II. ANALISA MIKROBIOLOGI UNTUK BAKTERI DAN FUNGI A. Pendahuluan
1. Latar Belakang Dalam bidang ilmu mikrobiologi, mikrobiologi, untuk untuk dapat dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat baktri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasan ya dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah di mengerti jenis-jenis nutrien yang disyaratkan bakteri dan juga macam ligkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut. Selain teknik pertumbuhan bakteri bakter i atau teknik isolasi di atas, dikenal juga adanya teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi yang merupakan suatu teknik pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroba yang lain yang tidak diiinginkan. Keanekaragaman dari mikroorganisme di alam sangat menarik perhatian manusia. Mikroorganisme tersebut ada yang menguntungkan dan ada pula yang merugikan manusia. Rasa keingintahuan yang ada pada manusia untuk mengetahui tentang jenis, sifat dan keuntungannya bagi manusia menyebabkan manusia melakukan usaha-usaha pembiakan terhadap mikrobia tersebut. Usaha pembiakan kali ini dilakukan pada media NA dan PDA. Setalah tumbuk mikroba yang diinginkan kemudain di analisa. Analisa yang dilakukan antara lain identifikasi morfologi, isolasi, inokulasi, purifikasi dan pewarnaan gram. Dalam praktikum ini dilakukan isolasi mikrobiota dengan cara pengenceran (dilution), yaitu (dilution), yaitu pengenceran bertingkat. Tujuan pengenceran bertingkat adalah untuk memperkecil jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Selain itu kali ini akan dilakukan isolasi dan menghitung
29
30
jumlah koloni bakteri dan jamur, purifikasi, dan identifikasi pada bakteri dan jamur berdasar kenampakan morfologi koloninya serta pewarna gram. Dilihat dari morfologinya, bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu batang, koma, dan spiral. Bentuk jamur mirip dengan tumbuhan, tetapi tidak memiliki daun dan akar yang sejati serta tidak mempunyai klorofil sehingga dia tidak dapat melakukan fotosintesis. 2. Tujuan Praktikum Tujuan dari praktikum acara ketiga Analisa Mikrobiologi untuk Bakteri dan Fungi antara lain: a. Mahasiswa mam pu mengisolasi dan menghitung jumlah koloni jamur dan bakteri b. Mahasiswa mam pu melakukan purifikasi jamur dan bakteri c. Mahasiswa mam pu membedakan jamur dan bakteri bedasar kenampakan mofologi koloninya. d. Mahasiswa mam pu melakukan pengukuran massa pada bakteri dan fungi serta analisa deferinsiasi pada bakteri. B. Tinjuan Pustaka
Fungi memiliki tipe sel eukariotik, dapat berkembangbiak baik secara seksual
maupun
aseksual.
Fungi
ada
yang
bersifat
parasit
dan
menguntungkan, dapat hidup pada berbagai habitat. Perannya di alam dapat berfungsi
sebagai
decomposer,
mikrosimbion,
maupun
pathogen
(Campbell 2003). Bakteri adalah mikroorganisme yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada di mana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis
dari
organisme
lain.
Banyak
patogen
merupakan
bakteri.
Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 0,5- 5 μm, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi
sangat
berbeda
(peptidoglikan).
Banyak
yang
bergerak
menggunakan flagela, yang berbeda dalam strukturnya dari flagela kelompok lain (Martinko 2005).
31
Kultur murni diperlukan karena semua metode septis mikrobiologis yang digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja (Suhardi, dkk 2008). Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri dari satu spesies bakteri yang ditumbuhkan dalam medium buatan. Medium buatan tersebut berfungsi sebagai medium pertumbuhan. Pada medium ini, bakteri dapat tumbuh dan berkembang biak. Bahan dasar yang digunakan untuk medium pertumbuhan ini adalah agar-agar. Untuk bakteri heterotrof, medium dilengkapi dengan air dan molekul makanan misalnya gula, sumber nitrogen, dan mineral (Purwoko 2009). Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Biakan murni diperlukan karena semua metode mikrobiologis yang digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultur, morfologis, fisiologis, maupun serologis memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroba saja (Waluyo 2005). Isolasi mikrobia pada prinsipnya adalah memisahkan suatu jenis mikrobia dengan jenis mikrobia lainnya dengan asal mikrobia yang terdiri dari berbagai
macam
spesies.
