi klonlamadan önce istenen genin izole edilmesi ya da sentezlenmesi sonrada klonlamadan sonra istenen genin yerleĢtirilmesini inceleyelim 20
1. BELĠRLĠ BĠR GENĠN KLONLANMASI 1.1.Klonlanacak DNA nın oluĢturulması. Belli bir geni ya da DNA parçasının klonlanmasından önce ilgili geni içeren çift kollu (DNA) parçasının saflaĢmıĢ halde mevcut olması gerekir.(DNA) elde etmek için çeĢitli yollar vardır. ÇeĢitli güçlük içermeyen oluĢumlar bir kollu (m RNA) elde edip onu çift kollu DNA ya çevirmek böyle bir usuldür. Bu durumda sorun istenen m RNA yı elde etmektir. Belli bir özel gen için m RNA özel genin niteliğine göre elde edilebilir. Eğer belli bir özel hücrede çok miktarda RNA mevcut ise direk olarak izole edilir.
bolca bulunur. Ayrıca Ribozomal Ribozomal RNA ve birçok t RNA yı uygun bir klonlama için bolca ve kolayca elde etmek mümkündür. RNA tümör viruslarından elde edilen tersinir kopyalanma (Reverse transcription) yardımı ile saflaĢmıĢ (RNA) dan klonlanacak çift kollu (DNA) elde edilebilir. Burada (3 poly-A) kuyruğuna sahip Eukaryotlardan elde edilen m -RNA kullanılarak (RNA) nın (DNA) ya dönüĢümü açıklanacaktır.
ġekil 10. (a) mRNA enzimi iki kollu DNA‟ya çevrilerek revers transkriptisekullanılarak klonlamayapılır. (b)Eukaryotik RNA‟nın Poly -A ucuna komplementer (PolyT)segmenti katılır. (c)RNA Ģablonundan bir primerin diziliĢ sırası kullanılarak DNA sentezlenmesi için Revers Transkriptize kullanılır. NaOH kullanılarak RNA uzaklaĢtırılır. polimeraz 1 için primer yeri de denir. Bundan çift kollu DNA oluĢur. (d-e) S1 Nükleaz enzimi saç tokasını uzaklaĢtırır. (f) Sonuçta komplementer DNA (cDNA) oluĢur. (Robert H. Tamarin‟inPrinciplesof Genetics(Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabındanmodifiye edilerek alınmıĢtır.) 21
ġekil (10)‟da görüldüğü gibi önce Poly -T, adı verilen primer kendine uygun Poly-A‟lı kuyruğa sahip m-RNA „ya katılır. Bu çeĢit çift kollu bölgeler serbest [3‟ -OH] içerdiğinden polimeraz aktivitesi için primer olarak baĢlama unsuru olarak iĢlem görür. Bilindiği gibi primer terimi (DNA) replikasyonunda (3‟ -5‟)‟ci istikamete tek kollu olarak devam eden çift kollu kısa (DNA) parçasını tanımlar. Daha sonra primer (RNA) tersinir kopyalama muamele edildiği zaman ,(RNA)‟yı kalıp olarak kullanarak (DNA) nükleotidleri polimerize eder(Bir araya getirir yani zincir haline getirir).Sonuçta (DNA-RNA) hibrid molekülleri oluĢur. Daha sonra m -RNA‟nın uzaklaĢtırılması için (NAOH) ile muamele sağlanır. Bu unsur DNA‟yı etkilemez. RNA uzaklaĢtırıldıktan sonra DNA‟nın (3‟)ucu genellikle diğer uca katlanır ve saç tokası biçiminde lop oluĢturur. Meydana gelen çift kollu DNA‟ya komplementer DNA (c DNA)adı verilir. Burada tek kollu m-RNA‟dan baĢlanarak çift kollu DNA üretilmiĢtir . Bu (DNA) kör uçlu ekleme metodu ile klonlanabilir. Eğer (RNA) çok miktarda ortamda mevcut değilse eğer belli bir gene iliĢkin proteinin aminoasit diziliĢ sırası biliniyorsa invitro olarak (DNA) sentezlenebilir. Bir genin protein unsuru yardımıyla aminoasit diziliĢ sırası buna iliĢkin muhtemel nükleotid diziliĢ sırası ise kod sözlüğünden elde edilir. Bu metod genetik kodda çokluk (aynı aminoasidin birden çok kodla belirlenmesi) olduğundan orjinal DNA tam yeniden oluĢumu sağlanmayabilir. Diğer bir bir değiĢle bir proteinde yer alan Leucin‟ne iliĢkin (6) farklı farklı kodon vardır. Bütün bunlara rağmen yeni tahmin her zaman gerçekleĢmemekle birlikte belli bir protein kodlayan (DNA) sentezlenebilir. sentezlenebilir. Günümüzde Ģekil (11)‟deki (11)‟deki gibi her zaman birimde D NA sentezleyicisi makineler geliĢtirilmiĢtir. bir (baz) (100) baz uzunlukta DNA Açıklanan bu metod ile genetik kod sözlüğünü kullanarak komplementer, bütünler (cDNA) yada sentetik DNA yapımı da genin promotor bölgesi ve (DNA) Protein çevrimine uğrayan kısmı (intron) Transkripsiyon Kontrol sıraları gibi kısımlar eksik kalacağı hususu akılda tutulmalıdır. Eğer bir geni promotor ve intronları ile birlikte klonlamak istiyorsak klonlanan genomun tesadüfi seçilmiĢ parçalarını oluĢturduktan sonra yapılması gerekir. Ġlgi duyulan gen klonlamadan önce yada sonra bulunabilir. mRNA aracılıgı ıle elde edılen cDNA çeĢitli Ģekillerde kullanılabılır.Soz gelimi uclarına çift zıncırlı kısa RE tanıma yerlerı ıceren DNA‟lar takılarak ardından RE ıle kesıp yapıskan uclar olusturarak bellı bazı teknıklerle faj yada plazmide aktarılarak klonlanır.Sadece bellı bır hucre tıpınde(embrıoda.yada dokuda) aktıf olan aktıf olan dızılerı(mRNA) iceren kolleksıyona cDNA kutuphanesı denır. Bu terım GENOMIK KUTUPHANEDEN farklıdır. Çunku cDNA sadece o safada o hucrede mevcut mRNA ların karsılıgı olan DNA‟ları içerir. Dıger bır deyısle cDNA genomda yeralan DNA nın düzeneleyici bolgelerıni Transkrıpsıyona ugramayan bolgelerı ni içermez. Genomık DNA genomdakı tum dızılerden enaz bır bı r kopya içeren klonlanmıĢ DNA kolleksıyonudur.
22
Ġnsan genomunu klonlamak ıcın faj vektoru kullanılırsa 4 -5 milyon faj vektoru gerekır. Genomun bır parcasından ornegın tek kromozomdan olusan kutuphaneler kromozom -ozgul kutuphane dıye adlandırılır. Bır genomık kutuphane yuzbınler varan klon içerebılir.
