LAPORAN BIOKIMIA (KI-3061) PRAKTIKUM V UJI AKTIVITAS AKTIVITAS SUKSINA S UKSINAT T DEHIDROGENASE DEHIDROG ENASE
Tanggal Praktikum: 22 April 2016
Disusun oleh : Joshua Andrian K 10414026 Kelompok 1
Asisten: Hanny eptiani 10412024
PROGRAM STUDI MIKROBIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI TEKNOLO GI HAYA HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2016
I. TUJUAN PERCOBAAN Tu!uan dari per"o#aan kali ini adalah se#agai #erikut : 1$ %enentukan akti&itas ke"epatan en'im suksinat dehidrogenase 2$ %enentukan pengaruh malonat( suksinat( dan )a*a'ida terhadap akti&itas en'im suksinat dehidrogenase +pada Ta#ung 2(4(,(6( dan -.$
II. TEORI DASAR
/n'im merupakan protein yang mampu mengkatalis reaksi*reaksi #iologis dengan mempengaruhi la!u reaksi saaat kesetim#angan telah di"apai( namun en'im tidak mengganggu kesetim#angan totdal dari reaksi yang ter!adi$ Pada dasarnya en'im mampu menemukan !alur lain yang mem#utuhkan energi le#ih sedikit untuk pem#entukan keadaan transisi maupun pem#entukan produk( sehingga reaksi akan #er!alan le#ih "epat di#anding reaksi tanpa pengkatalis en'im$ alah satu !enis en'im adalah en'im dehidrogenase yang mampu mengkatalis suatu reaksi yang meli#atkan ele"tron$ Prosesnya adalah reaksi transer elektron( termasuk ion hidrogen( dari su#strat menu!u senyaa akseptor seperti )AD ( )ADP( dan 3AD$
alah satu "ontoh dari en'im dehidrogenase adalah en'im suksinat
dehydrogenase yang terdapat dalam mitokondria suatu sel$ /n'im ini akan mem#entuk ikatan yang sulit terputus dengan akseptor elektronnya yakni #erupa protein 3la&in yakni 3AD $ /n'im ini #erperan dalam pengu#ahan su#strat suksinat men!adi umarat dalam siklus Kre# atau siklus TA saat proses respirasi aero#ik$ elain itu( en'im ini merupakan penyusun utama Kompleks 55 pada proses istem Transer /lektron pada respirasi aero#ik di mitokondria$ Kompleks 55 ini akan mengu#ah u#iuinon men!adi u#iionol dengan menam#ahkan elektron padanya$ Dalam ker!anya( en'im dapat diganggu oleh suatu senyaa lain sehingga ker!anya #isa terham#at #ahkan dapat mengaki#atkan kerusakan struktur yang dikenal se#agai inhi#itor en'im$ 5nhi#itor ini mekanisme ker!anya #eragam$ Jika didasarkan pada kesta#ilannya( di#agi men!adi dua yakni inhi#itor reversible dan irreversible$ Per#edaan yang mendasar dari keduanya adalah kesta#ilan inhi#itor menempel pada sisis akti en'im$ 7ntuk inhi#itor reversible mampu terlepas dari sisi akti en'im( sedangkan inhi#itor irreversible tidak mampu terlepas$ Kelompok
inhi#itor lainnya dikelompokkan #erdasarkan pengaruhnya terhadap reaksi en'im yang terdiri dari inhi#itor kompetiti( non*kompetiti( dan un*kompetiti$ 5nhi#itor kompetiti akan menempel pada sisi akti en'im sehingga su#strat tidak #isa menempel dan reaksinya tidak ter!adi$ edangkan inhi#itor non*kompetiti akan menempel pada en'im ataupun kompleks en'im sehingga mengu#ah struktur en'im( namun su#strat masih punya kemungkinan untuk menempel pada sisi aktinya dan reaksinya ter!adi$ 7ntuk inhi#itor un*kompetiti menempel pada kompleks en'im dan tidak dapat menempel pada en'im #e#as yang menye#a#kan kompleks en'im men!adi tidak akti$ III. DATA PENGAMATAN
Ta#ung 1 2 4 , 6 -
8uer 7!i +ml. 4 $, $4 2$< 2$$4 $4
A'ida +ml.
D5P +ml.
%alonat +ml.
uksinat +ml.
