Doseamento das proteínas pelo método do bioreto (Relatório)
#2439 – David Quintino #2466 – Filipe Sampaio #2587 – André Chucha
Resumo Este trabalho teve como objectivo a determinação da quantidade de proteína numa amostra. Para tal foi utilizada a espectroscopia de absorção molecular, mais concretamente concretamente o método do Biureto. Esta reacção ocorre com todos os compostos que contenham duas ou mais ligações peptídicas, formando-se um complexo azul púrpura. A concentração da proteína na amostra foi calculada a partir de uma curva de calibração feita usando uma solução proteica padrão, a solução de albumina de soro bovino (BSA) 2mg/mL. A equação da recta de calibração é y = 0,0371x + 0,0159 e através dela e dos valores da absorvência para o tubo 6 e 7, podemos concluir que as suas concentrações são: 21,17 mg/mL e 8,277 mg/mL, respectivamente. respectivamente. Em relação à Lei de Lambert – Beer podemos concluir que existem desvios, pois o coeficiente de correlação (r) = 0,9878, quando deveria ser 0,9999.
Introdução Teórica Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ ou emissão de radiação electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultra violeta e o infra vermelho. A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultra violeta ao infra vermelho no espectro da radiação electromagnética. O espectro do visível está contido essencialmente essencialmente na zona entre 400 e 800 µm. Um espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos comprimentos de onda. Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotómetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida em cada comprimento de onda. O conjunto das absorvências dos vários comprimentos de onda para um composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância, a espectrofotometria espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro espectro como também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a concentração da substância. Existe então princípios de absorção da luz: A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada; A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através das amostras.
Juntando estes princípios temos a lei de Lambert – Beer:
Abs = E. b. c
A absorvência da luz a cada comprimento comprimento de onda
é directamente
proporcional à concentração da solução contida na couvette. Esta linearidade deixa de ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nestes casos diluir previamente a amostra a medir. Com alguma frequência é necessário quantificar substâncias em misturas complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda. Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos, o composto a quantificar é posto em contacto com um reagente específico, de modo a desenvolver uma cor cuja intensidade é directamente proporcional à concentração da substância na mistura original. Por exemplo, para quantificar proteínas numa solução pura pode medir-se a absorvência a 280µm, 280µ m, sendo esta proporcional à concentração de proteína. Mas se quisermos saber a concentração de proteína num extracto impuro, este método já não pode ser utilizado, porque outras substâncias, como por exemplo os ácidos nucleícos, também absorvem a este comprimento de onda. Neste caso, podemos utilizar, por exemplo, o reagente de Biureto, que reage de modo quantitativo com as proteínas, originando um complexo violeta, que absorve fortemente a radiação a 540µm. Para quantificar espectrofotométricamente uma substância é necessário saber o valor de . Para isso é necessário preparar uma série de soluções do composto a quantificar, de concentração conhecida, fazê-las contactar com o reagente e medir as absorvências absorvências ao comprimento comprimento de onda adequado. Assim, podemos fazer corresponder uma absorvência medida, a uma concentração de substância na solução a analisar, obtendo deste modo, uma curva de calibração. Na determinação da concentração de proteínas, objectivo deste trabalho, há que ter em conta que nem todas as proteínas exibem o mesmo comportamento comportamento perante os ensaios espectrofotométricos de doseamento.
As
características
físico-químicas
das
proteínas
exploradas
em
análises
quantitativas são:
1. As absorvências das cadeias laterais de resíduos aromáticos a 280µm; 2. Absorvências específicas de grupos prostéticos de proteínas, por exemplo do grupo heme a 415µm; 3. A ligação peptídica que forma um complexo violeta com Cu
2+
na reacção do
Biureto; 4. As cadeias laterais de Tyr e Trp, que reagem com agentes oxidantes no método de Lowry; 5. A ligação de corantes a regiões hidrofóbicas, hidrofóbicas, como no método de Bradford; 6. As cadeias laterais de Lys e His e o terminal amina que reagem com a ninidrina.
Cada método é aplicável a gamas restritas de concentrações de proteínas e apresentam sensibilidades e interferências a considerar, quando as amostras contém outras moléculas para além das proteínas. Entre as vantagens da utilização destes métodos, figuram a facilidade de execução e o facto de substâncias específicas poderem ser doseadas em soluções que contenham misturas de várias biomoléculas sem etapas prévias de purificação. A reacção do Biureto (método utilizado nesta experiência) é um dos métodos mais rápidos e mais utilizados no doseamento de proteínas. Foi um dos primeiros ensaios colorimétricos a ser desenvolvido. A natureza do complexo colorido não é conhecida em detalhe, no entanto pensa-se que está envolvida a formação de um complexo de cobre em soluções muito alcalinas com uma ligação peptídica das proteínas e também com alguns resíduos de tirosina, formando um complexo de cor violeta.
