Appostilas de Práticas de Microbiologia

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS  – UNIFAL-MG INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

MICROBIOLOGIA BÁSICA Roteiro de aulas práticas

Professores da Disciplina no 2º Semestre de 2014

 Amanda Latércia Tranches Dias Daniela Cristina de Macedo Vieira Jorge Kleber Chavasco Marília Caixeta Franco Ariosa  Ana Carolina Padovan Eliane de Oliveira Silva

ÍNDICE 1- INTRODUÇÃ INTRODUÇÃO O ............................... ................................................ .................................. .................................. .................................. ................................. ............................... ............... 3 2- NORMAS DE SEGURANÇA E TRABALHO NO LABORATÓRIO... LABORATÓRIO............. ................... ................... ................... ................. ........ 6 3- MÉTODOS DE COLORAÇÃO EMPREGADOS EMPREGADOS EM BACTERIOLOGIA: ....................... .............. .................. ................ ....... 8 SIMPLES, NEGATIVA E DE ESPOROS ............................................................................................... 8 4- MÉTODO DE COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM................... ......... ................... .................. ................... ................... ............... ...... 12 5- MÉTODO DE COLORAÇÃO COLORAÇÃO PELA TÉCNICA DE ZIEHL-NEELSEN (ÁLCOOL-ÁCIDO RESISTÊNCIA RESISTÊNCIA)) ................................. ................................................. .................................. .................................. ................................. ................................. ................................ ................ 15 6- PREPARO DE MEIOS DE CULTURA ............................................................................................ 17 7- MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE CONTROLE MICROBIANO................... ......... ................... .................. ................... ................... .................. ............. 20 8- TÉCNICA DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO ..................................................................... 21 9- AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE NA ESTERILIZAÇÃO ................... ......... ................... ............... ...... 22 10- LAVAGEM DAS MÃOS ................................................................................................................ 23 11- AVALIAÇÃO AVALIAÇÃO DA D A AÇÃO ANTIMICROBIANA DE ANTISSÉPTICOS E DESINFETANTES ..... 25 12- TÉCNICAS DE INOCULA I NOCULAÇÃO ÇÃO DE BACTÉRIAS BACTÉRIAS EM MEIOS DE CULTURAS ......................... ................ ......... 27 27 13- IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS ..................................................................... 30 14- IDENTIFICA I DENTIFICAÇÃO ÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS  –  PROVAS  PROVAS BIOQUÍMICAS ......... . ........ 34 34 15- ANTIBIOGR ANTIBIOGRAMA AMA............................... ................................................ .................................. ................................. ................................. .................................. ........................ ....... 40 16- PROPRIEDADE OLIGODINÂMICA DE METAIS ....................................................................... 43 17- ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS DO SOLO ....................................................................... 44 18- ALTERAÇÕES FENOTÍPICAS E GENOTÍPICAS ........................................................................ 45 19- UROCULTU UROCULTURA.......... RA........................... ................................. ................................. .................................. ................................. ................................. ................................. ................ 47 20- ESTUDO DOS FUNGOS ANEMÓFILOS ...................................................................................... 50 21- MÉTODOS PARA O ESTUDO DE LEVEDURAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES ................. 53

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ÍNDICE 1- INTRODUÇÃ INTRODUÇÃO O ............................... ................................................ .................................. .................................. .................................. ................................. ............................... ............... 3 2- NORMAS DE SEGURANÇA E TRABALHO NO LABORATÓRIO... LABORATÓRIO............. ................... ................... ................... ................. ........ 6 3- MÉTODOS DE COLORAÇÃO EMPREGADOS EMPREGADOS EM BACTERIOLOGIA: ....................... .............. .................. ................ ....... 8 SIMPLES, NEGATIVA E DE ESPOROS ............................................................................................... 8 4- MÉTODO DE COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM................... ......... ................... .................. ................... ................... ............... ...... 12 5- MÉTODO DE COLORAÇÃO COLORAÇÃO PELA TÉCNICA DE ZIEHL-NEELSEN (ÁLCOOL-ÁCIDO RESISTÊNCIA RESISTÊNCIA)) ................................. ................................................. .................................. .................................. ................................. ................................. ................................ ................ 15 6- PREPARO DE MEIOS DE CULTURA ............................................................................................ 17 7- MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE CONTROLE MICROBIANO................... ......... ................... .................. ................... ................... .................. ............. 20 8- TÉCNICA DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO ..................................................................... 21 9- AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE NA ESTERILIZAÇÃO ................... ......... ................... ............... ...... 22 10- LAVAGEM DAS MÃOS ................................................................................................................ 23 11- AVALIAÇÃO AVALIAÇÃO DA D A AÇÃO ANTIMICROBIANA DE ANTISSÉPTICOS E DESINFETANTES ..... 25 12- TÉCNICAS DE INOCULA I NOCULAÇÃO ÇÃO DE BACTÉRIAS BACTÉRIAS EM MEIOS DE CULTURAS ......................... ................ ......... 27 27 13- IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS ..................................................................... 30 14- IDENTIFICA I DENTIFICAÇÃO ÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS  –  PROVAS  PROVAS BIOQUÍMICAS ......... . ........ 34 34 15- ANTIBIOGR ANTIBIOGRAMA AMA............................... ................................................ .................................. ................................. ................................. .................................. ........................ ....... 40 16- PROPRIEDADE OLIGODINÂMICA DE METAIS ....................................................................... 43 17- ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS DO SOLO ....................................................................... 44 18- ALTERAÇÕES FENOTÍPICAS E GENOTÍPICAS ........................................................................ 45 19- UROCULTU UROCULTURA.......... RA........................... ................................. ................................. .................................. ................................. ................................. ................................. ................ 47 20- ESTUDO DOS FUNGOS ANEMÓFILOS ...................................................................................... 50 21- MÉTODOS PARA O ESTUDO DE LEVEDURAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES ................. 53

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1- INTRODUÇÃO O conhecimento não é material a ser fragmentado, as ciências se complementam e é vivendo esta totalidade que podemos compreender um pouco do funcionamento do universo.  A idéia i déia da criação de uma apostila de práticas de microbiologia surgiu com a finalidade de facilitar o entendimento das práticas exercidas por um profissional de microbiologia dentro de um laboratório, mas é importante deixar claro que teoria e prática andam juntas e que, normalmente, as aulas criadas têm resultados previsíveis pr evisíveis para o certo, o que não acontece em um laboratório. Porém, são estes resultados imprevisíveis, que levam às grandes descobertas e é daí que nasce a principal característica de um pesquisador, a persistência.

Importância da Microbiologia Seria muita pretensão de nossa parte achar que todas as pessoas que entram em contato com a microbiologia tornem-se grandes amantes da área. Porém, não podemos minimizar a importância desta ciência para o conhecimento conhecimento geral dos profissionais das ciências biológicas e para os das demais áreas. “Meu Deus, que maravilhas existem em uma criatura tão pequena!”, foi o relato de Leeuwenhoek em sua carta enviada para a Society de Londres em 1693, quando visualizou pela primeira vez os micro-organismos. Seres que fascinaram e ainda fascinam muitos cientistas, importantes por estarem em praticamente todos os lugares que se pode imaginar, gerando benefícios e malefícios para a sociedade.  A microbiologia, ciência ciência que estuda a vida em miniatura, miniatura, foi uma ferramenta criada pelos estudiosos a fim de ampliar os conhecimentos do mundo microscópico. Os micro-organismos, os seres minúsculos, apesar do tamanho, são seres muito complexos, estão em todas as partes do planeta, convivendo de forma harmônica ou não com o homem e outros seres, fundamentais para a sobrevivência na Terra. Participam ativamente de diversos ciclos biogeoquímicos, devolvendo para o meio ambiente os nutrientes essenciais, além de auxiliarem na degradação da matéria orgânica. Além disso, atuam nos processos de biolixiviação e biorremediação.  As indústrias, farmacêuticas e alimentícias, principalmente, deleitam-se com a grande capacidade desses seres produzirem metabólitos importantes para a produção de suas matérias primas. Mas o aspecto mais importante e que deve sempre ser lembrado, é que os microorganismos fazem parte da biosfera, bi osfera, são encontrados em quase todos os ecossistemas, sendo assim, qualquer fator que provoque um desequilíbrio em suas populações, estará afetando todo um ecossistema e, consequentemente, a biosfera. Estudar para conhecer e preservar estas formas de vida é a importante tarefa dos microbiologistas, uma vez que ainda há muito que se descobrir sobre o universo dos microorganismos.  Alfenas –  Alfenas – MG

2004

Os Autores

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Termos empregados no laboratório de microbiologia

Micro-organismo - Grupo de organismos, procariontes ou eucariontes, cujas estruturas morfológicas são, geralmente, observadas ao microscópio óptico e crescem em uma ampla faixa de temperatura. Microbiota normal  –   –  Conjunto de micro-organismos que vivem na pele ou em algumas superfícies internas do corpo dos animais, inclusive o homem, que não causam mal ao hospedeiro e estão altamente adaptados à sobrevivência e ao crescimento nessas áreas. Microbiota residente - Conjunto de micro-organismos que são encontrados regularmente em um dado sítio, sem causar doença. Microbiota transitória - Conjunto de micro-organismos que se instalam temporariamente no hospedeiro, podendo, com o tempo, desaparecer. Desinfecção - Processo de eliminação de micro-organismos patogênicos, em suas formas vegetativas, de material inanimado pelo calor ou substâncias químicas. Exemplo: uso de desinfetantes em salas cirúrgicas.  Anti-sepsia - Processo de eliminação de micro-organismos patogênicos, em suas formas vegetativas, de tecidos vitalizados por substâncias químicas. Exemplo: uso de polivinil pirrolidona – pirrolidona –iodo iodo para lavagem das mãos.  Assepsia - Conjunto de medidas que visam minimizar a entrada de micro-organismos micro-organismos num local asséptico, isto é, onde não existam micro-organismos ou estejam em baixo número. Exemplo: Utilização de cabine de fluxo laminar para manipulação de culturas. Esterilização - Conjunto de medidas que levam a destruição total dos micro-organismos de materiais inanimados podem ser empregados métodos físicos e químicos. Exemplo: autoclavagem de meios de cultura. Flambagem - Ato de eliminação dos micro-organismos de materiais inanimados pela ação do calor. Exemplo: alça de platina na chama do bico de gás. Repicagem – Repicagem – Transferência  Transferência do inóculo de micro-organismos micro-organismos para um novo meio de cultura. Meio de cultura – cultura  – É  É a fonte de nutrientes essenciais, necessária para o crescimento crescimento dos microorganismos. 4

Esfregaço - Camada de células de micro-organismos espalhada uniformemente na área central da lâmina de vidro (limpa). Inoculação – Inoculação – Introdução  Introdução de um micro-organismo micro-organismo em um meio de cultura. cul tura. Incubação  –   –  Exposição temporária de um micro-organismo em condições físicas e químicas ideais para o seu crescimento. crescimento. Membrana filtrante ou Millipore - Filtros de celulose com diâmetros de poros variados, suficientes para reter os micro-organismos. micro-organismos. Usados para a filtração de substâncias substâncias termolábeis como soro, antibióticos, vitaminas, colírios.  Apresentação de equipamentos equipamentos e materiais utilizados no laboratório laboratório de microbiologia

Materiais:

Equipamentos:

 Alça e agulha de platina

 Autoclave

Bico de Bunsen

Banho Maria

Cemitério

Centrifuga

Descarte

Cabine de fluxo

Lâmina

Esterilizador de alça

Lamínula

Estufas

Pêra

Leitor de Microplacas (Elisa)

