Controle Biológico e Microbiológico de Qualidade de Medicamentos
Ensaios de pirogênio in vivo e in vitro
Prof a Giselle Fazzioni Passos
Pirogênios Substâncias que induzem febre são chamadas pirogênios. A palavra pirogênio é relacionada à palavra grega pyro, que significa ardente ou fogo, uma descrição adequada para substâncias que produzem elevação da temperatura do corpo.
Pirogênios Substâncias que induzem febre são chamadas pirogênios. A palavra pirogênio é relacionada à palavra grega pyro, que significa ardente ou fogo, uma descrição adequada para substâncias que produzem elevação da temperatura do corpo.
Classificação dos Pirogênios Os pirogênios são divididos em duas classes: exógenos (originados fora do organismo) - Pirogênios endógenos (produzidos pelo organismo em - Pirogênios resposta aos exógenos)
•
Embora a endotoxina (lipopolissacarídeo) seja o mais presente e importante pirogênio exógeno, há outros de constituição química diversa, que causam elevação de temperatura quando injetados sob condições específicas.
•
Classes gerais de pirogênios exógenos incluem bactéria, fungos e vírus, como também pirogênios não microbianos, por exemplo, alguns fármacos, esteróides, e frações do plasma.
Exemplos de pirogênios exógenos: Produtos bacterianos, toxinas ou microorganismos inteiros. ! Bactérias Gram- (vivas ou inativadas por calor) ! Bactérias Gram+ ! Endotoxina - lipopolissacarídeo (LPS) de Gram! Toxinas bacterianas (enterotoxina de S. aureus) ! Componentes de manana e glucana de fungos ( C. albicans); ! Componentes virais, como ds-RNA.
Endotoxina é um lipopolissacarídeo complexo que é o principal componente da membrana externa de gram negativos. Liberado pela bactéria por multiplicação, morte ou lise (viva ou morta) . Ocupa a maior parte da superfície da membrana externa. >\LVLV>\MM@;@=]^"V ;'(*/'# ,'$*%'/# V2*#)*+EF/+'# L9,/##'+'%E(*9 >/)E(*9 @ 89#F9,/)E(*9 L%9$*E3' >/)9)%9$*E3' L*)$E(*94,/+'39 "#)'J9 )*%/),O#1/+9 [*1-%'3' /3$*%3' ;/$9),'#1'
!"#$%& ( – "#$%&$&%' (' )'%*(* +*,&,'% (* -'+$.%/' 0%'123*4'$/5'6 7893$*: ;<'%,*#
=/5*% >'-9%'$9%/*#?
LPS – indução de resposta febril
Estimula centro termorregulador (hipotálamo) Vasoconstricção periférica,! calor
Mecanismo da febre Resposta febril é mediada por moléculas endógenas (pirogênios endógenos) que são liberadas por leucócitos a partir de estímulos de pirogênios exógenos. PEs
citocinas: TNF, IL-1, IL-6 e INFs. Atuam no SNC induzindo síntese de PG.
Vantagens do aumento da temperatura corporal durante uma infecção: ! Inibição do crescimento bacteriano; !
!
Aumento da ação bactericida de neutrófilos e macrófagos; Sonolência.
Controle de Qualidade x Niveis de Pirogênios !
Os níveis de pirogênio tornaram-se cruciais na liberação de produtos farmacêuticos.
!
Sob o ponto de vista de controle de qualidade, todos os injetáveis, bem como os acessórios para transfusão, infusão e todos os dispositivos implantáveis ou descartáveis empregados em terapia parenteral devem oferecer segurança ao paciente, sob o ponto de vista de contaminantes pirogênicos. Produtos injetáveis de grande volume e de pequeno volume, assim como produtos na forma de aerossol, para uso respiratório devem ser analisados.
!
O potencial de periculosidade é maior quando se trata de injetável de uso exclusivo por via intravenosa. O risco será ainda maior quando se trata de produto com inoculação intratecal, em que a experiência demonstrou ser a endotoxina 1000 vezes mais potente que na via intravenosa (utilizar teste in vitro).
Controle de Qualidade x Niveis de Pirogênios !
