MAKALAH BIOPROSES
NAMA
NIM
M. Tarmidzi
070405012
Alfi Syahrin Triargo
080405014
Juliananta Sitepu
080405060
Ardiano Pangaribuan
100405022
Rap Leanon
100405024
Deril Clinton
100405026
Dwimas Anggoro
100405028
Rajian Sobri Rezki
100405030
DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2012
1. Pendahuluan
Pada saat ini, kemajuan peradaban tidak dapat dipisahkan dari mikroorganisme. Penggunaan dan keterlibatan mikroorganisme dalam kehidupan sehari-hari telah menembus berbagai sektor, dan tanpa disadari kita hidup berdampingan dengan mikroorganisme, baik secara alami maupun penggunaan mikroorganisme dalam industri. Mikroba tersebar secara luas di alam. Dalam kehidupannya mereka tidak membatasi diri tinggal di suatu tempat. Sepanjang tempat tersebut memenuhi persyaratan, maka mikroba tersebut akan hidup. Penelitian dan informasi mengenai mikroorganisme amatlah diperlukan, karena : a. Perannya yang universal b. Tersebar secara luas di alam c. Memiliki
karakteristik
yang
relatif
sederhana
dan
mudah
diaplikasikan untuk kelangsungan hidup masyarakat. Oleh karena kehidupan kita tak dapat dipisahkan dari mikroorganisme, maka pembelajaran mengenai mikroorganisme harus dilakukan secara intens dan berkelanjutan, salah satunya dengan penulisan makalah ini. 2. Definisi Mikroorganisme
Mikroorganisme merupakan jasad hidup yang mempunyai ukuran sangat kecil.
Setiap
sel
tunggal
mikroorganisme
memiliki
kemampuan
untuk
melangsungkan aktivitas kehidupan antara lain dapat mengalami pertumbuhan, menghasilkan energi dan bereproduksi dengan sendirinya. Mikroorganisme memiliki fleksibilitas metabolisme yang tinggi karena mikroorganisme ini harus mempunyai kemampuan menyesuaikan menyesuaikan diri yang besar sehingga apabila ada interaksi yang tinggi dengan lingkungan menyebabkan terjadinya konversi zat yang tinggi pula. Akan tetapi karena ukurannya yang kecil, maka tidak ada tempat untuk menyimpan enzimenzim yang telah dihasilkan. Dengan demikian enzim yang tidak diperlukan tidak akan disimpan dalam bentuk persediaan.enzim-enzim tertentu yang diperlukan untuk pengolahan bahan makanan akan diproduksi bila bahan makanan tersebut sudah ada.
Mikroorganisme ini juga tidak memerlukan tempat yang besar, mudah ditumbuhkan dalam media buatan, dan tingkat pembiakannya relative cepat. Oleh karena aktivitasnya tersebut, maka setiap mikroorganisme memiliki peranan dalam kehidupan, baik yang merugikan maupun yang menguntungkan. Sekilas, makna praktis dari mikroorganisme disadari tertutama karena kerugian yang ditimbulkannya pada manusia, hewan, dan tumbuh-tumbuhan. Misalnya dalam bidang mikrobiologi kedokteran dan fitopatologi banyak ditemukan mikroorganisme yang patogen yang menyebabkan penyakit dengan sifat-sifat kehidupannya yang khas. Walaupun di bidang lain mikroorganisme tampil merugikan, tetapi perannya yang menguntungkan jauh lebih menonjol. 3. Definisi Pertumbuhan
Pertumbuhan merupakan proses bertambahnya ukuran atau subtansi atau masa zat suatu organisme, misalnya kita makhluk makro ini dikatakan tumbuh ketika bertambah tinggi, bertambah besar atau bertambah berat. Pada organisme bersel satu pertumbuhan lebih diartikan sebagai pertumbuhan koloni, yaitu pertambahan jumlah koloni, ukuran koloni yang semakin besar atau subtansi atau massa mikroba dalam koloni tersebut semakin banyak, pertumbuhan pada mikroba diartikan sebagai pertambahan jumlah sel mikroba itu sendiri. Dalam pertumbuhannya setiap makhluk hidup membutuhkan nutrisi yang mencukupi serta kondisi lingkungan yang mendukung demi proses pertumbuhan tersebut, termasuk juga bakteri. Menurut Darkuni (2001) pertumbuhan bakteri pada umumnya akan dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Pengaruh faktor ini akan memberikan gambaran yang memperlihatkan peningkatan jumlah sel yang berbeda dan pada akhirnya memberikan gambaran pula terhadap kurva pertumbuhannya. Sedangkan menururt Tarigan (1988) kebutuhan mikroorganisme untuk pertumbuhan dapat dibedakan menjadi dua kategori, yaitu: kebutuhan fisik dan kebutuhan kimiawi atau kemis. Aspek-aspek fisik dapat mencakup suhu, pH dan tekanan osmotik. Sedangkan kebutuhan kemis meliputi air, sumber karbon, nitrogen oksigen, mineral-mineral dan faktor penumbuh.