0$, 0$, 0$, 0$, 0$, * 0$,
* 0$, * 0$, 0$, 0$, 0$,
* * * * 0$2 * *
0$, 0$, 0$, 0$, 0$, 0$, *
uspensi %itokondria +ml. 0$0 0$0 0$6 0$6 0$6 0$6 0$6
IV. PENGOLAHAN DATA
∆A#sor#ansi Ta#ung
∆1 (t5t10)
∆2 (t10t15)
∆3 (t15t20)
T2
0,016
0,026
0,029
T4 T5
0,004 0,002
0,007 0,004
0,008 0,005
T6
-0,007
0,004
0,004
T7
0,006
0,008
0,011
A#sor#ansi pada t +menit. ,9
109
1,9
209
8lanko 0$,8lanko 0$21; 0$211 0$204 0$2-
8lanko 0$41 8lanko 0$214 0$20< 0$211 0$21
8lanko 0$1 8lanko 0$211 0$200$2 0$22<
8lanko 0$2; 8lanko 0$21 0$206 0$2 0$226
T2
! $ a # & % $ # "
0.36 0.36 0.35 0.35 0.34 0.34 0.33 0.33 0.32 0.32 0.31
f(x) = - 0.01x + 0.36 R² = 0.92
5
10
15
20
waktu (me!t)
T4
! $ a # & % $ # "
0.22 0.22 0.22 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.2
f(x) = - 0x + 0.22 R² = 0.94
5
10
15
waktu (me!t)
20
T5
! $ a # & % $ # "
0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 0.2 0.2
f(x) = - 0x + 0.21 R² = 0.98
5
10
15
20
15
20
waktu (me!t)
T6
! $ a # & % $ # "
0.21 0.21 0.21 0.21 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.19
f(x) = - 0x + 0.21 R² = 0.33
5
10
waktu (me!t)
T7
! $ a # & % $ # "
0.24 0.24 0.23 0.23 0.23 0.23 0.23 0.22 0.22 0.22
f(x) = - 0x + 0.24 R² = 0.95
5
10
15
20
'aktu (me!t)
T!"#$ 2 4 , 6 -
L%" A&' (A*+#,) K++#$# *0$00
V. PEMBAHASAN /n'im dehidroghenase en'im yang mengkatalisis reaksi transer hidrogen dari
suatu su#strat kepada senyaa akseptor seperti )AD( )ADP atau la&oprotein$ uksinat dehidrogenase adalah en'im yang mengkatalisis reaksi pengu#ahan suksinat men!adi umarat dalam siklus asam sitrat pada respirasi aero#ik +3rais(1<-2.$ elain #erperan pada siklus asam sitrat dan osorilasi oksidati( se#agai senyaa supresor tumor dan pengham#at pem#entukan => pada molekul 3AD +tyrer(2000.$ Pada per"o#aan ini dilakukan u!i akti&itas e'im suksinat dehidrogenase$ /n'im ini #erada pada organel sel yakni mitokondria yang merupakan organel untuk repirasi sel$ /n'im ini dapat diisolasi dari makhluk hidup yang memiliki mitokondria$ e"ara umum( untuk ke#utuhan praktikum ini( en'im diisolasi dengan "ara mengisolasi
mitokondria pada sel tum#uhan yakni #unga kol$ 5solasi mitokondria #ertu!uan untuk mengekstrak suspensi en'im suksinat dehidrogenase yang akan diu!i$ elain mudah untuk didapatkan( #unga kol mengandung mitokondria relati le#ih #anyak di#anding lainnya sehingga diharapkan en'im yang didapat !uga le#ih #anyak$ ?angkah pertama yang dilakukan adalah menggerus 20 gram kem#ang kol diatas mortar dingin dengan 40 m? mannitol grinding #uer$ 8uer ini #erungsi untuk men!aga agar kondisi mitokondria tetap ter!aga dan tu!uan penggerusan adalah untuk melisiskan sel$ ?alu ke dalam larutan ditam#ah , gram pasir dingin untuk mem#antu meme"ah dinding sel$ Kemudian suspensi diperas meleati kain dan di sentriugasi selama , menit 1000g pada suhu 4o$ Dekantasi supernatant hasil sentriugasi ke dalam ta#ung yang #ersih dan dingin$ ?alu di sentriugasi kem#ali selama menit 10000g$ /n'im ini didapat #erupa suspense dari pellet hasil isolasi yang disimpan pada suhu 0*4 0 dalam #uer u!i mannitol yang mengandung 0$ % mannitol( 0$006 % KH 2P>4( 0$014 % K 2HP>4( 0$01 % Kl( 0$00, % %gl 2( dengan pH -$2 yang #erguna untuk men!aga kualitas mitokondria sekaligus en'im yang dikandungnya agar tidak rusak +3essenden(1<<2.