BAB
METODE PENELITIAN
4.1. Jenis Penelitian
Jenis penelitian penelitian yang digunakan digunakan pada penelitian ini adalah penelitian penelitian eksperiment eksperimental al laboratori laboratoris. s. Penelitian Penelitian eksperiment eksperimental al merupakan merupakan suatu penelitian yang bertujuan bertujuan untuk mencari hubungan sebab akibat antara faktor resiko dengan timbulnya suatu penyakit, peneliti
bisa
mengintervensi
aktif
dengan
mengendalikan
faktor
yang
dapat
mempengaruhi hubungan sebab akibat serta pengamatan variabel pada penelititan ini dilakukan di laboratorium. (Notoatmodjo, 2002.
4.2. Rancangan Penelitian
Pengukur Pengukuran an variab variabel el dilaku dilakukan kan setela setelah h ada perlak perlakuan uan dan pengamb pengambila ilan n sampel sampel dilakukan secara acak dan ada kelompok kontrol atau pembanding. !leh karena itu, rancangan penelitian ini yang dipergunakan adalah "andomi#ed Post $est !nly %ontrol &roup 'esign (evilla et al.,)**+ $jokronegoro dkk, )***.
-"-
/-P) -P2 %-P+ '-P1
eterangan 3 sampel " 3 randominasi / 3 kelompok perlakuan ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus konsentrasi 2 4 3 kelompok perlakuan ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus konsentrasi 1 4 % 3 kelompok perlakuan ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus konsentrasi 5 4 ' 3 kelompok kontrol negatif P)61 3 pengamatan hari setelah perlakuan
4.3. Sampel Penelitian 4.3.1 Jenis Sampel Penelitian
ampel penelitian ini adalah he7an percobaan berupa tikus 8istar jantan ("attus norvegicus. (/stuti,20))
4.3.2 !ite!ia sampel penelitian
riteria sampel penelitian yang digunakan yaitu a.
Jenis kelamin jantan
b.
erat badan )90 : );0 gram c
c.
d.
eadaan umum tikus baik
e.
'iadaptasikan = hari
4.3.4 J"mla# Sampel Penelitian J"mla#
ampel penelitian yang digunakan ini adalah 21 ekor tikus 8istar jantan yang dibagi 2 kelompok secara acak dengan jumlah masing6masing kelompok adalah )2 ekor. esar sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah berdasarkan rumus sebagai berikut dari 'aniel (2009, yaitu n 3 >?.ծ? d? n3 jumlah sampel minimum Ծ3standar deviasi sampel
d3kesalahan yang masih ditoleransi, diasumsikan d3ծ >3konstanta pada tingkat kesalahan tertentu, jika @30,009 maka >3),*; !leh karena itu perhitungan menjadi n 3 >?.ծ? , dengan asumsi d3ծ , maka n3>? d? 3 (),*;? 3 +,51 31
Jadi, jumlah sampel minimum yang harus digunakan adalah 1 sampel untuk masing6 masing kelompok. Penelitian ini menggunakan 21 ekor tikus sebagai sampel, yang terbagi kedalam 2 kelompok yang masing6masing terdiri dari )2 ekor tikus.
4.4. $a!ia%el Penelitian 4.4.1. $a!ia%el Be%as
Akstrak akar rumput teki (%yperus "otundus konsentrasi 2 4, 14 dan 5 4 4.4.2. $a!ia%el Te!gant"ng
Jumlah makrofag 4.4.3. $a!ia%el Te!&en'ali
%ara pemberian ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus Bsolated alimantan $engah, berat badan he7an coba, teknik perlakuan, pembuatan ulcer
4.(. De)inisi Ope!asi*nal
a.
"umput teki (%yperus "otundus adalah tumbuhan tumbuh liar di tempat terbuka atau sedikit terlindung dari sinar matahari pada lapangan rumput, pinggir jalan, tegalan, atau lahan pertanian yang tumbuh sebagai gulma yang sukar diberantas. $umbuhan ini mempunyai tinggi sekitar )96*9 cm, batang segitiga. 'aun 16)0 helai terdapat pada pangkal batang membentuk roset akar, dengan pelepah daun tertutup tanah. Celaian daun bangun pita, pertulangan daun sejajar, tepi daun rata, permukaan atas ber7arna hijau mengkilap dengan panjang )06;0 cm, dan lebar 26; mm. Perbungaan majemuk berbentuk bulir mempunyai 5629 bunga yang berkumpul berbentuk payung, ber7arna kuning atau cokelat kuning.
b.
