Aktinomisetlerin Biyoteknoloji, Genetik Mühendisliği ve Nanoteknolojide Kullanımı Uğur ÇİĞDEM Bilecik Şeyh Edebali Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Anabilimdalı Kasım 2015
İçerik Aktinomisetler Hakkında Genel Bilgi Biyoteknolojide Aktinomisetler Aktinomisetler Mühendisliği
ve
Genetik
Nanoteknolojide Aktinomisetler Yürütülen Çalışmalar Hakkında Bilgi
AKTİNOMİSETLER • Aktinomiset terimi aktis (ışın demeti) ve mykes (mantar) kelimelerinin birleşmesiyle oluşmuştur ve bu terim organizmaların morfolojileri dikkate alınarak verilmiştir (Liman, 2007). • Aktinomisetler gram pozitif organizmalardır. Morfolojileri ve yüksek G+C içerikleri aktinomisetleri diğer organizmalardan ayıran özelliklerdendir. • Aktinomisetlerin en belirgin özelliği filamentli hiflere sahip olmaları dır. Çoğu aktinomiset kolayca tespit edilebilen ve havaya kolay bir şekilde yayılan sporlar üretirler (Lacey, 1997). Aktinomisetlerde substrat (vejetatif) ve hava miseli olmak üzere 2 tip misel bulunmak -tadır.
• Vejetatif miseller jelimsi yapıda ve parlak görünümlüdür. Miselin rengi sarı, pembe, kırmızı, turuncu, yeşil ve kahverenginin yanı sıra krem veya beyazımsı olabilir. Buna ek olarak suda çözünen pigment ler de üretilir. Bu pigmentlerin rengi kahverengi veya daha koyudur. • Aktinomisetlerin çoğunda özelikle Streptomyces cinsinde vejetatif miseller farklılaşarak hava misellerini oluşturur. Hava miselleri pa-m uksu ya da toz gibi görünen spor formuna dönüşebilirler (Waks- ma n, 1950).
AKTİNOMİSETLERİN DOĞADAKİ YAYILIŞI • Aktinomisetlerin mevcudiyetleri, dağılışları ve çeşitliliklerinin; hayvanlar, bitkiler, mağaralar, denizler, bataklıklar, çeltik tarlaları ve dağ ormanları gibi onların bulundukları çeşitli ekolojik habitatlarla ilişkili olduğu belirtilmiştir. • Özellikle, aktinomisetler için en önemli habitat topraktır (Lee ve Hwang, 2002).
• Topraktaki aktinomiset populasyonunu etkileyen önemli faktörler; Sıcaklık Tuzluluk Bitki örtüsü Organik madde miktarı Nem içeriği
• Çoğu aktinomiset türünün optimum büyümesi nötral pH’da iken bazı aktinomiset türlerinde pH 5.0-9.0 gibi geniş bir aralıkta da büyüme görülebilir (Goodfellow ve Williams, 1983).
AKTİNOMİSETLERİN SINIFLANDIRILMASI • Gram pozitif bakteriler iki önemli kola ayrılırlar: (Kieser ve ark., 2000). Düşük G+C İçeren Bacillus Staphylococcus Clostridium Streptococcus
Yüksek G+C İçeren Actinomycetes
• Aktinomisetleri tanımlamak için kullanılan önemli yöntemlerden biri de 16S rRNA analizidir. 16S rRNA’ları dikkate alınarak yapılan sınıflandırmada aktinomisetler 15 alt takıma ayrılmıştır (http://www. ncbi.nlm.nih./ 2015).
AKTİNOMİSETLERİN ENDÜSTRİYEL ÖNEMİ • Aktinomisetler; antibiyotik, enzim, bitki büyüme faktörleri, alkaloid ler ve vitaminler gibi ticari değeri yüksek olan biyolojik aktiviteye sahip bileşiklerin en iyi kaynaklarındandır (Omura, 1986). • Doğada bulunan antibiyotiklerin yaklaşık 2/3’ü aktinomisetlerden izole edilmiştir. Aktinomisetler farklı kimyasal sınıflara ve biyolojik aktiviteye sahip antibiyotikleri üretme yeteneğindedirler (Okami ve Hotta, 1988).
