Procesamientos De Muestras Microbianas M icrobianas Para Su Posterior Cultivo, Tinción Y Observación Descriptiva De Sus Morfologías E. Urdaneta; G. Avendaño; L. Rivera; O. Pabón Universidad Nacional Experimental Sur del Lago Laboratorio de Microbiología Microbiología General
Resumen En el presente documento se expondrá los procedimientos realizados para procesar muestras de cultivos, preparación, fijación y coloración simple de frotis y descripción morfológica de microorganismos (bacterias y hongos), de los cuales se utilizaron Bacillus Subtilis, levaduras, hongos filamentosos (mohos), se realizaron diluciones seriadas de una muestra de queso de las cuales se extrajeron unas porciones para sembrar en cajas de Petri además se realizaron siembras de un alimento evidentemente contaminado con mohos en cultivos de PDA y AA, para finalizar se procesaron tres muestras con distintos tipos de tinción para los cuales se utilizaron levadura, B. Subtilis y hongos filamentosos. En los cultivos encubados se lograron observar bacterias en colonias aisladas y hogos filamentosos debido a que provenían de alimentos contaminados por factores desconocidos. Palabras Claves: Agar , aislamiento, aislamiento, B. Subtilis, cultivos, frotis, hongos, incubación, queso, pan, tinción, zapote. Introducción El crecimiento microbiano es el número de microorganismos que crecen en un definido periodo de tiempo, y para determinado se debe hacer una suma de los ciclos celulares de los individuos que forman la población. Para que este crecimiento se realice es necesaria una fuente de energía y de esta manera formar proteínas. El aislamiento de microorganismos se hace mediante la ut ilización de medios de cultivos para así obtener colonias aisladas que puedan ser observables a simple vista. A partir de una sola célula se pueden obtener un gran número de las mismas; todo esto debe realizarse en un periodo de incubación a temperaturas ambientales normales, en el caso de que los microorganismos crezcan en un medio liquido las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente, mientras que los que crecen en un medio solido forman rápidamente colonia, y si el número que se siembran por unidad de superficie es elevado provoca una unión de colonias denominado césped, por el contrario en el caso de los hongos filamentosos en lugar de colonias se producen formaciones confusas. (Martinko M. Biología de los microorganismos-brock. 8ª Edición).
Un frotis consiste en la toma y posterior estudio de una muestra. Su función es la de aislar el microorganismo problema para poder visualizarlo fácilmente en el microscopio puesto a que se fija al portaobjetos, ya sea por calor pasándolo por un mechero, o con metanol, en caso de que las bacterias estén en un medio líquido. Al momento de distinguir la naturaleza de la muestra, se lleva a cabo el proceso de tinción, aplicando colorante al frotis. Esto permite discernir, observando en el microscopio óptico, si las bacterias son gram positivas o gram negativas, información relevante a la hora de describir y estudiar una bacteria, así como también su forma, teniendo presente, el tipo de microorganismo con el que se esté tratando y su estructura taxonómica. (José A. Cortes.. Preparación d e un frotis bacteriano 2.001). Objetivos Se tomaron y procesaron muestras microbiológicas a partir de distintos materiales, a su vez, se cultivaron y aislaron empleando diversas técnicas con el fin de caracterizar las colonias aisladas y así obtener cultivos puros de hongos y levaduras. De igual forma se aprendió las técnicas de preparación y observación de frescos a partir de medios sólidos y líquidos y se conocieron los métodos de preparación de frotis, fijación y coloración y posterior observación de microorganismos. Así como también se identificaron las principales formas de bacterias y las principales características morfológicas de los hongos. Materiales y Métodos Siembra de B. Subtilis: de un cultivo solido previamente realizado en una caja de Petri se tomó el inoculo con el asa de platino esterilizada con la cual se sembró en otra caja de Petri debidamente rotulada que poseía un medio de cultivo compuesto de agar nutritivo utilizando el método de estría simple. Además se realizó otra siembra con la misma bacteria la cual se encontraba en un medio líquido utilizando el método de siembra de estría en superficie formando tres planos distintos. Procesamiento de una Muestra de Queso: se realizó el corte y pesado de un gramo de la muestra y se procedió a triturarlo con agua peptonada, luego de que la misma se encontrase en las condiciones ideales se tomaron 2ml con los cuales 1ml se sembró en una caja de Petri con un medio de AN y el método de siembra en profundidad, el ml restante (1ml) se -2 -5 utilizó para realizar diluciones con agua peptonada desde 10 hasta 10 y de cada una de ellas se realizaron siembras con el método anteriormente nombrado. Cultivo de Hongos Filamentosos: de un pan que se encontraba en estado de descomposición y con evidente presencia de mohos se tomaron dos trozos los cuales se colocaron en cajas de Petri una de las cuales poseía un medio de AA y otra con Agar-PapaDextrosa, cabe destacar que el tiempo de incubación de todos los microorganismos estudiados fue de 24 horas aproximadamente.