Proses
pemisahan
atau
pemurnian
dari
mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari dari satu macam mikroorganisme saja.
Pertumbuhan
bakteri lebih banyak dijumpai pada intensitas pengenceran 10-8, sedangkan pertumbuhan fungi banyak dijumpai pada intensitas pengenceran 10 -4 (Muharni 2009). Proses
isolasi
fungi
dilakukan
memakai
medium
PDA
( Potato Potato Dextrose Agar ) yang terdiri dari kentang 20%, dektrosa 2% dan agar 2%. Media dibuat pH 5,0 5,0 untuk mengurangi mengurangi kemungkinan kontaminasi oleh
32
bakteri pada saat isolasi. Fungi lebih tahan terhadap pH suasana asam jika dibandingkan dengan bakteri atau aktinomycetes, sehingga dengan cara ini juga
telah
terjadi
seleksi
terhadap
mikroba
yang
sedang
diisolasi
(Saryono 2002). Bakteri merupakan mikrobia uniseluler yang termasuk dalam kelas Shizomycetes. Shizomycetes. Bakteri tersebar luas di alam. Ada yang hidup bebas, bersifat saprofitik, parasit, atau patogen pada manusia, binatang atau tumbuhan. Ada beberapa jenis bakteri bersifat fotosintetik. Ada tiga bentuk dasar bakteri, yaitu bentuk bulat, batang, dan melilit (Irianto 2007). Purifikasi bertujuan untuk mendapatkan satu spesies dalam satu tabung pemeliharaan
kultur.
Hal
ini
perlu
dilakukan
karena
identifikasi
mikroorganisme memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu. Langkah pemurnian adalah koloni dengan karakter morfologi tertentu dapat dipisahkan satu dengan lainnya dengan cara mengambilnya dengan ose. Digoreskan pada media nutrien agar atau pemurnian yang lain. Pengambilan dengan ose dapat memisahkan koloni tunggal dengan yang lainnya. Mengambil
koloni
dengan
karakter
morfologi
tertentu
dengan
cara
mengambilnya dengan jarum enten kemudian menaruhnya pada satu titik media PDA pada cawan petri. Jarum ose dan jarum enten yang digunakan untuk memindahkan sedikit biakan bakteri dan fungi ke gelas obyek harus disterilisasi dengan cara dipanaskan diatas lampu bunsen agar terbebas dari mikroba (steril), begitu pula dengan bibir cawan petri tempat koloni fungi (Suria 2005). Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana ST 2008).
33
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk: Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar, Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme, Membantu mengidentifikasi atau membedakan organism yang serupa ( Suriawieia 2002). C. Metodologi Metodologi Praktikum
1. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum Mikrobiologi Pertanian acara pertama ini dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 30 Oktober 2013 pukul 08.50-10.40 WIB di Laboratorium Biologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret. 2. Alat a. Lampu Bunsen b. Alumunium foil c. Jarum ose d. Dryglaski e. Tabung reaksi f. Pipet g. Erlenmayer h. Incubator i.
Cawan petri
j.
Kertas label
k. Hand colony counter l.
Spidol
m. Jarum inokulasi
34
n. Kacca preparat o. Bak pewarna p. Mikroskop q. Pinset 3. Bahan a. Sampel tanah b. Mikrobia dari bagian tubuh c. Sampel buah segar d. Sampel buah busuk e. Sampel air mineral f. Sampel kertas g. Alcohol h. Media NA i.
Media PDA
j.
Aquadest
k. Garam fisiologis l.
