Analisis Kuantitatif Gula Pereduksi Metode Somogyi-Nelson 1. Prinsip Meto Metode de ini ini digu diguna naka kan n untu untuk k mene menent ntuk ukan an kada kadarr gluk glukos osaa dalam dalam dara darah. h. Prot Protei ein n diendapkan dengan ZnSO dan !a"O#$%. Kupri oksida dioksidasi oleh larutan tem&aga alkali dengan mem&entuk kupro oksida "'uO$( kemudian kupro oksida ini dioksidasi kem&ali dengan asam arsen moli&dat yang akan mem&entuk )arna &iru arsenomoli&dat. %. 'ara mem&uat pereaksi Larutan ZnSO4 5% • *arutkan +, g ZnSO . # %O dengan auades dalam la&u ukur dan tera hingga •
/olume akhirnya men0adi 1,,, m*. Barium hidroksida 0,3 N *arutkan (%+ g !a"O#$ % . 2 # %O dengan auades dalam la&u ukur dan tera hingga /olume akhirnya men0adi 1,,, m*. *arutan ini harus distandarisasi terhadap larutan ZnSO +3 dengan 4ara mentitrasinya dengan indikator fenolftalein. Se&anyak 1, m* larutan ZnSO +3 dien4e dien4erkan rkan dengan dengan 1,, m* auade auades( s( lalu lalu tam&ah tam&ahkan kan satu tetes tetes fenolf fenolftale talein in dalam dalam erlenmeyer %+, m*( dan titrasi dengan larutan !a"O#$ % ,(5 N harus tepat 1, m*( &ila tidak(
•
maka sempurnakan agar dapat tepat 1, m* dan titrasi ulang. Pereaksi Pereaksi tembaga alkali (Somogi! *arutkan %2 g Na %PO anhidrat dan , g garam K-Na-tartrat "garam 6o4helle$ dalam ,, m* auades. 7am&ahkan 1,, m* NaO# 1 N(lalu 4ampur. 8engan pengadukan 4epat( tam&ah tam&ahkan kan 2, m* 'uSO 'uSO 1,3( 1,3( kemudi kemudian an tam&ah tam&ahkan kan 12, g Na %SO anhidrat. anhidrat. Setelah ter4amp ter4ampur ur sempurn sempurna( a( tera dengan dengan auade auadess hingga hingga /olume /olume akhirny akhirnyaa men0adi men0adi 1,,, 1,,, m*. !iarkan selama % hari dan saring dengan kertas saring 9hatman No. ,. *arutan ini dapat
•
&ertahan dalam )aktu lama. :ungsi garam 6o4helle adalah untuk mensta&ilkan )arna. Pereaksi arsenomolibdat (Nelson! *arutk *arutkan an %+ g amoniu amonium m moli& moli&dat dat dalam dalam +, m* auades( auades( dan se4ara se4ara hati-ha hati-hati ti tam&ahkan tam&ahkan sedikit demi sedikit sedikit %1 m* # %SO pekat. *arutkan 5 g Na#AsO . #%O dalam %+ m* auades dan tam&ahkan asam moli&dat( lalu 4ampurkan &aik-&aik dan tempatkan dalam inku&ator 5 o' selama 2 0am. !ila ingin 4epat digunakan( maka tempatkan pada suhu ++o' selama %+ menit sam&il diaduk untuk men4egah kele&ihan kele&ihan panas pada &agian tertentu yang dapat menye&a&kan peru&ahan )arna. Simpan pereaksi pada &otol &er)arna gelap dan
•
tertutup. Standar glukosa Standa Standarr glukos glukosaa ini mengan mengandun dung g glukos glukosaa ,(,+ ,(,+ mg;m*. mg;m*. *arutk *arutkan an + m* larutan larutan glukosa stok "1 g glukosa dalam 1,, m* asam &en
asam &en
Se&anyak 1 m* sampel darah dalam erlenmeyer ditam&ahkan 1+ m* auades. 'ampur perlahan dan tam&ahkan % m* ,(5 N !a"O#$ % dan 4ampur. Setelah 4ampuran &eru&ah men0adi &er)arna 4okelat( tam&ahkan % m* ZnSO +3( kemudian aduk dan saring. Siapkan 5 ta&ung :olin-9u( yang masing-masing terdiri dari >
!lanko diisi dengan % m* auades Sampel diisi dengan % m* filtrat darah Standar diisi dengan % m* glukosa standar Ke dalam masing-masing ta&ung( tam&ahkan % m* larutan 'uSO alkali dan 4ampur. 7empatkan masing-masing ta&ung terse&ut dalam air mendidih tepat 1, menit( lalu pindahkan ke dalam air dingin selama 5 menit. 7am&ahkan % m* pereaksi arsenomoli&dat ke dalam masing-masing ta&ung( 4ampur( dan en4erkan masing-masing larutan dengan auades hingga /olume akhirnya men0adi %+ m*. 7utup dan ko4ok &e&erapa kali agar &er4ampur( lalu ukur a&sor&annya dengan spektrofotometer pada pan0ang gelom&ang +%, nm( dengan nilai nol untuk &lanko.
