UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS ESCUELA DE QUIMICA QUÍMICA
ANÁLISIS CUANTITATIVO DE CARBOHIDRATOS QUANTITATIVE ANALYSIS OF CARBOHYDRA C ARBOHYDRATES TES Correa Fuentes Juanita Del Pilar Soracá Pérez Gina Yasmin
Fecha de entrega del informe: 18-03-2015 Resumen: Los carbohidratos presentes en las muestras problema se determinaran por el método colorimétrico fenol-sulfúrico, donde las soluciones ( patrón y muestras problema) de carbohidratos se someten a una serie de reacciones con fenol y ácido sulfúrico para producir complejos coloreados activos en UV-VIS, y se genera una curva de calibración. Se realiza el test de Nelson para determinar si los carbohidratos son o no reductores seguido de una hidrolisis hidrolisis acida para los carbohidratos no reductores. Por el método de DNS se determina la concentración de glucosa y su peso promedio promedio en las muestras problema, partiendo de la curva de calibración. P alabras labras c laves laves : UV-VIS, Soluciones patrón, Curva de calibración.
Abstract: The carbohydrates present in the test samples by the phen ol-sulfuric acid colorimetric method in which solutions (standard and unknown samples) carbohydrates undergo a series of reactions with phenol and sulfuric acid to produce active complexes underwent colored UV was determined VIS, and a calibration curve is generated. Nelson test is performed to determine whether or not reducing carbohydrates are followed by acid hydrolysis to the non-reducing carbohydrates. By the DNS method and the glucose concentration c oncentration is determined the average weight in the test samples, based on the calibration curve. Keywords: UV-VIS, standard solutions, calibration curve.
Introducción –H2SO4 los En el método fenol – carbohidratos serán destruidos por calor y por ácido, los carbohidratos son particularmente sensible a ácidos fuertes y a altas temperaturas. (1) Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano
que se condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos oscuros o compuestos coloridos, producto de la condensación denominados compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol. Este método es fácil, eficaz y rápido. (2) (Ver Anexo A)
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Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que estos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. La forma en que procede la reacción no es estequiométrica y depende de la estructura del azúcar, por lo tanto se realiza una curva patrón.(3)
absorbancia a una longitud de onda.
determinada
El reactivo de Benedict está constituido por una disolución de sulfato de cobre II, citrato de sodio y carbonato de sodio. Al tratar al azúcar con estos reactivos, experimentan una reacción de oxidación. El cobre (II) en disolución acuosa, de color azul, se reduce a cobre (I), el cual precipita como oxido de cobre (I), de color rojo.
El test de Nelson se realiza para determinar cuáles azucares son reductores, por una coloración rojo ladrillo producida por la reducción de Cu+2 a Cu+1.
(Ver Anexo C)
Resultados y discusión
Azúcar reductor+ Cu+2 → Cu+1.+ Azúcar reductor
1. Determinación
Cuantitativa (espectrofotométrica) de azúcares totales.
En el método de DNS para azucares reductores, en disolución alcalina el azúcar se enoliza produciendo un compuesto que reduce a un grupo nitro del DNS, para dar el producto mono amino correspondiente. Esta reacción da un producto colorido en solución alcalina. El procedimiento original de Dahlquist ha sido modificado en un proceso automatizado para análisis de azúcares totales producidos por la hidrólisis de polisacáridos que no contengan almidón. Para éste se requiere tener estándares similares a la muestra.
Se parte de una mezcla de carbohidratos glucosa/sacarosa con una concentración de [0,05 M]. La concentración para las soluciones de la curva de calibración se determinan haciendo los cálculos por dilución, ya que para realizarla se presentó la siguiente adición de compuestos:
Tabla 1. Curva de Calibración.
(Ver Anexo B)
Después de realizar la reacción de los carbohidratos con fenol y ácido sulfúrico se obtuvo muestras coloreadas de marrón oscuro, esta coloración indica que si hay presencia de carbohidratos y que estos al reaccionar generaron complejos coloridos.