Seperangkat pewarna gram (ungu Kristal, larutan iodium gram, alcohol 95%, safranin)
4. Cara Kerja a. Bakteri 1) Identifikasi, Perhitungan Populasi, dan Purifikasi a) Memasukkan 10 gram bahan kedalam 90 ml garam fisiologis, lalu digojog hingga homogeny (pengenceran 10 -1) b) Mengambil 1 ml larutan 10 -1, memasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis, lalu digojok hingga homogeny (pengenceran 10 -2) c) Melakukan hal seperti diatas hingga pengenceran 10 -5 d) Mengisolasi mikroba kedalam media NA dengan cara berikut: i. Mengambil 0,1 ml larutan 10 -5 dan menuangkan kedalam media NA, NA, lalu meratakan larutan tersebut keseluruh media menggunakan dryglasky steril. ii. Melakukan hal yang sama terhadap semua pengenceran
35
e) Menginkubasi isolate-isolat tersebut pada suhu kamar, dengan posisi petridish terbalik, selama 3 hari, kemudian amati kolonikoloni dari mikrobia yang tumbuh. f) Menghitung jumlah koloni yang tumbuh menggunakan hand colony counter dan mengidentifikasi morfologi koloni yang terbentuk. g) Menggambil koloni untuk ditumbuhkan lagi ke media agar miring dengan metode zig-zag h) Menumbuhkan satu koloni bakteri dalam petridish dengan metode goresan kuadran ( streak quadrant) i) Melakukan isolasi mikroba dari bahan sampel lainnya. 2) Pewarnaan Gram a) Melakukan konfirmasi (penyesuaian) antara mikroba yang tumbuh pada isolasi yang pertama dengan terakhir. b) Menyiapkan olesan bakteri pada kaca preparat dan memfiksasi dengan panas. c) Meletakkan kaca preparat diatas rak kawat pada bak pewarna. d) Menggenangi olesan bakteri dengan pewarna primer (ungu Kristal) selama 1 menit. e) Memiringkan kaca preparat menggunakan pinset dan membuang kelebihan ungu Kristal dan membilas menggunakan aquadest. f) Meniriskan kaca preparat dan meletakkan diatas kawat pada bak pewarna. g) Menggenangi olesan dengan iodium gram selama 2 menit. h) Memiringkan kaca preparat untuk membuang kelebihan iodium dan bilas dengan aquades i) Mencuci olesan dengan pemucat warna yaitu alcohol 95%, meneteskan tetes demi tetes selama 30 detik sampai zat unggu Kristal tidak terlihat. j) Mencuci
dengan
aquadest
kemudian
meniriskan
mengembalikan diatas rak kawat pada bak pewarna.
dan
36
k) Menggenangi olesan dengan pewarna tandingan yaitu safranin selama 30 detik, dan memiringkan kaca preparat untuk membuang kelebihan safranin kemudian membilas dengan aquades. l) Meniriskan
kaca
preparat
dan
menyerap
kelebihan
air
menggunakan kertas serap, kemudian mengamati dengan mikroskop. b. Fungi 1) Melakukan teknik pengenceran bertingkat seperti pada poin a, namun menggunakan media PDA 2) Menginkubasi isolate-isolat tersebut pada suhu kamar, dengan posisi petridish terbalik, selama 3 hari kemudian amati kolonikoloni dari mikrobia yang tumbuh 3) Menghitung jumlah koloni yang tumbuh dengan hand colony counter dan mengidentifikasikan morfologi koloni yang terbentuk 4) Mengambil 1 koloni untuk ditumbuhkan lagi kemedia agar miring dengan metode zig-zag 5) Menumbuhkan satu koloni bakteri dalam petridish dengan metode goresan kuadran (streak quadrant) 6) Melakukan identifikasi koloni mikrobia yang tumbuh 7) Melakukan konfirmasi (penyesuaian) antara mikrobia yang tumbuh pada isolasi yang pertama dengan yang terakhir. 8) Melakukan isolasi mikrobia dari bahan sample yang lainnya.
37
D. Hasil Pengamatan dan Pembahasan Pembahasan
1. Hasil Pengamatan Tabel 2.1 Hasil Isolasi dan Identifikasi Mikroba No
Media
1.