BİTOTEKNOLOJİDE AKTİNOMİSETLER Aktinomisetler tarafından 5 ana biyoürün grubu üretilir; 1. Primer metabolitler 2. Sekonder metabolitler 3. Biyolojik dönüşüm ürünleri 4. Ürün olarak aktinomiset hücreleri 5. Rekombinant ürünler
Aktinomisetlerin Primer Metabolitleri • Uygun besiyeri ortamına mikrobiyal suşların inokülasyonundan sonra mikrobiyal gelişmenin eksponansiyonel evresinde ara metabolik ürün üretilir. Bu yüzden, eksponansiyonel evrede üretilen metabolitler primer metabolitler olarak bilinirler. • Bu primer metabolitler; Enzimler Karbonhidratlar Aminoasitler Lipidler Proteinler Vitaminler Alkol Organik asitler
• Aktinomisetler tarafından üretilen önemli primer metabolitler mevcuttur (Tablo 1).
Tablo 1. Aktinomisetlerin Ürettiği Önemli Primer Metabolitler
Aktinomisetlerin Sekonder Metabolitleri • Sekonder metabolitler, mikrobiyal türler özellikle de bazı mikroorganizmaların filamentli formları ile belirli bitkiler tarafından üretilen çeşitli karmaşık kimyasal yapılara sahip bileşiklerdir. • Önemli sekonder metabolitler; Antibiyotikler İnsektisidler Anti kanser ajanları İmmün baskılayıcılar Antiviraller Toksinler Antiparazitleri Gelişim düzenleyiciler Pigmentleri
• Sekonder metabolizmanın özelliği, metabolitlerin genellikle hızlı gelişim evresinde (eksponansiyonel) üretilmemesidir, fakat takip eden üretim evresinde üretilirler. Bu bileşenler büyümenin ekponansiyonel evresinde fizyolojik olarak bir rol oynamazlar. • Sekonder metabolitlerin üretimi; gelişimin karbon, nitrojen ya da fosfat gibi bir anahtar besinlerin tükenmesi ile sınırlandırıldığı zaman başlar. • Aktinomisetler tarafından üretilen önemli sekonder metabolitler bulunmaktadır (Tablo 2).
Tablo 2. Aktinomisetlerin Ürettiği Sekonder Metabolitler
Aktinomisetlerin Biyolojik Dönüşüm Ürünleri • Mikrobiyal dönüşüm mikroorganizmalar tarafından bir maddenin (substrat), diğerine (ürün) dönüşümünü içerir. Mikrobiyal dönüşümde, enzimler kimyasal reaksiyonlar için katalistler olarak rol alır. Kimyasal sentez yapan enzimlerin kombine halde kullanımı yüksek derecede esnekliğe sahip kullanışlı maddelerin üretimine sebep olabilir (Zhou et al., 2005). • Biyodönüşümlerin avantajı; pH ve sıcaklık durumlarını kimyasal süreçler için daha az etkili hale getirmektir ve çok saf ürünleri de ikincil yan ürünler olmadan da elde edilebilir yapmaktır.
• Bazı mikroorganizmalar aracılığıyla ekonomik olarak önemli biyodönüşümlerden bazıları; steroid, pestisit, antibiyotik ve ksenobiyotiklerin mikrobiyal dönüşümüdür. • Biyodönüşümle ilgili olan mikroorganizmalar arasında aktinomisetler önemlidir. Biyodönüşüm reaksiyonlarıyla ilgili olduğu rapor edilen aktinomisetler, Streptomyces, Nocardia, Rhodococcus ve Dactyl osporangium’dur (Tablo 3).