ġekil 11. Ġlk otomatize edilmiĢ döngü ile solid fazdaki DNA sentezi.Birinci nükleotid silica ön maddesine (substrat‟a)bağlanır.Ġkinci nükleotid (aDMT=Dimetoksitrily) türevi ilk nükleotidle fosfodiester bağı oluĢturur.DMT ikinci nükleotidin (5„) ucunu korur.DMT uzaklaĢtırılmadığından nükleotid katılamaz.DMT uzaklaĢtırıldıktan sonra dinükleotid yeni döngüye hazır hale gelir.(R1) ve (R2) koruyucu grupları süreç tamamlandığında uzaklaĢtırılır.Ve oligonükleotidler silica ön maddesinden ayrılır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.) Promotor terimi (RNA) polimerazın transkripsiyon baĢlatmak üzere (DNA)‟da bağlandığı yeri tanımlar. Ġntron terimi ise (DNA) (DNA) içinde transcribe olan fakat translasyondan translasyondan önce uzaklaĢtırılan kısımları tanımlar.
23
GENOM KÜTÜPHANESĠ OLUġTURMA i lgili klonlama çalısmalarında genomun tumu buyukluk C-DNA veya sentetik DNA ile ilgili nedenıyle kullanılması mümkün olmadığında, organizmanın toplam DNA‟sı daha küçük parçalara bölünür. Bu küçük parçalardan da arzu edilen gen yada DNA DNA parçaları izole edilir. Bir genomik kutuplarda genomdaki tüm dizilerden en az bir kopya içereçek Ģekilde hücrelerden DNA dürüstirileri (Rejler ile kesilir parça vektörlere takılır. Her vektör sadece birkaç bin baz DNA içierir. Arzu edilen gen klonlamadan önce yada sonra elde edilebilir.Böyle (DNA) genomik DNA olarak adlandırılır ve c(DNA)‟dan farklıdır. Eğer (DNA) klonlamadan önce elde edilmiĢ ise o zaman sadece ihtiyaç duyulan DNA klonlanır.
Diğer bir yolda tüfek saçması benzeri (shotgun) adı verilen yaklaĢımı kullanmaktadır. Bu usulde genomunun bir örneği (küçük parça) kullanılarak klonlama yapılır.Böylece bir türün orjinal genomunun klonlanmıĢ parçalarının seti elde edilmiĢ olur. Bu sete genom kütüphanesi denir(ġekil.12). cDNA kutuphanesı tum gernomu degıl sadece mRNA ları karsılıgı olan DNA ların kutuphanesidir. O yüzden (cDNA) kütüphaneside denir.
ġekil 12. Rastgele atıĢ(Tüfek saçması atısı) yaklaĢımını kullanarak oluĢturulmuĢ,araya sokulmuĢ unsurları kullanarak Genomik kütüphane oluĢturulur.Genom kısımlarına parçalanır.Parçacıklar daha sonra vektörlerde vektörlerde Ģansa bağlı biçimde klonlanır.Bu klonlanır.Bu vektörlerin toplamı genomik kütüphanesi adıyla bilinir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGrawEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
24
Genom kütüphanesi olgusunda arzu edilen gen klonlandıktan sonra kutuphaneye yerleĢtirilmiĢ olur.
SOUTHERN BLOTTING Genellikle Endonükleaz enzımı ıle Sindirim aracılığı ile tesadüf olarak üretilen DNA segmentleri söz konusu ise bunların ıcınden arzu edilen genin yerini belirlemeye gerek vardır. Daha önce belirtildiği gibi klonlamadan önce yada sonra gen aranabilir. Önce (DNA)‟daki özel bir genin yerini (DNA) klonlamadan önce nasıl olduğunu inceleyelim DNA parçalarının ortasındaki özel bir genin yerini anlamak için önce özel sonda (probe) ihtiyaç duyulur.Klonlanan genın karakterızasyonu,pekçok DNA parcaları ıcınde ıstenılen parcanon varlıgını gosterme,ilgili genın farklı turlerde karsılıgını bulma, gıbı ıslemler ıcın SOUTHERN BLOTLAMA yapılır Sondalar genellikle nükleik asid yapısında olup diziliĢ sırası hibridizasyon sonucu ile varlıgı arastırılan hedef molekule(c-DNA)‟ya butunler olan ona uyan diziliĢ sırasını tanımlar. t anımlar. Sondalar daha sonra otoradyografi ile yada cemilĠmunuskent teknikler ile (ultraviyole yada laser ıĢınları altında varlıklarını ortaya koyan iĢaretlerdir)iĢaretlerinden dolayı belırlenebilmektedir. radyoaktif olarak -DNA
il e radyoaktif sonda arasında oluĢacaktır. yada DNA-DNA hibritleri özel gen ile Otoradyografi yada cemilımunuskent tekniği radyoaktif sondanın yerini gösterir. -globin geninin klonlamak istediğimizi varsayalım. Önce tavĢan (DNA)sında Restriksiyon enzimleri ile kesintiler oluĢturmak gerekir. Daha sonra bu kesintiler agaroz jelde elekeroforeze elekeroforeze tabi tutulur. Ve böylece büyüklüklerine göre çeĢitli ebatlarda parçacıklara ayrılır. Agoroz çok çeĢitli büyüklükte (DNA) parçacıklarını ayırmak için iyi bir ortamdır.Bu çeĢit bir kesme iĢleminde çok sayıda fragment söz konusu olup sonuçta çok küçükden çok büyüğe olmak üzere oligonükleotid lekeleri (band yapıları)oluĢur. Daha ileri iĢlem için elekroforez fragmentleri diğer ortama transfer edilerek sonda iĢlemi yürütülür.Bunun icin dogru DNA parçalarının agoroz jel den dıĢa dogru nıtro seluloz fıltreye düfüze olması sağlanır. Nitroselüloz filtre yada naylon membranlar hibridizasyonda en iyi neticeyi verir.
25
ġekil 13. Southern blotting tekniğini kullanarak bir (DNA) Kitlesi içinde tavĢan -globin geninin varlıg belirlemiĢtir. TavĢa DNA‟sı restriksiyon enzimler ile kısımlara ayrılır Agaroz el ortamında elektroforez yapılır Southern Blotting yapılır (Bantları gorulur kılmak ıcın -globin haberci RNA Ģeklindeki -globin geni içeren DNA fregmentinin yerini saptar. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
26
Bu teknikte Agoraz jeldeki çift kollu DNA önce genellikle (NaOH) ile tek kollu (DNA)‟ya denatüre edilir. Daha sonra Agoraz jeli filtre parçası dikkatlice Nitroselüloz filtre altına gelecek Ģekilde yerleĢtirilir.
Neticede Sandviç gibi Agoroz Agoroz tarafı aĢağıda ıslak sünger üstüne gelecek gelecek Ģekilde yerleĢtirilir. Sonra nitroselüloz filtre tarafına kuru filtre kâğıdı konur. Böylece tıpkı fitil gibi agorozlardaki (DNA) segmentini taĢıyan kısım Nitroselüloz filtreye geçirilir.
ġekil 14. Southern blotting tekniğinde je l ve filtrelerin düzenlenmesi (NaOH) Buffer solüsyonu kuru filtre aracılığı ile yukarı çekilir ve DNA‟yı agarose jelden nitro seluloz filtreye transfer eder. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.) Burada (NaOH) tepside yer alarak nakledici solüsyon olarak iĢlem görür.(DNA) kesintili parçaları ise ısıtma iĢlemi ile Nitroselüloz filtreye kalıcı olarak bağlanır. Filtre üzerinde DNA-DNA) hibridizasyonu gerçekleĢmiĢ olur.