Procedimento Experimental Material e reagentes: o o o
o o o o o o
Solução padrão de albumina de soro de bovino (BSA) 2 mg/mL Solução de proteína de concentração desconhecida desconhecida Reagente do Biureto: dissolveu-se 6g de tartarato de sódio e potássio tetrahidratado tetrahidratado em 500mL de água destilada. Adicionou-se lentamente 1,5g de sulfato de cobre pentahidratado e 300 mL de hidróxido de sódio10% (m/v). diluiu-se para 1 L. Espectrofotómetro Cuvettes para medição no visível (plástico ou vidro) Tubos de ensaio Copo de precipitação precipitação Pipetas Balança analítica
Procedimento: 1. Preparou-se o branco e os tubos para a curva de calibração de acordo com o quadro: Tubo mL BSA mL H2O
1
2
3
4
5
0,3 1,2
0,5 1,0
0,7 0,8
1,0 0,5
1,2 0,3
Tubo branco: 1,5 mL de H2O
2. Diluiu-se o extracto proteico preparado preparado na aula anterior 1/50 (0,1 mL de extracto + 4,9 mL de H2O) e prepararam-se os tubos com a amostra de proteína: Tubo 6: 0,2 mL de amostra + 1,3 mL de H2O Tubo 7: 1,0 mL de amostra + 0,5 mL de H2O 3. Adicionou-se 1,5 mL de reagente do Biureto a todos os tubos e agitou-se. 4. Deixou-se em banho-maria a 37ºC durante 15 minutos; 5. Leu-se a absorvência 540µm (calibrou-se o espectrofotómetro espectrofotómetro com o branco)
Apresentação e tratamento de resultados Cálculos: o
o
o
o
o
Tubo 1 2 mg ------------ 1 mL x ------------ 0,3 mL
x = 0,6 mg
2 mg ------------ 1 mL x ------------ 0,5 mL
x = 1,0 mg
2 mg ----------- 1mL x ----------- 0,7 mL
x = 1,4 mg
2 mg ------------ 1mL x ------------ 1,0 mL
x = 2,0 mg
2 mg ----------- 1mL x ----------- 1,2 mL
x = 2,4 mg
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
TUBOS
Abs 540µm
mL de BSA
1
0,051
0,3
0,6
2
0,097
0,5
1,0
3
0,118
0,7
1,4
4
0,170
1,0
2,0
5
0,200
1,2
2,4
mg de proteína
Gráfico: 0,25 y = 0,0371x + 0,0159 0,2
2
R = 0,9878
m n 0,15 0 4 5 . S B 0,1 A
Series1 Linear (Series1)
0,05 0 0,6
1,0
1,4
2,0
2,4
mg de proteína
Cálculos: (amostras) A partir da equação da recta: y = 0,0371 x + 0,0159 o
Tubo 6 0,173 = 0,0371 x + 0,0159 x = 4,234 mg
Concentração do tubo 6 = (4,234 x 1) / 0,2 = 21,17 mg/mL o
Tubo 7 0,323 = 0,0371 x + 0,0159 x = 8,277 mg
Concentração do tubo 7 = (8,277 x 1) / 1 = 8,277 mg/mL
TUBOS
Amostra (mL)
Abs. 540µm
Resultados do cálculo da massa (mg) apartir da equação da recta
6
0,2
0,173
4,234
7
1,0
0,323
8,277
Concentrações (mg/mL)
21,17 8,277
Discussão e conclusões De acordo com os nossos princípios teóricos concluímos que existem desvios à Lei de Lambert–Beer pois o coeficiente de correlação é igual a 0,9878, 0, 9878, quando deveria tomar valores próximos de 0,9999. Podemos também concluir que este é um método muito sensível, daí a existência de desvios, que podem ter ocorrido devido a pouco cuidado na execução e utilização da curva de calibração. No entanto, todos os objectivos foram alcançados, dentro dos quais se destaca a obtenção, através da recta de calibração y = 0,0371 x + 0,0159, do valor da concentração da amostra amostra contida no tubo 6 e no tubo 7. Este trabalho permitiu também a familiarização com a técnica da espectrofotometria e um dos métodos colorimétricos mais utilizados – o método do Biureto.
Bibliografia www.google.com Protocolo experimental experimental dado na aula Sebenta teórica de Bioquímica