Placa de Petri

Liofilizador

Pipetas

Microscópio

Pipetas semi-automáticas semi-automáticas

Microondas

PVPI

pHmetro

Recipiente de sulfocrômica

Shaker

Suporte de pipetas Termômetro Tubo

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2- NORMAS DE SEGURANÇA E TRABALHO NO LABORATÓRIO Nas aulas práticas trabalharemos, muitas vezes, com micro-organismos patogênicos para o ser humano. Por isso, torna-se necessário adotarmos medidas preventivas de segurança, para evitar possíveis contaminações: 1. Observe o horário de início das aulas práticas, a fim de evitar contratempos na execução dos trabalhos estipulados; 2. É obrigatório o uso do avental, luvas e óculos de proteção em todo trabalho prático onde há riscos de contaminação microbiana; 3. Não é permitido fumar, comer ou beber no ambiente do Laboratório; 4. Evite tocar os olhos, boca ou nariz com as mãos; 5. Não faça uso de lenços ou avental para limpar objetos ou instrumentos de trabalho, principalmente a objetiva do microscópio. 6. Lave sempre as mãos após manusear culturas ou materiais contaminados com microorganismos, patogênicos ou não; 7. Comunique imediatamente ao responsável, qualquer suspeita de haver contraído enfermidade como conseqüência de infecção no Laboratório; 8. Trabalhe sempre de maneira ordenada, tranqüila, constante e metódica; 9. Evite conversas desnecessárias, principalmente com as pessoas que estejam trabalhando, pois a concentração é indispensável para o sucesso da atividade prática; 10. Anote todos os detalhes da atividade prática para a elaboração do relatório; 11. Limpe e desinfete a superfície da bancada de trabalho antes e após o trabalho de cada dia; 12. No caso de derramamento acidental de material contaminado com micro-organismos, desinfete imediatamente o local; 13. Tome cuidado na pipetagem de soros, soluções antigênicas ou suspensões de microorganismos, utilizando para tal propósito pipetas semi-automáticas (não use pipetagem com a boca); 14. Flambe a boca de tubos de ensaio ou outros frascos que contenham culturas, após a retirada de tampas ou tampões de algodão e, também, antes de recolocá-los; 15. Não coloque de qualquer modo sobre a mesa o instrumental, alças e agulhas de platina, após ter sido utilizado; esterilize-o antes de guardá-lo. Há um “cemitério” para as placas e tubos contaminados e depósito próprio para pipetas, lâminas e lamínulas contaminadas. Algodão, gaze, papel-toalha e papel de filtro, quando não contaminados, deverão ir para a lata de lixo; quando contaminados, deverão ir para o saco branco, apropriado para esta finalidade. 16. Nunca deixe placas de Petri e tubos de ensaio abertos desnecessariamente sobre a bancada; 17. Antes de acender o bico de Bunsen, verifique se a entrada de ar está na posição correta; risque o fósforo e abra a chama convenientemente. Para desligar, feche primeiro o registro da bancada, espere até esgotar todo o gás e, então feche o registro do bico de Bunsen; 18. Após a utilização do microscópio, diminua ao mínimo a intensidade de iluminação, desligue-o, coloque-o na posição inicial, retire a lâmina e limpe suas objetivas com papel da bancada ou lenço de papel, sem esfregar até que retire todo o óleo; 19. Não retire ou forneça qualquer cultivo ou material do laboratório sem a prévia autorização dos responsáveis pelo mesmo; 20. Utilize todo material com o máximo de cuidado e atenção a fim de evitar perdas desnecessárias; 21. Não deixe, desnecessariamente, abertas as portas de armários, geladeiras e estufas. 6

22. Após a utilização de reagentes e soluções, retorne os frascos aos seus locais de origem; 23. Antes de conectar qualquer aparelho a tomada, verifique se a voltagem é a correta; 24. Qualquer dúvida sobre o seu modo de agir no Laboratório esclareça com os responsáveis pelo mesmo; 25. Ao sair do Laboratório no final da jornada de trabalho, verifique se não há aparelhos e lâmpadas ligados desnecessariamente.

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3- MÉTODOS DE COLORAÇÃO EMPREGADOS EM BACTERIOLOGIA: SIMPLES, NEGATIVA E DE ESPOROS  A visualização de bactérias após o emprego de métodos de coloração foi introduzida por Robert Koch em 1876, baseando-se em observações anteriormente feitas por Goeppert & Cohn em 1849. Os corantes quanto à origem podem ser classificados como naturais e artificiais. Quanto à natureza química os artificiais são classificados em ácidos, básicos e neutros. Dentre os corantes naturais temos o carmin e a hematoxilina. Já entre os corantes artificiais podem ser destacados os seguintes: Corantes básicos:  cristal violeta, violeta de genciana, azul de metileno, fucsina básica, verde malaquita, etc. Corantes ácidos: Fluoresceína, eosina, vermelho do congo, etc. O corante possui um cromóforo que pode ser negativo (corante ácido ou aniônicos) ou positivo (corante básico ou catiônico). Os corantes ácidos têm forte afinidade por constituintes positivos da célula como as proteínas. Os corantes básicos têm afinidade por constituintes negativos da célula, como os ácidos nucléicos e componentes da parede celular. Estes últimos são ideais para corar bactérias, pois o ácido nucléico está disperso no citoplasma.  As principais etapas do preparo de um espécime microbiano corado para exame microscópico são: confecção de um esfregaço a partir de uma camada fina do espécime sobre uma lâmina de vidro, fixação do esfregaço à lâmina, normalmente pelo calor e coloração com um ou mais corantes.  A coloração simples é utilizada para visualizar tipos morfológicos e arranjos celulares. Neste processo o esfregaço é corado por um único reagente. Corantes básicos são os preferidos. Os mais utilizados são o azul de metileno, cristal violeta ou a fucsina carbólica.  A coloração negativa é indicada em situações especiais, tais como a necessidade de observar a célula sem distorções, pois não há fixação pelo calor, ou ainda, observar microscopicamente micro-organismos tênues e difíceis de corar, como é o caso dos espirilos. Emprega-se corante acídico, tal como a eosina ou a nigrosina. O corante ácido, com sua porção cromógena carregada negativamente, não penetra na célula devido à carga negativa da superfície da mesma. A célula após o processo aparecerá não corada contra fundo escuro (fortemente corado). Coloração de esporos:  espécies de bactérias anaeróbicas dos gêneros Clostridium e Bacillus, são exemplos de organismos que tem a capacidade de existir tanto na forma metabolicamente ativa denominada de célula vegetativa, como também em células inativas chamadas de esporos. Essa estrutura intracelular é formada quando as condições ambientais tornam-se desfavoráveis para manter a atividade da célula vegetativa. O esporo é constituído por uma parede (composta de peptidoglicano e dipicolínato de cálcio), o córtex (composto de peptidoglicano com ligações menos rígidas), uma capa (composta de proteínas rica em ligações dissulfetos intramoleculares) e exósporo (membrana lipoprotéica que contém aminoaçucares. A capa do esporo confere resistência a agentes químicos). Devido sua estrutura, o esporo é resistente a efeitos deletérios como o calor excessivo, radiações, ação de agentes químicos, etc. Quando as condições ambientais tornam-se favoráveis, o esporo germina, assumindo a forma vegetativa da bactéria. O método de coloração de esporos de Wirtz-Conklin baseia-se no grau de afinidade que a estrutrura do esporo possui ao corante. Nesse método, é usado o verde de malaquita a quente como corante principal. Devido à ação drástica do calor sobre a célula e o esporo há penetração do verde-malaquita. No esporo o corante resiste a lavagem com água, porém, as estruturas vegetativas (células) não retêm esse corante e se descoram. Em seguida é usada a safranina, como corante de contraste, que cora a estrutura vegetativa de vermelho ou rósea. 8

Atividades Práticas Preparo dos esfregaços de micro-organismos Limpe a lâmina de vidro com papel, flambe-a e deixe esfriar a temperatura ambiente; Esterilize a alça de repicagem; Aguarde até a alça esfriar; Se a cultura estiver em meio liquido, transfira uma gota da cultura para o centro da lâmina. Se a cultura estiver em meio sólido, transfira uma gota pequena de água para o centro da lâmina e em seguida, com auxílio da alça (esterilizada) retire uma pequena porção, tocando levemente na superfície do meio de cul tura;  Espalhe a cultura sobre a parte central da lâmina e deixe o esfregaço secar ao ar;  Passe a parte de baixo da lâmina sobre a chama por três vezes para fixar o esfregaço;  Deixe a lâmina esfriar. Identifique-a com lápis de cera na parte superior (com um número). Circule o esfregaço pelo lado inverso da lâmina.

   

Coloração simples  Preparar o esfregaço segundo técnica acima, utilizando cultura de micro-organismo já identificado (padrão *).  Cobrir o esfregaço com a solução de um corante e deixar o tempo estipulado. Se empregar azul de metileno deixar 2 minutos, cristal violeta: 1 minuto e fucsina carbólica: 30 Segundos, Lavar a lâmina em água corrente e deixar secar ao ar;  Observar em microscópio com objetiva de imersão (100x).  Anotar os resultados.  Interpretação dos resultados: Observar a forma e o arranjo, em seguida desenhar. *

Culturas padrões:

Staphylococcus aureus e Bacillus cereus.

Forma

 Arranjo

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Coloração negativa  Colocar uma pequena gota de eosina a 2%, sobre a superfície de lâmina de vidro;  Transferir para a lâmina, com o auxílio de alça de platina, pequena porção da cultura de Bacillus cereus. Homogeneizar com a própria alça de platina, procurando espalhar o material na região central da lâmina; Secar ao ar;  Examinar em microscópio com objetiva de imersão (100x). Leveduras deverão ser observadas com objetiva a seco (40x);  Anotar os resultados.  Interpretação dos resultados: Observar e desenhar a forma e o arranjo.

Forma

 Arranjo

Coloração de esporos  Preparar esfregaço a partir da cultura de 48-72 horas de Bacillus cereus.  Cobrir o esfregaço com solução de verde malaquita a 5% em água destilada e deixar a lâmina sobre a superfície de placa aquecida durante 3 minutos, tendo o cuidado de não deixar ferver o corante. Colocar poucas lâminas de cada vez. Podemos utilizar também o aquecimento pela ação direta de uma chama;  Lavar a lâmina em água corrente;  Cobrir o esfregaço com solução de safranina durante 30 segundos. Escorrer o corante e lavar em água corrente;  Secar a lâmina e observar em microscopia de imersão.(100X)  Interpretação dos resultados: Observar a forma e o arranjo, em seguida desenhar.

Forma

 Arranjo

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Materiais utilizados para execução das técnicas de coloração: Lâminas de vidro, corantes, óleo de imersão, placa de aquecimento, culturas de microorganismos. Normas para a observação de micro-organismos ao microscópio óptico

Oculares Prisma Revólver Objetivas Platina Lâmpada

Braço Mesa de platina Botão macrométrico Botão micrométrico Condensador

Base  Gire o revólver (sem segurar nas objetivas), encaixando a objetiva de menor aumento (4X);  Coloque a lâmina sobre a platina, prenda-a com a presilha;  Verifique se o botão de intensidade luminosa está no mínimo;  Acenda a luz do microscópio;  Regule a quantidade de luz utilizando o diafragma e abaixando o condensador;  Movimente o botão macrométrico até seu ponto máximo levantando a platina;  Olhando pela ocular e utilizando o parafuso macrométrico, abaixe lentamente a platina até focalizar o material. Utilize o micrométrico para corrigir a focalização;  Observação: Certifique-se de que o material foi focalizado, movimentando o charriot.  Encaixe a objetiva de 10 X e focalize com auxílio do botão micrométrico;  Selecione com o charriot uma área contendo micro-organismos;  Coloque uma pequena gota de óleo de imersão sobre a lâmina no local onde a objetiva de 100X será colocada (sob o feixe luminoso); Encaixe a objetiva de 100 X. Suba cuidadosamente a platina com o macrométrico até encostar na objetiva de imersão;  Olhando pela ocular e utilizando o parafuso macrométrico abaixe a platina até focalizar o material;  Anote seus resultados  Para desligar o microscópio diminua a intensidade luminosa, desligue o fio da tomada. Gire o revólver, encaixando a objetiva de menor aumento e limpe a objetiva de imersão com papel higiênico. Coloque a capa no microscópio.

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4 - MÉTODO DE COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM O método de coloração diferencial de Gram foi descrito em 1884 pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachin Gram. Sua finalidade é facilitar a observação microscópica das bactérias e separá-las em dois grupos, segundo a cor revelada pelas mesmas ao final do processo de coloração. O método não se aplica a todas as espécies de bactérias, além disso, não é um método diferencial para fungos, uma vez que todos eles são Gram positivos. O processo de coloração é iniciado com a aplicação de um corante primário (cristal violeta) sobre o esfregaço, cuja função é corar todas as células bacterianas pertencentes aos dois grupos. A seguir aplica-se o lugol, que forma um complexo insolúvel e de difícil remoção, através de ligações com o corante primário. Em seguida, aplica-se o descorante (álcool e acetona). Dependendo da composição química dos componentes celulares, o agente da descoloração pode ou não remover da célula o complexo formado pelo corante primário da célula. Finalmente, é aplicado o corante final (fucsina ou safranina), que tem cor contrastante em relação ao corante primário. Se o corante primário não for removido após o processo de descoloração o corante final não será absorvido, neste caso a célula retém a cor inicial (roxo). Quando ocorre a remoção do complexo formado pelo corante primário e lugol, os componentes celulares descorados assumem a cor do corante final (vermelho).

Atividades Práticas Técnica da coloração:  Preparar o esfregaço em lâmina de vidro, conforme procedimentos detalhados anteriormente;  Coloque a lâmina sobre o suporte e cubra toda a região do esfregaço com cristal violeta.  Aguardar 1 minuto; escorrer o corante, não sendo necessário lavar a lâmina em água corrente.  Cobrir o esfregaço com solução de Lugol. Aguardar 1 minuto; escorrer o lugol, não sendo necessário lavar a lâmina em água corrente.  Com a lâmina inclinada, proceder a descoloração com Álcool Acetona, gotejar o descorante, por tempo rápido (máximo 3 segundos). Lavar em filete de água corrente;  Cobrir o esfregaço com solução de fucsina. Aguardar 30 segundos; Lavar em filete de água corrente;  Secar a lâmina ao ar e examiná-la microscopicamente, empregando objetiva de imersão (100 X), conforme instruções do roteiro de normas para a observação de microorganismo ao microscópio óptico.  Anotar os resultados: células coradas em roxo: Gram positivas, células coradas em vermelho: Gram negativas. Culturas Empregadas: Staphylococcus aureus, Streptococccus pyogenes, Proteus mirabilis .

Interpretação dos resultados: Observar a forma, o arranjo e o comportamento cromogênico da célula frente ao método de Gram.