Eğer aynı teknik RNA üzerinde sağlanırsa Northern blotting olarak adlandırılır.Northern blotlama belırlı bır genın farklı hucrelerde,dokuda organızmada transkrıpsıyon aktıvıtesını(mRNA‟lar aracılıgı ıle) kullanılır . Nükleotid komplementaritesini komplementaritesini olgusu içermeyen içermeyen immunolojik tekniklerde t ekniklerde ise proteinler için sonda kullanılabilir. Bu tekniğe tekniğe Western blotting denir. Yani antibody‟lerin antibody‟lerin sonda gibi kullanılarak belli bir proteinin aranması iĢlemine Western blotting denir. ĠĢaretlenmiĢ sondalarda çeĢitli Ģekillerde elde edilebilir. Bu örnekte radyoaktif sonda tersinir kopyalama kullanarak (cDNA) oluĢturmaktır. ol uĢturmaktır.
27
Tersinir kopyalamadade kullanılan Dideoksinükleotidler sentezlenirken Radyoaktif Fosfor [32P] içerirler. Bu durum Ģekil (13)‟de gösterilmiĢtir. içeren DNA segmentinin yerini gösterir.Doğal olarak (mRNA)‟dan türeyen cDNA gende mevcut intronu içermeyecektir. Ancak nükleotid kolunda komplementer kollar olduğu sürece sondalama baĢarılı olacaktır.
kesintisi örneğini kullanarak ikinci bir Agoroz jel uygulanır. (DNA-DNA) hibridasyonuna maruz bırakılmayan jel aynı yerde B globin segmentini içerir. Autoradyografi ile yeri bilinen bantı agoroz jelden kesilip çıkarılarak (DNA) izole edilir. Böylece bu DNA klonlama tekniği ile klonlanır.
DNA Sondaları Bir Klon kütüphanesinden özgül klonların seciminde kullanılan mototlar DNA prok kullanımı içerir. Bir genomik kütüphanede yüz binlerce klon vardır. Bir kütüphaneden çalıĢacak geni elde etmek için yalnızca ilğili geni içerir. Klona yada klonların belirlenmesi geliĢtirilmesi gerekir. Ayrıca klonları genini tutumunun bütününü belirlediği tesbiti gerekir. DNA grupları tek zincirli yada cift zincirli moleküller olarak hazırlanabilir. Sondaki genellikle radyoaktif polinoleotidlerdir. Özgül polipeptidler belirlere de renk, kimyasal reaksiyonlar içeren sondalarda kullanılır. Bu maksatla palazmit kütüphanesi taraması sa söz konusu olabilir. Bu iĢlem için klonları taĢıyan bakteriler besleyici plaklarda üretilip binlerce koloni oluĢturular. Koloni bakterileri plakdan nitroselüler yapıda kagıt filitreye mühür mühür replika yöntemi ile hafifce bastırılarak filtre üzerine aktarılır. Filtredeki kullanılan tek zincirli sonda ile muamele edilerek (DNA-DNA) hibritleri oluĢturulamsı sağlanır. Sonra filitre yıkanır bağlanmamıĢ (hibrit oluĢumu) molekül hibridasyonu olup olmadığı anlanabilir. Fotorgraf filmi üzerine konup sonra sondanın radyoaktif olması yada olmamasına göre film üzerinde koyu lekeler yada kimyasal ısınma Ģle ayır edilir. Bu maksatla Plaka hibridasyonu gibi baĢka yöntemler de kullanılabilir.
KLONLANMIġ GEN ĠÇĠN SONDA DOT BLOTTING: Daha önce açıklanan metodlar mesela Genom kütüphanesi oluĢturulduktan sonra zaten plasmid içinde klonlanan genlerin yerini belirlemek belirlemek içinde kullanılabilir. Bu durumda elektroforez ve Southern blotting gerekmeyecektir. gerekmeyecektir. Çünkü belli bir kesinti içindeki DNA segmentinin yerinden ziyade zaten klonlanmıĢ DNA‟nın belli özel diziliĢ sırası klonlanacaktır.
Dot blotting elektroforetik ayrım safhasını gerektirmeyen zaten klonlanmıĢ DNA‟nın Blotting (lekeler) ile Ģekillenen bantlar biçiminde görülürlügünü saglama tekniğidir. Mesela i nsan DNA‟sının yerini belirlemek için klonlanabilir. insan-fare hibrit hücre hattı DNA‟sı insan
28
Bu durumda hibrit hücre hatlı sadece 20 no‟lu kromozomu olan bir tane insan kromozomu içerir. Bu kromozomdan gelen DNA‟nın yerini belirlemek için insan kromozomundan izole edilmiĢ sonda (prob) kullanılır. Sondalar radyoaktif olarak iĢaretlenir. Aynı anda her biri hibrit plasmid içeren (288) E. coli kolonisi yerleĢtirilir ve direkt nitroselüloz filtreye dâhil edilir. Prob (sonda) iĢlemine hazırlık için hücreler lisise edilir ve DNA‟ların denatüre olmaları sağlanır. Her klonun hücreleri içindeki plasmid DNA‟sı radyo aktif bir sonda ile hibridize edilir. Yani insana özel diziliĢ sırası içeren prob(sonda)‟un radyoaktivıtesı kullanılır. Aynı anda ayrı bir iĢlem olarakta (288) adet insan-fare hibrit hücre hatt DNA klonları ile nitroselüloz filtre üzerinde (288) ayrı yerde lisise edilir. Sonra prob (sonda) lisise edilen örneklere tadbik edilir. ĠĢte bu (288) klon örneklerinden insan 20 no‟lu kromozom DNA‟sı taĢıyanlar koyu renk alır. renk alır. Bu Ģekilde elektroforez ayrımını gerektirmeyen klonların (DNA) hibritlenmesi tekniğine Dot Blotting denir.
ġekil 15. Fare-insan hibrit hücre hattı içeren i çeren (DNA)ya iliĢkin (288) clonun Dot Blot otoradyagrafisi. Clonlar insana özgü diziliĢ sırası için sondalarla hibridize edilmiĢtir. Sonda iĢlemi her clonun nitro seluloz filtre dolu örneklerinin Lisizi ile yapılmıĢtır.Ġki koyu karanlık nokta,insan (DNA)sı taĢıyan clonların yerini gösterir.Bir çok diğer noktalardaki silik radyasyon araĢtırıcının yerleĢimin biçimini anlamasına yardımcı olmak iç in oluĢturulmuĢtur. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
WESTERN BLOTTING Bu teknik belli bir klonlanmıĢ özel genin yerini belirlemek için farklı bir metod olarak bilinir. Plasmid içeren hücrelerdeki klonlanmıĢ klonlanmıĢ genlerin gerçek açıklamasının yapılmasından yapılmasından yararlanılır. Eğer eukaryotik genler E. coli plasmidlerinde klonlan-dığında aktif bir promotor uygun akım yönünde yönünde yer almıĢ ise bu durumda gen gen faaliyeti (Transcripsiyon>Translasyon>Protein) (Transcripsiyon>Translasyon >Protein) elde edilmiĢ olabilir.