Dakrofag adalah sel6sel monosit yang mempunyai masa beredar yang singkat dalam darah yang kemudian mengembara melalui membran6membran kapiler untuk masuk ke dalam jaringan. egitu masuk ke dalam jaringan sel6sel ini akan membengkak
sampai ukuran menjadi besar, membesar lima kali lipat sampai sebesar ;0650 mikrometer, berbentuk tidak berarutan serta mempunyai inti lonjong atau bentuk seperti ginjal. Dakrofag mempunyai ciri6ciri sel yang sitoplasmanya berkembang begitu banyak lisosom dan mitokondria sehingga sitoplasmanya tampak seperti sebuah kantong yang penuh dengan granula (&uyton, 200=. c.
4.+. L*&asi Dan ,a&t" Penelitian 4.+.1. L*&asi Penelitian
a.
Pembuatan ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus dan uji kandungan ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus di lakukan di laboratorium Earmasi universitas Fambung Dangkurat, Faboratorium Earmasi
b.
Pemeliharaan he7an coba dan pengujian ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus pada he7an coba dilakukan di laboratorium iokimia Eakultas edokteran
c.
Pembuatan sediaan dan pengamatan sediaan histometri dilakukan di laboratorium Eakultas edokteran
4.+.2. ,a&t" Penelitian
Pengumpulan sampel, pemebrian perlakuan sampel, pembuatan sediaan histopatologi serta analisis data dimulai sejak bulan eptember 20)9 sampai dengan 'esember 20)9
4.-. Alat Penelitian
a.
andang he7an coba berukuran ;0G;9G50 cm
b.
/utoclave
c.
tirer
d.
&elas ukur
e.
urnisher
f.
$imbangan
g.
$ermometer
h.
Hibrator
i.
$abung reaksi dan rak
j.
Pengaduk kaca
k.
ecker glass
l.
Pipet
m. arung tangan n.
aca mulut
o.
!ven
p.
Fampu
I.
'isposible syringe 2,9 ml
r.
Penutup mulut
s.
otol tempat sampel
t.
Fabel, slide dan cover glass
u.
Petri disk
v.
urner
7. Pingset kedokteran gigi G.
Askavotor
y.
Dikroskop cahaya
4.. Ba#an Penelitian
a.
/kar rumput teki (%yperus "otoundus, diperoleh dari Provinsi kalimantan $engah yang hidup ditanah &ambut, dengan berat dengan dosis 900mgkg untuk manusia =0 kg.
b.
%otton buds
c.
Paraffin
d.
Kylol
e.
/Iuadest
f.
Ater
g.
uffer formalin
h.
Atanol 94
4./. *n0e!si Pe!#it"ngan '*sis
Perhitungan onversi dosis manusia (=0kg ke tikus (200gr 3 0,0)5 'osis Akstrak /kar "umput $eki (%yperus "tundus3 900 mgkg 'osis pada tikus 3 dosis terapi manusia G 0,0)5 3 900 mg G 0,0)5 3 * mg200 gr 3 0,019 mggr Jadi dosis Akstrak akar teki (%yperus "otundus yang diberikan kepada $ikus 8istar jantan adalah 0,019 mggr ("ehman, 200=
4./. P!*se'"! Penelitian 4./.1. Pe!siapan ean *%a
$ikus 8istar ditempatkan didalam kandang, kemudian diadaptasikan selama satu minggu dilaboratorium. $ikus 8istar diberi makan dan diganti setiap hari.
4./.2. Pe!siapan Ba#an a. Mem%"at e&st!a& a&a! !"mp"t te&i 5pe!"s R*t"n'"s6
/kar rumput teki dibersihkan dan langsung dikeringkan dalam oven dengan suhu +=L% selama 21 jam. etelah kering, akar rumput teki tersebut dipotong kecil6kecil dan diserbuk, kemudian diekstrak dengan etanol *94 selama +0 menit. etelah itu dimaserasi
dalam etanol *94 selama 21 jam, lalu difiltrasi dengan corong uchner dan diperoleh filtrat. Eiltrat yang diperoleh tersebut dievaporasi dengan rotary evaporator dengan suhu 10o% dan tekanan vakum dan diperoleh ekstrak kental sampai tidak menetes (uganda dan !#aki, )**; ardoko dan Aleison, )*** dalam Puspitasari et al .200+.