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Micro-organismo 1:_________________________________________

Forma

Arran o

Coloração

Micro-organismo 2: ___________________________________________

Forma

Arran o

Coloração

Micro-organismo 3: ___________________________________________

Forma

Arran o

Coloração

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Anexos Composição das soluções utilizadas na coloração diferencial de GRAM Solução Estoque de cristal violeta do Gram cristal violeta etanol

20g 100 mL

Solução de oxalato de amônio 1% oxalato de amônio água destilada

1g 100 mL

Solução de uso do cristal violeta cristal violeta (estoque) solução de oxalato de amônio 1%  Água destilada

1 mL 40 mL 10 mL

Solução de iodo-iodeto (lugol) iodo metálico iodeto de potássio bicarbonato de sódio água destilada

1g 2g 3g 300 mL

Solução para descoloração mistura v/v de acetona e etanol 95% Solução estoque de safranina safranina etanol 95%

2g 100 mL

Solução de uso da safranina Misturar 1 parte da solução estoque com 5 partes de água destilada.

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5- MÉTODO DE COLORAÇÃO PELA TÉCNICA DE ZIEHL-NEELSEN (ÁLCOOL-ÁCIDO RESISTÊNCIA)  A maioria das espécies bacterianas é corada por métodos simples ou pela técnica de Gram. Porém, espécies de alguns gêneros, particularmente Mycobacterium, são resistentes à coloração por tais métodos, podendo, entretanto, ser visualizadas pelo método de ZiehlNeelsen.  As micobactérias possuem fina camada de cera de natureza lipídica, denominada de cera D, envolvendo a parede celular. A cera D dificulta a penetração de corantes, tais como o cristal violeta e o azul de metileno.  A fucsina carbólica (corante primário) é um derivado fenólico que é solúvel em material lipídico da parede celular de micobactérias. A penetração desse corante, através da camada lipídica (cera) em direção ao citoplasma, é facilitada pela aplicação de calor. Após esse tratamento, todas as células bacterianas, possuindo ou não cera D, são coradas de vermelho.  A fucsina carbólica não pode ser removida das micobactérias, mesmo que sejam utilizados processos drásticos, tal como o tratamento com soluções álcool-ácidas (descorante). Devido a essa propriedade, estes micro-organismos são denominados de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) e continuam corados de vermelho. Porém, a aplicação de mistura de álcool etílico e ácido clorídrico (descorante) remove o corante de todas as bactérias que não possuem a camada de cera D, tornando-as incolores. Para a visualização dessas bactérias é utilizado um corante de contraste, o azul de metileno, que cora as células de azul.

Atividade Prática  Preparar esfregaços empregando células mortas de BCG (Bacilos de Calmete Guerin)  Cobrir o esfregaço com solução de fucsina carbólica (Ziehl). Com auxílio de chumaço de algodão embebido em álcool, aquecer a lâmina até a emissão de vapores, não deixando a lâmina secar, adicionando mais corante. O processo de aquecimento deverá durar cerca de 5 minutos;  Lavar a lâmina em água corrente;  Descorar o esfregaço com solução de álcool-ácido clorídrico, adicionando o descorante gota a gota, até que não remova mais corante;  Lavar novamente a lâmina em água corrente;  Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno durante 2 minutos;  Lavar a lâmina, secar e observar em microscopia de imersão (objetiva 100X), conforme instruções do roteiro de normas para a observação de micro-organismo ao microscópio óptico.

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Interpretação dos resultados observados na lâmina Bacilos corados em vermelho: Positivo para a técnica de BAAR Bacilos corados em azul: Negativo para a técnica de BAAR

Forma

Arran o

Coloração

Anexos Reagentes 1 - Fucsina carbólica (Fucsina de Ziehl) Solução A Fucsina básica  Álcool etílico

0,3 g 10 mL

Solução B Fenol  Água destilada

5g 10 mL

Misturar as soluções A e B. 2 - Mistura Álcool-Ácido (Descorante)  Álcool etílico 95%  Ácido clorídrico concentrado

97 mL 3 mL

3 - Azul de Metileno  Azul de metileno  Água destilada

0,3 g 100 mL

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6- PREPARO DE MEIOS DE CULTURA  A composição dos meios de cultura utilizados para o crescimento dos micro-organismos no laboratório, normalmente, possui grande parte dos nutrientes disponíveis no habitat natural dos mesmos e devem possuir todos os elementos que compõem a célula, tais como C, N, P, O, H, S, etc.  Alguns micro-organismos podem viver da matéria orgânica morta (saprófitas), outros parasitando os organismos vivos. Os meios podem ser sólidos, líquidos, semi-sólidos ou bifásicos. Os líquidos são usados para produção de biomassa, em fermentação e em estudos de crescimento. Os sólidos para isolamento do micro-organismo e contagem do número de células. Os semi-sólidos para estudos de motilidade e para detecção de placas de lise em culturas bacterianas infectadas por vírus. Os bifásicos para hemocultura (técnica destinada a evidenciar os micróbios acaso existentes no sangue, e que consiste em pôr certa quantidade de sangue em meio nutritivo apropriado à proliferação deles). O agente solidificante do meio de cultura é o ágar, que possui a propriedade de se fundir a 96ºC e solidificar a 45ºC. São encontradas algumas denominações especiais dos meios de cultura, relacionadas à sua composição ou função. Temos meios sintéticos, como o meio mínimo que fornece somente os nutrientes essenciais ao desenvolvimento celular. O meio diferencial contém substâncias que permitem diferenciar grupos de micro-organismos. O meio de enriquecimento favorece determinadas populações que terão maior número de células, enquanto o meio seletivo possui substâncias (antibióticos) que inibem o crescimento de determinadas populações.  Alguns fatores físicos interferem no crescimento microbiano: pH, temperatura, oxigênio, luz e salinidade. Esses devem ser considerados quando o micro-organismo for cultivado no laboratório. Para a maioria das bactérias o pH ótimo de crescimento varia entre 6,5 a 7,5.

Atividades Práticas 1. Preparo de alguns meios de cultura Preparar os meios de cultura conforme demonstrado pelo instrutor e seguindo as instruções abaixo: Bancada 1 – Preparar 100 mL de ágar BHI (conforme instru ções do rótulo) e distribuir 7 mL em tubos médios. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em um recipiente de plástico. Embalar e identificar os materiais; Bancada 2 – Preparar 100 mL de ágar nutriente (conforme instruções do rótulo) e transferir 16 mL para tubos grandes. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em um recipiente de plástico. Embalar 6 placas de Petri. Embalar e identificar os materiais; Bancada 3 – Preparar 50 mL de caldo BHI (conforme instruções do rótulo) e distribuir 3 mL em tubos pequenos. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em um recipiente de plástico. Embalar e identificar os materiais; Bancada 4  – Preparar 100 mL de ágar Nutriente (conforme instruções do rótulo). Colocar em balão e fechar com tampão. Embalar 6 placas de Petri. Embalar e identificar os materiais;

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2. Esterilização dos meios O meio de cultura e as placas de Petri serão esterilizados, em autoclave a 120 ºC por 15 minutos a 1 atmosfera. Posteriormente 15 mL de ágar nutriente, preparado pelos alunos da bancada 1, serão vertidos na placas de Petri. Os tubos preparados pelos alunos da bancada 4 serão colocados para solidificar na posição inclinada. 3. Armazenamento dos meios O meio, após seu preparo e esterilização, deve ficar à temperatura ambiente até seu resfriamento e, posteriormente, ser armazenado em geladeira devidamente identificado (nome do meio, data de fabricação, etc.) de uma forma clara a fim de que mesmo um estranho ao laboratório possa identificá-lo. Composição dos meios de cultura a - Ágar Nutriente ou Ágar Simples Peptona Extrato de carne  Ágar  Água destilada

5,0 g 3,0 g 15,0 g 1.000 mL

1. Em balão acrescentar os componente do meio em 100 mL de água destilada. 2. Aquecer com agitações freqüentes e ferver por 1 minuto para a dissolução completa. 3. Distribuir em recipientes apropriados e autoclavar a 121°C por 15 minutos. b - Caldo Nutriente ou Caldo Simples Composição e preparo como mencionado em “a”, sem a presença de ágar. c- Agar BHI O meio é comercialmente fornecido desidratado (pó). Sua composição aproximada é a seguinte: Fórmula por litro Infusão de cérebro e coração Tecido animal enzimaticamente digerido Caseina hidrolizada 16 g Dextrose Cloreto de sódio Fosfato dissódico  Agar

8g 5g 2g 5g 2.5 g 13.5 g

O pH final deve ser ajustado a 7.4 ± 0.2 a 25°C  A fórmula pode ser ajustada e/ou suplementada de acordo com as exigências da cultura.. 1. Suspender do meio desidratado uma quantidade suficiente para 100 mL de água destilada. 2. Aquecer com agitações freqüentes e ferver por 1 minuto para a dissolução completa do 18

3. Distribuir em recipientes apropriados e autoclavar a 121°C por 15 minutos. d - Caldo BHI Composição e preparo como mencionado em “c”, sem a presença de ágar. e- Base para o Agar Sangue Fórmula por litro: Peptona Digesto de fígado bovino Extrato de levedura Cloreto de sódio  Agar

15 g 2,5 g 5g 5g 12 g

1. Pesar uma quantidade do meio desidratado suficiente para 100 mL de água destilada . 2. Aquecer com agitações freqüentes e ferver por 1 minuto para a dissolução completa do 3. Distribuir em recipientes apropriados e autoclavar a 121°C por 15 minutos.

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7- MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO 1- Calor 1.1- Úmido: Autoclave Materiais: Balão com meio sólido, caixa de ponteira, balão com água, tubo  – limpos. Lâminas usadas, tubos com micro-organismos - descarte. 1.2- Seco: Estufa de esterilização (ar quente) Pipeta de vidro, placa de petri, utensílios (pinça, espátula) – limpos. Chama direta Bico de bunsen, alça de platina e balão. 2- Filtração Substâncias liquídas Material: membrana filtrante, seringa, água contaminada, pó (antibiótico ou similar), eppendorf, placas; micro-organismos pelo sistema HEPA: câmara de fluxo;  Água pelo sistema milli-Q 3- Baixa temperatura: freezer e ultrafreezer 4- Alta pressão 5- Dissecação: liofilizador 6- Pressão osmótica 7- Radiação 7.1- Ionizante: raios gama, raio X - Material: placa de petri descartável, seringa, luvas, cateter 7.2- Não ionizante: raio U.V - Exemplo: câmara de fluxo laminar. Métodos Químicos de Controle Microbiano Tipos de desinfetantes fenol bifenol biguanidas halogênios: PVPI álcoois: etanol e isopropanol metais pesados: nitrato de prata antibióticos: tubo com antibiótico

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8 - TÉCNICA DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO Exame microbiológico da água com membrana filtrante Os métodos de esterilização empregados em microbiologia utilizam temperatura, radiação ou filtração para eliminação do micro-organismo de materiais, instrumentos, meios de cultura, soluções ou, ainda, para impedir sua liberação ou penetração num determinado ambiente. Em 1884 Charles Chamberland descreveu o uso de um filtro de porcelana porosa para remover bactérias da água potável. Os filtros existentes são de porcelana porosa, vidro sinterizado ou de celulose. Os filtros de partículas de ar de alta eficiência (HEPA) são usados nas cabines de segurança biológica e salas de cirurgia. São de celulose e foram desenvolvidos para promover segurança contra aerossóis contaminados, retendo quase 100% dos micro-organismos manipulados na câmara. Normalmente são usadas para a filtração de substâncias que são termolábeis como soro, antibióticos, vitaminas, colírios, etc. Após a filtração, o liquido já estéril deve ser coletado em um recipiente limpo e estéril. Como elas não conseguem reter os vírus, elas são usadas para separá-los de outros micro-organismos, permitindo assim seu isolamento para estudos posteriores.  A capacidade das membranas filtrantes de reterem os micro-organismos sem matá-los faz com que elas possam ser utilizadas para exames microbiológicos de líquidos. A membrana concentra os micro-organismos de um grande volume de amostra. A técnica é sensível para líquidos com pequena contaminação.

Atividade Prática 1. 2. 3. 4.

Esterilizar por autoclave um conjunto para filtração de líquidos; Acoplar uma membrana filtrante 0,2µ estéril na base do conjunto; Conectar o conjunto na bomba a vácuo; Com auxilio de alça de platina transferir um pouco de água (ou leite) não filtrado para o meio de cultura fazendo estrias; 5. Colocar 100 ml de água (leite) sobre o recipiente; 6. Ligar bomba de vácuo (pressão negativa) e após filtração desligá-la; 7. Colocar a membrana filtrante sobre o meio de cultura de uma placa de petri; 8. Com auxilio de alça de platina transferir um pouco de água (ou leite) filtrado para o meio de cultura fazendo estrias; 9. Incubar as placas de petri a 37ºC por 28-24 h; 10. Observar resultados:  Membrana filtrante: crescimento de colônias de micro-organismos.  Placa com água (leite) não filtrada: crescimento de colônias de microorganismos  Placa com água (leite) filtrada: ausência de crescimento.