Endotoxinas são complexos de alto peso molecular associados à membrana externa de bactérias Gram-negativas, sejam elas patogênicas ou não, e se constituem na mais significante fonte de pirogênio para a indústria farmacêutica.
!
Apesar de a maior parte da endotoxina permanecer associada à parede celular até a desintegração da bactéria, quantidades ínfimas de endotoxinas são liberadas, na forma solúvel, por culturas de bactérias jovens ou também por bactérias Gram-negativas como E.coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus e outros agentes patogênicos, em crescimento.
!
Endotoxinas não purificadas podem conter lipídeos, carboidratos e proteínas. Como podem ser encontradas unidades não purificadas nas fases em processo ou nos produtos farmacêuticos terminados, prefere-se utilizar a terminologia endotoxina. A denominação de lipopolissacarídeo (LPS) é aplicada à endotoxina purificada, para enfatizar a sua natureza química.
Controle de Qualidade x Niveis de Pirogênios As endotoxinas são tóxicas à maioria dos mamíferos. Estudos têm demonstrado que a injeção de bactérias Gram-negativas vivas ou mortas, ou LPS purificado causa uma série de reações: ! ! ! ! ! !
febre mudança na contagem de leucócitos (leucopenia seguida por leucocitose) coagulação intravascular disseminada hipotensão choque morte
Por isso, é de vital importância aos pacientes a detecção e a eliminação de pirogênios em injetáveis, equipos de transfusão, infusão e todos os dispositivos implantáveis ou de uso único empregados na terapia parenteral.
Métodos Oficiais - Ensaio de Pirogênio pelo Método in vivo
Objetivo: avaliar o risco de reações febris no homem após administração por via i.v. Atividade pirogênica: capacidade de elevar a temperatura. 1-10ng/kg " resposta pirogênica " febre
Pirogênio in vivo • 1º Método (USPXII 1942) • 3 coelhos adultos, sadios (M ou F) – sistema termorregulador semelhante ao humano • Peso mínimo " 1,5 kg (equivalência relacionada à idade) • Termômetro clínico ou termoelétrico " precisão 0,1oC • Temperatura ! 39,8oC • Reutilização: 48h ou 2 semanas (se resultado for +) • Material: despirogenizado (30min 250oC ou 1h a 200oC) • Volume injeção 10mL/kg tempo máximo 4 min • Sessão de treino anterior ao ensaio
Teste de pirogênio in vivo Metodologia: • Imobilizar em gaiola de contenção 03 coelhos adultos sadios; • Introduzir termômetro no reto de cada animal; • Registrar TC1 30 min e TC2 60 min após introdução do termômetro; • TC = (TC1+TC2)/2 • Após 30 min da obtenção da TC, injeta-se a amostra através da veia marginal da orelha do animal; • Aquecer amostra a 37 ± 2oC antes da injeção; • Registrar a Tcorpórea de cada animal, 1, 2 e 3 h após a administração da amostra (ou registro contínuo); • Calcular diferença de temperatura de cada animal.
Ensaio de Pirogênio pelo Método in vivo !
Ensaio aplicado aos produtos que podem ser tolerados pelo animal em uma dose máxima de 10 mL por kg e envolve a medida do aumento na temperatura em coelhos após a injeção intravenosa de uma solução. São utilizados coelhos adultos e saudáveis, acomodados individualmente em uma área com temperatura uniforme entre 20 e 23 °C e livre de distúrbios que possam excita "-los.
!
Pelo critério de interpretação atualmente empregado em países europeus, cada amostra deve ser avaliada em um grupo de três animais e quando a soma das elevações térmicas individuais máximas for inferior a 1,15 °C a amostra será aprovada e caso seja superior a 2,65 °C será rejeitada. Quando o valor da somatória estiver entre estes valores, a amostra será injetada em outros três animais (máximo mais dois retestes = 12 coelhos – máx 6,6 °C).
Ensaio de Pirogênio pelo Método in vivo !
Pelo critério adotado pela USP e FB, se nenhum coelho apresentar um aumento individual de temperatura de 0,5 °C ou mais, acima da respectiva temperatura de controle, o produto atende aos requisitos para ausência de pirogênio.
!