Posteriormente se realizaron varios tipos de tinciones, primero la tinción simple de levadura la cual consistió en tomar un portaobjeto y rotularlo, luego se le agrego una gota del inoculo posteriormente se aplicó una gota de azul de metileno y se procedió a colocar el cubreobjetos y llevar al microscopio para su observación, en la siguiente tinción simple se utilizó un inoculo solido ( B. Subtilis) el cual se esparció en el portaobjeto con la ayuda del asa y una gota de agua destilada luego se colocó una gota de azul de metileno y para finalizar se protegió la preparación con el cubreobjeto para llevarla al microscopio, el siguiente procedimiento realizado fue el de la tinción de gram la cual consistió en primer lugar en la preparación de un frotis del inoculo solido del B. Subtilis para su posterior tinción siguiendo la técnica de gram de tinción diferencial, la última preparación fue la tinción simple de hongo se realizó con una fruta (zapote) infectado con un hongo filamentoso desconocido y consistió en tomar una cinta adhesiva transparente con la cual se cubrió la superficie infectada por el hongo para adherir parte de la estructura del hongo a la cinta luego esta se colocó en un portaobjetos que poseía una gota de azul de metileno y se continuo con su observación. Resultados
Siembra por estría simple y estría en superficie de un inoculo sólido y otro liquido del B. Suptilis en medio de AN.
Descripción macroscópica Colonia (color) Forma y textura
Apreciación
Muestra de B. suptilis Inoculo Solido Inoculo Liquido Estría simple Estría en superficie Beige Beige Organizadas en la trayectoria Organizadas en la trayectoria de zig-zag utilizada en la de zig-zag utilizada en la siembra y poseían una textura siembra y poseían una textura cremosa cremosa
Siembra por diluciones seriadas de una muestra de queso utilizando el método de siembra a profundad. Descripción macroscópica Colonia (color) Forma y textura
Microorganismo Desconocido -2 Muestra sin diluir Muestra diluida a 10 Blancas Blancas La forma apreciable era de La forma apreciable era de puntos muy pequeños puntos muy pequeños en pertenecientes a un solo tipo menor cantidad que la de bacteria y poseía una anterior pertenecientes a textura cremosa un solo tipo de bacteria y poseía una textura cremosa
Apreciación
-3
-4
Descripción macroscópica
Muestra diluida a 10
Muestra diluida a 10
Colonia (color) Forma y textura
Incoloras se formaron puntos con una apariencia de gotas de agua muy pequeñas y poseían una textura cremosa
Incoloras se formaron puntos con una apariencia de gotas de agua muy pequeñas en menor cantidad y más pequeñas y poseían una textura cremosa
Apreciación
Descripción macroscópica Colonia (color) Forma y textura
-5
Muestra diluida a 10 Incoloras se formaron puntos con una apariencia de gotas de agua muy pequeñas siendo estas las más diminutas de la serie de dilución y poseían una textura cremosa
Apreciación
Siembra de hogos filamentosos en medios de Agar-Agua y PDA. Descripción macroscópica Colonia (color) Forma
Muestra de hongos desconocido Muestra en medio de AA Muestra en medio de PDA Amarillo intenso y algunos puntos marrones Forma filamentosa entrecruzadas
Amarillo pálido y verde musgo Forma filamentosa entrecruzadas
Apreciación
Observaciones microscópicas de una levadura p or tinción simple. Muestra de Levadura Descripción microscópica Tinción simple con azul de metileno microorganismo (color) Verde Forma Ovoide Apreciación Microscópica a 40x
Observaciones microscópica del B. Subtilis con tinción simple de un inoculo sólido. Descripción microscópica Bacteria (color) Forma Apreciación Microscópica a 100x
Muestra de B. Subtilis Tinción simple con azul de metileno Azul Bacilos
Observaciones microscópicas del B. Subtilis con tinción de ganm de un inoculo solido Muestra de B. Subtilis Descripción microscópica Tinción de gram Bacteria (color) Moradas (gram positivas) Forma Bacilos Apreciación Microscópica a 100x