29
Bilindiği gibi AĢagı yön(Down stream) (akım yönü) terimi (RNA) polimeraz enzim i ile ılgılı olagan,yonu tanımlar. DNA transcipsiyonun yönü ve pozisyonuna dair olağan durum (5‟) ucundan (3‟) uc yönüne doğrudur. Bu durumda ters akım yönü (up stream) (5‟) uca doğru normal akım yönünu (Down stream) ise(3‟) uca doğru polimerazın geliĢimini tanımlar. Promotor ise (RNA) polimeraz bağlanma yerini tanımlar. ĠĢte yabancı DNA‟nın DNA‟nın açıklanmasına olanak veren plasmide plasmide expresion vektör adı verilir. Normal olarak bakteriler eukaryotik genleri açıklamayacağından bu teknikte birçok zorluk olduğu hatırlanmalıdır. Ancak genede klonlama yeri promotorun akım yönünde olan çeĢitli özel plasmidler geliĢtirilmiĢtir. Bu durumda eukaryotik gen prokaryotik genin bir kısmı haline gelir ve bu Ģekilde genellikle prokaryotlar bir kaç aminoasit içeren fusyon protein oluĢturur. ġüphesiz eukaryotik genin uygun yerleĢimde yer alması ve uygun translasyon için tam doğru kodon çerçeve okunmasına maruz kalması gerekir. Doğal olarak böyle bir olasılık düĢüktür.Belli bir protein ürününün yeri Southern blottıng yada Dot Blottıng‟e benzer Ģekilde belirlenebilir. belirlenebilir. Bu tekniğe Western Blotting adı verilir. Yani burada antibiyotik kullanarak belli özel proteinin sonda tekniği ile anlaĢılması amaçlanır.
ġekil 16. Western Blot tekniğiyle birçok Klon arasından belli bir proteini açıklayan klonun yeri belirlenir. Açıklanan proteini taĢıyan Klonlar lisize adilir. Antibodi uygulanarak protein yeri saptanır.Ġkinci bir antibadi,birinci antibadinin yerini saptar.Bu iĢlem fl orosent renklendirici ile yada otoradyografi ile yapılır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGrawEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.) 30
Bu teknikte sondalama radyoaktif oligonükleotid sondadan ziyade belli özel proteine özgü antibodi ile yapılır. Birinci antibodiye özgü ikinci bir antibodide iĢaretleyici olarak genellikle floresans nitelikli olur ve birincinin yerini belirler. Mesela Ģekil (15)‟deki clonda yer alan belli özel proteinin açıklanmasını arıyor olalım. Clonlar nitroselüloz membrana aktarılır ve orada genellikle kloroform buharı ile lisize edilir. Sonra belli özel proteine özgü antibody tatbik edilir. Aynı Ģekilde birinciye özel ikinci antibodi florescens iĢaretleyici ile iĢaretlenir ve filtreye uygulanır. Ġkinci antibodi‟nin florescens ıĢıması birinci antibodi‟nin yerini gösterir. Bu da hangi klonun belli bir özel geni açıkladığını gösterir. ġekil 16‟d a bu durum gösterilmiĢtir.
KROMOZOM YÜRÜYÜġÜ, KOMUġU GENLERĠN TANIMLANMASI Bu terim bireysel olarak klonlanabilecekten daha uzun (DNA) segmentlerinin segmentlerinin üst üste çakıĢan sondalar kullanılarak incelenmesini açıklar. Bır genın yerı yaklasık bılınıyorsa once komsu dızılerı klonlayarak suretı ıle o genıde klonlamak mumkundur. Aktarılan yabancı (DNA) boyu sınırlı olmasına karĢın bazen daha uzun (DNA) segmentlerini üst üste çakıĢan clonları incelemek suretiyle kromozom yürüyüĢü adlı teknikle incele yebiliriz. Kromozom yürüyüĢü metodunda klonların ve DNA”nın uç kısmı tekrar klonlanır ve Genomik kütüphaneden baz dizileri örtüĢen diğer klonların araĢtırılmasında sonda (prob) olarak kullanılır. Sonuç örtüĢme düzeyi için analiz edilir. Ġkinci kez klonlanan örtüĢen bölgenin ucu alınır tekrar baĢka baĢka örtüĢen klonaların seçimi için sonda olarak kullanılır. Böylece kromozom boyunca yürümüĢ olunur.
ġekil 17. Kromozom yürüyüĢ tekniği ile bölgeyi kapsayan araya sokulmuĢ kısmın klonlarında üst üste çakıĢan kısmın yerini belirlemek Ģeklinde uzun kromozom yürüyüĢ yapılır.(A)Araya sokulmuĢ kısım olarak tanımladığımız belli özel (DNA) parçası ile baĢlanır. Daha sonra bu kısımlarına bölünerek diğer klonlar için,(A) bölgesiyle çakıĢan bölgeyi içeren genom kütüphanesi içindeki diğer klonlar için sonda elde edilir.(aĢağıda diğer bölge (B) ile belirtlmiĢtir.) (A-B)klonunun kendisi kısımlara ayrılır ve iĢlemi tekrarlayarak sonde elde edilir. Böylece kromozom üzerinde sürekli ilerlenir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.) 31
Mesela (A) bölgesi adı verdiğimiz belli bir gen (1) no‟ lu klonda yer alsın. Bu bölgenin bu klonda yer aldığı aldığı sonda aracılığı ile anlaĢılmıĢtır. KlonlanmıĢ kısım aynı aynı (R.E)‟yi kullanarak baĢlangıç vektörü ile yapıldığı gibi alınıp uzaklaĢtırılır ve sonda (Prob) ların kendilerinin kullanımı gibi parçalara ayrılabilir. Burada amaç birinci ile üst üste çakıĢan klonlanan kısmı içeren diğer bir klonun yerini belirlemektir. Ġkinci klonda aynı Ģekilde muamele muamele görür. Böylece segmentleri kromozomda kromozomda daha aĢağı kısımlardaki diğer üst üste çakıĢan kısımlarda sonda olarak kullanılır. Bu Ģekilde nisbeten kromozomun uzun segmentleri çakıĢan klonlar yardımı il e incelenebilir. Kromozom yürüyüĢünün açık bir kullanım alanı eukaryotik kromozomlarda hangi genlerin birbiriyle yan yana olduğunu anlamayı sağlar. Kıstık fıbroz ve kas dıstrofısı dı strofısı genının yerı boyle belırlenmıstır. Bu teknik çok bıktırıcı iĢlemleri gerektirir. Belli bazı alanlarla sınırlı uygulaması vardır. Mesela Eukaryot DNA larda tekrarlanan diziliĢ sıraları gibi konular özel güçlükler oluĢturur. ÇakıĢan sonda birçok ortak tekrarlanan diziliĢ sırası i çerir bitiĢik segment içermeyen birçok klonla hibritleĢir. Bu Ģekilde çapraz iliĢki tekniğin değerini azaltır. Yakın zamanda kromozom sıçraması (kromozom jumping) teknikler geliĢtirilmiĢtir. Bu teknikler yürüyüĢ için uygun olmayan bölgeleri atlayan onları (bypass) yapan yapan tekniklerdir. Bu teknikler segmentler iki ucunun ortasında yürüme iĢlemi yapılmadan iki uçların yerlerinin belirleme kabiliyetlerine bağımlıdır. Segmentlerin uçları eğer bölge invert edilmiĢ ise (ters çevrilmiĢ)yada büyük bir bölge klonlanıp orta kısım sonra uzaklaĢtırılarak sadece uçlar kalmıĢ ise segmentlerin uçlarının yeri belirlenebilir. Ġki ucun sondası araĢtırıcının birinci ucu ve diğerlerini etkili olarak clonlamasına ve e aradaki bölgelerin üzerinden atlanılmasını mümkün kılar. Kısaca kromozom jumping terimi genomik kromozom üzerindeki birbirini ta kip atl ayan klonların izolasyonu sağlayan etmeyen fakat bilinen noktalar arasında o bölgeyi atlayan tekniktir. Bu iĢ genellikle ilgili olmadığı düĢünülen bölgeler üzerinde iĢlem yapmak yada (yürüyüĢ) uzun olduğunda by - pass pass bölgelerinde yapılır.