Pertumbuhan secara umum dapat didefinisikan sebagai pertambahan secara teratur semua komponen di dalam sel hidup. Dengan demikian, pertambahan ukuran yang diakibatkan oleh bertambahnya air atau karena penumpukan lemak, bukan merupakan pertumbuhan. Pada organisme multiseluler (banyak sel), yang dimaksud pertumbuhan adalah peningkatan jumlah sel per organisme, dimana ukuran sel juga menjadi lebih besar. Pada organisme uniseluler (bersel satu/tunggal) pertumbuhan adalah penambahan jumlah sel, yang juga berarti pertambahan jumlah organisme yang membentuk populasi atau suatu biakan. 4. Pola Pertumbuhan Sel untuk Kultur Curah
Bila suatu mikroorganisme ditempatkan dalam suatu medium yang mengandung nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroorganisme di dalam suatu sistem tertutup (batch system) maka pola pertumbuhannya mengikuti fase-fase tertentu, yaitu : 1. Fase Lag (Adaptasi) Pada tahap ini terjadi reorganisasi konstitue molekul mikro dan makro. Melibatkan sintesis komponen struktur sel atau respirasi enzim. Fase lag bias panjang atau singkat, tergantung kondisi lingkungan dan
sifat organism. 2. Fase Log (Eksponensial) Suatu periode kesetimbangan ( steady growth) dengan nilai µ ( growth
rate) konstan. Karakteristik fase ini adalah garis lurus bila diplot pada kurva semilog (ln
x vs waktu). Keadaan akan konstan sampai terjadi perubahan komposisi medium yang
cukup signifikan. 3. Fase Stasioner Saat nutrisi berkurang
atau adanya akumulasi beberapa produk yang
dapat bertindak sebagai inhibitor, µ akan berkurang. Pada fase ini µ sampai mendekati 0. Untuk banyak mikroorganisme, metabolit sekunder baru diproduksi pada
fase ini, dapat disimpan di dalam sel atau disekresi keluar sel.
4. Fase Kriptik (Cryptic Growth) Adakalanya setelah fase stasioner beberapa saat, terjadi lisis pada sel yang
telah mati, menyebabkan keluarnya produk/isi sel. Isi sel yang lisis dapat menjadi nutirisi bagi sebagian sel yang masih
hidup sehingga memungkinkan terjadinya pertumbuhan baru ( cryptic growth).
Gambar Kurva Pertumbuhan Mikoorganisme
a. Kinetika Pertumbuhan Mikroorganisme dX/dt = µ . X dX/x = µ. Dt µ=dX/dt . 1/X
∫
∫
sehingga ln X 2 /X1 = µ (t2-t1) bila X2 = 2X1 (doubling), maka (t2-t1) = ln 2/ µ = 0,683/ µ Sehingga kurva ln X vs t akan linear dengan angka kemiringan µ.
1. Syarat-syarat mikroba tumbuh Mikroba dalam berkembang biak (tumbuh) mempunyai syarat-syarat tertentu, yaitu diantaranya : 1. Ada sel hidup 2. Ada sumber energi 3. Ada nutrisi dan faktor pertumbuhan 4. Tidak ada inhibitor atau toksin. 5. Kondisi fisiko-kimia yang mendukung.