Tablo 3. Aktinomisetlerin Ürettiği Biyodönüşüm Ürünleri
Ürün Olarak Aktinomiset Hücreleri • Mikrobiyal hücreler; biyogübreler, tek hücre proteinleri (SCP), probiyotikler, biyopestisitler ve biyokontrol ajanları gibi ürünler olarak kullanılırlar. • Ürün olarak mikrobiyal hücrelerden faydalanmak için; onlar doğal substratlar kullanılarak büyük ölçüde geliştirilir ve basit biyoayırma metodlarıyla toplanır. • İlk olarak, simbiyotik bir azot bağlayıcı bakteri olan Frankia, azot bağlayan biyogübreler olarak kullanılmıştır. Streptomyces fradiae, Streptomyces lydicus, S. albocinerescens ve S. aurantiacus bazı mikrobiyal bitki hastalıklarını kontrol etmek için biyokontrol ajanları olarak kullanılmıştır (Balagrunathan ve ark., 2007) .
• Bir termofilik aktinomiset olan Termomonospora fusca’dan kurutulmuş miselyum hazırlığı özellikle hayvanlar ve kümes hayvanları için tek hücre protein yiyeceği olarak kullanılmıştır. • Son zamanlarda, akuakültürün balık ve karideslerde mikrobiyal hastalıkları önleyen probiyotikler olarak arttırılmış deniz Streptomyces biyokütlesiyle beslendiği ortaya konulmuştur (Devendiran ve ark., 1997, Balagrunathan ve ark., 2007). Şaşırtıcı bir şekilde, arttırılmış canlı Streptomyces biyokütlesi ile beslenmeyi akuakültüre uygulad ı-ğımız zaman karideslerdeki White Spot Syndrome Virus (WSSV) enfeksiyonu azalmıştır.
Aktinomisetlerin Rekombinant Ürünleri • Rekombinant DNA teknolojisi, bitki, hayvan ve mikroorganizmalarda özel karakterleri kontrol eden bireysel genleri tanımlama, izole etme ve kullanma/oynama araçlarının gelişimi için temeldir. • Rekombinant DNA teknolojisi iki yolda aktinomisetlerin antibiyotik üretimi üzerinde pozitif bir etkiye sahip olabilir. İlki, bu teknoloji seçilmiş hedeflere karşı arttırılmış aktivite ve azaltılmış yan etkiye sahip yapısal olarak özgün antibiyotikler geliştirmek için veya hibrit antibiyotik üretimi için kullanılabilir. İkincisi, genetik uygulamalar ürünleri arttırmak için kullanılabilir ve böylece üretim maliyeti daha düşük olur.
AKTİNOMİSETLER VE GENETİK MÜHENDİSLİĞİ • Son yıllarda Streptomyces’in genetik ve moleküler biyolojisi hakkın daki bilgi önemli derecede artmış durumdadır. Birçok önemli araştırma; genetik yapı, genetik uygulama, antibiyotik üretimi ve direnci, plazmidler ve vektörler ve gen ekpresyonunun düzenlenmesi hakkında sunulan güncellenmiş bilgileri ortaya koymuş durumdadır.
Aktinomisetlerdeki Ekstra Kromozomal Genetik Materyal- Plazmid • Genelde aktinomisetler, özellikle Streptomycetes’ler bol miktarda kendiliğinden replike olabilen ekstra kromozomal genetik elementler taşırlar. • Bunlar 1.8’den 200 kb boyutuna kadar ve kopya sayısıda 2’den 600’ e kadar çeşitlenir. Ekstrem durumlarda, ekstra kromozomal DNA, t oplam hücresel DNA’nın % 10-20’sini oluşturabilir. Genelikle plazmid boyutu 10-40 kb’dır ve kopya sayısı 30’dan azdır.
• Bu ekstra kromozomal yapılar aktinomisetlerde geniş yaygınlık gösterdiğinden ve organizmanın genom düzenlenmesinde ve antibiyotik sentezinde rolü olabilecek genleri taşıdığı gerekçesiyle araştırmacıların çok ilgisini çekmektedirler. • Streptosporangium, Micromonospora sp., Streptoverticillium, Nocar dia, Amycolatopsis ve Frankia sp.’yi içeren diğer aktinomiset cinslerinin temsilci suşlarından da plazmidler tanımlanmıştır.