Se o aumento individual for 0,5 °C ou mais, o ensaio deve ser repetido em outros cinco coelhos. Se no máximo três dos oito coelhos mostrarem aumentos individuais de temperatura de 0,5 °C ou mais, e se a soma dos oito aumentos máximos individuais não exceder 3,3 °C, o produto atende aos requisitos para ausência de pirogênio.
!
O ensaio de pirogênio em coelhos, embora seja utilizado quando a metodologia in vitro não é aplicada, ainda é mantido porque tem a seu favor a situação do envolvimento de toda a reação fisiológica do animal, constituindo um teste de segurança para os produtos injetáveis, líquidos para infusão e perfusão, materiais cirúrgicos e descartáveis em geral. DETECTA TODO O TIPO DE PIROGÊNIO
Teste de pirogênio in vivo Imunoterápicos: elevação permitida é maior Nos EUA: rejeição quando mais da metade dos animais apresentar Tcrítica ! 0,6oC No Brasil: Tcrítica 1,1oC (permitida para 1/3 dos animais) e valor limite para #DT (8) # 5,5 oC, ao invés de 3,3 oC. Avaliação dos resultados: os dados obtidos são confrontados com a monografia adotada, possibilitando a classificação final – APIROGÊNICO, PIROGÊNICO ou DUVIDOSO.
Teste de pirogênio in vivo Amostras: Para controle de qualidade " Injetáveis (de grande ou pequeno volume); " Material para infusão e transfusão; " Todos os dispositivos implantáveis ou descartáveis empregados em terapia parenteral; Limitações do ensaio: Produtos que contenham fármacos que atuem sobre os sistema termorregulador; " Hipnóticos, anestésicos, gluconato de cálcio, esteróides, quimioterápicos, alguns antibióticos, radiofármacos (provocam ! natural na TC). "
Teste de pirogênio in vivo Vantagens: # Possibilidade de detecção de outras substancias pirogênicas além das endotoxinas # Segurança, envolve toda a reação fisiológica do animal (similar à humana). Desvantagens: #Teste-limite
– não permite determinação quantitativa; #Sensibilidade insuficiente de coelhos na detecção da presença de endotoxinas (limite: 0,5 UE/ml) – importante limitação para produtos de uso intratecal; # Tolerância à endotoxina; # Nem todos os produtos farmacêuticos podem ser avaliados neste ensaio; # Estresse e/ou condições de saúde; # Tempo; # Recursos humanos; 3 R’s.
Determinação de Endotoxinas Bacterianas pelo Método in vitro
límulo ou caranguejo-ferradura, que habita alguns locais na costa do Oceano Atlântico dos Estados Unidos até o Golfo do México. Limulus polyphemus:
Determinação de Endotoxinas Bacterianas pelo Método in vitro !
Simples e amplamente utilizado.
!
O método se baseia na reação entre os amebócitos e a endotoxina, produzindo um gel opaco facilmente reconhecido.
!
Utiliza o reagente de LAL (lisado do amebócito do Limulus) que é um extrato aquoso dos amebócitos, que são as células sanguíneas da hemolinfa azul da espécie de caranguejo ferradura Limulus polyphemus, composto de enzimas que reagem em presença de pequenas quantidades de endotoxina (reação concentração-dependente).
Limulus Amebocyte Lysate Test -
LAL Método laboratorial utilizado para detecção de endotoxinas pirogênicas e como uma alternativa ao teste de pirogênios em coelhos. HISTÓRICO: Infecção do L. polyphemus por Gram (-) resultava em coagulação intravascular extensiva e morte (Bang, 1956); Levin e Bang (1964) demonstraram que a coagulação extracelular da hemolinfa do Limulus era causada por uma reação entre endotoxinas e uma proteína coagulativa em amebócitos circulantes na hemolinfa do caranguejo; Levin e cols. (1970) desenvolveram um ensaio sensível para detecção de endotoxinas em plasma humano utilizando o material lisado dos amebócitos do Limulus; Young, Levin e Prendergast (1993) isolaram, purificaram e descreveram a proteína coagulativa do LAL e provaram que a reação entre o lisado e a endotoxina apresenta natureza enzimática.