HETERODUPLEX ANALĠZ Genellikle eklenen parçanın boyutunu tahmin etmek için clonlama tecrübelerinin sonuçlarını görmek arzu edilir. Bu teknik heteroduplex heter oduplex analizi yada heteroduplex haritalama olarak anılır.
Duplex DNA farklı kaynaklardan gelen tek kolların (DNA) ları farklı olan yerl erde Loop yada çıkıntı yapacak Ģekilde oluĢumu ile elde edilir. Bu heterojen DNA‟ya heteroduplex adı verilir. Elektron mikroskobu gözlemi ile analizi ile bu çeĢit DNA analizlerinde rekombinans DNA aralarındaki önemli bilgiler sağlanır.
32
ġekil 18. Ġki lambda faj kromozomunun iki bölgede farklılaĢmıĢ hetero dubleks haritası. Her ikiside hem uzunluk, hemde bir bölgenin böl genin diziliĢ sırası bakımından farklılaĢır.(soldaki ok).Ayrıca biri diğerinde bulunmayan biraraya sokulmuĢ kısım içerir.(sağdaki ok).(a) Elektron Mikrografik (b)-Açıklayıcı diyagram araya sokulmuĢ bölge içeren kromozom farklı çizimle gösterilmiĢtir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
33
Heteroduplex analizi kullanılarak çeĢitli yabancı DNA ilave yerler, delesyonlar yada (DNA) parçacıklarındaki heterojenite ile belirlenebilir. Bu yöntemte klonlanan ürünlerin clon genellikle kendi sondası yada clonsuz plasmidi olmak üzere diğer nükleik asit ile hibritleĢtiğinde heteoduplex DNA oluĢur. Bu Ģekilde clonlanan ürün elektron mikroskobu ile görülebilir. Metot bu Ģekilde elektron mikroskobik incelemeye dayanır. Mesela bir canlıda lamda fajlarının iki klonlama vektörü arasındaki farklılığı haritalamak için Heteroduplex analiz kullanılabilir. Bu durum ġekil 18‟de gösterilmiĢtir. ġekilde iki farklı bölgede farklılaĢan iki faj kromozomunun hibridizasyonu gösterilmiĢtir. ġekilde okla iĢ aretli yerde iki faj kromozomu ebat ve diziliĢ sırası farklıdır. Bu durum heteroduplex kromozomdaki tek kollu lop halinde gözlenir. Oysa bunun her iki tarafında eĢit kollu molekül yer alır. Ġki bölge farklı diziliĢ sırası ile gözlenir. Çünkü bunlar hibrit hibridize olmaz. Bunun nedeni bölgeler ebat bakımından farklıdır. Ġki tek kollu zincir ölçülerek aĢıkar olarak farklı olduğu gösterilebilir. Ġkinci farklı bölgede ise tek kolu (DNA)‟nın gözlendiği araya sokulmuĢ loop göze çarpar. Bu durum bir kromozomun ilave içine alınmıĢ alı nmıĢ kazanılmıĢ bölge içerirken değerinin böyle olmadığını gösterir. Lamda kromozomu kromozomu ebatını bilirsek iki vektörün ebat farklılığı farklılığı yanı sıra farklılığın tam uç noktasını belirlemek mümkün olur. Bu ölçümler araĢtırıcıya iki vektörün nelere maruz kaldığını gösterir.
EUKARYOTĠK VEKTÖRLER Yapılan çeĢitli çalıĢmalarda kimerik plazmidlerin baĢlıca E.Coli olmak üzere bakterilere sokulması söz konusudur. konusudur. Ancak bu tekniklerin eukaryotlarda uygulanması için E.Coli gibi prokaryotlar, fajlar eukaryot genlerinin tümünü açıklamaya muktedir değildir. Çünkü bunlar genetik bazı transcripsiyon sonrası yada translasyon sonrası, iĢlemler, intron uzaklaĢtırılması, bazı proteinlerin modifikasyonu gibi iĢlemler için gerekli enzimler bakımından eksiktir. canlı Eukaryotik genomun in vivo (canlı içi) i çi) organizasyon ve açıklanması konusunda da çeĢitli konular arastırma alanlarını olusturmaktadır. Bunları anlayabilmek için Eukaryotik plazmidler ve eukaryotik genomun invivo iĢlemesi konuları incelenmelidir.
MAYA VEKTÖRÜ Bira mayası küçük bir eukoryatik olup, laboratuvarda tıpkı prokaryatik gibi genetık ıslemlere uygun çalıĢabilir nıtelıktedır.. Ekmek mayası (saccharomyces cerevisia ) da böyle doğal olarak mevcut 2 mikron ebadında plazmitler vardır. Bu tıp plazmıt vektor olarak kullanılabılır. Ayrıca bakteriyel plazmitler maya hücresine konulabilir. Maalesef böyle pl azmitler hücreden kaybedilebilme eğilimindedir.Bu güçlük maya sentromeri (cen) ve bakteriyal plazmitler birlestırılerek içinde maya DNA replikasyon orijini bölgesinide (autonomously (autonomously replication sequences ARS) içeren bakteriyel plasmitler oluĢturularak giderilmiĢtir. Daha sonra plasmitler bir generasyondan generasyona maya aracılığı ile aktarılır.
34
Plazmitler içlerine konan telomerik diziliĢ sırasına sahiptir. Ancak endonükleazlarla telomerik sıralarda kesilerek doğrusal hale getirebilir. Yada plazmitler önce doğrusal kılınıp uçlarına telomerik diziliĢ sırası eklenebilir. Bu plazmitler sonra maya suni kromozomu ( yeast articifical chomoromozom = Y.A.C.) olarak adlandırılır. YAC‟nin özel avantajı içlerine konan büyük (DNA) parçalarını taĢıma kapasiteleridir. Cosmitlerin 50 kb taĢıdıkları hatırlanırsa YAC‟ler 800 kb yada daha büyük taĢıyabilir. YAC‟lar Eukaryotlarda insan genom prosesinde olduğu gibi çok miktarda DNA‟nın klonlanması söz konusu olduğunda önem kazanmaktadır. MayadaRekombinantDNA çalıĢmaları, Eukaryotlarda gen regulasyonu, sentromer çalıĢma biçimi eu karyotik, Linear, kromozom replikasyonunun ayrıntıları anlaĢıldıkça artacaktır.