Aktinomisetlerdeki Antibiyotik Biyosentezinin Genetik Yönü • Aktinomisetler çok çeşitli kimyasal gruplara ait antibiyotik olarak bilinen mevcut aktif maddelerin yaklaşık 2/3’ünü sentezlerler. • Bu nedenle, aktinomisetler; antibiyotik biyosentezinin organizasyonu ve regülasyonu hakkında temel bilgiyi toplamak ve nicel/nitel olarak etkili antibiyotik üretimi için bu bilgileri açıklayabilme olasılığından dolayı büyük ilgiyi toplamaktadır. • Antibiyotik biyosentezinin genetiği hakkında araştırmaların erken dönemlerinde, önemle vurgulanan; antibiyotik biyosentezinden sorumlu yapısal genlerin kromozomal olarak lokalize olup olmadığı ya da onların ekstra kromozomal olarak kodlanıp kodlanmadığıdır.
• Daha detaylı analizler antibiyotik biyosentezinden sorumlu yapısal genlerin çoğunlukla kromozom üzerinde ve nadir olsa da ekstra kromozomal yapılarda da bulunabileceğini göstermiştir. Aktinomiset ler tarafından üretilen antibiyotiklere ait genlerin lokalizasyonu tablo 4.’te gösterilmektedir. Tablo 4. Aktinomisetlerde Antibiyotik Üretiminden Sorumlu Genlerin Loka-lizasyonu
Aktinomisetlerde Gen Transfer Teknikleri • Genelde, konjugasyon ve transformasyon Streptomyces’de genetik değiş tokuş için ana mekanizmalardır. Transdüksiyon fajları tanımlanmış olmasına rağmen, transdüksiyon aktinomisetlerde yabancı DNA’nın girişi için daha az öneme sahiptir. Son zamanlarda, genellenmiş transdüksiyon bazı Streptomyces suşları için bildirilmiştir.
• Diğer bakterilerde olduğu gibi, kendini aktaran plazmidler Streptom yces’deki konjugal gen transferinden sorumludur. • Streptomyces coelicolor’da genetik değiş tokuşu içeren SCP1 ve SCP2 plazmidlerinin keşfini takiben, birçok farklı plazmid diğer Streptomyces suşlarında saptanmıştır. • Konjugasyon, Streptomyces içerisine yabancı DNA’nın girişi için yaygın bir teknik değildir. Konjugasyon sadece Streptomyces suşları arasında en kompleks yolakları kodlamak için kapasiteye sahip çok geniş DNA fragmentlerini transfer etmek için bir yoldur.
Streptomyces İçin Vektör Sistemleri • Streptomyces için önemli replikatif vektörler; pIJ101, pSG5 ve SCP 2* türevlerini içerir. pIJ101 türevleri yüksek kopya sayısına sahip vektörlerdir ve genomik kütüphaneler oluşturmak ve promotör aktivitesini analiz etmek için kullanılmaktadır.
pSG5 türevleri ısıya hassas, hücre replikasyonunda rol alan yüksek kopya sayılı plazmidlerdir. Gen işleyişini durdurma ve gen yer değiştirme ile klonlama vektörü olarak kullanılır.
SCP2* türevleri düşük kopya sayılı plazmidlerdir. Avantajı yüksek stabilitesi ve büyük DNA fragmentleri taşıyabilme yeteneğidir. Bu vektörler ilk hibrid antibiyotikleri üretmek için kullanılmışlardır.
Rekombinant Proteinlerin Üretimi İçin Konak Hücre Olarak Aktinomisetler • Son zamanlara kadar, tüm proteinleri geniş miktarda evrensel olarak eksprese edebilen formda hiçbir konak hücre bulunmamıştır. Rekombinant ekspresyon sistemlerindeki gelişmeler Özellikle Gram+ bakterilerde plazmidlerin karakterizasyonu ve identifikasyonu
aktinomisetlerdeki rekombinant ekspresyon sistemlerinin geliştirilmesine olanak sağlamıştır (Nakashima ve ark., 2005).
