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Universidade Federal de São João Del Rei
Enzimas e Cinética Enzimática
Engenharia Bioquímica Prof. Marília Magalhães Gonçalves
Enzimas •
•
•
As enz enzima imass são prote proteína ínass globul globulare aress que funcionam como catalisadores catalisadores biológicos biológicos Encont Encontrad radas as em anima animais, is, vegeta vegetais is e nos microrganismos Viabi iabililiza zam m as ativ ativid idad ades es das das célu célula las, s, quebrando moléculas e juntando-as para formar novos compostos
Enzimas •
com o subtrato sobre o qual atuam •
•
As enzimas possibilitam que que as indústrias utilizem proc rocesso essoss mais econ econôm ômic icos os e menos enos polue poluente ntes, s, além além de serem serem extrem extremame amente nte eficientes Atualmente, podem substituir muitos produtos químicos nocivos ou até perigosos e permitem uma produç produção ão segura segura e ambien ambienta talme lmente nte correta, decorrente de uma tecnologia limpa
Algum lgumas as
enzi enzima mass
são são
espe espec cífic íficas as
para para
determinado tipo de ligação química, outras para um tipo particular de isômero óptico •
“Toda enzima é uma proteína, mas nem toda proteína proteína é uma enzima”
Enzimas •
Apresent Apresentam am elevado elevado grau de especif especificidad icidade e
Enzimas •
•
•
O uso de enzimas para fins tecnológicos consiste em faze fazerr dest destes es cata catalilisa sado dore ress biológ o lógic icos os,, catalisadores catalisadores de processo, capazes de transformar matérias-primas matérias-primas em produtos com valor agregado Entretanto, Entretanto, esse é um grande desafio tecnológico devido do à instabili instabilidad dade e da estrutura estrutura proteica proteica da enzima Ain Ainda da são são pouc poucos os os proc proces esso soss enzi enzimá máti tico coss operados em escala industrial
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CARACTERÍSTICA
1 – Especificidade ao substrato 2 – Natureza da estrutura 3 – Sensibilidade à temperatura 4 – Co nd ç i õe sd e r ea çã o(T ,P e p H) 5 – Custo de obtenção (isolamento e purificação)
E NZI MA S
CAT AL ISAD OR ES QUÍMICOS
Alta
Baixa
Complexa
Simples
Alta
Baixa
Su av es
Dr ás tic as (ge ral me nt e)
Alto
Moderado
6 – N at ur ez ad o p ro ce ss o
B at el ad a/ co nt ín uo
B at el ad a/ co nt ín uo
7 – Consumo de energia
Baix o
Alto
8 – For ma çã od es ub pr od ut os
Ba xi a
Al ta
9 – Reutilização do catalisador
Simples/cara
Simples
10 – Atividade catalítica (temperatura Ambiente)
Alta
Baixa
11- Presença de cofatores
Sim
Não
12 – Energia de ativação
Baixa
Alta
Alta
Baixa
13 – Velocidade de reação
Enzimas •
São divididas em seis classes conforme a reação que catalizam
•
Oxirredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, ligases
Enzimas Classe da Enzima
Tipo de reação catalizada
Oxirredutases
Catalisam reações de oxirredução. Transferência de H, O ou elétrons Catalisam a transferência de grupos entre moléculas Catalisam reações de hidrólise C at al is am a a di ção d e grupos a ligações duplas e vice-versa Catalisam reações de isomerização Catalisam a união de duas moléculas, associadas à ruptura da ligação trifosfato do ATP
Transferases Hidrolases Li as es Isomerases Ligases
Enzimas •
•
•
Após os antibióticos, as enzimas são os produtos mais explorados na indústria biotecnológica Muitas das enzimas obtidas de vários tipos de microrganismos podem ter um uso comercial Atualmente comercializam-se em todo o mundo mais de 1500 toneladas de enzimas por ano, correspondendo a um mercado mundial estimado em mais de US$ 2 bilhões
Enzimas •
•
•
A obtenção de enzimas comerciais pode ser feita a partir de fo ntes animais, vegetais e microbianas Sua produção pode ser aumentada pela transferência das informações genéticas para um microrganismo hospedeiro Esses microrganismos geneticamente modificados (OGMs) podem, então, ser cultivados sob as melhores condições