Determinação de Endotoxinas Bacterianas pelo Método in vitro
Teste de endotoxinas bacterianas – LAL (Lisado do amebócito do Limulus) Endotoxina catalisa a ativação da pró-enzima no lisado (LAL). A coagulase ativada hidrolisa ligações especificas em uma proteína coagulante (coagulogênio) também presente no LAL.
!342.25-3' 6789: ; <'=;
Derivado celulósico usado raramente em injetáveis 6)FG:FAB$1'32
>'.20 < '.-?'42
>'.20 <
>'.20 C
>'.20 C '.-?'42
>'.20 D '.-?'42
!3@-&' 80212'A$B'3.%
>'.20 D
!3@-&' <2'A$B'3.%
<2'A$B2AE3-2
<2'A$B-3' 6D%B:
! A formação de gel ocorre quando a enzima de coagulação dos amebócitos
ativada pela endotoxina, na presença de cátions divalentes, é adicionada à proteína coagulante (coagulogênio)
! A reação entre o lisado de amebócito e a endotoxina é dependente da
concentração de endotoxina, temperatura e pH.
!"#
!$#
!%#
!&#
!"#
!$#
Classificação legislativa do LAL: Na edição da EP (Eur. Pharm., 3rd 1996) e no suplemento 2001 o teste de LAL é mencionado como sendo de igual valor ao ensaio in vivo, em coelhos. O teste LAL é classificado no mesmo nível em outras farmacopeias, como a USP XXIV (USP 24, 2000), a BP (1999) e outras.
Método farmacopeico oficial
LAL 6 métodos oficiais descritos na EP:
A: Gel-clot method: limit test B: Gel-clot method: semi-quantitative test C: Turbidimetric kinetic method D: Chromogenic kinetic method E: Chromogenic end-point method F: Turbidimetric end-point method Método cromogênico: uso de substrato colorido, clivado com a ativação do sistema enzimático para produção de cor.
Farmacopeia brasileira: admite os métodos acima. Necessário realizar validação para o método de gelificação (teste de sensibilidade do LAL utilizando padrão de referência de endotoxina (PRE). Incluído na 4ª Edição da Farmacopeia (1996).
Determinação de Endotoxinas Bacterianas pelo Método in vitro PROTOCOLO: • Volumes iguais de reagente LAL, da solução a ser analisada ou controle (endotoxina padrão) são transferidos a tubos de ensaio. • A mistura homogeneizada é incubada em banho de água a 37°C/ 1h. • O ponto final da reação é facilmente verificado pela remoção dos tubos e inversão a 180°. • A presença do gel que se mantém sólido durante a inversão é considerada positiva para endotoxinas. • O ensaio se constitui em teste limite, levando-se em consideração a sensibilidade do LAL empregado, que varia de 0,25 a 0,015 UE/mL. (UE = Unidade de Endotoxina ). • 1 UE é igual a 1 UI (unidade internacional). Precauções: Qualidade do material, assepsia, pH (6,5 a 8,0)
Metodologia Preparo dos controles Controles positivos Água: solução a 0,05 mg/mL de endotoxina padrão em água BET; Amostra: solução a 0,05 mg/mL de endotoxina padrão em água BET, contendo a amostra. Padrão de Referência de Endotoxina (10.000 UI/ampola). Um ng de endotoxina de E.coli 055:B5 é similar em potência a 5 UE. Controle negativo Água BET (Bacterial Endotoxins Test ): obtida por destilação tripla ou filtração em membrana. Preparo do Reagente Pirogente: Reconstituir o lisado de amebócitos liofilizado (“kit”) em 5,2 mL água BET e dispensar 0,1mL em tubos de ensaio estéreis. Incubar com a amostra teste (0,1mL) e controles positivo e negativo. Incubar a 37oC por 60min; O resultado é POSITIVO quando há formação de um gel firme capaz de se manter íntegro quando o tubo é invertido a 180º; O resultado é NEGATIVO quando não há formação de um gel firme ou ainda quando há formação de um gel viscoso que não se mantém preso ao tubo quando invertido.