• Genetik mühendisliğinde konak hücre olarak aktinomisetlere bakıldığında iki çarpıcı özellik vardır. İlki, Aktinomisetler, özgün metabolik çeşitlilik ve enzimatik yetenekler ortaya koyarlar. Sekonder metabolit olarak onların ürettiği bileşenler endüstri, eczacılıkla ilgili amaçlar ve antibi-yotikler için değerlidir (Weber ve ark., 2003). İkincisi, aktinomisetlerin E. coli gibi geleneksel konakçı hücreler ile karşılaştırıldığında farklı intraselüler ortama sahip olması beklenir.
• Bu yüzden en uygun ekspresyon koşullarına ve en verimli konakçı olma özelliğine sahip aktinomisetleri taramak için konak-vektör sistemlerini geliştirmek gerekmektedir.
NANOTEKNOLOJİDE AKTİNOMİSETLER • Nanoteknoloji, 1 – 100 nanometre aralığında küçük yapıları ve bo- yutları ele alır. Nanoteknoloji, nanometre boyutundaki biçim ve bo- yutları kontrol ederek yapıların ve araçların tasarımı, özelliği, üreti-mi ve uygulaması olara k da isimlendirilir. • Nanoteknolojideki araştırma alanı;
Fizik Mikrobiyoloji Kimya Biyokimya Materyal bilimi Moleküler biyoloji
• Nanopartiküllerin bilimsel olarak adlandırılması, Michael Faraday’ ın (183 1) altının yakut kırmızısı kolloidlerini araştırdığı ve rengin metal partikülle rinin küçük boyutlarından dolayı olduğunu bildirdiği çalışma ile yapılmıştır.
• Günümüzde, sentez protokolünde toksik kimyasalların kullanılmadığı çevresel olarak yararlı nanopartikül sentezini geliştirmek için artan bir ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, nanopartiküllerin sentezi ve birleştirilmesi alanındaki araştırmacılar esinlenmek için biyolojik sistemlere odaklanmış durumdadırlar. • Bu yüzden biyolojik sistemlerin kullanımı, nanopartiküllerin sentezi için yeni bir metod olarak ortaya çıkmış durumdadır. Bakteri, aktinomiset, mantar ve algleri içeren mikroorganizmaların farklı boyut ve şekillerde nanopartiküller sentezledikleri bildirilmiştir.
• Toksik metallerin iyileştirilmesi gibi birçok biyoteknolojik uygulamada bakteri ve maya gibi mikroorganizmaları kullanmasına rağmen, şimdilerde bilim adamları olası çevre dostu nanofaktörlerle ilgi li aktinomisetleri incelemektedir. • Tablo 5.’da bazı mikroorganizmaların ürettiği nanopartiküller gösterilmektedir.
Tablo 5. Bazı mikroorganizmaların ürettiği nanopartiküller
• Aktinomisetler ve özellikle ekstremofilik aktinomisetler altın ve gümüş nanopartiküllerinin potansiyel üreticileri olarak tanımlanmıştır. • 50 ºC sıcaklıkta ve pH 9’da optimum bir büyümeye sahip alkalotermofilik aktinomiset olan Thermomonospora sp.’nın altın nanopartiküllerini sentezlediği bildirilmiştir. • Alkalotermofilik aktinomiset olan Thermomonospora sp. tarafından altının ekstraselüler sentezinin aksine, daha konsantre altın partikülleri sentezleyen Rhodococcus sp. de ise altın sentezi hücre duvarı üzerinden ziyade sitoplazmik membran üzerinde gerçekleşir.
