Aislamiento de Rhizobium

TITULO : “Aislamiento de Rhizobium” OBJETIVO: • • • •

Reconocer ndulos en ra!ces de le"uminosas #re$arar medio de culti%o E&tracto Le%adura 'anitol Realizar la t(cnica de )*uash $ara aislar bacterias  Aislar microor"anismos microor"anismos

+U,-A'E,TO TEORI.O  A/ +IJA.IO, BIOLO0I.A BIOLO0I.A -EL ,ITRO0E,O ,ITRO0E,O El nitr"eno es uno de los elementos *u!micos esenciales $ara todos los seres %i%os 1a *ue 2orma $arte de los 3cidos nucleicos 1 de las $rote!nas 14 $or lo tanto4 es 2undamental en la estructura 1 el metabolismo celular 5#aerl4 67789/ Las $lantas toman el nit"eno directamente desde el suelo en 2orma de nitratos 5,O;9 o amonio 5,<=>94 al"o al"o *ue *ue no $ued $ueden en hace hacerr los los anim animal ales es44 *ue *ue $rec $recis isan an toma tomarl rlo o en 2orm 2orma a de com$ com$ue uest stos os

or"3 or"3ni nico cos/ s/

)lo )lo

al"u al"uno nos$ s$ro roca cario riota tas s

$ued $ueden en

toma tomarr

el

nitr nitr" "en eno o

directamente desde la atms2era4 %ia 2i?acin de nitr"eno4 con%irtiendo el nitr"eno molecular en nitr"eno asimilable $or otros seres %i%os/ Teniend niendo o en cuen cuenta ta *ue *ue este este eleme element nto o es mu1 abun abunda dante nte en la atms2 atms2er era4 a4 la obtencin de nitr" nitr"en eno o direc directam tamen ente te desde desde (sta (sta es una una de las %!as %!as m3s m3s im$ort im$ortan antes tes $ara $ara el mantenimiento del ciclo del nitr"eno4 del *ue 2orman $arte las bacterias 2i?adoras de nitr"eno4 ?unto con otros "ru$os de bacterias *ue lle%an a cabo $rocesos intermedios de trans2ormacin de com$uestos nitro"enados 1 de desnitri2icacin4 *ue de%uel%e 2inalmente el nitr"eno nitr"eno a la atms2era/ #or #or lo tanto4 la e&istencia de un e*uilibrio e*uilibrio en el cicl ciclo o del del nitr nitr" "en eno o es 2und 2undam amen enta tall $ara $ara la %ida %ida en la tier tierra ra 1 esto esto conl conlle le%a %a el mantenimiento de los ecosistemas microbianos $resentes en los medios terrestres 1 acu3ticos/

B/ )I'BIO) )I'BIO)I) I) R
La asociacin mutualista de rhizobia 1 le"uminosas ha sido desde siem$re la m3s estudiada $or la im$ortancia a"ronmica4 econmica 1 social *ue tiene el culti%o de esta estas s

$lan $lanta tas s

a

esca escala la mund mundia ial/ l/ Ambos mbos $art $art!c !ci$ i$es es son son

ca$a ca$ace ces s

de %i%i %i%ir  r 

inde$endientemente4 sin embar"o4 los dos se bene2ician mutuamente de la interaccin *ue se caracteriza $or la 2ormacin de ndulos 2i?adores de nitr"eno *ue4 en la ma1or!a de las le"uminosas4 se 2orman en la ra!z/ Los ndulos son r"anos es$ecializados *ue se desarrollan como resultado de un di3lo"o molecular $or $arte de los rhizobia 1 de las $lantas/ El establecimento de una simbiosis rhizobia;le"uminosa e2iciente conlle%a una serie de eta$as *ue comienzan con un intercambio de seales entre ambos or"anismos: las ra!ces de la $lanta liberan a la rizos2era 2la%onoides mol(culas de naturaleza 2enlica *ue $romue%en la e&$resin en las bacterias de los "enes