. Penyiapan kur/a standar a. !uat larutan glukosa standar "1, mg glukosa anhidrat;1,, m*$ &. 8ari larutan glukosa( lakukan ? kali pengen4eran( sehingga diperoleh larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing %(,@ (,@ +(,@ ?(,@ 2(,@ dan 1, mg;1,, m*. 4. Siapkan ta&ung reaksi yang &ersih dan kering( kemudian isilah masing-masing dari keenam ta&ung dengan 1 m* larutan glukosa standar di atas( sedangkan satu ta&ung lainnya isi dengan 1 m* auades se&agai &lanko. d. Ke dalam setiap ta&ung di atas( tam&ahkan 1 m* pereaksi Nelson( lalu panaskan semua ta&ung dalam penangas air mendidih selama %, menit. e. Am&il semua ta&ung dan segera dinginkan &ersama-sama dengan memasukkan ke dalam gelas kimia yang &erisi air dingin( sehingga suhu ta&ung men4apai %+ o'. f. Setelah dingin( tam&ahkan ke dalam setiap ta&ung 1 m* pereaksi Arsenomoli&dat. Go0ok sampai semua endapan 'u%O yang ada larut kem&ali. g. Setelah semua endapan 'u%O larut sempurna( tam&ahkan m* auades dan go0oklah sampai homogen. h. Selan0utnya( &a4a serapan atau a&sor&ansi "A$ masing-masing larutan pada spektrofotometer i.
dengan pan0ang gelom&ang +, nm. !uat kur/a standar yang menun0ukkan hu&ungan antara kadar glukosa dan a&sor&ansi. untuk menggam&arkan kur/a hu&ungan kadar dan a&sor&ansi( dapat digunakan metode kuadrat terke4il " Least-Squares$ agar diperoleh garis lurus yang konstan. Metode sering digunakan untuk menentukan ketepatan garis yang ter&aik pada pem&uatan kur/a &aku "standar$.
Persamaan *east-Suares yang men0elaskan satu garis lurus "linier$ di&erikan oleh persamaan > " # a $ b
dengan > "a&sis$
B Kadar larutan glukosa standar "mg;1,, m*$
C "ordinat$
B A&sor&ansi
a dan b
B 7etapan yang dihitung dari persamaan
a = {N (DEy$ - "DE$ "Dy$F ; "Dy %$ "Dy%$F
a = {(Dy%) (DE$ - "Dy$ "DEy$F ; N "Dy %$ "Dy%$F
dengan > N B !anyaknya pengamatan !. Analisis Kuantitatif Glukosa Metode 8initrosalisilat "8NS$ 1. Prinsip Metode ini digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik kolorimetri. 7eknik ini hanya dapat mendeteksi satu gula pereduksi( misalnya glukosa. Glukosa memiliki gugus aldehida( sehingga dapat dioksidasi men0adi gugus kar&oksil. Gugus aldehida yang dimiliki oleh glukosa akan dioksidasi oleh asam 5(+-dinitrosalisilat men0adi gugus kar&oksil dan menghasilkan asam 5-amino-+-salisilat pada kondisi &asa dengan suhu ,-1,,o'. Senya)a ini dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada pan0ang gelom&ang +, nm. %. 'ara mem&uat pereaksi 8NS Se&anyak + g asam 5(+-dinitrosalisilat dan + g NaO# % N dilarutkan dalam 1,, m* auades "larutan A$. Se&anyak 1+, g natrium kalium tartarat dilarutkan dalam %,, m* auades "larutan !$. *arutan A dan ! di4ampur( lalu ditera dalam la&u takar dengan auades hingga /olume akhirnya men0adi +,, m*( kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik selama satu malam. 5. Metode !uat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing ,( %,,( ,,( 2,,( 1%,,( 1?,,( dan %,,, ppm. Masing-masing larutan diam&il 1 m*( lalu tam&ahkan 5 m* pereaksi 8NS. Kemudian( masing-masing larutan di/orteks dan dipanaskan dalam air