• Nanoteknolojide mevcut kimyasal metodlar yerine mikroorganizmalar kullanılarak metal nanopartiküllerinin sentezi uygulanabilir bir alternatife dönüştürülebilirse, o zaman üretilen partiküllerin boyutu ve yayılımı üzerinde büyük bir kontrol kurulabilir. Bu; mantar, bakteri ve şimdilerde de aktinomisetlerin farklı türlerinin taranmasındaki amaçlardan biridir. Hedeflenen bu amaç aktinomisetler de büyük oranda başarılmıştır. • Bu boyut ve yayılganlık kontrolü mantarlar ile kıyaslandığında aktino -misetler tarafından salgılanan çok miktarda proteinin/enzimin bir sonucu olabilir. Ayrıca sentez koşullarının da tamamen farklı olduğu not edilmelidir.
• Aktinomisetlerdeki nanopartiküllerin sentezinde ekstrem biyolojik koşulların kullanımının boyut ve yayılım kontrolünde yardımcı bir faktör olabileceği düşünülmektedir. • Özellikle sekonder metabolitler ve nanopartikül araştırmasında aktinomisetlerin biyoürünleri için yapılan araştırmalar ve yeni aktinomiset taramaları başlangıç evresindedir. • Bu yüzden, özellikle ekstrem ekosistemde aktinomisetlerin taramaları ve araştırmaları yapılarak nanoteknoloji alanında ki potansiyelle ri de kanıtlanması gerekmektedir.
GELECEK BEKLENTİLER • Aktinomisetler, kültüre edilebilen üyeleri arasında hem kültürlenmesi nispeten daha kolay hem de antibiyotik keşifinde öneme sahip olmasından dolayı önemli bir prokaryotik gruptur. • Tüm Streptomycetes antibiyotiklerinin sadece %1-3 ü keşfedilmiş olmasına rağmen, geriye kalan %99-97’lik kısmı bulmak için; modern teknolojilerle yüksek verimlilikli tarama kombinasyonuna nadir ve yavaş gelişen aktinomisetleri zenginleştirmek için metodlara büyük bir mikrobiyal koleksiyona Streptomyces’lerde kültürleme girişimleri ve kombinasyonel biyosenteze
• Baltz (2006), topraktan elde edilen aktinomisetlerin 1/1012 den daha az olduğunu düşünmektedir. • Aktinomiset sekonder metabolitlerinin keşfi rakipsizdir ve tıbbi önemi eşsizdir. • Yapısal ve fonksiyonel olarak farklı biyoaktif bileşenler antibakteriyel, antifungal, antiparazitik, antiviral ve antitümör aktivitesine sahip metabolitler özellikle prokaryotların bu grubundan izole edilmiştir.
• Son zamanlarda, karasal kaynaklardan elde edilen mevcut aktinomiset cinslerinden yeni bileşiklerin keşif oranı azalmıştır. Bu yüzden, keşfedilmemiş habitatlardan elde edilecek yeni türlerin yeni antibiyotik ve diğer yüksek değerli metabolit kaynağı olarak düşünülmesi önemlidir. • Son olarak, aktinomisetlerin; gelecekteki tıbbi, tarımsal ve endüstriyel olarak ilaç yapımı ile tasarımında ve ilaç vb. diğer türevlerin üretimi için önde gelen bileşiklerin eldesinde çok büyük bir öneme sahip olacağı tartışılmazıdır.
FARKLI LOKALİTELERDEN ELDE EDİLEN ÖRNEKLERDEN AKTİNOMİSET İZOLASYONU VE MOLEKÜLER TİPLENDİRMESİ
Amaç Farklı morfolojik özellik gösterme ve antimikrobiyal etki özellikleri ne göre 16S rRNA gen bölgesi analizi yapılarak olası yeni tür olabilecek adaylarının belirlenmesi Yeni tür olabilecek adayların tür tanımlama çalışması çerçevesinde ileriki analizlerinin yapılması Organizmanın varsa ürettiği metabolit/metabolitlerinin saflaştırılması ve analizleri
Materyal Metod • Çalışılması istenilen lokaliteden elde edilen örnekler ilk aşamada oda ısısında iyice kuruyana kadar bekletilir ve sonra steril havanlarda ezilerek elekten geçirilip 100°C de kuru ısıya tabi tutulur.