Ponto final de gelificação
Ensaio turbidimétrico
Método cromogênico
Curvas padrão com mínimo de 3 concentrações log (5; 0,5; 0,05 UE/mL), e controle positivo com concentração média da curva. Sensibilidade maior: 0,005 UE/ml, versus 0,25 a 0,015 UE/mL do teste de gelificação
# # # #
$ é
a sensibilidade declarada do reagente LAL em UE/mL São utilizadas 4 diluições do Padrão de Referência de Endotoxina em quadruplicata, e incluir controles negativos. Os resultados são considerados em conformidade se a média geométrica da concentração do ponto final for !0,5$ e < 2$. Pode-se fazer a comprovação também utilizando ensaios turbidimétrico e cromogênico.
Teste de inibição e exacerbação da amostra A maioria dos medicamentos requer diluição para evitar interferências caracterizadas pela inibição (falha na recuperação do controle positivo) ou por potencialização (recuperação do controle positivo maior que a esperada).
Caso seja detectada interferência do produto no teste, devese calcular máxima diluição válida (MDV).
Substituição do ensaio in vivo pelo LAL: Possível quando o limite de endotoxina é definido para o material em consideração. Limites para endotoxina bacteriana (FDA): • Parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL; • Drogas intratecais:0,2 UE/mL; • Água para injeção, água estéril para injeção e água estéril para irrigação: 0,25 UE/mL; • Água bacteriostática para injeção e água estéril para inalação: 0,5 UE/mL (USP - Suplemento 4a - 1984). • Drogas intratecais:0,2 UE/mL; • Correlatos até 0,5 UE/mL e correlatos intratecais 0,06 UE/mL.
Vantagens x Desvantagens do LAL Vantagens: " $ quantidade
de amostra; " Varias amostras podem ser testadas por dia; " 1 operador treinado para realizar os testes; " Enconomia; " ↑ sensibilidade; " Metodologia padronizada; " Rapidez. Desvantagens do LAL: Reação pode ser inibida pela amostra (tensoativos, metais pesados); " Quelantes de cátions divalentes (EDTA); " Só detecta endotoxinas de bactérias gram negativas; " pH fora da faixa 6,5 a 8,0. "
Despirogenização Diversas metodologias, mas importante é ter produto final apirogênico ou com baixos níveis de endotoxina. Despirogenização: por inativação ou remoção das endotoxinas. Por inativação da Endotoxina ! Hidrólise ácida ou alcalina (desativação do lipídio A) – separação do lipídeo A do resto da molécula ou saponificação (materiais – ÁCIDA: HCl 0,05 N, 30 min, 100 °C ou ácido acético glacial 1%, 2 a 3 horas, 100 °C; ALCALINA: NaOH 0,25 N, 1 hora, 50 °C); ! Oxidação – peróxido de hidrogênio 5% (mecanismo?), usado em água estéril para injeção, salina e salinadextrose, mas pode oxidar produtos susceptíveis;
Despirogenização Por inativação da Endotoxina ! Alquilação (ex. uso de óxido de etileno em materiais termolábeis); ! Processo térmico – Autoclavação é ineficaz. Incineração por tratamento com calor seco (250 oC/ 30’), materiais termorresistentes como vidro e metal; ! Radiação ionizante – 60Co, uso limitado devido aos riscos de toxicidade.
Despirogenização Por remoção da Endotoxina !
!
!
Lavagem - água estéril para injeção USP (vidrarias, tampas e dispositivos); Destilação – método mais antigo, durante a formação de vapor a endotoxina é separada por ter peso molecular elevado; Ultrafiltração – exclusão por peso molecular (monômeros de LPS de 20.000 daltons se agregam em vesículas de 300.000 a 1.000.000 daltons). Uso para fármacos e soluções de baixo a médio peso molecular – filtro que retém moléculas acima de 100.000 daltons);
Despirogenização Por remoção da Endotoxina !
!
!
Osmose reversa – membrana capaz de promover exclusão de íons ou exclusão por tamanho – útil para produção de água estéril para injeção; Carvão ativo – adsorção de endotoxinas (adsorção de ingredientes ativos é uma limitação); Cromatografia troca iônica - (etapa de purificação de biotecnológicos).
Métodos devem ser sempre validados – teste desafio que deve mostrar contaminação reduzida em pelo menos 3 níveis logarítmicos (1000 UE/ml para 1 UE/ml)