%. Mem%"at se'iaan e&st!a& a&a! !"mp"t te&i %e!"pa 7el6
Akstrak akar rumput teki (%yperus "otundus diletakkan pada mortar panas. PA& 100 dan PA& 1000 dilelehkan dalam ca7an porselin diatas penangas air dengan perbandingan )2, setelah cair atau leleh, basis dituang dalam ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus dan diaduk sampai homogen. emudian ditambah sisa basis sedikit demi sedikit sesuai konsentrasi 24, 14, dan 5 4 kemudian diaduk sampai terbentuk massa gel yang halus dan homogen. emudian gel dikemas dalam 7adah tertutup rapat ('amaiyanti, 20))
4./.3. Pe!la&"an Pa'a ean *%a 1. Pem%"atan 8l&"s
ebelum mendapat perlakuan, semua he7an coba diberikan anestesi inhalasi agar he7an coba tidak mengalami rasa sakit pada perlakuan a7al. ain yang telah dibahasi larutan ether )04 diberikan kepada he7an coba, kemudian ditutup rapat dan ditunggu sampai tertidur. Dukosa bibir ba7ah tikus dioleskan dengan clorheGidinedigluconate 0,)24. emudian mukosa bibir ba7ah tikus dilukai dengan burnisher no.1 dengan penampang 2 mm yang telah dipanaskan selama ) menit dan disentuhkan ke mukosa mulut tikus 7istar selama ) ('amaiyanti, 20)2
2. Te&ni& Apli&asi 7el E&st!a& A&a! R"mp"t Te&i 5pe!"s R*t"n'"s6
&el ekstrak akar rumput teki (%yperus "oundus dengan konsentrasi 24, 1 4, dan 5 4 disiapkan. &el ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus yang diaplikasikan ke ulser adalah sebanyak 0,019 mg untuk masing6masing kelompok perlakuan (Mulianto, 2005. Pada hari ke +. etelah perlakuan, aplikasi topical gel ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus diberikan. erdasarkan penelitian yang dilakukan %avalcante 20)), bah7a ulser pada umumnyaterjadi pada hari ke )6+ setelah he7an coba diberi perlakuan.
!leh karena itu aplikasi gel diberikan pada hari ke tiga. /plikasi pada kelompok /,,% dan 'dilakukan ) kali sehari pada hari ke + setelah perlakuan hingga hari ke empat ('amaiyanti,20)2
3. Ta#ap E"t#aniasia ean *%a
$ikus perlakuan dan tikus kontrol dikorbankan pada hari 1 setelah perlakuan pembuatan ulkus traumatikus. Pembunuhan tikus diletakkan dalam tabung kaca dan dengan menggunakan eter dalam dosis letal. emudian mukosa bibir ba7ah dipotong sampai sudut mulut tikus mengikutkan bagian yang ulser dan bagian yang normal dimasukkan dalam larutan fiksasi dan selanjutnya tikus yang telah mati dikubur ('amaiyanti,20)2
4. Ta#ap Pem%"atan Se'iaan
Persiapan pembuatan preparat histology dia7ali dengan memotong mukosa bibir ba7ah tikus dengan mengikutkan jaringan normal tikus. emudian dilanjutkan teknik proses jaringan dengan metode parafin (udian, 2001
(. Ta#ap Pe!la&"an Dengan Met*'e Pa!a))in
a.
Dukosa bibir ba7ah tikus dipotong pada 1 hari setelah perlakuan, kemudian direndam dalam butterformalin )0 4 (pC =,1
b.
Eiksasi dilakukan 2 tahap, setelah 15 jam pertama larutan fiksasi diganti yang baru dan pada tahap kedua dibiarkan dalam larutan fiksasi selama 15 jam (ketebalan jaringan 0,9 cm. Eiksasi dilakukan untuk menghentikan proses autolisis pada sel yang disebabkan oleh perlakuan selanjutnya. etelah dilakukan fiksasi jaringan dibilas dengan air mengalir selama ;6* jam
c.
$ahap selanjutnya adalah dehidrasi B untuk mengekstrasi air dari jaringan dan alkohol dengan konsentrasi 50 4 selama ) jam, alkohol *9 4 2 kali ) jam dan alkohol )004 (absolut + kali ) jam
d.
emudian dilakukan penjernihan atau clearing B dengan cara memasukkan kedalam larutan Kylene 2 kali 0,96) jam. Pada )0 menit terakhir proses clearing itu dinaikkan sampai ;2% dengan memasukkan kedalam inkubator (udiana,2001
e.
Proses berikutnya adalah dilakukan infiltrasi B pada jaringan. Bnfiltrasi pertama ini dilakukan tidak lebih dari 9 menit. emudian setela selesai infiltrasi B, jaringan dicelupkan kedalam Gylene selama 26+ menit. emudian dimasukkan kedalam alkohol *9 4 selama setengah jam, dicuci dengan air mengalir selama )62 jam (sudiana 2001
f.
etelah proses infiltrasi dilakukan kembali proses dehidrasi BB dan clearing BB cara sama seperti dehidrasi B dan clearing B. emudian dilakukan infiltrasi BB yaitu dengan cara mencelupkan jaringan kedalam paraffin yang telah dicairkan pada suhu ;2%, selama ),9 jam sebanyak 2 kali (sudiana, 2001
g.