2. Sistem Kultur Untuk Pertumbuhan dan Produksi Menggunakan Mikroorganisme Sistem batch (kultur curah) Sistem feed-batch (kultur curah umpan) Sistem continuous (kultur sinambung)
P-1
V-1
E-1
Kultur Batch
P-1
P-1
V-1
V-1
E-1
Feed Batch
E-1
Continuous
Sistem batch (kultur curah)
Pada sistem ini, tempat mikroba dan nutrisi yang akan dibiakkan ditempatkan di dalam satu tangki reaktor berpengaduk, dimana merupakan cara yang paling sederhana dalam mengembangbiakkan mikroba sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika. Selama kultivasi kondisi pengembangbiakan dalam keadaan unsteadystate. Dari aspek rekayasa proses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil. Kelemahan produk dapat menghambat pertumbuhan yang terakumulasi
Pada kultur curah fermentasi dapat digunakan untuk biomassa, produksi metabolit primer dan metabolit sekunder. Pada produksi biomassa kondisi kultur menunjang laju pertumbuhan tercepat sehingga diperoleh populasi sel maksimum, sedangkan pada produksi metabolit primer kondisi kultur dapat memperpanjang fase eksponensial dan diikuti oleh pengeluaran produk, dan untuk produkusi metabolit sekunder kondisi kultur dapat mempersingkat fase eksponensial dan memperpanjang fase produksi serta kondisi penurunan laju pertumbuhan pada fase log mengalami pembentukan metabolit sekunder lebih awal.
Pola Pertumbuhan Seluler dan Yield Produk
Gambar Pola Pertumbuhan dan Yield Produk
A = Growth-associated product formation B = Mixed-growth-associated product formation C = Non growth-associated product formation 1) Pembentukan metabolit primer :
……. (1)
Dimana : p = konsentrasi produk qp = laju pembentukan produk spesifik 2) Pembentukan produk berhubungan dengan produksi biomassa dp/dx =Yp/x ……………………………………………………… (2) Dimana : Yp/x = Y produk yang berhubungan dengan biomassa (g produk g -1
biomassa h )
-1
Dari persamaan 1) dan 2) diperoleh : dx/dt . dp/dx = Y p/x . dx/dt sedangkan dx/dt = µx, maka : dp/dt = Y p/x . µx dp/dt = qp . x sehingga : qp . x = Yp/x . µx qp = Yp/x . ……………………………………………………. (3) Pada persamaan 3) :
Bila pembentukan produk berasosiasi dengan pertumbuhan maka q p meningkat sejalan dengan µ, produktivitas kultur curah paling besar pada saat µ max, peningkatan produk dicapai dengan peningkatan µ dan biomassa.
Bila
produk
tidak
berasosiasi
dengan
pertumbuhan
maka,
pembentukan produk (produktivitas) tidak berhubungan dengan konsentrasi biomassa, dan metabolit sekunder hanya diproduksi pada kondisi fisiologis tertentu yang umumnya keterbatasan substrat tertentu. Contoh kultur curah dalam proses kultivasi/fermentasi adalah pada fermentasi asam laktat oleh bakteri asam laktat (homofermentatif dan heterofermentatif). Homofermentatif adalah bakteri asam laktat yang hanya memproduksi asam laktat saja, sedangkan heterofermentatif adalah bakteri asam laktat yang memproduksi asam laktat, asetat, etanol dan karbondioksida dan ini tidak cocok dalam aplikasi industri. BAL Homofermentatif
Gambar Pembentukan Asam Laktat Oleh BAL Homofermentatif
Adapun bakteri jenis ini berupa lactobacillus, lactococcus dan beberapa jenis streptococcus. Jenis produk yang dihasilkan dalam industri yaitu pada fermentasi
susu dan beberapa turunan fermentasi susu seperti yogurt, buttermilk, sour cream, keju dan sebagainya. BAL Heterofermentatif
Gambar Pembentukan Asam Laktat Oleh BAL heterofermentatif Reaksi pada Fermentasi dan Pemanenan Asam Laktat a. Fermentasi dan Netralisasi 2+ C6H12o6 + Ca(OH)2 (2CH3CHOHCOO ) Ca + 2H2O b. Hidrolisis Oleh H2SO4 2+ (2CH3CHOHCOO ) Ca + H2SO4
2CH3CHOHCOOH + CaSO4
c. Esterifikasi 2CH3CHOHCOOH + CH3OH CH3CHOHCOOCH3 + 2H2O d. Hidrolisaa Oleh H2O CH3CHOHCOOCH3 + 2H2O 2CH3CHOHCOOH +CH3OH
3. Penentuan Konsentrasi Sel dan Jumlah Sel