Enzimas Mercado •
•
•
Enzimas Técnicas: formulação de detergentes, produção de papel e celulose, manufatura de couros e produção de fármacos (50% do mercado de enzimas) Alim entos: xarope de açúcar invertido (frutose), aromas, produção de pães, processamento de carnes e embutidos, queijos, cerveja, sucos e lipídeos estruturados isentos de isômeros trans Ração animal: engorda de animais (celulases, xilanases, fitase desdobramento do ácido fosfórico do inositol em fosfato livre para ser absorvido)
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Enzimas •
•
•
Enzimas
Em 2008 haviam cerca de 3000 enzimas identificadas e integrantes da lista de Comissão Internacional de Enzimas (E.C.) Apenas 60 dessas enzimas com aplicação industrial, devido ao alto custo de produção
Proteases constituem quase 40% das vendas
•
de enzimas, seu uso em detergentes é o seu principal mercado Principais mercados: detergentes (37%),
•
setor têxtil (12%), amido (11%), panificação (8%), ração animal (6%)
Mais de 75% das enzimas comerciais são hidrolases
Enzimas
Aplicação das Enzimas • 90% são extracelulares e de origem microbiana
Obtenção Industrial
• Fonte
V eg et ai s
An ima is
Microrganismos
Origens
S em en te s Sucos Polpas Raízes Muc osa s Pâncreas Fígado Sangue Bactérias Fungos Leveduras
Método de Obtenção
Trituração de tecidos
do
mercado
de
enzimas
– Protease alcalina de Bacillus licheniformis em detergentes
Trituração de tecidos
Cultura submersa semi-sólida
Proteases: 50% microbianas
– Coalho de Mucor miehei (enzima quimosina) na produção de queijos
ou
– Utilização em massa de pães e biscoitos • Amilases: conversão de amido em xaropes, produção de açúcares fermentáveis (cerveja)
Aplicação das Enzimas •
•
•
Pectinases de Aspergillus niger : processos de extração de suco e elaboração de vinhos aumentam o rendimento, reduzem a viscosidade e melhoram a extração da cor das cascas de frutas e vegetais macerados Celulases: processamento de alimentos, indústria têxtil, tratamento de despejos Glicose isomerase: conversão de glicose em frutose
Aplicação das Enzimas •
•
•
Papaína (extraída do látex de mamão): cervejaria e processamento de alimentos Quimosina (ou renina): extraída do 4º estômago de novilhos em aleitamento produção de queijo Atualmente a quimosina animal foi substituída por enzimas microbianas (bactérias geneticamente modificadas)
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Características das Enzimas •
•
•
•
Moléculas de proteínas com função de reconhecer e se ligar a reagentes específicos, catalisando sua conversão em produtos Responsáveis pelo aumento da velocidade de todas as reações que ocorrem no interior das células
•
Combinam-se temporariamente com os substratos (ou reagentes) durante a reação
•
São liberadas sem alteração em sua estrutura
•
Específicas em sua atividade (um único tipo
Sua atividade catalítica depende da integridade da sua conformação proteica nativa
de molécula ou grupo de moléculas
Características das Enzimas
Características das Enzimas
Saturadas
por
altas
concentrações
de
substrato •
Características das Enzimas
Podem
relacionadas)
•
Apoenzima: estado inativo da enzima na ausência de cofator
conter
grupos
não-protéicos
(Cofatores) que contribuem para sua ativi dade - inorgânicos: íons metálicos (Mg, Zn, Mn, Fe) - orgânicos (coenzimas): grupos complexos derivados de vitaminas (NAD, FAD, coenzima A ou algumas vitaminas)
Mecanismo de catálise •
•
•
Energia de Ativação
Enzimas aumentam a velocidade de reações espontâneas por redução da energia de ativação Energia de ativação – barreira de energia entre subtratos e produtos que deve ser transposta pelas moléculas para que a reação ocorra
Figura 1: Gráfico de energia de ativação de uma reação química e a mesma reação catalisada por uma enzima.