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9- AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE NA ESTERILIZAÇÃO O processo de esterilização através do uso da autoclave é obtido após 15 minutos a 121°C. O método é muito utilizado na esterilização de materiais cirúrgicos, meios de cultura etc. Dada a sua constante utilização no laboratório, torna-se necessário verificar periodicamente a sua eficiência. Tal verificação pode ser r ealizada utilizando bioindicador. Robert Koch utilizava como bioindicador, esporos de Bacillus anthracis, os quais são destruídos a 121 ºC em 15 minutos. Na atualidade, utilizam-se espécies de bactérias não patogênicas com resistência térmica conhecida, como por exemplo esporos do Geobacillus sthearothermophilus que são destruídos em autoclave a 121 ºC após 15 minutos. STERIKON R, bioindicador da MERCK, é composto por ampola que contém caldo nutriente, açúcares (glicose), indicador de pH (púrpura de bromocresol) e esporos do Geobacillus sthearothermophilus (ATCC 7953) não patogênico. FUNDAMENTO: Devido a termo-resistência dos esporos quando aquecidos em vapor sob pressão, só serão destruídos a temperatura de 121 ºC por 15 minutos. Se houver esterilização, não haverá crescimento posterior do Geobacillus sthearothermophilus.  Caso contrário, ocorrerá seu desenvolvimento.

Procedimento:  colocar ampola contendo esporos de Geobacillus sthearothermophilus  junto com o material a esterilizar;  realizar o processo a 121 ºC por 15 minutos;  após a autoclavagem, incubar a ampola, juntamente com uma ampola controle (que não sofreu o processo de autoclavação), em banho-maria a 56 ºC; por 24-48 horas;  após tal procedimento, realizar a interpretação do teste. Interpretação Ocorrendo a esterilização, a solução contida na ampola permanecerá violeta, não havendo mudança do indicador (púrpura de bromocresol). Não ocorrendo esterilização, os esporos se transformarão em bactérias ativas (formas vegetativas), turvando o caldo. A fermentarão da glicose com a conseqüente produção de ácido, modificará o indicador tornando a solução amarela.

O uso de fitas reativas para verificar a autoclavação: São fitas adesivas empregadas para selar volumes que serão submetidos à ação da autoclave. Estas fitas contem substância química que muda da cor branca para vários tons de castanho, até ao negro, de acordo com o grau de aquecimento a que foi submetida. É útil para nos revelar que o material atingiu certa temperatura, mas não indica que o mesmo está estéril. As fitas indicadoras auxiliam na diferenciação dos pacotes que já passaram pelo processo de esterilização, evitando que pacotes não processados sejam utilizados.  Ao término de um procedimento correto de esterilização, os produtos no interior da autoclave estarão esterilizados. O ar da sala contém partículas de poeira que podem conter micro-organismos. Logo, ao remover a carga da autoclave, esta será superficialmente contaminada. Além do mais, normalmente os artigos esterilizados são armazenados por algum tempo antes de serem utilizados. O material deve ser acondicionado em embalagens para evitar a recontaminação após a esterilização. Ao mesmo tempo, o material da embalagem deve ser adequado para permitir a esterilização dos artigos contidos dentro da mesma. 22

10 - LAVAGEM DAS MÃOS  As mãos devem ser lavadas antes e após todo e qualquer procedimento. É a lavagem das mãos que evita a infecção cruzada, ou seja, a veiculação de micro-organismos. A lavagem das mãos, tem por finalidade: diminuir o número de micro-organismos; eliminar sujidade, substâncias tóxicas e medicamentosas; evitar a disseminação de doenças; proteger a saúde do profissional.  As mãos devem ser lavadas: sempre que entrar ou sair da Unidade de Internação; sempre que estiverem sujas; antes e após contato com o paciente; após contato com fonte de micro-organismo (secreções e fluidos corporais); sempre que manipular materiais ou equipamentos que estão ou estiveram conectados a pacientes; antes e após o preparo de medicações, de materiais ou equipamentos. O Iodo é um agente microbicida de alta eficiência contra todas as espécies de bactérias, e também esporicida, fungicida, viricida e amebicida. É utilizado como um agente anti-séptico na forma de tintura de iodo. É também utilizado na forma de substâncias denominadas iodóforos, que são complexos de iodo com compostos que atuam como carreadores e agentes solubilizadores do iodo, como a polivinilpirrolidona. Os iodóforos são germicidas e não coram e nem irritam a pele. O filme protetor proporcionado pelo PVPI faz com que o iodo seja liberado gradativamente, tornando seu efeito germicida mais prolongado. Mesmo após várias aplicações, o efeito residual não provoca irritação. Indicado na anti-sepsia e degermação das mãos e dos antebraços da equipe cirúrgica, laboratorial, ambulatorial e no preparo do campo operatório. O Mecanismo de ação não é completamente conhecido, mas acredita-se na halogenação da tirosina e inativação de enzimas. O álcool é um desinfetante e anti-séptico, que possui de 70 a 90 % de eficiência contra células vegetativas. As propriedades bactericidas aumentam com a cadeia de C. Não é eficiente contra esporos (Bacillus anthracis). Mecanismo de ação: solvente de lipídeos, desnaturação e coagulação de proteínas.

Técnica da lavagem das mãos com água e detergente 1- abrir a torneira; 2- molhar as mãos; 3- passar o sabão; 4- friccionar bem; 5- passar as mãos ensaboadas sobre a torneira; 6- conserva-la aberta; 7- proceder assim: - palma com palma - palma no dorso da mão (incluso entre os dedos) - dorso na palma (incluso os dedos) - ponta dos dedos - polegares - costas das mãos - unhas. 8- esfregar os punhos de maneira circular, até a metade do antebraço; 9- Enxaguar as mãos e com as mãos em concha, jogar água sobre a torneira; 10- pegar o papel toalha estéril e secar as mãos; 11- com o mesmo papel, secar a torneira e fechá-la.

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Técnica da lavagem das mãos com Polivinilpirrolidona-Iodo 10% (PVPI) Proceder conforme técnica de lavagem das mãos, porém, usar PVPI em vez de detergente.

Técnica da lavagem das mãos com álcool Proceder conforme técnica de lavagem das mãos, porém, usar álcool em vez de detergente.

Atividade prática:  Aluno da bancada 1: 1- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri; 2- Lavar as mãos com água corrente e água destilada, enxugar com papel toalha estéril; 3- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri.  Aluno da bancada 2: 4- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri; 5- Lavar as mãos com água e detergente conforme técnica descrita acima; 6- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri.  Aluno da bancada 3: 7- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri; 8- Lavar as mãos com PVPI conforme técnica descrita acima; 9- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri.  Aluno da bancada 4: 10- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri; 11- Lavar as mãos com álcool 70 conforme técnica descrita acima; 12- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri. Incubar as placas invertidas em estufa a 37°C/ 18 a 24 h. Observar os resultados.

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11- AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DE ANTISSÉPTICOS E DESINFETANTES  As substâncias químicas utilizadas para desinfecção ou anti-sepsia são divididas em vários grupos: fenol e compostos fenólicos, álcoois, halogênios (iodo e cloro), metais pesados e seus compostos e detergentes. Um agente químico ideal deve ter as seguintes características: atividade antimicrobiana, solubilidade em água ou solventes, estabilidade durante armazenamento, ausência de toxicidade para homem e animais, inativação mínima por material estranho, atividade em temperaturas ambiente, poder de penetração limitado ao local de aplicação, ausência de poderes corrosivos e tintoriais, poder desodorizante, capacidade detergente, disponibilidade e baixo custo.  A seleção de uma substância química antimicrobiana deve levar em consideração: 1. Natureza do material a ser tratado: tecido vivo ou objeto inanimado 2. Tipo de micro-organismo 3. Condições ambientais: tempo de contato, temperatura, pH, presença de matéria orgânica, presença de água, etc.

Principais grupos de desinfetantes e anti-sépticos FENÓIS: Mata rapidamente as células vegetativas. São muito tóxicos para os tecidos. Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas; agente ativo de superfície (surfactante) precipita proteínas celulares e rompe a membrana citoplasmática. ÁLCOOIS: 70 a 90 % eficientes contra células. vegetativas. Propriedades bactericidas aumentam com a cadeia de C. Não é eficiente contra esporos ( Bacillus anthracis). Mecanismo de ação:solvente de lipídeos, desnaturação e coagulação de proteínas. HALOGÊNIOS: são fortes agentes oxidantes. Iodo: bactericida, esporicida, fungicida, amebicida e viricida. Pouco solúvel em água e mais solúvel em álcool. Mecanismo de ação:não está completamente conhecido, mas acredita-se na halogenação da tirosina e inativação de enzimas. Cloro: desinfetante mais utilizado. Atuam sobre bactérias, fungos, vírus. Hipocloritos contém o grupo químico -OCl. Os mais usados são Ca(OCl) 2  e NaOCl. Cloraminas  são mais estáveis que os hipocloritos. Mecanismo de ação:desnaturação de proteínas; dissolvidos em água hidrolisam originando ácido hipocloroso oxigênio nascente (agente oxidante poderoso). DETERGENTES ou SURFACTANTES: São compostos que diminuem a tensão superficial e são utilizados para limpar superfícies. Os detergentes são classificados em 3 grupos principais: aniônicos (Duodecil sulfato de sódio), catiônicos (cloreto de cetilpiridínico), não-iônicos (polissorbato 80) Muitos detergentes antimicrobianos pertencem ao grupo catiônico, sendo que os não-iônicos não possuem esta atividade.  A avaliação do poder antimicrobiano dos desinfetantes e anti-sépticos pode ser feita em laboratório. São empregadas as técnicas de diluição em tubo, inoculação em placas, e a do coeficiente fenólico. Os micro-organismos usados para o teste são Staphylococcus aureus ou Salmonella typhi

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Atividade prática  Preparar placa de Petri com meio Agar nutriente. Após solidificação fazer orifícios no  Agar para colocação do agente químico a ser testado  Preparo da suspensão bacteriana em soro fisiológico. Obter turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, feita com sulfato de bário. Isto é, 10 5 a 10 6 UFC/ mL (Unidades Formadoras de Colônias).  Espalhamento da suspensão bacteriana no meio sólido com auxilio de “swab” (técnica de sementeira de superfície)  Secagem da placa por 5 a 10 minutos em estufa a 37°C  Colocar um pequeno volume das substâncias a serem testadas nos orifícios  Incubar a placa por 24-48 h a 37ºC  Observar aparecimento de zona de inibição, isto é ausência de crescimento. Resultados: Substâncias: fenol, Pinho, água sanitária. Tamanho do halo de inibição (mm) Concentrações 100% 1:2 (50%) 1:4 (25%) 1:8 (12,5%) 1:16 (6,25%) 1:32 (3,125%) Fenol Pinho  Água sanitária

Conceitos:  Anti-sepsia - eliminação de micro-organismos de tecidos vivos  Assepsia – conjunto de medidas para evitar a contaminação de materiais, instrumentos, meios de cultura, etc com micro-organismos. Desinfecção – eliminação de micro-organismos de tecidos mortos ou de objetos inanimados

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12- TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS EM MEIOS DE CULTURAS Os micro-organismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu crescimento “in vitro”. Além dos componentes presentes no meio, existem outros fatores ambientais que interferem no seu desenvolvimento, tais como temperatura (psicrófilas, mesófilas, termófilas e termófilas extremas), tensão de oxigênio (aeróbias, anaeróbias obrigatórias, microaerófilas e anaeróbias facultativas), pH, intensidade luminosa, pressão osmótica e salina.  A inoculação de um micro-organismo em um meio de cultura que possua todos os requisitos físico-químicos favoráveis permite que o mesmo inicie seu desenvolvimento. Neste desenvolvimento da cultura ocorrem todas as fases do crescimento (fase de latência ou adaptação, fase logarítmica, fase estacionária, e morte). Estas fases podem ser plotadas em um gráfico em função do tempo de incubação, gerando a curva de crescimento.  A fase logarítmica (exponencial) é caracterizada por divisões sucessivas (cissiparidade), originando a formação de um agrupamento de bactérias da mesma espécie, que em meio sólido, é denominada colônia .  Teoricamente a colônia se origina a partir de uma célula, podendo ser visualizada sem o auxílio de microscópio, sendo, portanto, considerada como característica macroscópica das bactérias. Como cada espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, estas deverão ser analisadas quanto à elevação, forma, tamanho, bordas e pigmentação, sendo, portanto mais um critério a ser empregado na identificação da cultura bacteriana. Culturas puras propiciam o desenvolvimento de um único tipo de colônia, ao contrário do resultado do crescimento de tipos variados de colônias em culturas mistas . Em microbiologia, há várias técnicas de inoculação de micro-organismos; algumas são utilizadas para exames qualitativos e outras para exames quantitativos (contagem de bactérias). TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO NORMAS UTILIZADAS  A) O fio e a alça de platina devem sempre ser esterilizados antes e depois de qualquer inoculação. Para a coleta de material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com o meio, antes de tocar na cultura. B) Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc) com meio de cultura devem ser sempre abertos próximo ao bico de Bunsen; C) A boca do tubo de ensaio deve ser flambada na chama do bico de Bunsen após a retirada e antes da colocação da tampa(algodão ou plástico). A tampa nunca deve ser colocada sobre o balcão, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão direita durante o processo de inoculação. TÉCNICAS DE SEMEADURA EM MEIOS LÍQUIDOS (CALDOS) Com auxilio de alça de platina, retirar inóculo de E. coli  do meio liquido e transferir para meio liquido. TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO INCLINADO Com auxílio da alça de platina, retirar inóculo de Serratia marcescens do meio sólido e fazer estrias na superfície do ágar.