Dilüsyon Plaka Yöntemi
Sükroz Santrifügasyon Yöntemi • Bu yöntemin amacı; aktinomisetler tarafından oluşturulan farklı boyutlardaki sporların birbirlerinden ayrılması ile bir faz oluşturulması dır. Oluşturulan bu fazlardan steril pipetlerle alınan örneklerin ekimlerinden farklı aktinomiset gruplarının izolasyonunu sağlamaktır.
İzolatların Seçimi ve Saflaştırılması • Seçilimde makroskobik ve mikroskobik araştırmalar yapılarak farklı morfolojik özellik gösteren koloniler belirlenir. Belirlenen yeni tür olabilecek koloniler antibiyotik ilaveli seçici besiyerinde yoğun ekim olarak saf bir şekilde üretilir.
İzolatların Stoklanması • İnkübasyon sonunda her bir suş %20’lik gliserol içeren otoklavlanabilir 1,5 ml’lik vidalı kapaklı tüpler içerisine steril bir öze veya kürdan yardımı ile transfer edilerek -18C de stoklanır.
Genomik DNA İzolasyonu • Pithcer ve ark. (1989) tarafından tanımlanan “Guanidin Tiyosiyona t DNA İzolasyon” metodu modifiye edilerek test organizmalarının DNA izolasyonu için kullanılmaktadır.
16S rRNA'nın PCR Amplifikasyonu • Test organizmalarından saf olarak elde edilmiş DNA örneklerinin 16S rRNA genini kodlayan DNA bölgesinin amplifikasyonu için evrensel primerler (27f ve 1525r; Lane, 1991) kullanılır.
Filogenetik Analiz • Amplifikasyonu gerçekleştirilen ürünlerin sekanslanması sonucunda elde edilen DNA dizileri MEGA 6.1. gibi paket programlar sayesinde karşılaştırmalı analizlere tabi tutularak filogenetik ağaçlar oluşturulmaktadır.
S. anthocyanicus NBRC 14892T (AB184631) S. violaceoruber NBRC 12826T (AB184174) S. coelescens DSM 40421T (AF503496) S. tricolor NBRC 15461T (AB184687) 84
S. coelicoflavus NBRC 15399T (AB184650) S. violaceolatus DSM 40438T (AF503497) Streptomyces sp. (HCI 50-1)
66
S. humiferus DSM 43030T (AF503491) S. rubrogriseus LMG 20318T (AJ781373) S. lienomycini LMG 20091T (AJ781353) S. marokkonensis Ap1T (AJ965470) S. thinghirensis DSM 41919T (FM202482)
51
S. althioticus NRRL B-3981T (AY999791) S. flaveolus NBRC 3715T (AB184786) S. violaceorubidus LMG 20319T (AJ781374) S. 51
tendae ATCC 19812T (D63873)
53 S. 59
tritolerans DAS 165T (DQ345779)
S. coeruleorubidus ISP 5145T (AJ306622) S. 78 99 S.
pactum NBRC 13433T (AB184398) olivaceus NBRC 12805T (AB249920)
S. malachitospinus NBRC 101004T (AB249954) S. geysiriensis NBRC 15413T (AB184661)
Paraoerskovia marina DSM 21750T (AB695379 0.01
• Yapılan analizler sonucunda olası yeni bir tür olarak belirlenen organizmanın tanımlanması çalışmaları polifazik taksonomik metodlarla gerçekleştirilir. • Polifazik taksonomik metodlar; nümerik taksonomi (C,N kaynağı gibi besinsel testler ile biyokimyasal, sıcaklık, pH ve tuz tölerans testleri gibi farklı fenetik testleri içerir), kemotaksonomi (hücre duvar analizleri, menaquinone, polar lipid, yağ asidi gibi analizler hücresel analizler) ve genomik taksonomi ( MLSA, DNA-DNA homolojisi gibi moleküler teknikler) tekniklerini içermektedir. Bir organizmayı tür olarak tanımlayabilmek için belirtilen tüm polifazik metodların uygulanması gerekmektedir.