Não são consumidas nem alteradas no processo e não afetam o equilíbrio da reação
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Mecanismo de catálise •
•
•
Sítio ativo
Sítio ativo: cavidade com forma definida, aberta na superfície da molécula globular da enzima, constituída por grupos R de aminoácidos Para ser reconhecida como substrato, uma molécula deve ter a forma adequada para acomodar-se no sítio ativo e os grupos químicos capazes de se ligar com os grupos R
Figura 2: Esquema representativo da atuação de uma enzima num processo bioquímico
Enzimas podem possuir mais de um sítio ativo
Regulação da atividade enzimática •
•
•
•
•
Alguns compostos do metabolismo têm a propriedade de se ligarem com alta especificidade a uma região de determinadas enzimas chamada sítio alostérico Este é diferente do sítio ativo Modificação da estrutura terciária da enzima Nova conformação pode auxiliar ou prejudicar a ação catalítica
Figura 3: Ativação (a) e inibição alostérica (b) de uma enzima
Enzima chamada alostérica
Regulação da atividade enzimática •
•
Tipo de regulação largamente empregada
Medida da atividade enzimática •
pelas células, praticamente em todas as
quantificação em massa é a medida de sua
vias metabólicas
atividade
Normalmente a inibição da atividade
•
Mecanismo de feedback
Atividade
da
enzima
é
avaliada
pela
velocidade da reação que a enzima catalisa
alostérica é feita por produtos finais da via •
Para enzimas, mais importante do que a
•
Para essa medida uma amostra de solução contendo
a
enzima
é
incubada
com
concentrações altas de substratos
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Medida da atividade enzimática •
•
•
Fatores que afetam a atividade enzimática
A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades Internacionais Uma Unidade Internacional (U) é a quantidade de enzima capaz de formar um µmol de produto por minuto em condições ótimas de medida Medida da atividade da enzima importante em processos de purificação
Temperatura •
De maneira geral, aumento da temperatura leva a aumento da atividade enzimática (maior número de colisões entre enzima e subtrato)
•
Entretanto, acima de determinado valor de temperatura, ocorre desnaturação da enzima
é
com declínio rápido de sua atividade
Fatores que afetam a atividade enzimática pH •
•
Fatores que afetam a atividade enzimática
Cada enzima tem uma faixa de pH ótima, na qual mantém sua configuração normal no meio em que atua Variação no pH pode alterar a ionização de cadeias de aminoácidos no sítio ativo da enzima, causando mudança de configuração e ou desnaturação, impedindo – a de se combinar com o substrato
Efeitos do pH
pH •
A alteração do pH tem efeitos na atividade enzimática e, como consequência, é necessário selecionar e controlar o pH do meio Aumento do pH
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Cinética das reações enzimáticas
Efeitos do pH
Objetivos •
•
•
•
•
•
Cinética das reações enzimáticas •
•
•
•
A velocid ade de consumo do subtrato ou formação do produto varia com o tempo Com o desenvolvimento da reação as condições em que se encontra o sistema variam A concentração de substrato decresce e da enzima pode diminuir também (instabilidade), alguns produtos podem inibir ação catalítica da enzima Instante inic ial – condições experimentais são conhecidas
Efeito da concentração inicial da enzima
Medir a velocidade das transformações Verificar influência das condições de trabalho Correlacionar (equações ou modelos matemáticos) as velocidades das reações com os fatores que as afetam Otimizar processo Estabelecer parâmetros para controle de processo Projeto de reator
Cinética de Michaelis-Menten •
•
•
Baseado no conceito de formação do complexo Enzima - Substrato (ES) como intermediário no mecanismo de formação de produtos Primeiro a enzima combina-se com o substrato, formando o complexo ES, em um passo reversível e rápido A seguir, num passo mais lento, o complexo se desfaz, com reaparecimento da enzima livre e formação do produto