El método DNS se basa en la reducción del ácido 3,5-dinitrosalicilico (el cual se encuentra de color amarillonaranja) por la glucosa al acido 3amino-5-nitrosalicilico (de color rojo oscuro), cuya presencia puede detectarse por la lectura de la
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Al agregar el ácido sulfúrico a los carbohidratos, se presentó una reacción exotérmica en todas las muestras, y se formaron dos fases la superior marrón oscura y la inferior amarilla, luego se homogenizaron. CC*VC=CD*VD
Solución 6 CD=0,5 ml * 0,05 M / 0,5 ml = 0,05 M Dilución 1/10 ml Cd=0,5 ml * 0,05 M / 5ml Cd= 5*10-4 M En la tabla se muestran las absorbancias y concentraciones de las soluciones, las muestras problema X1, X2 y X3 utilizaron un factor de dilución 1/20 ml.
Solución 1 La concentración es cero, pues no se le adiciono solución de carbohidratos. Solución 2 CD=0,4 ml * 0,05 M / 0,5 ml = 0,04 M Esta solución resultante tenía una coloración marrón muy fuerte, indicaba una gran concentración que estaría por encima del límite de detección del instrumento de UV-VIS, por este motivo para poder leer su absorbancia en él, se realizó una dilución 1/10 ml:
1 2 3 4 5 6 X1 X2 X3
Cd=0,5 ml * 0,04 M / 5 ml = 4*10 -3 M
Azucares Totales A492nm Concentración 0 0 0,042 0,004 0,073 0,003 0,109 0,002 0,213 0,001 0,362 0,0005 0,952 0,952 1,092 1,092 0,561 0,561
Tabla 2. Absorbancias de las muestras tomada en UV-VIS a λ= 492 mn.
Solución 3 CD=0,3 ml * 0,05 M / 0,5 ml = 0,03 M Dilución 1/10 ml Cd=0,5 ml * 0,03 M / 5ml = 3*10 -3 M
Absorbancias ) 0,4 m n 2 0,3 9 4 ( 0,2 a i c n 0,1 a b r o 0 s b A-0,1
Solución 4 CD=0,2 ml * 0,05 M / 0,5 ml = 0,02 M Dilución 1/10 ml Cd=0,5 ml * 0,05 M / 5ml = 2*10 -3 M Solución 5 CD=0,1 ml * 0,05 M / 0,5 ml = 0,01 M Dilución 1/10 ml Cd=0,5 ml * 0,01 M / 5ml = 1*10 -3 M
y = 0,0674x - 0,1027
0
0,004
0,003
0,002
0,001 0,0005
Concentración [M]
Gráfica 1. Absorbancia Vs. Concentración [M].
Ecuación aproximada de la recta es: y = 0,0674x – 0,1027 3
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Los carbohidratos presentes en la muestra de jugo no eran un azúcares reductores, por tanto fue necesario realizarle la hidrolisis acida con HCl concentrado, para separarlos en sus monómeros.
Donde Y: absorbancia X: concentración de la muestra Abs = 0,0674x – 0,1027 X= abs + b/ m La concentración de las muestras problemas se determinan de la siguiente forma: X1= (0,952 + 0,1027 / 0,0674) * 20 X1=0,782
(Ver Anexo E)
3. Determinación Cuantitativa (peso promedio) de azúcares reductores. El reactivo de Benedict es una fuente confiable para confirmar la existencia de glucosa. La glucosa contiene oxígeno y éste se combina con el sulfato de cobre contenido en el reactivo y le da la coloración anaranjada o rojiza que le caracteriza a los óxidos. Pero el reactivo de Benedict solo reacciona con la glucosa, la cual es un monosacárido, por lo que para detectar los carbohidratos contenidos en las sustancias o productos, primero se debe descomponer en monosacáridos mediante un proceso químico, en este caso fue mediante el calentamiento de las sustancias.
X2= (1,092 + 0,1027 / 0,0674) * 20 X2=0,886 X3= (0,561 + 0,1027 / 0,0674) * 20 X3=0,492 . /
000 /
)(
)(000 )
= 2,18mg carbohidratos/ml de solución
2. Reconocimiento poder reductor de la muestra Test de Nelson para muestras problema La formación de un precipitado de Cu2O color pardo indica que el azúcar redujo el Cu2+ presente en el reactivo de Nelson a Cu + probándose así el efecto reductor del azúcar. En la fig4. las muestras de carbohidratos 1 y 2 si son reductoras, pero la muestra de jugo no era reductora ya que sus carbohidratos constituyentes no redujeron el Cu y no se formó coloración.