a. Lama Pertumbuhan Selang waktu yang dibutuhkan bagi sel untuk membelah diri menjadi dua kali lipat dinamakan waktu generasi (generation time) atau waktu berganda (doubling time). Tidak semua spesies mikroba mempunyai waktu generasi yang sama. Waktu generasi untuk spesies bakteri tertentu juga tidak sama pada segala kondisi. Waktu generasi amat bergantung pada cukup atau tidaknya kondisi fisik. Waktu generasi bakteri dapat ditentukan dengan pemeriksaan mikroskopik. Tetapi metode yang lebih praktis dan umum adalah menginokulasi suatu medium dengan bakteri dengan jumlah yang diketahui, membiarkan mereka tumbuh pada kondisi optimum, dan menentukan populasi pada interval waktu tertentu secara berkala. Data yang dibutuhkan untuk menghitung waktu generasi adalah jumlah bakteri yang ada pada mula-mula, yakni di dalam inokulum, jumlah bakteri yang ada pada akhir waktu tetentu, dan interval waktu. b. Kurva Pertumbuhan Suatu mikroorganisme, misalnya bakteri yang sudah cukup tua kemudian diambil sedikit bakteri untuk ditanam pada medium cair yang cocok. Dalam waktu yang sama bila kita ambil 1 kolong kawat inokulasi kemudian disebarkan pada agar-agar lempengan dalam cawan Petri. Jumlah koloni yang kemudian tumbuh di cawan dapat kita hitung. Biasanya jumlah menjadi sangat besar, maka kita ambil logaritmanya saja. Bila logaritma jumlah bakteri ditulis dalam ordinat, waktu dituliskan dalam absis, maka diperoleh Kurva Jasad Renik
c. Pengukuran Pertumbuhan Ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk mengukur atau menghitung jumlah jasad renik, yaitu : a. Pertumbuhan Jumlah Sel
Hitungan mikroskopik Hitungan cawan MPN (Most Probable Number)
b. Perhitungan Massa Sel secara Langsung
c.
Cara volumetric
Cara gravimetric
Turbidimetri (kekeruhan)
Perhitungan Massa Sel secara Tidak Langsung
Analisis komponen sel (protein, AND, ATP, dan sebagainya)
Analisis produk katabolisme (metabolit primer, metabolit
sekunder, panas)
Analisis konsumsi nutrien (karbon, nitrogen, oksigen, asam
amino, mineral, dan sebagainya)
Perhitungan massa sel secara langsung maupun secara tidak langsung jarang digunakan dalam menguji jumlah mikroba pada bahan, tetapi sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel selama proses fermentasi. Dalam perhitungan massa sel secara langsung, jumlah mikroorganisme dapat dihitung jika medium pertumbuhannya tidak menggangu pengukuran. Metode volumetrik dan gravimetrik, pengukuran volume dan berat sel dilakukan terlebih dahulu dengan menyaring mikroorganisme tersebut. Oleh karena itu, bila substrat tempat tumbuhnya banyak mengandung padatan, misalnya bahan pangan, sel mikroorganisme tidak dapat diukur dengan metode volumetrik maupun dengan turbidimetri. Perhitungan massa sel secara tidak langsung sering digunakan dalam mengamati
pertumbuhan sel selama proses fermentasi, dimana komponen substrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur. d. Beberapa Metode Penentuan Jumlah sel Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis mikrometer
yaitu
mikrometer
okuler
dan
mikrometer
objektif.
Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop, sedangkan mikrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui, menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. 1 skala micrometer objektif = 0,01 mm / 10 µ m. Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi.
Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa 1 skala okuler.
Cara Kerja :
Kalibrasi :
Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung lensa okuler.
Tentukan perbesaran yang digunakan, (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar perbesaran dari skala mikrometer objektif.
Setelah fokus didapat, kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer objektif dan okuler.
Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit lagi.
Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.
cara kalibrasi
cara mengukur mikroba
Penentuan ukuran mikroba
Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda.
Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan
Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama.
Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler.
Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama. Tabung lensa okuler dapat diputar dan dicari posisi yang pas.
Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya :
Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya : x skala okuler X hasil kalibrasi y skala okuler X hasil kalibrasi misal : 5 X 1,54 = 7,7 µm 2 X 1,54 = 3,08 µm
Penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung)
1. Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasark an hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut:
Satu koloni dihitung 1 koloni.
Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah
luas cawan) tidak dihitung.
Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 -6 dengan metode Spread Plate dan Pour Plate.
Spread plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 0,1 ml Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml SP = 0,1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml = 5x108 CFU’s / ml Pour plate : koloni = 50 = 50 x 106 CFU’s / 1 ml Fp = 1/10 -6 = 50 000 000 CFU’s / 0,1 ml SP = 1 ml = 5x107 CFU’s / ml
Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat khusus berdasarkan statistik untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan. Perhitungan mengacu kepada standar atau peraturan yang telah ditentukan. Syaratsyaratnya sebagai berikut :
Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni. > 300 = TNTC (Too Numerous To Count ) atau TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). < 30 = TFTC ( Too Few To Count ).
Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial), 4
4
missal 2,3 X 10 , bukan 2,34 X 10 . pembulatan keatas dilakukan pada angka 4
seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima, missal 2,35 X 10 menjadi 4
4
2,4 X 10 , atau 2,34 X 10 menjadi 2,3 X 10
4
Bila diperoleh perhitungan kurang dari 30 dari semua pengenceran, maka hanya dari pengenceran terendah yang dilaporkan.
Bila diperoleh perhitungan >300 dari semua pengenceran, maka hanya dari pengenceran tertinggi yang dilaporkan. Misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada ¼ bagian (transek) cawan kemudian hasilnya dikalikan empat. Hasil tersebut dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya faktor pengenceran, tetapi jumlah sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
Bila ada 2 cawan, masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni pengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2, maka jumlah yang dilaporkan adalah nilai rata-rata. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2 maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran terendah.
Apabila setiap pengenceran digunakan dua cawan Petri (duplo), maka jumlah angka yang digunakan adalah data dari kedua cawan, tidak boleh diambil salah satu, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat diantara 30-300. Data yang dilaporkan adalah rata-rata dari kedua cawan duplo tersebut.
bagan untuk mempersingkat syarat SPC
Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak. Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Pola transek dapat dibuat bervariasi, tergantung kebutuhan. Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Colony Counter . Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count:
Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab, maserasi dan rinse) (jika perlu).
Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama, selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu.
Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. Jika secara Spread Plate, dapat digunakan batang L atau glass beads.
Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam.
Setelah tumbuh, koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan.
2. Most Probable Number (MPN) Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS ( Lactose Broth Double Stregth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan
pada media LBSS ( Lactose Broth Single Stregth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr. Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.
Cara kerja : 1. Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar). 2. Kocok botol yang berisi air sampel. 3. Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3 tabung LBDS), secara aseptis. 4. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung LBSS), secara aseptis. 5. Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung LBSS), secara aseptis. 6. Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam. 7. Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.
Misal : didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.
Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung)
Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer . Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri
yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.
2
Luas kotak sedang = p x l = 0,2 x 0,2 = 0,04 mm jadi misalnya diperoleh: Volume kotak sedang : 20 sel dalam satu kotak sedang = 0,04 mm2 x 0,1 mm maka jumlah sel keseluruhan : = 0,004 mm3 = 20 x (1/4) x 106 Karena 1 ml = 1cm2 = 5 x 106 sel/ml Maka : = 0,004 mm3 = 0,000004 cm3 = 4x10-6 ml
Sel/ml : = jumlah sel/4x10-6 ml = (jumlah sel/4) x 106 = jumlah sel x (¼) x 106 = jumlah sel x 2,5 x 105 Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2,5 x 105 Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk kotak kecil : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106
Cara kerja (digunakan kotak sedang) : 1. Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu. 2. Keringkan dengan tissue. 3. Letakkan cover glass di atas alat hitung. 4. Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas. 5. Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas). 6. Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10. 7. Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10. 8. Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik). Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.