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TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM TUBO (PICAGEM PROFUNDA) Inocular a cultura em meio sólido utilizando a agulha de platina. A inoculação deverá ter a profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser mais do que uma única picada. TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM PLACA (TÉCNICA DE ESGOTAMENTO) Consiste em depositar sobre um ponto da superfície do meio de cultura uma alíquota do inóculo e depois espalhá-lo em dois ou três setores, por meio de alça de platina, sem recarregá-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do inóculo. Temos que obter rarefação suficiente do inóculo, de modo a f ormar colônias perfeitamente isoladas. O sucesso da semeadura depende: - tomada de pequena quantidade de inóculo para semear; - grande número de estrias; - não perfurar o meio; - não voltar a alça sobre a estria. Com auxilio de alça de platina, transferir o inóculo de Micrococcus luteus do meio liquido para placa de Petri fazendo estrias compostas.

TÉCNICA DE SEMEADURA EM PLACA EM PROFUNDIDADE ( POUR-PLATE) Pode ser realizada com o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placa (estudo quantitativo): Realizar diluições de um cultivo bacteriano: 1. Retirar 0,1 ml de inóculo de S. epidermidis  do meio liquido e transferir para tubo contendo 0,9 ml de salina. Retirar 0,1 ml do tubo 1 (diluição 10 -1) e transferir para tubo 2, e assim sucessivamente até o tubo 8. 2. Transferir 0,1 mL dos tubos de diluição para a placa de Petri vazia e estéril; (bancada 1: diluição 10-5, bancada 2: diluição 10 -6, bancada 3: diluição 10 -7, bancada 4: diluição 10-8); 3. Depositar na placa 15 a 20 mL de ágar fundido (+/- 45ºC); 4. Realizar movimentos circulares para que ocorra a incorporação do inóculo diluído no meio; 5. Esperar solidificar e inverter a placa.

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0,1 mL 0,9 mL

0,1 mL

Placa após incubação TÉCNICA DE INOCULAÇÃO POR SEMENTEIRA DE SUPERFÍCIE É realizada com “swabs” contendo o inóculo do micro-organismo, sendo este espalhado por toda a superfície do meio de cultura sólido contido em placa de Petri. Observação: Geralmente, o inóculo é padronizado segundo o tubo 1 da escala de Macfarland. IDENTIFICAÇÃO DAS PLACAS E TUBOS: Identifique seu material com as siglas do curso, bancada, bactéria e técnica. CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO  Após a inoculação, as bactérias deverão ser incubadas em ambiente com tensão de oxigênio e temperatura ideais para o seu desenvolvimento. Como as bactérias que estamos trabalhando são aeróbias ou anaeróbias facultativas e mesófilas, elas devem ser incubadas entre 35oC e 37ºC (estufa bacteriológica) com tensão de oxigênio ambiental. O período de incubação deve ser de 18 a 24 horas porque estas bactérias possuem tempo de geração de cerca de 20 a 30 minutos; isto significa que após este período estarão na fase logarítmica de crescimento, sendo visíveis macroscopicamente.

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13- IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS Os cocos Gram-positivos são divididos em grupos de acordo com as diferenças de arranjo e tipo de metabolismo celular. Um de seus subgrupos contém os cocos aeróbios e um gênero comum é o Micrococcus, cujas células estão dispostas irregularmente ou em tétrades.  As espécies de Micrococcus são saprófitas que vivem no solo e na água. Outro subgrupo de cocos Gram-positivos contém aqueles que são facultativos em relação à necessidade de oxigênio. As espécies do gênero Staphylococcus , com suas células agrupadas são os mais conhecidos. Os estafilococos vivem na pele e nas membranas das mucosas do homem e de outros animais de sangue quente. A principal espécie patogênica é o Staphylococcus aureus, que pode causar infecções pós-operatórias, síndrome do choque tóxico e intoxicação alimentar no homem. Outro gênero conhecido é o Streptococcus, cujas células estão arranjadas em pares ou cadeias. O Streptococcus pyogenes é a espécie mais importante sendo o agente da angina estreptocócica, da escarlatina e da febre reumática. Outro patógeno importante é o S.  pneumoniae, que constitui a principal causa de pneumonia bacteriana no homem. Outras espécies como o E. faecalis, fazem parte da flora normal do trato intestinal do homem e dos animais. Um terceiro grupo de cocos Gram-positivos inclui gêneros de bactérias anaeróbias tais como os Peptococcus, Peptostreptococcus e  Coprococcus. Muitas espécies fazem parte da flora normal do homem e de outros animais de sangue quente.

Estafilococos e Estreptococos Os estafilococos são cocos Gram-positivos (0,5 a 1,5 μm de diâmetro), que se encontram isolados, aos pares, em tétrades ou em agrupamentos irregulares, semelhantes a um cacho de uvas. São imóveis, não esporulados, geralmente CATALASE positivos e não encapsulados. A maioria das espécies é OXIDASE negativa. As espécies de maior interesse clínico (homem: Staphylococcus aureus; animais: S. intermedius) são COAGULASE positivos.  A coagulase é uma enzima que reage com um co-fator existente no plasma de algumas espécies (coelho, cavalo, humano), transformando o fibrinogênio em fibrina. O co-fator é indistinguível da protrombina, porém a enzima se diferencia da tromboquinase, pois, ao contrário desta, não requer a presença de íons Ca 2+, nem os fatores 5, 6 e 7 para a sua ativação. A capacidade de coagular o plasma continua sendo o critério mais amplamente utilizado para a identificação dos estafilococos patogênicos. Os estreptococos são bactérias cocóides Gram-positivas, OXIDASE negativas, que geralmente crescem em forma de cadeias. A principal diferença bioquímica com os estafilococos é a enzima CATALASE, caracteristicamente AUSENTE nos estreptococos (CATALASE negativos). A catalase é uma enzima capaz de desidrogenar o peróxido de hidrogênio segundo a reação: 2H2O2 2H2O + O2 catalase  A ação ou atividade HEMOLÍTICA dos estreptococos é também útil para a identificação desses micro-organismos. Dependendo da espécie, diferentes tipos de hemólise podem ser observados: 1. Hemólise alfa () leva a destruição parcial dos eritrócitos presentes no meio de cultivo, sendo muitas vezes acompanhada de uma coloração esverdeada. 2. Hemólise beta () leva a formação de uma zona clara, incolor, ao redor da colônia, indicando destruição total dos eritrócitos. Um exemplo de estreptococos -hemolítico é o Streptococcus pyogenes , agente etiológico de faringites, amigdalites, sinusites, erisipela, endocardites e febre reumática.

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ATIVIDADE PRÁTICA Prova da Catalase  A prova pode ser feita em lâmina ou em tubo. Cultivar o micro-organismo a testar em ágar inclinado, por 18 a 24 horas a 37ºC.

Técnica da Prova em lâmina:  retirar uma colônia do meio de cultivo e transferir para uma lâmina contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 30%. Neste caso, deve-se evitar retirar colônias de meios contendo sangue para este teste, pois a enzima catalase está presente em eritrócitos e o transporte de eritrócitos para o local da reação pode resultar em resultados falso-positivos. Técnica da Prova em tubo:   Adicionar sobre o material cultivado 1 ml de uma solução de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) a 30%. O desprendimento de bolhas de gás indica uma prova positiva.

Observação:  Esta prova não é específica para catalase, e sua interpretação deve ser feita levando-se em consideração demais aspectos de crescimento do micro-organismo. Microorganismos produtores de uma outra enzima, a PEROXIDASE (também atua sobre o peróxido de hidrogênio), como alguns Streptococcus e  Aerococcus  podem oferecer resultados falsos. Neste caso, pode-se usar a prova da benzidina, específica para a determinação da peroxidase. Prova da Coagulase  A prova pode ser feita em lâmina ou em tubo. Contudo a prova em lâmina é menos precisa e é recomendada apenas para se realizar uma triagem, devendo a prova em tubo ser realizada para confirmação do resultado.

Técnica da Prova em Lâmina:  em lâmina de vidro bem limpa, adicionar uma gota da suspensão bacteriana (densa) a testar, e uma gota de plasma. Misturar com auxílio de uma espátula plástica e observar o aparecimento de grumos nos primeiros 10 segundos. Técnica da Prova em Tubo:  retirar 0,1 ml do meio líquido ou uma colônia isolada do meio sólido de uma cultura da bactéria (a partir de meio BHI, após 24 horas de cultivo) e transferir para tubo de ensaio contendo 0,5 ml de plasma (ver observações). Incubar em banho-maria a 37ºC, por 1 a 4 horas. Observar a formação de um coágulo no tubo. Observações:  Qualquer plasma pode ser usado, porém o plasma de coelho (obtido usando-se CITRATO ou EDTA como anticoagulantes) é o mais recomendado.  10 a 15 % das cepas podem produzir resultados negativos em lâmina. Reações após 10 segundos, assim como o uso de células provenientes de meio com alta concentração salina (Ex: ágar manitol salgado), podem dar resultados falso-positivos.  Organismos contaminantes, incluindo bactérias Gram-negativas podem dar resultados falso-positivos. Por isso, antes de se testar uma cepa bacteriana, deve-se assegurar que esse micro-organismo possui características morfo-tintoriais compatíveis com estafilococos. 31

Pesquisa de estreptococos -hemolíticos na garganta  As melhores placas de ágar sangue para um isolamento primário contém 5% de sangue de carneiro. Com auxílio de um “swab” estéril coletar material na região das amígdalas e orofaringe (evitar tocar na língua e na úvula). Realizar estrias em meio de ágar sangue (pH 7,3 a 7,4) e incubar a 37ºC. Após 24 horas de cultivo, observar o aparecimento de halos de hemólise ao redor das colônias. Observação: O halo hemolítico é visível, sendo que o crescimento de colônias em meio ágar sangue não é indicativo de hemólise.

Preparo do Meio Agar Sangue: a) Base para Ágar-Sangue Extrato de Carne Triptose Cloreto de Sódio  Agar  Água destilada

3,0 5,0 5,0 15,0 1000 ml

b) Preparo do Agar Sangue Base para ágar sangue fundido e resfriado a aproximadamente 50ºC 95 ml Sangue total ou desfibrinado de coelho ou carneiro 05 ml

Prova de fermentação do Manitol S. aureus, ao contrário de S. epidermidis e de outras espécies coagulase-negativas, é

capaz de fermentar o manitol. A alta concentração de sais presente no meio ágar-manitol inibe o crescimento de outros micro-organismos (exceto enterococos) e permite isolar, de modo seletivo, estafilococos.

Ágar-Manitol Peptona de carne Extrato de carne D-Manitol Cloreto de sódio Vermelho de fenol  Ágar  Água destilada

10 g 1g 10 g 75 g 0,025 g 15 g 1000 mL

pH a 25ºC = 7.4

32

ATIVIDADE PRÁTICA: Primeira aula: inoculação da bactéria a ser identificada pelos testes bioquímicos  Alunos da Bancada 1, 3 e 5  – inocular bactéria A conforme procedimento técnico descrito no roteiro para cada teste  Alunos da Bancada 2 e 4  –  inocular bactéria B conforme procedimento técnico descrito no roteiro para cada teste

Segunda aula: Execução e avaliação dos testes conforme procedimento descrito no roteiro. Identificação da bactéria inoculada a partir dos testes bioquímicos. RESULTADOS DOS TESTES E IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS Bancada

Gram

Célula Forma

Arranjo

Testes Catalase

Bactéria Coagulase Manitol

1 2 3 4

33

14- IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS  – PROVAS BIOQUÍMICAS 1 - Provas do IMViC  A identificação de bacilos entéricos é de grande importância para determinar a etiologia de infecções intestinais e outras infecções, bem como contaminações de águas e alimentos. Este grupo de bactérias pode ser encontrado nos intestinos do homem e de certos animais, sendo as mesmas classificadas como pertencentes à família Enterobacteriaceae. São bactérias em forma de bastonete, Gram negativas, e sem capacidade de esporulação. Encontramos os seguintes gêneros dentro desta família: Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella, Escherichia, Enterobacter , Serratia, etc.  A diferenciação das enterobactérias pode ser feita com base em suas propriedades bioquímicas, em presença de substratos específicos. Um conjunto de provas que auxilia a identificação e classificação destas bactérias, são as provas do IMViC (Indol, Vermelho de Metila, Voges Proskauer e Citrato). Neta prática serão utilizadas, na identificação das bactérias, alguns testes bioquímicos incluindo as provas do IMVIC.

A - Prova de Produção do Indol Objetivo: Determinar a habilidade de certos micro-organismos em decompor o aminoácido triptofano. A oxidação do referido aminoácido é catalisada pela enzima tri ptofanase; CH2

CH

COOH

tr iptof anase amônia

N

+

NH2

triptofano

N

Indol

 Ácidopir úvic

 A presença do indol é detectada pela adição do reativo de Kovacs ao meio de cultura. O reagente é composto por p-dimetilaminobenzaldeido, álcool amílico e ácido clorídrico. O indol forma complexo com o p-dimetilamino-benzaldeido, o qual têm cor vermelha. Culturas que desenvolvem a cor vermelha, após adição do reativo de Kovacs, são consideradas indol positivas. Procedimento técnico: Cultivar a bactéria em tubo de ensaio contendo água de peptona, durante 4 dias a 37 ºC. Adicionar 0,5 mL (10 gotas) do reativo de Kovacs através da parede interna do tubo. Agitar suavemente e observar. A formação de um anel de coloração vermelha é indicativo de positividade do teste.