PDA
Asal Mikroba Sayur
Foto
Hasil Pengamatan
Keterangan
Ukuran: besar Bentuk: rhizoid Elevasi: flat Margin: sertate Permukaan: Permukaan: kerutan Opacity: hampir trasparan sedikit distorsi Chromagenesis: putih kusam Jumlah koloni: 28
Tidak ada kontaminasi
Tanah 10-4
Ukuran: besar Bentuk: circular Elevasi: umbonate Margin: entire Permukaan: kasar Opacity: buram Chromagenesis: hitam Jumlah koloni: 8
Tidak ada kontaminasi
Kertas
Ukuran: large Bentuk: irregular Elevasi: umbonte Margin: serrate Permukaan: kasar Opacity: buram Chromagenesis: putih kecoklatan Jumlah koloni: 13
Tidak ada kontaminasi
Air Mineral
Ukuran: kecil Bentuk: irraguler Elevasi: convex Margin: lobate Permukaan: berkontur Opacity: transparan t ransparan Chromagenesis: putih kekuningan Jumlah koloni: 101
Ada Kontaminasi
38
2.
NA
Sayur
Ukuran: besar Bentuk: irraguler Elevasi: raised Margin: berombak Permukaan: halus Opacity: hampir transparan sedikit distorsi Chromagenesis: putih tulang kekuningan Jumlah koloni: 25
Tidak ada kontaminasi
Tanah 10-4
Ukuran: sedang Bentuk: circular Elevasi: flat Margin: lobate Permukaan: halus Opacity: buram Chromagenesis: putih kekuningan Jumlah koloni: 18
Tidak ada kontaminasi
Kertas
Ukuran: besar Bentuk: irreguler Elevasi: flat Margin: lobate Permukaan: halus Opacity: buram Chromagenesis: putih tulang kekuningan Jumlah koloni: 2
Tidak ada kontaminasi
Air Mineral
Ukuran: small Bentuk: circular Elevasi: convex Margin: entire Permukaan: halus Opacity: buram Chromagenesis: putih kecoklatan Jumlah koloni: 132
Tidak ada kontaminasi
Sumber: Logbook
39
Tabel 2.2 Hasil Inokulasi Mikroba pada Media Miring No. Media Asal Mikroba Foto 1. PDA Sayur
2.
NA
Keterangan Tidak ada kontaminasi
Tanah 10-4
Tidak ada kontaminasi
Kertas
Tidak ada kontaminasi
Air mineral
Ada kontaminasi
Sayur
Tidak ada kontaminasi
Tanah 10-4
Tidak ada kontaminasi
40
Kertas
Tidak ada Kontaminasi
Air mineral
Tidak ada kontaminasi
Sumber: Logbook Tabel 2.3 Hasil Purifikasi Streak Kuadran Mikroba No
Media
1.
PDA
Asal Mikroba Sayur
Foto
Hasil Pengamatan Ukuran: large Bentuk: filamen Elevasi: raised Margin: felame Permukaan: halus Opacity: buram Chromagenesis: putih kapas
Keterangan Tidak ada kontaminasi
Tanah 10-4
Ukuran: small Bentuk: rizoid Elevasi: berbukit bukit Margin: seperti benang Permukaan: kasar Opacity: buram Chromagenesis: hitam
Tidak ada kontaminasi
Kertas
Ukuran: small Bentuk: circular Elevasi: flat Margin: seperti wol Permukaan: halus Opacity: buram Chromagenesis: coklat keabuan Ukuran: -
Tidak ada kontaminasi
41
2.