6. Faktor Yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroorganisme
Telah diketahui bahwa aktivitas hidup suatu organisme sangat dipengaruhi oleh lingkungannya. Perubahan yang terjadi pada lingkungan turut mempengaruhi perubahan organisme, baik secara morfologi maupun sifat-sifat fisiologisnya. Bakteri memiliki kemampuan yang cukup besar terhadap perubahan lingkungan dan dapat beradaptasi secara cepat terhadap perubahan lingkungan yang baru tersebut. Semua proses pertumbuhan tergantung pada reaksi kimia dan karena laju reaksi-reaksi ini dipengaruhi oleh suhu, maka pola pertumbuhan bakteri dapat sangat dipengaruhi oleh suhu. Suhu juga mempengaruhi laju pertumbuhan dan jumlah total pertumbuhan organism. Faktor-faktor lingkungan yang dapat mempengaruhi mikroba dibagi atas faktorfaktor abiotik dan faktor-faktor biotik. a. Faktor abiotik 1. Faktor-faktor alam, terdiri atas : a. Pengaruh temperatur Temperatur merupakan salah satu faktor yang penting di dalam kehidupan. Beberapa jenis mikroba dapat hidup pada daerah yang bertemperatur yang luas , sedangkan jenis yang lainnya pada daerah yang terbatas. Pada umumnya batas o
o
daerah temperatur bagi kehidupan mikroba terletak antara 0 C sampai 90 C dan kita kenal adanya temperatur minimum, optimum, dan maksimum. Daya tahan mikroba terhadap temperatur tidak sama untuk tiap-tiap spesies. b. Pengaruh kebasahan dan kekeringan. Mikroba mempunyai nilai kelembaban optimum. Bakteri sebenarnya adalah makhluk yang suka akan keadaan basah, bahkan dapat hidup di air. Tanah yang cukup basah sangat baik untuk kehidupan bakteri. Tetapi banyak bakteri mati, jika udara kering. Keadaan kering menyebabkan proses pengeringan protoplasma yang berakibat berhentinya metabolisme. c. Pengaruh perubahan nilai osmotik Pada umumnya larutan hipertonik menghambat pertumbuhan mikroba karena dapat menyebabkan plasmolisis. Medium yang paling cocok bagi kehidupan mikroba adalah medium yang isotonik terhadap isi sel mikroba.
d. Pengaruh sinar Pada umumnya mikroorganisme rusak akibat cahaya, terutama pada mikroba yang tidak mempunyai pigmen fotosintetik. Sinar dengan gelombang pendek akan berpengaruh buruk terhadap mikroba. Sedangkan sinar dengan gelombang panjang mempunyai daya fotodinamik dan daya biosfik. 2. Faktor-faktor kimia Di alam jarang mikroorganisme yang mati akibat terkena zat-zat kimia. Zatzat
yang
hanya
menghambat
pembiakan
mikroorganisme
dengan
tiada
membunuhnya dinamakan zat antiseptik dan desinfektan. Antiseptik dan desinfektan merupakan zat yang sama tetapi berbeda dalam cara penggunannya.
b. Faktor biotik Di alam bebas banyak mikroba dari berbagai genus maupun dari berbagai species hidup berkumpul di dalam suatu medium yang sama. Tidak mudah meneliti pengaruh atau hubungan hidup antar species, namun pengaruh timbal balik niscya ada. Hal ini karena pada suatu species yang mencerna zat makanan menimbulkan perubahan kimia dalam komposisi substrat. Pengaruh kemungkinan baik, buruk, mungkin juga pengaruh tersebut tidak memiliki efek sama sekali. Hubungan antar species termasuk pada mikroba dapat dibedakan yaitu, netralisme, kompetisi, antagonisme, komensalisme, mutualisme, sinergisme, parasitisme, predatorisme, dan sintropisme. Suhu adalah faktor terpenting yang mempengaruhi perumbuhan mikroorganisme dan
kelangsungan
hidupnya.