mendidih selama + menit. Setelah dingin( masing-masing larutan dien4erkan + kali dan di/orteks kem&ali. Hkur a&sor&annya dengan spektrofotometer pada pan0ang gelom&ang +, nm( kemudian &uat persamaan liniernya se&agai kur/a standar. Pengukuran kadar gula pereduksi pada sampel dilakukan dengan 4ara mengam&il 1 m* sampel kemudian ditam&ahkan 5 m* pereaksi 8NS. Proses selan0utnya sama seperti pada larutan glukosa standar( kemudian nilai pengukuran yang diperoleh diplot pada kur/a standar. '. Analisis Kuantitatif Glukosa Metode Asam :enol Sulfat 1. Prinsip Metode ini dise&ut 0uga dengan metode 7S "total sugar $ yang digunakan untuk mengukur total gula. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula pereduksi. Gula sederhana( oligosakarida( dan turunannya dapat dideteksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat yang akan menghasilkan )arna 0ingga kekuningan yang sta&il. %. Metode !uat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing ,( 1,,( %,,( 5,,( ,,( dan +,, ppm. Masukkan ,(+ m* dari masing-masing larutan ke dalam ta&ung yang terpisah( kemudian rendam dalam air( lalu tam&ahkan ,(+ m* fenol +3 dan %(+ m* # %SO pekat dengan hati-hati melalui dinding ta&ung. !iarkan selama 1, menit( lalu /orteks dan &iarkan kem&ali selama %, menit. Hkur a&sor&annya dengan spektrofotometer pada pan0ang gelom&ang , nm( kemudian &uat persamaan liniernya se&agai kur/a standar. Pengukuran sampel dilakukan dengan 4ara memasukkan ,(+ m* larutan sampel ke dalam ta&ung( lalu rendam dalam air( kemudian tam&ahkan ,(+ m* fenol +3 dan %(+ m* # %SO se4ara hati-hati. Proses selan0utnya sama seperti pada larutan glukosa standar( kemudian nilai pengukuran yang diperoleh diplot pada kur/a standar. 8. Analisis Kuantitatif Gula Pereduksi Metode *ane-=ynon 1. Prinsip Penentuan gula 4ara ini adalah dengan 4ara menitrasi reagen soEhlet "larutan 'uSOK-Na tartrat$ dengan larutan gula yang diselidiki. !anyaknya larutan 4ontoh yang di&utuhkan untuk menitrasi reagen soEhlet dapat diketahui &anyaknya gula yang ada dengan melihat pada ta&el *ane-=ynon. Pada titrasi reagen soEhlet dengan larutan gula akan &erakhir apa&ila )arna larutan &eru&ah dari &iru men0adi tidak &er)arna. Indikator yang digunakan pada 4ara ini adalah methilen &lue. =. Analisis Kuantitatif Glukosa Metode Anthrone
8asar dari reaksi ini adalah kemampuan kar&ohidrat untuk mem&entuk turunan furfural dengan ke&eradaan asam dan panas( yang kemudian diikuti dengan reaksi dengan anthrone yang menghasilkan )arna &iru kehi0auan. H0i Anthrone ini memiliki kele&ihan dalam hal sensitifitas dan kesederhanaan u0inya"Koehler 1+%$.Se0umlah ke4il kar&ohidrat dapat mem&erikan )arna yang terdeteksi denganmenggunakan spektrofotometer. Kekurangan dari Metode Anthrone adalah ketidaksta&ilan dari reagen "anthrone yangdilarutkan dalam asam sulfat$( sehingga perlu dilakukan persiapan reagen yang &aru setiap hari.