Efeito da concentração de substrato
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Curvas cinéticas para os componentes da reação enzimática: Estado Estacionário
Equilíbrio químico �� ��
A velocidade de reação entre A e B é proporcional às concentrações de A e B, l ogo:
No equilíbrio:
Reação catalisada por enzima
Reação catalisada por enzima Isolando as constantes:
Como k3 < k2 e k1 , ES → P é a etapa limitante do processo
(k4 é muito baixo) Definindo a velocidade relativa v/vMax: (após a mistura de E e S, ES permanece constante)
k3 < k2
Reação catalisada por enzima •
•
•
Efeito da concentração de substrato
O valor máximo de velocidade será obtido quando toda a enzima se encontrar na forma de complexo enzima – substrato
V = Vmax
� Parte A: v depende da [S]
- Parte B: v não aumenta proporcionalmente com aumento de [S] - Parte C: v não depende da [S], tendendo a um valor máximo (Vmax)
A equação de Michaelis – Menten expressa a relação quantitativa entre a velocidade inicial, a velocidade máxima e a concentração de substrato, por meio de Km Km é a constante de de Michaelis da enzima (ou do substrato, ou do complexo) – concentração de substrato à qual corresponde uma velocidade igual à metade da máxima
Cinética de ordem variável Cinética de 1ª ordem (Km >> [S])
V = Vmax [S]/k m = K[S]
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Efeito da concentração de substrato •
•
•
Método Lineweaver - Burk
A velocidade é proporcional à concentração de substrato (primeira ordem) para baixos valores de S (K m >> S) Para valores maiores de S (S >> K m ), a velocidade torna-se constante, de ordem zero e igual a Vmax
•
A determinação de V e Km a partir de valores experimentais pode ser feita pela linearização da equação de Michaelis – Menten
•
O método Lineweaver – Burk é bastante utilizado e consiste em inverter ambos os membros da equação
Quanto menor o valor de Km maior será a afinidade da enzima pelo substrato
Método Lineweaver - Burk •
•
•
Percebemos que 1/V varia linearmente com 1/S Os coeficientes angular e linear dessa reta são K m/Vmax e
Determine os valores de Km e Vmax para os resultados
da
seguinte
reação
enzimática
catalisada por uma protease
1/Vmax •
Exemplo
Com os valores experimentais de S e correspondentes valores de V, os coeficientes são determinados por regressão linear
Glicilglicina + H2O → 2 Glicina [S] (mmol L-1)
Velocidade (µmol L -1 s-1)
1,5
0,21
2
0,24
3
0,28
4
0,3
8
0,40
16
0,45
Exemplo ��� ��� ��� ��� ��� � �
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Isoenzimas: apresentam atividade sobre um mesmo substrato, porém apresentam
característicascomo sequência de aminoácidos, massa molecular, K M , V Max diferentes
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Inibição da atividade enzimática •
Processos pelos quais a atividade normal da enzima
é
reduzida
ou
•
eliminada
completamente •
Inibição da atividade enzimática •
Compostos que reduzem a velocidade da reação, por qualquer mecanismo, são chamados inibidores e podem se combinar
•
As enzimas estão sujeitas a inibições reversíveis ou irreversíveis Inibidores irreversíveis se ligam a um grupo funcional na molé cula de enzima para formar ligações covalentes e cineticamente estáveis, podendo levar a destruição desse grupo Inibidores reversíveis se ligam à enzima por ligações fracas, de forma reversível
com a enzima alterando sua atividade catalítica
Inibição da atividade enzimática •
O inib idor pode ser uma das substância s que participa da reação (substrato ou produto)
Inibição competitiva •
estrutural com o substrato e ambos competem
- Inibição da invertase por concentrações elevadas de sacarose - Inib ição da alfaamilase por dextrinas e pela maltose •