Suhu
yang
rendah
umumnya
memperlambat
metabolisme seluler, sedangkan suhu yang lebih tinggi meningkatkan taraf kegiatan sel. Tetapi tiap organisme memiliki batas suhu terendah dan batas suhu tertinggi, serta suhu optimum bagi organisme tersebut. pH juga mempengaruhi pertumbuhan bakteri, kebanyakan bakteri yang patogen mempunyai suhu pH optimum 7,2 – 7,6. Meskipun suatu pembenihan pada suatu permulaannya baik pada suatu bakteri, tetapi pertumbuhan bakteri selanjutnya juga akan terbatas karena produk metabolisme bakteri itu sendiri. Hal utama yang
dijumpai pada bakteri yang sifat fermentasinya akan menghasilkan sejumlah besar asam-asam organik yang bersifat menghambat. Pengaruh logam berat terhadap pertumbuhan bakteri adalah dimana ion-ion dari beberapa logam berat dalam konsentrasi yang rendah berdaya meracuni bakteri. Daya ini dapat dilihat apabila sekeping tembaga kemudian dituang ke dalam medium NB yang sebelumnya telah diinokulasikan dengan bakteri, dimana setelah 48 jam akan terlihat pertumbuhan bakteri yang tidak merata, zona dimana titik-titik koloni tidak tumbuh disebut dengan zona oligodinamik atau zona bening. Bakteri merupakan organisme kosmopolit yang dapat kita jumpai di berbagai tempat dengan berbagai kondisi di alam ini. Mulai dari padang pasir yang panas, sampai kutub utara yang beku kita masih dapat menjumpai bakteri. Namun bakteri juga memiliki batasan suhu tertentu dia bisa tetap bertahan hidup, ada tiga jenis bakteri berdasarkan tingkat toleransinya terhadap suhu lingkungannya: 1. Mikroorganisme psikrofil yaitu mikroorganisme yang suka hidup pada suhu o
yang dingin, dapat tumbuh paling baik pada suhu optimum dibawah 20 C. 2. Mikroorganisme mesofil, yaitu mikroorganisme yang dapat hidup secara o
maksimal pada suhu yang sedang, mempunyai suhu optimum di antara 20 C sampai o
50 C 3. Mikroorganisme termofil, yaitu mikroorganisme yang tumbuh optimal atau suka pada suhu yang tinggi, mikroorganisme ini sering tumbuh pada suhu diatas o
40 C, bakteri jenis ini dapat hidup di tempat-tempat yang panas bahkan di sumbersumber mata air panas bakteri tipe ini dapat ditemukan, pada tahun 1967 di yellow o
stone park ditemukan bakteri yang hidup dalam sumber air panas bersuhu 93-94 C Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat dikelompokan menjadi 3 yaitu : 0
1. psikrofilik (0-20 C) 0
2. mesofilik Mesofilik (20-30 C) 0
3. termofilik (50-100 C). Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan kehidupan mikroorganisme, pengaruh suhu berhubungan dengan aktivitas enzim. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim.
Pengaruh temperatur pada bakteri tidak sama bagi tiap-tiap species. Ada species yang mati setelah mengalami pemanasan beberapa menit di dalam cairan medium o
pada temperatur 60 C, sebaliknya bakteri yang berbentuk spora sperti genus Basillus o
dan Clostridium tetap dapat hidup setelah dipanasi dengan uap 100 C atau lebih selam kira-kira setengah jam. Untuk sterilisasi, maka syarat untuk membunuh setiap o
species bakteri adalah pemanasan selama 15 menit dengan temperatur 121 C di dalam otoklaf. Pertumbuhan mikroba dalam suatu medium mengalami fase-fase yang berbeda, yang berturut-turut disebut dengan fase l ag, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian. Pada fase kematian eksponensial tidak diamati pada kondisi umum pertumbuhan kultur bakteri, kecuali bila kematian dipercepat dengan penambahan zat kimia toksik, panas atau radiasi. Dalam pertumbuhannya setiap makhluk hidup membutuhkan nutrisi yang mencukupi serta kondisi lingkungan yang mendukung demi proses pertumbuhan tersebut, termasuk juga bakteri. Pertumbuhan bakteri pada umumnya akan dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Pengaruh faktor ini akan memberikan gambaran yang memperlihatkan peningkatan jumlah sel yang berbedadan
pada
akhirnya
memberikan
gambaran
pula
terhadap
kurva
pertumbuhannya.