1 2 3 4 X1 X2 X3
(Ver Anexo D)
Hidrólisis ácida
4
Peso Tubo vacío 25,1509 15,0311 18,7425 20,8702 18,8304 18,6342 17,5249
Peso Peso tubo con final muestra 28,0214 (Blanco) 21,9471 3,9884 22,3674 0,0871 24,5764 0,0555 21,7124 0,650 21,5851 0,688 20,8599 0,2879
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Hallamos las concentraciones de la glucosa en mg. Tubo1 Blanco Tubo2
∗
C=
000
∗
0,0C6H12O6
000
∗
80,C6H12O6 C6H12O6
Reacción Ácido Mucico
(Ver anexo)
∗
= 54C6H12O6
Conclusiones La prueba de fenol –H2SO4 fue adecuada para determinar una concentración de carbohidratos en la muestras problema. Debido a que los carbohidratos presentes en el jugo no tenían grupos aldehído y cetona libres, la muestra de jugo no se clasifica como mezcla de azucares reductores. El ácido mucico es el menos soluble en agua acidificada de todos los ácidos sacáricos, este precipito formando cristales transparentes e indicando la presencia de galactosa en la solución.
Tubo3
C=
80,C6H12O6 C6H12O6
∗
0,0C6H12O6
∗
000
∗
000
∗
=
63 C6H12O6
Tubo4 ,
∗
C=
000
∗
0,0C6H12O6 000
∗
80,C6H12O6 C6H12O6
∗
= 67, C6H12O6
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA Vs PESO PRODUCTO OBTENIDO ) g (
5 4 3 2 1 0 -1 0
O D I N E T B O O T C U D O R P O S E P
y = -0,3116x + 20,543 R² = 0,8971
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Bibliografía (1) FORNAGUERA, JAIME. GÓMEZ, GEORGINA. 2004. Bioquímica la ciencia de la vida. Madrid España 1° edición. Editorial EUNED. Págs 170-172. (2) MULLER WERNER. 2008. Bioquímica fundamentos para la medicina y ciencias de la vida. Buenos Aires Argentina. Editorial reverte. Pág 66. (3) VARIOS AUTORES. 2006. Fundamentos de bioquímica estructural. Madrid España. Editorial Tebar. Pág 167.
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CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (mg)
Mediante la ecuación y = -0,3116x + 20,543 hallamos las concentraciones de X1, X2 y X3. −,
X=
−,
C X1 = C X2 = C X3 =
0,0−0, −0, 0,88−0,
= 63,84mg = 63,71mg
−0, 0,89−0, −0,
= 65mg
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Anexos Anexo A
Fig1. Reacción que representa el método fenol-sulfúrico.
Anexo B
Fig2. Esquema de reacción del método DNS.
Anexo C
Fig3. Esquema de reacción para prueba positiva (+) de Benedict.
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Anexo D
Fig4. Test de Nelson. Tubo 1 (X 1 ) Tubo 2 (X 2 ) Tubo 3 (Jugo).
Anexo E
Fig5. Hidrolisis ácida de la muestra de jugo
Anexo ácido Mucico Reacción del Ácido Múcico Este ensayo es exclusivo de la galactosa o de los azúcares que la contienen y sirve para confirmar la presencia del azúcar anterior en algún hidrato de carbono. El HNO 3 oxida tanto al grupo aldehído como el alcohólico primario de cualquier azúcar para originar ácidos dicarboxilicos que han recibido el nombre general de ácidos sacáridos. La molécula de lactosa (disacárido) por acción del HNO 3, se hidroliza dando glucosa y galactosa (monosacáridos) los cuales sufren una oxidación inmediata transformándose en ácido glutámico soluble en agua y en ácido múcico insoluble, respectivamente; ambos son ácidos dicarboxílicos y puesto que el que proviene de la galactosa es insoluble en agua, precipita en for ma de finos cristales. El ácido múcico es el menos soluble en agua acidificada de todos los ácidos sacáridos.
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Figura. Reacción del ácido mucico
En la prueba realizada se formaron cristales de coloración transparente en la muestras de lactosa y galactosa, la glucosa es un carbohidrato soluble en agua, por tanto se disolvió en el agua de la disolución del ácido y no se formaron cristales.
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