Inibidor competitivo tem grande semelhança pelo mesmo sítio ativo da enzima
•
A formação do complexo enzima – inibidor reduz a quantidade de enzima disponível para
A inibição reversível é que apresenta interesse prático e os dois tipos mais importantes são a inibição competitiva e não - competitiva
interação com o substrato com redução da velocidade da reação
Inibição competitiva
Inibição competitiva •
•
Como o inibidor se liga à enzima de forma reversível, a competição pode se tornar favorável ao substrato se for adicionado mais substrato ao meio Com altas concentrações de substrato no meio, será mínima a probabilidade de uma molécula de inibidor se ligar à enzima e a reação terá velocidade máxima normal
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Inibição competitiva •
Inibição competitiva
Entretanto, a concentração de substrato na qual v = vmax/2 ( valor de Km) estará aumentada na presença do inibidor
•
K M aumenta → menor afinidade da enzima pelo substrato
O efeito no valor de K m e a ausência de um efeito em v max são indicadores da inibição competitiva
Inibição não - competitiva •
Inibição não - competitiva
O inibidor não – competitivo interage com a enzima, ligando-se a um sítio ativo diferente daquele no qual se liga o substrato e não altera a conformação deste
•
Todas
as formações
de complexos
são
possíveis: enzima – substrato, enzima - inibidor, enzima – substrato - inibidor
Inibição não - competitiva •
•
•
•
Inibição não - competitiva
A enzima é inativada quando o inibidor está ligado, estando o substrato presente ou não Em qualquer caso, o complexo resultante é inativo, não formando produto O inibidor reduz efetivamente a concentração da enzima ativa e, consequentemente, diminui vmax O efeito sobre k M é pequeno ou nenhum
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Inibição Não-Competitiva: Recíprocos de Lineweaver-Burk
Inibição Irreversível •
Vmax diminui KM inalterado •
•
•
•
Inibição Irreversível
Exemplo: Presença de íons Fe2+ em caldo de cana – I nibição da invertase (Complexosestáveis com íons S2- da cisteína e metionina)
•
não
covalente
Não há modelo cinético Destruição de um grupo funcional essencial ao funcionamento da enzima Enzima não pode ser regenerada Inibidores irreversíveis podem ser úteis para preparações enzimáticas comerciais
Exercício •
Exercício
Ligação covalente ou particularmente estável
Uma enzima com K M de 2,6 x 10 -5 mol L-1 foi testada para uma concentração inicial de substrato de 0,3 mol L-1. A velocidade observada foi de 5,9 x 10-5 mol L-1 min-1. Se a concentração inicial de substrato fosse 2 x 10 -5 mol L-1,e admitindo-se estequiometria 1:1, qual seria o tempo necessário para a concentração do produto atingir 1,1 x 10 -5 mol L-1.
Referências Bibliográficas
A reação de conversão do citrato → oxaloacetato + acetato por
•
velocidade enzimática foram obtidos onde se investigou o efeito do inibidor Ca2+. Determine KM, Vmax, KI e o tipo de inibição
•
•
�Mg2+] mmol L -1
V sem Ca2+ (mmolL -1 s-1)
V com Ca 2+ (2,5 mmol L-1s-1)
V com Ca2+ (5 mmol L -1s-1)
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GALLO, L. A. BASSO, L. C. Fundamentosde Bioquímicapara Ciências Biológicas, Ciências dos Alimentos, Agronômicas e Florestais (apostila) ESALQ USP, 2012
uma enzima exige a presença de íons Mg2+. Os seguintes dados de
•
•
•
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. - Princípios de Bioquímica. São Paulo, Sarvier, 2006 SERPA, G.; PORTO, L. Introdução à Engenharia Genômica (apostila). UniversidadeFederal de Santa Catarina, 2005 Schmidell, W. et al. Biotecnologia Industrial. São Paulo: Edgard Blucher, vol.1 EngenhariaBioquímica,2001. Tortora, G.R. Microbiologia.8ª Ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. Notas de aula do professor André Aguiar. Engenharia Bioquímica, UFSJ CAP
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