NA
Air Mineral
Bentuk: Elevasi: Margin:Permukaan:Opacity: Chromagenesis:-
Ada kontaminasi
Sayur
Ukuran: small Bentuk: bundar dendan tepian timbul Elevasi: cembung Margin: brlekuk Permukaan: kerutan Opacity: buram Chromagenesis: putih basah
Tidak ada kontaminasi
Tanah 10-4
Ukuran: besar Bentuk: tak beraturan dan menyebar Elevasi: flat Margin: bercabang Permukaan: Permukaan: licin Opacity: buram terdisrosi Chromagenesis: putih susu
Tidak ada kontaminasi
Kertas
Ukuran: small Bentuk: circular Elevasi: timbul Margin: licin Permukaan: bundar dengan tepian timbul Opacity: buram Chromagenesis: kuning
Tidak ada kontaminasi
Ukuran: besar
Tidak ada
42
Air Mineral
Bentuk: bundar dengan tepian timbul Elevasi: timbul Margin :licin Permukaan: timbul Opacity: bening (transparan) Chromagenesis: putih bening
kontaminasi
Sumber: Logbook Tabel 2.4 Hasil Pewarnaan Gram Asal Mikroba Foto Bakteri Sayur
Keterangan Penampakan bakteri dibawah mikroskop menghitam karena terbakar
Sumber: Logbook 2. Pembahasan Menurut
waluyo
(2005)
isolasi
merupakan
cara
untuk
memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya. Tujuannya adalah untuk memperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. t unggal. Biakan murni diperlukan karena semua metode
mikrobiologis
mengidentifikasi
yang
mikroba,
digunakan
termasuk
untuk
penelaahan
menelaah ciri-ciri
dan kultur,
morfologis, fisiologis, maupun serologis memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroba saja Purifikasi mikroba adalah suatu cara atau mekanisme untuk mendapatkan mikroba yang dibutuhkan atau diinginkan. Identifikasi mikroba adalah cara untuk mempelajari secara detail karakter fisik, kimiawi,
dan
biologis
mikroba
sehingga
dapat
diketahui
dan
dimanfaatkan secara optimal. Identifikasi akan menimbulkan suatu
43
karakteristik sifat dari masing-masing mikroorganisme dan bertujuan untuk membedakan morfologi dari fungi dan bakteri. Tujuan dari purifikasi dan identifikasi bakteri dan jamur adalah untuk mendapatkan bakteri dan jamur yang diinginkan dan untuk membedakan morfologi antara jamur dan bakteri. Menurut Wistreich (2003), faktor yang mempengaruhi keberhasilan isolasi suatu mikroorganisme antara lain: a. Media biakan. Mikroorganisme memerlukan nutrisi untuk tumbuh yang berbeda, misalnya medium NA untuk bakteri dan medium PDA untuk fungi. b. Suhu, pengaruh suhu berhubungan dengan akktivitas enzim. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim. c. Tekanan osmotik. Keberadaan mikroorganisma dilingkungan dapat dipengaruhi kepekatan suspensi/ cairan di lingkungan. Bila kepekatan suspensi di lingkungan tinggi makanisi sel akan ke luar. Sebaliknya kepekatan suspensi di lingkungan rendah maka akan terjadi pergerakan massa cair ke dalam sel. d. Sinar UV, panjang gelombang 210-300 nm dapat membunuh mikroorganisme jika di paparkan. Komponen seluler yang dapat menyerap sinar UV adalah asamnukleat sehingga dapat rusak dan menyebabkan kematian. e. pH berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi metabolisme. Jamur dan bakteri memiliki ciri morfologi yang berbeda. Jamur telah banyak kita temui sehari-hari, Sebagian besar fungi adalah organisem multiseluler dengan hifa yang dibagi menjadi sel-sel oleh dinding yang bersilangan. Jamur mempunyai tipe sel eukariotik, berkembang biak secara seksual dan aseksual. Habitat jamur beragam sehingga jamur dapat dapat tumbuh dan berkembang dibanyak dibanyak tempat. Jamur adalah tumbuhan yang berinti, berspora, dan tidak berklorofil, berupa sel atau benang yang yang bercabang-cabang, dengan dinding dari selulosa atau
44
dari kitin atau dari keduanyal. Jamur ini tergolong tumbuhan thallus karena belum bisa dibedakan antara bagian batang, daun, maupun akarnya. Pertumbuhannya mula-mula akan berwarna putih, tetapi jika spora telah timbul akan terbentuk berbagai warna tergantung dari jenis kapang. Kapang terdiri dari suatu thallus yang thallus yang tersusun dari filamen yang bercabang yang disebut hifa. Kumpulan Kumpulan dari hifa disebut miselium. Bakteri merupakan sekelompok mikroorganisme yang termasuk prokaryote, sel tubuh bakteri berukuran sangat kecil, kebanyakan diameternya
berukuran
kira-kira
0,5-0,1µm.