ġekil 19. E.Coli‟de PBR 232 plazmidi. Bira mayasında kullanımı için modifiye edilmiĢtir. Bu plazmid hem bira mayasında ve hemde hemde E.Colide yaĢamakta ve replike olmaktadır. Çünkü Çünkü her iki durum içinde replikasyon orjin içermenin yanı sıra, bira mayası sentromerik bölgesi(CEN) bulundurur. Bunlar doğrusal doğrusal hale getirildiğinde telomerler de katıldığında bira mayası, mayası, suni kromozomu(YAC) büyük (DNA) parçalarını klonlamak için uygun hale gelmiĢ olacaktır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
HAYVAN VEKTÖRLERĠ Taksonomik bakımdan yüksek hayvanlarda yaygın kullanılan aygıt DNA tümor virüsü (SV40)‟dır.(S.V.sembolü (SV40)‟dır.(S.V.sembolü sgımıan vacuolotıng virusu tanımlar. Ġlk olarak maymunlarda izole edilmiĢ olup normal fareye tavĢana hamster hücresinede transforme olabilir. Transformasyon kelimesinin bakterilerde kullanımının aksine eukaryotlarda normal hücrenin hızlı büyüyen kanserli hale dönüĢümünü tanımlar.
35
SV40 bu bakımdan çok küçük nıtelıkte partükül olup kçok az (5224 baz çifti ) kromozom içerir. Kalıtsal içeriği çift kollu halka DNA molekülü halindedir. Lamb‟de vektörü gibi (SV40) virionları kendi DNA‟larının bir kısmını yabancı DNA ile değiĢebilir. Rekombinant DNA çalıĢmalarında kullanılan viruslar iki çeĢit yol izlerler. Bunlar kendi hayat sikluslarını rekombinant olmayan viruslar yardımıyla tamamlar replike olur yada konukçu hücrede mevcut stoplazmadaki halka plazmidler aracılığı ile aktif virus partikülleri yapmaksızın(Yanı hucreyı lısıze etmeden) yada konukçu kromozomuna eklenerek hayat sikluslarını tamamlar(lısogenı). (SV40)memeli hayvanlar genetik çalıĢmalarında önemli bir araç olmaktadır. Mesela -Globun geni (SV40)‟de klonlanmıĢtır.SV40‟da enhancer( kuvvetlendırıcı zenginleĢtirici) diziliĢ sırası keĢfedilmiĢtir. Onkogenler gibi transformasyon konusunda yeni bilgilerin çoğu DNA tümör viruslarını viruslarını taĢıyıcı aygıt olarak kullanılan çalıĢmalardan sağlanmıĢtır. Enhancer ise eukaryotik DNA diziliĢ sırasında transkribe edilen bölgeden belli bir uzaklıkta bile olsa transkribe olan bölgenin transcipsiyonunu arttıran DNA diziliĢ sırasına verilen addır.
ġekil 20. SV40 bir klonlama aygıtı olarak kullanılabilir. Klonlama esnasında sokulan (DNA) ile virüsün bir kısmı yer değiĢtirir. Beraber normal helper (yardımcı) virüs yardımı ile hala replike olur.(Rekombinant olmayan SV40). Helper virüsü yardımı olmaksızın, ya plazmıt ya plazmıt gibi çoğalır yada konukçu kromozomuna eklenir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGrawEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
36
BĠTKĠ VEKTÖRLERĠ Yabancı genlerin bitki hücrelerine konulmasında en iyi çalıĢılan sistem doğal olarak mevcut Krown genleri tumor sistemidir. Toprak bakterisi Agrobacterium Agrobacterium tumofaciens birçok dikotiledon bitkilerde Krown galerileri adı verilen tümöre neden olur. Esas olarak Krown galerileri ise transforme olmuĢ bitki hücresidir. Bu hücreler bakteri içinde bulunan tümör özendirici adı verilen Tumor Inducıng (Ti) plasmidlerı aracılıgı transformeolmus bıtkı hucrelerıdır. Plazmidin belli bir bölgesine T -DNA (transfer edilen DNA) parçası adı veril ir. Eğer plasmidin T-DNA kısmı konukçu bitki hücre kromozomuna integre olursa transformasyon oluĢur. Krown galeri hücreleri opın adı verilen bir cins aminoasit türevi üretir. Bu unsur A. tumofacıen‟sin ihtiyaç duyduğu bir unsurdur. Bu sistem kullanılarak genetikçiler transformasyon iĢleminin nasıl olduğunu anlamıĢlardır. Bu süreci bitkilerde gen aktarımı için kullanmıĢlardır. Genetikçilerin çalıĢması büyük oranda E. coli maya ve meyva sinekleri gibi model bireyleri bitkilerde belirledikten sonra çalıĢmalar hız kazanmıĢtır. Bu konuda en büyük ilgiyi çayır otlarından otl arından Arabıdopsıs thalıana almıĢtır. Bu küçük bitki bitki genetiği çalıĢmaları için idealdir. Çünkü genomu genomu çok küçük olup (5) kromozomda kromozomda 100 milyon baz çifti (2 nükleosu) bulunur. Bu miktar mayaların (5) katı E. coli‟nin (20) katıdır. Dolayısıyla bu genom büyüklüğünde iĢlem yapmak genomu genomu tamamen analiz etmek mümkün olacaktır. Bitkiler çok sayıda yetiĢtirilerek her bitkinin binlerce tohumunu almak mümkün olduğu düĢünülürse bu organizma genellikle çalıĢmak için oldukça uygundur.
ġekil 21. Arabidopsis thaliana bitkisinin cüce formu. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGrawEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
37
YABANCI DNA’NIN EUKARYOTĠK HÜCREDE FAALĠYETĠNĠN SAĞLANMASI Yabancı DNA eukaryotik hücrelere bakteriyel transformasyona benzer tarzda konulur. Ancak bu durumda TRANSFECTI T RANSFECTION ON adı verilir. Çünkü daha önce açıklandığı gibi eukaryotlarda transformasyon kanserli büyümeyi ifade eder Eukaryotik organizmalar yabancı (DNA)‟yı aldığı zaman T ransgenik adını alır. Hayvan hücreleri yada hücre duvarı uzaklaĢtırılmıĢ bitki bi tki hücresi (protoplast) yabancı kromozomu yada (DNA)‟yı direkt çevreden Kalsiyuum bifosfat mevcudiyeti halinde düĢük etkinlikte kendi içine alır. ,Bu etkinlik DNA‟yı direkt olarak injekte etmek suretiyle arttırılabilir. Mesela Transgenik fare Ģimdilerde diĢi farelere uygun hormonal hazırlık uygulanarak sağlanan oosite yada bir yada iki hücreli emriyo halinde iken yabancı DNA injekte inje kte edilebilmektedir(ġekil23).
