1. Definisi Spektrofotometri fluoresensi merupakan suatu prosedur yang menggunakan pengukuran intensitas cahaya fluoresensi yang dipancarkan oleh zat uji dibandingkan dengan yang dipancarkan oleh suatu baku tertentu. Pada umumnya cahaya yang diemisikan oleh larutan berfluoresensi mempunyai intensitas maksimum pada panjang gelombang yang biasanya 20 nm hingga 30 nm lebih panjang dari panjang gelombang radiasi eksitasi (gelombang pita penyerapan sinar yang membangkitkannya).
Fluoresensi adalah gejala dari suatu molekul setelah radiasi cahaya, melepas kembali radiasi dengan panjang gelombang yang lebih panjang
Fluoresensi adalah terpancarnya sinar oleh suatu zat yang telah menyerap sinar atau radiasi elektromagnet lain. Fluoresensi adalah bentuk dari luminesensi. Dalam beberapa hal, sinar yang dipancarkan memiliki gelombang lebih panjang dan energi lebih rendah daripada radiasi yang diserap.
2. Prinsip Cahaya yang diemisikan terjadi karena proses absorbsi cahaya oleh atom yang mengakibatkan mengakibatkan keadaan atom tereksitasi. Keadaan atom yang tereksitasi akan kembali ke keadaan semula dengan melepaskan energi yang berupa cahaya (de-eksitasi). Emisi cahaya oleh larutan berfluoresensi mempunyai intensitas maksimum pada panjang gelombang yang biasanya 20 nm hingga 30 nm lebih panjang dari panjang gelombang radiasi eksitasi.
3. Intensitas Radiasi Fluoresensi Dipengaruhi Oleh: 1. Suhu dan viskositas Intensitas fluoresensi akan turun dengan naiknya suhu. Suhu yang lebih tinggi tabrakan-tabrakan antar molekul atau tabrakan molekul dengan pelarut menjadi lebih sering, sehingga kelebihan energi molekul yang tereksitasi dilepaskan ke molekul pelarut. 2. Pelarut Intensitas radiasi fluoresensi makin besar jika pelarut makin polar sedangkan intensitasnya akan menurun jika pelarut mengandung logamlogam berat terlarut.
3. Derajat Keasaman (pH) pH berpengaruh pada kesetimbangan larutan menjadi bentuk terionisasi atau tidak terionisasi. Bentuk terionisasi akan menurunkan fluoresensi. 4. Oksigen terlarut Quenching adalah deaktivasi non-radiatif dari molekul tereksitasi oleh suatu zat sehingga menurunkan intensitas fluoresensi. Oksigen yang terlarut dalam pelarut yang digunakan merupakan quencher yang serius bagi beberapa senyawa hidrokarbon aromatik yang berfluoresensi. Karena terjadinya oksidasi senyawa oleh pengaruh cahaya ( fotochemically induced oxidation). 5. Energi eksitasi dan metode iluminasi Energi eksitasi (intensitas, kemonokromatisan dan λ) yang digunakan mempengaruhi intensitas fluoresensi. Makin kecil intensitas cahaya makin lemah fluoresensi. 6. Fotodekomposisi Makin kuat serapan radiasi pada λ eksitasi yang dipilih, makin besar kesalahan karena penguraian oleh radiasi. 7. Struktur Molekul Senyawa-senyawa yang mempunyai ikan rangkap terkonjugasi ini merupakan calon senyawa yang mampu berfluoresensi. Modifikasi struktur terhadap senyawa-senyawa ini dapat menurunkan atau meningkatkan intensitas fluoresensi, tergantung pada sifat dan letak gugus substituen. 8. Konsentrasi/ kadar larutan Perlu larutan 10-100 kali lebih encer dari spektrofotometri.