Kebanyakan
bakteria
merupakan jasad yang transparan (tembus cahaya). Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Bakteri ini biasanya ditemukan dalm keadaan berlendir ataupun berbentuk kumpulan kumpulan hifa yang berwarna putih keabuan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa perbedaan bakteri dan jamur secara umum yakni dengan melihat ukurannya jamur berukuran lebih besar daripada bakteri. Struktur sel jamur yang multiseluler dan bakteri yang uniseluler. Bakteri merupakan mikroorganisme prokariotik yang memiliki sel tunggal. Bakteri memiliki struktur sel yang sederhana karena tidak memiliki nukleus/inti sel, cytoskeleton dan organel lain seperti mitokondria juga
kloroplas. Struktur Struktur morfologinya morfologinya hanya bisa bisa dilihat
dengan bantuan mikroskop karena ukurannya yang mikroskopis. Selain diadakan isolasi dan purifikasi juda diakan identifikasi morfologi koloni. koloni . Pada kondisi yang sesuai maka mikroorganisme akan tumbuh dengan cepat serta jenis koloninya beragam. Untuk itu perlu dilakukan identifikasi koloni. Identifikasi koloni ini akan menghasilkan karakteristik dari mikroorganisme dengan cirri morfologi yang berbeda. Identifikasi morfologi koloni meliputi: ukuran, bentuk, elevasi, tepiam, permukaan, opacity, dan chromogenesis. Hasil dari identifikasi ini akan
45
menentukan jenis mikroorganisme tersebut, apakah masuk dalam jenis bakteri, jamur ataukan bagian dari yang lain. Pada isolasi mikrobia dalam media NA, dan PDA kami menggunakan berbagai bayan yakni: sayuran yang dicuci dan tidak dicuci,
air
tanah,
kertas,
air
mineral,
dan
tangan
manusia.
Mikroorganisme dapat pada media tersebut. Pada saat pengamatan setelah diinkubasi se;alam 4 hari, mikroorganisme dapat teridentifikasi. Rata-rata ukurannya yaitu cenderung kebesar karena mikroorganisme tumbuh terkumpul disuatu tempat. Pada saat identifikasi didapatkan bahwa media PDA untuk air mineral mengalami kontaminasi yaitu tumbuhnya jamur pada media. Untuk menghindari tumbuhnya bakteri pada konsentrasi tempat tertentu maka dilakukan purifikasi streak empat kuadran. Streak empat kuadran ini digunakan untuk mencari biakan yang murni. Pengamatan pada purifikasi ini adalah tidah adanya kontaminasi pada media kecuali yang PDA air mineral yang sejak isolasi sudah terkontaminasi. Pada isolasi dilakukan pengenceran bertingkat. Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Untuk praktikum praktikum ini menggunakan menggunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran tersebut. Pengenceran bertingkat ini menggunakan garam fisiologis. Garam fisiologis ini berfungsi untuk menjaga tonisitas dari sel mikroorganisme sehingga tidak akan terjadi plasmolisis. Setelah
dilakukan
purifikasi,
langkah
selanjutnya
dalah
menumbuhan masing-masing pada petridish dengan metode goresan 4 kuadran ( streak plate). plate).
Tujuan dari streak 4 kuadran kuadran ini adalah untuk
memperoleh biakan yang benar-benar murni. Streak 4 kuadran ini juga sebagai dimaksudkan menghindari tumbuhnya mikrrorganisme yang
46
terkonsentrasi pada suatu tempat sehingga dalam mengidentifikasi jenis koloni tersebut akan menyulitkan. Teknik streak plate plate (lempeng gores) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan menumbuhkan mikroorganisme mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur bakteri. Dengan teknik ini mikroorganisme yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak jarum. Hasil dari steak 4 kuadran ini akan tumbuh koloni yang lebih spesifik sehingga akan mempermudah dalam mengidentifikasikan jenis koloni tersebut. Karena pada streak 4 kuadran ini mikroorganisme tidak tumbuh menggumpul atau terkonsentrasi pada suatu tempat. Telah dijelaskan bahwa dalam mengidentifikasikan bakteri ini cukup sulit. Karena morfologi dari bakteri ini adalah transparan, sehingga perlu diadakan prosess pewarnaan untuk mengidentifikasikan jenis bakteri. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan pada noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu
47
digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digoongkan ke dalam Gram Negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. Perbedaan warna antara bakteri Gram Negatif dan bakteri Gram Positif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding sel nya. Dinding Gram Positif mengandung banyak peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung lipopolisakarida (Suriawiria 1999). Pada praktikum pewarnaan gram ini hasil dari kelompok kami menghitam, hal ini disebabkan karena terlalu lama dalam proses fiksasi sehingga bakteri yang diamati terbakar. E. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan Berdasarkan
hasil
pengamatan
dan
pembahasan
praktikum
Mikrobiologi Terapan dapat ditarik kesimpulan, antara lain : a.