ġekil 22. Fare oositininn çekirdeğine DNA Ġnjeksiyonu. Oosit pipet i çerisine çekilirve daha sonra injekte edilir. (Ro bert H. Tamarin‟in Principles of Genetics Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.) KlonlanmıĢ DNA‟dan yaklaĢık 2 picoliter (2x10 -12 litre) hücreler alıcı konukçu diĢi uterusuna reimplante edilir(yeniden yerleĢtirilir.)Bu injesiyonların yaklaĢık %15‟inde yabancı DNA embriyoya incorpore olur. Transgenik hayvanlar yabancı eukaryotik genlerin kontrol ve açıklanması için faydalıdır.1988‟de transgenik fare patenti alınan ilk genetik ol arak düzenlenmiĢ kansere eğilimli patenti alınmıĢ ilk organizmadır. Transgenik fare kanser üzerinde çalıĢmalar için idealdir. Farelerde kemirgen büyüme hormonu geni ile transfecte edilmiĢ fare baĢarı ile elde edilmiĢtir. Ġnsan pıhtılaĢma faktörü üreten Transgenik koyun elde edilmiĢtir. En son Rekombinant DNA uygulaması bilimsel tartıĢma yaratan bir olgu olarak koyun klonlanması ile 1997‟de elde edilmiĢtir.
38
Transfeksiyon Transfeksiyon Retro virusler ile de yürütülebilir. Retroviruslar RNA içeren viruslar olup tersine kopyalama enzimini içerirler. Mesela insan akyuvar hücrelerinde “Adenosındeamınaz” enzimi eksiktir. Bu eksiklik Retrovirus vektör infeksiyonu ile giderilir. Kemirgenlerde lösemi Ģekillendirmekten sorumlu retrovirus olan “Moloreu murin losemi virusu” böyle bütün genler için düzenlenmiĢ virusun bütün genleri çıkarılmıĢ “neomisin” dayanıklılık ant ibiyotik iĢaretleyici ile yer değiĢtirilmiĢtir. Virus hücre yüzeyine bağlanır ve hücre içine alınır. Bunun RNA‟sı tersinir kopyalama ile DNA‟ya çevrilir ve DNA D NA hücre kromozomları ile birleĢip ona incorpore olur.
Bu oldukça yüksek modifiye edilmiĢ virusun bir yardımcı Helper virusu olmadıkça hücrelere hücum edip bozması mümkün değildir. ġekil 20‟deki (SV40) virusu modifiye edilmiĢ Moleney virusu önemli genler uzaklaĢtırıldığı için Helper virus olmaksızın baĢarılı infeksiyon baĢlatamaz. Diğer üç çeĢit teknikte eukaryotik hücrelere Rekombinant DNA konmasında kullanılır. Bu teknikler elektroporasyon,Lıpozom aracılığı ile tranfer. biolistik t ransfer‟dir. Elektroporasyon dıĢ kaynaklı eksojen DNA‟nın yüksek voltajlı elektriğe maruz kalmıĢ hücreye alınmasıdır. Bu elektrik alanı mühtemelen hücre membranından geçici porlar oluĢturmakta ve eksojen DNA içeri girmektedir. Lipozom aracılığı ile transfer yontemınde ise yabancı DNA suni membranlı bağlı lipozom adı verilen kesecikle kaplanır. Bu lipozomlar DNA‟yı hedef hücreye aktarmada
ekte olmuĢ neticede transfekte DNA ile kodlanan protein üretilmiĢtir. transf ekte Bir çok nedenlerin yanısıra çift membranlı hücre duvarı rekombinant DNA aktarımı için uygun olmaması yanısıra DNA‟nın mitokondriye yada kloroplastlara konması Ģimdilik genetik mühendisliği için zor hedeftir. Yakın zamanlarda hem mitokondrial ve kloroplastlarla transfeksiyon için biolistik (Biyolojik Balistik) yöntemler geliĢtirilmiĢtir. Bu yöntemde rekombinant DNA Tungsten mikro projectle kaplanır. Sonra bu organizmalara gen tabancası adı verilen fırlatıcı ile fırlatılır.
NAKAUT (KNOCKOUT) FARE Belli bir lokustaki belli bir fonksiyonu olmayan allel için homozigot kılınmıĢ transgenik fareyi tanımlar. Normal olarak bir fareyi transfekte etmek için kullanılan gen fare genomunda ise tesadüfî bir yere inkorpore olur. (eklenir)Ancak bazen, eğer yabancı gen Krossingover olmadan homologunun aksi yönünde yer alırsa yabancı gen orijinal genle yer değiĢtirir. Bu avantajı dikkate alarak Knockout Fare (Nokaut Fare) tekniği oluĢturulmuĢtur. Bu teknik de normal fare oositi kusurlu genle transfekte edilir ve bazı vakalarda bu normal kopyası ile yer değiĢtirir ve sonuçta fare bu gen için heterozigot olur. Böyle iki transfekte edilen genin fonksiyonları gözlenmemiĢ olacaktır. Böylece bilim adamları bir genin fare yaĢamı için hayati olup olmadığını, değilse kusurlu fenotipin ne olduğunu anlamıĢ olacaklardır. Bu teknoloji geliĢme ve imminoloji çalıĢmaları için çok uygundur.
39
KlonlanmıĢ normal genın arasına antıbıyotık dırenc genı gıbı marker katıp fonksıyonu bozulduktan sonra fare embrıonık koken hucrelerıne verılırse bazı hucrelerde bu bu gen normal genle yer degıstırır.Daha sonra bu hucreler blastomer safasında embrıolara ınjekte edılerek homozıgot mutant genı tasıyan fareler elde edılmıs olur. Mesela “Mulleran” engelleyici unsuru için gen “knock out” edilirse erkekler kısır olur. Çünkü diĢi genital organlarına sahip olur. Bu deneyler cinsiyet belirlemesi genetik yönlere daha önem verilmesini sağlayacaktır. Halen her yıl 150-200 knock out deneyi sergilenmektedir.Ayrıca nakavt genler ınsanlarda genetık hastalıkları calısılmasında model hayvan olarak kullanılır.
BĠLDĠRĠCĠ SĠSTEMLER Bu sistemler bir genetik yapı olup araĢtırıcıya belli bir l iliĢkili lokusun fenotipik açıklaması suretiyle aktif olup olmadığını belirtir. Mesela “Luciferaz” isimlı bildirici(reporter) genın yada urununun varlıgı Luci ferin ile yıkandığında parıltılı kızarık görünüĢü vermesi ile belırl enır. Kısaca bu sistemler transfeksiyon (Yabancı DNA‟nın eukaryotik hücreye sokulması) deneyinin baĢarılı olup olmadığını belirleyen sistemlerdir. Bitkilerin Agro Bakterium Tumofaciens‟in (Ti) plazmidi ile transfekte edildiğini düĢünelim. Eğer bir bitki (Ti) plazmidi içeren A.Tumofaciens ile infekte edilmiĢ ise konukçu bitkiye T-DNA bölgesini transfer ederek onu tranfekte eder. Bu Ģekilde T -DNA‟yı alan hücreler T-DNA ile transfekte edilmiĢ olan ve „opin‟ maddesi adı verilen bir çeĢit aminoasit türevinin üretimi özendirilir. Bu madde bakterinin gıdasıdır. (Ti) plazmidi hakkında yapılan deneylerin çoğu konukçu bitkiye aktarılan diğer genleride içermektedir. Böylece aktarılan genler için transgenik bitkiler oluĢturulmuĢ olur. Böyle bir denemede de Tütün bitkisi ateĢ böceğinden alınan Luciferaza genini içeren (Ti) plazmidi ile transfekte t ransfekte edilmiĢtir. Bu genin ürünü ATP bağımlı Luciferin oksidasyonunu katalize eder ve dıĢarıya ıĢık salar. Transfekt e bitki Luciferin ile sulanırsa ateĢ böceği gibi ıĢıldar. Böyle denemelerin önemi ıĢıldayan bitkilerden ziyade, bu ıĢıldamanın belli özel genin etkisini bildirmesini sağladıgı hususudur. Daha ileri denemelerde belli özel genlerin promatör ve enhancer (zenginleĢtirilmiĢ) bölgeleri Luciferaze genine eklenebılır.