B - Reação do Vermelho de Metila (V. M.). Objetivo: Determinar a capacidade de certos micro-organismos, em utilizar a glicose com a produção e estabilização de altas concentrações de ácidos como produtos finais dos processos fermentativos. Nesta prova o vermelho de metila indica a presença de elevadas concentrações de ácidos como produtos finais. Em pH em torno de 4 o indicador se torna vermelho, o qual é indicativo de positividade do teste. Em pH 6, ainda indicativo da presença de ácidos em baixas 34

concentrações, o vermelho de metila assume a coloração amarela, o que é indicativo da negatividade do teste.  A prova é útil para separar a  Escherichia coli  de  Enterobacter  aerogenes.  Ambos os micro-organismos produzem inicialmente ácidos orgânicos em estágio precoce da incubação da cultura. O pH baixo é estabilizado e mantido por E. coli  até o final da incubação. Durante o tempo que a cultura de   E. aerogenes  permanece na estufa, ocorre a conversão enzimática destes ácidos em produtos não acídicos, tais como o álcool etílico e a acetoína (acetil metil carbinol), resultando em elevação do pH (aproximadamente 6).

Procedimento técnico: Cultivar a bactéria durante 4 dias, em tubo de ensaio contendo meio de Clark & Lubs, em estufa a 37ºC. Adicionar 8 gotas de solução de vermelho de metila. Agitar e observar. Coloração avermelhada é indicativo de positividade do teste, já a cor amarela indica negatividade do mesmo.

C - Teste de Voges-Proskauer (V.P.) Objetivo: Detecção da acetoína  Algumas bactérias fermentam a glicose com produção de ácido acético que, posteriormente, se transforma em produtos neutros como acetil -metil-carbinol (acetoína). Em presença de oxigênio, acetoína forma diacetil que, ao reagir com KOH, forma um complexo de cor róseo-avermelhada. Glicose  acido acético (ac. orgânico)  acetoina (neutro) +O2 diacetil +KOH complexo róseo avermelhado

Procedimento técnico: Cultivar a bactéria durante 4 dias em tubo de ensaio contendo caldo Clark & Lubs, em estufa a 37ºC. Adicionar ao tubo 10 gotas de solução A de Barritt (alfa-naftol 5%) e agitar. Imediatamente adicionar 10 gotas da solução B de Barritt (KOH 40%) e deixar em repouso por 15 minutos. Examinar e registrar a cor do meio. O aparecimento de coloração rósea é indicativo da positividade do teste.

D - Prova de Assimilação do Citrato Objetivo: Verificar a capacidade do micro-organismo em assimilar citrato como fonte de carbono. É detectada a presença da enzima citrato permease.  Alguns micro-organismos são capazes de utilizar citrato como única fonte de carbono na ausência de glicose ou outro açúcar fermentável. A enzima citrato permease, transporta o citrato para o interior da célula, onde sofre a ação da enzima citrase, produzindo o ácido oxaloacético e o ácido acético. Estes produtos são enzimaticamente convertidos em ácido pirúvico e dióxido de carbono. Durante esta reação o meio se torna alcalino, pois o dióxido de carbono combina com o sódio do meio formando carbonato de sódio, um produto alcalino. A presença do carbonato de sódio muda a cor do indicador azul de bromotimol incorporado ao meio, do verde para o azul.  As culturas citrato-positivas são identificadas pela presença de crescimento de colônias na superfície do meio que possui coloração azul.

35

Procedimento técnico: Inocular a bactéria na superfície inclinada de um tubo contendo ágar citrato de Simmons (pH=7,3-verde). Incubar a cultura a 37ºC durante 24 a 48 horas. Observar os tubos para verificar ou não a presença de crescimento e cor azul.

2 - Produção de Ácido Sulfídrico (H2S) Objetivo: detecção da produção de ácido sulfídrico  Alguns micro-organismos são capazes de produzir ácido sulfídrico através da utilização de substratos que contêm aminoácidos com enxofre, ou compostos inorgânicos de enxofre. O ácido sulfídrico pode ser produzido pela redução do enxofre orgânico presente na cisteína, a qual é componente das peptonas incorporadas ao meio de cultura. As peptonas são degradadas por enzimas microbianas em aminoácidos, incluindo a cisteína. Este aminoácido, em presença da enzima cisteína desulfurase, perde o enxofre, o qual é reduzido para formar o ácido sulfídrico, segundo a equação abaixo representada. HS-CH2 -CHNH2-COOH cisteína



H3C-CO-COOH ácido pirúvico

+ NH3 + H2S amônia ácido sulfídrico

O ácido sulfídrico produzido é liberado do meio e reage com o acetato de chumbo contido em tira de papel de filtro colocada na parte inferior da boca do tubo de cultura. A formação de coloração negra indica a presença de H 2S, de acordo com a seguinte equação: H2S + (H3C-COO)2Pb ácido sulfídrico acetato de chumbo

PbS  + 2 H3C-COOH   sulfeto de chumbo ácido acético

O sulfeto de chumbo é um precipitado de cor negra.

Procedimento técnico: Inocular a bactéria em estudo em tubo de ensaio contendo água de peptona. Após a inoculação colocar no interior do tubo, na parte superior e fixa na tampa, uma tira de papel de filtro impregnada com solução de acetato de chumbo. Cultivar a bactéria durante 4 dias a 37ºC. O aparecimento de cor negra no papel indica positividade do teste.

3 - Cultivo em Agar-Eosina Azul de Metileno (EMB, Eosin Methylene Blue Agar) Os meios diferenciais são utilizados para caracterizar grupos de micro-organismos, baseando-se em modificações visuais que podem ocorrer nas colônias ou no meio de cultura. O ágar EMB contendo lactose e os corantes eosina azul de metileno permite a diferenciação entre micro-organismos entéricos que fermentam e que não fermentam a lactose, bem como identificar colônias de Escherichia coli , a qual produz colônias azul-escuras com brilho metálico devido a grande quantidade de ácido que ela produz.

Procedimento técnico: Inocular as bactérias em estudo em placas contendo ágar EMB. Incubar a 37ºC por 48 horas. Observar o aparecimento de colônias e a cor das mesmas. 36

4  – Hidrólise do amido Objetivo: detecção da atividade da enzima amilase O amido é um polímero composto de moléculas de glicose unidas entre si por ligações glicosídicas. Esse precisa ser hidrolisado antes de ser transportado para o interior da célula bacteriana. A enzima extracelular responsável pela hidrólise do amido é a amilase. A ação dessa enzima é evidenciada pela ausência de amido ao redor da colônia crescida em meio sólido contendo amido (0,2%), após adição de iodo (lugol) sobre o meio. Se o iodo reagir com o amido, será formado um complexo de cor azul, indicando teste negativo para a amilase. O aparecimento de zonas claras ao redor das colônias indica teste positivo para a presença de amilase.

Procedimento técnico: Inocular as bactérias em estudo, fazendo estrias simples sobre a superfície do meio ágar amido. Incubar as placas por 48 horas a 37ºC.  Após incubação, adicionar solução saturada de iodo (Lugol) sobre o meio de cultura.

ATIVIDADE PRÁTICA: Primeira aula: inoculação da bactéria a ser identificada pelos testes bioquímicos - Alunos da Bancada 1 e 3  – inocular bactéria A conforme procedimento técnico descrito no roteiro para cada teste; - Alunos da Bancada 2 e 4  – inocular bactéria B conforme procedimento técnico descrito no roteiro para cada teste; - Alunos da Bancada 5 – inocular bactéria C conforme procedimento técnico descrito no roteiro para cada teste.

Segunda aula: 1. Execução e avaliação dos testes conforme procedimento descrito no roteiro. 2. Identificação da bactéria inoculada a tabela de diferenciação de Enterobacteriaceae por testes bioquímicos.

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ANEXOS Meios de Cultura e Reagentes. 1 - Água de peptona Peptona Cloreto de sódio  Água destilada

2g 0,5 g 100 ml

 Ajustar o pH entre 7,4 e 7,6. Distribuir em tubos e esterilizar a 120 ºC durante 15 minutos. 2 - Agar Eosina Azul de Metileno (EMB Agar). Peptona Lactose Sacarose Fosfato monoácido de potássio Eosina amarela  Azul de metileno  Agar  Água destilada

10 g 5g 5g 2g 0,4 g 0,065 g 13,5 g 1000 mL

Fundir o ágar na água destilada e, a seguir, acrescentar os outros componentes. Acertar o pH em 7,2. Autoclavar a 120 ºC por 15 minutos. 3 - Meio de Clark & Lubs Glicose Peptona Fosfato dibásico de potássio  Água destilada

0,5 g 0,5 g 0,5 g 100 ml

 Autoclavar a 120 ºC durante 15 minutos. Deixar esfriar e acrescentar 5 ml de solução de glicose a 10 % previamente esterilizada por filtração. Distribuir o meio em tubos de ensaio em porções de 10 ml. 4 - Agar Citrato de Simmons. Fosfato biácido de amônio Fosfato monoácido de potássio Cloreto de sódio Citrato de sódio Sulfato de magnésio  Azul de bromotimol  Agar  Água destilada

1g 1g 5g 2g 0,2 g 0,08 g 15 g 100 mL

Fundir o ágar na água destilada. Dissolver os outros componentes e acertar o pH em 6,9. Distribuir o meio em tubos de ensaio em volume suficiente para uma placa de Petri.  Autoclavar a 120ºC por 15 minutos. 38

5 - Solução de Barrit A. α - naftol  Alcool etílico absoluto

5g 95 mL

6 - Solução de Barrit B. Hidróxido de potássio Creatina  Água destilada

40 g 0,3 g 100 mL

Dissolver o hidróxido de potássio na água destilada. 7 - Solução de vermelho de metila. Vermelho de metila  Álcool etílico 95 %  Água destilada

0,1 g 300 mL 200 mL

Dissolver o vermelho de metila no álcool. Acrescentar a água destilada. 8 - Reativo de Kovacs.  Álcool amílico 75 mL p-dimetilaminobenzaldeido 5g  Ácido clorídrico concentrado 25 mL Dissolver o p-dimetilaminobenzaldeido no álcool amílico e, a seguir, acrescentar o ácido clorídrico. 9- Ágar amido Peptona Extrato de carne  Amido solúvel  Ágar  Água destilada qsp

15 g 3g 2g 15 1000 ml

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15- ANTIBIOGRAMA Introdução O antibiograma é uma prova laboratorial para avaliar a sensibilidade ou resistência de determinado micro-organismo frente a diferentes antimicrobianos.  A proposta primária deste teste é guiar o clínico na escolha do agente apropriado para a terapia. Além disso, estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento bactérias resistentes emergentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC ( minimum inhibitory concentration) ou MBC (minimum bactericidal concentration). 1. Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ ou MBC. 2. Método de difusão de Bawer e Kirby: é um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o micro-organismo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. O método deverá ser executado a partir de culturas puras, pois o padrão de sensibilidade ou resistência dos micro-organismos é muito variado. Se em determinado material biológico encontrarmos tipos de bactérias diferentes, temos que realizar um antibiograma para cada espécie de micro-organismo isolado. O resultado do antibiograma só é válido para o micro-organismo em estudo. Assim temos, por exemplo, que os resultados para determinada amostra de  Staphylococcus aureus isolado de uma urocultura não serve para um Staphylococcus aureus  isolado de uma coprocultura.

Realização do antibiograma Técnica do método de difusão: O inóculo bacteriano tem que ser padronizado devendo conter de 10 5 a 106 UFC/mL (Unidades Formadoras de Colônias por mL). Padronizar suspensão da bactéria em solução fisiológica, com turvação equivalente ao tubo nº 0,5 da Escala de McFarland. A Escala de McFarland constitui-se de 10 tubos numerados onde temos volumes crescentes de mistura de ácido sulfúrico e hidróxido de bário, a qual dará um precipitado de sulfato de bário, produzindo turbidez característica. 1. Sature um swab de algodão com a suspensão bacteriana. 2. Remova o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo.

SWAB

Figura 1

3. Semeie a suspensão por espalhamento, em placa contendo ágar Muller-Hinton, utilizando sucessivamente três direções para obter um inóculo uniformemente espalhado sobre toda a superfície do ágar (Fig 2). O ágar Mueller Hinton contém baixos teores de timina e timidina, substâncias que são antagonistas das sulfas. As sulfas bloqueiam na bactéria a síntese do ácido fólico, não 40

ocorrendo assim síntese de ácidos nucléicos e, tendo como conseqüência, a morte da bactéria. Altos níveis de timina e timidina favorecem a formação de ácidos nucléicos por outra via impedindo a ação das sulfas. O meio contém ainda baixos teores de íons cálcio e magnésio, os quais, quando em concentrações elevadas, interferem na ação dos aminoglicosídeos.

Figura 2

Com auxílio de uma pinça, distribua cinco discos de diferentes antibióticos sobre a superfície do ágar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). A seleção dos discos deve levar em consideração o tipo de bactéria e a procedência do material biológico (local da infecção). Os discos serão colocados à distância considerável uns dos outros e da borda da placa, a fim de evitar a confluência dos halos de inibição.