7. HEAT GENERATIO
Secara umum, jamur bertumbuh pada kisaran suhu 20-55°C tetapi suhu optimum untuk pertumbuhan, dan untuk pembentukan produk, bisa berbeda. Kontrol suhu merupakan isu utama. Pertama, karena tingkat panas yang tinggi dari metabolisme aerobik dihasilkan oleh pertumbuhan mikroba. Tingkat maksimum dan rata-rata generasi panas oleh Aspergillus oryzae dalam campuran kedelai / gandum untuk produksi kecap diukur pada 130 kJ/kg h dan 53 kJ/kg h, dan tingkat maksimum dan rata-rata generasi panas untuk A.niger pada pati / beras campuran dedak untuk produksi asam sitrat diukur pada 71 kJ/kg h dan 33 kJ/kg h. Jamur menembus massa substrat sepenuhnya dan tumbuh dari dan ke dalam partikel yang membentuk substrat. Namun, substrat tidak memiliki konduktor panas yang baik, dan arus konveksi untuk mengambil panas mungkin lemah, juga tidak dapat digunakan pendingin karena dapat dengan kaldu berbasis budidaya. Akibatnya, gradien suhu
dapat terbentuk di substrat padat dan beberapa bagian dari massa substrat dapat mencapai suhu yang cukup untuk membunuh jamur apapun dan menghentikan pembentukan produk. Panas yang berlebihan juga dapat mengeringkan substrat dengan hilangnya kelembaban melalui penguapan dan ini adalah salah satu cara kunci dimana suhu bisa dikurangi. Kontrol yang dilakukan dalam sistem tradisional adalah dengan menggunakan nampan dangkal sehingga panas yang dihasilkan hanya memiliki sebuah bagian yang singkat untuk perjalanan yang akan hilang ke lingkungan. Dalam sistem modern, udara lembab mekanis didorong didorong melalui bahan padat tetapi tingkat aliran udara merupakan parameter penting yang mempengaruhi suhu, aktivitas air dan kadar oksigen. Pada kenyataannya, seluruh proses tidak mudah untuk sepenuhnya dikendalikan. HEAT GENERATIO II
Sekitar 40% sampai 50% dari energi yang tersimpan dalam karbon dan sumber energi diubah menjadi energi biologis (ATP) selama metabolisme aerobik, dan seluruh sisa energi dilepaskan sebagai panas Untuk sel aktif tumbuh, kebutuhan pemeliharaan rendah, dan evolusi panas secara langsung berkaitan dengan pertumbuhan. Panas dari pembakaran substrat adalah sama dengan jumlah dari panas metabolik dan panas pembakaran dari bahan selular:
Di mana ΔHS adalah panas pembakaran substrat (kJ / g substrat ), ΔHC adalah panas pembakaran dari sel, dan Y H adalah panas metabolik berevolusi per gram massa sel yang dihasilkan (kJ / g sel).
Persamaan dapat disusun kembali untuk menghasilkan:
ΔHS dan ΔHC dapat ditentukan dari pembakaran substrat dan sel. Nilai ΔHC khas untuk sel-sel bakteri adalah 20-25 kJ / g sel. Nilai khas Y H adalah: glukosa, 0,4 g / kkal; malat, 0,3 g / kkal; asetat, 0,21 g / kkal; etanol, 0,18 g / kkal; metanol, 0,12 g / kkal, dan metana, 0,061 g / kkal. Jelas, tingkat oksidasi substrat memiliki efek yang kuat pada jumlah panas yang dilepaskan. Tingkat total evolusi panas dalam fermentasi batch adalah:
Di mana V L adalah volume cair (l) Dalam fermentasi aerobik, tingkat evolusi panas metabolik secara kasar dapat dikorelasikan dengan tingkat penyerapan oksigen:
Di mana QGRis dalam kkal / jam, dan QO2 is di mM of O2/hH net
Panas metabolik dilepaskan selama fermentasi dapat dihapus oleh sirkulasi air pendingin melalui koil pendingin dalam fermentor, atau jaket pendingin sekitarnya fermentor tersebut. Kontrol suhu adalah keterbatasan kritis pada desain reaktor. Kemampuan untuk memperkirakan pemindahan panas sangat penting untuk desain r eaktor yang tepat.