Observaciones microscópicas de hogos filamentosos con tinción simple con cinta adhesiva. Descripción microscópica microorganismo (color) Forma
Muestra de hongos filamentosos Tinción simple con azul de metileno Azules y traslucidos Presentaban forma filamentosa septada y se observaron las estructuras de los esporangios
Apreciación Microscópica a 40x
Discusión Referente a la primera experiencia la cual fue el estriado simple se logró notar que estuvo bien realizada aunque se pudieron haber formado estrías más unidas, se presume que esto sucedió por no tener suficiente agilidad en la mano. En la segunda experiencia que fue la de estriado de superficie no se pudieron observar los tres planos que se realizaron sino solo uno de ellos debido a que no se usó suficiente inoculo a pesar de la falta del mismo del primer estriado se corrió para el segundo y tercer cuadrante más sin embargo se pudieron observar colonias pero no tan aisladas. En las diluciones seriadas (con siembra a profundidad) se pudo observar que mientras más concentrada esta la muestra se va a formar una mayor concentración de bacterias -3 cumpliéndose así la tendencia incluso cuando la dilución fue de 10 ya se podían notar colonias aisladas que eran fáciles de cuantificar además que había la presencia de una sola bacteria , a diferencia del grupo 3 de la mañana el cual trabajo con leche se le podían notar dos tipos de bacterias las cuales eran difíciles de cuantificar pero en el caso planteado si se hubiesen realizado más diluciones no se hubiesen podido observar microorganismo.
En el caso de los hongos filamentosos sembrados A.A se observó que eran menos filamentosos que los que se sembraron en PDA y crecieron en menos proporción debido a que este medio no brinda los nutrientes necesarios para que se realiza un crecimiento acelerado en cambio lo que se sembraron en PDA tenían mayor cantidad de filamentos y crecieron a gran escala hasta el punto que cubrieron casi todo el fondo de la caja de Petri siendo evidente que este medio contenía mejores nutrientes para el crecimiento pleno de este hongo . Esto se corroboro con el resultado de otro grupo. En la observación microscópica de la levadura se pudo constatar su forma la cual era de células ovoides y que gracias a la tinción con azul de metileno tenían un aspecto verdoso, así mismo la observaciones hechas al B. Subtilis con la tinción simple se apreció su morfología, posteriormente en la observación diferencial de gram se observó que eran gram positivas. En la última observación la cual fue realizada a unos hongos filamentosos se apreciaron claramente sus estructuras con un aumento de 40x entre las cuales se identificaron las ifas septadas y esporangios en distintas fases de la reproducción los culés presentaban una forma de sacos estos presentaban una coloración azul más oscuras en las etapas más tempranas del ciclo y un tono de azul más claro en las etapas finales de la producción de esporas. Conclusiones En general se logró notar que en todas las muestras utilizadas se encontraban microorganismos es decir, bacterias, hongos filamentosos y levaduras; estas pudieron haber sido contaminadas en cualquiera de los procesos que se les realiza o incluso cuando se encontraban en los establecimientos donde se encontraban para la venta. En el caso del queso tal vez fue porque en el mismo lugar vendían carne y por el simple hecho de haber cortado con el cuchillo y este tuviese algún residuo de carne se pudo haber contaminado. Esto conlleva a pensar que por el simple hecho de consumir un alimento que no cumpla con las medidas sanitarias adecuadas y el consumidor lo desconozca por completo se pueden adquirir enfermedades producidas por algún microorganismo y eso que no se logró saber si eran patógenos o no, lo cual sería de gran importancia conocer. Referencias Bibliográficas
Edición.
Martinko M. 2.003 Biología de los microorganismos-brock. 8ª
José A. Cortes. 2.001 Preparación http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm
de
un
frotis
bacteriano