nod 4

lo cual ori"ina la

s!ntesis 1 secrecin de li$o;oli"o*uitinas llamadas 2actores nod/ En las le"uminosas en las *ue la in2eccin se $roduce a tra%(s de $elos radicales se $roduce una de2ormacin de los mismos *ue ori"ina un cambio en la direccin del crecimiento4 $roduci(ndose en el e&tremo a$ical la mor2olo"!a t!$ica denominada “ca1ado de $astor”4 de modo *ue al"unas de las bacterias *uedan recluidas en el interior de la cur%atura de la misma/ Los rhizobia4 una %ez in%adidas las c(lulas de la $lanta4 $roli2eran 1 se di2erencian a bacteroides4 res$onsables de la 2i?acin de nitr"eno4 *ue est3n rodeados $or una membrana $eribacteroidea de ori"en %e"etal 1 constitu1en un nue%o or"3nulo enominado simbiosoma/ ./ TACO,O'IA -E LA R
 A/ 'ATERIALE) 'atraz Balanza  A"ua -estilada 'aterial biol"ico : Rhizobium Obtenido a $artir de la ra!z de al2al2a 5 'edica"o sati%a9 • • • •

B/ 'ETO-OLO0IA #RI'ERO : )e $rocede a $re$arar el medio D'A4 *ue en este caso ser3 A"ar  Le%adura 'anitol o tambi(n llamado Ro?o de .on"o 4 $ara em$ezar $esamos una cantidad determinada de A"ar Le%adura 'anitol / A*u! se $resenta la com$osicin del medio D'A/  A"ua -estilada 'anitol FG<#o= '")O=/
6L 6/ "  /H " /G " /6 " /G "

)E0U,-O : #rocedencia de los ndulos Los ndulos 2ueron e&traidos de $lantaciones de al2al2a sil%estre en al"unos casos en estado 2enolo"ico de 2loracin como en al"unas zonas de $lantacin en el distrito de #ocolla1 1 'iculla  $or otro lado se $udo encontrar $lntaciones de al2al2a con ausencia de 2lores como es el caso de las zonas de Ilaba1a 4 #achia de la Re"ion Tacna / La obtencin de los ndulos se realizo de manera aleatoria 4 $or cada 3rea de 6K mG se tomaron  $lantones de manera aleatoria 4es decir al azar bien se$aradas una de otras 1 de cada $lanta se tomaron G a  nodulos 4 tmando en cuenta *ue al"unos $lantones $ose!an $ocos ndulos a di2erencia de otros *ue carec!an de ndulos  cada uno $ose!a di2erentes caracter!sticas / Los ndulos eran de a$ro&imadamente G mm 4 $or 2alta de materiales se e&tra?o el $lantn com$leto 5tallo 1 ra!z 9 $ara $oder conser%arlo hasta la 2echa de laboratorio  la manera correcta hubiera sido cortar 6 cm de ra!z $ara lue"o ser introducidos en 2rascos conteniendo el desecante 5cloruro c3lcico anh!drido cubierto con al"odn hidr2ilo9/ Los ndulos se mantu%ieron en sombra hasta su traslado a laboratorio/

TER.ERO : Los ndulos deben ser la%ados cuidadosamente con a"ua destilada 1 secados con $a$el celulosa $ara eliminar restos de suelo TER.ERO: Los ndulos se esterilizaron en su$er2icie sumer"i(ndolos en una

solucin de

<".lG al 64 durante =4H;K4 minutos/ -es$u(s4 en condiciones as($ticas4 se la%aron diez %eces con a"ua est(ril $ara eliminar los r estos de <".lG/

.UARTO : #osteriormente se trituraron uno a uno con a1uda de una %arilla de %idrio est(ril 1 se sembraron en $lacas con medio de culti%o D'A

-I).U)IO, La ausencia

de Rhizobium en las ra!ces de 'edica"o sati%a 4 $uede ser 

ocasionado $or al"unas condiciones ad%ersas *ue im$iden la in2eccin 1 la acti%idad ben(2ica de Rhizobium en al2al2a $esados 4 $esticidas 4etc/

4 $or concentraciones de metales