4. Instrumentasi Pengukuran intensitas fluoresensi dapat dilakukan dengan suatu fluorometer filter sederhana. Instrument yang dipergunakan bermacam-macam mulai dari yang paling sederhana (filter
fluorometer) sampai ke yang sangat kompleks yaitu spektrofotometer. Komponen-komponen utama dari masing-masing instrument ini yaitu : 1. Sumber energi eksitasi Banyak terdapat sumber radiasi. Lampu merkuri relatif stabil dan memancarkan energi terutama pada panjang gelombang diskret. Lampu tungsten memberikan energi kontinyu di daerah tampak. Lampu pancar xenon bertekanan tinggi seringkali digunakan pada spektrofluorometer karena alat tersebut merupakan sebuah sumber dengan intensitas tinggi yang menghasilkan energi kontinyu dengan intensitas tinggi dari ultraviolet sampai inframerah. Pada filter fluorometer ( fluorimeter ) digunakan lampu uap raksa sebagai sumber cahaya dan energi eksitasi diseleksi dengan filter. Pada spektrofluorimeter biasanya digunakan lampu Xenon ( 150 W ) yang memancarkan spectrum kontinu dengan panjang gelombang 200-800nm. Energi eksitasi diseleksi dengan monokromator eksitasi ( grating ). 2. Kuvet untuk sample Sel spesimen yang digunakan dalam pengukuran fluoresensi dapat berupa tabung bulat atau sel empat persegi panjang (kuvet), sama seperti yang digunakan pada spektrofotometri resapan, terkecuali keempat sisi vertikalnya dipoles. Ukuran spesimen uji yang sesuai adalah 2 ml sampai 3 ml, tetapi beberapa instrumen dapat disesuaikan dengan sel-sel kecil yang memuat 100 μl hingga 300 μl atau dengan pipa kapiler yang hanya memerlukan jumlah spesimen yang kecil. Spektrofotometer harus dioperasikan sesuai dengan petunjuk pabrik pembuat. Bila panjang gelombang untuk eksitasi di atas 320nm dapat digunakan kuvet dari gelas, akan tetapi untuk eksitasi pada panjang gelombang yang lebih pendek digunakan kuvet dari silika. Kuvet tidak boleh berfluoresensi dan tidak boleh tergores karena dapat menghamburkan. 3. Detektor Pada umumnya fluorometer menggunakan tabung-tabung fotomultiplier sebagai detektor, banyak tipe dari jenis tersebut yang tersedia dan masing-masing mempunyai ciri khusus yang berkenaan dengan daerah spektral dengan kepekaan maksimum, menguntungkan dan derau secara elektrik. Arus foto diperbesar dan dibaca pada sebuah meter atau perekam. Seperti pada spektrofotometri, detektor yang biasa digunakan adalah ‘fotomultiplier tube’ atau ‘thermocouple’. Pada umumnya, detektor ditempatkan di atas sebuah poros yang 0
membuat sudut 90 dengan berkas eksitasi. Geometri sudut siku ini memungkinkan radiasi eksitasi menembus spesimen uji tanpa mengkontaminasi sinyal luaran yang diterima oleh detektor fluoresensi. Akan tetapi tidak dapat dihindarkan detektor menerima sejumlah radiasi eksitasi sebagai akibat sifat menghamburkan yang ada pada larutan itu sendiri atau jika adanya debu atau padatan lainnya. Untuk m enghindari hamburan ini maka digunakan instrument yang bernama filter. 4. Sepasang filter atau monokromator untuk menyeleksi panjang gelombang eksitasi dan emisi. Fluorometer Filter pertama hanya meneruskan cahaya ultraviolet dari sumber cahaya yaitu radiasi dengan panjang gelombang yang cocok untuk eksitasi specimen uji. Filter kedua meloloskan hanya panjang gelombang yang sesuai dengan fluoresensi maksimum dari zat yang diperiksa dan menahan setiap cahaya eksitasi yang terhambur. Jenis filter kedua ini biasanya yang menahan panjang gelombang pendek. Persoalan yang dihadapi pada pemilihan filter yaitu panjang gel ombang yang lebih panjang yang diteruskan oleh filter pertama juga lolos pada daerah panjang gelombang yang lebih pendek dari filter kedua, sehingga menghasilkan blangko yang tinggi. Disamping itu sukar untuk mendapatkan filter dengan panjang gelombang yang cocok dengan radiasi eksitasi karakteristik untuk sample. Spektrofluorimeter Ini menggunakan sepasang monokromator (grating) untuk menyeleksi radiasi eksitasi dan emisi yang lebih akurat (memberikan kepekaan yang tinggi) sehingga kesulitan-kesulitan
tersebut diatas dapat diatasi. Monokromator pertama mendispersikan cahaya dari sumber cahaya sehingga menghasilkan radiasi eksitasi yang monokromatis. Sample yang tereksitasi kemudian berfluoresensi sehingga merupakan sumber cahaya bagi monokromator kedua. Dengan alat ini dapat dibuat spekrum eksitasi maupun emisi.
a) Perbandingan intensitas fluoresensi spesimen uji dengan intensitas fluoresensi zat baku yang diperoleh pada pengaturan instrumen yang sama memberikan ukuran semi kuantitatif bagi kekuatan fluoresensi. Sering kali sebagai baku pembanding digunakan larutan quinin dalam asam sulfat 0,1 N yang dinyatakan kadarnya atau fluoresein dalam natrium hidroksida 0,1 N.