$ Prinsip dari per"o#aan ini adalah mengamati peru#ahan suksinat men!adi umarat dengan mengukur a#sor#ansi senyaa penerima ele"tron #uatan yang tereduksi men!adi senyaa tak #erarna$ emakin rendah a#sor#ansi yang didapat( maka akti&itas en'im suksinat dehydrogenase semakin tinggi$ enyaa penerima ele"tron #uatan yang digunakan adalah 2(6*dikloroenolindolenol atau dikenal dengan nama D5P yang memiliki arna #iru ketika teroksidasi$ Ketika D5P tereduksi dengan "ara menangkap elektron #e#as( maka men!adi senyaa tak #erarna$ /lektron ini #erasal dari 3ADH2 yang teroksidasi menghasilkan ele"tron #e#as yang seharusnya ditangkap oleh oksigen se#agai akseptor ele"tron terakhir$ Agar ele"tron dapat ditangkap oleh D5P dan tidak ditangkap oleh oksigen( maka ditam#ahkan natrium a'ida atau kalium sianida yang mampu menghalangi transer elektron pada mitokondria$ Dalam mengamati akti&itas en'im siksinat dehidrogenase ini( di#uat #er#agai perlakuan dengan mem&ariasikan konsentrasi en'im yang ditam#ahkan( ke#eradaan su#strat #erupa suksinat( serta ke#eradaan inhi#itor kompetiti #erupa malonat$ %alonat ini merupakan senyaa yang memiliki struktur mirip dengan struktur suksinat$ ehingga dapat dikatakan #aha malonat merupakan senyaa analog dari suksinat$ %alonat ini dapat menginhi#isi akti&itas en'im karena mampu mengikat sisi akti dari en'im sehingga su#strat tidak dapat menempel dan reaksi yang
sesungguhnya tidak dapat #erlangsung$ Karena itu lah( malonat ini digolongkan se#agai inhi#itor kompetiti dari en'im suksinat dehidrogenase$ Dari per"o#aan yang dilakukan( didapat data yang dapat dilihat pada #agian Data Pengamatan dan Pengolahan Data di atas$ Ta#ung 1 dan digunakan se#agai #lanko$ 7ntuk ta#ung 1 digunakan se#agai #lanko ta#ung 2( sementara untuk ta#ung digunakan untuk #lanko ta#ung 4(,(6(dan -$ 7ntuk data ta#ung 2 seharusnya didapat la!u aal reaksi yang #ernilai negati yang seharusnya menun!ukkan tidak ter!adi penurunan konsentrasi D5P atau D5P tidak tereduksi karena tidak dilakukan penam#ahan en'im pada Ta#ung 2$ )amun la!u untuk ta#ung dua #ernilai negati dan ter!adi penurunan a#sor#ansi D5P pada aktu ,9( 109( 1,9 dan 20 menit$ Hal ini mungkin ter!adi dikarenakan terdapat kontaminasi suatu 'at yang dapat menye#a#kan D5P tereduksi$ 7ntuk Ta#ung 4 yang #erisi #uer u!i( )a*a'ida( suksinat( suspensi mitokondria dan D5P seharusnya ter!adi penurunan a#sor#ansi dan la!u aal reaksi$ ?a!u aal reaksi menun!ukkan hasil negati yang menyatakan ter!adinya penurunan konsentrasi D5P #erarna #iru men!adi senyaa tak #erarna karena tereduksi$ Hal ini sesuai
dengan hipotesis$ 7ntuk ta#ung , yang komposisinya serupa dengan
ta#ung 4( namun ditam#ah malonat se#agai inhi#itor yang seharusnya ter!adi penurunan a#sor#ansi D5P dan penurunan la!u aal reaksi namun le#ih ke"il penurunannya di#andingkan ta#ung 4$ Hasil menun!ukkan #aha pada ta#ung , ter!adi penurunan la!u aal reaksi namun nilai la!u aal reaksi ta#ung 4 le#ih #esar$ Hal ini sesuai dengan hipotesis karena malonat #erperan se#agai inhi#itor kompetiti suksinat yang akan mengham#at ker!a en'im suksinat dehidrogenase$ pada Ta#ung 6 le#ih tinggi di#anding Ta#ung 4 yang menun!ukkan data yang #er#anding lurus dengan !umlah en'im