Isolasi mikrobia pada prinsipnya adalah memisahkan suatu jenis mikrobia dengan jenis mikrobia lainnya dengan asal mikrobia yang terdiri dari berbagai macam spesies dengan cara menumbuhkan pada media padat.
b.
Pada hasil isolasi terjadi kontaminasi pada PDA Air Mineral
c.
Inokulasi adalah tindakan menanam mikroorganisme mikroorganisme ke dalam wadah atau
media tumbuhnya tumbuhnya yang diambil dari dari sediaan, misalnya pada pada
pembiakan bakteri. d.
Streak 4 kuadran akan menghasilkan biakan yang murni, karena mikroorganisme tidak tumbuh pada menggumpul pada tempat tertentu, sehingga mempermudah dalam identifikasi.
e.
Pewarnaan
gram
merupakan
meted
yang
penting
dalam
mengidentifikasi bakteri, karena bakteri merupakan bakteri yang tidak berwarna dan cenderung transparan. f.
Perbedaan warna antara bakteri Gram Negatif dan bakteri Gram Positif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding sel
48
nya. Dinding Gram Positif mengandung banyak peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung lipopolisakarida. 2. Saran Berdasarkan hasil praktikum Analisis algae dan Protozoa dari alam, maka didapatkan beberapa saran untuk lancarnya praktikum, yaitu sebagai berikut: a. Diharapkan praktikan serius dalam melakukan praktikum sehingga hasil dari praktikum bisa maksimal. b. Pada proses pewarnaan gram sebaiknya co.ass menjelaskan lebih jelas lagi, terutama pada proses fiksasi sehingga tidak terjadi kegagalan karena bakteri yang diamati terbakar.
49
DAFTAR PUSTAKA
Campbell 2003. Biologi 2003. Biologi jilid 2. 2. Jakarta: Erlangga Irianto K 2007. Mikrobiologi. 2007. Mikrobiologi. Bandung: Bandung: Yrama Widya. Madigan M and Martinko J (editors) 2005. Brock Microorganisms (11th ed.). Prentice ed.). Prentice Hall: New Jersey
Biology
of
Muharni 2009. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil Penghasil Kitinase dari Sumber Air Panas Danau Ranau Sumatera Selatan. J. Penelitian Sains. Sains. Vol. 4 (9): 12-15. Purwoko T 2009. Fisiologi 2009. Fisiologi Mikroba. Mikroba. Jakarta: Bumi Aksara. Saryono 2002. Isolasi Dan Karakterisasi Fungi Penghasil Inulinase yang Tumbuh pada Umbi Dahlia (Dahlia variabilis). J Natur Indonesia. Vol. 4 (2): 171-177. Suhardi Koesnandar Indriani Arnaldo 2008. Biosafety: Pedoman Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit . Jakarta: PT. Multazam Mitra Prima. Suria 2005. 2005. Mikrobiologi Dasar . Jakarta: Papas Sinar Sinanti. Suriawiria 2002 Mikrobiologi 2002 Mikrobiologi Dasar dalam Praktek . Jakarta: PT. Garaemedia Suriawiria U. Suriawiria U. 1999. Mikrobiologi 1999. Mikrobiologi.. Jakarta : Universitas Terbuka. Tryana ST 2008. Dasar-Dasar 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Mikrobiologi. Malang: Djambatan Waluyo L 2005. Mikrobiologi 2005. Mikrobiologi Umum. Umum. Malang: MM Press. Wistreich GA 2003. Microbiologi Laboratory Fundamental and Application 2nd Edition. New Jersey: Pearson Education