Sonuçta Luciferaze sadece promatörler aktive edilince iĢlev i Ģlev görmüĢtür, üretilmiĢtir. Bu durumda bitkinin ıĢıldayan bölgesi transfekte genin aktif olduğu yerleri gösterir. Daha yakın zamanlarda incelene bildirici sistemler Jöle balığı (Jelly Fish)‟den gelen geni kullanır. Bu gen yeĢil floresans proteinidir. Bu sistemin önemi Luciferazda olduğu gibi bir Ģey katmaya gerek olmaksızın olmaksızın ultraviole ıĢığında parlar. YeĢil floresans protein geni incelenen gen ile il e kombine edilip transfeksiyon yapılır. Eğer istenen gen baĢarı ile geçirildiyse ultraviole ile aktive edildiğinde bildirilmesi yani sonucun görülmesi gerekir. 40
RESTRĠKSĠYON HARĠTALAMA Restriksiyon enzimlerinin bir çift kollu DNA‟da yaptıkları kesik sayısı bu DNA segmentinin uzunluğuna, diziliĢ sırasına, belli enzimin tanıma diziliĢ sırasında baz çifti sayısına bağlıdır. Prokaryot ve eukaryotlarda gen faaliyetlerinin unsurları aĢağıda kısaca özetlenmiĢtir.
Prokaryotlar ve eukaryotlarda transkripsiyon sonrası (post transcription) ve translasyon sonrası (post translasyon) modifikasyonlarda farklılıklar olabilmektedir. Gen açıklamasının kontrolünde en önemli “yer” trankripsiyonun baĢladığı, RNA polimerazın baglandığı yer olan promotordur. promotordur. DNA zincirinde transkripsiyonun transkripsiyonun bitiĢ yeri terminatör (sona erdirici) diziliĢ sırası ile belirlenir. Promotor yanı sıra eukaryotlarda DNA uçlarındaki enhancer bölgesi promotorun iĢlem yönüne ters yönde yer alır ve transkribe edilen yerden belli bir mesafede bile olsa ilgili bölgenin transkripsiyonunu arttıran ayarlayıcı bölgedir. Klon DNA‟sın tanımlamanın ılk adımı onun Rstrıksıyon harıtasını yapmaktır.Restrıksıyon harıtası klonlanmıs bır DNA parcası uzerınde RE kesme bolgelerının sayısının sıralanısının ve aralarındakı uzaklıgın jel elektroforezı ıle parca buyuklugu bılınen bır molekul ıle karsılastırılarak belırlenmesıdır. DiziliĢ sırası buyuklugunun Ģans etkisi oluĢma ihtimali ilgili sıra uzunluğunun r.
Mesela Hınd II enzimi (SV40) tümör virüsü halka DNA‟sını iki parçaya böler. Bazı restriksiyon enzimleri E.Coli DNA‟sını yüzlerce parçaya böler Restriksiyon enzimlerinin DNA örneği üzerine etkisinin ürünlerine restriksiyon kesintileri (restriction digest) adı verilir. Elektroforez kullanarak bu restriksiyon kesintilerinin büyüklük sırasına göre ayırabiliriz. Bu teknik aĢağıda anlatılacaktır. Bu teknik sayesinde orijinal gendeki yada DNA parçasındaki restriksiyon yerlerinin yeri yeri belirlenmiĢ olur. Böylece restriksiyon tanıma yerlerine göre bir harita yapılabilir. Sonuçta bu tanıma yerleri arasındaki fiziksel mesafe hesaplanır. Böyle restriksiyon haritaları çeĢitli nedenlerden oldukça önemlidir. Söz gelimi (SV40) unsurunda (DNA) replikasyon baĢlangıcında kısa sürede radyoaktif nükleotid trifosfatlı timidin katıldığında radyoaktiflik sadece bir restriksiyon parçasında gözlenir. Bu durum (SV40) replikasyonunun bir özgün noktadan baĢladığını ve bu noktanın yer aldığını gösterir. (SV40) belli yer kromozomunun, belli yerinde yer Ayrıca bu Ģekilde restriksiyon haritaları araĢtırıcılara genetik harital ar ile kromozom fiziksel haritalarını iliĢkilendirme olanağı verir. DNA‟daki Delasyon, inversiyon ve restriksiyon değiĢimleri gibi bazı fiziksel değiĢimler genetik haritalardaki yeri bakımından belirlenebilir.
41
Restrıksıyon harıtaları klonlanan parcanın uzunlugu hakkında fıkır verdıgı gıbı RE kesım bolgelerınıde belırtır. Bu bilgiler DNA değiĢikliliklerini anlamamızı sağlar. Ayrıca türlerin farklılaĢmasının anlaĢılması bu çalıĢmalarla anlaĢılması daha iyi anlaĢılır. Parçacık boyutundaki farklılıklar, restriksiyon parçacık ebat polimorfizmi (R.F.L.P Restriksiyon Fragment Length Polimorfizim) olarak adlandırılır ve genlerin tam yerlerinin belirlemesinde önemli bilgiler sağlar. Ayrıca Ayrıca bireylerin akrabalığı yada benzerliğini anlamaya anlamaya yardımcı olur. Restriksiyon kesintileri kısa DNA segmentlerinin izole edilmesi ve diziliĢ sırasının analiz edilmesi bakımından mümkün olur.
ġekil 23. Restriksiyon endonükleazlar ile sindirilmiĢ parçaların elektroforesi ıle restriksiyon haritaları. (a)- (A) ile gösterilen restriksiyon yerlerini gösteren orjinal DNA parçası. (b) kısmi ve toplam sindirilmiĢ kısımların bandlarını gösteren agaroz jel bandları. Yıldızlar ise uçları iĢaretlenmiĢ segmentler aracılığıyla üretilen radyoaktif bandları gösterir. Soldaki skala, baz çiftleri için molekül agırlığı değerlerini gösterir.(Örneğin: 800bp,700bp). Toplam sindirilmiĢ(kesılmıs) kısımlar 400.200.100 ve 50bp‟lik fregmentler üretir. Ayrıca 200 ve 100bp‟lik fregmentler iĢaretlenmiĢtir kısmi sindirilmiĢ unsurlar altı ilave bant verir. NOT; Kısım kesim (RE) (RE) yerlerinin tümü değil bir kısmı kesilmis kesilmis olmayı tanımlar. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)
42