yang ditam#ahkan$ Dapat disimpulkan #aha semakin tinggi konsentrasi en'im yang ditam#ahkan( maka la!u aal reaksi en'im akan semakin "epat pula$ 7ntuk ta#ung 6 komposisinya #erisi #uer u!i( suspensi mitokondria( suksinat dan D5P seharusnya ter!adi penurunan a#sor#ansi dan la!u aal reaksi( seharusnya tidak adanya a'ida !uga mampu mempengaruhi la!u aal reaksi en'im karena penangkapan ele"tron oleh oksigen tidak terham#at dan menye#a#kan la!u tereduksinya D5P #erlangsung le#ih lam#at
masih terdapat kemungkinan D5P
tereduksi oleh ele"tron lainnya karena en'im masih akti dan tidak terinhi#isi oleh inhi#itor kompetiti sehingga penurunan a#sor#ansi dapat #ersiat luktuati$ Hal ini ter#ukti ter!adi kenaikkan a#sor#ansi pada t , @ t10$ )amun la!u aal tetap #ernilai negati( namun le#ih ke"il dari la!u aal reaksi ta#ung 4$
7ntuk ta#ung -
komposisinya #erisi #uer u!i( )a*a'ida( suspensi mitokondria dan D5P seharusnya tidak ter!adi penurunan a#sor#ansi dan la!u aal reaksi karena su#strat tidak di#erikan$ Hasil yang didapat adalah ter!adi peru#ahan a#sor#ansi yang "enderung turun dan mem#uktikan adanya akti&itas reaksi$ Hal ini tidak sesuai dengan hipotesis karena seharusnya tidak ada perunahan a#sor#ansi karena tidak ada suksinat se#agai su#strat$ Hal ini ter!adi karena aktor suspensi mitokondria yang telah mengandung 3ADH2 sehingga #isa mereduksi D5P +tyrer( 2000.$ 8erasarkan data yang didapatkan tidak dapat ditentukan apakah graik ke"epatan en'im terhadap konsentrasi en'im sesuai dan konsisten dengan persamaan %i"haelis*%enten karena konsentrasi su#strat yang digunakan sama yaitu se#esar 0(, m?$ emakin tinggi konsentrasi en'im yang ditam#ahkan maka akti&itas en'im akan semakin tinggi !ika dilihat dari la!u reaksi aal$ Ke#eradaan malonat se#agai inhi#itor kompetiti en'im suksinat dehydrogenase akan menurunkan akti&itas en'im dalam mengkalatis reaksi pengu#ahan suksinat men!adi umarat$ Ketidakhadiran suksinat se#agai su#strat en'im suksinat dehidrogenase dan natrium a'ida se#agai pengham#at penangkapan ele"tron oleh oksigen( akan menurunkan akti&itas en'im !ika ditin!au dari la!u reaksi aal$
VI. KESIMPULAN Dari per"o#aan yang telah dilakukan( dapat disimpulkan
1$ Pengukuran ke"epatan aal akti&itas en'im se#esar *0$00<-At untuk ta#ung 2( *0$002-At untuk ta#ung 4( *0$001-At untuk ta#ung ,( *0$002At untuk ta#ung 6 dan *0$00,At untuk ta#ung -$ 2$ emakin tinggi konsentrasi en'im yang ditam#ahkan maka akti&itas en'im akan semakin tinggi !ika dilihat dari la!u reaksi aal$ $ Ke#eradaan malonat se#agai inhi#itor kompetiti en'im suksinat dehydrogenase akan menurunkan akti&itas en'im dalam mengkalatis reaksi pengu#ahan suksinat men!adi umarat$ 4$ Ketidakhadiran suksinat se#agai su#strat en'im suksinat dehydrogenase dan natrium a'ida se#agai pengham#at penangkapan ele"tron oleh oksigen( akan menurunkan akti&itas en'im !ika ditin!au dari la!u reaksi aal$
VII. DA/TAR PUSTAKA
3rais( 3$ 1<-2$ Practical Biochemistry on Introductory Course$ ?ondon : 8uer Borths
3essenden$ 1<<2 $ Kimia Organik edisi 3$ Jakarta : /rlangga
)elson( D$ ?$ dan oC( %$ %$ 2004$ Lehninger Principles of Biochemistry, ourth edition$ 5nggris : B$ H$ 3reeman$ Halaman -,*11,$
tyrer(2000$ Biochemistry$ )e ork : B$H 3reeman and ompany