Figura 3

4. Pressione levemente os discos para que não se desprendam durante a incubação. 5. Incube as placas por 24 horas a 37°C.

Análise dos Resultados Medir o halo de inibição do crescimento (em milímetros) e comparar com tabelas padronizadas. A simples formação do halo não é indicativo de sensibilidade da bactéria ao antibiótico, em níveis terapêuticos. Temos que levar em consideração o tamanho do halo, tipo de bactéria e a concentração do antibiótico. Deve-se observar halos nítidos e bem definidos. O tamanho do halo não indica necessariamente que uma bactéria é mais sensível a um determinado antibiótico que a outro. Os valores das tabelas vão se alterando à medida que as bactérias vão se tornando mais resistentes.  Através da análise dos resultados poderemos classificar os micro-organismos testados em: “resistente”, “intermediário”, “moderadamente sensível”, e “sensível”, dependendo da formação ou não de halo inibitório e também de seu diâmetro. No caso de formação de um halo inibitório, este deve ter seu diâmetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas (Fig 5) . De modo geral, estas tabelas determinam medidas de diâmetro, e dessa forma a medida encontrada em cada caso pode então ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas.

41

Figura 4

Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade Códig  Antimicrobiano [µg] o Bacitracina Cefotaxima Gentamicina Tetraciclina Vancomicina

BAC CTX GEN TET VAN

10 30 10 30 30

Halos de Inibição (mm) Resistente Intermediário <8 < 14 < 12 < 14 <9

9 a 12 13 a 14 15 a 18 10 a 11

Moderadament e sensível 15 a 22 -

Sensível > 13 > 23 > 15 > 19 > 12

Exemplo: Se para um determinado micro-organismo, utilizando-se o antimicrobiano Gentamicina, foi medido o diâmetro de um halo de inibição e constatou-se que este era de 16 mm, tal micro-organismo deve ser classificado como sensível para a Gentamicina. Entretanto se o diâmetro do halo fosse de 13 mm o micro-organismo seria classificado como intermediário a Gentamicina. No caso de não formação de um halo de inibição, o micro-organismo seria considerado resistente. Observações 1) Na leitura do halo de inibição, pode-se observar o aparecimento de “véu” dentro do mesmo (Pseudomonas e Proteus). Fazer a leitura normalmente, ignorando o véu. Esse fato ocorre porque estes micro-organismos são extremamente móveis. 2) Poucas colônias dentro do halo sugerem mutantes, os quais devem ser ignorados.

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16 - PROPRIEDADE OLIGODINÂMICA DE METAIS  Alguns metais pesados são muito tóxicos e altamente reativos, como por exemplo, Hg (mercúrio), Ag (prata), Pb (chumbo), Zn (zinco) e Cu (cobre). Eles possuem capacidade oligodinâmica, isto é capacidade de exercer efeito letal sobre as bactérias mesmo em quantidades extremamente pequenas. No inicio do XX o cloreto de mercúrio era amplamente usado como um desinfetante geral, porém pelo seu efeito tóxico foi substituído por outros agentes.

Compostos de Mercúrio Compostos Inorgânicos de Mercúrio - HgCl 2: São irritantes de tecidos, tóxicos para os órgãos, inativados por matéria orgânica e não têm ação sobre esporos Mecanismo de ação: ocorre inativação de enzimas com grupo sulfidrila (SH) - precipitação de proteínas celulares. SH SH Enzima

+ HgCl 2

SH Enzima ativa

Enzima - Hg

cloreto de mercúrio

+

2HCl

SH Enzima inativa

Compostos Orgânicos de Mercúrio: Eram usados para tratamento de pequenos cortes, feridas e infecções de pele. São menos irritantes e menos tóxicos que os inorgânicos. Não matam esporos. São eles: mertiolate (timerosal), mercurocromo (merbromin), metafen (nitromersol). Mecanismo de ação semelhante aos compostos inorgânicos. Compostos de Prata Nitrato de prata (AgNO3): É usado para prevenir infecções oculares por gonococos em recém-nascidos. É usado para prevenir infecções em queimaduras. Mecanismo de ação: precipita proteínas celulares, interfere nas atividades metabólicas das células microbianas. Possui efeito germicida. Metal: é usado em filtros de água Compostos a base de cobre Sulfatos (CuSO4): Efetivo como um algicida em reservatórios de água e piscinas. Usado como fungicida em plantas. Metal:  usado no dispositivo intrauterino (D.I.U), possuindo ação tóxica contra os espermatozóides. Atividade prática 1. Preparo da suspensão bacteriana, de  Staphylococcus aureus , em soro fisiológico. Obter turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, feita com sulfato de bário. Isto é, 105 a 106 UFC/ mL (Unidades Formadoras de Colônias); 2. Espalhamento da suspensão bacteriana no meio sólido de agar nutriente com auxilio de “swab” (técnica de sementeira de superfície) em duas placas de petri ; 3. Colocar uma moeda de prata estéril sobre o meio de cultura de uma placa. Colocar uma moeda de cobre estéril sobre o meio de cultura da outra placa. Identificar as placas; 4. Incubar as placas, sem inverter, em estufa a 37ºC por 18/24 h; 5. Observar os resultados. 43

17- ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS DO SOLO  A microbiota do solo compreende uma grande diversidade de micro-organismos incluindo bactérias, fungos, algas, protozoários e vírus. Desses, as bactérias - actinomicetos e cianobactérias - juntamente com os fungos, constituem os grupos predominantes nos diversos tipos de solo. Esses micro-organismos efetuam a ciclagem e a transformação de elementos químicos essenciais para a natureza. Os actinomicetos são bactérias aeróbias do solo que formam um micélio composto de hifas ramificadas, multiplicam-se por fragmentação ou por produção de esporos e são importantes produtores de antibióticos.  A metodologia a ser utilizada para o isolamento desses micro-organismos será a técnica de Pour Plate (placa derramada) e o meio de cultura que será usado, têm a característica de seletividade, mas não é exclusivo para actinomicetos.

Metodologia  Pesar uma porção de solo de 10 gramas e colocar em placa de Petri. Colocar em estufa a 56ºC e deixar por 24 horas, para determinação do peso seco do solo.  Pesar uma porção de solo sem secar de 10 gramas para a contagem global de acordo com o método descrito a seguir:  Fazer suspensão de 0,5 grama de solo em 4,5 mL de salina estéril (10 -1). Pipetar 0,5 mL da diluição 10 -1 e transferir para um tubo de ensaio contendo 4,5 mL de salina estéril (10-2). Repetir o processo em mais 06 tubos (até 10 -8)  Em oito placas de Petri, estéreis (identificadas de 10-1 a 10-8), pipetar 1 mL das respectivas diluições da suspensão do solo.  Fundir oito tubos contendo 16 mL do meio de cultura esterilizado e resfriado a aproximadamente 56º C. Verter o meio em cada uma das placas e homogeneizar rapidamente por “Pour Plate”. Esperar o meio solidificar e incubar as placas invertidas à temperatura ambiente por 48-72 horas. Meio de cultura para o isolamento de actinomicetos do solo Glicerol 10 mL MgSO4 0,25g K2HPO4 1,25g KNO3  2,10g CaCO3 1,00g Extrato de leveduras 0,10g  Aferir o pH (7,0), distribuir em tubos de ensaio (15 mL) Oligoelementos (sais) 0,10 mL e esterilizar a 121º C durante 15 minutos.  Ágar 15,0g  Água destilada 1000mL

Realizar a leitura e interpretação dos resultados Determinação do peso seco do solo Pesar o solo seco e fazer o seguinte cálculo % água = (PI-PS)/ PI x 100 PI= Peso inicial do solo PS= Peso seco do solo Observar as características (formato, coloração, borda) das colônias e o processo de antibiose entre micro-organismos de diferentes grupos. 44

18- ALTERAÇÕES FENOTÍPICAS E GENOTÍPICAS O grande desenvolvimento da genética nos últimos anos se deve, em grande parte, à utilização dos micro-organismos nas pesquisas. Dentre os micro-organismos empregados em estudos genéticos, as bactérias merecem destaque especial, dado o curto tempo de geração e o grande número de células que podem ser obtidas em reduzido espaço. Além disso, alterações causadas por mutações podem ser facilmente identificadas nesses organismos. A mutação, juntamente com a recombinação, é geradora de variabilidade genética. Ela pode ser definida como uma alteração hereditária na seqüência de bases do DNA de um organismo. O indivíduo que carrega essa alteração é denominado mutante. Mutação pode ocorrer espontaneamente ou pode ser induzida por agentes físicos e químicos. Mutantes resistentes a antibióticos podem ser selecionados pelo plaqueamento direto das bactérias em meio contendo o antibiótico apropriado. O mutante apresenta o genótipo diferente da linhagem parental. O genótipo representa o conjunto completo de genes de um organismo Bactérias recombinantes podem ser obtidas naturalmente por transformação, conjugação e transdução. Por técnicas de engenharia genética, podemos introduzir plasmídeos recom binantes em bactérias competentes, tratadas artificialmente. O método de produção de bactérias quimiocompetentes mais utilizado é o do cloreto de cálcio. O plasmídeo é introduzido nas células quimiocompetentes (transformação) por choque térmico. Assim, essas bactérias transformadas possuem alterações genotipicas quando comparadas as bactérias selvagens.  As alterações genotípicas são alterações no DNA e são transmitidas de uma geração a outra. O genótipo associado ao meio ambiente determina o fenótipo de um organismo. Tanto modificações genotipicas quanto ambientais podem provocar alterações fenotipicas. Porém, as modificações fenotipicas causadas pelas modificações ambientais são reversíveis. O efeito da temperatura de incubação sobre a produção de pigmentos por Serratia marcescens  é um exemplo de alteração fenotípica.

OBJETIVOS 1. Observe as alterações na produção de pigmentos por Serratia marcescens cultivada em diferentes temperaturas. 2. Isolamento de mutantes resistentes à ampicilina pela técnica da placa gradiente 3. Observação de colônias mutantes resistentes à ampicilina 4. Observação do crescimento de cepas de E. coli   sensíveis (selvagem) à ampicilina em meio LB sem ampicilina, e, a ausência de crescimento em meio LB acrescido de ampicilina.

MATERIAL Micro-organismos: Serratia marcescens E. coli selvagem - sensível a ampicilina.

Meios e soluções: Meio Luria Broth liquido e sólido. Meio BHI líquido e sólido. Solução de ampicilina (100 mg/ml). 45

Equipamentos: estufas a 37ºC e 40ºC Materiais: tubos de cultura pequenos, placas de Petri, alça de platina.

PROCEDIMENTO II. A) Produção de pigmento por S. marcescens Inocule, com alça de platina, o meio sólido de dois tubos contendo ágar inclinado fazendo estrias. Incube um dos tubos à temperatura ambiente e outro a 40ºC, por 48 hs. II. B) Confirmação da sensibilidade da E. coli  selvagem à penicilina Com auxilio de alça de platina flambada e fria, inocule a cepa sensível fazendo estrias simples no meio LB acrescido de ampicilina (100 mg/ml) Com auxilio de alça de platina flambada e fria, inocule a cepa sensível fazendo estrias simples no meio LB sem ampicilina. Incube as placas invertidas em estufa a 37ºC, por 18 - 24hs; Observe os resultados. II. C) Isolamento de mutantes resistentes à ampicilina pela técnica da pl aca gradiente O Isolamento é realizado após confirmação da sensibilidade da E. coli   selvagem à ampicilina. Preparar placas de Petri segundo técnica da placa gradiente (Figura abaixo). Usar tratamentos contendo no meio de cultura acrescido de ampicilina nas seguintes concentrações: 25, 50, 75 e 100 mg/ml;  Após solidificação espalhar com auxilio de swab, cultura pré-crescida (18 h) de E. coli sensível à ampicilina sobre o meio de cultura dos tratamentos descritos no item a; Incube as placas invertidas em estufa a 37ºC, por 18 - 24hs.

TÉCNICA DA PLACA GRADIENTE Concentração máxima (+)

Adição de meio em placa com ligeira inclinação

Adição de segunda camada de meio com o antibiótico penicilina, com a  placa na posição normal

Concentração mínima (-)

Difusão do antibiótico

Semeadura de bactéria

Mutantes resistentes

Crescimento total Placa vista por cima

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19- UROCULTURA Princípio  Amostras de urina devem ser submetidas à cultura quando existe suspeita de infecção do trato urinário, para controle de tratamento ou em pacientes assintomáticos com alto risco de infecção. Os agentes etiológicos que mais freqüentemente causam este tipo de infecção são as enterobactérias, como Escherichia coli   (70% dos casos), Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Enterobacter   spp., e entre os cocos gram-positivos os mais freqüentes são os estafilococos, destacando o Staphylococcus saprophyticus e o Enterococcus spp.