$ahapan selanjutnya adalah embedding. 'isini jaringan ditanam kedalam balok parafin, caranya paraffin cair dituangkan kecetakan yang dibentuk dari 2 logam yang disusun membentuk kotak yang diberi alas lembaran logam
h.
egera setelah paraffin cair dituangkan kecetakan, potongan jaringan dimasukan memakai alat pingset dengan arah permukaan jaringan yang akan diposting menghadap ke dasar bagian atas diberi label tanda. etelah paraffin mengeras selanjutnya logam cetakan dapat dilepas (udiana, 2001
i.
$ahapan terakhir adalah pemotingan yang dilakukan dengan rotary microtome secara serial dengan ketebalan 9 O. elama 7aktu pemotongan suhu blok diusahakan rendah 96)0%, hal ini diusahakan dengan mendinginkan blok dan pisau pemotong dengan air es. &unanya agar sediaan tetap basah dan yang tertanam blok dapat terpotong dengan baik. 'ari potongan6potongan ini dipilih yang bagus kemudian dimasukkan kedalam 7ater bath
j.
ayatan jaringan ditempelkan pada gelas objek kemudian siap di7arnai (udiana, 2001
4.19. Te&ni& Pem%"atan P!epa!at ist*met!i
a.
$eknik yang dilakukan adalah pengecatan CA (hematoGilineosin
b.
Dencelupkan slide kedalam larutan Gylol selama 2 jam sebanyak 2 kali, etanol absolute selama ) jam sebanyak 2 kali, setanol *9 4 selama ) jam sebanyak 2 kali, etanol 50 4 selama ) jam
c.
'icuci dengan air )06)9 menit
d.
'imasukkan kedalam larutan mayers haemotoksilin selama )9 menit untuk me7arnai inti sel, dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kelebihan cat selama 20 menit
e.
Pengecatan dengan lithium karbonat, slide dimasukkan kedalam lithium karbonat selama )62 menit agar didapatkan inti yang membiru, dicuci dalam air mengalir selama 96)0 menit
f.
Pengecatan dengan eosin yaitu dengan memasukkan slide kedalam larutan eosin selama )9 detik62 menit, tujuan tahap ini untuk memberi pe7arnaan pada sitoplasmanya (udiana,2001
g.
Proses berikutnya adalah dehidrasi yaitu dengan memasukkan slide ke dalam etanol *94 selama 2 menit sebanyak 2 kali dan etanol absolute selama 2 menit sebanyak + kali.
h.
$ahap terakhir adalah mounting. ediaan ditetesi entellan kemudian ditutup dengan gelas penutup dan siap dilakukan pemeriksaan diba7ah mikroskop cahaya hasil yang didapatkan adalah inti ber7arna biru dan sitoplasma sel ber7arna merah (udiana, 2001
4.11. Ta#apan Pengam%ilan Data
Jumlah monosi ditentukan berdasarkan pengamatan preparat histometri blok paraffin diba7ah mikroskop cahaya dengan pembesaran 100G. Perhitungan sel dilakukan dengan cara graticulae yang membagi bidang visual dari mikroskop cahaya dalam ukuran tertentu agar untuk memudahkan membaca dan mencegah duplikasi sel. 'ata diperoleh dari hitungan rata6rata dalam lima bidang visual dalam graticulae tersebut (ratna, 2009.
4.12. Analisis Data
'ata penelitian yang telah menggunakan
uji
diperoleh
olmogorov6smirnov
terlebih dahulu diuji
dan
di
uji
Fevene
normalitasnya
untuk
menguji
homogenitasnya. 'ata penelitian yang terdistribusi normal (p Q 0,09, dilanjutkan dengan uji parametrik menggunakan $7o7ay /nova dengan tingkat kepercayaan *94 (@30,09 (Notoatmojo, 2002. /pabila terdapat perbedaan bermakna dilanjutkan dengan uji $ukey C' dan jika distribusi yang tidak normal maka dilakukan analisa data dengan
menggunakan uji Dann68itney $est untuk mengetahui perbedaan pengamatan antara perlakuan topikal gel ekstrak akar rumput teki (%yperus "otundus dengan konsentrasi 24,1 4 dan 54 dengan kelompok kontrol pada pengamatan hari ke 1 (ugiyono, 20)1
4.13. Al"! Penelitian
ampel tikus jenis "atus norvegicus strain 7istar (tikus 7istar R /nestesi $opikal R $erjadi
Pemberian gel ekstrak akar rumput teki
$anpa perlakuan (kelompok kontrol
(%yperus "otundus pada hari ke6+ (kelompok perlakuan ↓
onsentrasi 24 ↓
konsentrasi 14
konsentrasi 5 4
↓
↓
R 'ikorbankan R 'iambil jaringan mukosa dan dibuat sediaan R Pe7arnaan CA R Perhitungan jumlah makrofag R
Casil R /nalisis data R Pembahasan