5. Analisis Kuantitatif Absorban Pada larutan dengan konsentrasi tinggi, sebagian besar cahaya diserap lapisan larutan yang paling dulu kontak dengan radiasi eksitasi, sehingga fluoresensi hanya terjadi pada bagian yang menyerap cahaya tersebut. Dengan demikian, pada analisis kuantitatif harus didunakan larutan yang encer (serapan tidak lebih dari 0,02) supaya dapat memenuhi persamaan fluoresensi: F = 2,3IoQabc atau F = kc Keterangan: F = fluoresensi k = konstan = 2,3Ioabc Io = intensitas sumber cahaya Q = efisiensi fluoresensi a = daya serap b = tebal larutan c = konsentrasi
Kelebihan fluorometer dan fosforimeter dalam analisis kuantitatif: - Metode ini selektif dan tidak terjadi interferensi spektral. Interferensi ini bila timbul dapat diatasi dengan pemilihan panjang gelombang yang tepat baik pada eksitasi maupun pemendarannya. - Metode ini sensitif. Pada fosforometer, resolusi waktunya cukup besar, karena panjangnya waktu hidup. Hal ini juga mengeliminasi penghamburan sampel. Tidak seperti fluorometer, fosforometer jarang digunakan dalam analisis kimia karena rumitnya peralatan. Untuk memperoleh hasil reprodusibel pada analisis fosforimeter, diperlukan pendinginan sampel dengan suatu campuran 5:2:2 dietileter, isopentana dan etanol, EPA.
6. Analisis kualitatif Koefisien dan panjang gelombang
7. Jenis senyawa yang dianalisis a) Molekul analit dapat menyerap cahaya dengan kuat sehingga analit harus mengandung gugus kromofor. Contohnya adalah senyawasenyawa aromatik, heterosiklik, dan sistem konjugasi.
Supaya suatu molekul berfluoresensi, maka molekul tersebut harus menyerap radiasi. Jika konsentrasi senyawa yanng menyerap radiasi tersebut sangat ti nggi, maka sinar yang mengenai sampel akan diabsorbsi oleh lapisan pertama larutan dan hanya sedikit radiasi yang diserap oleh oleh bagian lain sa mpel pada jarak yang lebih jauh. Karena hal ini tidak diinginkan, maka sampel harus dibuat dalam konsentrasi rendah untuk mencegah terjadinya penyerapan radiasi yang tidak seragam ini.
b) Struktur molekulnya planar dan rigid/ kaku.
Struktur molekul yang mempunyai ikatan rangkap mempunyai sifat fluoresensi karena strukturnya kaku dan plana EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada sistem dapatmenaikkan intensitas fluoresensi EWG (NO2, Br, I, CN, COOH) dapat menurunkan bahkan menghilangkan sifat fluoresensi Penambahan ikatan rangkap (aromatik polisiklik) dapat menaikkan fluoresensi
c) Transisi energi hingga ke tingkat kondisi eksitasi terendah pasangan elektron singlet adalah transisi π – π d) Molekul yang tereksitasi kembali ke kondisi dasar ( ground state ) dengan melepaskan energi radiatif (fluoresensi) dengan waktu relaksasi kurang dari 10-9 detik. Perlu diketahui bahwa kebanyakan zat kembali ke kondisi dasar (ground state ) dengan melepaskan panas (energi nonradiatif) sehingga tidak berfluoresensi.
8. Keunggulan Kepekaan yang baik karena : 1. Intensitas dapat diperbesar dengan menggunakan sumber eksitasi yang tepat 2. Detektor yang digunakan seperti tabung pergandaan foto sangat peka 3. Pengukuran energi emisi lebih tepat daripada energi terabsorbsi 4. Dapat mengukur sampai kadar 10-4 – 10-9 M 9. Kelemahan Penggunaan terbatas hanya untuk senyawa berfluoresensi
Intensitas fluoresensi dipengaruhi oleh intensitas sumber cahaya
Investasi mahal.
Spektroflurometri dapat digunakan untuk :
Analisa kualitatif , Perbandingan spectrum fluoresensi dapat membantu pengenalan senyawa. Analisa kuantitatif, Pengukuran dapat dilakukan pada kadar yang sangat rendah dengan ketepatan, keterulangan, dan kepekaan tinggi. Misalnya pengukuran kadar vitamin E. Bila panjang gelombang emisi dan eksitasi telah dipilih, makandapat dibuat hubungan antara intensitas fluoresensi dengan konsentrasi senyawa. Intensitas fluoresensi tergantung dari tingkat konsentrasi senyawa. Hubungan tersebut berupa garis lurus (linier) pada konsentrasi sangat rendah. Apabila kadarnya terlalu tinggi, larutan tersebut tidak l inier lagi karena akan menyerap sebagian sinar eksitasi.
MEKANISME !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Langkah pertama (i) adalah eksitasi, di mana cahaya diserap oleh molekul,yang ditransfer ke keadaan tereksitasi secara elektronik yang berarti bahwa sebuahelektron bergerak dari keadaan dasar singlet, S0, ke keadaan singlet tereksitasiS‟1. Inidiikuti dengan relaksasi getaran atau konversi internal (ii), dimana molekul inimengalami transisi dari elektronik atas ke yang lebih rendahS „1, tanpa radiasiapapun. Akhirnya, emisi terjadi (iii), biasanya 10 - 8 detik setelah eksitasi, ketika kembali elektron kekeadaan dasar lebih stabil, S0, memancarkan cahaya pada panjanggelombang yang sesuaidengan perbedaan energi antara kedua negara elektronik.