Material Clínico a) Coleta Colher, preferencialmente, a primeira urina da manhã em frasco estéril de tampa com rosca e de boca larga, antes da antibioticoterapia. Outras amostras também podem ser obtidas desde que o paciente retenha a urina por, pelo menos, 2 horas antes de realizar o exame. b) Transporte  Amostras transportadas em temperatura ambiente (20 a 25°C) devem ser processadas em até 2 horas. Após este tempo, a amostra deve ser refrigerada (2 a 8°C) e processada em até 24 horas. Se for colhida em tubo contendo preservativo (ácido bórico), a amostra pode permanecer à temperatura ambiente (20 a 25°C) até 24 horas antes de ser processada. c) Volume O volume mínimo de urina que pode ser recebido vai depender do método de cultura empregado. Em geral, para cultura, 2 mL são suficientes. Como Reportar o Resultado Independente do tipo de coleta realizado, o resultado da cultura de urina deve sempre ser quantitativo e reportado em unidades formadoras de colônias por mililitro de urina (UFC/mL). Em casos de dúvidas na interpretação, sugerir repetição do exame para esclarecimento diagnóstico. Cultura negativa- não houve crescimento de micro-organismos. Cultura positiva- 100.000 UFC/mL de Escherichia coli , p. ex.

Comentários  A coleta e o transporte inadequados da amostra podem levar a resultado de difícil interpretação. Portanto, a medida mais importante para realizar uma cultura de urina é estabelecer rígidos critérios de coleta e dar treinamento constante para os profissionais envolvidos na realização da coleta e do exame. Para melhor interpretação da cultura de urina o ideal é realizar a análise do sedimento urinário para verificar o número de leucócitos e a presença ou não de micro-organismos. Qualquer micro-organismo pode ser importante, mesmo se isol ado em quantidades inferiores a 105 UFC/mL.

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Atividade Prática 1. Microscopia de Gram  Homogeneizar bem a amostra de urina (sem centrifugar).  Retirar 10 μL da urina e colocar em uma lâmina, sem espalhar.  Deixar secar ao ar.  Fixar no calor antes de corar.  Reportar o número de micro-organismos observados por campo de imersão (raros, alguns ou numerosos). Nota: a presença de um ou mais micro-organismos por campo correlaciona geralmente com  105UFC/mL. A presença de muitas células epiteliais e de mais de um tipo de micro-organismo no Gram sugere contaminação da amostra de urina em decorrência da coleta. 2. Cultura  A. Semear parte da amostra de urina em uma placa de agar EMB. B. Técnica de Pour-Plate: contagem de colônias  Retirar 0,1 mL da amostra de urina e transferir para tubo 1 contendo 0,9 mL de salina. Retirar 0,1 mL do tubo 1 (diluição 10 -1) e transferir para o tubo 2 contendo 0,9 mL de salina (diluição 10 -2) e assim sucessivamente até o tubo 6;  Transferir 0,1 mL dos tubos de diluição para a placa de Petri vazia e estéril; (bancada 1: diluição 10 -3, bancada 2: diluição10-4, bancada 3: diluição 10 -5, bancada 4: diluição 10 -6);  Depositar na placa de 15 a 20 mL de agar casoy fundido (+/- 45°C);  Realizar movimentos circulares para que ocorra a incorporação do inoculo diluído no meio;  Esperar solidificar e inverter a placa.  Incubar a 37°C durante 24 horas e após este período, anotar as características de colônias crescidas em cada um dos meios. 3. Sistema API 20 E O API 20 E é um sistema para a identificação das Enterobacteriaceae e outros bacilos Gram negativos não fastidiosos que utiliza 21 mini-testes bioquímicos padronizados e uma base de dados. a) Princípio  A galeria API 20 E comporta 21 microtubos que contêm substratos desidratados. Os microtubos são inoculados com uma suspensão bacteriana que reconstitui os meios. As reações produzidas durante o período de incubação traduzem-se pelas mudanças de cor espontâneas ou reveladas através da adição de reagentes. b) Tratamento das amostras O API 20 E não deve ser utilizado diretamente em amostras de origem clínica. Os microorganismos a identificar devem primeiro ser isolados num meio de cultura adaptado à cultura de bacilos Gram negativos segundo as técnicas habituais de bacteriologia. c) Preparação da galeria  Reunir fundo e tampa de uma caixa de incubação e distribuir cerca de 5 mL água destilada nos alvéolos para criar uma atmosfera úmida.  Identificar a amostra na lingüeta lateral da caixa d) Preparação do inóculo  Abrir uma ampola de NaCl 0,85% (5 mL) (próprio Kit) ou utilizar um tubo contendo 5 mL de soro fisiológico estéril ou de água destilada estéril.  Coletar uma única colônia bem isolada do micro-organismo  Preparar uma suspensão bacteriana homogeneizando cuidadosamente as bactérias no meio. 48

e) Inoculação da galeria  Encher os tubos e cúpulas dos testes “CIT”, “VP”, “GEL” com a suspensão bacteriana.  Encher unicamente os tubos ( e não as cúpulas) dos outros testes.  Criar uma anaerobiose nos teste ADH, LDC, ODC, H 2S, URE enchendo as cúpulas com óleo de parafina.  Fechar a caixa de incubação  Incubar a 35°C-37°C durante 18-24 horas. f) Resultados  Realizar a leitura e anotar os resultados.  Se 3 ou mais testes forem positivos, revelar os testes que necessitam da adição de reagentes (TDA, IND, VP, NO2).  Se o número de testes positivos for inferior a 3, não adicionar os reagentes mas incubar a galeria por mais 24 horas e realizar testes adicionais. g) Identificação  A identificação é obtida a partir do perfil numérico. Na ficha de resultados, os testes são separados por grupos de três e um valor 1, 2 ou 4 é indicado para cada teste. A soma dos valores de cada teste positivo resultará num número final, representante de cada grupo de 3 testes. No final obtém-se um perfil numérico de 7 algarismos; estes algarismos são lançados em uma planilha que nos remeterá à provável espécie desta bactéria. Por exemplo: +

1 ONPG

-

+

+

+

-

+

-

-

2

4

1

2

4

1

2

4

ADH LDC ODC

5

CIT H2S

3

Resultado numérico: 5 315 173

URE TDA IND

1

banco de dados

Enterobacter gergoviae

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20- ESTUDO DOS FUNGOS ANEMÓFILOS O ar atmosférico possui flora fúngica muito rica. Encontramos os esporos que são as formas de disseminação destes micro-organismos pelo meio ambiente. Os esporos dos fungos constituem-se em unidades de propagação da espécie, à semelhança das sementes das plantas. Muitas vezes estes esporos são os responsáveis pela transmissão de doenças como as alergias. Estes fungos encontrados no ar são denominados anemófilos, o que significa “amigos do ar”. Os fungos estão no ar devido à dispersão pelos ventos, pois na realidade os mesmos vivem no solo, nas plantas, ou em outras fontes de matéria orgânica.  A umidade e a poeira são os principais responsáveis pela presença desses microorganismos em locais tais como banheiros, bibliotecas, salas de aula, etc. Muitas vezes fazemos a determinação da flora fúngica presente no ar para verificarmos se alguns dos fungos encontrados são capazes de transmitir doenças. A determinação da flora fúngica também tem importância para verificarmos o índice de poluição ambiental por fungos. Pode-se encontrar no ar esporos e hifas, sendo estas isoladas com menos freqüência.  As classes encontradas com mais freqüência são: Zygomycotina e Deuteromycotina.

TÉCNICA  Deixar exposta ao ar atmosférico por 20 minutos, placas de Petri contendo ágar Sabouraud;  Ao expor a placa, tomar o cuidado de manter a tampa com a face interna voltada para baixo e apoiada nos bordos da placa. Neste período, não tocar mais na placa.  Incubar as mesmas por quatro a cinco dias. Examinar as placas, contando o número de colônias de bolores e leveduras formadas.  Se houver necessidade de identificação dos fungos, isolá-los para tubos contendo ágar Sabouraud.  Algumas informações a respeito da micromorfologia dos fungos presentes na placa poderão ser obtidas através da microscopia de fragmento da colônia, corado com lactofenol azul algodão. MONTAGEM DE LÂMINA DE MICROCULTIVO Cultivar o fungo em bloco de ágar batata depositado na superfície de lâmina contida em câmara úmida. Lamínula deverá ser colocada na superfície do meio. Após o desenvolvimento, o fungo que cresceu aderido à lamínula é examinado microscopicamente (40x) com adição de corantes (Lactofenol-azul algodão). As características que deverão ser observadas na lâmina de microcultivo são basicamente as mesmas já descritas anteriormente. A vantagem do microcultivo é de que as estruturas de esporulação ficam bastante preservadas. Pode-se organizar um laminário (arquivo) com microcultivo de diferentes fungos.

MONTAGEM DE COLÔNIA GIGANTE Inocular o fungo no centro de uma placa de Petri contendo ágar Sabouraud. Manter a placa em posição invertida, à temperatura ambiente, até desenvolvimento do fungo (geralmente de 5 a 20 dias).

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Observar e anotar:

CARACTER STICAS DA COLÔNIA ASPECTOS DO MICÉLIO Cotonoso Lanoso Feltroso Pulverulento

ASPECTOS GERAIS Velocidade de crescimento

TOPOGRAFIA DA SUPERFÍCIE Dobras

Cor da colônia (verso e anverso) Sulcos Consistência: Pregas Coriácea Branda Elevações Cremosa

CONTORNO Circular Irregular Amebóide Rizóide Elíptico Oval

Situação do micélio aéreo e profundo, Presença de pigmentos difusíveis, etc. Meios de cultura mais comumente utilizados em micologia  Agar Sabouraud Dextrose Peptona  Agar  Água destilada

20g 10g 15g 1.000 mL

Ferver a água e acrescentar ao ágar e após a dissolução do mesmo, adicionar a dextrose e a peptona. Distribuir em tubos ou balões e autoclavar. Caldo Sabouraud  A composição em relação ao ágar Sabouraud, difere somente em relação à ausência do ágar.  Agar sabouraud com penicilina  Agar Sabouraud estéril Penicilina G potássica

1.000 mL 40.000 Unidades

Homogeneizar e distribuir em tubos estéreis. Dermatophyte Teste Medium (DTM) Phytone Dextrose Solução de vermelho de fenol (1) Solução de ácido clorídrico 0,8 M Cicloheximida (2) Sulfato de gentamicina (3) Tetraciclina (4)  Agar  Água destilada qsp

10 g 10 g 40 mL 6 mL 0,5 g 100 mg 100 mg 20 g 1.000 mL 51

Solução de Vermelho de Fenol: Vermelho de fenol Hidróxido de sódio 0,1 M  Água destilada qsp

0,5 g 15 mL 100 mL

(2) A cicloheximida (Actidione) deverá ser previamente solubilizada em 2 mL de acetona. (3) Utilizar ampolas de Garamicina de 100 mg. (4) Dissolver a tetraciclina (Clortetraciclina) em 10 mL d e álcool absoluto e adicionar ao meio já esterilizado. OBS. A tetraciclina poderá ser substituída por cloranfenicol. Neste caso, o antibiótico poderá ser adicionado ao meio antes da autoclavagem.  Após dissolução de todos os componentes do meio, medir o p H, o mesmo deverá ser 5,0 (O meio deverá ter coloração amarela). Distribuir o meio em tubos de ensaio e autoclavar.  Agar Batata Extrato de batatas * Dextrose  Agar  Água destilada qsp

250 mL 20 g 20 g 1.000 mL

Preparo do extrato de batatas: Batatas em pedaços (sem casca)  Água destilada

100 g 300 mL

Cozinhar as batatas em banho-maria fervente durante 1 hora. Filtrar o infuso através de gaze. Completar o volume do filtrado para 300 mL. O meio de cultura é distribuído em tubos ou balões e, a seguir, autoclavado.  Agar Malte Extrato de malte 30 g  Agar 15 g  Água destilada 1.000 mL O meio é distribuído em tubos de ensaio e autoclavado.

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21- MÉTODOS PARA O ESTUDO DE LEVEDURAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES 1- Isolar o fungo em cultura pura. 2- Cultivar o fungo em caldo Sabouraud e manter o tubo de cultura a 37ºC por 48 horas. Observar: Formação de depósito, Turvação, Floculação, Bolhas, Película na superfície. 3- Pesquisar a formação de tubos germinativos através da inoculação de culturas recentes (2448 horas) em solução de Bacto-peptona ou soro de cavalo. Incubar a suspensão a 37ºC durante 3 a 4 horas (banho-maria). 4- Pesquisar a formação de clamidosporos em ágar fubá Preparo do meio de cultura Fubá Tween 80  Agar  Água destilada qsp

40 g 10 mL 20 g 1.000 mL -maria

fervente. Filtrar em gaze (5 camadas). Misturar o filtrado com os demais componentes. Distribuir o meio de cultura em tubos e autoclavar. Procedimento: Colocar ± 2 mL de agar fubá, fundido, em lâmina apoiada em suporte de vidro, dentro de placa de Petri (Todo o conjunto deverá estar estéril). Inocular amostra da levedura, estrias finas, e cobrir o ágar com lamínula estéril. Colocar dentro da placa chumaço de algodão embebido em água estéril. Incubar o conjunto a temperatura ambiente por 48 - 72 horas. Fazer leitura microscópica empregando objetiva 40X. 5- Auxanograma - Utilização de Fontes de Carbono. Meio Basal: Sulfato de amônio Fosfato biácido de potássio Sulfato de magnésio hepta hidratado  Agar  Água destilada

5g 1g 0,5 g 20 g 1.000 mL

Distribuir o meio em tubos de ensaio e autoclavar. Procedimento técnico do auxanograma:  Fazer suspensão da levedura em tubo contendo água destilada estéril (correspondência ao tubo no 1 da escala de MacFarland).   Colocar a suspensão da levedura no fundo da placa de Petri. 53